JP2595216B2 - α―アミラーゼインヒビターの結晶の製造方法 - Google Patents
α―アミラーゼインヒビターの結晶の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は内因性小麦α−アミラーゼインヒビターの精
製と結晶化のための方法に関する。
製と結晶化のための方法に関する。
殊に本発明は球状蛋白質の１種である内因性小麦α−
アミラーゼインヒビターをその酵素活性を有する状態の
ままで精製し、結晶化するための方法に関する。
アミラーゼインヒビターをその酵素活性を有する状態の
ままで精製し、結晶化するための方法に関する。
更に具体的には本発明は内因性小麦のα−アミラーゼ
インヒビターを低度に濃縮された状態の溶液から、透析
の手段によって精製しかつ粒形の大きい結晶として取り
出すための方法に関する。
インヒビターを低度に濃縮された状態の溶液から、透析
の手段によって精製しかつ粒形の大きい結晶として取り
出すための方法に関する。
種々の酵素を含めて、一般に球状蛋白質をより純粋に
かつ安定な形で得ることの要求が化学工業、食品工業、
医薬などの技術分野において存在する。さらにまた球状
蛋白質の立体構造の解明はこれら酵素などの球状蛋白質
の機能中心（作用中心）の決定のためにきわめて重要な
課題であり、そのために現在のところ球状蛋白質の結晶
のＸ線解析の手段が汎用されている。このＸ線解析の手
段を用いるためには試料となる球状蛋白質の結晶はＸ線
解析を可能とする程度に大きくなければならず、また高
純度であることが要求される。
かつ安定な形で得ることの要求が化学工業、食品工業、
医薬などの技術分野において存在する。さらにまた球状
蛋白質の立体構造の解明はこれら酵素などの球状蛋白質
の機能中心（作用中心）の決定のためにきわめて重要な
課題であり、そのために現在のところ球状蛋白質の結晶
のＸ線解析の手段が汎用されている。このＸ線解析の手
段を用いるためには試料となる球状蛋白質の結晶はＸ線
解析を可能とする程度に大きくなければならず、また高
純度であることが要求される。
こうした球状蛋白質の結晶の取得のために従来以下の
ような方法が用いられている。
ような方法が用いられている。
（１）高濃度蛋白質溶液に沈澱剤を加えるか透析の手段
によって半透膜を介して蛋白質溶液を高張液と接触させ
これを過飽和の状態にし、水溶性蛋白質を水に溶けてい
る状態から結晶状態に移行させる方法。
によって半透膜を介して蛋白質溶液を高張液と接触させ
これを過飽和の状態にし、水溶性蛋白質を水に溶けてい
る状態から結晶状態に移行させる方法。
この方法において使用される沈澱剤又は透析に用いる
透析用の高張液中に含まれる物質の例としては （ａ）硫酸アンモニウム等に代表される水に対する溶解
度が大な塩類 （ｂ）エタノール等に代表される水溶性有機溶媒 （ｃ）ポリエチレングリコール が挙げられる。
透析用の高張液中に含まれる物質の例としては （ａ）硫酸アンモニウム等に代表される水に対する溶解
度が大な塩類 （ｂ）エタノール等に代表される水溶性有機溶媒 （ｃ）ポリエチレングリコール が挙げられる。
この方法においては被処理蛋白質溶液の濃度は通常２
〜10％の範囲にあり、また透析用の高張液に含まれる物
質の濃度は例えば硫酸アンモニアの場合は2.0〜3.3Mと
高い濃度のものが用いられる。
〜10％の範囲にあり、また透析用の高張液に含まれる物
質の濃度は例えば硫酸アンモニアの場合は2.0〜3.3Mと
高い濃度のものが用いられる。
（２）高濃度蛋白質溶液のpHを蛋白質の等電点付近に調
節することにより蛋白質を電気的に中性にし、溶液中に
おける溶解度を低下せしめて結晶化をはかる方法。この
方法におけるpHの調節は弱い苛性ソーダ又は酢酸の添加
により行う。
節することにより蛋白質を電気的に中性にし、溶液中に
おける溶解度を低下せしめて結晶化をはかる方法。この
方法におけるpHの調節は弱い苛性ソーダ又は酢酸の添加
により行う。
（３）高濃度蛋白質溶液から徐々に水を蒸発させること
により適当量の水を除去し蛋白質を結晶化させる方法。
