PL206158B1 - Sposób otrzymywania oczyszczonych, rekombinowanych wariantów alergenu Bet v 1 - Google Patents
Sposób otrzymywania oczyszczonych, rekombinowanych wariantów alergenu Bet v 1Info
- Publication number
- PL206158B1 PL206158B1 PL359713A PL35971301A PL206158B1 PL 206158 B1 PL206158 B1 PL 206158B1 PL 359713 A PL359713 A PL 359713A PL 35971301 A PL35971301 A PL 35971301A PL 206158 B1 PL206158 B1 PL 206158B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- purification
- protein
- recombinant
- solution
- chromatographic
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims abstract description 50
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 26
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 90
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 24
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 23
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 239000013638 trimer Substances 0.000 claims description 6
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 5
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 235000019846 buffering salt Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 39
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 16
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 15
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 15
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013575 birch pollen allergen Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010010744 Conjunctivitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000013567 aeroallergen Substances 0.000 description 1
- 239000013572 airborne allergen Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002205 allergic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000024998 atopic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000013574 grass pollen allergen Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003112 potassium compounds Chemical class 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu rozpuszczania i oczyszczania rekombinowanych białek, które są powielane w bakteryjnych komórkach gospodarza, i odkładają się w postaci nierozpuszczalnych agregatów - form inkluzyjnych (ang. inclusion bodies). Oczyszczanie opiera się na doprowadzeniu wymienionych form inkluzyjnych do postaci rozpuszczalnych z zastosowaniem organicznych odczynników denaturujących oraz chromatografii. W tym celu dobiera się nieorganiczne, zasadowe, zawierające sól eluenty (fazy ruchome), które po oczyszczeniu umożliwiają otrzymanie rekombinowanego białka po neutralizacji w formie tolerowanej fizjologicznie, które można bezpośrednio stosować w medycynie. Sposób jest szczególnie odpowiedni do wariantów alergenu Bet v 1.
Sposób według wynalazku prowadzi się w warunkach, które odpowiadają wymogom obowiązującym przy otrzymywaniu farmaceutyków (GMP). Środki biologicznie aktywne bezpośrednio po rozpuszczeniu mogą być stosowane w postaci preparatów pozajelitowych. Odpowiednie rekombinowane alergeny lub alergeny modyfikowane, otrzymane sposobem według wynalazku, mogą więc znaleźć zastosowanie w ulepszonej terapii jak i w diagnostyce chorób alergicznych.
Powszechnym problemem występującym podczas otrzymywania rekombinowanych białek w bakteryjnych lub prokariotycznych komórkach gospodarza, jak na przykład E. coli jest fakt, że otrzymane, powielone białko nie wykazuje odpowiedniej struktury fałdowania - właściwej dla formy natywnej, która jest niezbędna dla uzyskania maksymalnej aktywności biologicznej. Niewłaściwa struktura fałdowania często prowadzi do tego, że szereg białek w środowisku, w którym zachodzi powielanie, występuje w postaci nierozpuszczalnej, względnie odkłada się w postaci agregatów, znanych z literatury fachowej jako formy inkluzyjne. Tworzenie wspomnianych form inkluzyjnych wywiera niekorzystny wpływ na rozpuszczalność i możliwości oczyszczania powielanego rekombinowanego białka (Marston et al., 1986, Biochem J. 240: 1-12).
Aby oczyścić zgromadzone w komórkach bakterii rekombinowane białko, często dodaje się do eluentu substancje denaturujące, jak na przykład mocznik lub chlorowodorek guanidyny. Dodatki te jednak nie mogą być stosowane w przypadku niektórych rodzajów chromatografii, na przykład w interaktywnej chromatografii hydrofobowej (ang. interaction hydrophobe chromatography). Ponadto rekombinowane białka mogą ulec niekorzystnym przemianom w reakcjach chemicznych, na przykład wskutek kontaktu z cyjanianem, który może powstawać w roztworach mocznika. Usunięcie środka denaturującego poprzez dializę, diafiltrację lub filtrację żelową umożliwia renaturację, czego dokonuje się na drodze dializy, diafiltracji lub filtracji żelowej. Procesy te są nie tylko długotrwałe lecz prowadzą często do ponownego wytrącania się produktów (białek). Przeprowadzenie analitycznego dowodu zupełnego usunięcia wyżej wymienionych środków denaturujących z końcowego produktu jest trudne. Przedstawiona powyżej problematyka nabiera szczególnego znaczenia w przypadku otrzymywania i oczyszczania rekombinowanych alergenów i alergenów modyfikowanych.
W ostatnich kilkunastu latach, w skali światowej dramatycznie wzrosła liczba przypadków alergii typu 1. Do 20% ludności krajów uprzemysłowionych cierpi na dolegliwości związane z alergicznym nieżytem nosa (rhinitis), zapaleniem spojówek lub astmą oskrzelową. Alergie te wywoływane są przez alergeny znajdujące się w powietrzu (aeroalergeny), które uwalniane są z różnych źródeł, takich jak: pyłki roślinne, roztocza, sierść ssaków (koty, psy, konie) oraz pleśnie. Alergie o ostrym przebiegu mogą być także wywoływane przez użądlenia owadów, takich jak pszczoły i osy.
