RU2110279C1 - Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ - Google Patents
Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2110279C1 RU2110279C1 RU95119174A RU95119174A RU2110279C1 RU 2110279 C1 RU2110279 C1 RU 2110279C1 RU 95119174 A RU95119174 A RU 95119174A RU 95119174 A RU95119174 A RU 95119174A RU 2110279 C1 RU2110279 C1 RU 2110279C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- protein
- pyrogenic
- solution
- aluminum hydroxide
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 238000011082 depyrogenation Methods 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ включает доведение раствора пирогенного иммуноглобулина до рН 4,5-6,3, разбавление дистиллированной водой до концентрации белка 1,0-5,0% и ионной силы 0,05-0,15 М, отделение образовавшегося осадка и концентрирование раствора до необходимой концентрации белка. 2 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим белковые вещества, и может быть использовано для очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ.
В настоящее время в связи с отказом от использования асбеста используется множество методов удаления пирогенов. Но количество и возможности резко ограничиваются для белков в связи с их высокой вязкостью, наличием различных связей между молекулами белка и липополисахаридов (пирогенов) : гидрофобных, ионных, водородных.
Часто изоэлектрические точки белков и липополисахаридов близки, а если нет, то возможны и более сильные взаимодействия типа антигена (липополисахарид) - антитела (иммуноглобулин). Кроме того, при депирогенизации возможна и денатурация интересуемого продукта.
Обработка щелочью, кислотой, хлороформом и другими химическими реагентами не приемлема для иммуноглобулина в связи с потерями эффекторных функций иммуноглобулина - снижение титра антител, полимеризации. В литературе пока не описана возможность удаления пирогенов из иммуноглобулина ультрафильтрацией в связи с близостью молекулярных весов.
Не получили распространения в мире и другие методы из-за отсутствия воспроизводимости и неэффективности. Обработка активированным углем [1] не дала положительных результатов, так как не только гидрофобные связи участвуют в связывании липополисахаридов.
Ионообменная хроматография [2] также не дает постоянных положительных результатов из-за использования только ионных связей. Кроме того, хроматографический материал может деградироваться и оказаться в препарате. Часто сорбенты сами могут стать источниками процесса хроматографии.
Использование детергентов [3] часто приводит к денатурации самого иммуноглобулина, снижает его выход при осаждении этанолом, так как увеличивает его растворимость. Существует возможность элюции пирогенов детергентами с оборудования и материалов, с которыми контактирует белок.
Афинный способ [4] не гарантирует от попадания лиганда, сшивающего агента, сорбента в препарат.
Наиболее близким аналогом является метод обработки гидроокисью алюминия. Однократность использования, возможность стерилизации и обработки гидроокиси алюминия при 180oC в течение 3 ч (гарантирует депирогенизацию). Легкость удаления, отсутствие разбавления, сохранность нативного состояния интересуемого продукта. Все это предопределило выбор в пользу гидроокиси алюминия.
Известен способ очистки иммуноглобулина от пирогенных субстанций согласно источнику [5]. Удаление пирогена гидроокисью алюминия проводится при следующих условиях: количество Al(OH)3 - 3,0 - 5,0 г на 1000 мл иммуноглобулина, величина pH 6,6 - 7,4, концентрация белка 9,5 - 10,5 % и общей молярности раствора 0,45 М, за счет 2,25 % (0,3 М) раствора гликокола и 0,9 % (0,15 М) раствора натрия хлорида. Обработка проводится в течение трех суток с последующей фильтрацией через мезгу и осветляющей фильтрацией.
Недостатками этого способа являются низкая эффективность снятия пирогенности (процент снятия пирогенности составляет 40 ± 8,94; n - 30), длительность обработки - 3 суток (72 ч).
Задачей, решаемой изобретением, является увеличение эффективности снятия пирогенности иммуноглобулина.
