RU2299214C2 - СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ Bet v 1 - Google Patents

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ Bet v 1 Download PDF

Info

Publication number
RU2299214C2
RU2299214C2 RU2003109430/13A RU2003109430A RU2299214C2 RU 2299214 C2 RU2299214 C2 RU 2299214C2 RU 2003109430/13 A RU2003109430/13 A RU 2003109430/13A RU 2003109430 A RU2003109430 A RU 2003109430A RU 2299214 C2 RU2299214 C2 RU 2299214C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
purification
nacl
chromatographic
solution
recombinant
Prior art date
Application number
RU2003109430/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2003109430A (ru
Inventor
Роланд ЗУКК (DE)
Роланд ЗУКК
Оливер КРОМВЕЛЛЬ (DE)
Оливер КРОМВЕЛЛЬ
Хельмут ФИБИГ (DE)
Хельмут ФИБИГ
Original Assignee
Мерк Патент Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерк Патент Гмбх filed Critical Мерк Патент Гмбх
Publication of RU2003109430A publication Critical patent/RU2003109430A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2299214C2 publication Critical patent/RU2299214C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложенный способ основывается на преобразовании телец включения в растворимую форму при использовании органических денатурирующих реагентов, а также при использовании хроматографических методов. При хроматографии выбирают неорганические, щелочные, солесодержащие элюенты. После окончания очистки получают рекомбинантные варианты Bet v 1 аллергена в форме, которая может непосредственно использоваться для медицинских целей. Преимущество способа состоит в минимальной обработке образца, использовании фармакологически совместимых веществ, кроме этого в процессе очистки раствора целевого белка эффективно удаляются эндотоксины. 11 з.п. ф-лы, 2 табл.

Description

Изобретение касается способа растворения и очистки рекомбинантных белков, которые экспрессируются в бактериальных клетках-хозяевах и откладываются как нерастворимые агрегаты (тельца включения). Очистка основывается на превращении телец включения в растворимую форму при использовании органических денатурирующих реагентов и хроматографических методов. В данной заявке описываются неорганические, щелочные, солесодержащие элюенты, которые после окончания очистки дают возможность получить рекомбинантные белки после нейтрализации в доступной форме, которая может использоваться непосредственно для медицинских целей и которая является физиологически приемлемой. Способ частично приемлем для очистки аллергенов и фрагментов аллергенов.
Способ в соответствии с изобретением проводят в условиях, которые необходимы для получения фармацевтических препаратов (GMP). Фармацевтически активные ингредиенты могут использоваться непосредственно после растворения как препараты для парентерального введения. Предпочтительные рекомбинантные аллергены или варианты аллергенов, которые получают способом в соответствии с изобретением, могут использоваться как для усовершенствованной терапии, так и для диагностики аллергических заболеваний.
Общей проблемой приготовления рекомбинантных белков при использовании бактериальных и прокариотических клеток-хозяев, таких как, например, Е. coli, является то, что экспрессированные белки не обладают правильной или природной укладкой, которая обычно требуется для проявления полной биологической активности. Неправильная укладка часто приводит к получению ряда белков, которые находятся в форме, являющейся нерастворимой в экспрессионной среде или откладываются в форме агрегатов, которые известны в научной литературе как, так называемые, "тельца включения". Образование указанных "телец включения" имеет вредное влияние на очистку и необходимую растворимость экспрессированного рекомбинантного белка (Marston et al, 1986, Biochem J.240: 1-12). Для того чтобы очистить рекомбинатные белки, которые в виде отложений содержатся в бактерии, к хроматографическим элюентам часто добавляют денатурирующие вещества, такие как, например, мочевина или гидрохлорид гуанидина. Однако эти добавки не могут совмещаться с каждым принципом разделения, таким как, например, хроматография на основе гидрофобного взаимодействия. Кроме того, продукты могут быть модифицированы неблагоприятным образом химическими реагентами, такими как, например, цианат, который может образовываться в растворах мочевины. Удаление денатурирующего агента, и, таким образом, возможная ренатурация, часто выполняются путем диализа, диафильтрации или гель-фильтрации. Эти процессы являются не только длительными, но и часто приводят к повторной преципитации продуктов. Аналитическое определение и полное удаление указанных выше денатурирующих агентов из конечного продукта являются сложными. Проблема, описанная выше, представляется особенно важной при получении и очистке рекомбинантных аллергенов и вариантов аллергенов.
