CN115304668A - 一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种高效生产α1‑抗胰蛋白酶的方法，涉及蛋白质药物制备领域，包括：收集含有α1‑抗胰蛋白酶的溶液进行S/D法病毒灭活，将人半乳糖凝集素8作为诱饵蛋白，将带有组氨酸标签的诱饵蛋白、灭活的含有α1‑抗胰蛋白酶的溶液、Ni‑NTA、缓冲液混匀，搅拌使Ni‑NTA与诱饵蛋白的组氨酸标签结合，α1‑抗胰蛋白酶与诱饵蛋白发生特异性结合，离心收集Ni‑NTA，清洗，将α1‑抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来，凝胶过滤层析纯化，收集含有α1‑抗胰蛋白酶的谱峰，经透析、脱盐、浓缩、巴氏灭活、冻干后获得α1‑抗胰蛋白酶。本发明能获得高纯度α1‑抗胰蛋白酶，生产效率高，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质药物制备技术领域，具体涉及一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法。
背景技术
人α1-抗胰蛋白酶(UniProt编号为P01009)是FDA批准上市的药物，用于治疗肺气肿、慢性阻塞性肺等疾病。另外，一些人先天具有α1-抗胰蛋白酶基因的突变，因此也需要定时往血液中补充α1-抗胰蛋白酶。目前上市的α1-抗胰蛋白酶产品包括AralastNP、Glassia、Prolastin-C、Zemaira等。
α1-抗胰蛋白酶是肝细胞合成分泌的一种蛋白质。α1-抗胰蛋白酶的基因发生突变，会造成α1-抗胰蛋白酶从肝细胞中分泌发生障碍，造成α1-抗胰蛋白酶聚集在肝细胞内质网中，引起肝炎、肝硬化等疾病。
α1-抗胰蛋白酶是丝氨酸家族蛋白酶的抑制剂，能够抑制中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase)、胰酶等蛋白酶的活性。中性粒细胞弹性蛋白酶可降解肺泡弹性纤维。如果人体缺乏α1-抗胰蛋白酶，中性粒细胞弹性蛋白酶的活性得不到抑制，那么会导致肺气肿、慢性阻塞性肺等疾病。静脉注入α1-抗胰蛋白酶会缓解患者的症状。
一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法，涉及蛋白质药物制备领域。α1-抗胰蛋白酶可用于治疗肺气肿药物，也可以给某些含有α1-抗胰蛋白酶基因突变的人补充。另外，α1-抗胰蛋白酶也有治疗新型冠状病毒肺炎的潜力。
目前，生产α1-抗胰蛋白酶的方法主要包括以Cohn IV沉淀为原料制备、以聚乙二醇沉淀法进行初始制备、以聚乙二醇沉淀法结合氯化锌沉淀法进行初始制备，最后应用离子交换层析或凝胶过滤层析等手段进行进一步纯化，以获得α1-抗胰蛋白酶。这些制备方法都十分繁琐，并且生产效率低，成本较高。
发明内容
为了解决现有α1-抗胰蛋白酶的制备方法存在的制备过程繁琐、生产效率低、成本高的问题，本发明提供一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：
步骤一、收集含有α1-抗胰蛋白酶的溶液；
步骤二、将含有α1-抗胰蛋白酶的溶液进行S/D法病毒灭活，在25±1℃下孵育6小时±0.5小时，得到灭活的含有α1-抗胰蛋白酶的溶液；
步骤三、将人半乳糖凝集素8作为诱饵蛋白，将带有组氨酸标签的诱饵蛋白、灭活的含有α1-抗胰蛋白酶的溶液、Ni-NTA、缓冲液混合均匀，在4℃±1℃下持续搅拌0.5小时-4小时，使Ni-NTA与诱饵蛋白的组氨酸标签结合，α1-抗胰蛋白酶与诱饵蛋白发生特异性结合；
步骤四、将上述混合物于100g-1000g离心1分钟-10分钟收集Ni-NTA，弃上清，用缓冲液清洗Ni-NTA2-4次，去除其他蛋白；
步骤五、将α1-抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来；
步骤六、采用凝胶过滤层析进一步对α1-抗胰蛋白酶进行纯化；
步骤七、收集含有α1-抗胰蛋白酶的谱峰，进行透析脱盐浓缩；