Технический результат: повышение выхода депирогенизированного иммуноглобулина (процент депирогенизации возрос с 40 ± 8,94 до 90 ± 5,48; выход с 36,22 ± 5,80 до 89,80 ± 7,10 %, n = 60) и сокращение длительности процесса с 72 до 4 - 6 ч.
Общим для прототипа и заявляемого изобретения является сорбент - гидроокись алюминия.
Отличительные признаки приведены в табл. 1.
Нами установлено, что для увеличения сорбции пирогенных субстанций на гидроокиси алюминия необходимо снизить концентрацию белка, ионную силу и величину pH.
Понижение pH и ионной силы, уменьшение концентрации белка приводит к снижению вязкости раствора, общей величины заряда липополисахаридов пирогена (растворимости), межбелковых взаимодействий, увеличению взаимодействия между гидроокисью алюминия и липополисахаридами, следовательно, к более полному удалению сорбентом пирогенов из раствора иммуноглобулина. Это позволило провести депирогенизацию практически всех серий иммуноглобулина. Процесс занимает вместо 72 всего 4 - 6 ч, увеличивается выход апирогенного иммуноглобулина более чем в 2 раза, а короткое время контакта сорбента с белком при комнатной температуре не приводило к ухудшению других показателей: ни молекулярных параметров, ни титров нормальных антител. В отличие от этого регламентный способ приводил к фрагментации и полимеризации иммуноглобулина, снижению титра специфических антител на порядок. Приведенная совокупность отличительных признаков заявленного способа в литературе не описана, а их влияние на достижение технического результата не следует из известного уровня техники. Предложенное техническое решение обеспечивает достижение технического результата и может быть реализовано в технологи получения иммуноглобулинов.
В процессе выбора параметров были определены следующие оптимальные точки:
pH в интервале 4,5 - 6,3. Превышение pH не снимало пирогенности, снижение pH приводило к большему растворению гидроокиси алюминия и затруднению отбивания осадка, трудностям стерилизующей фильтрации и мутности препарата;
ионная сила должна быть в пределах 0,05 - 0,15 М, увеличение ионной силы выше 0,15 М не снимало пирогена, а снижение ниже 0,05 М увеличивало растворимость гидроокиси алюминия с плохим отбиванием осадка гидроокиси и соответственно также не снимало пирогенности;
процент белка должен быть в диапазоне 1,0 - 5,0 %. При более высокой концентрации белка увеличиваются вязкость (плохо отбивается гидроокись), межбелковые взаимодействия, соответственно не снимается пирогенность. Снижение концентрации белка ниже 1 % приводит к увеличению обрабатываемых объемов, денатурации белка и уменьшению выхода.
pH в интервале 4,5 - 6,3. Превышение pH не снимало пирогенности, снижение pH приводило к большему растворению гидроокиси алюминия и затруднению отбивания осадка, трудностям стерилизующей фильтрации и мутности препарата;
ионная сила должна быть в пределах 0,05 - 0,15 М, увеличение ионной силы выше 0,15 М не снимало пирогена, а снижение ниже 0,05 М увеличивало растворимость гидроокиси алюминия с плохим отбиванием осадка гидроокиси и соответственно также не снимало пирогенности;
процент белка должен быть в диапазоне 1,0 - 5,0 %. При более высокой концентрации белка увеличиваются вязкость (плохо отбивается гидроокись), межбелковые взаимодействия, соответственно не снимается пирогенность. Снижение концентрации белка ниже 1 % приводит к увеличению обрабатываемых объемов, денатурации белка и уменьшению выхода.