Количество аллергий первого типа значительно выросло во всем мире в последние десятилетия. До 20% популяции населения в промышленно развитых странах страдает от таких заболеваний, как аллергический ринит, конъюнктивит или бронхиальная астма, которые вызваны аллергенами, присутствующими в воздухе (аэроаллергенами), которые высвобождаются из различных источников, таких как растительная пыльца, клещи, млекопитающие (коты, собаки, кони) и плесневые грибки. Тяжелые аллергии могут инициироваться укусами насекомых, таких как, например, пчелы и осы.
Вещества, которые инициируют аллергию первого типа, являются белками, гликопротеинами или полипептидами. После поглощения через слизистые оболочки или после укусов эти аллергены реагируют с IgE антителами, которые размещаются на поверхности тучных клеток у чувствительных особей. Если два или более IgE антител связаны друг с другом посредством аллергена, то это приводит к выделению медиаторов (например, гистамина, простагландинов) и цитокинов эффекторной клеткой и, таким образом, приводит к инициации аллергических симптомов. При помощи последовательностей кДНК возможно получать рекомбинантные аллергены, которые могут использоваться при диагностике и терапии аллергий (Scheiner und Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391). Рекомбинантные аллергены могут приобретать особую значимость в методах диагностики, поскольку, в отличие от обычных экстрактов, они дают возможность идентифицировать индивидуальный спектр IgE чувствительности. Кроме того, возможно получать специфические генно-инженерные модификации рекомбинантных аллергенов, что дает возможность достичь уменьшенного аллергенного потенциала при отсутствии изменения реактивности с регуляторными клетками Т-хелперов (Schramm et al, 1999, J. Immunol., 162 (4): 2406-2414, Valenta et al., 1999, Biol. Chem. 380: 815-24; Singh et al, 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 119: 75-85). Варианты аллергенов этого типа предлагаются как будущие кандидаты для специфической иммунотерапии аллергии первого типа. В частности, недавно полученные модифицированные аллергены представляют собой предмет способа в соответствии с данным изобретением.
В этой связи получение рекомбинантных аллергенов и вариантов аллергенов в бактериальных экспрессионных системах часто является особо важным. По сравнению с эукариотическими системами эти системы дают то преимущество, что высокий выход продукта получают в течение короткого времени экспрессии. Кроме того, они являются существенно безопасными с фармакологической точки зрения в отношении вирусной контаминации и онкогенов. Однако при рекомбинантном способе получения в бактериальных экспрессионных системах основные аллергены различного происхождения, такие как, например, группа 1 ((Vrtala et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97: 781-7) и 13 (Suck et. al, 2000, Clin Exp. Allergy 30: 324-332), аллергены луговых трав, Der f2 аллергены клещей (Iwamoto et al., 1996, Int. Arch. Allergy Immunol. 109: 356-61) и аллергены фосфорилазы А2 и гиалуронидазы токсинов насекомых (Soldatova et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 101: 691-8; Kuchler et al., 1989, Eur. J. Biochem. 184: 249-254), откладываются в клетках-хозяевах как тельца включения. Варианты аллергенов, такие как, например, фрагменты или мультимеры человеческого аллергена пыльцы березы Bet v 1 (фрагмент А, фрагмент В, Bet v 1 тример) также ведут себя подобным образом, несмотря на то, что немодифицированный рекомбинантный аллерген Bet v 1 является существенно растворимым (Hoffmann-Sommergruber et al., 1997, Prot. Expr. Purific. 9: 233-39; van Hage-Hamsten at al., 1999, J. Allergy Clin. Immunol. 104: 969-7).
Объект, таким образом, обеспечивает способ, который предоставляет возможность очистки рекомбинантных белков в форме "телец включения" определенных аллергенов или белков, имеющих аллергенное действие, простым и эффективным способом, в то время как он свободен от указанных выше недостатков способов предшествующего уровня техники. Кроме того, объект заключается в изоляции белков таким образом, чтобы во время, а особенно в конце очистки, они пребывали в форме, которая дает им возможность стать доступными непосредственно и без дальнейшей обработки для медицинского или диагностического использования.
Данное изобретение представляет собой биохимический способ очистки, который посредством эффективного одно- или многоступенчатого, преимущественно одно- - трехступенчатого метода очистки приводит к получению чистых форм белков из рекомбинантных белков, находящихся после экспрессии в форме телец включения, при использовании существенно небуферированных щелочных элюентов.
Изобретение также представляет собой способ, в котором рекомбинантные белки в дальнейшем остаются в растворе при быстрой нейтрализации после заключительного этапа очистки. В то же время таким образом получают физиологическую среду.