W przypadku substancji powodujących alergie typu 1 chodzi o białka, glikoproteiny lub polipeptydy. Alergeny te po wniknięciu do organizmu przez błony śluzowe lub po ukąszeniu reagują na powierzchni komórek tucznych z przeciwciałami-lgE (ang. ImmunglobulinE), wywołując u osób uczulonych reakcję alergiczną. W przypadku kiedy alergen zwiąże dwa lub większą ilość przeciwciał-lgE, wówczas komórki efektorowe uwalniają gwałtownie mediatory (na przykład histaminę lub prostaglandyny) oraz cytokiny, co prowadzi do powstawania klinicznych symptomów alergii. Za pomocą sekwencji c-DNA możliwe jest otrzymanie rekombinowanych alergenów, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce i terapii (Scheiner i Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391). Rekombinowane alergeny mogą mieć szczególne znaczenie w przypadku metod diagnostycznych. W porównaniu z klasycznymi ekstraktami, umożliwiają one identyfikację indywidualnych widm uczuleniowych IgE.
Ponadto możliwe jest przeprowadzenie celowej modyfikacji genetycznej rekombinowanych alergenów, umożliwiającej uzyskanie obniżonej aktywności alergicznej przy niezmienionej aktywności względem regulatorowych komórek pomocniczych T (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162 (4), 2406-2414; Valenta et al., 1999, Biol. Chem. 380: 815-24; Singh et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 119: 75-85).
PL 206 158 B1
W przyszł o ś ci szczególnie obiecują cymi w aspekcie specyficznej immunoterapii alergii typu 1 są takie właśnie alergeny modyfikowane. Wynalazek dotyczy w szczególności wspomnianych alergenów modyfikowanych.
Wobec powyższej współzależności, szczególnego znaczenia nabiera otrzymywanie rekombinowanych alergenów oraz alergenów modyfikowanych w powszechnie używanych bakteryjnych procesach powielania. Układy te, w porównaniu z układami eukariotycznymi posiadają istotną zaletę polegającą na tym, że już po krótkim czasie powielania można uzyskać wysokie wydajności produktu. Ponadto z farmakologicznego punktu widzenia ich zastosowanie pozbawione jest ryzyka zanieczyszczenia produktu wirusami i onkogenami. Jednakże w przypadku rekombinacyjnego sposobu otrzymywania, w bakteryjnych procesach powielania, główne alergeny, pochodzące z różnych źródeł, jak na przykład alergeny pyłków traw grupy 1 (Vrtala et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97: 781-7) oraz 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332), alergeny roztocza Der f2 (Iwamoto et al., 1996, Int. Arch. Allergy Immunol. 109: 356-61), jak również trujące alergeny owadów fosfolipaza A2 oraz hialuronidaza (Soldatova et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 101: 691-8; Kuchler et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184: 249-254), gromadzą się w komórkach gospodarza jako formy inkluzyjne. Również alergeny modyfikowane, jak na przykład fragmenty i multimery głównego alergenu pyłku brzozy Bet v 1 (fragment A, fragment B, Bet v 1 - trimer) zachowują się w podobny sposób, chociaż nie modyfikowany rekombinowany alergen Bet v 1 jest rozpuszczalny (Hoffmann-Sommergruber et al., 1997, Prot. Expr. Purific. 9: 233-39; van Hage-Hamsten et al., 1999, J. Allergy Clin. Immunol. 104: 969-7).
Celem wynalazku było opracowanie sposobu, który umożliwiałby oczyszczanie opisanych wcześniej białek rekombinowanych występujących w formie inkluzyjnej, w szczególności alergenów, względnie białek o działaniu alergicznym, w sposób możliwie najprostszy i zachowujący ich pełną aktywność, unikając wymienionych trudności, znanych z dotychczasowego stanu techniki.
Ponadto celem wynalazku było opracowanie techniki otrzymywania białek takim sposobem, aby podczas oczyszczania, a szczególnie pod koniec oczyszczania otrzymać białko w takiej postaci, która umożliwia jego bezpośrednie stosowanie, w lecznictwie lub diagnostyce, bez dalszej obróbki.
Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania następujących oczyszczonych, rekombinowanych wariantów alergenu Bet v 1:
- trimer,
- fragment A (aminokwas 1-74),
- fragment B (aminokwas 75-164), z form inkluzyjnych uzyskanych w procesie powielania bakteryjnego, które są nierozpuszczalne w ośrodku powielania, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
(i) roztworzenia oddzielonych nierozpuszczalnych form inkluzyjnych w organicznych odczynnikach denaturujących, (ii) oczyszczenia roztworu otrzymanego w etapie (i) za pomocą co najmniej jednego etapu chromatografii z zastosowaniem zasadniczo nieorganicznych niebuforowych eluentów alkalicznych zawierających sól, które są kluczowe dla otrzymania czystego białka, oraz (iii) neutralizacji alkalicznego roztworu otrzymanego po końcowym etapie oczyszczania, który zawiera rozpuszczone, zrenaturowane i biologicznie aktywne białko.
