JPH04502014A - 結晶性ｒ―ｈ―ｇｍ―ｃｓｆ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 結晶性Ｒ−Ｈ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びその製造方法本発明は組換えヒト顆粒球−マク ロファージコロニー刺激因子（ｒ−ｈ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ）、及び特にその結晶型に 関する。

コロニー刺激因子とは、イン　ビトロでを髄及び赤血球系の造血原細胞の生存、 増殖及び分化に必要な蛋白質のグループを意味する：メトカーフ、Ｄ、（Ｍｅｌ ｃｉｌｌ。

Ｄｌ、造血コロニー刺激因子（Ｔｈｅ　１ｌｅｓｏｐｏｉｅｌｉｃ　Ｃｏ１ｏａ ７　Ｓ目−ｍｌｅｌｉＢ　Ｆａｃｔｏｒｓ）　。

エルセヴイ乙　アムステルダム、１９８４年；メトカーフ、　Ｄ、（Ｍｒｌｅｓ ｌｆ、　Ｄ、）。

サイエンス（ＳｃｉｅＩＩｃｅ）　、２２９巻、第１６〜２２頁、１９８５年； メトカーフ、Ｄ、（Ｍｅｔｃｔｌｌ、Ｄ、）　、ブラッド（Ｂｆｏｏｄ）　、６ ７巻、第２５７−２６７頁。

１９８６年；及びクラーク、Ｓ、　Ｃ，ら（Ｃ１ｓ＋に、　Ｓ、　Ｃ，、ｅｌ　 ＊１．）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２３６巻、第１２２９〜１２３ ７頁、１９８７年。顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ） は、顆粒球及びマクロファージのそれらの前駆細胞からのコロニー産生を刺激す ると共に、多能性腺細胞の成長及び分化を促進する。

さらに、ＧＭ−Ｃ８Ｆは成熟した効果器細胞の種々の作用活性を高めることがで き〔モースチン、Ｇ、らｆＭｏ＋５ｔｙｎ、　Ｇ、、　ｃｌ　ｓｌ、）　、キャ ンサーリサーチ（Ｃｓｎｃｅｔ　Ｒｅｓ、　）　、４８巻、第５６２４〜５６３ ７頁、１９８８年、に概説〕、を髄白血病細胞の分化を促進することができる〔 トモナガ１Ｍ、、ら（Ｔｏｓｏｎｓｇｚ。

Ｍ、、ｅｌ　１１．）　、ブラッド（Ｂｆｏｏｄ）　、６７巻、第３１〜３６頁 、１９８６年〕。

ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆは天然の材料から精製されているが〔ガッソン、Ｊ、Ｃ，、ら （Ｇｓｓｓｏｎ、１．　Ｃ，、ｔｌ　＊１．）　、　サイエンス（ＳｃｉｅＩｌ ｃり　、２２６巻、第１３３９〜１３４２頁、１９８４年〕、製造された量が少 なく、その物理化学的及び生物学的性質の詳細な特性表示はなされていない。ヒ トＧＭ−Ｃ３Ｆをコード化する相捕的ＤＮＡのクローニング並びに、バクテリア 及び哺乳動物の細胞宿主中におけるその発現は、精製された組換え蛋白質の大量 生産を可能にしている〔グリーンバーブ、Ｒ１ら（Ｇ＋ｅｅｎｂｅ＋１．　Ｒ， 、ｃｌ　ａｔ、）　、　カレントミクロバイオロジイ（Ｃｗｕ。

１ｌＩｉｃ＋＠、）　、１７巻、第３２１〜３３２頁、１９８８年；バージニス 、Ａ、　Ｗ、ら（ＢｕＩｅ■、＾　Ｗ、、ｅｌ　ｓｌ、）　、ブラッド（［１ｆ ｏｏｄ）　、６９巻、第４３−５１頁。

１９８７年；及びり−、Ｆ、らＩＬｅｔ、Ｆ、、ｃｌ　＊１．）　、　プロシー ディングスオブザナシタナルアカデミイオブサイエンスＵ　Ｓ　Ａ　（Ｐ「ｏ、 　Ｎ１１．　Ａｔ暑ｄ、　Ｓｃｉ、　１１３＾）。