В частности, способ особенно оптимизирован для получения рекомбинантных аллергенов и вариантов аллергенов. Способ представляет собой общее применение для этих первичных продуктов экспрессии. Аллергены и варианты аллергенов из других источников, экспрессируемые, главным образом, как тельца включения, могут также очищаться таким образом, подвергаться ренатурации и вводиться в состав рецептур.
Для целей изобретения термин "варианты аллергенов" предназначен для обозначения фрагментов, мультимеров, таких как, например, димеры или тримеры, а также модификаций исходных аллергенов или их фрагментов/мультимеров. Для целей изобретения последние могут иметь вставки, делеции или замены одной или более аминокислот.
Предпочтение отдается вариантам рекомбинантных аллергенов, которые не существуют в природе и которые не имеют или имеют сниженную IgE активность, но при этом сохраняют Т-клеточную активность. Способ особенно приемлем для изоляции вариантов аллергенов основного аллергена пыльцы березы Bet v 1, а именно фрагментов А (аминокислоты 1-74) и В (аминокислоты 75-164) и рекомбинантного тримера. Рекомбинантные аллергены и варианты аллергенов, получаемые таким способом, являются в высшей степени приемлемыми для использования в специфической терапии и диагностике аллергических заболеваний.
Изобретение, таким образом, связано со способами получения очищенных рекомбинантных белков в растворимой, биологически активной форме как физиологической среды, которая является непосредственно приемлемой для медицинского использования, из белковых агрегатов ("телец включения"), получаемых в результате бактериальной экспрессии, и которые являются нерастворимыми в экспрессионной среде, при этом указанный способ может быть описан следующими этапами:
(i) помещение выделенных нерастворимых белковых агрегатов в органические денатурирующие реагенты,
(ii) очистка раствора, полученного на этапе (i), посредством, по крайней мере, одного хроматографического этапа при использовании существенно неорганического небуферированного щелочного, солесодержащего элюента, и
(iii) нейтрализация щелочного раствора, полученного после этапа заключительной очистки, при этом раствор содержит растворенный, ренатурированный и биологически активный белок.
Для очистки первоначально образованные нерастворимые агрегаты, прежде всего, растворяют в денатурирующих реагентах, которые сами по себе являются известными и, таким образом, указанные агрегаты подвергают денатурации. Предпочтение отдается использованию мочевины, в частности 5-10 М мочевине, желательно 8 М мочевине. Альтернативно также могут использоваться другие агенты, такие как, например, относительно высококонцентрированный раствор гидроокиси натрия или калия (0,2-1 М) или упомянутый выше гидрохлорид гуанидина.
На последующем этапе растворенный, денатурированный белок связывается с приемлемым хроматографическим материалом. В основном, приемлемыми в данной заявке являются ионитовые фильтры, предпочтительно анионитовые фильтры.
Хроматографический элюент, который используется в соответствии с изобретением, представляет собой неорганический, небуферированный, щелочной, солесодержащий раствор. Приемлемыми элюентами являются растворы, например, NaOH или КОН вместе с NaCl или KCl. Если это желательно, а также в предпочтительном воплощении добавляют гидрокарбонат натрия или гидрокарбонат калия. Желательно, чтобы элюенты содержали NaOH, NaCl или NaOH, NaCl и NaHCO3. Водный щелочной раствор в соответствии с изобретением имеет содержание NaOH или КОН от 5 мМ до 50 мМ (моль/л), предпочтительно от 15 до 25 мМ, в частности 20 мМ. Концентрация соли (например, NaCl) сначала является относительно низкой, пока белок крепко не связывается с ионообменным материалом. Начальная концентрация соли в соответствии с изобретением находится между 6 и 60 мМ, предпочтительно между 15 и 30 мМ, в частности 20 мМ. Благодаря этому удаляют денатурирующий агент и загрязняющие включения, которые не связались или не связаны достаточно прочно с хроматографическим материалом. Если добавляют NaHCO3, то содержание составляет от 5 до 15 мМ, предпочтительно 11 мМ.
Таким образом, изобретение относится к соответствующему способу, в котором денатурирующий реагент удаляется из денатурирующего раствора путем связывания растворенного рекомбинантного белка с хроматрографическим материалом и замены денатурирующего раствора существенно неорганическим, небуферированным, щелочным элюентом, имеющим концентрацию соли, которая обеспечивает связывание белка с указанным материалом обменника.