により適当量の水を除去し蛋白質を結晶化させる方法。
これらの従来方法では、高純度例えば90％以上の純度
の蛋白質の溶液が結晶取得のために必要であると考えら
れており、そのためにこのような高純度の蛋白質の溶液
を得るためには莫大な量の出発原料物質と何段階にも及
ぶ精製手段を必要とする。さらに上記（１）の方法では
比較的濃度の高い蛋白質の溶液を用いまた比較的濃度の
高い高張液を透析に用いることから濃度の高い蛋白質溶
液がその濃度を急速に更に高めることになり、多数の結
晶核が同時に出来やすくそのために得られる結晶は微小
化する傾向がある。また上記（２）の方法で用いるpH調
節剤によってはpHの変化が急激にすぎ蛋白質の立体構造
に変化が生ずるなどの不都合がある。さらに（３）の方
法では蛋白質は不純物と一緒に濃縮されるので得られる
結晶の純度は低く、また得量も低い欠点がある。
の蛋白質の溶液が結晶取得のために必要であると考えら
れており、そのためにこのような高純度の蛋白質の溶液
を得るためには莫大な量の出発原料物質と何段階にも及
ぶ精製手段を必要とする。さらに上記（１）の方法では
比較的濃度の高い蛋白質の溶液を用いまた比較的濃度の
高い高張液を透析に用いることから濃度の高い蛋白質溶
液がその濃度を急速に更に高めることになり、多数の結
晶核が同時に出来やすくそのために得られる結晶は微小
化する傾向がある。また上記（２）の方法で用いるpH調
節剤によってはpHの変化が急激にすぎ蛋白質の立体構造
に変化が生ずるなどの不都合がある。さらに（３）の方
法では蛋白質は不純物と一緒に濃縮されるので得られる
結晶の純度は低く、また得量も低い欠点がある。
上述した従来法では蛋白質の結晶化に高純度の蛋白質
溶液を必要とするが、これを比較的低純度の蛋白質溶液
で置換することは上述したような蛋白質の溶液の精製の
工程のいくつかを省略しうることになり、目的とする蛋
白質の収率に飛躍的な向上をもたらす。従って比較的低
純度の蛋白質溶液でも使用しうる方法の開発が求められ
るのである。
溶液を必要とするが、これを比較的低純度の蛋白質溶液
で置換することは上述したような蛋白質の溶液の精製の
工程のいくつかを省略しうることになり、目的とする蛋
白質の収率に飛躍的な向上をもたらす。従って比較的低
純度の蛋白質溶液でも使用しうる方法の開発が求められ
るのである。
また上述した従来法ではＸ線解析に用いうる程度の粒
度の大きい結晶の取得に困難がある。従ってここに粒度
の大きい結晶の取得が強く求められるのである。
度の大きい結晶の取得に困難がある。従ってここに粒度
の大きい結晶の取得が強く求められるのである。
更にまたこの蛋白質の結晶化に当たっては蛋白質を変
性させ、そのために蛋白質の立体構造（三次元構造）を
変化させるような操作条件を避け、出来るだけ蛋白質を
温和な条件で結晶化させ、もって蛋白質を未変成の状態
で取得することが望まれるのである。
性させ、そのために蛋白質の立体構造（三次元構造）を
変化させるような操作条件を避け、出来るだけ蛋白質を
温和な条件で結晶化させ、もって蛋白質を未変成の状態
で取得することが望まれるのである。
そして化学工業、食品製造工業、医薬品製造工業の局
面においては球状蛋白、殊に酵素を純粋にかつ高収率で
結晶の形で得ることには大きな意味がある。例えば麦
類、すなわち夫々小麦、大麦、ライ麦、カラス麦、ハダ
カ麦などに由来する澱粉糖化酵素のα−アミラーゼは夫
々の穀粒中に天然の状態で含まれているが、このものの
存在によって穀粒を貯蔵或いは製粉後貯蔵する場合に澱
粉は糖化作用をうけ、穀粒又は穀粉は劣化する。しかし
ながら、これらの穀物中にはこのα−アミラーゼの作用
を阻止するインヒビターも同時に存在しこのインヒビタ
ーすなわち内因性α−アミラーゼインヒビター（Endoge
nous α−amylase inhibitor）の作用によってα−アミ
ラーゼの作用が阻止されている。今、何等かの原因で存
在するα−アミラーゼの量に拮抗する量の内因性α−ア
ミラーゼインヒビターが不在の場合は上記した穀粒又は
穀粉の劣化が進行することになる。この場合、何等かの