８３巻、第３１０１〜３１０５頁、１９８５年〕。

イン　ビトロの生物学及び動物モデルにおけるＧＭ−Ｃ３Ｆの活性（メイヤー。

Ｐ、らｆＭＢｅｒ、　Ｐ、、　ｅｌ　ｓｌ、）　、ブラッド（Ｂｆｏｏｄ）　、 ７０巻、第２０６〜２１３頁、１９８７年、及びドナヒ：ｘ　、Ｒ，Ｅ、ら（Ｄ ｏｎＩｈｗｅ、　Ｒ，Ｅ、、　ｅｌ　ｒｌ、）　、ネイチャー　（Ｎｓ１ｗ＋ｅ ）　、３２１巻、第８７２−８７５頁、１９８６年〕に基づき、組換えＧＭ−Ｃ ３ＦによるフェーズＩ／ＩＩ臨床試験がを髄形成異常症候群（バドハンーラジ、 Ｓ、ら（ＹｔｄｈＩ＊−Ｒ＊ｉ、Ｓ、、ｒｌ　Ｉｌ、）　、　＝ユーイングラン ドジャーナルオブメデ４　ス：／　（Ｎ、　ＥＩｌｇｌ、　１．　Ｍｅｄ、）　 、３１７巻、第１５４５〜１５５１頁。

１９８７年〕、後天性免疫不全症候群〔グループマン、Ｊ、Ｅ、ら（Ｇ＋ｏｏｐ ｓｕ。

１、Ｅ、、ｔｊ　ｓｌ、）、ニューイングランドジャーナルオブメディスン（Ｎ 、　Ｅｎ震１．Ｊ。

Ｍｅｄ、）　、３１７巻、第５９３−５９８頁、１９８７年、及びパルドウイン Ｇ、Ｃ。

ら（Ｂ＊１ｄｖｉｎ　Ｇ、　Ｃ，、ｃｌ　ｔｌ、ｌ、プロシーディングスオブザ ナショナルアカデミイオブサイエンスＵＳＡ　（ＦｒｏＣ，ＮＪｌｌ、Ａｔ５ｄ 、Ｓｃｉ、ｔｌｓＡ）　、８５巻、第２７６３〜２７６６頁、１９８８年〕及び 癌〔ブランド、Ｓ、Ｊ、ら（Ｂｒｓａｄｌ、Ｓ、Ｊ、、　ｅｌｌｌ、ｌ、−ｓ− イングランドジャーナルオブメディスン（Ｎ、　ＥＢｌ、Ｉ、　Ｍｅｄ、）　。

３１８巻、第８６９〜８７６頁、１９８８年フにおいて開始されている。

ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの完全な蛋白質配列は１２７アミノ酸から成り、２個のジスル フィド結合を形成する４個のシスティン残基を含む〔リー、Ｆ、ら、（Ｌ！ｅ、 　Ｆ、。

ｅｌ象１．）、　プロシーディングスオブザナショナルアカデミイオブサイエン スＵＳＡ　（Ｐｌｏｔ、　Ｎ５１１．　Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ）、８３ 巻、第３１０１〜３１０５頁。

１９８５年；キャントレル、　Ｍ、Ａ、ら（Ｃ１ｌ＋ｅｌｌ、Ｍ、＾、、ｃｌ　 ｓｌ、）　、プロシーディングスオブザナシジナルアカデミイオブサイエンスＵ 　Ｓ　Ａ　（Ｐｒａｃ、Ｎｓ目Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ）　、８２巻、第 ６２５０−６２５４頁、１９８５年、及びンユリムシｗ＋、Ｊ、Ｌ、ら（Ｓｃｌ ＋＋ｉｍｔｈｅ＋、　Ｉ、　Ｌ、　ｔｌ　ｔｌ、）　、バイオケミカルジャーナ ル（ＢｉｏｃｈｅｌＩ＋、）　、２４７巻、第１９５〜１９９頁、１９８７年】 。物理学試験から、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆはアルファらせん及びベータ板状構造の両 方を含む小型の球型蛋白質であることが示されている〔ウィングフィールド、Ｐ 、ら（ＷｉＢ＋１ｅｌｄ、Ｐ、、ｅｌ　Ｉｌ、）　、ヨーロピアンジャーナルオ ブバイオケミストリイ（Ｅｕ、１．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、）　、１７３巻、第６５ 〜７２頁、１９８８年〕。