Dzięki temu rekombinowane białko dzięki szybkiej neutralizacji po końcowym etapie oczyszczania, pozostaje w roztworze, co prowadzi do uzyskania środowiska fizjologicznego.
Sposób według wynalazku jest w szczególności optymalny dla otrzymywania rekombinowanych wariantów głównego alergenu pyłku brzozy Bet v 1. Sposób ten jest dla tych pierwotnych produktów powielania ogólnym sposobem otrzymywania. Sposób według wynalazku może także służyć do oczyszczania, renaturowania oraz preparowania pierwotnych alergenów oraz alergenów modyfikowanych innego pochodzenia, które po powieleniu występują w formach zainkludowanych.
Termin „alergeny modyfikowane” lub „warianty alergenów” należy według wynalazku rozumieć jako fragmenty, multimery, jak na przykład dimery, trimery, jak również zmodyfikowane pierwotne alergeny lub ich fragmenty/multimery. Ostatnie z wymienionych należy, według wynalazku, rozumieć jako wstawienia (insercje), braki (wycięcia) lub podstawienia pojedynczych aminokwasów lub większej liczby aminokwasów w łańcuchach polipeptydowych.
Korzystne jest stosowanie modyfikowanych alergenów rekombinowanych, nie występujących w przyrodzie, które nie posiadają lub posiadają obniż oną aktywność wzglę dem IgE, i jednocześ nie zachowują swoją aktywność względem komórek T.
PL 206 158 B1
Rekombinowane alergeny i alergeny modyfikowane otrzymane sposobem według wynalazku nadają się szczególnie do zastosowań w immunoterapii specyficznej i diagnostyce chorób alergicznych.
W celu oczyszczenia, pierwotnie otrzymane nierozpuszczalne agregaty bia ł ek poddaje się denaturacji za pomocą znanych odczynników denaturujących, co powoduje ich rozpuszczenie. Korzystnie stosuje się roztwory mocznika o stężeniach w zakresie od 5-10 M, szczególnie korzystnie stężenie wynosi 8 M. Alternatywnie stosować można także inne odczynniki na przykład stężone roztwory zasady sodowej lub potasowej (0,2 M do 1 M) lub wcześniej wspomniany chlorowodorek guanidyny.
W nastę pnym etapie nanosi się rozpuszczone, zdenaturowane biał ko na odpowiednie wypeł nienie chromatograficzne (fazę stacjonarną). Szczególnie korzystnymi do tego celu są wymieniacze jonowe, a zwłaszcza anionity.
Charakterystyczne dla wynalazku jest zastosowanie nieorganicznych, niebuforowych, alkalicznych roztworów zawierających sól, jako eluentów. Odpowiednimi eluentami są roztwory, na przykład NaOH lub KOH w połączeniu z NaCI lub KCI. Korzystne są jednak roztwory zawierające wodorowęglany sodu lub potasu, jako odczynniki obniżające pH. Korzystne eluenty zawierają NaOH, NaCI lub NaOH, NaCI oraz NaHCO3. Alkaliczne, wodne roztwory (eluenty) cechują się według wynalazku zawartością NaOH względnie KOH od 5 mM do 50 mM (mol/L), korzystne są roztwory 15-25 mM, a szczególnie korzystne stężenie to 20 mM. W początkowym etapie chromatografii utrzymuje się stosunkowo niskie stężenie soli (na przykład NaCI), tak że białko ulega mocnemu związaniu z wymieniaczem jonowym. Początkowe stężenie soli, według wynalazku, zawiera się w granicach między 5-50 mM, korzystne są stężenia pomiędzy 15 a 30 mM, a szczególnie korzystne stężenie wynosi 20 mM. Na tym etapie oczyszczania usuwa się środek denaturujący jak również zanieczyszczenia, które nie wiążą się wystarczająco silnie z wypełnieniem chromatograficznym. Jeśli stosuje się dodatek NaHCO3, to jego stężenie mieści się w granicach od 5 do 15 mM, a optymalne stężenie wynosi 11 mM.
Odczynnik denaturujący usuwa się korzystnie z roztworu denaturującego poprzez wiązanie rozpuszczonego białka rekombinowanego do materiału chromatograficznego i zastępowanie roztworu denaturującego odpowiednim nieorganicznym, niebuforowym eluentem o odczynie alkalicznym, zawierającym sól o stężeniu zapewniającym dobre wiązanie białka z materiałem chromatograficznym.
Według wynalazku, w celu wyeluowania (żargon: wymycia z kolumny), związanego z fazą stacjonarną rekombinowanego białka, przy zachowaniu niezmienionych pozostałych warunków chromatografii, stosuje się gradient stężenia soli (NaCI lub KCI). Korzystne jest stosowanie liniowego gradientu pomiędzy wartością początkową stężenia wynoszącą ok. 20 mM NaCI (KCI), a wartością końcową stężenia soli równą 0,1 M NaCI. W ten sposób otrzymuje się pożądane białko, pozbywając się pozostałych zanieczyszczeń takich jak na przykład inne białka. Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób uwalniania, związanego z chromatograficzną fazą stacjonarną, rekombinowanego białka, od zanieczyszczeń, zwiększając stężenie soli w eluencie. Dokonuje się tego stosując odpowiedni gradient stężenia soli.