Для достижения технического результата осуществляется следующий технологический процесс. В растворе пирогенного иммуноглобулина 0,1 - 0,3 М раствором соляной кислоты устанавливают pH 4,5 - 6,3 и разбавляют дистиллированной водой в 2 - 10 раз до концентрации белка от 1,0 до 5,0 %. Необходимой ионной силы добиваются либо простым разбавлением дистиллированной водой для инъекции либо диафильтрацией для достижения молярности 0,05 - 0,15 М. Добавляют гидроокись алюминия в количестве 3 - 5 г/1000 мл иммуноглобулина. Раствор осторожно перемешивают встряхиванием в течение 1,0 - 2,0 ч, выстаивают в течение 30 мин. Центрифугируют при 2000 - 3000 об/мин на центрифуге РС-6 или подвергают осветляющей фильтрации через осветляющие мембраны и концентрируют до 12,0 - 13,0 % белка ультрафильтрацией. Устанавливают необходимые показатели: pH, ионную силу добавлением недостающих количеств глицина и натрия хлорида и концентрацию белка 9,5 - 10,5 %.
В табл. 2 представлены результаты, полученные в результате депирогенизации заявляемым способом и регламентным. Выход апирогенного иммуноглобулина составляет 89,80 ± 7,10 %. Процент депирогенизации составляет 90 ± 5,48, время обработки 4 - 6 ч. В то время как процент депирогенизированных серий по известному способу составил лишь 40 ± 5,48, и время, необходимое для обработки, 72 ч, при выходе 36,22 ± 5,8. Следовательно, различия в выходе можно считать статистически значимыми.
Пирогенность или апирогенность иммуноглобулина оценивалась согласно источнику [6]:
раствор лекарственного средства считается непирогенным, если сумма повышения температур у трех кроликов меньше или равна 1,4oC.
раствор лекарственного средства считается непирогенным, если сумма повышения температур у трех кроликов меньше или равна 1,4oC.
Если эта сумма превышает 2,2oC, то раствор лекарственного считается пирогенным.
Пример 1. 1000 мл 10 %-ного пирогенного иммуноглобулина (+0,9+0,9+1,0; Σ = 2,8)oC осторожно подкисляют 0,2 М раствором соляной кислоты до pH 4,9. Разбавляют дистиллированной водой для инъекций до 3300 мл (до 3,0 % белка) и ионной силы 0,15 М. Добавляют 4 г гидроокиси алюминия и осторожно перемешивают 1,5 ч, отстаивают 30 мин. Центрифугируют при 2500 об/мин 30 мин на центрифуге РС-6. Концентрируют на ВПУ-15 (0,2 м2) до 12,0 - 13,0 % белка. Осторожно подщелачивают 0,25 М раствором NaOH до pH 7,0. Доводят содержание белка, хлорида натрия, глицина до 10,0; 0,9 и 2,25 % соответственно. Полученный объем иммуноглобулина составляет 920 мл. Выход 97 %. Температурные параметры (+0,2; +0,2; +0,3; Σ = 0,7)oC.
Пример 2. 1000 мл 10 %-ного пирогенного иммуноглобулина (+0,9 + 1,0 + 1,0; Σ = 2,9)oC осторожно подкисляют 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 4,5. Доводят дистиллированной водой для инъекций до 10000 мл (до 1 % белка) и ионной силы 0,05 М. Прибавляют сухой гидроокиси алюминия в количестве 4 г, перемешивают 1 ч, отстаивают 30 мин. Дальнейшие операции выполняются согласно примеру 1. Выход 90 %, температурные характеристики (+0,2; +0,3; +0,3; Σ = 0,8)oC.
Пример 3. В 1000 мл 10 %-ного пирогенного иммуноглобулина (согласно примеру 1) устанавливают pH 6,3 0,3 М соляной кислотой. Доводят до 2000 мл дистиллированной водой для инъекций (5 % белка). Проводят диафильтрацию на ВПУ-15 (0,2 м2) 3 объемами 0,1 М раствора хлорида натрия для перевода в раствор с ионной силой 0,1 М. Все последующие операции проводят согласно примеру 1. Выход 83 %, температурные данные (+0,3; +0,3; +0,3; Σ = 0,9)oC.