本発明者らは今回、結晶性のヒト組換えＧＭ−Ｃ３Ｆを得た。本発明の結晶性Ｇ Ｍ−ＣＳＦは好ましくは、Ｎ−末端メチオニンを欠き８０位にメチオニンを有す る完全なヒト組換えＧＭ−Ｃ３Ｆである。本発明者らは該結晶性ｒ−ｈ−ＧＭ− Ｃ３Ｆがその活性を完全に保持していること、すなわち水性の系での再溶解に際 して結晶の製造に使用したｒ−ｈ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ原料と本質的に同等の活性をそ れが持っていることを証明した。本発明者らはまた、Ｘ線結晶学解析により該結 晶の特性表示も行なった。好ましくは、該結晶性ＧＭ−Ｃ３Ｆはグリコジル化さ れておらず、大腸菌（Ｅ、ｅｏｌｉ）に由来するものである。好ましい態様にお いては、本発明で使用するｒ−ｈ−ＧＭ−Ｃ３Ｆは以下の完全なアミノ酸配列を 有する： （Ｈ）　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　 Ｓｅｒ　Ｔｈｒ（１０）Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａ ｓｎ　Ａｌａ　ｌｌｅ　Ｇｉｎ（２０）　Ｇｌｕ　ＡｌａＭｅｔ　Ｐｈｅ　Ａｓ ｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ（５０）　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉ ｎＭｅｔ　Ｍｅｔ（８０）　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ 　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ（９０）　Ｔｈｒ’Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　 Ｔｈｒ　Ｇ１ｎ１１ｅ（１００）　ｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ＡｓｎＬｅｕ（１１０）　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　ＰｈｅＡｓｐ（１２０）　Ｃｙｓ　 Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　（ＯＨ）本発明はさらに、 ＧＭ−Ｃ３Ｆ、とりわけｒ−ｈ−ＧＭ−Ｃ３Ｆの溶液を、該ＧＭ−Ｃ３Ｆ溶液を より濃縮してＧＭ−Ｃ５Ｆ結晶を形成させる第２溶液に対して平衡化することを 含み、平衡化された該ＧＭ−Ｃ３Ｆ溶液が分子量が約８．０００のポリエチレン グリコール及び４０ないし２５０曙ｇ／ｍｌのＧＭ−Ｃ３Ｆを含有する、ＧＭ− Ｃ３Ｆ結晶の製造方法を含む。好ましくは、この平衡化は徐々に、例えば５ない し３０日間かけて起こる。

本発明の方法は、ｒ−ｈ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ若しくは上記のアミノ酸配列を有するＧ Ｍ−Ｃ８Ｆの使用に限定されるものではない。本方法は種々の形態のＧＭ−Ｃ９ Ｆに（例えば、グリコジル化ＧＭ−ＣＳＦでも非グリコジル化ＧＭ−Ｃ８Ｆでも よく、それが属する哺乳動物種に関係なく、またそれがリーダー配列を持つかど うかにかかわらず）使用してもよい。突然変異ＧＭ−Ｃ３Ｆ及び対立形質のＧＭ −Ｃ３Ｆを使用してもよい。好ましくは、グリコジル化された形態のＧＭ−Ｃ３ Ｆを、結晶化に先立ってクロマトグラフィーにかけ、一定の分子量を得るであろ う。しか；−ながら最も好ましくは、本発明の方法で使用するＧＭ−Ｃ３Ｆは大 腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）に由来し、Ｎ−末端メチオニンを欠き８０位にメチオニン を有する完全なヒト組換えＧＭ−Ｃ３Ｆ、例えば上記の完全なアミノ酸配列を有 するｒ−ｈ−ＧＭ−Ｃ３Ｆである。

平衡化の適当な方法としては、透析、限外濾過（例えば、ダイアフィルトレージ ョン）若しくは液滴の使用（例えば、水滴の垂下あるいはサンドイッチ処理）が 含まれる。平衡化はＧＭ−Ｃ３Ｆ溶液よりも濃度の高い適当な溶質の第２溶液に より実施してもよい。特に好ましい方法はｒ−ｈ−ＧＭ−Ｃ８Ｆをポリエチレン グリコール溶液に対して平衡化することであり、このＰＥＧは好ましくは分子量 が約ｓ、ｏｏｏである。

好ましい態様においては、適当なバッファー、例えばｐＨ６，５ないし８．５の もの、とりわけｐＨ７，０ないし８．０のリン酸ナトリウム、及びポリエチレン グリコール（ＰＥＧ）、好ましくはＰＥ（、−８，０００によるＧＭ−Ｃ３Ｆの 純粋溶液を、好ましくは同じＰＥＧによる、より濃度の高いＰＥＧ溶液に対して 平衡化させる。該バッファーの濃度は幅広い範囲、例えば約１＋＋Ｍないし１． ０００ｍＭが可能であるが、好ましくは１０ないし４００５Ｍ、とりわけ１６な いし３２０霧Ｍである。適当な温度、例えばちょうど溶液の凝固点以上から２０ ℃まで、好ましくは０〜１０℃で数日間平衡化した後、通常結晶が形成されてい るであろう。このような結晶をその後のＧＭ−Ｃ３Ｆ結晶のバッチ用の種晶とし て使用することができる。

