JP2011097940A - オオアワガエリからの主要アレルゲンPhlp1の変異体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】これまで不可能であった、生理学的な媒体に可溶性で安定なモノマー分子の製造が、原核生物発現系の利用と、その後のその精製により行うことができることを特徴とする変異体に関する。該変異体が野生型と比較して追加のCys残基をAla236の置換により導入されたものであり、最初は不溶性の封入体である粗タンパク質から出発し、2段階金属イオンキレートアフィニティークロマトグラフィーおよびHisタグの除去を包含する、複数の生化学的精製工程を行うことを特徴とする変異体の精製方法。
【選択図】なし
Description
I型アレルギーは、世界的に重要である。工業国の25%までの人口が、植物花粉、ダニ、ネコまたはイヌなどの、空気中に存在する種々の起源のアレルゲン(エアロアレルゲン)により引き起こされるアレルギー性鼻炎、結膜炎もしくは気管支喘息などの疾患に苦しんでいる。これらのI型アレルギー患者の40%までが、草本花粉の場合、特異的なIgE(免疫グロブリンE)反応性を示す(Freidhoff et al., 1986, J. Allergy. Clin. Immunol. 78, 1190-201)。
これらのアレルゲンの治療的使用においては、ヘルパーT細胞との反応が用いられており、そこでは、病原性のTH2細胞のTH1型への方向転換が起こる。これはサイトカインプロファイルの変化をもたらし、B細胞はIgEの代わりにIgGを形成するよう刺激される。
しかしながら、この方法には、アレルギー反応、またはアナフィラキシーショックのリスクさえ存在する。これらのリスクを最小化するために、アレルゴイド(allergoid)の形態の革新的な製剤が用いられている。これらは化学的に修飾されたアレルゲンエキスであり、未処理エキスに比べて顕著に低いIgE反応性を有するが、同等のT細胞反応性を有する(Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382)。
細菌による発現の場合、Phl p1は封入体として沈着し(Vrtala et al., J. Allergy Clin. Immunol, 1996; 97: 781-7)、精製の前に、まず最初に変性させなければならい。変性剤は、後で除去される。しかしながら、当該タンパク質の天然の可溶性コンホメーションへの完全な再折り畳みは、これまで達成されていない(Andersson, Lidholm, Int. Arch. Allergy Immunol. 2003;130:87-107)。
この代わりに、可溶性の欠如の原因は、タンパク質分解活性であり、これが当該分子の自己分解をもたらすと推測されている(Grobe et al., Eur. J. Biochem. 1999; 263: 33-40; Kirsten Gehlhar, Dissertation, 1998, Medical University of Luebeck, Germany)。さらに、分子間の疎水性相互作用もまた、凝集の原因として考えられる。
図1:野生型nPhl p1(n=天然)と、アレルゲン変異体rPhl p1−A236C(r=組換え)の折り畳み変異体(fold variant)LMおよびHMの、還元条件(ジチオスレイトールDTTの存在下)および非還元条件(DTTなし)でのSDS−PAGE。
トラック1:分子量標準(10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、160、220kDa、ベンチマークタンパク質ラダー、Invitrogen, Karlsruhe, Germany)
トラック2:Phleum pratense花粉からのエキス
トラック3:nPhl p1
トラック4:rPhl p1−LM
トラック3:rPhl p1−HM
図は、2つの折り畳み変異体が、異なる見掛けの分子量を有することを示す。
図3:折り畳み変異体rPhl p1−A236C−LMおよび−HMのIgE結合の定量のための酵素アレルゲン吸着試験(Enzyme allergo-sorbent test: EAST)
IgE−nPhl p1結合の阻害剤の濃度をmol/lで横軸にプロットし、阻害の程度を「%」で縦軸に示した。測定は、固相上のnPhl p1、および、草本花粉アレルギー患者の典型的な血清で行った。
驚くべきことに、追加のシステイン残基を、好ましくは当該分子のカルボキシ末端部分(特にアミノ酸位置140から、極めて特に好ましくはアミノ酸位置230と240との間)に導入することにより、IgE活性とT細胞反応性を変化させずに、本発明による改善された可溶性がもたらされることが、今回見出された。
本発明は、したがって、野生型に比べて追加のCys残基を有するオオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1の変異体、および、当該基本分子に由来する、同一のもしくは類似の有利な特性を有する断片および変異体に関する。
原核生物による組換え的製造および精製は、融合要素が遺伝子工学により導入されることを伴って、もしくは伴わずに行うことができ、そして常に同一の産物をもたらす。融合要素を用いる場合、Hisタグが好ましい。精製方法は、発現ベクターまたは発現系に応じて変わる。
本発明はまた、したがって、本発明のアレルゲン変異体をコードするDNA分子にも関する。
