JPS63148984A - α―アミラーゼインヒビターの結晶の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は球状蛋白質の精製と結晶化のｆコめの方法に関
する。

殊に本発明は球状蛋白質である酵素をその酵素活性を何
する状態のままで精製し、結晶化するための方法に関す
る。

更に具体的には本発明は球状蛋白質である酵素を低度に
ａ縮された状態の溶液から、透析の手段によっ、て精製
しかつ粒形の大きい結晶として取り出すための方法に関
する。

〔従来の技術〕

種々の酵素を含めて、一般に球状蛋白質をより純粋にか
つ安定な形で得ることの要求が化学工業、食品工業、医
薬などの技術分野において存在する。さらにまた球状蛋
白質の立体構造の解明はこれら酵素などの球状蛋白質の
機能中心（作用中心）の決定のためにきわめて重要な１
−４１題であり、そのために現在のところ球状蛋白質の
結晶のＸ線解析の手段が汎用されている。このＸ線解析
の手段を用いるためには試料となる球゛状蛋白質の結晶
はＸ線解析を可能とする程度に大きくなければならず、
また高純変であることが要求される。

こうした球状蛋白質の結晶の取得のために従来以下のよ
うな方法が用いられている。

（１）高濃度蛋白質溶液に沈澱剤を加えるか透析の手段
によって半透膜を介して蛋白質溶液を高張液と接触させ
これを過飽和の状態にし、水溶性蛋白質を水に溶けてい
る状態から結晶状態に移行させる方法。

この方法において使用される沈澱剤又は透析に用いる透
析用の高張液中に含まれる物質の例としては （ａ）硫酸アンモニウム等に代表される水に対する溶解
度が大な塩類 （ｂ）エタノール等に代表される水溶性有機溶媒 （ｃ）ポリエチレングリコール が挙げられる。

この方法においては被処理蛋白質溶液の濃度は通常２〜
１０％の範囲にあり、また透析用の高張液に含まれる物
質の濃度は例えば硫酸アンモニアの場合は２．０〜３．
３Ｍと高い濃度のものが用いられる。

（２）高濃度蛋白質溶液のｐｌ＋を蛋白質の等電点付近
に調節することにより蛋白質を電気的に中性にし、溶液
中における溶解度を低下せしめて結晶化をはかる方法。

この方法におけるｐＨの調節は弱い苛性ソーダ又は酢酸
の添加により行う。

（３）高濃度蛋白質溶液から徐々に水を蒸発さＵ′るこ
とにより適当ｉ倉の水を除去し蛋白質を結晶化させる方
法。

これらの従来方法では、高純度例えば９０％以」二の純
度の蛋白質の溶液が結晶取得のために必要であると考え
られており、そのためにこのような高純度の蛋白質の溶
液を得るためには莫大な量の出発原料物質と何段階にも
及ぶ精製手段を必要とする。さらに上記（１）の方法で
は比較的濃度の高い蛋白質の溶液を用いまた比較的濃度
の高い高張液を透析に用いることから濃度の高い蛋白質
溶液がその濃度を急速に更に高めろことになり、多数の
結晶核が同時に出来やすくそのために得られる結晶は微
小化する傾向がある。また上５己（２）の方法で用いる
ｐｕ調節剤によってはｔ）＋１の変化が急激にすぎ蛋白
質の立体構造に変化が生ずるなどの不都合がある。さら
に（３）の方法では蛋白質は不純物と一緒に濃縮される
ので得られろ結晶の純度は低く、また得量ら低い欠点が
ある。

・７発明か解決しようとする問題点〕 上述１−た従来法では蛋白質の結晶化に高純度の蛋白質
溶液を必要とするが、これを比較的低Ｉｔ！、Ｉの蛋白
質溶液で置換することは−Ｌ述したような蛋白質の溶液
の精製の工程のいくつかを省略しうろことになり、目的
とする蛋白質の収率に飛躍的な向上をらたらす。従って
比較的低純度の蛋白質溶液で６使用しつる方法の開発が
求められるのである。

