CN1675240A

CN1675240A - 来自梯牧草的主要过敏原Phl p1的变异体

Info

Publication number: CN1675240A
Application number: CNA038198231A
Authority: CN
Inventors: R·萨克; H·菲比希; O·克洛姆维尔
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2002-08-19
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2005-09-28
Anticipated expiration: 2023-07-31
Also published as: BRPI0313613B1; PL212891B1; JP4668616B2; US20060251682A1; CN100509844C; EP1532169B1; CA2495825A1; JP5868587B2; US9453058B2; WO2004022588A1; RU2323942C2; US20120263741A1; CA2495825C; BR0313613A; PL373069A1; PT1532169E; US7731970B2; EP1532169A1; AU2003251674B2; JP2006516382A

Abstract

本发明涉及来自梯牧草的主要过敏原Phlp1的药物学上重要的变异体，其特征在于可通过原核表达系统的方式生产先前不可能生产的稳定且可溶于生理性介质的单体分子，并且可随后纯化所述的分子。

Description

来自梯牧草的主要过敏原Phl p 1的变异体

本发明涉及来自梯牧草(timothy grass)的主要过敏原Phl p 1的变异体，其特征在于可利用原核表达系统的帮助来制备迄今不可能生产的、可溶的且在生理性介质中稳定的单体分子，并且可随后将其纯化。

发明背景

1型过敏反应具有世界范围内的重要性。工业化国家中多达25％的人群患有例如，过敏性鼻炎、结膜炎或支气管气喘的疾病，这些疾病是由各种起始存在于空气中的过敏原(空气过敏原)引起的，例如植物花粉、螨、猫或狗。在草花粉的病例中，这些1型过敏反应患者的多达40％依次显示出特异的IgE(免疫球蛋白E)反应(Freidhoff等人，1986，过敏反应临床免疫学杂志J.Allergy.Clin.Immunol.78，1190-201)。

发起1型过敏反应的物质是蛋白质、糖蛋白或多肽。经粘膜摄取后，在敏感人群中这些过敏原与结合肥大细胞表面的IgE分子起反应。如果两个IgE分子通过过敏原相互交联，这导致效应细胞释放介质(例如组氨酸、前列腺素)和细胞因子，并因此产生相应的临床症状。

根据具有针对某些过敏原的IgE抗体的过敏反应患者的相对频率，在主要和次要过敏原之间是有差别的。在梯牧草(Phleumpratense)的病例中，Phl p 1(Petersen等人，1993，J.Allergy Clin.Immunol.92，789-796)、Phl p 5(Matthiesen和Lwenstein，1991，Clin.Exp.Allergy 21，297-307)、Phl p 6(Petersen等人，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108，49-54)和Phl p 2/3(Dolecek等人，1993)迄今还没有被鉴定为主要过敏原，而Phl p 4(Lwenstein，1978，过敏反应进展Prog.Allergy 25，1-62)和来自黑麦草(Lolium perenne)的第10和11组(Ansari等人，1987，J.Allergy Clin.Immunol.80，229-235)也没有被鉴定为次要过敏原。

包括来自梯牧草的Phl p 1的第1组，被分类为草花粉的最相关抗原组之一(Tamborini，E.等人，Eur.J.Biochem.1997，249：886-894)。第1组中来自于其他草的其他代表性过敏原有时候与Phl p 1具有大于95％的同源性(Petersen，A.，等人，Allergy Clin.Immunol.1995，95：987-994)。由于高同源性，在草致敏的情况下也出现与其他交叉反应种属的过敏原的反应。因此，这些分子对于相应的诊断和治疗方法至关重要。

关于这些过敏原的治疗性用途，可利用与T辅助细胞的反应，该反应中出现病理学的TH2细胞重定向为TH1型。这导致细胞因子分布的变化，从而刺激B细胞形成IgG而非IgE。

有效治疗过敏反应的经典方法是特异性免疫治疗或弱敏化作用(Fiebig，1995，Allergo J.4(6)，336-339，Bousquet等人，1998，J.AllergyClin Immunol.102(4)，558-562)，其中用天然的过敏原提取物以增加的剂量对患者进行皮下注射。