W niektórych przypadkach można bezpośrednio otrzymać pożądaną czystość białka, bez stosowania żadnych dodatkowych etapów oczyszczania. W takich przypadkach otrzymuje się od razu białko w formie aktywnej, odpowiedniej do użycia, z wyłączeniem wspomnianego (opisanego dokładniej) etapu neutralizacji.
W przeciwnym przypadku (to znaczy jeśli nie uzyska się od razu wymaganej czystości białka w pierwszym etapie), według wynalazku, przeprowadza się chromatografię ponownie. Zastosowanie znajdują wszelkie typowe metody chromatograficzne.
W szczególnoś ci należ y się tutaj kierować wł asnoś ciami fizykochemicznymi konkretnego biał ka podlegającego oczyszczaniu. W przypadku alergenów i alergenów modyfikowanych typu Bet v 1, właściwe jest stosowanie interaktywnej chromatografii hydrofobowej. Alternatywnie można stosować technikę filtracji żelowej.
Według wynalazku odpowiedni do tego celu jest proces trójetapowy, który obejmuje zastosowanie: wymieniacza jonowego, interaktywnej chromatografii hydrofobowej oraz filtracji żelowej, w wymienionym porządku. Nie stanowi to jednak żadnego ograniczenia sposobu według wynalazku.
W zwią zku z tym, przedmiotem wynalazku jest również sposób wymagający co najmniej jednego dalszego etapu chromatografii, odpowiednio interaktywnej chromatografii hydrofobowej i/lub filtracji żelowej.
Charakterystyczne dla wynalazku jest przeprowadzanie wszystkich etapów oczyszczania przy takich jakościowych i ilościowych składach eluentów, jakie zostały podane w niniejszym opisie. Dotyczy to NaOH, NaCI, a szczególnie NaHCO3, jak również odpowiednich związków potasu. Jedynie
PL 206 158 B1 stężenie soli kuchennej może być zmieniane na poszczególnych etapach. Przykładowo: używając interaktywnej chromatografii hydrofobowej, stosuje się odwrotny gradient stężenia NaCI (KCI), wychodząc od wyższego stężenia początkowego (1-3 M, korzystnie 2 M) i przechodząc do niższego stężenia końcowego (30-10 mM, korzystnie 20 mM).
Korzystne stężenie soli w roztworze produktu końcowego, uzyskuje się stosując odpowiednie stężenie soli na ostatnim etapie oczyszczania. Stężenie to (soli w roztworze produktu końcowego), według wynalazku powinno być fizjologicznie tolerowane. Na przykład jeśli filtracja żelowa stanowi ostatni etap, odpowiedniego trójstopniowego procesu oczyszczania, to stosuje się około 150 mM roztwór NaCI. Ponadto pożądane stężenie końcowe soli (w roztworze produktu), po ostatnim etapie, można osiągnąć przez rozcieńczenie lub dodanie soli, przy czym jest to również uzależnione od docelowej ilości białka jaka ma być uzyskana po chromatografii.
Po ostatnim etapie oczyszczania, którym w korzystnej wersji sposobu według wynalazku jest filtracja żelowa, następuje neutralizacja roztworu, względnie renaturacja białka przez dodatek rozcieńczonego kwasu. Szczególnie korzystny jest HCI, przy czym ustala się wartość pH pomiędzy 6,5 a 8,0. Roztwór zawierający aktywne rekombinowane białko może być od tego momentu, względnie po skorygowaniu stężenia soli (na przykład Na+) i białka, stosowany bezpośrednio jako gotowy preparat.
Korzystne jest, aby po oczyszczaniu prowadzić neutralizacje w zakresie pH między 6,5 a 8,0, stosując rozcieńczone kwasy, korzystnie rozcieńczony HCI.
Poniżej bardziej szczegółowo opisano sposób według wynalazku, na przykładzie otrzymywania modyfikowanych alergenów głównego alergenu pyłku brzozy - Bet v 1, mianowicie rekombinowanego fragmentu A (aminokwas 1-74) i B (aminokwas 75-164), jak również rekombinowanego trimeru.
W celu oczyszczenia, pierwotne nierozpuszczalne agregaty denaturuje się mocznikiem, odpowiedni jest 8 M roztwór. Alternatywnie można stosować na przykład 0,2 M ług sodowy.
Pierwszy etap oczyszczania chromatograficznego realizuje się na anionicie, na przykład Source Q. Podczas tego procesu alergeny lub alergeny modyfikowane zostają związane z nośnikiem (fazą stacjonarną - wypełnieniem kolumny) i roztwór denaturujący zostaje zastąpiony eluentem. Alkaliczny eluent powoduje, że białko pozostaje w roztworze. Następnie elucja (wymywanie) z gradientem NaCI prowadzi do częściowego oddzielenia zanieczyszczeń bakteryjnych i fragmentów biologicznie aktywnych.