步骤八、对浓缩后的α1-抗胰蛋白酶进行巴氏灭活，在62℃-65℃下孵育12小时-16小时，10mM-20mM甘氨酸和1％-2％葡萄糖作为巴氏灭活保护剂；冻干后获得α1-抗胰蛋白酶。
作为优选的实施方式，步骤一中，所述收集含有α1-抗胰蛋白酶的溶液的方法采用以下方法中的一种：
(a)收集含有α1-抗胰蛋白酶的人血浆、人血清、动物血浆或动物血清，加入抗凝剂，静止0.5小时-4小时以形成凝块，于500g-2000g离心5分钟-30分钟，收集含有α1-抗胰蛋白酶的血清；
(b)收集含有α1-抗胰蛋白酶的Cohn组分Ⅳ沉淀；
(c)收集重组表达α1-抗胰蛋白酶的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；
(d)收集含有α1-抗胰蛋白酶的人乳汁；
(e)收集含有α1-抗胰蛋白酶的动物乳汁。
作为优选的实施方式，(a)中，所述抗凝剂采用柠檬酸钠、肝素、EDTA或草酸钾。
作为优选的实施方式，步骤二中，所述S/D法病毒灭活时，所采用的有机溶剂为终浓度0.003g/ml±0.001g/ml的磷酸三丁酯，所采用的去污剂为终浓度0.01g/ml±0.005g/ml的吐温-80。
作为优选的实施方式，步骤三中，所述带有组氨酸标签的诱饵蛋白为带有组氨酸标签的人半乳糖凝集素8，其制备方法如下：
将人半乳糖凝集素8的cDNA插入到质粒pET28a中，限制性内切酶的位点为NdeI和XhoI，组氨酸标签被置于人半乳糖凝集素8的N端或C端，将获得的质粒命名为pET28a_Galectin-8；将质粒pET28a_Galectin-8转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，并用IPTG诱导，采用Ni-NTA对带有组氨酸标签的人半乳糖凝集素8进行纯化；所述人半乳糖凝集素8的基因来源于人或来源于基因合成；所述人半乳糖凝集素8与UniProt数据库中编号为O00214蛋白的序列一致性为100％。
作为优选的实施方式，步骤三和步骤四中，所述缓冲液的组成成分为：10mM-50mMTris、200mM±50mM NaCl和20mM-50mM咪唑，所述缓冲液的pH为7.0-10.0。
作为优选的实施方式，步骤三中，所述诱饵蛋白、灭活的含有α1-抗胰蛋白酶的溶液、Ni-NTA、缓冲液的用量比为1mg∶(1mL-10mL)∶1mL∶(8mL-17mL)。
作为优选的实施方式，步骤五中，将α1-抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来的方法采用以下方法中的一种：
(a)加入10mL-30mL缓冲液以破坏诱饵蛋白与α1-抗胰蛋白酶之间的特异性结合；所述缓冲液的pH为7.0-10.0，所述缓冲液中含有10mM-50mM Tris、200mM±50mM NaCl和5mM-300mM糖类物质；所述糖类物质为乳糖、半乳糖、N-乙酰氨基乳糖或N-乙酰基-D-半乳糖胺；
(b)加入10mL-30mL、pH 1.0的HCl溶液或者10mL-30mL、pH 10.0的NaOH溶液，通过改变缓冲液的pH将α1-抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来；
(c)加入10mL-30mL、5M NaCl溶液，通过改变缓冲液中盐离子浓度将α1-抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来。
作为优选的实施方式，步骤六中，所述凝胶过滤层析的流动相的pH为7.0-10.0，所述流动相中含有10mM-100mM Tris、50mM-500mM NaCl和5mM-300mM糖类物质；所述糖类物质为乳糖、半乳糖、N-乙酰氨基乳糖或N-乙酰基-D-半乳糖胺；所述凝胶过滤层析的凝胶过滤柱为HiLoad 26/600Superdex 75pg，流速为0.5ml/min-4ml/min。
作为优选的实施方式，步骤七中，透析液为纯水，pH为7.5。
本发明的有益效果是：