然而，在该方法中存在过敏反应或过敏性休克的风险。为了使这些风险最小化，应用类过敏原形式的创新制剂。这些制剂是化学修饰的过敏原提取物，其具有显著减小的IgE反应性，但与未处理的提取物相比有相同的T-细胞反应性(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377-382)。

使用通过重组方法制备的过敏原可使更多的基本治疗优化。通过重组方法制备的高纯度过敏原的、任选匹配于个别患者的限定混合物可释放来自天然过敏原来源的提取物，除包含各种过敏原外，还包含相对大量免疫原性的、但伴随非过敏原性的蛋白质。通过特异突变的重组过敏原所提供的实际观点是，其可导致用表达产物进行可靠的弱敏化作用，在该特异突变的重组过敏原中，特异性缺失IgE表位，而不减弱为治疗所必需的T-细胞表位(Schramm等人，1999，免疫学杂志J.Immunol.162，2406-2414)。

进一步用于治疗影响过敏反应患者中扰乱的Th-细胞平衡的可能性，是用编码相关过敏原的可表达DNA进行治疗。已经在注射编码过敏原DNA的啮齿类动物中提供免疫应答的过敏原特异性影响的最初实验证据(Hsu等人，1996，自然医学Nature Medicine 2(5)，540-544)。

Phl p 1是包括240个氨基酸和n-糖基化位点的蛋白质。糖基化部分占分子量的5％，其在天然蛋白质中为大约30-35kDa(Petersen等人，Allergy Clin.Immunol.1995，95：987-994；Suck等人，免疫学方法杂志J.Immunol.Meth.199.9，229：73-80)。Phl p 1的核酸序列是已知的(Laffer等人，J.Allergy Clin Immunol.1994，94：689-698；Petersen等人J.Allergy Clin.Immunol.，1995，95：987-94)，并可因此用于该分子的重组制备。

以前试图在细菌或真核系统中，例如酵母中通过重组方法制备该分子，由此可获得稳定的单体形式，但是由于其较差的溶解性而不是很成功：

在细菌表达的情况中，Phl p 1以包涵体形式沉积(Vrtala等人，J.Allergy Clin.Immunol，1996；97：781-7)，并且在纯化前必须先变性。然后除去变性剂。但是迄今为止还没有实现使该蛋白质完全重折叠成为天然的可溶性构象(Andersson，Lidholm，Int.Arch.Allergy Immunol.2003；130：87-107)。

阻止稳定构象形成的一个可能原因是由于缺乏糖基化。然而，在可进行糖基化的真核系统中尚未获得稳定的Phl p 1(K.Grobe，论文Dissertation，1998，汉堡大学)。

替代性地，认为溶解性缺失的原因是由于导致分子自身-降解的蛋白水解活性(Grobe等人，Eur.J.Biochem.1999；263：33-40；KirstenGehlhar，Dissertation，1998，Medical University of Lübeck，德国)。此外，分子间的疏水性相互作用也可能导致聚集作用。

本发明基于的目的是提供来自梯牧草的主要过敏原Phl p 1的变异体，其区别在于该变异体具有改善的溶解性，同时仍然完全保持治疗和诊断的重要免疫学特性，并因此可以药物学上合适的形式进行纯化。

附图

图1：野生型nPhl p 1(n＝天然)和过敏原变异体rPhl p 1-A236C(r＝重组)的折叠变异体LM和HM，在还原条件(存在二硫苏糖醇DTT)和非还原条件下(没有DTT)的SDS-PAGE。

泳道1：分子量标准(10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、160、220kDa，基准蛋白质Ladder，Invitrogen，Karlsruhe，德国)

泳道2：来自梯牧草(Phleum pratense)花粉的提取物

泳道3：nPhl p 1

泳道4：rPhl p 1-LM

泳道5：rPhl p 1-HM

图2：在Sephacryl S100柱上的rPhl p 1-HM和rPhl p 1-LM的凝胶过滤。

该图显示两种折叠变异体具有明显不同的分子量。

图3：用于定量折叠变异体rPhl p 1-A236C-LM和-HM的IgE-结合的酶过敏原-吸附剂测试(EAST)

