ES2333939T3 - Metodo para purificar diferentes formas de alergenos bet v 1 recombinantes expresados como agregados insolubles. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de las siguientes variantes del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 recombinantes y purificadas en forma soluble, activas biológicamente y presentes en un medio fisiológico adecuado para utilizarse directamente en medicina: - trímero, - fragmento A (aminoácidos 1-74) y -fragmento B (aminoácidos 75-164), a partir de agregados proteicos (cuerpos de inclusión) insolubles en el medio de expresión y que se han obtenido tras la expresión bacteriana, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas: (i) extracción de los agregados proteicos insolubles separados en los reactivos orgánicos desnaturalizantes, (ii) purificación de la disolución obtenida en (i) mediante, como mínimo, una etapa cromatográfica con el uso de eluyentes esencialmente inorgánicos, alcalinos sin tamponar y salinos, en la que la etapa indispensable es una cromatografía de intercambio iónico, y (iii) neutralización de la disolución alcalina obtenida tras la última etapa de purificación y que contiene la proteína disuelta, renaturalizada y biológicamente activa.

Description

Método para purificar diferentes formas de alergenos Bet v 1 recombinantes expresados como agregados insolubles.

La invención se refiere a un procedimiento para la solubilización y purificación de proteínas recombinantes que se expresan en células huésped bacterianas y se almacenan como agregados (inclusión bodies, cuerpos de inclusión) insolubles. La purificación se basa en la conversión de los mencionados "cuerpos de inclusión" a una forma soluble mediante el uso de reactivos desnaturalizantes orgánicos y el empleo de procedimientos cromatográficos. En este caso se seleccionan eluyentes inorgánicos, alcalinos y salinos que, tras la purificación efectuada, permiten obtener las proteínas recombinantes, después de la neutralización, en una forma fisiológicamente aceptable que se puede utilizar directamente para el uso médico. El procedimiento es especialmente adecuado para la purificación de alergenos y fragmentos de alergenos.

El procedimiento según la invención se lleva a cabo según las condiciones indispensables de la ciencia farmacéutica (GMP). Los principios activos farmacéuticos se pueden utilizar como medicamentos parenterales directamente tras la solubilización. Los alergenos o variantes alergénicas recombinantes preferidos que se preparan conforme al procedimiento según la invención pueden encontrar su uso en terapias mejoradas o bien en el diagnóstico de enfermedades alérgicas.

En la preparación de proteínas recombinantes mediante células huésped bacterianas o procariotas, como por ejemplo E. coli, un problemas general es que las proteínas que se expresan no presentan el correspondiente pliegue nativo correcto que normalmente se necesita para mostrar una actividad biológica completa. A menudo, el pliegue incorrecto provoca que una serie de proteínas sólo se presenten en forma insoluble en el medio de expresión, es decir, se almacenan en forma de agregados, los cuales han irrumpido en la bibliografía científica como los conocidos "cuerpos de inclusión". La formación de los llamados "cuerpos de inclusión" repercute negativamente en la purificación y la necesaria disponibilidad en disolución de la proteína recombinante expresada (Marston y col., 1986, Biochem J. 240: 1-12). Para poder purificar las proteínas recombinantes almacenadas en bacterias, a menudo se añaden a los eluyentes cromatográficos sustancias desnaturalizantes, como por ejemplo urea o clorhidrato de guanidinio. Sin embargo, estos aditivos no son compatibles con todos los métodos de separación, como por ejemplo la cromatografía de interacción hidrofóbica. Además, los productos se pueden modificar desfavorablemente mediante reacciones químicas, como por ejemplo mediante cianato, que se puede formar en las disoluciones de urea. La extracción del medio desnaturalizante y con ello la posible renaturalización normalmente se efectúa por diálisis, diafiltración o filtración de gel. Estos procesos no sólo son largos, sino que a menudo provocan una nueva precipitación del producto. Es difícil comprobar analíticamente la eliminación completa en el producto final de los medios desnaturalizantes arriba mencionados. El problema expuesto arriba es de especial importancia en la preparación y purificación de alergenos y variantes alergénicas recombinantes.

