CN1468255A - 表达为不溶性聚集体的重组蛋白质的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表达于细菌宿主细胞中且以不溶性聚集体形式沉淀(包埋体)的重组蛋白质的溶解与纯化方法。纯化基于将所述包埋体用有机变性试剂并使用色谱法转化为可溶形式。此处选用无机的，碱性的，含盐的洗脱剂，其在纯化完成后使重组蛋白质在中和后可以成为能够直接用于医药用途且为生理学可接受的形式。该方法特别适用于纯化过敏原和过敏原片断。

Description

表达为不溶性聚集体的重组蛋白质的纯化方法
本发明涉及表达于细菌宿主细胞中且以不溶性聚集体形式沉淀(包埋体)的重组蛋白质的溶解与纯化方法。纯化基于将所述包埋体用有机变性试剂并使用色谱法转化为可溶形式。此处选用无机的，碱性的，含盐的洗脱剂，其在纯化完成后使重组蛋白质在中和后可以成为能够直接用于医药用途且为生理学可接受的形式。该方法特别适用于纯化过敏原和过敏原片断。
本发明方法在制药(GMP)必需的条件下进行。药物活性成分在溶解后作为胃肠外用药物制剂而直接使用。用本发明方法制备的优选的重组过敏原或过敏原变体既可用于改善性治疗也可用于过敏疾病的诊断。
在用细菌或原核生物宿主细胞如，例如大肠菌制备重组蛋白质时通常遇到的问题在于表达的蛋白质通常不具有为完全显示其生物活性所需的正确的或天然的折叠。不正确的折叠通常产生一系列不溶于表达介质或以聚集体形式沉淀的蛋白质，后者在科学文献中被称作“包埋体”。“包埋体”的形成对表达的重组蛋白质的纯化和获得溶解性有不利影响(Marston等，1986，Biochem J.240：1-12)。为了能够纯化沉淀于细菌中的重组蛋白质，通常在色谱洗脱剂中加入变性物质如，例如尿素或胍盐酸盐。但是，这些添加剂无法与每一个分离方法如，例如憎水作用色谱法相结合。而且，产品可能被以不利的方式通过化学反应修饰，例如被氰酸盐修饰，其可在尿素溶液中形成。变性试剂的脱除及因此可能的复性通常通过透滤，透析或胶滤完成。这些过程不仅耗时而且经常导致产品的再沉淀。对于最终产品中上述变性试剂的彻底除去的分析检测是困难的。上述问题对于重组过敏原和过敏原变体的制备和纯化特别重要。
近年来1型过敏在全球迅速增加。工业化国家中人口的20％患上了过敏性鼻炎，结膜炎或支气管哮喘，它们由空气中存在的过敏原引起(气源性致敏源)，后者具有不同来源如植物花粉，螨虫，哺乳动物(猫，狗，马)和霉菌真菌。昆虫如，例如蜜蜂和黄蜂的叮咬也会引起严重的过敏。
引起1型过敏的物质为蛋白质，糖蛋白或多肽。在通过黏膜或在叮咬被吸收后，这些过敏原与敏化人体内肥大细胞表面键联的IgE抗体反应。如果两个或多个IgE抗体彼此通过过敏原相联，将导致调节剂(例如，组胺，前列腺素)的分泌和分裂效应细胞分泌细胞分裂素并从而引起过敏症状。在cDNA序列的帮助下，可以制备可用于过敏的治疗及诊断的重组过敏原(Scheiner und Kraft，1995，Allergy 50，384-391)。重组过敏原在诊断方法中与传统析取相比具有特别的重要性，其可辩识出个体的IgE敏化谱。另外，可对重组过敏原进行特定的基因工程修改，从而可以在不改变与调控T助细胞反应性的前提下减少过敏的可能。(Schramm等，1999，J.Immunol.162(4)：2406-2414；Valenta等，1999，Biol.Chem.380：815-24；Singh等，1999，Int.Arch.Allergy Immunol.119：75-85)。这一类型的过敏原变体可能在未来用于1型过敏的特别的免疫疗法。特别地，进行了后一种修改的过敏原是本发明方法的主题。