在横轴上作图指明mol/l的IgE-nPhl p 1结合抑制剂的浓度，在纵轴上指明[％]的抑制程度。用固相上的nPhl p 1和草花粉过敏反应患者的典型血清进行测量。

发明详述

令人惊奇地，根据本发明现在已经发现导入附加的半胱氨酸残基，优选地在所述分子的羧基端部分(特别是从第140位氨基酸往后，特别优选在第230位和第240位氨基酸之间)导入，可导致改善溶解性而不改变IgE活性和T-细胞反应性。

因此本发明涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p 1的变异体，其与野生型相比具有附加的Cys残基，并且涉及具有相同或相似有利特性的碱基分子衍生的片段和变异体。

本发明进一步涉及用于制备重组主要过敏原rPhl p 1的本发明所述变异体的方法，其特征在于，通过本身已知的方法，经插入或置换将编码Cys残基的碱基三联体导入Phl p 1基因，如此改变的基因在宿主生物体中过表达，并纯化由过表达获得的过敏原变异体。

可使用或不使用经基因工程导入的融合元件制备和纯化原核重组体，并且通常可得到相同的产物。如果使用融合元件，优选为His标记。纯化的方法可根据表达载体或系统而不同。

因此本发明包括重组过敏原rPhl p 1的特异改变的初级序列，该序列有利于其在细菌和其他表达系统中的重组制备并适于随后的纯化。

因此本发明也涉及编码本发明所述的过敏原变异体的DNA分子。

重组蛋白是自发蛋白水解失活的，因此可根据应用，以稳定的单体形式贮存在生理学缓冲液或其他溶液中。在重组体和天然Phl p 1之间T-细胞刺激未显示显著的差异。

因此重组的过敏原变异体和衍生的片段或变异体可用于治疗草花粉诱导的过敏原疾病。

由于药物学适用性，本发明也涉及其作为药物特性的新过敏原变异体。

通过重组方法制备的过敏原变异体和片段可进一步用于诊断花粉过敏反应。

在通过基因工程改变来自梯牧草的主要过敏原Phl p 1的制备中，氨基酸置换受到例如PCR方式的定向核苷酸置换的影响。在特别优选的实施方案中，如SEQ ID NO 2所示的突变rPhl p 1-A236C中，第236位的丙氨酸被替换为半胱氨酸。然而，置换位点也可以是在该分子的任何所需要的其他位点。但是通常，其位于分子的C端区域，优选从第140位往后，特别是在第230位和第240位之间。

置换的结果是，Phl p 1的已知的蛋白水解活性同时被消除了。

另一个未料到的结果是，根据本发明，在分子的分离和纯化过程中两种折叠的变异体可完全相互分离。

第一种构象变异体，称为rPhl p 1-LM(LM＝低分子量)，显示与天然蛋白质非常相似的性状，因为其在非还原的SDS-PAGE(图1)和凝胶过滤(例如在图2的Sepharcryl S-100上)中泳动性状是相似或相同的，而第二种变异体，称为rPhl p 1-HM(HM＝高分子量)，则显示不同的折叠形式。IgE反应性也不同。rPhl p 1-LM具有与天然蛋白质相当的反应性，rPhl p 1-HM则极少与IgE抗体结合，并且由于其弱敏性而特别适合于特异的免疫治疗(参见图3)。

然而就原理而论，两种折叠都适合于治疗和诊断的应用。

因此本发明进一步涉及本发明所述的rPhl p 1过敏原变异体的不同折叠形式，并涉及其用于治疗和诊断目的的用途。

两种折叠形式都是易溶的、稳定的单体形式并且不具有可检测的蛋白水解/自发水解活性。

可例如通过下文列出的两种制备方法-有或没有-人工融合元件的方法来获得本发明所述的过敏原变异体。

1)具有人工融合元件(His标记)的表达

在使用His标记的情况中，经多个生化分离步骤纯化起始不可溶的粗蛋白，包括一个或多个金属离子螯合亲和色谱步骤，并除去His标记。对于纯化前和纯化后，可使用各种其他的色谱方法和变性及复性步骤。