Wstępnie oczyszczone i znajdujące się w stanie równowagi alergeny lub alergeny modyfikowane, zostają uwolnione od pozostałych zanieczyszczeń bakteryjnych podczas dwóch dalszych etapów oczyszczania - interaktywnej chromatografii hydrofobowej oraz filtracji żelowej. W tym przypadku używa się generalnie tych samych eluentów, skomponowanych z niskomolowej zasady i soli o zmiennym stężeniu. Przedmiotem wynalazku jest więc specjalny system eluentów umożliwiający skuteczne oczyszczanie białka. Działanie eluentu polega na tym, że białko podczas oczyszczania utrzymuje się w niewielkim stężeniu w roztworze (to znaczy nie nastę puje wytrą canie biał ka, a jego stężenie jest na tyle wysokie, że umożliwia oczyszczanie chromatograficzne).
Sposób według wynalazku, charakteryzuje się tym, że po ostatnim etapie chromatografii otrzymuje się oczyszczone rekombinowane białka w postaci rozpuszczalnej lub renaturuje poprzez prostą neutralizację zasady obecnej w eluencie za pomocą odpowiedniego kwasu. Przy właściwym doborze stężeń składników eluentu otrzymuje się roztwór fizjologiczny, odpowiedni do stosowania w postaci preparatów pozajelitowych. Oczyszczone rekombinowane alergeny lub alergeny modyfikowane identyfikuje się na podstawie pomiarów ich znanych cech fizycznych, chemicznych, immunologicznych lub biologicznych, w szczególności w oparciu o pomiar punktu izoelektrycznego, SDS-PAGE oraz specyficzne przeciwciała monoklonalne, jak również przeciwciała IgE u alergików. Kontrolę rozpuszczalników prowadzi się przez pomiar wartości pH roztworu oraz oznaczenie stężenia Na+ i Cl-, a w odpowiednich przypadkach CO32-. Odpowiednie metody są ogólnie znane i opisane. Wydajności oczyszczonych według wynalazku, rekombinowanych alergenów lub alergenów modyfikowanych, otrzymanych w formie roztworu, zawierają się w granicach 75-95% w stosunku do pierwotnego wyjściowego białka.
Otrzymane w ten sposób komponenty alergenów mogą być stosowane w diagnostyce in vivo oraz in vitro w ramach rozdzielczej identyfikacji komponentów alergenów w widmach uczuleniowych specyficznych dla danego pacjenta, jak również w specyficznej immunoterapii alergii.
Ponadto poprzez wydzielenie (izolację lub chemiczną przemianę) oczyszczonego rekombinowanego białka, można otrzymywać preparaty farmaceutyczne o przedłużonym działaniu.
PL 206 158 B1
Tabela 1 przedstawia schematycznie optymalną realizację sposobu, według wynalazku:
T a b e l a 1
Wydzielenie (separacja) form inkluzyjnych Denaturowanie na przykład 8 M roztworem mocznika Chromatografia na anionicie, na przykład Source Q roztwór A: 20 mM NaOH, 20 mM NaCI, 11 mM NaHCO3 roztwór B: 20 mM NaOH, 0,5 M NaCI, 11 mM NaHCO3 (opcjonalnie) interaktywna chromatografia hydrofobowa, na przykład Source PHE roztwór A: 20 mM NaOH, 2 M NaCI, 11 mM NaHCO3 roztwór B: 20 mM NaOH (opcjonalnie) filtracja żelowa, na przykład Superdex 75 roztwór A: 10 mM NaOH, 11 mM NaHCO3,
148,4 mM NaCI renaturacja / formulacja docelowe białko w 10 mM NaOH, 148,4 mM NaCI, 11 mM NaHCO3 + dodatek 100 mM HCI po 10 mM = rozpuszczalne białko docelowe w roztworze 0,154 M Na+
Podsumowując można stwierdzić że, wynalazek, dzięki przedstawionej metodologii (która obejmuje: specjalne zestawienie składu eluentów chromatograficznych, wybór mediów chromatograficznych, jak również określone wartości pH i stężeń soli), stwarza technologiczne i farmakologiczne możliwości prowadzenia produkcji rozpuszczalnych alergenów rekombinowanych i alergenów modyfikowanych o wysokiej czystości, z otrzymywanych pierwotnie nierozpuszczalnych agregatów, przy niewielkim nakładzie pracy oraz czasu. Ponieważ warunki, w których oczyszcza się i renaturuje, względnie rozpuszcza rekombinowane białko, są lepsze i farmakologicznie korzystniejsze w porównaniu ze znanymi sposobami, to otrzymywane substancje czynne mogą być stosowane w diagnostyce chorób alergicznych, a w postaci preparatów pozajelitowych również w terapii.
