JP2017517514A - Hmg−up(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)を得るための方法及び夾雑物を含まない組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
セリンプロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンが夾雑しているゴナドトロピン組成物を、以下の工程:
i)マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体を使用して、pHは一定であるが伝導率(conductivity)を変更する緩衝液で溶出させて、夾雑している前記ゴナドトロピンを精製して、LH生物活性のみを有する画分J3-UPを得る工程と、
ii)画分J2からのFSH生物活性を画分J3-UPからのLH生物活性と同等量で混合することによるバランス工程によってHMG-UPを得る工程と、
iii)前記HMG-UPの溶液を、
1)滅菌濾過工程、
2)ナノ濾過工程、及び
3)沈殿工程
に供することによって、非関連ゴナドトロピンタンパク質夾雑物、例えば、プロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンを含まないHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得る工程と
に供する、方法を含む。
i)酸性化されたヒト閉経期/閉経後尿のカオリンによる最初の処理を行う工程であり、尿中に存在するゴナドトロピンを含むタンパク質をカオリンに吸着させる工程と、
ii)カオリンに吸着されたゴナドトロピンを、アルカリ溶出によって溶出させる工程と、
iii)アルカリ溶出物をアセトンで沈殿させて、画分Aを得る工程と、
iv)酢酸アンモニウムのエタノール(70%)中10%w/v溶液でこの沈殿画分Aから生物活性画分を抽出し、酢酸アンモニウムのエタノール(90%)中10%溶液で沈殿させて、画分Bを得る工程と、
v)イオン交換クロマトグラフィーによって画分Bを精製して、画分C(HMG原材料又は同等物)を得る工程と、
vi)強陽イオン樹脂を使用して酢酸アンモニウムで溶出させる陽イオン交換クロマトグラフィーによって、画分Cを精製する工程と、
vii)前記工程で得られた溶出物から、酸性媒体中での沈殿によって画分Fを得る工程と、
viii)強陰イオン樹脂を使用して酢酸アンモニウムで溶出させる陰イオン交換クロマトグラフィーによって画分Fを精製して、画分Gを得る工程と、
ix)疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、漸減濃度の硫酸アンモニウムを含有する緩衝液の逐次添加によって、画分G中の得られたゴナドトロピンを精製して、画分J2及びJ3を得る工程であり、画分2が主にFSH生物活性を有し、画分J3がLH生物活性を有する工程と、
x)マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体を使用して、pHは一定であるが伝導率を変更する緩衝液で溶出させて、画分J3のゴナドトロピンを精製して、LH生物活性のみを有する画分J3-UPを得る工程と、
xi)画分J2中のFSH生物活性と画分J3-UP中のLH生物活性を同等量で混合することによるバランス工程においてHMG-UPを得る工程と、
xii)前記HMG-UPの溶液を、
4)滅菌濾過工程、
5)ナノ濾過工程、及び
6)沈殿工程
に供することによって、非関連ゴナドトロピンタンパク質夾雑物、例えば、プロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンを含まないHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得る工程と
を含む、方法を含む。
ミックスモード又はマルチモーダルクロマトグラフィーは、リガンドと標的分子との間の2つ以上の相互作用機構の組合せが実質的に関係するクロマトグラフィーを指す。一部の実施形態において、この組合せは、シングルモードの担体によって達成できない抗体の分画を達成できるような独特の選択性をもたらす。特定の実施形態において、ミックスモード樹脂は、負に帯電している部分と疎水性部分とを含む。一実施形態において、負に帯電している部分は、陽イオン交換のためのアニオン性のカルボキシレート基又はアニオン性のスルホ基である。このような担体の例としては、Capto-MMC(商標)(GE Healthcare社)が挙げられるが、これに限定するものではない。
材料の供給源
画分J3からのLH活性は、欧州特許EP1169349B1に記載されるようにして、HIC(疎水性相互作用クロマトグラフィー)によって得た。
マルチモーダルクロマトグラフィーは、AKTA Purifierシステムを使用して行った。
この樹脂は、抗体並びに更に宿主細胞タンパク質及び核酸の製造中において二量体及び凝集体を排除するための、プロテインA工程後における夾雑物の除去に主に推奨されている。
- カラムXK 16/40:容量24ml。
- 装填量:LH活性画分ロット4625/51-1のタンパク質50mg。
- 流量:3ml/分
- 検出:280nm
- 溶出緩衝液:
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+0mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+50mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+100mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+225mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+300mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+1000mM NaCl