制备折叠形式的rPhl p 1-LM：

-利用盐酸胍使从宿主生物体分离的包涵体变性，

-在螯合亲和色谱柱上使溶解的蛋白质复性，

-除去His标记，

-第一次凝胶过滤，

-螯合亲和色谱分析，

-从流过液分离靶蛋白质，第二次，最后的凝胶过滤。

通过进行下列的方法步骤，在该纯化的变异体中可获得另一种折叠形式的-rPhl p 1-HM：

-在宿主生物体中过表达具有His标记的rPhl p 1过敏原变异体，

-利用盐酸胍使从宿主生物体分离的包涵体变性，

-在螯合亲和色谱柱上使溶解的蛋白质复性，

-除去His标记，

-第一次凝胶过滤，

-螯合亲和色谱分析，

-用咪唑梯度洗脱靶蛋白质，

-第二次，最后的凝胶过滤。

2)没有融合元件(没有His标记)的表达

-利用盐酸胍使从宿主生物体分离的包涵体变性，其中，如下所述，根据变性持续的时间获得一种或另外一种折叠形式。

-通过在缓冲溶液中稀释来使溶解的蛋白质复性，其中优选使用20-50mM的Tris/HCl pH7-8，但是其他的缓冲液和pH值(例如，7-10.5)也是可行的。对于稀释，优选将每批变性物加入多倍于其体积(大约10至80倍，优选20至60倍的体积)的、优选为搅拌的或混合的缓冲溶液，例如通过倾析、吹吸或抽打；然而也可以将缓冲溶液加入每批变性物。加入的比例不是至关重要的：因此，可以在数秒内一次性加入全部量或备选地-(但优选不是必须的)均一地-在数小时内分次加入。

-通过螯合亲和色谱法和随后用咪唑梯度(优选使用分级梯度进行，但连续梯度同样也是可行的)洗脱来浓缩和纯化复性的蛋白质。备选或附加地，也可任选进行螯合亲和色谱法、疏水性相互作用色谱法和/或阴离子交换色谱法(必须用色谱法完全处理所述分子)。

-最后的凝胶过滤。

在变性步骤中用不同孵育时间的方式，以最小的交叉污染在此可特异获得替换性的稳定折叠形式的LM和HM。对于LM形式的制备，基本上在大约1和50小时之间进行孵育。然而通常使用10至40小时的范围，优选15至30小时，其中18至22小时的范围是特别优选的。

对于HM变异体，需要显著较长的孵育时间。其为大约60至120小时。然而通常孵育可进行70至100小时，特别优选为80至90小时的范围。

在所有的情况中变性步骤后是用缓冲溶液进行上述稀释的步骤。

之间的间隔时间(大约50至60小时)表示再形成阶段。稀释步骤明显决定了折叠过程，没有发生进一步的动力学过程。

经疏水性相互作用色谱法或通过凝胶过滤可实现分离LM和HM的良好纯化，其中该形式具有显著不同的持续时间。

可获得高纯度折叠变异体LM和HM的、本发明所述的过敏原变异体，其具有颇有价值的药物学相关特性。因此，其可作为混合物、也可单独用于诊断(特别是rPhlp 1-LM，因为保留IgE活性)和治疗(特别是rPhl p 1-HM，因为减弱的IgE活性)过敏性疾病。

因此本发明同样涉及过敏原变异体和/或其药物学上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物在制备用于特异性免疫治疗(弱敏化作用)的药物，以及在诊断过敏反应中的用途，其中该过敏反应的触发中涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p 1。

本发明进一步涉及包括本发明所述的过敏原变异体和/或其药物学上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物的药物组合物，并且如果需要，所述组合物可包括赋形剂和/或佐剂。可将本发明所述的活性成分在此与至少一种固体、液体和/或半液体-赋形剂或佐剂一起以及，如果需要，与一种或多种另外的活性成分组合而转化为合适的剂型。