Для того чтобы элюировать связанный рекомбинантный белок, в соответствии со способом по данному изобретению более высокие концентрации соли (NaCl и KCl) обеспечиваются путем создания градиента, при этом другие условия остаются такими же. Предпочтительно использовать линейный градиент между 20 мМ NaCl (KCl) (начальное значение) и 0,5 М NaCl (конечное значение) Таким образом восстанавливают не только желаемый белок, но также отделяют его от других загрязнений (например, от других белков).
Таким образом, изобретение относится к соответствующему способу, который характеризуется тем, что рекомбинантный белок элюируется и освобождается от загрязнений путем увеличения концентрации соли, такого увеличения концентрации соли предпочтительно можно достичь при помощи создания градиента.
В ряде случаев этого оказывается достаточно и можно будет не продолжать далее этап очистки, поскольку элюированный белок является в достаточно степени очищенным в соответствии с требованиями В таких случаях этап нейтрализации, описанный более подробно ниже, проводят непосредственно после для того, чтобы получить готовый к употреблению активный белок.
В противном случае, в соответствии со способом выполняют последующий этап хроматографии. Все известные способы хроматографии могут использоваться в данном изобретении. Более подробно, это будет зависеть от химических/физических свойств определенного белка, который подвергают очистке. Предпочтительно, в частности в случае аллергенов и вариантов аллергенов Bet v 1 типа, проводить дальнейшую очистку путем хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий. Альтернативно, вместо этого также может использоваться гель-фильтрацию.
В предпочтительном воплощении способ в соответствии с изобретением представляет собой трехэтапный способ, который включает ионо-обменную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия и гель-фильтрацию, предпочтительно в установленной последовательности. Однако это не означает ограничения способа в соответствии с изобретением.
Таким образом, изобретение также относится к соответствующему способу, который включает, по крайней мере, один хроматографический этап, предпочтительно хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия и/или гель-фильтрацию.
Для данного изобретения является существенным на всех этапах очистки, что их проводят с тем же качественным и количественным составом композиции элюентов, которая уже была описана выше: NaOH, NaCl и предпочтительно NaHCO3 или соответствующие производные калия. Только концентрация компонента хлорида натрия может колебаться в широких пределах на различных этапах. Таким образом, например, в хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия может использоваться концентрационный градиент NaCl (KCl) от высокого (1-3 М, предпочтительно, 2 М) до низкого (30-10 мМ, предпочтительно 20 мМ). Заключительная концентрация в данном случае коренным образом зависит от желаемой концентрации соли после заключительного этапа очистки. Эта концентрация в соответствии с изобретением является физиологически допустимой концентрацией раствора. Если, к примеру, гель-фильтрация представляет собой заключительный этап очистки предпочтительного трехэтапного способа очистки, то используется концентрация NaCl в пределах приблизительно 150 мМ. Кроме того, предпочтительную конечную концентрацию соли после заключительного этапа можно также контролировать путем разведения или добавления соли, это, в свою очередь, зависит от количеств целевого белка, который подвергают хроматографии.
После заключительного этапа очистки - гель-фильтрации - в предпочтительном воплощении способа раствор нейтрализуют или белок ренатурируют путем добавления разбавленной кислоты, предпочтительно HCl, при рН, которое устанавливается на уровне 6,5-8,0. Раствор с активным рекомбинантным белком может теперь, в случае необходимости, после последующей доводки содержания соли (например, Na+) и содержания белка, непосредственно использоваться в препаративной форме.
Таким образом, изобретение связано с соответствующим способом, который характеризуется тем, что нейтрализацию выполняют в интервале рН между 6,5-8,0 после окончания очистки с помощью разведенной кислоты, в частности, предпочтительным является использование разведенной HCl.
Способ в соответствии с изобретением описывается более подробно ниже с использованием примера изоляции вариантов аллергена основного аллергена пыльцы березы Bet v 1, а именно рекомбинантных фрагментов А (аминокислоты 1-74) и В (аминокислоты 75-164) и рекомбинантного тримера.
Для очистки изначально нерастворимые агрегаты денатурируют, предпочтительно в 8 М мочевине. Альтернативно, могут использоваться также другие агенты, например, 0,2 М раствор гидроокиси натрия.
Первый этап хроматографической очистки выполняют посредством анионобменной хроматографии, например, при использовании источника Q. При этом большинство аллергенов или вариантов аллергенов связываются с носителем и переносятся в элюент при помощи исходного денатурирующего раствора. Щелочной элюент служит причиной того, что белки остаются в растворе. Элюирование градиентом NaCl вызывает частичное удаление бактериального загрязнения и активных фрагментов ингредиентов.