就此而论，通常使用的细菌表达系统中制备的重组过敏原及过敏变体具有特别的重要性。与真核细胞系统相比，这些系统的优点在于只需短的表达时间即可得到高的产品收率。另外，其从药理学角度说其基本不存在病毒污染与致癌风险。但是，当其在细菌表达系统中重组制备时，来自不同来源的主过敏原如，例如1族(Vrtala等，1996，J.Allergy Clin.Immunol.97：781-7)和13族(Suck等，2000，Clin.Exp.Allergy 30：324-332)花粉过敏原，Der f2螨虫过敏原(Iwamoto等，1996，Int.Arch.Allergy Immunol.109：356-61)和磷脂酶A2与透明质酸酶昆虫毒素过敏原(Soldatova等，1998，J.Allergy Clin.Immunol.101：691-8；Kuchler等，1989，Eur.J.Biochem.184：249-254)，以包埋体的形式沉淀于宿主细胞中。过敏原变体如，例如主桦花粉过敏原Bet v1的片断或多聚体(片断A，片断B，Bet v1三聚体)的行为方式与之相同，尽管未修改的重组Bet v1过敏原为基本可溶的(Hoffmann-Sommergruber等，1997，Prot.Expr.Purific.9：233-39；van Hage-Hamsten等，1999，J.Allergy Clin.Immunol.104：969-7)。
因此本发明目的是提供可纯化“包埋体”形式的重组蛋白质，特别是过敏原，或具有过敏活性的蛋白质的方法，其以简单而有效的方式避免了上述先有技术方法的上述不足之处。而且，目的是以这样的方式分离出该蛋白质即这一分离使蛋白质在纯化过程中特别是在纯化结束时的形式可使其能够直接且不需进一步处理即可用于医药或诊断用途。
本发明为生化纯化方法，其通过有效的一至多步，优选一至三步纯化方法，使用基本非缓冲的碱性洗脱液将表达后以包埋体形式存在的重组蛋白质转化为纯态蛋白质。
本发明还是这样一种方法，其中重组蛋白质在最终纯化步骤后通过快速中和最终留在溶液中。同时，由此生成一生理学介质。
本方法特别优选用于制备重组过敏原和过敏原变体。本方法代表了这些初级表达产品通常的应用。来自其他来源的初级表达为包埋体的过敏原和过敏原变体可通过本方法得以纯化，复性并复配。
为了本发明的目的，术语过敏原变体指原始过敏原或其片断/聚集体的片断，聚集体如，例如二聚体或三聚体及修改物。为了本发明的目的，后者可插入，删除或取代一个或多个氨基酸。
优选使用非天然存在且无IgE活性或IgE活性降低了的，但保存了T细胞活性的重组过敏原变体。本方法特别适用于分离主桦花粉过敏原Bet v1的过敏原变体，即重组片断A(氨基酸1-74)和B(氨基酸75-164)，及重组体三聚体。本方法制备的重组过敏原和过敏原变体极其适用于特定的过敏疾病的免疫治疗和诊断。
因此本发明涉及纯化的重组蛋白质的制备方法，该蛋白质是可溶解的生物活性物的形式且可作为生理学介质直接用于医疗用途，该制备源于细菌表达后的蛋白质聚集体(“包埋体”)，后者不溶于表达介质，该方法可由以下步骤描述：
(i)将分离出的不溶性蛋白质聚集体摄取入有机变性试剂中。
(ii)将(i)所得溶液使用基本无机非缓冲的碱性含盐洗脱液通过至少一个色谱步骤进行纯化。
(iii)将得自最终纯化步骤的含有不溶的，复性的且有生物活性的蛋白质的碱性溶液中和。
对于纯化，起初形成的不溶性聚集体首先在本身已知的变性试剂中溶解并变性。优选使用尿素，特别是5-10M的尿素，优选8M尿素。另外，可使用其他试剂如，例如相对高浓度的氢氧化钠或钾溶液(0.2M-1M)或上文所述胍盐酸盐。
在其后的步骤中，溶解的变性蛋白质与适当的色谱物质结合。此处主要适用的是离子交换剂，优选阴离子交换剂。
根据本发明的色谱洗脱剂为基本无机非缓冲的碱性含盐溶液。适合的洗脱剂为例如NaOH或KOH与NaCl或KCl的溶液。如果需要及在优选的实施方案中，可将碳酸氢钠或碳酸氢钾加入洗脱剂中以降低pH值。优选的洗脱剂含有NaOH，NaCl，或NaOH，NaCl及NaHCO3。根据本发明，碱性水溶液中NaOH或KOH的含量为5-50mM(mol/l)，优选15-25mM，特别是20mM。盐浓度(如NaCl)在开始时相对较低，以便于蛋白质牢固地与离子交换剂物质相键联。本发明初始盐浓度为5-50mM，优选15-30mM，特别是20mM。这除去了与色谱物质未键联或键联强度不够的变性试剂及杂质。如果加入NaHCO3，其浓度为5-15mM，优选11mM。