En las últimas décadas, las alergias de tipo 1 han crecido drásticamente por todo el mundo. En los países industrializados, hasta un 20% de la población sufre dolencias, como la rinitis alérgica, la conjuntivitis o el asma bronquial, provocadas por alergenos que se encuentran en el aire (aeroalergenos) y que son liberados por diferentes fuentes como el polen de las plantas, los ácaros, los mamíferos (gatos, perros, caballos) y los mohos. Las alergias graves también se pueden producir por picaduras de insectos, como por ejemplo de abejas y avispas.

Las sustancias que provocan las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción en las mucosas o tras la picadura, estos alergenos reaccionan con los anticuerpos IgE que están unidos a la superficie de los mastocitos. Si dos o más anticuerpos IgE se enlazan mediante un alérgeno, esto provoca la liberación de mediadores (p. ej. histamina, prostaglandinas) y citoquinas en las células efectoras y con ello se desencadenan los síntomas alérgicos. Con la ayuda de secuencias de ADNc es posible preparar alergenos recombinantes que se puedan utilizar en el diagnóstico y la terapia de alergias (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391). Los alergenos recombinantes pueden alcanzar una especial importancia en los métodos de diagnóstico que hacen posible la identificación de los espectros de sensibilización de IgE individuales en comparación con extractos convencionales. Aparte de esto, son posibles las modificaciones selectivas por ingeniería genética de los alergenos recombinantes mediante las cuales se puede obtener un potencial alergénico reducido, manteniendo inalterada la reactividad con las células T auxiliares reguladoras (Schramm y col., 1999, J. Immunol. 162 (4): 2406-2414; Valenta y col., 1999, Biol. Chem. 380: 815-24; Singh y col., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 119: 75-85). Estas variantes alergénicas son futuros candidatos prometedores para la inmunoterapia específica de las alergias de tipo 1. En especial, el último alérgeno modificado mencionado es objeto del procedimiento según la invención.

En este contexto, es de especial importancia la producción de alergenos y variantes alergénicas recombinantes en los sistemas de expresión bacterianos más utilizados. Estos sistemas, en comparación con los sistemas eucariotas, ofrecen la ventaja de que se obtienen rendimientos de producto elevados incluso después de tiempos de expresión cortos. Además, desde el punto de vista farmacológico, presentan un riesgo mucho menor en cuanto a las contaminaciones virales y a los oncogenes. Sin embargo, en su preparación recombinante en sistemas de expresión bacterianos, los principales alergenos de diferentes fuentes, como por ejemplo los alergenos del polen de hierba del grupo 1 (Vrtala y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97: 781-7) y 13 (Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332), el alérgeno de ácaros Der f 2 (Iwamoto y col., 1996, Int. Arch. Allergy Immunol. 109: 356-61) así como los alergenos del veneno de insectos fosfolipasa A2 y hialuronidasa (Soldatova y col., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 101: 691-8; Kuchler y col., 1989, Eur. J. Biochem. 184: 249-254) se almacenan como cuerpos de inclusión en las células huésped. Incluso las variantes alergénicas, como por ejemplo los fragmentos y multímeros del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 (fragmento A, fragmento B, trímero Bet v 1) se comportan de este modo, a pesar de que el alérgeno recombinante Bet v 1 sin modificar es en gran parte soluble (Hoffmann-Sommergruber y col., 1997, Prot. Expr. Purific. 9:233-39; van Hage-Hamsten et al., 1999, J. Allergy Clin. Immunol. 104: 969-7).

Por consiguiente, la tarea consiste en poner a punto un procedimiento que permita purificar proteínas recombinantes existentes en forma de "cuerpos de inclusión", en especial alergenos, o proteínas con efecto alergénico, de un modo fácil y eficaz que evite los inconvenientes arriba mencionados del procedimiento según el estado de la técnica. Aparte de eso, la tarea consiste en obtener las proteínas de modo que durante y, en especial, al final de la purificación se encuentren en una forma que permita que se puedan poner a disposición para el uso médico o diagnóstico directamente y sin más procesamiento.