На двух последующих этапах очистки, хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия и гель-фильтрации, предварительно очищенные и уравновешенные аллергены или варианты аллергенов являются существенно свободными от бактериального загрязнения, которое еще осталось. С этой целью используются существенно те же элюентные вещества, состоящие из основания низкого молекулярного веса и варьирующего содержания неорганической соли. Таким образом, изобретение связано со специфической элюентной системой, в которой рекомбинантные белки, подвергаемые очистке, содержатся в растворе при мягких условиях во время очистки, и которая приводит к его эффективной очистке. После заключительного хроматографического этапа очищенные рекомбинантные белки могут в соответствии с изобретением быть изолированы в растворимой форме или ренатурированы простой нейтрализацией основы, которая присутствует в элюенте, при использовании соответствующей кислоты. Сделав приемлемый выбор концентрации элюентных добавок, готовят физиологический раствор, который является приемлемым для парентеральных препаратов. Очищенные рекомбинантные аллергены или варианты аллергенов идентифицируются при использовании их известных физических, химических, иммунологических или биологических свойств, в частности, при использовании изоэлектрического фокусирования, SDS-ПАГЭ и специфических моноклональных антител, а также IgE антител больных аллергией. Растворитель тестируется с помощью измерения рН, оценки количества Na+ и Cl- и, в случае необходимости, концентрации СО3-. Эти способы общеизвестны и описаны. Выход рекомбинантных аллергенов или вариантов аллергенов в очищенной форме и растворенных в соответствии с изобретением составляет 75-95% по отношению к исходному белку.
Аллергенные компоненты, приготовленные таким образом, могут использоваться при in vivo и in vitro диагностике как часть процесса идентификации, дающего возможность выявить аллергенный компонент спектра пациент-специфической чувствительности, а также для специфической иммунотерапии аллергий. Кроме того, фармацевтические композиции в форме препаратов длительного хранения могут быть приготовлены превращением очищенных рекомбинантных белков.
Предпочтительный вариант воплощения способа в соответствии с изобретением представлен на диаграмме, приведенной ниже (Таблица 1):
Таблица 1
Изоляция телец включения
Денатурация, например, в 8 М мочевине
Анионобменная хроматография, например, при использовании источника Q
Раствор А: 20 мМ NaOH, 20 мМ NaCl, 11 мМ NaHCO3
Раствор В: 20 мМ NaOH, 0,5 М NaCl, 11 мМ NaHCO3
(Необязательно) хроматография на основе гидрофобного взаимодействия,
например, при использовании источника РНЕ
Раствор А: 20 мМ NaOH, 2 М NaCl, 11 мМ NaHCO3
Раствор В: 20 мМ NaOH
(Необязательно) гель-фильтрация, например, Superdex 75
Раствор А: 10 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3, 148,4 мМ NaHCO3
Ренатурирующая композиция I
Целевой белок в 10 мМ NaOH, 148,4 мМ NaCl, 11 мМ NaHCO3 + добавление 100
мМ HCl к 10 мМ = растворимый целевой белок в 0,154 М Na+ растворе
Таким образом, можно наблюдать следующее: данное изобретение позволяет при использовании способа в соответствии с изобретением сделать возможным посредством специфической композиции хроматографических элюентов, выбора хроматографической среды, установления специфического рН и, таким образом, содержания соли, технологически и фармакологически осуществимого способа изоляции высокоочищенных, растворимых рекомбинантных аллергенов или вариантов аллергенов, которые первоначально готовят как нерастворимые агрегаты, достичь способа, который требует незначительных трудозатрат и времени. Поскольку условия, при которых рекомбинантные белки очищают и ренатурируют или растворяют, являются мягкими и фармакологически более приемлемыми по сравнению с известными способами, активные ингредиенты можно использовать как для диагностики, так и для парентеральной терапии аллергических заболеваний.