因此，本发明涉及一种相应的方法，其中通过将不溶重组蛋白质键联至色谱物质并用基本无机非缓冲的碱性洗脱剂(其盐含量可保证蛋白质与所述交换剂材料的键联)对变性溶液进行交换将变性试剂从变性溶液中除去。
为洗脱键联的重组蛋白质，根据本发明方法以一定梯度提供持续增加的盐的浓度(NaCl或KCl)，同时其他条件相同。优选使用的线性梯度介于20mM NaCl(KCl)(初始值)与0.5M NaCl(终止值)之间。由此，不仅所需的蛋白质得到回收，且其与杂质(例如其他蛋白质)分离。
本发明因此涉及一种相应的方法，其特点在于方法中键联的重组蛋白质通过提高盐浓度得以洗脱并不含有杂质，而盐浓度的增加优选以梯度的方式完成。
某些情况下，此后不再进行另外的纯化步骤也已足够，因为根据需要洗脱的蛋白质已足够纯。在此情况下，继之以下文更加详细地描述的中和步骤以得到备用且活性的蛋白质。
否则，根据本方法进行另外的色谱步骤。此处可使用所有已知的色谱方法。具体地，这取决于待纯化的特定蛋白质的化学/物理性质。优选，特别地对于Bet v1型过敏原及过敏原变体，进一步的纯化通过憎水作用色谱进行。另外，也可以进行凝胶过滤来代替。
本发明方法的一个优选实施方案为一种三步方法，其包括离子交换色谱法，憎水性作用色谱法及凝胶过滤，优选以一定的序列进行。但是，这不意味着对于本发明方法的限制。
因此，本发明由此进一步涉及一种相应的方法，其具有至少一个另外的色谱步骤，优选憎水作用色谱和/或凝胶过滤。
对于本发明所有这些纯化步骤的基本点是其洗脱剂定性的与定量的组成与上文所详细描述的相同：NaOH，NaCl及优选的NaHCO3，或相应的钾添加物。只有氯化钠组份的浓度可在不同步骤中安排为变动的方式。因此，例如在憎水作用色谱中，使用了高(1-3M，优选2M)至低(30-10mM，优选20mM)浓度的NaCl(KCl)梯度。此处的最终浓度基本上取决于最终纯化步骤后希望的盐浓度。该浓度根据本发明为生理学可耐受的浓度。如果，例如，凝胶过滤是优选的三步纯化方法的最终纯化步骤，则使用约150mM的NaCl。最后，最终步骤后所希望的终了盐浓度还可通过稀释或加入盐进行控制，这又取决于色谱的目标蛋白质的量。
最终纯化步骤后，在本方法的优选实施方案中其为凝胶过滤，通过加入稀酸，将溶液中和或将蛋白质复性，优选盐酸，其pH被调节为6.5-8.0。含有活性重组蛋白质的溶液此时可以，根据需要在随后对盐浓度(如Na+)和蛋白质含量进行调节后，以制剂的形式直接使用。
本发明因此涉及一相应的方法，其特点在于中和在纯化完成后在pH6.5-8.0的范围中进行，优选使用稀酸，特别是稀HCl。
在下文中使用实施例对本发明方法进行更详细的叙述，该例为主桦花粉过敏原Bet v1过敏原变体，即重组片断A(氨基酸1-74)和B(氨基酸75-164)，及重组体三聚体的分离：
对于纯化，初级不溶聚集体被变性，优选用8M尿素。另外，也可使用其他试剂，如0.2M氢氧化钠溶液。
第一色谱纯化步骤通过阴离子交换色谱进行，如在Source Q上进行。其中，多数过敏原与过敏原变体与载体键联并被初始变性溶液转移至洗脱液中。碱性洗脱液使蛋白质保留在溶液中。NaCl梯度洗脱使细菌杂质与活性成份片断部分除去。
在另外两个纯化步骤，即憎水作用色谱和凝胶过滤中，预纯化且平衡的过敏原或过敏原变体基本与仍然保留的细菌杂质分离。其后，基本仍使用同一洗脱物质，含有低分子量碱和不同比例的无机盐。
本发明因而涉及一特定的洗脱系统，其中待纯化重组蛋白质在纯化过程中保留在温和条件下的溶液中，并且其产生有效纯化。