P r z y k ł a d
Otrzymywanie rozpuszczalnych wariantów alergenów Bet v 1 (aktywne terapeutycznie alergeny modyfikowane rekombinowanego alergenu Bet v 1, fragment
A i B oraz trimer Bet v 1)
Standardowo oczyszczone formy inkluzyjne alergenów modyfikowanych, denaturuje się optymalnie 8 M roztworem mocznika, 20 mM Tris/HCI. Po pełnej denaturacji przeprowadza się filtrację na sączkach (filtrach) o porowatości 0,22-0,45 μm, lub wykonuje odpowiednie 5-15 min odwirowanie przy 10000-20000 x g. Klarowny roztwór poddaje się chromatografii na wymieniaczu jonowym Source 15Q. (Pharmacia), doprowadzonym do równowagi roztworem alkalicznym o składzie: 20 mM NaOH, 11 mM NaHCO3, 20 mM NaCI. Materiał wypełnienia musi być stabilny przy wartości pH 12,0. Działanie wyjściowego roztworu o stosunkowo wysokim pH polega na tym, że prawie wszystkie białka ulegają związaniu z anionitem. Wyjątek stanowią rzadkie białka, których punkt izoelektryczny leży powyżej 11,0. Roztwór denaturujący (na przykład 8 M mocznik) oraz farmakologicznie niepożądane bufory (na przykład Tris) eliminuje się przemywając zaadsorbowane białko. Technika ta pozwala, przy zachowaniu rozpuszczalności rekombinowanych białek, na przejście do kolejnego rozpuszczalnika, umożliwiającego przeprowadzenie następnych etapów izolacji (separacji). Następnie prowadzi się elucję rosnącym gradientem NaCI, na przykład od 20 mM NaOH, 11 mM NaHCO3 20 mM NaCI do 20 mM NaOH, 11 mM NaHCO3, 0,5 M NaCI, usuwając zanieczyszczenia (białka komórek gospodarza) i fragmenty substancji czynnych.
Następny etap chromatografii stanowi interaktywna chromatografia hydrofobowa (tylko dla fragmentów). Stosuje się eluat z etapu 1 z wysokomolowym roztworem soli, na przykład 5 M NaCI oraz 20 mM NaOH, 11 mM NaHCO3, wiążący docelowe białko. Eluowanie związanego docelowego białka prowadzi się alkalicznym roztworem o niskiej lub zerowej zawartości soli, na przykład 20 mM NaOH. Stosowane wypełnienie do interaktywnej chromatografii hydrofobowej musi być stabilne do pH 12, na przykład Source PHE.
Jako trzeci etap prowadzi się filtrację żelową w warunkach alkalicznych, na przykład Superdex 75. Eluent komponuje się tak, aby zneutralizować zasadę, uzyskując pożądany skład finalny na przykład 10 mM NaOH, 11 mM NaHCO3 oraz 148,4 mM NaCI.
Końcowy eluat filtracji żelowej neutralizuje się kwasem, uzyskując z jednej strony neutralne pH, które powoduje przejście białka do postaci rozpuszczalnej lub jego renauturację, a z drugiej strony poprzez
PL 206 158 B1 neutralizację uzyskuje się pożądane stężenie soli. Przykładowo z roztworu: 10 mM NaOH, 11 mM NaHCO3 oraz 148,4 mM NaCI, otrzymuje się roztwór fizjologiczny dodając 100 mM HCI w stosunku 1/10 (obj. / obj.). Stężenia kontroluje się wykonując zwykłe pomiary wartości pH oraz pomiar stężenia Na+. Opisany sposób sprowadza się więc do minimalnej obróbki próbek, krótkiego czasu ich przetrzymywania, zastosowania wyłącznie substancji kompatybilnych farmakologicznie, zgodności eluentu z różnymi typami podziałów chromatograficznych oraz pominięciem czasochłonnych procesów jak dializy. Zastosowanie zasady sodowej wyklucza ponadto degradację lub zanieczyszczenie obrabianego białka przez mikroorganizmy, jak również eliminuje lub skutecznie degraduje endotoksyny mogące sprawiać utrudnienia wynikające z powielania bakteryjnego. Kolejność oraz liczba opisanych powyżej etapów chromatograficznych może ulegać zmianie, w zależności od specyficznych cech fizykochemicznych docelowego białka. Spis stosowanych roztworów znajduje się w Tabeli 2.
Neutralizacja /rozpuszczanie po filtracji żelowej
- powolne dodawanie 100 mM HCI w stosunku 1/10 obj. (w odniesieniu do odbieralnika) na przykład w 100 ml wyjściowego roztworu zawarte jest:
mM NaOH, 148,4 mM NaCI, 11 mM NaHCO3 po neutralizacji 110 ml:
mM NaHCO3 * 10/11 = 10 mM NaHCO3 10 mM NaOH/HCI (NaCI) * 10/11 = 9,1 mM NaCI 148,4 mM NaCI * 10/11 = 134,9 mM NaCI
Gotowy roztwór składa się więc z 154 mM Na+, 144 mM Cl-, 10 mM CO3-, (licząc CO32- i HCO3 razem)
T a b e l a 2
Roztwory do rozdziałów chromatograficznych wariantów Bet v 1
| Chromatog./białko | Próbka | Roztwór A | Roztwór B | Gradient |
| AlEX (wymiana jonowa) | ||||
| Fragment 1 | 8 M mocznik, 20 mM Tris/HCI pH 8 | 20 mM NaOH, 10 mM NaCI, 11 mM NaHCO3 | 20 mM NaOH, 500 mM NaCI, 11 mM NaHCO3 | 10 CV |
| Fragment 2 | j.w. | j.w. | j.w. | j.w. |
| Trymer | j.w. | j.w. | 20 mM NaOH, 800 mM NaCI, 11 mM NaHCO3 | j.w. |
| HIC (chromatografia z oddziaływaniem hydrofobowym) | ||||
| Fragment 1 | AIEX pula ustalona na 2M NaCI | 20 mM NaOH, 2 M NaCI, 11 mM NaHCO3 | 20 mM NaOH | 10 CV |
| Fragment 2 | AIEX pula ustalona na 3M NaCI | 20 mM NaOH, 3 M NaCI, 11 mM NaHCO3 | 20 mM NaOH | 10 CV |
| Trymer | - | - | - | - |
| Filtracja żelowa | ||||
| Fragment 1 | pula HIC | 10 mM NaOH, 148,4 mM NaCI, 11 mM NaHCO3 | ||
| Fragment 2 | j.w. | j.w. | - | - |
| Trymer | pula Q | j.w. | - | - |
Zebrane roztwory oraz frakcje przechowuje się w temp. pokojowej (CV = objętość kolumny).