La presente invención trata de un método de purificación bioquímico que, mediante un procedimiento de purificación de una o varias etapas, preferiblemente de una a tres etapas, de las variantes recombinantes del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1, que existen en forma de cuerpos de inclusión tras su expresión, proporciona una presentación pura de las proteínas con el uso de eluyentes básicamente alcalinos sin tamponar.

La invención también trata de un procedimiento en el que las proteínas recombinantes permanecen en disolución tras la última etapa de purificación mediante una neutralización rápida. De este modo, al mismo tiempo se produce la creación de un medio fisiológico.

En el sentido de la invención, se entiende como variantes alergénicas los fragmentos, los multímeros, como por ejemplo dímeros o trímeros, aunque también las modificaciones de los alergenos originales o de sus fragmentos/multímeros. Por último, en el sentido de la invención se presentan inserciones, deleciones o sustituciones de uno o varios aminoácidos.

Preferentemente se utilizan variantes alergénicas recombinantes que no existen en la naturaleza y que poseen una actividad IgE nula o reducida, a pesar de que conservan la actividad con las células T. El procedimiento es adecuado para la obtención de variantes alergénicas del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1, o sea, de los fragmentos A (aminoácidos 1-74) y B (aminoácidos 75-164) recombinantes, así como de un trímero recombinante. Los alergenos y variantes alergénicas recombinantes preparados conforme a este procedimiento son especialmente adecuados para ser utilizados en la inmunoterapia específica y el diagnóstico de enfermedades alérgicas.

Por consiguiente, el objeto de la invención es un procedimiento para la preparación de variantes recombinantes purificadas del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 en forma soluble, activa biológicamente y presente en un medio fisiológico adecuado para utilizarse directamente en medicina, a partir de agregados proteicos (cuerpos de inclusión) insolubles en el medio de expresión y que se han obtenido tras la expresión bacteriana, el cual se describe a través de las etapas siguientes:

(i) extracción de los agregados proteicos insolubles separados en los reactivos orgánicos desnaturalizantes,

(ii) purificación de la disolución obtenida en (i) mediante una etapa cromatográfica, como mínimo, con el uso de un eluyente esencialmente inorgánico, alcalino sin tamponar y salino y

(iii) neutralización de la disolución alcalina obtenida tras la última etapa de purificación y que contiene la proteína disuelta, renaturalizada y biológicamente activa.

Para la purificación, al principio se disuelven los agregados insolubles formados en primer lugar en los reactivos desnaturalizantes conocidos para ellos y de esta forma se desnaturalizan. Preferentemente se utiliza urea, en especial urea 5 a 10 M, preferentemente urea 8 M. Como alternativa también se pueden utilizar otros medios, como por ejemplo sosa o potasa cáustica de elevada concentración (0,2 M a 1 M) o el clorhidrato de guanidinio anteriormente mencionado.

En otro paso, la proteína disuelta desnaturalizada se enlaza a un material cromatográfico adecuado. En este caso, en primer lugar son adecuados los intercambiadores iónicos, preferentemente los intercambiadores aniónicos.

Según la invención, como eluyente de la cromatografía se utiliza una disolución esencialmente inorgánica, alcalina sin tamponar y salina. Los eluyentes adecuados son disoluciones de, por ejemplo, NaOH o KOH junto con NaCl o KCl. En caso necesario y en una forma de ejecución preferida se añade al eluyente hidrogenocarbonato sódico o potásico para permitir la disminución del pH. Los eluyentes preferidos contienen NaOH, NaCl, o NaOH, NaCl y NaHCO_{3}. Según la invención la disolución alcalina acuosa presenta además un contenido de NaOH o KOH de 5 mM a 50 mM (mol/L), preferentemente de 15 a 25 mM, en especial 20 mM. La concentración de sal (p. ej. NaCl) es relativamente baja al principio, para que la proteína se pueda fijar sobre el material intercambiador de iones. Según la invención, la concentración inicial de sal se encuentra entre 5 y 50 mM, preferentemente entre 15 y 30 mM, en especial es de 20 mM. De este modo se elimina el medio desnaturalizante así como las impurezas que no se enlazan o no se enlazan lo suficiente al material cromatográfico. Si se añade NaHCO_{3}, éste presenta un contenido de 5 a 15 mM, preferentemente de 11 mM.