総タンパク質含有量
総タンパク質含有量は、Hartree[Hartree、1972年]によって変更された、Lowry[Lowryら 1951年]の方法に従って決定した。ウシ血清アルブミンを、標準として使用した。
試料のLH及びFSH生物活性を、インビボバイオアッセイを使用して評価した。
方法:卵巣質量増加法(USPXXXV、イギリス薬局方2015、III巻)。
一次参照標準:尿中FSH及び尿中LHの国際標準(NIBSC、WHO-ECBS)。
使用参照標準:一次参照標準に対して較正されたInstituto Massone S.A.社製のMenotrophin(HMG)。
動物:ウィスター系ラット雌、日齢21〜24日、1ケージ当たり動物6匹の群、群内体重差は10g以下。
用量:3×3試験、即ち、使用標準3用量及び試料3用量、1ケージ当たり1用量を試験。低用量:2.4IU;中用量:4.3IU;高用量:7.7IU。
緩衝液:hCG 28IU/mlを含有するリン酸-アルブミン緩衝生理食塩水(pH7.2)。
方法:精巣質量増加法(USPXXXV、イギリス薬局方2015、III巻)。
一次参照標準:尿中FSH及び尿中LHの国際標準(NIBSC、WHO-ECBS)。
使用参照標準:一次参照標準に対して較正されたInstituto Massone S.A.社製のMenotrophin(HMG)。
動物:ウィスター系ラット雄、日齢21〜24日、1ケージ当たり動物6匹以上の群、群内体重差10g以下。
用量:3×3試験、即ち、使用標準3用量及び試料3用量、1ケージ当たり1用量を試験。低用量:7IU;中用量:14IU;高用量:28IU。
緩衝液:リン酸-アルブミン緩衝生理食塩水(pH7.2)。
種々の画分を、SDS-PAGEによって還元条件下でPhastSystemユーザーマニュアル(ファイル番号110)に記載されたようにして特性決定した。
- 電気泳動分離はPhastSystem(GE Healthcare社)を使用して行った。
- ゲルの画像は、ImageScanner(PowerLook 1120「UMAX」)をソフトウェアLabScan 5.0(GE Healthcare社)と共に使用して処理した。Image Quant TL バージョン2005、Amersham Biosciences社。
- 試料アプリケーター8/1(1μl)、GE Healthcare社、コード番号18-1618-01。
- LMW較正混合物、GE Healthcare社製、コード番号17-0446-01。
- HMG HP参照標準。
- HCG HP参照標準。
- Phastgel勾配 SDS 8〜25%、GE Healthcare社、コード番号17-0542-01。
- ゲル中緩衝液系: 0.112M酢酸塩(リーディングイオン)及び0.112MTris(pH6.5)。
- Phastgel SDS緩衝液ストリップ 2〜3%アガロース、GE Healthcare社、コード番号17-0516-01。
- TRIS/HCl p. a.。
- EDTA-Na2 p. a.。
- β-メルカプトエタノールp. a.。
- 試料緩衝液: 10mM Tris/HCl、1mM EDTA(pH8.0)+2.5%SDS、+5%β-メルカプトエタノール+0.01%ブロモフェノールブルー。
HMG-UP及びHMG-HPの試料、並びに中間体画分J3及び画分J3-UPを、標品中に存在する異なる種の分子量とそれらのpIの両方によって試料を分離できる二次元電気泳動のような非常に高感度の技法によって、更に特性決定した。
二次元電気泳動によって得られた試料のスポットを、MALDI-TOF MSによって分析し、データベースから同定した。
マルチモーダルクロマトグラフィーによる画分J3-UPの生成
マルチモーダルクロマトグラフィーを、強陰イオン交換体を使用して行った。疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって得た画分J3中に存在するLH生物活性を、Capto-adhereを使用して精製した。AKTA精製システムを使用してCapto-adhere(容量24ml)を用いて準備したXK16/40カラムに画分J3 50mgを装填した。種々の工程の勾配を使用して、不純物を排除した。
使用した一連の緩衝液は以下の通りであった:
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+0mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+50mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+100mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+225mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+300mM NaCl
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+1000mM NaCl
画分J3及び画分J3-UPのタンパク質パターンを、8〜25%ゲル上で還元条件において分析し、銀染色した。
二次元電気泳動によって精製された材料、画分J3-UPの分析(図2)は、Capto-adhereが、MALDI MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析)によって決定されたアルファ及びベータhCGに相当するスポットのみを有する生成物(図5)を引き離すことができることを示している。他方、出発原料(画分J3)中に存在する高量の不純物により、活性物質(アルファ及びベータhCG)に相当するバンドを割り当てるのは更に困難になる。