技術的手段により内因性α−アミラーゼインヒビターか
このインヒビターとしての作用を有する物質を添加すれ
ば上記の劣化は阻止することができるのである。そして
この内因性α−アミラーゼインヒビターも球状蛋白質で
あって、このものの単離と純粋な形での取得には食品工
業上に大きな意義があるということができるのである。
面においては球状蛋白、殊に酵素を純粋にかつ高収率で
結晶の形で得ることには大きな意味がある。例えば麦
類、すなわち夫々小麦、大麦、ライ麦、カラス麦、ハダ
カ麦などに由来する澱粉糖化酵素のα−アミラーゼは夫
々の穀粒中に天然の状態で含まれているが、このものの
存在によって穀粒を貯蔵或いは製粉後貯蔵する場合に澱
粉は糖化作用をうけ、穀粒又は穀粉は劣化する。しかし
ながら、これらの穀物中にはこのα−アミラーゼの作用
を阻止するインヒビターも同時に存在しこのインヒビタ
ーすなわち内因性α−アミラーゼインヒビター（Endoge
nous α−amylase inhibitor）の作用によってα−アミ
ラーゼの作用が阻止されている。今、何等かの原因で存
在するα−アミラーゼの量に拮抗する量の内因性α−ア
ミラーゼインヒビターが不在の場合は上記した穀粒又は
穀粉の劣化が進行することになる。この場合、何等かの
技術的手段により内因性α−アミラーゼインヒビターか
このインヒビターとしての作用を有する物質を添加すれ
ば上記の劣化は阻止することができるのである。そして
この内因性α−アミラーゼインヒビターも球状蛋白質で
あって、このものの単離と純粋な形での取得には食品工
業上に大きな意義があるということができるのである。
さらにまたこのようにして得られた大きい粒子形状の
蛋白質結晶からはＸ線解析によってその三次元構造を決
定するデータの取得が可能であり、酵素の場合にはその
機能中心を決定するデータともなるので、この機能中心
部分を切り出すことや、この機能中心部分をそなえた別
異の蛋白質の合成などの手段を通じて酵素作用を有する
物質を新たに創造しうるなど蛋白質工学に新たな局面を
拓く技術として変成をうけていない蛋白質の大きい粒形
の結晶の取得が求められるのである。
蛋白質結晶からはＸ線解析によってその三次元構造を決
定するデータの取得が可能であり、酵素の場合にはその
機能中心を決定するデータともなるので、この機能中心
部分を切り出すことや、この機能中心部分をそなえた別
異の蛋白質の合成などの手段を通じて酵素作用を有する
物質を新たに創造しうるなど蛋白質工学に新たな局面を
拓く技術として変成をうけていない蛋白質の大きい粒形
の結晶の取得が求められるのである。
そこで本発明者らは今回（１）低純度の内因性小麦α
−アミラーゼインヒビターを緩衝液に溶解し、こうして
得られた溶液を低濃度の硫酸アンモニウム水溶液、アル
コールの水溶液もしくはポリエチレングリコールの水溶
液で透析するか、又は（２）低純度の前記インヒビター
を緩衝液に溶解し、こうして得られた溶液を前記インヒ
ビターの等電点の近傍のpHを有する低イオン強度の緩衝
液で透析することにより内因性小麦α−インヒビターの
大きい結晶が得られることを見いだして本発明を完成し
た。
−アミラーゼインヒビターを緩衝液に溶解し、こうして
得られた溶液を低濃度の硫酸アンモニウム水溶液、アル
コールの水溶液もしくはポリエチレングリコールの水溶
液で透析するか、又は（２）低純度の前記インヒビター
を緩衝液に溶解し、こうして得られた溶液を前記インヒ
ビターの等電点の近傍のpHを有する低イオン強度の緩衝
液で透析することにより内因性小麦α−インヒビターの
大きい結晶が得られることを見いだして本発明を完成し
た。
この発明の上記した（１）および（２）の方法におい
てはじめに内因性小麦α−アミラーゼインヒビターを溶
解する緩衝液としては中性、弱アルカリ性又は弱酸性に
調節したトリス−塩酸緩衝液、トリス−リン酸緩衝液、
イミダゾール−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などが用いら
れ、そしてこれらの緩衝液中には場合によっては防腐剤