組換えタンパク質は、自己タンパク質分解的に(autoproteolytically)不活性であり、したがって、用途に応じて、生理溶液、緩衝液またはその他の溶液中に、安定したモノマー形態で貯蔵することができる。T細胞刺激は、組換えPhl p1と天然Phl p1との間で有意な差を示さない。
この医薬的な適性のために、本発明はまた、医薬としての特性における新規なアレルゲン変異体にも関する。
組換え的方法により製造されたアレルゲン変異体および断片はさらにまた、花粉アレルギーの診断に用いることもできる。
置換の結果、Phl p1において知られているタンパク質分解活性は、同時に消失する。
rPhl p1−LM(LM=低分子量)と称せられる第1のコンホメーション変異体は、非還元SDS−PAGE(図1)およびゲルろ過(例えば、Sepharcryl S 100でのもの、図2参照)でのその類似もしくは同一の移動挙動(run behavior)のため、天然タンパク質と極めて類似の挙動を示す一方、rPhl p1−HM(HM=高分子量)と称せられる第2の変異体は、異なる折り畳み形態で存在する。IgE反応性も異なる。rPhl p1−LMが天然タンパク質に匹敵する反応性を有する一方、rPhl p1−HMは、IgE抗体にそれほど良好に結合せず、その低アレルゲン性により特異的免疫療法に特に好適である(図3参照)。
しかしながら、原則として、両方の折り畳み形態は、両方とも治療および診断のために好適である。
両方の折り畳み形態は、易溶解性であり、モノマー形態で安定であり、そして、検出可能なタンパク質分解/自己タンパク質分解活性を有しない。
本発明のアレルゲン変異体は、例えば、人工的な融合要素を伴って、または伴わずに、以下に概説する2種の製造方法により得ることができる。
Hisタグを用いる場合、最初は不溶性である粗タンパク質の精製は、1もしくは2以上の金属イオンキレートアフィニティークロマトグラフィー工程と、Hisタグの除去とを含む、複数の生化学的分離工程を介して行う。前精製および後精製(pre- and post-purification)のために、種々の他のクロマトグラフィー法、および変性および再生工程を用いることができる。
−グアニジニウムクロリドを用いた、宿主生物から単離した封入体の変性、
−溶解したタンパク質の、キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでの再生、
−Hisタグの除去、
−第1のゲルろ過、
−キレートアフィニティークロマトグラフィー
−標的タンパク質の流出液(flow-through)からの単離、第2、最終ゲルろ過。
−グアニジニウムクロリドを用いた、宿主生物から単離した封入体の変性、
−溶解したタンパク質の、キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでの再生、
−Hisタグの除去、
−第1のゲルろ過、
−キレートアフィニティークロマトグラフィー
−イミダゾール勾配による標的タンパク質の溶出
−第2、最終のゲルろ過。
−グアニジニウムクロリドを用いた、宿主生物から単離した封入体の変性。ここで、以下に記載のとおり、一方または他方の折り畳み形態は、変性期間に応じて得られる。
−緩衝液における希釈による、溶解タンパク質の再生。ここで、20〜50mMのTris/HCl、pH7〜8が好ましく用いられるが、他のバッファーおよびpH値(例えば7〜10.5)もまた可能である。希釈のために、変性したバッチを、好ましくはその容量の倍数(容量の約10〜80倍、好ましくは20〜60倍)の、好ましくは攪拌されているもしくは別様に混合されている緩衝液に、例えばデカント、ピペッティングもしくはポンピングによって添加する。しかしながら、緩衝液を変性バッチに添加することもできる。添加の速度は重要ではない。したがって、全量を一度に数秒以内に、または代替的に、均一に(しかし好ましくは必ずしも均一にではなく)多時間にわたって分配して添加することができる。
−最終ゲルろ過。
HM変異体については、顕著に長いインキュベーション時間を要する。これは、60〜120時間のレベルである。しかしながら、インキュベーションは、通常70〜100時間、特に好ましくは80〜90時間の範囲で行われる。
その間の間隔(約50〜60時間)は、再構成フェーズ(re-formation phase)である。希釈工程は、折り畳み過程を整える(fix)と考えられ、さらなる運動(kinetics)は生じない。
LMとHMとの分離のための高品質な精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより可能であり、または、これらの形態が顕著に異なる保持時間を有するゲルろ過により達成される。
したがって、本発明はさらに、アレルゲン変異体および/またはその医薬的に使用可能な誘導体(あらゆる比率のそれらの混合物を含む)の、オオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1が誘発に関与しているアレルギーの、特異的免疫療法(減感作)および診断のための医薬の製造への使用に関する。
したがって、本発明はさらに、オオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的なDNAワクチン接種による処置のための、本発明のDNA分子を含有する組換えDNA発現ベクターに関する。