Claims (12)
1. Sposób otrzymywania następujących oczyszczonych, rekombinowanych wariantów alergenu Bet v 1:
- trimer,
- fragment A (aminokwas 1-74),
- fragment B (aminokwas 75-164), z form inkluzyjnych uzyskanych w procesie powielania bakteryjnego, które są nierozpuszczalne w ośrodku powielania, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
(i) roztworzenia oddzielonych nierozpuszczalnych form inkluzyjnych w organicznych odczynnikach denaturujących, (ii) oczyszczenia roztworu otrzymanego w etapie (i) za pomocą co najmniej jednego etapu chromatografii z zastosowaniem zasadniczo nieorganicznych niebuforowych eluentów alkalicznych zawierających sól, oraz (iii) neutralizacji alkalicznego roztworu otrzymanego po końcowym etapie oczyszczania, który zawiera rozpuszczone, zrenaturowane i biologicznie aktywne białko.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpoznano rekombinowane warianty nie posiadają lub posiadają obniżoną aktywność względem IgE, i jednocześnie zachowują swoją aktywność względem komórek T.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ż e jako odczynnik denaturujący stosuje się mocznik lub chlorowodorek guanidyny.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że odczynnik denaturujący usuwa się z roztworu denaturującego poprzez wiązanie rozpuszczonego białka rekombinowanego do materiału chromatograficznego i zastępowanie roztworu denaturującego odpowiednim nieorganicznym, niebuforowym eluentem o odczynie alkalicznym, zawierającym sól o stężeniu zapewniającym dobre wiązanie białka z materiałem chromatograficznym.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że związane rekombinowane białko eluuje się zwiększając stężenie soli i pozbawia zanieczyszczeń w tym procesie.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że zwiększenie stężenia soli osiąga się za pomocą gradientu.
7. Sposób według zastrz. 4 albo 5, albo 6, znamienny tym, ż e jako materiał chromatograficzny stosuje się wymieniacz anionowy.
8. Sposób według zastrz. 4 albo 5, albo 6, albo 7, znamienny tym, ż e przeprowadza się co najmniej jeden dalszy etap oczyszczania chromatograficznego.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako dalszy etap oczyszczania chromatograficznego przeprowadza się interaktywną chromatografię hydrofobową i/lub filtrację żelową.
10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, znamienny tym, że jako eluent chromatograficzny stosuje się NaOH, NaHCO3 oraz NaCI.
11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że neutralizację przeprowadza się w zakresie wartości pH między 6,5 do 8,0 po oczyszczeniu.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że do neutralizacji używa się HCI.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10044360A DE10044360A1 (de) | 2000-09-08 | 2000-09-08 | Verfahren zur Aufreinigung von rekombinanten als unlösliche Aggregate exprimierte Proteinen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL359713A1 PL359713A1 (pl) | 2004-09-06 |
| PL206158B1 true PL206158B1 (pl) | 2010-07-30 |
Family
ID=7655449
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL359713A PL206158B1 (pl) | 2000-09-08 | 2001-08-18 | Sposób otrzymywania oczyszczonych, rekombinowanych wariantów alergenu Bet v 1 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6900034B2 (pl) |
| EP (1) | EP1315740B1 (pl) |
| JP (1) | JP5174312B2 (pl) |
| CN (1) | CN1468255A (pl) |
| AT (1) | ATE443712T1 (pl) |
| AU (2) | AU8769501A (pl) |
| CA (1) | CA2421438C (pl) |
| DE (2) | DE10044360A1 (pl) |
| ES (1) | ES2333939T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0303554A2 (pl) |
| PL (1) | PL206158B1 (pl) |
| PT (1) | PT1315740E (pl) |
| RU (1) | RU2299214C2 (pl) |
| WO (1) | WO2002020559A1 (pl) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL206709B1 (pl) † | 2002-02-27 | 2010-09-30 | Merck Patent Gmbh | Sposób wytwarzania i sposób obniżania aktywności IgE głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rBet v 1, główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rBet v 1uzyskiwany takim sposobem i jego zastosowanie jako leku oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca taki główny alergen |
| CA2487673C (en) * | 2003-12-02 | 2010-11-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improved method for the recombinant production and purification of protein kinases |