実験手順 （Ｅ、ｃｏｌｉ）の周辺庫形質中に発現させた〔グリーンバーブ、Ｒ１ら（Ｇ＋ ｅ！ｎｂｃＢ。

Ｒ，ｅｌ　１１．）、カレントミクロバイオロジイ（Ｃｗｒｒ、　Ｍｉｃ＋ｏ、 ）、１７巻、第３２１〜３３２頁、１９８８年〕。ｒ−ｈ−ＧＭ−Ｃ３Ｆの発現 のための他の方法を用いることもできる；例えば、リーら（Ｌｅｅ　ｓｌ　薯１ ．）　、ブσシーディングスオブザナシ３ナルア力デミイオブサイエンスＵＳＡ 　（ＰＴＩＩＣ，Ｎ１１ｌ　＾ｔｔｄ、　Ｓｅｉ、　ＩＩＳ＾）。

８２巻、第４０６０〜４０６４頁、１９８５年、の方法等がある。ヒトＧＭ−Ｃ ３Ｆは先に述ヘラれテイルヨうに（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０２２９４゜ ンエリング・コーポレーシヨン及びトロツタ、Ｐ、Ｐ、ら（ＴＴＯＩＩｌ、Ｐ、 Ｐ、、５ｌａ１．ｌ、ＷＯ３９１００５７９ａして１９８９年１月２６０国際公 開、１９８７年７月１６１１出願の米国出願第０７４，４１０号に対応）、通常 のクロマトグラフィーによって精製し、その後０．１％トリフルオロ酢酸中２７ 〜７２％のアセトニトリル勾配を用いてレイニンダイナマソクス（Ｒ＞１ｉｉｎ 　Ｄｙｎｉｍｏ）　−３００人Ｃ−４カラムＩＺの逆相高速液体クロマトグラフ ィー（ＨＩ）　Ｌ　Ｃ）にかけた。

Ｘ線解析に適した結晶は、水滴の垂下若しくは水滴のづンドイッチ処理のいずれ かを用いる蒸気拡散実験によって得た。水滴の垂下には、１０％ポリエチレング リコール８．０００　（ＰＥＧ−８，０００）及び１６ｓｌｊリン酸ナトリウム 。

ｐＨ８，０中に２０　ｍｇ／’ｍｌの蛋白質を含有する２０μｍの水滴をリンプ ロ（Ｌｉｎｂ＋ｏ）プレート」−に逆に置いたシリコン処理カバーグラスから垂 下させた。

これらの水滴は１　ｗｌｃＪ）　１６　ｄリン酸ナトリウム、ｐ＋＋８．０中２ ０％ＰＥＧ−８，０００に対して平衡化した。４℃で１０〜１５Ｌｊ間の後、最 大２．　０ＩＩＩＩＸＯ，６０ｍｍｘ　Ｑ、］、　０關までの寸法の斜方晶系結 晶が得られた。あるいは、水滴の号ンドイノグー処理による蒸気拡散実験には、 １００伺）ＥＧ−８，０００及び１６１リン酸ナトリウム、ｐＨ８，０中に２０ ｍｇ／ｍｌの蛋白質を含有する２０μｍの水滴を、１６ｄリン酸す］・リウム、 ｐＨ３，０中における２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　−８，０００１＋ｓｌに対して平衡化 した。４℃で１５〜２０日間の後、同しような一般形態及びサイズの結晶が出現 した。各処理において、結晶は６．５ないり、、８．５のｐｉ範囲、好まし、く は７．０〜８０で生した：本発明ｎらはｐＨ８，０において最も良好な結晶を得 た。

Ｘ線試験のために、結晶をガラスキャピラリー中に据え付け、２２℃で、４０ｋ Ｖ及び１００−＾で作動する。リガク（Ｒｉｇｉｋｗ）　ＲＵ　＝３００回転ア ノード発生器からのＣｕＫα放射線を用いてプリセツションカメラで撮影した。