本発明は、さらにまた、該発現ベクターおよび/またはその誘導体(あらゆる比率のそれらの混合物を含む)の、オオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的なDNAワクチン接種による処置のための医薬の製造への使用に関する。
さらにまた、遅延放出組成物を、本発明のアレルゲン変異体を対応する製剤化、例えば、水酸化アルミニウムへの吸着により得ることができる。
グループ1草本花粉主要アレルゲンの高い配列相同性を考慮すると、本明細書に記載したPhl p1についての、Cys残基の導入による可溶性の向上および折り畳み変異体の発生に関するすべての効果は、このグループの他の代表例に対しても予想することができる。
すべてのクロマトグラフィー材料は、Amersham Biosciences(Freiburg, Germany)から市販されている。
記載されたキレートアフィニティークロマトグラフィー法における金属イオンの選択は重要ではなく、NiおよびCuの両方を用いることができる。
−Hisタグによる精製法
Phl p1をコードする配列を、PCRにより、5’−および3’−特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅し、EheIおよびHindIII制限部位で、pProExベクター(GIBCO, La Jolla, USA)中にライゲーションした。3’プライマーは、塩基位置706/707にてGCからTGへ改変され、これによりアラニンをコードするトリプレットがシステインをコードするトリプレットに変換された(Essential Molecular Biology; T.A. Brown ed., IRL Press, Oxford, 1994)。形質転換は、大腸菌origamiで行った。選択された開始ベクターpProExは、後にTEVプロテアーゼのための認識配列が続く、N末端側終端に位置する6xHis配列を供給する。細菌による発現の後、不溶性の凝集として存在する一次的に6xHisタグを有する組換えrPhl p1−A236C分子は、6Mグアニジニウムクロリド(GdmCl)、50mM Tris/HCl、500mM NaCl(pH8.0)にて前精製の後溶解する。この後、2段階Niキレートアフィニティークロマトグラフィーが続く。
第2のアフィニティークロマトグラフィーの準備のため、Sephadex G 25と、溶離液としてリン酸バッファーとを用いてゲルろ過を行ない、この結果イミダゾールが除去された。
−Hisタグなしでの精製法
最初に、例1に従った手順が行われるが、ここで、選択されたベクターは、一次産物として融合タンパク質を提供しない。
細菌による発現の後、不溶性の凝集(封入体)として存在する一次的な組換えrPhl p1−A236C分子を、6Mグアニジニウムクロリド(GdmCl)、50mM Tris/HCl(pH8.0)にて前精製の後溶解した。この後、20mM Tris pH8.0に40倍に希釈した。この目的ために、変性した溶液を、マグネチックスターラーを用いて攪拌されている希釈溶液にデカントした。
封入体は、変性溶液中20時間インキュベートした後、上記のとおりに希釈した。
b)HM形態の製造
封入体は、変性溶液中85時間インキュベートした後、上記のとおりに希釈した。
キレートアフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質溶出前のコンディショニングのために、例えば、3M NaCl溶液を洗浄用に、および3M NaCl、200mMイミダゾール溶液を溶出用に用いて、任意に利用することができる。高い塩含量を有する溶出液は、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィーに直接用いることができる。
最後の工程では、最終精製のためにSuperdex 75によるゲルろ過と所望の溶媒への移行とを行った。
天然nPhl p1と、組換えrPhl p1変異体HMおよびLMとを、これらのIgE結合の強度に関して、アレルギー患者血清プールでのSuckら(Int. Arch. Allergy Immunol. 2000; 121: 284-291)の方法により行ったEAST阻害アッセイにおいて、相互に比較した(図3)。HM変異体が、そのIgE結合について、天然Phl p1タンパク質と比較して有意に低減していたが、LM変異体が、天然Phl p1タンパク質に匹敵するIgE結合を有していたことが見出された。
Claims (21)
- オオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1の変異体であって、野生型と比較して追加のCys残基を有することを特徴とする、前記アレルゲン変異体。
- 追加のCys残基が、カルボキシ末端領域に位置することを特徴とする、請求項1に記載のアレルゲン変異体。
- 追加のCys残基が、アミノ酸位置140よりも高い位置に位置することを特徴とする、請求項1または2に記載のアレルゲン変異体。
- 追加のCys残基が、アミノ酸位置230と240との間に位置することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載のアレルゲン変異体。
- 追加のCys残基が、アミノ酸置換に由来することを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載のアレルゲン変異体。