本发明的一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法，将人半乳糖凝集素8作为诱饵蛋白，从人血浆，人血清，动物血浆，动物血清，Cohn组分Ⅳ沉淀，重组表达α1-抗胰蛋白酶的细菌、酵母、动物细胞、植物细胞以及人乳汁，动物乳汁中结合纯化α1-抗胰蛋白酶；所选取的诱饵蛋白能够特异性的结合α1-抗胰蛋白酶，而几乎不与溶液中其他蛋白相结合。本发明的一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法，能够获得高纯度的α1-抗胰蛋白酶，极大地提高了α1-抗胰蛋白酶的生产效率，同时降低了生产α1-抗胰蛋白酶的成本，有利于α1-抗胰蛋白酶的工业化生产。
附图说明
图1为实施例1步骤(4)中获得的α1-抗胰蛋白酶的SDS-PAGE分析结果。图中，M为蛋白质标准品的条带，1为人半乳糖凝集素8的条带，2为人半乳糖凝集素8与α1-抗胰蛋白酶相互结合的条带。
图2为实施例1步骤(6)中获得的α1-抗胰蛋白酶的SDS-PAGE分析结果。图中，M为蛋白质标准品的条带，1为从人半乳糖凝集素8上洗脱下来的α1-抗胰蛋白酶的条带。
图3为实施例1步骤(7)中采用凝胶过滤层析进一步对α1-抗胰蛋白酶进行纯化后的谱图。图中，峰1为α1-抗胰蛋白酶，峰2为人半乳糖凝集素8。
图4为实施例1步骤(9)中获得的α1-抗胰蛋白酶的SDS-PAGE分析结果。图中，M为蛋白质标准品的条带，1为最终获得的α1-抗胰蛋白酶的条带，2为sigma(货号为A6150)的条带。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料来源：
质粒pET28a购自Novagen公司。
大肠杆菌BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司。
HiLoad 26/600Superdex 75pg凝胶过滤柱购自GE公司。
实施例1α1-抗胰蛋白酶的制备
(1)所采用的人半乳糖凝集素8的基因来源于人或来源于基因合成，该人半乳糖凝集素8与UniProt数据库中编号为O00214蛋白的序列一致性为100％。
将人半乳糖凝集素8的cDNA插入到质粒pET28a中，限制性内切酶的位点为NdeI和XhoI，组氨酸标签被置于人半乳糖凝集素8的C端，将获得的质粒命名为pET28a_Galectin-8；将质粒pET28a_Galectin-8转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，并用IPTG诱导，采用Ni-NTA对带有组氨酸标签的人半乳糖凝集素8进行纯化；
(2)收集含有α1-抗胰蛋白酶的动物血浆，在纯化α1-抗胰蛋白酶之前，将109mM的柠檬酸钠加入到动物血浆之中，动物血浆与柠檬酸钠的体积比为9:1；并将动物血浆静止1小时以形成凝块，于2000g离心10分钟，收集含有α1-抗胰蛋白酶的血清；
(3)将含有α1-抗胰蛋白酶的溶液进行S/D法病毒灭活，使磷酸三丁酯的终浓度为0.003g/ml，吐温-80的终浓度为0.01g/ml，在25±1℃下孵育6小时，得到灭活的含有α1-抗胰蛋白酶的溶液；
(4)将1mg带有组氨酸标签的人半乳糖凝集素8、1mL灭活的含有α1-抗胰蛋白酶的溶液、1mLNi-NTA、20mL缓冲液(10mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，20mM咪唑)混合均匀，在4℃下持续搅拌1小时，使Ni-NTA与人半乳糖凝集素8的组氨酸标签结合，α1-抗胰蛋白酶与人半乳糖凝集素8发生特异性结合；
(5)将上述混合物于1000g离心3分钟收集Ni-NTA，弃上清，用缓冲液(10mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，20mM咪唑)清洗Ni-NTA3次，去除其他蛋白；
(6)加入20mL缓冲液(10mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，50mM乳糖)以破坏人半乳糖凝集素8与α1-抗胰蛋白酶之间的特异性结合，将α1-抗胰蛋白酶从人半乳糖凝集素8上洗脱下来；