例えばアジ化ナトリウムを含有させうるものとし、これ
らの緩衝液中へ内因性小麦α−アミラーゼインヒビター
は低濃度例えば２％以下の濃度で溶解される。このよう
な低濃度の溶液とする場合に透析工程における過飽和状
態への進行が徐々であるために結晶核の生成数が少な
く、結晶粒子の粗大化に好結果をもたらすのである。し
かしながら極端な低濃度は結晶の生成には好ましくな
い。
てはじめに内因性小麦α−アミラーゼインヒビターを溶
解する緩衝液としては中性、弱アルカリ性又は弱酸性に
調節したトリス−塩酸緩衝液、トリス−リン酸緩衝液、
イミダゾール−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などが用いら
れ、そしてこれらの緩衝液中には場合によっては防腐剤
例えばアジ化ナトリウムを含有させうるものとし、これ
らの緩衝液中へ内因性小麦α−アミラーゼインヒビター
は低濃度例えば２％以下の濃度で溶解される。このよう
な低濃度の溶液とする場合に透析工程における過飽和状
態への進行が徐々であるために結晶核の生成数が少な
く、結晶粒子の粗大化に好結果をもたらすのである。し
かしながら極端な低濃度は結晶の生成には好ましくな
い。
この発明の（１）の方法における透析に使用する硫酸
アンモニウム水溶液は1.0〜1.2M程度の濃度またはポリ
エチレングリコール水溶液は同じく２〜6w/v％程度の低
い濃度において用いられる。アルコール水溶液としては
緩衝液中で調製したメタノール溶液、同エタノール溶液
などが用いられ、アルコール濃度は10〜30v/v％程度の
もの、好ましくは15〜25v/v％程度のものが用いられ
る。
アンモニウム水溶液は1.0〜1.2M程度の濃度またはポリ
エチレングリコール水溶液は同じく２〜6w/v％程度の低
い濃度において用いられる。アルコール水溶液としては
緩衝液中で調製したメタノール溶液、同エタノール溶液
などが用いられ、アルコール濃度は10〜30v/v％程度の
もの、好ましくは15〜25v/v％程度のものが用いられ
る。
この発明の（２）の方法における透析に使用する緩衝
液としては、内因性小麦α−アミラーゼインヒビターを
溶解するのに用いた好ましくは低イオン強度の緩衝液と
は同様の組成ではあるが酸或いはアルカリの添加によっ
てそのpHが異なるもの、或いは別異の組成でかつそのpH
が異なるものが用いられる。いずれの場合にあっても透
析に用いる緩衝液はそのpHが内因性小麦α−アミラーゼ
インヒビターの等電点の近傍のものであることが必要で
ある。
液としては、内因性小麦α−アミラーゼインヒビターを
溶解するのに用いた好ましくは低イオン強度の緩衝液と
は同様の組成ではあるが酸或いはアルカリの添加によっ
てそのpHが異なるもの、或いは別異の組成でかつそのpH
が異なるものが用いられる。いずれの場合にあっても透
析に用いる緩衝液はそのpHが内因性小麦α−アミラーゼ
インヒビターの等電点の近傍のものであることが必要で
ある。
この発明の（１）および（２）の方法にいずれにおい
ても透析には半透膜が用いられるが、この半透膜には公
知の透析用の半透膜のいずれもが使用可能である。しか
して入手の容易な硝酸セルロース膜、コロジオン膜、セ
ロファン膜、ヴィスキングチューブ、セロファンチュー
ブなどが通常使用される。
ても透析には半透膜が用いられるが、この半透膜には公
知の透析用の半透膜のいずれもが使用可能である。しか
して入手の容易な硝酸セルロース膜、コロジオン膜、セ
ロファン膜、ヴィスキングチューブ、セロファンチュー
ブなどが通常使用される。
この方法における操作温度としては、蛋白質が変成し
ない温度範囲を用いうるが、30℃までの温度、好ましく
は４℃〜室温の条件下に操作される。
ない温度範囲を用いうるが、30℃までの温度、好ましく
は４℃〜室温の条件下に操作される。
この方法の操作においては内因性小麦α−アミラーゼ
インヒビターは上記した緩衝液中に所定の濃度に溶解
し、半透膜製のチューブ、例えばヴィスキングチューブ
に装入し、上記（１）の方法では硫酸アンモニウム溶
液、アルコール溶液、ポリエチレングリコール溶液中で