また上述した従来法ではＸ線解析に用いろる程度の粒度
の大きい結晶の＠ｊ（）に困Ａ１かある。

従ってここに粒度の大きい結晶の取得が強く求められる
のである。

更にまたこの蛋白質の結晶化に当たっては蛋白質を変性
させ、そのために蛋白質の立体構造（三次元構造）を変
化させろような操作条件を避け、出来るだけ蛋白質を温
和な条件で結晶化させ、もって蛋白質を未変成の状態て
取得することが望まれるのである。

そして化学工業、食品製造工業、医薬品製造工業の局面
においては球状蛋白、殊に酵素を純粋にかつ高収率で結
晶の形で得ることには大きな意味がある。例えば麦類、
すなわち夫々小麦、大麦、ライ麦、カラス麦、ノ＼ダカ
麦などに由来する澱粉糖化酵素のα−アミラーゼは夫々
の穀粒中に天然の状態で含まれているが、この乙ののａ
在によって穀粒を貯蔵或いは製粉後貯、依する場合に澱
粉は糖化作用をうけ、穀粒又は穀粉は劣化する。しかし
ながら、これらの穀物中にはこのα−アミラーゼの作用
を阻止するインヒビターら同時に存在しこのインヒビタ
ーすなわち内因性α−アミラーゼインヒビター（Ｅｎｄ
ｏｇｅｎｏｕｓα−ａｍｙｌａｓｅ　１ｎｈｉｂＨｏｒ
）の作用によってα−アミラーゼの作用が阻止されてい
る。今、何等かの１京因て存在するα−アミラーゼの虫
に拮抗ケる量の内因性α−アミラーゼインヒビターが不
在の場合は上記した穀粒又は穀粉の劣化が進行すること
になる。この場合、何等かの技術的予設により内因性α
−アミラーゼインヒビターかこのインヒビターとしての
作用を有する物質を添加すれば上記の劣化は阻止ずろこ
とができるのである。そしてこの内因性α−アミラーゼ
インヒビターら球状蛋白質であって、このらのの単離と
純粋な形での取得には食品工業上に大きな意義があると
いうことができるのである。

さらにまたこのようにして得られた大きい粒子形状の蛋
白質結晶からはＸ線解析によってその三次元構造を決定
するデータの取得が可能であり、酵素の場合にはその機
能中心を決定するデータともなるので、この＋ｉ！！！
能中心部分を切り出すことや、この機能中心部分をそな
えた別異の蛋白質の合成などの手段を通じて酵素作用を
ｆ丁する物質を新たに創造しうるなど蛋白質工学に新た
な局面を拓く技術として変成をうけていない蛋白質の大
きい粒形の結晶の取得が求めろれるのである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは研究の結果（１）低純度の球状蛋白質を緩
衝液に溶解し、こうして得られた溶液を低濃度の硫酸ア
ンモニウム水溶液、アルコールの水溶液もしくはポリエ
チレングリコールの水溶液で透析するか、又は（２）低
純度の球状蛋白質を緩衝液に溶解し、こうして得られｆ
こ溶液を球状蛋白質の等電点の近傍のｐＨを有する低イ
オン強度の緩衝液で透析することにより、球状蛋白ｆｆ
の大きい結晶が得られることを見いたして本発明を完成
したのである。

この発明の上記した（１）および（２）の方法は酵素を
含め１こ球状蛋白質の精製と結晶化に好適に用いること
かでき殊に下記する実施例に示されろようにα−アミラ
ーゼのインヒビターの精製と結晶化に有効であることが
分かった。

この発明の上記した（１）および（２）の方法において
はじめに球状蛋白質を溶解ずろ緩衝液としては中性、弱
アルカリ性又は弱酸性にＡ節したトリス−塩酸緩衝液、
トリス−リン酸緩衝液、イミグゾールー塩酸緩衝液、酢
酸緩衝液なとが用いられ、そしてこれらの緩衝液中には
場合によっては防腐剤例えばアジ化ナトリウムを含有さ
Ｕうるらのとし、これらの緩衝液中へ球状蛋白質は低濃
度例えば２％以下の濃度で溶解される。このような低濃
度の溶液とする場合に透析工程における過飽和状聾への
進行が徐々であるために結晶核の生成数が少なく、結晶
粒子の粗大化に好結果をもたらすのである。しかしなが
ら極端な低濃度は結晶の生成には好ましくない。