(7)采用凝胶过滤层析进一步对α1-抗胰蛋白酶进行纯化，凝胶过滤层析的流动相为10mM Tris，pH8.0，200mM NaCl，50mM乳糖，凝胶过滤层析的凝胶过滤柱为HiLoad 26/600Superdex 75pg，流速为3ml/min；
(8)收集含有α1-抗胰蛋白酶的谱峰，进行透析脱盐浓缩，透析液为纯水，pH为7.5；
(9)对浓缩后的α1-抗胰蛋白酶进行巴氏灭活，在65℃下孵育14小时，20mM甘氨酸和2％葡萄糖作为巴氏灭活保护剂，冻干后获得高纯度的α1-抗胰蛋白酶。
实施例2α1-抗胰蛋白酶的SDS-PAGE分析
对实施例1获得的纯化α1-抗胰蛋白酶的过程进行SDS-PAGE分析。
实施例1的步骤(4)中，α1-抗胰蛋白酶与人半乳糖凝集素8发生特异性结合，SDS-PAGE分析结果如图1所示，M为蛋白质标准品的条带，1为人半乳糖凝集素8的条带，2为人半乳糖凝集素8与α1-抗胰蛋白酶相互结合的条带；由图1可知，人半乳糖凝集素8可特异性结合α1-抗胰蛋白酶，并从血清中调取结合α1-抗胰蛋白酶。
实施例1的步骤(6)中，加入缓冲液后进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，M为蛋白质标准品的条带，1为从人半乳糖凝集素8上洗脱下来的α1-抗胰蛋白酶的条带；由图2可知，加入缓冲液(10mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，50mM乳糖)可破坏人半乳糖凝集素8与α1-抗胰蛋白酶的特异性结合，并且可将α1-抗胰蛋白酶从人半乳糖凝集素8上洗脱下来，得到纯度约为80％的α1-抗胰蛋白酶。
实施例1的步骤(7)中，采用凝胶过滤层析进一步对α1-抗胰蛋白酶进行纯化，SDS-PAGE分析结果如图3所示；由图3可知，通过凝胶过滤层析能够进一步将α1-抗胰蛋白酶与人半乳糖凝集素8或者其他蛋白分开，得到纯度约为95％的α1-抗胰蛋白酶。
实施例1的步骤(9)中，SDS-PAGE分析结果如图4所示，M为蛋白质标准品的条带，1为最终获得的α1-抗胰蛋白酶的条带，2为sigma(货号为A6150)的条带；由图4可知，通过一系列处理，最后获得了约为95％的α1-抗胰蛋白酶。本发明公开了一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
Claims (10)
1.一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、收集含有α1-抗胰蛋白酶的溶液；
步骤二、将含有α1-抗胰蛋白酶的溶液进行S/D法病毒灭活，在25±1℃下孵育6小时±0.5小时，得到灭活的含有α1-抗胰蛋白酶的溶液；
步骤三、将人半乳糖凝集素8作为诱饵蛋白，将带有组氨酸标签的诱饵蛋白、灭活的含有α1-抗胰蛋白酶的溶液、Ni-NTA、缓冲液混合均匀，在4℃±1℃下持续搅拌0.5小时-4小时，使Ni-NTA与诱饵蛋白的组氨酸标签结合，α1-抗胰蛋白酶与诱饵蛋白发生特异性结合；
步骤四、将上述混合物于100g-1000g离心1分钟-10分钟收集Ni-NTA，弃上清，用缓冲液清洗Ni-NTA2-4次，去除其他蛋白；
步骤五、将α1-抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来；
步骤六、采用凝胶过滤层析进一步对α1-抗胰蛋白酶进行纯化；
步骤七、收集含有α1-抗胰蛋白酶的谱峰，进行透析脱盐浓缩；
步骤八、对浓缩后的α1-抗胰蛋白酶进行巴氏灭活，在62℃-65℃下孵育12小时-16小时，10mM-20mM甘氨酸和1％-2％葡萄糖作为巴氏灭活保护剂；冻干后获得α1-抗胰蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中，所述收集含有α1-抗胰蛋白酶的溶液的方法采用以下方法中的一种：
(a)收集含有α1-抗胰蛋白酶的人血浆、人血清、动物血浆或动物血清，加入抗凝剂，静止0.5小时-4小时以形成凝块，于500g-2000g离心5分钟-30分钟，收集含有α1-抗胰蛋白酶的血清；
(b)收集含有α1-抗胰蛋白酶的Cohn组分Ⅳ沉淀；
(c)收集重组表达α1-抗胰蛋白酶的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；