如果将根据本发明过敏原变异体所基于的DNA分子与合适的载体连接，这些构建体可另外用作免疫治疗的制剂(DNA疫苗)。

本发明因此同样涉及包含本发明所述DNA分子的重组DNA表达载体，气用于通过免疫治疗性DNA的疫苗接种来治疗过敏反应，其中该过敏反应的触发中涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p 1。

本发明进一步涉及所述表达载体和/或其衍生物，包括其所有比例的混合物在用于制备通过免疫治疗性DNA的疫苗接种来治疗过敏反应的药物中的用途，其中该过敏反应的触发中涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p 1。

最后，本发明涉及包括本发明所述表达载体和/或其衍生物，和/或其药物学上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物，并且如果需要，包括赋形剂和/或佐剂的药物组合物，所述组合物用于通过免疫治疗性DNA的疫苗接种来治疗过敏反应，其中该过敏反应的触发中涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p 1。

为了本发明的目的，药物学组合物可在人类医学或兽医学中用作治疗性试剂。合适的赋形剂是有机或无机物质，该物质适合于非肠胃给药并且不与来自梯牧草的主要过敏原Phl p 1的本发明所述过敏原变异体起反应。适合于非肠胃给药的是，特别为溶液，优选以油为基础的或含水的溶液，进一步为悬浮液、乳液或植入物。本发明所述的过敏原变异体也可被冻干并且所得到的冻干物可用于，例如制备注射制剂。所指定的组合物可以是无菌的和/或包括佐剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂和/或湿润剂、乳化剂、用于改变渗透压的盐、缓冲物质和/或多种另外的活性成分。

此外，可通过本发明所述过敏原变异体的相应剂型，例如表面吸附在氢氧化铝上来获得延迟释放的组合物。

根据本发明的突变，在不同位置的其他选择性改变和-例如用于增加弱敏性-的其他改变，当然也是可行的。这些改变可以是，例如过敏原提取物的化学修饰(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377-382)。然而，也可通过基因工程在DNA水平进行改变，其中，例如氨基酸的插入、缺失和置换，切割蛋白质成为片段以及将蛋白质或其片段与其他蛋白质或肽融合都是合适的。

就第1组草花粉主要过敏原内的高序列同源性而言，在此所描述的通过导入Cis残基用于改善Phl p 1相关溶解性，并出现折叠变异体的所有效应也可预期适用于该组的其他代表性过敏原。

即使没有这些评注，认为本领域的技术人也能够在最广泛的范围内利用上述说明。因此下列表1和表2中所描述的，并以变异体rPhl p1-A236C的实施例方式说明的实施方案只被认为是说明性的公开，而绝对不是以任何方式加以限制。

所有的色谱法材料可从Amersham Biosciences(Freiburg，德国)商业购买。

在所描述的螯合亲和色谱方法中选择的金属离子不是至关重要的，Ni和Cu都可使用。

实施例1：分离具有His标记的rPhl p 1-A236C-LM和-HM-纯化变异体

用特异于5’-和3’的寡核苷酸，通过PCR方式扩增编码Phl p 1的序列，并经EheI和Hind III限制性位点连接到ProEx载体(GIBCO，LaJolla，美国)中。将3’-引物第706/707位置的碱基GC改变为TG，由此将编码丙氨酸的三联体转变为编码半胱氨酸的三联体(基本分子生物学Essential Molecular Biology；T.A.Brown编辑，IRL Press，牛津，1994)。在大肠杆菌生物体中进行转化。所选择的起始载体pProEx提供位于N末端的6xHis序列，其后是TEV蛋白酶的识别序列。细菌表达后，将以不溶聚集物存在的初级6xHIS-标记的重组rPhl p 1-A236C分子在6M盐酸胍(GdmCl)，50mM Tris/HCl，500mM NaCl，pH8.0)中预纯化后溶解。然后是两级的Ni螯合亲和色谱分析：