この発明の（１）の方法にお１する透析に使用」゛る硫
酸アンモニウム水溶液は１．０−１．２Ｍ程度の濃度ま
たポリエチレングリコール水溶液は同じく２〜６　ｗ／
ｖ％程度の低い異変において用いられろ。アルコール水
溶液としては緩衝液中で調製したメタノール溶液、同エ
タノール溶液などが用いられ、アルコール濃度は１０〜
３０ｖ／ｖ％程度のもの、好ましくは１５〜２５ｖ／ｖ
％程度のらのが用いられる。

この発明の（２）の方法における透析に使用する緩衝液
としては、球状蛋白質を溶解するのに用いた好ましくは
低イオン強度の緩衝液とは同様の組成ではあるが酸或い
はアルカリ土類金属よってそのｐ！■が異なるもの、或
いは別異の組成でかつそのｐＨが異なるものが用いられ
る。いずれの場合にあっても透析に用いる緩衝液はその
ｐＨ１が目的とする球状蛋白質の等電点の近傍のもので
あることが必要である。

この発明の（１）および（２）の方法のいずれにおいて
も透析には半透膜が用いられるが、この半透膜には公知
の透析用の半透膜のいずれらが使用可能である。しかし
て入手の容易な硝酸セルロース膜、コロンオン膜、セロ
ファン膜、ヴイスキングチューブ、セロファンデユープ
などが通常使用される。

この方法における操作温度としては、蛋白質が変成しな
い温度範囲を用いうるが、３０℃までの温度、好ましく
は４℃〜室温の条件下に操作される。

この方法の操作においては結晶化したい球状蛋白質は上
記した緩衝液中に所定の濃度に溶解し、半透膜製のチュ
ーブ、例えばヴイスキングヂューブに装入し、上記（１
）の方法では硫酸アンモニウム溶液、アルコール溶液、
ポリエチレングリコール溶液中で透析する。半透膜中の
蛋白質水溶液は不純物と水分を徐々に失い体積を減少し
てついに過飽和状態に達して蛋白質は結晶を開始する。

上記（２）の方法ではｐｌ＋が蛋１日質の等電点近傍に
調節された緩衝液中で半透膜製チューブに入れられた蛋
白質、室液は透析されるので蛋白質溶液中の蛋白質は溶
解度を低下さｄ゛て結晶の析出が開始される。この方法
にあたっては数時間〜数１０時間の操作により結晶化は
完了する。

この発明の方法を更に詳細に説明するために、実施例に
よってこの方法を具体的に説明り−る。

この実施例においては球状蛋白質として小麦α−アミラ
ーゼに対する内因性インヒビターを結晶化した。

〔実施例〕

小麦α−アミラーゼに対する内因性インヒビターの調製
： 小麦粉５　ｋｇと水２０Ｑとを混合し、４℃で２時間撹
拌した。２日間静置した後、デカンテーノヨンして約４
Ｑの上澄を得た。この上澄に硫酸アンモニウムを６０％
（Ｗ／Ｖ）になるように添加し、−晩装置し、遠心分離
機で沈澱を集めた（　ｔｏ、０ＱＯＧ、３０分）。得ら
れた約５０ｇの湿潤沈澱を３０ｍＭリン酸−１５ｍＭク
エン酸緩衝液（ｐＨ５，３）２００ｍＱに溶かし、同緩
衝液にて２日間透りテした。次いで、この緩衝液で平衡
化したＣＭ・セファ０−スＣＬ−６Ｂ　（４，７ｘ　２
０ｃｍ　）カラムにて、０−＋０．５．Ｍ　ＮａＣＱ勾
配を使用してクロマト処理し、粗インヒヒター区分約２
ｇを得ｆこ（純度５〜ｌＯ％）。