Список литературы:
1. A 61 K 39/395 Патент Франции N 2 433 342, 14.3.1980.
1. A 61 K 39/395 Патент Франции N 2 433 342, 14.3.1980.
2. A 61 K 39/395 Патент EP N 0 085 747, 14.05.86.
3. A 61 K 35/16 Патент EP N 0 050 061, 11.12.85.
4. Sharma S. K. Endotoxin detection and elimination in Biotechnol. and appl. Biochem, 1986, 8, N 1, 5 - 22.
5. Регламент производства "Иммуноглобулина человека нормального" N 131-79, утвержденный 3 мая 1986 г.
6. Государственная фармакопея СССР, 11 изд. вып. 2, с. 184.
Claims (1)
- Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ, включающий обработку сорбентом гидроокиси алюминия с последующим удалением осадка, отличающийся тем, что перед добавлением гидроокиси алюминия в растворе пирогенного иммуноглобулина устанавливают pH 4,5 - 6,3, затем разбавляют дистиллированной водой до концентрации белка 1,0 - 5,0% и ионной силы 0,05 - 0,15 М, после отделения осадка проводят концентрирование раствора до необходимой концентрации белка.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95119174A RU2110279C1 (ru) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95119174A RU2110279C1 (ru) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU95119174A RU95119174A (ru) | 1998-05-10 |
| RU2110279C1 true RU2110279C1 (ru) | 1998-05-10 |
Family
ID=20173705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU95119174A RU2110279C1 (ru) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2110279C1 (ru) |
-
1995
- 1995-11-13 RU RU95119174A patent/RU2110279C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Регламент производства иммуноглобулина человека нормального N131-79, 07.05.79. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU1837880C (ru) | Способ разделени белков крови | |
| JPH06107561A (ja) | 静脈内相容性免疫グロブリン− ｇ− 製剤の製造方法 | |
| KR940005589B1 (ko) | 핵산 또는 엔도톡신의 제거제 및 제거방법 | |
| US4301064A (en) | Ubiquitary tissue protein PP8 | |
| AU642089B2 (en) | Novel method for extraction of horseshoe hemocyte polypeptide | |
| SK54993A3 (en) | Imidoester cross-linked hemoglobin compositions | |
| NO146818B (no) | Fremgangsmaate for aa danne kanaler med hoey fluidumledningsevne i en formasjon rundt et borehull | |
| RU2110279C1 (ru) | Способ очистки иммуноглобулина от пирогенных веществ | |
| US6464851B1 (en) | Removal of biological contaminants | |
| RU2084229C1 (ru) | Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных заболеваний | |
| JP2022501375A (ja) | 卵黄から抗体を精製するプロセス、その製品及び使用 | |
| US5151498A (en) | Glycoprotein from avena sativa, process for its preparation, and pharmaceutical compositions containing same | |
| WO2006064373A2 (en) | Methods of purifying immunologlobulins | |
| RU2158137C1 (ru) | Способ получения иммуноглобулинового препарата | |
| RU2062617C1 (ru) | Способ получения антитоксической сыворотки | |
| CN1468255A (zh) | 表达为不溶性聚集体的重组蛋白质的纯化方法 | |
| JPS62292731A (ja) | 低温殺菌された免疫グロブリン製剤の製法 | |
| RU2158136C1 (ru) | Способ получения igm-содержащего концентрата иммуноглобулина | |
| CN117285588A (zh) | 一种去除多肽中内毒素的通用方法 | |
| JP2980362B2 (ja) | シアル酸含量の高いグリコオリゴペプチド混合物及びその製造法 | |
| RU2065876C1 (ru) | Способ извлечения ферментного препарата из мышечной ткани рыб | |
| JPH05310799A (ja) | ムチンの精製方法 | |
| JPS6143330B2 (ru) | ||
| KR100229420B1 (ko) | 대장균에서 발현된 닭 성장 호르몬의 정제 방법 | |
| HU183590B (en) | Process for the isolation of an active suastance influencing specifically the nutrition centre with a regulative effect on the appetite from human and/or animal blood serum |