Por consiguiente, el objeto de la invención es un procedimiento adecuado con el que se elimina el reactivo desnaturalizante de la disolución de des- naturalización, en el que la proteína recombinante disuelta se enlaza a un material cromatográfico y la disolución desnaturalizada se intercambia con un eluyente esencialmente inorgánico y alcalino sin tamponar que asegura un enlace de la proteína sobre el mencionado material de intercambio.

Conforme al procedimiento según la invención, para eluir la proteína recombinante enlazada se prepara un gradiente de una concentración de sal (NaCl o KCl) creciente manteniendo las demás condiciones constantes. Preferentemente se utiliza un gradiente lineal de entre unos 20 mM de NaCl (KCl) (valor inicial) y 0,5 M de NaCl (valor final). De este modo no sólo se vuelve a obtener la proteína objetivo, sino que también se separa de las demás impurezas (p. ej. otras proteínas). Por consiguiente, el objeto de la invención es un procedimiento adecuado que se caracteriza por que la proteína recombinante enlazada se eluye mediante un aumento de la concentración de sal y simultáneamente se eliminan las impurezas, en el cual, preferentemente, el aumento de la concentración de sal se consigue mediante un gradiente.

En algunos casos puede ser suficiente, sin añadir otra etapa de purificación, ya que la proteína eluída está purificada suficientemente, conforme a los requisitos. En estos casos sigue directamente la etapa de neutralización descrita abajo más detalladamente para obtener una proteína activa lista para ser utilizada.

De lo contrario, según el procedimiento, sigue otra etapa cromatográfica. En este caso, en general se pueden utilizar todos los métodos cromatográficos conocidos. En particular, esto depende de las propiedades químico-físicas de la proteína correspondiente que se debe purificar. En el caso de alergenos y variantes alergénicas de tipo Bet v 1, la siguiente purificación se realiza mediante una cromatografía de interacción hidrofóbica. Como alternativa, en lugar de eso también se puede realizar una filtración de gel.

Una forma de ejecución preferida del procedimiento según la invención es un procedimiento en tres etapas que incluye cromatografía de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica y filtración de gel, preferentemente en el orden mencionado. Sin embargo, esto no significa una restricción del procedimiento según la invención.

Por consiguiente, el objeto de la invención es un procedimiento adecuado que presenta como mínimo otro paso cromatográfico, preferentemente una cromatografía de interacción hidrofóbica y/o de filtración de gel.

Es básico para la invención que todas estas etapas de purificación se lleven a cabo con la misma composición cualitativa y cuantitativa de disolvente de elución o eluyente que ya se han descrito previamente con detalle: NaOH, NaCl y preferentemente NaHCO_{3}, o los correspondientes derivados de potasio. Únicamente la concentración del componente de sal común puede variar en las diferentes etapas. Así que, por ejemplo, en la cromatografía de interacción hidrofóbica se utiliza un gradiente de NaCl (KCl) desde una concentración elevada (1 - 3 M, preferentemente 2 M) hasta una menor (30-10 mM, preferentemente 20 mM). La concentración final depende finalmente de la concentración de sal deseada después de la última etapa de purificación. Según la invención, esta concentración deber ser la concentración de una disolución fisiológicamente compatible. Por ejemplo, si la filtración de gel es la última etapa de purificación en el procedimiento preferido de purificación de tres etapas, se utiliza NaCl aproximadamente 150 mM. Por último, la concentración final de sal deseada tras la última etapa se puede controlar mediante dilución o adición de sal, lo cual vuelve a depender de la cantidad cromatografiada de la proteína objetivo.

Tras al última etapa de purificación -la filtración de gel en la forma de ejecución preferida del procedimiento- se efectúa la neutralización de la disolución, o la renaturalización de la proteína, mediante la adición de un ácido diluido, preferentemente HCl, con el ajuste del valor de pH de 6,5 a 8,0. A partir de este momento, o en caso necesario tras el posterior ajuste del contenido de sal (p. ej. Na^{+}) y del contenido de proteína, la disolución con la proteína recombinante activa se puede utilizar directamente en la formulación.