透析する。半透膜中の蛋白質水溶液は不純物と水分を徐
々に失い体積を減少してついに過飽和状態に達して蛋白
質は結晶を開始する。上記（２）の方法ではpHが蛋白質
の等電点近傍に調節された緩衝液中で半透膜製チューブ
に入れられた蛋白質溶液は透析されるので蛋白質溶液中
の蛋白質は溶解度を低下させて結晶の析出が開始され
る。この方法にあたっては数時間〜数10時間の操作によ
り結晶化は完了する。
インヒビターは上記した緩衝液中に所定の濃度に溶解
し、半透膜製のチューブ、例えばヴィスキングチューブ
に装入し、上記（１）の方法では硫酸アンモニウム溶
液、アルコール溶液、ポリエチレングリコール溶液中で
透析する。半透膜中の蛋白質水溶液は不純物と水分を徐
々に失い体積を減少してついに過飽和状態に達して蛋白
質は結晶を開始する。上記（２）の方法ではpHが蛋白質
の等電点近傍に調節された緩衝液中で半透膜製チューブ
に入れられた蛋白質溶液は透析されるので蛋白質溶液中
の蛋白質は溶解度を低下させて結晶の析出が開始され
る。この方法にあたっては数時間〜数10時間の操作によ
り結晶化は完了する。
この発明の方法を更に詳細に説明するために、実施例
によってこの方法を具体的に説明する。
によってこの方法を具体的に説明する。
小麦α−アミラーゼに対する内因性インヒビターの調
製： 小麦粉5kgと水20とを混合し、４℃で２時間撹拌し
た。２日間置した後、デカンテーションして約４の上
澄を得た。この上澄に硫酸アンモニウムを60％（w/v）
になるように添加し、一晩静置し、遠心分離機で沈澱を
集めた（10,000G、30分）。得られた約50gの湿潤沈澱を
30mMリン酸−15mMクエン酸緩衝液（pH5.3）200mlに溶か
し、同緩衝液にて２日間透析した。次いで、この緩衝液
で平衡化したCM・セファロースCL−6B（4.7×20cm）カ
ラムにて、０→0.5M NaCl勾配を使用してクロマト処理
し、粗インヒビター区分約2gを得た（純度５〜10％）。
製： 小麦粉5kgと水20とを混合し、４℃で２時間撹拌し
た。２日間置した後、デカンテーションして約４の上
澄を得た。この上澄に硫酸アンモニウムを60％（w/v）
になるように添加し、一晩静置し、遠心分離機で沈澱を
集めた（10,000G、30分）。得られた約50gの湿潤沈澱を
30mMリン酸−15mMクエン酸緩衝液（pH5.3）200mlに溶か
し、同緩衝液にて２日間透析した。次いで、この緩衝液
で平衡化したCM・セファロースCL−6B（4.7×20cm）カ
ラムにて、０→0.5M NaCl勾配を使用してクロマト処理
し、粗インヒビター区分約2gを得た（純度５〜10％）。
上記インヒビター含有区分を25mMトリス−塩酸緩衝液
にて２日間透析した後、同緩衝液で平衡化したDEAE・セ
ファロースCL−6B（2.7×15cm）カラムにて、０→0.5M
NaCl勾配を使用してクロマト処理し、粗インヒビター区
分約0.8gを得た（純度10〜20％）。
にて２日間透析した後、同緩衝液で平衡化したDEAE・セ
ファロースCL−6B（2.7×15cm）カラムにて、０→0.5M
NaCl勾配を使用してクロマト処理し、粗インヒビター区
分約0.8gを得た（純度10〜20％）。
かくして得られたインヒビター含有区分を25mM酢酸緩
衝液にて２日間透析した後、この緩衝液で平衡化したCM
・セファロースCL−6B（2.7×15cm）カラムにて０→0.8
M NaCl勾配を使用してクロマト処理し、粗インヒビター
区分約0.2gを得た（純度50〜60％）。
衝液にて２日間透析した後、この緩衝液で平衡化したCM
・セファロースCL−6B（2.7×15cm）カラムにて０→0.8
M NaCl勾配を使用してクロマト処理し、粗インヒビター
区分約0.2gを得た（純度50〜60％）。
次いで、得られたインヒビター含有区分を10mMリン酸
緩衝液にて２日間透析した後、この緩衝液で平衡化した
ハイドロキシアパタイト（1.7×10cm）カラムにて10→1
00mMリン酸勾配を使用してクロマト処理し、70〜80％純
度を有するインヒビター区分約0.15gを得た。このイン