Пример
Изоляция растворимых вариантов аллергена Bet v 1 (терапевтически эффективные варианты аллергенов рекомбинантного Bet v 1, фрагменты А и В, тример Bet v 1)
Тельца включения вариантов аллергенов, очищенные с помощью стандартных способов, предпочтительно денатурируют в 8 М мочевине, 20 мМ Трис/HCl. После завершения денатурации проводят фильтрацию, предпочтительно через фильтр с размером пор 0,22-0,45 мкм, или центрифугирование, предпочтительно 5-15 минут при 10,000-20,000×g. Осветленный раствор используют для ионно-обменной хроматографии с источником 15 Q (Pharmacia), при использовании материала носителя, который уравновешен щелочным раствором, предпочтительно 20 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3 и 20 мМ NaCl. Материал твердого носителя должен быть стабильным при значениях рН до 12,0. Относительно высокое значение рН исходного раствора является причиной того, что фактически все целевые белки связываются с анионным обменником. Исключение составляют очень редкие белки, изоэлектрическая точка которых выше 11,0. Промывание иммобилизованных белков начальным раствором эффективно удаляет денатурирующий раствор (например, 8 М мочевину) и фармакологически нежелательные буферные вещества (например, Трис). Этот способ обеспечивает тот факт, что замена растворителем, который улучшает последующие этапы разделения, происходит при сохранении растворимости рекомбинантных белков. Последующее элюирование выполняют с помощью повышающегося градиента NaCl, например от 20 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3, 20 мМ NaCl до 20 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3, 0,5 М NaCl, это приводит к отделению загрязнений (белки клетки-хозяина) и активных фрагментов ингредиентов.
Последующий хроматографический этап представляет собой хроматографию на основе гидрофобных взаимодействий (только для фрагментов). С этой целью элюат этапа 1 доводят до высокой молярности солевого раствора, например, 5 М NaCl и 20 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3, и таким образом связывают целевые белки. Элюирование связанного белка проводят с помощью щелочного раствора, который содержит низкую концентрацию соли или не содержит соли, например 20 мМ NaOH. Твердый материал носителя, используемый для хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий, должен быть также стабильным по отношению к щелочи до значения рН 12, как, например, источник РНЕ.
На третьем этапе гель-фильтрацию, например, с помощью Superdex 75, проводят при щелочных условиях. Хроматографический раствор выбирают таким образом, что нейтрализация основания, прибавленного к элюенту, приводит к желаемой заключительной композиции, как, например, 10 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3, 148,4 мМ NaCl.
Элюат, полученный в результате гель-фильтрации, в заключение нейтрализуют, используя кислоту, соответствующую использованному основанию, посредством чего, с одной стороны, устанавливается нейтральное значение рН, и белок, таким образом, превращается в растворимую форму или ренатурируется и, с другой стороны, устанавливается желаемая концентрация соли посредством нейтрализации. Таким образом, например, раствор гель-фильтрации, который включает 10 мМ NaOH, 11 мМ NaHCO3, 148,4 мМ NaCl, превращают в физиологический раствор путем добавления 1/10 (об./об.) 100 мМ HCl. Растворитель тестируют простым измерением рН и оценки количества Na+. Таким образом, способ в соответствии с изобретением предусматривает минимальную обработку образца, незначительную длительность обработки образца, использование исключительно фармакологически совместимых веществ, возможность использования отдельного элюента с минимальными вредными принципами разделения, возможность избежать длительных и, при определенных обстоятельствах, несостоятельных способов, таких как диализ. В дополнение, раствор гидроокиси натрия, который известен как эффективный бактериостатик, предохраняет присутствующие белки от деградации или контаминации микроорганизмами. Эндотоксины, которые могут вызвать проблемы при бактериальной экспрессии, также эффективно удаляются или подвергаются деградации. Последовательность и количество хроматографических этапов, описанных выше, может изменяться в зависимости от специфических физико-химических свойств целевых белков. Обзор растворов представлен в Таблице 2.
Нейтрализация/растворение после гель-фильтрации:
- медленное добавление 1/10 объема (основываясь на исходной смеси) 100 мМ HCl. Например, в 100 мл исходного раствора содержится:
10 мМ NaOH, 148,4 мМ NaCl, 11 мМ NaHCO3
после нейтрализации 110 мл
11 мМ NaHCO3×10/11=10 мМ NaHCO3
10 мМ NaOH/HCl(NaCl)×10/11=9,1 мМ NaCl
148,4 мМ NaCl×10/11=134,9 мМ NaCl
Заключительный раствор соответственно включает 154 мМ Na+, 144 мМ Cl- и 10 мМ СО3 -.
Таблица 2
Растворы для хроматографического разделения вариантов Bet v 1
Хроматогр. белок Применяемый образец Раствор А Раствор В Градиент
AIRX        
Фрагмент 1 8 М мочевина, 20 мМ Трис/HCl рН 8.0 20 мМ NaOH, 10 мМ NaCl, 11 мМ NaHCO3 20 мМ NaOH, 500 мМ NaCl, 11 мМ NaHCO3 10 OK
Фрагмент 2 смотри выше смотри выше смотри выше смотри выше
Тример смотри выше смотри выше 20 мМ NaOH, 800 мМ NaCl, 11 мМ NaHCO3 смотри выше
HIC        
Фрагмент 1 набор AIEX пула до 2 М NaCl 20 мМ NaOH, 2 мМ NaCl, 11 мМ NaHCO3 20 мМ NaOH 10 OK
Хроматогр. белок Применяемый образец Раствор А Раствор В Градиент
Фрагмент 2 набор AIEX пула до 3 М NaCl 20 мМ NaOH.