Por consiguiente, el objeto de la invención es un procedimiento adecuado que se caracteriza porque la neutralización se lleva a cabo después de haber efectuado la purificación en un intervalo de valores de pH entre 6,5 y 8,0 y en la que se utiliza preferentemente un ácido diluido, en especial HCl diluido.

A continuación se describe en detalle el procedimiento según la invención como ejemplo de la obtención de variantes alergénicas del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1, o sea, de los fragmentos A (aminoácidos 1-74) y B (aminoácidos 75-164) recombinantes, así como de un trímero recombinante: Para la purificación los agregados insolubles primarios se desnaturalizan, preferentemente con urea 8 M. Como alternativa, también se pueden utilizar otros medios, por ejemplo sosa cáustica 0,2 M.

La primera etapa de purificación cromatográfica se realiza mediante una cromatografía de intercambio aniónico, por ejemplo en Source Q. En este caso la mayoría de alergenos o variantes alergénicas se enlazan al soporte y pasan de la disolución desnaturalizada inicial al eluyente. El eluyente alcalino provoca que las proteínas permanezcan en disolución. Mediante la elución por gradiente de NaCl se realiza una separación parcial de las impurezas bacterianas y los fragmentos de principio activo.

En dos etapas más de purificación, una cromatografía de interacción hidrofóbica y una filtración de gel, esencialmente se separan los alergenos o variantes alergénicas que se han purificado y equilibrado de las impurezas bacterianas todavía presentes. Para ello se utilizan fundamentalmente las mismas sustancias eluyentes, que consisten en una base de baja molaridad y un porcentaje variable de sal inorgánica. Por consiguiente, el objeto de la invención es un sistema de elución especial en el que durante la purificación las proteínas recombinantes a purificar se mantienen cuidadosamente en disolución y esto conduce a una purificación efectiva.

Tras la última etapa cromatográfica, las proteínas recombinantes purificadas se pueden obtener en forma disuelta según la invención mediante una neutralización simple de la base presente en el eluyente con un ácido adecuado o se pueden renaturalizar. Si se eligen adecuadamente las concentraciones de los aditivos del eluyente se obtiene una disolución fisiológica adecuada para medicamentos parenterales. La identificación de los alergenos o variantes alergénicas recombinantes purificados se realiza según sus características físicas, químicas, inmunológicas o biológicas conocidas, en especial mediante isoelectroenfoque, SDS-PAGE y anticuerpos monoclonales específicos, así como anticuerpos IgE de alérgicos. El control del disolvente se realiza mediante la medida del valor de pH y la cuantificación de la concentración de Na^{+} y Cl^{-}, así como de CO^{3-} en caso necesario. Estos procedimientos son conocidos por todos y están descritos. El rendimiento de los alergenos o variantes alergénicas recombinantes purificados y solubilizados según la invención es de 75-95% respecto a la proteína primaria de partida.

Los componentes alergénicos así preparados se pueden utilizar en el diagnóstico in vivo e in vitro en el marco de una identificación resolutoria de los componentes alergénicos dentro del espectro de sensibilización específico del paciente, así como para la inmunoterapia específica de alergias. Además se pueden elaborar preparaciones farmacéuticas en forma de preparaciones depot mediante la transformación de la proteína recombinante purificada. Una forma de ejecución preferida del procedimiento según la invención se presenta en el siguiente esquema (Tabla 1).

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TABLA 1

1

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Por consiguiente, en resumen se puede manifestar que: Por consiguiente, la presente invención hace posible, mediante el procedimiento puesto a disposición según la invención, el cual se caracteriza por la combinación especial del eluyente cromatográfico, la elección de los medios cromatográficos, así como el ajuste especial del valor de pH y con ello del contenido de sal, un método de producción aplicable tecnológica y farmacológicamente para la obtención de alergenos y variantes alergénicas recombinantes, solubles y de elevada pureza, que al principio se preparan en forma de agregados insolubles, con una baja inversión de tiempo y trabajo. Puesto que las condiciones en las que se purifican y renaturalizan, o solubilizan, las proteínas recombinantes, en comparación con los métodos conocidos, son cuidadosas y adecuadas farmacológicamente, los principios activos se pueden utilizar tanto para el diagnóstico como para la terapia parenteral de las enfermedades alérgicas.