ヒビター区分を以下の実施例における出発原料として使
用した。
緩衝液にて２日間透析した後、この緩衝液で平衡化した
ハイドロキシアパタイト（1.7×10cm）カラムにて10→1
00mMリン酸勾配を使用してクロマト処理し、70〜80％純
度を有するインヒビター区分約0.15gを得た。このイン
ヒビター区分を以下の実施例における出発原料として使
用した。
実施例 １ 前記のようにして得られた小麦α−アミラーゼに対す
る内因性インヒビター含有区分（純度70％）0.60mgを、
0.02％アジ化ナトリウム含有0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.6）30μに溶解して、２％全蛋白質溶液を得
た。この溶液30μを円筒形のミクロ透析器（φ＝3.5m
m、高さ＝3mm）に入れ、1.05M硫酸アンモニウムを含む
上記トリス−塩酸緩衝液20mlに対して20℃において透析
した。２日後に平均1.0×0.5×0.5mm3の単斜結晶が0.40
mg析出した。この結晶の純度は99.9％であった。
る内因性インヒビター含有区分（純度70％）0.60mgを、
0.02％アジ化ナトリウム含有0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.6）30μに溶解して、２％全蛋白質溶液を得
た。この溶液30μを円筒形のミクロ透析器（φ＝3.5m
m、高さ＝3mm）に入れ、1.05M硫酸アンモニウムを含む
上記トリス−塩酸緩衝液20mlに対して20℃において透析
した。２日後に平均1.0×0.5×0.5mm3の単斜結晶が0.40
mg析出した。この結晶の純度は99.9％であった。
上記のようにして得られた結晶のＸ線回折的特徴は次
の通りであった。
の通りであった。
格子定数 ａ＝42.6Å ｂ＝64.9Å ｃ＝32.0Å Ｖ＝8.3×104 空間群＝P21 実施例 ２〜10 実施例１における小麦α−アミラーゼに対する内因性
インヒビター含有区分の純度およびその使用量、透析温
度、緩衝液、硫酸アンモニウム等の条件を以下の表に示
すように設定して実施例１の操作を繰り返した。
インヒビター含有区分の純度およびその使用量、透析温
度、緩衝液、硫酸アンモニウム等の条件を以下の表に示
すように設定して実施例１の操作を繰り返した。
得られた結晶は、いずれも収率90％以上、純度99％で
あった。
あった。
比較例 １ 実施例１における硫酸アンモニウム濃度1.05Mを0.8M
として実施例１の操作を繰り返したが結晶は得られなか
った。
として実施例１の操作を繰り返したが結晶は得られなか
った。
比較例 ２ 実施例１における1.05M硫酸アンモニウムの代わりに
1.3M硫酸アンモニウムを用いて実施例１の操作を繰り返
したところ、平均約0.2×0.1×0.1mm3の微結晶が得られ
たにすぎなかった。
1.3M硫酸アンモニウムを用いて実施例１の操作を繰り返
したところ、平均約0.2×0.1×0.1mm3の微結晶が得られ
たにすぎなかった。
実施例 11 前記小麦α−アミラーゼに対する内因性インヒビター
含有区分（純度70％）0.45mgを0.02％アジ化ナトリウム
含有80mMトリス−塩酸緩衝液30μに溶解して、1.5％
蛋白質溶液を得た。この溶液30μを実施例１と同じミ
クロ透析器に入れ、15v/v％エタノール溶液（0.02％ア
ジ化ナトリウム含有80mMトリス−塩酸緩衝液中に調製）
20mlに対して20℃において透析した。３日後に最大1.0
×0.5×0.5mm3の単斜結晶が0.30mg析出した。この結晶
の純度は99.9％であった。
含有区分（純度70％）0.45mgを0.02％アジ化ナトリウム
含有80mMトリス−塩酸緩衝液30μに溶解して、1.5％
蛋白質溶液を得た。この溶液30μを実施例１と同じミ
クロ透析器に入れ、15v/v％エタノール溶液（0.02％ア
ジ化ナトリウム含有80mMトリス−塩酸緩衝液中に調製）
20mlに対して20℃において透析した。３日後に最大1.0
×0.5×0.5mm3の単斜結晶が0.30mg析出した。この結晶