上記インヒビター含有区分を２５ｍＭ）リス−塩酸緩衝
液にて２日間透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡ
Ｅ・セファロースＣＬ−６Ｉ３ｉ１’２．７Ｘ　１５ｃ
ｍ　）カラムにて、０−０．５Ｍ　ＮａＣ（ｌ勾配を使
用してクロマト処理し、粗インヒビター区分約０．８ｇ
を得た（純度１０〜２０％）。

かくして得られたインヒビター含有区分を２５ｎ＋ｌＪ
酢酸緩衝液にて２日間透析した後、この緩１１液で平衡
化したＣＭ・セファロース　ＣＬ−６Ｂ（２，７ｘ１５
ＣＩ）カラムにてＯ−０，８ＭＮａＣ（！勾配を！Ｕ　
ｌ’ｆｌ　してクロマト処理し、祖インヒビター区分約
０２９を得た（純度５０〜６０％）。

次いで、得られたインヒビター含有区分を１０ｍＭ’）
ン酸緩衝液にて２日間透析した後、この緩衝液で平衡化
したハイドロキンアパタイト（１７Ｘ１０ＣＩＩ）カラ
ムにてｔｏ−１００ｍＭリン酸勾配を使用してクロマト
処理し、７０〜ｂ ンヒビター区分的０．１５９を得た。このインヒビター
区分を以下の実施例における出発原料として使用した。

実施例　１ 前記のようにして得られた小麦α−アミラーゼに対する
内因性インヒヒター含￥ｆ区分（純度７０％）　０．６
０Ａ１ｇを、０．０２％アジ化ナトリウム含汀０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）３０成に溶解して、
２％全蛋白質溶液を得た。この溶液３０　ｔｌを円筒形
のミクロ透析器（φ−３．５．關、高さ一３韮）に入れ
、１．０５Ｍ１ｔ酸アンモニウムを含む上記トリス−塩
酸緩衝液２０ｍ（ｌに対して２０°Ｃにおいて透析した
。２日後に平均１．ＯＸ　Ｏ，５ｘ　Ｏ，５朋３の単斜
結晶が０．４０７５析出した。この結晶の純度は９９９
％であった。

上記のようにして得られた結晶のＸ線回折的特徴は次の
通りであった。

格子定数　　１＝　４２．６人 ｂ＝６４．９人 ｃ＝３２．０人 Ｖ　＝　８．３Ｘ　１０’入 空間群−Ｐ２゜ 実施例　２〜ｌＯ 実施例１における小麦α−アミラーゼに対する内因性イ
ンヒヒター含有区分の純、変およびその使用量、透析温
度、緩衝液、硫酸アンモニウム等の条件を以下の表に示
すように設定して実施例１の操作を操り返した。

実施例２　　尺賢鯉１　　火嵐りロー　　害」１烈□灸
透析温度（’Ｃ）　　　　　２０　　　　２０　　　　
２０　　　　２０緩　衝　液　　　　実施ｆＰ＋１ト（
左に同し）（左に同し）（左に同じ）同しらの Ｊ、’：ｉ旦７．１４りｌ−７又重列Ｊ−丸輿刑ｙ　　
ノ瀝」隻１．０　　　　　１．５　　　　　１．０　　
　　　１．５　　　　　　１．５１．０５　　　　１．
０５　　　　１．２　　　　１，０５　　　　１．０５
得られた結晶は、いずれら収率９０％以上、純度９９％
であった。

比較例　ｌ 実施例１における硫酸アンモニウム濃度１．０５Ｍを０
．８Ｍとして実施例１の操作を繰り返したが結晶は得ら
れなかった。

比較例　２ 実施例Ｉにおけるｌ　、　０５１ｖｌ硫酸アンモニウム
の代わりに１．３ＭＩＩ酸アンモニウムを用いて実施例
１の操作を繰り返したところ、平均約０．２Ｘ　Ｏ，１
ｘｏ、ｔａｘ’の微結晶が得られたにすぎなかった。

実施例　１１ 的記小麦α−アミラーゼに対する内因性インヒビター含
有区分（純度７０％）　Ｏ，’４５ｕｇを０．０２％ア
ジ化ナトリウム含有８０ｍＭトリス−塩酸緩衝液３０ｍ
に溶解して、１．５％蛋白質溶液を得た。