LH生物活性を含むCapto-adhereによって精製された画分J3-UPを、バランス工程に使用してFSH活性及びLH活性を約1:1の比に調整して、HMG-UPを得た。このバランス工程は、画分J2からのFSH活性と画分J3-UPのLH生物活性を同等量で混合することによって行った。
HMG-UPを、二次元電気泳動によって更に特性決定した。この技法は非常に高感度で、優れた解像度を有する。実際に、タンパク質を1つの次元でそれらの等電点によって、第2の次元でそれらの分子量によって分離することができる。HMG-UPとHMG-HPの両方を、比較のために泳動した。
図1の流れ図に示される本発明の好ましい実施形態として、EP1169349B1に開示されている共通の工程を考慮して、前記実施形態を以下のように行う。
1)0.05〜0.15M酢酸アンモニウム(pH5.0〜6.0)中で希釈された前記未精製ゴナドトロピンを、スルホプロピル型の強陽イオン樹脂を含むイオン交換カラム中で、0.05〜0.5M酢酸アンモニウム溶液(pH5.0〜7.0)によりFSH生物活性及びLH生物活性の両方を溶出させて、精製する工程と、
2)0.01〜0.05M酢酸アンモニウム(pH5.0〜7.0)中で希釈されたこの画分を、第四級アンモニウム型の強陰イオン樹脂を含むイオン交換カラム中で、0.05〜0.2M酢酸アンモニウム溶液(pH5.0〜7.0)によりFSH及びLHの両方を溶出させて、精製する工程と、
3)ゴナドトロピンを、疎水性相互作用樹脂を含むカラム中で、以下の溶液:a)50〜200mMリン酸ナトリウム及び0.8〜1.2M硫酸アンモニウムの緩衝液(pH5.0〜6.0)(不純物)、b)50〜200mMリン酸ナトリウム及び0.4〜0.6M硫酸アンモニウムの緩衝液(pH5.0〜7.0)(画分J2)、並びにc)50〜200mMリン酸ナトリウム(50〜70%v/v)及び96%エタノール(50〜30%v/v)の緩衝液(画分J3)の逐次添加によって精製する工程と、
4)ゴナドトロピン画分J3を、マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体で精製する工程。溶出は、緩衝液のpHは一定に保つが伝導率は変更して行った。pHが7〜10の範囲の、好ましくはpH8.5の40mMトリス緩衝液を選択し、工程の勾配の作成にはNaClを使用した。LH生物活性は、低伝導率で溶出させた。他方、夾雑物は高伝導率で脱着させた。
画分Fの調製
スルホプロピル型の強陽イオン交換樹脂10リットルを含むクロマトグラフィーカラムで、画分Cをクロマトグラフィー処理する。
第四級アンモニウム型の強陰イオン交換樹脂4リットルを含むクロマトグラフィーカラムで、画分Fをクロマトグラフィー処理する。
疎水性相互作用樹脂(Phenyl Sepharose HP、Amersham-Pharmacia Biotech社)400mlを含むクロマトグラフィーカラムで、画分Gをクロマトグラフィー処理する。
- 画分Gの溶液をクロマトグラフィーカラム中に入れる。
- 2容量の50〜200mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.8〜1.2M硫酸アンモニウム、pH5.0〜7.0で溶出させる。
- 2容量の50〜200mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.4〜0.6M硫酸アンモニウム、pH5.0〜7.0で、最後に2容量の50〜200mMリン酸緩衝液(50〜70%v/v)及び96%エタノール(50〜30%v/v)で溶出を続ける。
マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体(Capto-adhere、GE社)24mlを含むクロマトグラフィーカラムで、画分J3をクロマトグラフィー処理する。pH7〜10、好ましくはpH8.5の40mMトリス緩衝液を選択し、工程の勾配の作製にはNaClを用いた。
FSH(画分J2から)とLH(画分J3-UPから)を同等量で混合して両ホルモンの比を1:1とすることによって、HMG-UPを得る。
1.1 画分Fの調製
画分C 231.2gを、2つの等しい部分に分け、前述のようにしてクロマトグラフィーカラムで2つの同等なプロセスでクロマトグラフィー処理した。
前記工程で得られた2つの画分Fを一緒にし、前記技法に従ってカラムでクロマトグラフィー処理した。
1)画分J2(FSH生物活性)及びJ3(LH生物活性)の調製
硫酸アンモニウムを、濃度1Mまで画分Gのアリコート(80ml)に加えた。この溶液をPhenyl- Sepharose HPクロマトグラフィーカラム中に流し、2容量の緩衝液、50mMリン酸ナトリウム、1M硫酸アンモニウム、pH5.1を用いて溶出させた。2容量の緩衝液、50mMリン酸ナトリウム、0.5M硫酸アンモニウム、pH5.1を用いて、最後に2容量の50mMリン酸緩衝液(60%v/v)及び96%エタノール(40%v/v)を用いて、溶出を続けた。
画分J3 50mgを40mMトリス緩衝液(pH8.5)に対して透析し、AKTA精製システムを使用してCapto-adhere(容量24ml)を用いて準備したXK16/40カラムに装填した。種々の工程の勾配を使用して、不純物を排除した。
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+0mM NaCl:1容量
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+50mM NaCl:3容量
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+100mM NaCl:3容量
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+225mM NaCl:5容量