の純度は99.9％であった。
実施例 12〜17 実施例11における該インヒビター含有区分の純度およ
びその使用量、エチルアルコール濃度を以下の表に示す
ように設定して実施例11の操作を繰り返した（実施例12
〜16）。また、実施例11におけるエタノールの代わりに
メタノールを用いて実施例11の操作を繰り返した（実施
例17）。
びその使用量、エチルアルコール濃度を以下の表に示す
ように設定して実施例11の操作を繰り返した（実施例12
〜16）。また、実施例11におけるエタノールの代わりに
メタノールを用いて実施例11の操作を繰り返した（実施
例17）。
得られた結晶はいずれも収率90％以上、純度99％以上
であった。
であった。
比較例 ３ 実施例11における15v/v％エタノール溶液の代わりに1
0v/v％エタノール溶液を用いて実施例11の操作を繰り返
したが結晶は得られなかった。
0v/v％エタノール溶液を用いて実施例11の操作を繰り返
したが結晶は得られなかった。
比較例 ４ 実施例11におけるエタノール溶液の代わりに30v/v％
エタノール溶液を用いて実施例11の操作を繰り返したと
ころ、0.2×0.1×0.1mm3の微結晶が得られたにすぎなか
った。
エタノール溶液を用いて実施例11の操作を繰り返したと
ころ、0.2×0.1×0.1mm3の微結晶が得られたにすぎなか
った。
実施例 18 実施例１における硫酸アンモニウムの代わりにポリエ
チレングリコール4000（メルク社製）を2w/v％および6w
/v％用いて実施例１の操作を繰り返した。
チレングリコール4000（メルク社製）を2w/v％および6w
/v％用いて実施例１の操作を繰り返した。
得られた結晶の収量はそれぞれ0.38mgおよび0.40mgで
あり、純度は両者とも99.9％であった。
あり、純度は両者とも99.9％であった。
比較例 ５ 実施例18におけるポリエチレングリコールの濃度とし
て1w/v％および7w/v％を用いて実施例１の操作を繰り返
した。
て1w/v％および7w/v％を用いて実施例１の操作を繰り返
した。
1w/v％の場合、結晶せず、7w/v％の場合、微結晶が得
られたにすぎなかった。
られたにすぎなかった。
実施例 19 前記小麦α−アミラーゼに対する内因性インヒビター
含有区分（純度70％）0.60mgを0.02％アジ化ナトリウム
含有25mM酢酸緩衝液（pH5.6）30μに溶解して、２％
蛋白質溶液を得た。この溶液30μを前記ミクロ透析器
に入れ、0.02％アジ化ナトリウム含有25mMトリス−塩酸
緩衝液（pH7.0）に対して４℃で透析した。24時間以内
に平均1.0×0.5×0.3mm3の結晶が0.38mg析出した。この
結晶の純度は99.9％であった。
含有区分（純度70％）0.60mgを0.02％アジ化ナトリウム
含有25mM酢酸緩衝液（pH5.6）30μに溶解して、２％
蛋白質溶液を得た。この溶液30μを前記ミクロ透析器
に入れ、0.02％アジ化ナトリウム含有25mMトリス−塩酸
緩衝液（pH7.0）に対して４℃で透析した。24時間以内
に平均1.0×0.5×0.3mm3の結晶が0.38mg析出した。この
結晶の純度は99.9％であった。
実施例 20〜24 実施例19におけるインヒビター含有区分の純度および
使用量、透析温度、緩衝液（インヒビター溶解用および
透析用）の条件を以下の表に示すように設定して実施例
19の操作を繰り返した。
使用量、透析温度、緩衝液（インヒビター溶解用および
透析用）の条件を以下の表に示すように設定して実施例
19の操作を繰り返した。
得られた結晶は、いずれも収率90％以下、純度99％以
上であった。
上であった。
比較例 ６ 実施例19における蛋白質溶液のpHを等電点付近に調節
するために緩衝剤の代わりに0.1モル苛性ソーダまたは
0.1モル酢酸を使用して結晶化を行った。
するために緩衝剤の代わりに0.1モル苛性ソーダまたは
0.1モル酢酸を使用して結晶化を行った。
得られた結晶は収率65％で微結晶であった。
Claims (1)
- 【請求項１】内因性小麦α−アミラーゼインヒビターを