この溶液３０ｕ１を実施例１と同じミクロ透析器に入れ
、１５ｖ／ｖ％エタノール溶液（０，０２％アノ化す）
・リウム含有３０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液中に調製）　
２０　、ｗＱに対して２０℃において透析した。３日後
に最大１．ＯＸ　Ｏ，５ｘ　０．５ｍｓ　’の単斜結晶
が０．３０ｒｉ析出し１ヒ。この結晶の純度は９９９％
であった。

実施例　１２〜Ｉ７ 実施例Ｉｆにおける該インヒビター含有区分の純度およ
びその使用量、エチルアルコール濃度を以下の表に示す
ように設定して実施例１１の操作を繰り返した（実施例
１２〜＋６）。また、実施例！１におけるエタノールの
代わりにメタノールを用いて実施例１１の操作を繰り返
した（実施例１７）。

壜Ｘ　　　１凶　　　ｈｌＪ 得られた結晶はいずれも収率９０％以上、純度９９％以
」二であっｔ二。

比較例　３ 実施例１［における１５ｖ／ｖ％エタノール溶液の代わ
りにｌｏｖ／ｖ％エタノール溶液を用いて実施例ＩＩの
操作を繰り返したが結晶は得られなかった。

比較例　４ 実施例【１におけるエタノール溶液の代わりに３０ｖ／
ｖ％エタノール溶液を用いて実施例１１の操作を繰り返
したところ、０．２ｘ　Ｏ，ＩＸ　Ｏ，ｌｕ’の微結晶
が得られたにすぎなかった。

実施例　１８ 実施例Ｉにおける硫酸アンモニウムの代イ゛〕りにポリ
エチレングリコール４０００　（メルク社製）を２ｗ／
ｖ％および６　ｗ／ｖ％用いて実施例１の操作を繰り返
した。

得られた結晶の収量はそれぞれ０．３８１Ｉｇおよび０
．４０４であり、純度は両者とも９９，９％であった。

比較例　５ 実施例１８におけるポリエチレングリコールの濃度とし
てｌ　ｗ／ｖ％および７　ｗ／ｖ％を用いて実進例１の
操作を繰り返した。

Ｉ　ｗ／ｖ％の場合、結晶せず、７　ｗ／ｖ％の場合、
微結晶が得られたにすぎなかった。

実施例　１９ 前記小麦α−アミラーゼに対する内因性インヒビター含
有区分（純度７０％）　０．６０４を０．０２％アジ化
ナトリウム含有２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）３０
ｕｆｌに溶解して、２％蛋白質溶液を得た。この溶液３
０成を前記ミクロ透析器に入れ、０．０２％アノ化ナト
リウム含有２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）
に対して４°Ｃで透析した。２４時間以内に平均１．Ｏ
Ｘ　０．５ｘ　０ＪｘＲ’の結晶が０．３８ｉ析出した
。この結晶の純度は９９．９％であった。

実施例　２０〜２４ 実施例１つにおけるインヒヒター含汀区分の純度および
使用量、透析温度、緩衝液（インヒビター溶解用および
透析用）の条件を以下の表に示すように設定して実施例
１９の操作を繰り返した。

得られた結晶は、いずれも収率９０％以下、純度９９％
以上であった。

比較例　６ 実施例１９における蛋白質溶液のｐＨを等重点付近に調
節するために緩衝剤の代わりに０．１モル苛性ソーダま
たは０．１モル酢酸を使用して結晶化を行った。

得られた結晶は収率６５％で微結晶であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 低純度の球状蛋白質を緩衝液に溶解し、こうして得られ
   た溶液を（１）低濃度の硫酸アンモニウム水溶液、アル
   コール水溶液もしくはポリエチレングリコール水溶液で
   透析するか、又は（２）球状蛋白質の等電点の近傍のｐ
   Ｈ１を有する低イオン強度の緩衝液で透析することから
   なる、球状蛋白質の結晶化方法。