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Ejemplo Obtención de variantes alergénicas solubles de Bet v 1 (variantes alergénicas efectivas terapéuticamente de Bet v 1 recombinante, fragmento A y B, así como del trímero Bet v 1)

Los cuerpos de inclusión de las variantes alergénicas purificados según los procedimientos estándar se desnaturalizan preferentemente con urea 8 M, Tris/HCl 20 mM. Tras la desnaturalización completa se lleva a cabo una filtración, preferentemente de 0,22-0,45 \mum, o una centrifugación, preferentemente de 5-15 min a 10000-20000 xg. La disolución aclarada se emplea en una cromatografía de intercambio iónico con Source 15Q (Pharmacia), en la que el soporte está equilibrado con una disolución alcalina, preferentemente de NaOH 20 mM, NaHCO_{3} 11 mM y NaCl 20 mM. El soporte debe estabilizarse a un valor de pH de hasta 12,0. El valor de pH relativamente elevado de la disolución inicial provoca que casi todas las proteínas objetivo se enlacen al intercambiador de aniones. La excepción son las proteínas extremadamente raras cuyo punto isoeléctrico está por encima de 11,0. Mediante el lavado de las proteínas inmovilizadas con la disolución inicial, se eliminan con eficacia tanto la disolución desnaturalizante (p. ej. urea 8 M) como las sustancias tampón no adecuadas farmacológicamente (p. ej. Tris). A través de este procedimiento se garantiza que con la conservación de la solubilidad de las proteínas recombinantes tiene lugar un cambio hacia un disolvente que hace posible la siguiente etapa de separación. La elución posterior se lleva a cabo con un gradiente creciente de NaCl, p. ej. de NaOH 20 mM, NaHCO_{3} 11 mM, NaCl 20 mM hasta NaOH 11 mM, NaHCO_{3} 11 mM, NaCl 0,5 mM y provoca una separación de las impurezas (proteínas de la célula huésped) y de fragmentos del principio activo.

La siguiente etapa cromatográfica presenta una cromatografía de interacción hidrofóbica (sólo para los fragmentos). Para esto el eluído de la etapa 1 se ajusta con una disolución salina de elevada molaridad, p. ej. NaCl 5 M y NaOH 20 mM, NaHCO_{3} 11 mM de tal manera que la proteína objetivo se enlaza. La elución de la proteína objetivo enlazada se produce con una disolución alcalina baja en sal o sin sal, p. ej. NaOH 20 mM. El soporte empleado para la cromatografía de interacción hidrofóbica debe ser asimismo estable frente los álcalis hasta pH 12, como p. ej. Source PHE.

Como tercera etapa se realiza una filtración de gel, p. ej. Superdex 75, en condiciones básicas. La disolución cromatográfica se selecciona de modo que provoque una neutralización de la base añadida al eluyente para obtener la formulación final deseada, como p. ej. NaOH 10 mM, NaHCO_{3} 11 mM y NaCl 148,4 mM.

Para terminar, el eluído de la filtración de gel se neutraliza con un ácido correspondiente a la base utilizada, así, por un lado, se ajusta un valor de pH neutro y con ello la proteína se renaturaliza o se convierte en una forma soluble y, por otro lado, mediante la neutralización se ajusta el contenido de sal deseado. Así, por ejemplo, una disolución de filtración de gel de NaOH 10 mM, NaHCO_{3}11 mM y NaCl 148,4 mM se convierte en una disolución fisiológica de sal común mediante la adición de HCl 100 mM 1/10 (v/v). El control del disolvente se lleva a cabo mediante una medida sencilla del valor de pH, así como una cuantificación de Na^{+}. Por consiguiente, según la invención el procedimiento incluye los mínimos tratamientos de muestra, un tiempo de residencia de la muestra corto, únicamente el uso de sustancias farmacológicamente compatibles, la compatibilidad de un único eluyente con varios principios de separación y la elusión de procedimientos largos y, dado el caso, que no se pueden validar, como la diálisis. Además, la sosa cáustica, conocida como agente bacteriostático efectivo, evita que las proteínas que contiene sean degradadas o impurificadas por microorganismos. Del mismo modo, las endotoxinas, que pueden ser problemáticas en la expresión bacteriana, se eliminan o degradan de forma efectiva. El orden y el número de las etapas cromatográficas descritas arriba se pueden modificar según las características fisicoquímicas específicas de las proteínas objetivo. En la Tabla 2 se presenta un resumen de las disoluciones.