在第一步中，经过90分钟过程的梯度，将在变性条件下结合螯合琼脂糖凝胶的蛋白质从变性溶液转移到由50mM磷酸盐缓冲液和500mM NaCl(pH 7.4)组成的缓冲液中。然后用磷酸盐缓冲液中的500mM咪唑逐步洗脱。复性的融合蛋白被特异的TEV蛋白酶切割成rPhl p 1和6xHis融合元件。

为了准备第二次亲和色谱分析，用Sephadex G-25和磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行凝胶过滤，结果是除去了咪唑。

然后将缓冲液形式的蛋白质混合物用于第二次Ni螯合亲和色谱分析。此中，在流过液中发现一些成功切割的rPhl p 1。这是LM-形式的分子。除了未切割的分子，显然由于暴露的组氨酸残基，构象变异体HM也保留粘附在柱上。在未切割的融合蛋白前，该切割的变异体在咪唑梯度中洗脱出来，从而还能够以高纯度获得这种形式。在最后的步骤中，用Superdex 75进行凝胶过滤以用于最后的纯化，并转移到所需要的溶剂中。

表1概述利用His标记的本发明所述的制备和纯化方法

1.表达2.分离包涵体3.变性4.Ni螯合亲和色谱1(复性)5.除去His标记6.凝胶过滤(Sephadex G-25)7.Ni螯合亲和色谱2：流过液：rPhl p 1-LM洗出液：rPhl p 1-HM，未切割的His-rPhl p 1融合蛋白8.凝胶过滤(Superdex 75)

实施例2：分离没有His标记的rPhl p 1-A236C-LM和-HM-纯化变异体

起初，遵循实施例1的步骤，但是其中所选择的载体不提供作为初级产物的融合蛋白。

细菌表达后，将以不溶聚集物存在的初级rPhl p 1-A236C重组分子(包涵体)在6M盐酸胍(GdmCl)，50mM Tris/HCl，pH8.0)中预纯化后溶解。然后在20mM Tris pH 8.0中稀释40倍。为此，将变性的溶液轻轻倒入利用磁力搅拌仪搅拌的稀释溶液。

a)制备LM形式

包涵体在变性溶液中孵育20h，然后如上所述稀释。

b)制备HM形式

包涵体在变性溶液中孵育85h，然后如上所述稀释。

将500mM的NaCl分别加入各批溶液(复性)。通过Cu螯合亲和色谱法并用磷酸盐缓冲液中的200mM咪唑阶段(或逐渐经过磷酸盐缓冲液中的500mM咪唑)洗脱来浓缩各批复性溶液中溶解的分子。

在蛋白质的洗脱前，可例如用3M的NaCl溶液进行洗涤，以及3M的NaCl，200mM的咪唑溶液进行洗脱来任选地将螯合亲和色谱法用于处理。然后可将高盐含量的洗脱物直接用于疏水性相互作用色谱法。

表2概述没有利用His标记的本发明所述的制备和纯化方法

1.表达2.分离包涵体3.变性4.稀释持续20h：LM持续85h：HM5.Cu螯合亲和色谱(复性)6.凝胶过滤(Superdex 75)

实施例2：野生型和过敏原变异体rPhl p 1-A236C的折叠变异体LM和HM的不同IgE结合

根据Suck等人(Int.Arch.过敏反应免疫学Allergy Immunol.2000；121：284-291)的方法，用过敏反应患者的血清库进行EAST抑制试验，来比较天然的nPhl p 1和重组的rPhl p1变异体HM和LM相互之间对IgE结合的强度(图3)。发现与天然的Phl p 1蛋白相比，HM变异体显著地减小了其与IgE的结合，而LM变异体与IgE的结合与天然Phl p 1蛋白相当。

序列表

<110> Merck Patent GmbH

<120> 来自梯牧草的主要过敏原Phl p1的变异体

<130> P 02/129

<140> EP 02 018 157.4

<141> 2002-08-19

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 723

<212> DNA

<213> 梯牧草

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(720)