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+300mM NaCl:5容量
- 40mMトリス緩衝液(pH8.5)+1000mM NaCl:3容量
最後に、1:1のFSH:LH比を必要とするHMG-UPを生成するために、両ホルモンの含有量を調整するバランス工程を行った。画分J2からのFSH生物活性と画分J3-UPからのLH生物活性を同等量で混合した。混合溶液を、滅菌濾過し、ナノ濾過し、沈殿させた。
尿中HMG-HPは、夾雑物として非ゴナドトロピンタンパク質を依然として含有する。
Claims (4)
- 非ゴナドトロピン夾雑物、例えば、血漿セリンプロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンを含まないHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得るための方法であって、
ゴナドトロピン組成物を以下の工程:
i)マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体を使用して、pHは一定であるが伝導率を変更する緩衝液で溶出させて、夾雑している前記ゴナドトロピンを精製して、LH生物活性のみを有する画分J3-UPを得る工程と、
ii)画分J2からのFSH生物活性を得られた画分J3-UPからのLH生物活性と同等量で混合することによるバランス工程において画分HMG-UPを得る工程と、
iii)前記画分HMG-UPを、
1)滅菌濾過工程、
2)ナノ濾過工程、及び
3)沈殿工程
に供することによって、非ゴナドトロピン夾雑物、例えば、プロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンを含まないHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得る工程と
に供する、方法。 - 画分HMG-UPをヒト閉経期/閉経後尿から得ることを特徴とする、請求項1に記載の、非ゴナドトロピン夾雑物、例えば、血漿セリンプロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンの除去によるHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得るための方法。
- i)酸性化されたヒト閉経期/閉経後尿をカオリンを用いて処理する工程であって、尿中に存在するゴナドトロピン及び非ゴナドトロピンタンパク質をカオリンに吸着させる、工程と、
ii)カオリンに吸着された、別個のゴナドトロピンを、アルカリ溶出によって1つの画分に溶出させる工程と、
iii)前記画分をアセトンで沈殿させて、画分Aを得る工程と、
iv)酢酸アンモニウムのエタノール(70%)中10%w/v溶液でこの沈殿画分Aから生物活性画分を抽出し、酢酸アンモニウムのエタノール(90%)中10%溶液で沈殿させて、画分Bを得る工程と、
v)イオン交換クロマトグラフィーによって画分Bを精製して、画分C(HMG原材料又は同等物)を得る工程と、
vi)強陽イオン樹脂を使用して酢酸アンモニウムで溶出させる陽イオン交換クロマトグラフィーによって、画分Cを精製する工程と、
vii)前記工程で得られた溶出物から、酸性媒体中での沈殿によって画分Fを得る工程と、
viii)強陰イオン樹脂を使用して酢酸アンモニウムで溶出させる陰イオン交換クロマトグラフィーによって画分Fを精製して、画分Gを得る工程と、
ix)疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、漸減濃度の硫酸アンモニウムを含有する緩衝液の逐次添加によって、画分G中の得られたゴナドトロピンを精製して、画分J2及びJ3を得る工程であり、画分2が主にFSH生物活性を有し、画分J3がLH生物活性を有する工程と、
x)マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体を使用して、pHは一定であるが伝導率を変更する緩衝液で溶出させて、画分J3のゴナドトロピンを精製して、LH生物活性のみを有する画分J3-UPを得る工程と、
xi)画分J2中のFSH生物活性と画分J3-UP中のLH生物活性を同等量で混合することによるバランス工程において画分HMG-UPを得る工程と、
xii)前記画分HMG-UPの溶液を、
1)滅菌濾過工程、
2)ナノ濾過工程、及び
3)沈殿工程
に供することによって、非ゴナドトロピン夾雑物、例えば、プロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンを含まないHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得る工程と
を含むことを特徴とする、請求項2に記載の、非ゴナドトロピン夾雑物、例えば、血漿セリンプロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンの除去によるHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得るための方法。 - HMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得るための方法であって、画分J2を、マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体を使用して、pHは一定であるが伝導率を変更する緩衝液で溶出させるゴナドトロピンの追加の精製工程に供して、FSH生物活性のみを有する画分を得、それをバランス工程に供することが可能であることを特徴とする、方法。
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