Neutralización/Solubilización tras la filtración de gel

- adición lenta de HCl 100 mM 1/10 en volumen (en relación al original).

p.ej. 100 ml de disolución inicial contienen:

NaOH 10 mM, NaCl 148,4 mM, NaHCO_{3} 11 mM

después de la neutralización, 110 ml:

NaHCO_{3} 11 mM * 10/11 = NaHCO_{3} 10 mM

NaOH/HCl (NaCl) 10 mM * 10/11 = NaCl 9,1 mM

NaCl 148,4 mM * 10/11 = NaCl 134,9 mM

Por lo tanto, la disolución final se compone de Na^{+} 154 mM, Cl^{-} 144 mM, CO^{3-} 10 mM.

TABLA 2 Disoluciones para la separación cromatográfica de las variantes de Bet v 1

2

Todas las disoluciones y fracciones se almacenan a TA. (VC = volumen de la columna).

Claims (12)

1. Procedimiento para la preparación de las siguientes variantes del alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 recombinantes y purificadas en forma soluble, activas biológicamente y presentes en un medio fisiológico adecuado para utilizarse directamente en medicina:

- trímero,

- fragmento A (aminoácidos 1-74) y -fragmento B (aminoácidos 75-164),

a partir de agregados proteicos (cuerpos de inclusión) insolubles en el medio de expresión y que se han obtenido tras la expresión bacteriana, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

(i) extracción de los agregados proteicos insolubles separados en los reactivos orgánicos desnaturalizantes,

(ii) purificación de la disolución obtenida en (i) mediante, como mínimo, una etapa cromatográfica con el uso de eluyentes esencialmente inorgánicos, alcalinos sin tamponar y salinos, en la que la etapa indispensable es una cromatografía de intercambio iónico, y

(iii) neutralización de la disolución alcalina obtenida tras la última etapa de purificación y que contiene la proteína disuelta, renaturalizada y biológicamente activa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las variantes recombinantes mencionadas presentan una actividad IgE nula o disminuida, aunque mantienen la actividad con las células T.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque se utiliza urea o clorhidrato de guanidinio como reactivo desnaturalizante.

4. Procedimiento la reivindicación 1 a 3, caracterizado porque se elimina el reactivo desnaturalizante de la disolución de desnaturalización, en el que la proteína recombinante disuelta se enlaza a un material cromatográfico y la disolución desnaturalizada se intercambia frente un eluyente esencialmente inorgánico, alcalino sin tamponar, que presenta una concentración de sal entre 5 y 50 mM, que asegura un enlace de la proteína sobre el mencionado material de intercambio.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la proteína recombinante enlazada se eluye mediante un aumento de la concentración de sal y de este modo se separa de las impurezas.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque el aumento de concentración de sal se realiza mediante un gradiente.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 4 a la 6, caracterizado porque se utiliza un intercambiador aniónico como material cromatográfico.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 4 a la 7, caracterizado porque, como mínimo, se lleva a cabo otra etapa de purificación cromatográfica.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque como etapa cromatográfica adicional se lleva a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica y/o una filtración de gel.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 1 a la 9, caracterizado porque se utiliza NaOH, NaHCO_{3} y NaCl como eluyente cromatográfico.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizado porque tras la purificación efectuada, la neutralización se realiza en un intervalo de valores de pH entre 6,5 y 8,0.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se utiliza HCl para llevar a cabo la neutralización.