完全な生のデータセットは同じ放射線源を用いたニコレット（Ｎｉｃｏｌｅｌ） 　Ｘ−１００Ａエリア探知器に収集した。

水滴垂下法により製造されたもの及び水滴サンドイッチ処理法により製造された ものを含む、幾つかのバッチの結晶をＸ線解析にかけ、空間群及び単位格子サイ ズに関して矛盾のない結果を得た。この結果は後で述べる。

本発明の結晶性ＧＭ−Ｃ５Ｆは、従前のＧＭ−Ｃ５Ｆ材料が医薬用製剤、例えば ＧＭ−Ｃ３Ｆのデボ製剤等に使用されてきたのと基本的に同様の方法で使用する ことができ、ＧＭ−Ｃ３Ｆの一日用量が０．１μｇ／ｋｇないし１００μｇ　／ 　ｋ　ｔの投与になるように設計してもよい。このような製剤は医薬上有効な量 の結晶性ＧＭ−Ｃ３Ｆを通常の医薬上許容し得るキャリアーとともに含有する。

個々の結晶を垂下水滴からンリンジで抽出した後、４℃で２０％ＰＥＧ３．００ ０及び１６請關リン酸ナトリウム、ｐＨ７，５から成る洗浄溶液１００μｍ中に 再！Ｌｌｌｌｉシた。該懸濁液を遠心分離し、洗浄溶液をパスツールピペットで 除去１．た。洗浄した結晶を２５℃で、１００μＩの２０ｍＭリン酸ナトリウム 。

ｐＨ７，５，０，１５Ｍ塩化ナトリウム中に再溶解した。

蛋白質測定及び再溶解した結晶溶液によるＫＧ−１細胞系を用いての細胞増殖ア ッセイ〔モスマン、　Ｔ、Ｊ、（Ｍｏｎｕｖ、　Ｔ、１．）　、ジャーナルオブ イミュノロジカルメソッヅ（ｌｏｕｕｌ　ａｔ　Ｉｒｓｗｎｏ、　Ｍｅｔｈｏｄ ＋）　、６５巻、第５５〜６３頁。

１９８３年〕から、２．７Ｘ１０８ユニット／ｍｇの特異活性が得られた。この 値は、結晶化以前の元のＧ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ製剤について得られたものと同等で あり、当アッセイの精度限界内（通常、２Ｘ１０　ないし３Ｘ１０’ユニツト／ 町の範囲内）にある。

２、　１ｉＰＬｃ 分析ｍ高速道ＷＩＧ体クロマトグラフィーを、再溶解した結晶溶液の一部を、ウ ォーターズ社（Ｗ＋Ｉｕ＋）製分折用ｉＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ系上に３０分間かけて２ ７％アセト二１−リル　０．１％トリフルオロ酢酸から７２％アセトニトリル、 ０．１％トリフルオロ酢酸の線型勾配を用いてレイニンダイナマソクス（Ｒｉｉ ｎｉｎ　Ｄｙｎｘｍａ＋）　Ｃ８ワイドボア（４，６ｖｓＸ２５ｃ＋１）カラム にかけて行なった。０．０２アブソ一バンス単位の感度のギルマン？Ｉ：　（Ｇ ｉ１＋ｏｎ’ｌ製可変式波長検知器セットを２８Ｏｎ１１でピークのモニターに 使用した。再溶解結晶溶液及び結晶化前の元のＧＭ−Ｃ３Ｆ製剤の保持時間及び クロマトグラフィーパターンは同一であった。

上記の１．及び２６　から、結晶化若しくは再構成の間に該蛋白質に何らかの化 学的変化若しくは何らかの変性が起きたと考えるような理由は明らかにない。

３　Ｘ線回折分析 Ｘ線回折データは最初にエリア検出器を用いて２．８への分解能で収集した。

振動フレームは０．２５°に設定し１０分間測定ｌ、た。総計６，７９７の反射 を測定した。これらは３，８４１の独特の反射に合併整理された。強度データの 指数化及び積分はＸＥＮＧＥＮ処理プログラムを用いて行なった（ハワード。

Ａ、Ｊ、ら（Ｈｏｖｕｄ、Ａ　１．、ｅｌ　ｇｌ、）　、ジャーナルオブアプラ イドクリスタログラフィ（１＾＋ｌｐ１．　Ｃ＋ｙ＋ｌ＋ｌｌｏｇ＋、　）　、 ２０巻、第３８３〜３８７頁、１９８７年〕。