在最终色谱步骤后，根据本发明纯化的重组蛋白质可以溶液形式分离或通过使用相应酸简单中和洗脱液中的碱而复性。如果选择了适当的洗脱液添加剂的浓度则可形成适于胃肠外用制剂的生理学溶液。纯化的重组过敏原或过敏原变体通过其已知的物理，化学，免疫学或生物学性质进行鉴识，特别是通过等电子聚焦，SDS-PAGE和过敏症患者的特定单克隆抗体及IgE抗体之类方法。溶剂的测试是通过测量pH、Na+和Cl-以及如果希望，CO3-浓度的定量完成。这些方法是公知且描述过的。根据本发明纯化且溶解的重组过敏原或过敏原变体的收率基于初始蛋白质为75-95％。
该方法制备的过敏原组份可用于体内和体外诊断，其可作为患者特定的过敏谱的过敏原组份分辨识别及特定的过敏症免疫治疗的一部分。另外，以长效制剂形式制备的药物制剂可通过纯化的重组蛋白质的转换完成。
本发明方法的优选实施方案以图表形式(表1)示于下文：
表1
                      包埋体的离析
                  在例如8M尿素中的变性
               阴离子交换色谱，如Source Q
        溶液A：20mM NaOH，20mM NaCl，11mM NaHCO3
        溶液B：20mM NaOH，0.5M NaCl，1lmM NaHCO3
            (任选)憎水作用色谱，如Source pHE
        溶液A：20mM NaOH，2M NaCl，11mM NaHCO3
                     溶液B：20mM NaOH
            (任选)凝胶过滤，如Superdex 75
            溶液A：10mM NaOH，11mM NaHCO3
                   148.4mM NaCl
                    复性/复配
目标蛋白质在10mM NaOH，148.4mM NaCl，11mM NaHCO3中
              +加入100mM HCl至10mM
        ＝在0.154M Na+溶液中的可溶目标蛋白质
总之，可观察到以下现象：通过实现本发明的方法，其通过特别的色谱洗脱剂的组合物，色谱介质的选择及特别设定的pH及由此产生的盐含量，本发明因此能够实现一个在技术上及药理学上可以实现的离析出高纯度，可溶性重组过敏原和过敏原变体的生产方法，产品主要以不溶性聚集体的形式制得，该方法省力省时。由于与已知方法相比重组蛋白质进行纯化和复性或溶解的条件温和且在药物上适合，其活性成分可用于过敏疾病的诊断和胃肠外治疗。
实施例：
Bet v1可溶性过敏原变体的离析
(治疗有效的重组Bet v1的过敏原变体，片断A和B及Bet v1三聚体)
通过标准方法纯化的过敏原变体的包埋体优选在8M尿素，20mMtris/HCl中变性。完全变性后，进行过滤，优选0.22-0.45μm，或离心，优选在10,000-20,000xg下5-15分钟。清液用Source15Q(Pharmacia)进行离子交换色谱，固定相用碱溶液平衡，优选使用20mM NaOH，11mM NaHCO3和20mM NaCl。固定相在pH高至12.0时仍稳定。初始溶液相对较高的pH实际上使所有目标蛋白质与阴离子交换剂键联。例外的是特别稀有的等电点高于11.0的蛋白质。用初始溶液对固化的蛋白质进行淋洗可有效地去除变性溶液(如8M尿素)和药物中不希望出现的缓冲物质(如tris)。该方法保证在保持重组蛋白质溶解性的情况下为便于随后的分离步骤而改变溶剂。其后的洗脱通过增加NaCl梯度进行，如从20mM NaOH，11mM NaHCO3，20mM NaCl到20mM NaOH，11mM NaHCO3，0.5M NaCl，且实现杂质(宿主细胞蛋白质)和活性组分片断的分离。
其后，色谱步骤为憎水作用色谱(仅对于片断)。为此目的，步骤1的洗出液用高摩尔浓度的盐溶液，如5M NaCl和20mM NaOH，11mMNaHCO3调节，由此使目标蛋白质键合。键联的目标蛋白质的洗脱通过低盐或无盐碱溶液如20mM NaOH进行。用于憎水作用色谱的固定相也必须在碱性至pH12时稳定，如，例如Source pHE。