3 мМ NaCl,
11 мМ NaHCO3 		20 мМ NaOH 10 OK
Тример - - - -
Гель-фильтрация        
Фрагмент 1 HIC пул 10 мМ NaOH, 148,4 мМ NaCl, 11 мМ NaHCO3 - -
Фрагмент 2 смотри выше смотри выше - -
Тример Q пул смотри выше - -
Все растворы и фракции сохранялись при комнатной температуре (ОК = объем колонки).

Claims (12)

1. Способ получения следующих очищенных рекомбинантных вариантов Bet v 1 аллергена: тримера, фрагмента А (аминокислота 1-74) и фрагмента В (аминокислота 75-164), из телец включения, полученных в результате бактериальной экспрессии, которые являются нерастворимыми в экспрессионной среде, отличающийся тем, что включает следующие этапы:
(i) помещение выделенных нерастворимых телец включения в органические денатурирующие реагенты,
(ii) очистку раствора, полученного на этапе (i) путем, по крайней мере, одного хроматографического этапа при использовании по существу неорганических, небуферированных, щелочных, солесодержащих элюентов, содержащих NaOH, NaCl, NaHCO3, КОН, KCl и/или КНСО3, причем если применяют более чем один этап хроматографии, на этих этапах используют одинаковый качественный и количественный состав композиции элюентов с концентрационным градиентом компонента NaCl и/или KCl в пределах от 1-3 М до 30-10 мМ в случае хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия,
(iii) нейтрализацию щелочного раствора, полученного в результате заключительного этапа очистки, при этом указанный раствор содержит растворенный, ренатурированный и биологически активный белок.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что эти рекомбинантные варианты не имеют или имеют сниженную IgE активность, но сохранили Т-клеточную активность.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что используемым денатурирующим реагентом является гидрохлорид гуанидина.
4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что используемый денатурирующий реагент удаляют из денатурирующего раствора путем связывания растворенного рекомбинантного белка с хроматографическим материалом и замены денатурирующего раствора на неорганический, небуферированный, щелочной элюент, который имеет концентрацию соли, обеспечивающую связывание белка с указанным материалом обменника.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что связанный рекомбинантный белок элюируют с помощью увеличивающейся концентрации соли и в процессе обработки освобождают от загрязнений.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что увеличения концентрации соли достигают путем создания градиента.
7. Способ по любому из пп.4-6, отличающийся тем, что используемый хроматографический материал представляет собой анионитовый фильтр.
8. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что проводят, по крайней мере, один дальнейший этап хроматографической очистки.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что проводимый этап дальнейшей хроматографической очистки представляет собой хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия и/или гель-фильтрацию.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что используемый хроматографический элюент представляет собой NaOH, NaHCO3 и NaCl.
11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что нейтрализацию проводят после окончания очистки в интервале рН между 6,5-8,0.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что HCl используют для нейтрализации.