３０人のデータに対するＲｓｙｍ値（１に基づく）は０．０８７であった。デー タは旦−１２６，９±２人、共＝４７．４±１人及びｃ−＝５９．１±１人の斜 方晶系で指数化した。空間群Ｐ２，２，２．は、ｈ＝２旦＋１であるｈｏｏ、に ＝２ｎ＋ｌであるｏｋｏ、及び１＝２ｎ＋ｌであるｏｏｌの各反射の系統的欠如 によって特定化した。その後のＧＭ−Ｃ３Ｆのｘｖａプリセツション写真は該空 間群及び単位格子寸法を確認するものであった。該結晶は室温で少なくとも３日 間はＸ＠に安定であり、２．５人若しくはより良好な分解能で回折する。

使用した結晶性ｒ−ｈ−ＧＭ−Ｃ３ＦのｃＤＮＡから予想される１４．／＋７７ ダルトンの分子量に基づき〔リ−１Ｆ、ら（１，ｕ、　Ｆ、、　ｅｌ　＋１．） 　、プロシーディングスオブザナショナルアカデミイオブサイエンス（Ｐｔｏｃ 、ＮＪＩｌ、Ａｔ５ｄ、５ｃｉＵＳ＾）、８３巻、第３１０１〜３１０５頁、１ ９８５年］、結晶学的非対称単位あたり２若しくは３分子に対するＶｍのｊ１算 値〔フシ。１−ズ、Ｂ、Ｗ。

（Ｍｘｌｌｈｅｖ＋、Ｂ、　Ｌ）　、ジャーナルオブモリキュラーバイオロジ４ 　（１，Ｎ６１゜Ｂｉｏｌ、ｌ、３３巻、第４９１〜４９７頁、１９６８年〕は それぞれ３．０７、及び２．０５である。部分固有容積を０．７２４Ｃ−、／ｇ と仮定すると〔ウィングフィールド、Ｐ、ら（ＷｉＢｔｉｔｌ＋１．　Ｐ、、ｅ ｌ　ｓｌ、）　、ヨーロビアンジャーナルオブバイオケミストリイ（Ｅｕ、］、 Ｒｉｏｃｈｎ、　ｌ、１７３巻、第６５−７２頁、１９８８年〕、これらの値は それぞれ５９％及び３９％の溶媒容積画分に対応する。結晶学的非対称単位あた り１及び４分子に対する対応するＶｍ値はそれぞれ６．１４及び１．５３である が、これらは蛋白質について通常観、察される限界をはるかに逸脱している。そ れゆえに、該蛋白質は非対称単位中に２若しくは３分子のいずれかずつ結晶して いるらしい。エリア検出器に収集された生データを用いて計算された自己回転関 数は、非結晶学的な２倍若しくは３倍の軸は示さなかった。

手続補正書 平成　３年１２月　６０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 結晶性ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ。 アミノ酸配列 【配列があります】 を有する、請求項１記載の結晶性ＧＭ−ＣＳＦ。 ３．ＧＭ−ＣＳＦの溶液を、該ＧＭ−ＣＳＦ溶液をより濃縮してＧＭ−ＣＳＦ結 晶を形成させる溶液に対して平衡化することを含み、ここにおいて、平衡化され た核ＧＭ−ＣＳＦ溶液が分子量約８，０００のポリエチレングリコール及び４０ ないし２５０ｍｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含有する、結晶性ＧＭ−ＣＳＦの製造 方法。 ４．該平衡化が限外濾過あるいは透析、若しくは液滴の使用によって実施される 、請求項３記載の方法。 ５．該平衡化が水滴の垂下若しくはサンドイッチ処理によって実施される、請求 項３若しくは４のいずれかに記載の方法。 ６．ｒ−ｈ−ＧＭ−ＣＳＦの溶液がポリエチレングリコール溶液に対して平衡化 される、請求項３ないし５のいずれかに記載の方法。 ７．該ポリエチレングリコール溶液中のポリエチレングリコールが約８，０００ の分子量を有する、請求項６記載の方法。 ８．該ＧＭ−ＣＳＦ溶液が適当なパッファーを含み、該ポリエチレングリコール 溶液中のポリエチレングリコールの濃度が該ＧＭ−ＣＳＦ溶液中よりも高い、請 求項６若しくは７のいずれかに記載の方法。 ９．該バッファーのｐＨが６．５ないし８．５である、請求項８記載の方法。 １０．結晶性ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ及び医薬上許容しうるキャリアーを含む医 薬用組成物。