第三步，凝胶过滤，如Superdex 75，在碱性条件下进行。色谱溶液的选择使得对加入洗脱液中的碱的中和的结果是得到希望的最终配比如，例如为10mM NaOH，11mM NaHCO3和148.4mM NaCl。
最后将凝胶过滤所得的洗出液用与所用碱相对应的酸进行中和，由此一方面形成中性的pH且使蛋白质转换为可溶的形式或复性，而另一方面通过中和形成所希望的盐浓度。因此，例如，含有10mM NaOH，11mM NaHCO3和148.4mM NaCl的凝胶过滤溶液通过加入1/10(v/v)100mM HCl被转换为生理盐溶液。通过简单测量pH及对Na+定量来测试溶剂。根据本发明，本方法因而涉及最少的样品处理，短的样品等待时间，使用专用的药理学相容性物质，与不同分理原理兼容的单一溶剂，及避免了拖延和在某些情况下无法使用的方法如透析等。另外，氢氧化钠溶液，一种已知的有效的细菌抑制剂，避免了存在于其中的蛋白质被降解或被微生物污染。内毒素，其可在细菌表达过程中造成麻烦，同样被有效地去除或降解。上述色谱步骤的顺序和数量可根据目标蛋白质特殊的物理化学性质进行改变。表2示出了溶液的总结。
凝胶过滤后的中和/溶解：
-缓慢加入1/10体积(基于初始混合物)的100mM HCl。例如在100ml初始溶液中含有：
10mM NaOH，148.4mM NaCl和11mM NaHCO3
中和后110ml：
11mM NaHCO3*10/11＝10 NaHCO3
10mM NaOH/HCl(NaCl)*10/11＝9.1mM NaCl
148.4mM NaCl*10/11＝134.9mM NaCl
由此最终溶液含有154mM NaCl，144mM Cl-和10mM CO3-。
表2：
用于色谱分离Bet v1变体的溶液：
色谱/蛋白质 样品应用 溶液A 溶液B 梯度
AIEX
片断1 8M尿素，20mM tris/HCl，pH8.0 20mM NaOH，10mM NaCl，11mM NaHCO3 20mM NaOH，500mM NaCl，11mM NaHCO3 10CV
片断2 同上 同上 同上 同上
三聚体 同上 同上 20mM NaOH，800mM NaCl，11mM NaHCO3 同上
HIC
片断1 将AIEX池设为2M NaCl 20mM NaOH，2M NaCl，11mM NaHCO3 20mM NaOH 10CV
片断2 将AIEX池设为3M NaCl 20mM NaOH，3M NaCl，11nM NaHCO3 20mM NaOH 10CV
三聚体 - - - -
凝胶过滤
片断1 HIC池 10mM NaOH，148.4mM NaCl，11mM NaHCO3 - -
片断2 同上 同上 - -
三聚体 Q池 同上 - -
所有溶液和馏份保存于室温。(CV＝柱体积)。

Claims (13)

1.纯化的重组蛋白质的制备方法，该蛋白质是可溶解的生物活性物的形式且可作为生理学介质直接用于医疗用途，该制备源于细菌表达后的蛋白质聚集体(“包埋体”)，后者不溶于表达介质，
该方法特点在于进行了以下步骤：
(i)将分离出的不溶性蛋白质聚集体摄取入有机变性试剂中，
(ii)将(i)所得溶液使用基本无机非缓冲的碱性含盐洗脱液通过至少一个色谱步骤进行纯化，和
(iii)将得自最终纯化步骤的含有不溶的，复性的且有生物活性的蛋白质的碱性溶液中和。
2.根据权利要求1的方法，特点在于所用变性试剂是尿素或胍盐酸盐。
3.根据权利要求1或2的方法，特点在于变性试剂通过将不溶的重组蛋白质键联至色谱物质上，并用基本无机非缓冲碱性洗脱剂，其盐浓度可使蛋白质键联至所述交换物质上，进行交换而从变性溶液中脱除。
4.根据权利要求3的方法，特点在于在该过程中，键联的重组蛋白质通过提高盐浓度被洗脱且不含有杂质。
5.根据权利要求4的方法，特点在于盐浓度的提高以梯度的方式完成。