| RU2513948C2 (ru) * | 2008-08-08 | 2014-04-20 | Янссен Фармацевтика Нв | Антиаллергенные комбинации солей кальция и лантана |
| EP2721051B1 (en) * | 2011-06-15 | 2017-11-29 | ASIT BioTech s.a. | A method for the production of hydrolyzed allergens |
| CN104558100A (zh) * | 2015-02-04 | 2015-04-29 | 吉林农业大学 | 包涵体的预处理方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0432419T3 (da) * | 1989-12-05 | 1994-11-14 | American Cyanamid Co | Fremgangsmåde til solubilisering og naturering af somatotropiner under anvendelse af lav urinstofkoncentration |
| US5912327A (en) * | 1996-09-30 | 1999-06-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Method of purifying chemokines from inclusion bodies |
| SE9703531D0 (sv) * | 1997-09-30 | 1997-09-30 | Rudolf Valenta | Non-anaphlactic forms of allergens and their use |
-
2000
- 2000-09-08 DE DE10044360A patent/DE10044360A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-08-18 AU AU8769501A patent/AU8769501A/xx active Pending
- 2001-08-18 AU AU2001287695A patent/AU2001287695B2/en not_active Ceased
- 2001-08-18 WO PCT/EP2001/009552 patent/WO2002020559A1/de not_active Application Discontinuation
- 2001-08-18 PL PL359713A patent/PL206158B1/pl unknown
- 2001-08-18 JP JP2002525179A patent/JP5174312B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-18 RU RU2003109430/13A patent/RU2299214C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-18 AT AT01967286T patent/ATE443712T1/de active
- 2001-08-18 EP EP01967286A patent/EP1315740B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-18 PT PT01967286T patent/PT1315740E/pt unknown
- 2001-08-18 US US10/363,788 patent/US6900034B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-18 HU HU0303554A patent/HUP0303554A2/hu unknown
- 2001-08-18 ES ES01967286T patent/ES2333939T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-18 DE DE50115119T patent/DE50115119D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-18 CN CNA018153550A patent/CN1468255A/zh active Pending
- 2001-08-18 CA CA2421438A patent/CA2421438C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE443712T1 (de) | 2009-10-15 |
| DE50115119D1 (de) | 2009-11-05 |
| HUP0303554A2 (hu) | 2004-03-01 |
| AU8769501A (en) | 2002-03-22 |
| WO2002020559A1 (de) | 2002-03-14 |
| PT1315740E (pt) | 2009-12-29 |
| JP5174312B2 (ja) | 2013-04-03 |
| AU2001287695B2 (en) | 2006-10-05 |
| CA2421438C (en) | 2010-10-26 |
| EP1315740B1 (de) | 2009-09-23 |
| EP1315740A1 (de) | 2003-06-04 |
| US6900034B2 (en) | 2005-05-31 |
| JP2004508384A (ja) | 2004-03-18 |
| PL359713A1 (pl) | 2004-09-06 |
| RU2299214C2 (ru) | 2007-05-20 |
| CN1468255A (zh) | 2004-01-14 |
| CA2421438A1 (en) | 2003-03-06 |
| US20030170815A1 (en) | 2003-09-11 |
| ES2333939T3 (es) | 2010-03-03 |
| DE10044360A1 (de) | 2002-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4228154A (en) | Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography | |
| US9441021B2 (en) | Process for the preparation of hypoallergenic major birch pollen allergen rBet v 1 | |
| PL206158B1 (pl) | Sposób otrzymywania oczyszczonych, rekombinowanych wariantów alergenu Bet v 1 | |
| JP5868587B2 (ja) | オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌｐ１の変異体 | |
| Dedic et al. | Immune recognition of novel isoforms and domains of the mugwort pollen major allergen Art v 1 | |
| DE69708420T2 (de) | Herstellung von gereinigten (Poly)Peptiden | |
| JP6647220B2 (ja) | Ｈｍｇ−ｕｐ（超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン）を得るための方法及び夾雑物を含まない組成物 | |
| WO2020234742A1 (en) | Granulocyte colony stimulating factor purification | |
| JP2007277094A (ja) | 改変ダニ主要アレルゲン含有医薬組成物 | |
| Hasan et al. | Plant antimicrobial peptides in Bangladesh: sources, extraction, purification and characterization | |
| WO2019077432A1 (en) | IMPROVED PURIFICATION METHOD OF RECOMBINANT PTH (1-34) | |
| Idar et al. | Purification of IgY Anti-SARS-CoV-2-Chicken Nucleocapsid and Elimination of Its Low-temperature Storage-induced Aggregates | |
| EP0662327A1 (en) | Use of self-incompatability receptor proteins (SLG and SRK) of plants for the treatment of allergic diseases | |
| JPH06228197A (ja) | 卵黄からのγーリベチンの分画方法 | |
| TW201323436A (zh) | 自非乙醯化蛋白質分離乙醯化蛋白質 |