- 追加のCys残基が、Ala236の置換により導入されたことを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の、配列番号2に記載のアレルゲン変異体rPhl p1−A236C。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のアレルゲン変異体をコードするDNA分子。
- 請求項6に記載のアレルゲン変異体をコードする、配列番号1に記載のDNA分子。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の組換え主要アレルゲンrPhl p1の変異体の製造方法であって、自体公知の方法により、
−Cysをコードする塩基トリプレットを、対応する遺伝子に、挿入または置換により導入すること、
−このように改変された遺伝子を、宿主生物で過剰発現させること、および
−過剰発現により得たアレルゲン変異体を精製すること、
を特徴とする、前記方法。 - 最初は不溶性である粗タンパク質を変性させ、次いで希釈により再生し、そして生化学的精製工程で精製することを特徴とする、可溶性形態での、請求項9に記載の組換え主要アレルゲンrPhl p1の変異体の製造および精製方法。
- 精製目的のためのHisタグを有する、過剰発現された、最初は不溶性である粗タンパク質から出発し、2段階金属イオンキレートアフィニティークロマトグラフィーおよびHisタグの除去を包含する、複数の生化学的精製工程を行うことを特徴とする、可溶性形態での、請求項9に記載の組換え主要アレルゲンrPhl p1の変異体の精製方法。
- 様々な折り畳み形態で存在することを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載のアレルゲン変異体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のアレルゲン変異体の折り畳み形態rPhl p1−LMであって、以下の処理工程:
−Hisタグを有するrPhl p1アレルゲンを、宿主生物において過剰発現させる工程、
−宿主生物から単離した封入体を、グアニジニウムクロリドを用いて変性させる工程、
−溶解したタンパク質を、キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムで再生する工程、
−Hisタグを除去する工程、
−ゲルろ過工程
−さらなるキレートアフィニティークロマトグラフィー工程、
−標的タンパク質を流出液から単離する工程、
−ゲルろ過工程、
を行うことにより得ることができる、前記rPhl p1−LM。 - 請求項1〜6のいずれかに記載のアレルゲン変異体の折り畳み形態rPhl p1−HMであって、以下の処理工程:
−Hisタグを有するrPhl p1アレルゲンを、宿主生物において過剰発現させる工程、
−宿主生物から単離した封入体を、グアニジニウムクロリドを用いて変性させる工程、
−溶解したタンパク質を、キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムで再生する工程、
−Hisタグを除去する工程、
−ゲルろ過工程
−さらなるキレートアフィニティークロマトグラフィー工程、
−標的タンパク質をイミダゾール勾配により溶出する工程、
−ゲルろ過工程、
を行うことにより得ることができる、前記rPhl p1−HM。 - 医薬としての、請求項1〜6および12〜14のいずれかに記載のアレルゲン変異体。
- 請求項15に記載のアレルゲン変異体および/またはその医薬的に使用可能な誘導体(あらゆる比率のこれらの混合物を含む)の、オオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1が誘発に関与しているアレルギーの、特異的免疫療法のための医薬の製造への使用。
- 請求項15に記載のアレルゲン変異体および/またはその医薬的に使用可能な誘導体(あらゆる比率のこれらの混合物を含む)と、所望により、賦形剤および/または添加剤とを含む、医薬組成物。
- 請求項1〜6および12〜14のいずれかに記載のアレルゲン変異体、および/またはその誘導体(あらゆる比率のこれらの混合物を含む)の、オオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1が誘発に関与しているアレルギーのin vitro診断のための使用。
- オオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的DNAワクチン接種による処置のための、請求項7または8に記載のDNA分子を含有する組換えDNA発現ベクター。
- 請求項19に記載の発現ベクターおよび/またはその誘導体(あらゆる比率のこれらの混合物を含む)の、オオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的DNAワクチン接種による処置のための、医薬の製造への使用。
- 請求項19に記載の発現ベクターおよび/またはその誘導体(あらゆる比率のこれらの混合物を含む)と、所望により、賦形剤および/または添加剤とを含む、オオアワガエリからの主要アレルゲンPhl p1が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的DNAワクチン接種による処置のための、医薬組成物。
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