6.根据权利要求3至5之一的方法，特点在于所用色谱物质是阴离子交换剂。
7.根据权利要求3至7之一的方法，特点在于至少进行一个另外的色谱纯化步骤。
8.根据权利要求8的方法，特点在于所进行的另外的色谱步骤是憎水作用色谱和/或凝胶过滤。
9.根据权利要求1至8之一的方法，特点在于所用色谱洗脱剂主要为NaOH，NaHCO3及NaCl。
10.根据权利要求1至9之一的方法，特点在于纯化完成之后的中和步骤在pH6.5至8.0之间的范围内进行。
11.根据权利要求10的方法，特点在于使用HCl进行中和。
12.根据权利要求1至10之一的方法，特点在于所用重组蛋白质为过敏原，过敏原变体或过敏原或过敏原变体的片断。
13.根据权利要求12的方法，特点在于选用Bet v1过敏原的重组过敏原变体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102112000B (zh) * 2008-08-08 2015-02-25 詹森药业有限公司 钙盐及镧盐的抗过敏组合
CN104558100A (zh) * 2015-02-04 2015-04-29 吉林农业大学 包涵体的预处理方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003072601A1 (de) † 2002-02-27 2003-09-04 Merck Patent Gmbh VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON HYPOALLERGENEM BIRKENPOLLENHAUPTALLERGEN rBet v 1
CA2487673C (en) * 2003-12-02 2010-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved method for the recombinant production and purification of protein kinases
AU2012269031B2 (en) * 2011-06-15 2016-10-06 Biotech Tools S.A. A method for the production of hydrolyzed allergens

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0432419T3 (da) * 1989-12-05 1994-11-14 American Cyanamid Co Fremgangsmåde til solubilisering og naturering af somatotropiner under anvendelse af lav urinstofkoncentration
US5912327A (en) * 1996-09-30 1999-06-15 Human Genome Sciences, Inc. Method of purifying chemokines from inclusion bodies
SE9703531D0 (sv) * 1997-09-30 1997-09-30 Rudolf Valenta Non-anaphlactic forms of allergens and their use

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102112000B (zh) * 2008-08-08 2015-02-25 詹森药业有限公司 钙盐及镧盐的抗过敏组合
CN104558100A (zh) * 2015-02-04 2015-04-29 吉林农业大学 包涵体的预处理方法

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