RU2003109430/13A 2000-09-08 2001-08-18 СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ Bet v 1 RU2299214C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10044360.5 2000-09-08
DE10044360A DE10044360A1 (de) 2000-09-08 2000-09-08 Verfahren zur Aufreinigung von rekombinanten als unlösliche Aggregate exprimierte Proteinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2003109430A RU2003109430A (ru) 2004-10-27
RU2299214C2 true RU2299214C2 (ru) 2007-05-20

Family

ID=7655449

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2003109430/13A RU2299214C2 (ru) 2000-09-08 2001-08-18 СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ Bet v 1

Country Status (14)

Country Link
US (1) US6900034B2 (ru)
EP (1) EP1315740B1 (ru)
JP (1) JP5174312B2 (ru)
CN (1) CN1468255A (ru)
AT (1) ATE443712T1 (ru)
AU (2) AU8769501A (ru)
CA (1) CA2421438C (ru)
DE (2) DE10044360A1 (ru)
ES (1) ES2333939T3 (ru)
HU (1) HUP0303554A2 (ru)
PL (1) PL206158B1 (ru)
PT (1) PT1315740E (ru)
RU (1) RU2299214C2 (ru)
WO (1) WO2002020559A1 (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL206709B1 (pl) † 2002-02-27 2010-09-30 Merck Patent Gmbh Sposób wytwarzania i sposób obniżania aktywności IgE głównego hipoalergicznego alergenu pyłku brzozy rBet v 1, główny hipoalergiczny alergen pyłku brzozy rBet v 1uzyskiwany takim sposobem i jego zastosowanie jako leku oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca taki główny alergen
CA2487673C (en) * 2003-12-02 2010-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved method for the recombinant production and purification of protein kinases
RU2513948C2 (ru) * 2008-08-08 2014-04-20 Янссен Фармацевтика Нв Антиаллергенные комбинации солей кальция и лантана
EP2721051B1 (en) * 2011-06-15 2017-11-29 ASIT BioTech s.a. A method for the production of hydrolyzed allergens
CN104558100A (zh) * 2015-02-04 2015-04-29 吉林农业大学 包涵体的预处理方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0432419T3 (da) * 1989-12-05 1994-11-14 American Cyanamid Co Fremgangsmåde til solubilisering og naturering af somatotropiner under anvendelse af lav urinstofkoncentration
US5912327A (en) * 1996-09-30 1999-06-15 Human Genome Sciences, Inc. Method of purifying chemokines from inclusion bodies
SE9703531D0 (sv) * 1997-09-30 1997-09-30 Rudolf Valenta Non-anaphlactic forms of allergens and their use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
К.HOFFMANN-SOMMERGRUBER ЕТ AL. High-level expression and purification of the major birch pollen allergen. Bet v 1. Protein expression and purification, 1999, 9, 33-39. *

Also Published As

Publication number Publication date
ATE443712T1 (de) 2009-10-15
DE50115119D1 (de) 2009-11-05
HUP0303554A2 (hu) 2004-03-01
AU8769501A (en) 2002-03-22
WO2002020559A1 (de) 2002-03-14
PT1315740E (pt) 2009-12-29
JP5174312B2 (ja) 2013-04-03
AU2001287695B2 (en) 2006-10-05
CA2421438C (en) 2010-10-26
EP1315740B1 (de) 2009-09-23
EP1315740A1 (de) 2003-06-04
US6900034B2 (en) 2005-05-31
JP2004508384A (ja) 2004-03-18
PL359713A1 (en) 2004-09-06
CN1468255A (zh) 2004-01-14
PL206158B1 (pl) 2010-07-30
CA2421438A1 (en) 2003-03-06
US20030170815A1 (en) 2003-09-11
ES2333939T3 (es) 2010-03-03
DE10044360A1 (de) 2002-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0359593B2 (fr) Séparation chromatographique des protéines du plasma, notamment du facteur VIII, du facteur von Willebrand, de la fibronectine et du fibrinogène
US4228154A (en) Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography
WO2010130810A1 (en) Extracellular yaluronidase from streptomyces koganeiensis
DK175251B1 (da) Renfremstilling af erythropoietin
RU2299214C2 (ru) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ Bet v 1
US20090069236A1 (en) PROCESS FOR THE PREPARATION OF HYPOALLERGENIC MAJOR BIRCH POLLEN ALLERGEN rBet v 1
US20090281282A1 (en) Method for the isolation of haptoglobin
JPH01502556A (ja) イー・コリにおいて発現したピー・ファルシパラム・ｃｓタンパク質ワクチンの単離および精製方法
JP2011097940A (ja) オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌｐ１の変異体
CA2307655C (en) Tolerogenic fragments of natural allergens
TWI593702B (zh) 純化由細胞培養而來的ａｌｐｈａ蛋白酶抑制劑
WO2020234742A1 (en) Granulocyte colony stimulating factor purification
EP2670429B1 (en) Method for inactivation/removal of coagulation factors by precipitation
JP2007277094A (ja) 改変ダニ主要アレルゲン含有医薬組成物
WO2019077432A1 (en) IMPROVED PURIFICATION METHOD OF RECOMBINANT PTH (1-34)
JP2020511516A (ja) 組換え抗体断片の精製方法
JPWO2004099406A1 (ja) 改変ダニ主要アレルゲンの精製方法
JP4798831B2 (ja) ヒト血清アルブミンのミスホールディングを抑制する方法
JP2024537490A (ja) タンパク質を単離するための構成及び方法
JPH06228197A (ja) 卵黄からのγーリベチンの分画方法
JPH089980A (ja) 百日咳菌由来感染防御成分の分離取得方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20170819