緩衝液に溶解して濃度２％以下の溶液を調製し、この溶
液を（１）1.0〜1.2Mの硫酸アンモニウム水溶液、10v/v
％以上30v/v％未満のアルコール水溶液もしくは2w/v％
以上6w/v％以下のポリエチレングリコール水溶液で透析
するか、又は（２）前記インヒビターの等電点の近傍の
pHを有する低イオン強度の緩衝液で透析することからな
る内因性小麦α−アミラーゼインヒビターの結晶の製造
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61294797A JP2595216B2 (ja) | 1986-12-12 | 1986-12-12 | α―アミラーゼインヒビターの結晶の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61294797A JP2595216B2 (ja) | 1986-12-12 | 1986-12-12 | α―アミラーゼインヒビターの結晶の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63148984A JPS63148984A (ja) | 1988-06-21 |
| JP2595216B2 true JP2595216B2 (ja) | 1997-04-02 |
Family
ID=17812395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61294797A Expired - Fee Related JP2595216B2 (ja) | 1986-12-12 | 1986-12-12 | α―アミラーゼインヒビターの結晶の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2595216B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5109119A (en) * | 1989-06-06 | 1992-04-28 | Schering Corporation | Crystalline r-h-gm-csf and method |
| JP3094880B2 (ja) * | 1995-03-01 | 2000-10-03 | 住友金属工業株式会社 | 有機化合物の結晶化制御方法およびそれに用いる結晶化制御用固体素子 |
| CN1303413C (zh) * | 2003-06-17 | 2007-03-07 | 余伟明 | 蛋白质、病毒快速富集方法 |
| KR100705282B1 (ko) * | 2005-06-30 | 2007-04-12 | 주식회사 케이씨아이 | 유채씨로부터 분리 단백질을 제조하는 방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1157399A (en) * | 1979-06-05 | 1983-11-22 | Thomas R. Hopkins | Alcohol oxidase from pichia-type yeasts |
-
1986
- 1986-12-12 JP JP61294797A patent/JP2595216B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８ Ｐ．８１−９０（１９８３） |
| Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７３ Ｐ．１００８−１０１２（１９８３） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63148984A (ja) | 1988-06-21 |
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|---|---|---|---|
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