(d)收集含有α1-抗胰蛋白酶的人乳汁；
(e)收集含有α1-抗胰蛋白酶的动物乳汁。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，(a)中，所述抗凝剂采用柠檬酸钠、肝素、EDTA或草酸钾。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中，所述S/D法病毒灭活时，所采用的有机溶剂为终浓度0.003g/ml±0.001g/ml的磷酸三丁酯，所采用的去污剂为终浓度0.01g/ml±0.005g/ml的吐温-80。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中，所述带有组氨酸标签的诱饵蛋白为带有组氨酸标签的人半乳糖凝集素8，其制备方法如下：
将人半乳糖凝集素8的cDNA插入到质粒pET28a中，限制性内切酶的位点为NdeI和XhoI，组氨酸标签被置于人半乳糖凝集素8的N端或C端，将获得的质粒命名为pET28a_Galectin-8；将质粒pET28a_Galectin-8转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，并用IPTG诱导，采用Ni-NTA对带有组氨酸标签的人半乳糖凝集素8进行纯化；所述人半乳糖凝集素8的基因来源于人或来源于基因合成；所述人半乳糖凝集素8与UniProt数据库中编号为O00214蛋白的序列一致性为100％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三和步骤四中，所述缓冲液的组成成分为：10mM-50mM Tris、200mM±50mM NaCl和20mM-50mM咪唑，所述缓冲液的pH为7.0-10.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中，所述诱饵蛋白、灭活的含有α1-抗胰蛋白酶的溶液、Ni-NTA、缓冲液的用量比为1mg∶(1mL-10mL)∶1mL∶(8mL-17mL)。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五中，将α1-抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来的方法采用以下方法中的一种：
(a)加入10mL-30mL缓冲液以破坏诱饵蛋白与α1-抗胰蛋白酶之间的特异性结合；所述缓冲液的pH为7.0-10.0，所述缓冲液中含有10mM-50mM Tris、200mM±50mM NaCl和5mM-300mM糖类物质；所述糖类物质为乳糖、半乳糖、N-乙酰氨基乳糖或N-乙酰基-D-半乳糖胺；
(b)加入10mL-30mL、pH 1.0的HCl溶液或者10mL-30mL、pH 10.0的NaOH溶液，通过改变缓冲液的pH将α1-抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来；
(c)加入10mL-30mL、5M NaCl溶液，通过改变缓冲液中盐离子浓度将α1-抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤六中，所述凝胶过滤层析的流动相的pH为7.0-10.0，所述流动相中含有10mM-100mM Tris、50mM-500mM NaCl和5mM-300mM糖类物质；所述糖类物质为乳糖、半乳糖、N-乙酰氨基乳糖或N-乙酰基-D-半乳糖胺；所述凝胶过滤层析的凝胶过滤柱为HiLoad 26/600Superdex 75pg，流速为0.5ml/min-4ml/min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤七中，透析液为纯水，pH为7.5。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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