<223>

<400> 1

atc ccc aag gtt ccc ccc ggc ccg aac atc acg gcg acc tac ggc ggc 48

Ile Pro Lys Val Pro Pro Gly Pro Asn Ile Thr Ala Thr Tyr Gly Gly

1 5 10 15

aag tgg ctg gac gcg aag agc acc tgg tac ggc aag ccg acg gcc gcc 96

Lys Trp Leu Asp Ala Lys Ser Thr Trp Tyr Gly Lys Pro Thr Ala Ala

20 25 30

ggt ccc aag gac aac ggc ggc gcg tgc ggg tac aag gac gtg gac aag 144

Gly Pro Lys Asp Asn Gly Gly Ala Cys Gly Tyr Lys Asp Val Asp Lys

35 40 45

ccc ccg ttc agc ggc atg acc ggc tgc ggc aac acc ccc atc ttc aag 192

Pro Pro Phe Ser Gly Met Thr Gly Cys Gly Asn Thr Pro Ile Phe Lys

50 55 60

tcc ggc cgg ggc tgc ggc tcc tgc ttc gag atc aag tgc acc aag ccc 240

Ser Gly Arg Gly Cys Gly Ser Cys Phe Glu Ile Lys Cys Thr Lys Pro

65 70 75 80

gag gcc tgc tcc ggc gag ccc gtg gtg gtc cac atc acc gac gac aac 288

Glu Ala Cys Ser Gly Glu Pro Val Val Val His Ile Thr Asp Asp Asn

85 90 95

gag gag ccc atc gcc gcg tac cac ttc gac ctc tcc ggc atc gcg ttc 336

Glu Glu Pro Ile Ala Ala Tyr His Phe Asp Leu Ser Gly Ile Ala Phe

100 105 110

ggg tcc atg gcc aag aag ggc gac gag cag aag ctg cgc agc gcc ggc 384

Gly Ser Met Ala Lys Lys Gly Asp Glu Gln Lys Leu Arg Ser Ala Gly

115 120 125

gag gtg gag atc cag ttc cgc cgc gtc aag tgc aag tac ccg gag ggc 432

Glu Val Glu Ile Glu Phe Arg Arg Val Lys Cys Lys Tyr Pro Glu Gly

130 135 140

acc aag gtg acc ttc cac gtg gag aag ggg tcc aac ccc aac tac ctg 480

Thr Lys Val Thr Phe His Val Glu Lys Gly Ser Asn Pro Asn Tyr Leu

145 150 155 160

gcg ctg ctg gtg aag ttt gtc gcc ggc gac ggc gac gtg gtg gcg gtg 528

Ala Leu Leu Val Lys Phe Val Ala Gly Asp Gly Asp Val Val Ala Val

165 170 175

gac atc aag gag aag ggc aag gac aag tgg atc gcg ctc aag gag tcg 576

Asp Ile Lys Glu Lys Gly Lys Asp Lys Trp Ile Ala Leu Lys Glu Ser

180 185 190

tgg gga gcc atc tgg agg atc gac acc ccg gag gtg ctc aag ggc ccc 624

Trp Gly Ala Ile Trp Arg Ile Asp Thr Pro Glu Val Leu Lys Gly Pro

195 200 205

ttc acc gtc cgc tac acc acc gag ggc ggc acc aag ggc gag gcc aag 672

Phe Thr Val Arg Tyr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Lys Gly Glu Ala Lys

210 215 220

gac gtc atc ccc gag ggc tgg aag gcc gac acc tgc tac gag tcc aag 720

Asp Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys Ala Asp Thr Cys Tyr Glu Ser Lys

225 230 235 240

tga 723

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> 梯牧草

<400> 2

Ile Pro Lys Val Pro Pro Gly Pro Asn Ile Thr Ala Thr Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Lys Trp Leu Asp Ala Lys Ser Thr Trp Tyr Gly Lys Pro Thr Ala Ala

20 25 30

Gly Pro Lys Asp Asn Gly Gly Ala Cys Gly Tyr Lys Asp Val Asp Lys

35 40 45

Pro Pro Phe Ser Gly Met Thr Gly Cys Gly Asn Thr Pro Ile Phe Lys

50 55 60

Ser Gly Arg Gly Cys Gly Ser Cys Phe Glu Ile Lys Cys Thr Lys Pro

65 70 75 80

Glu Ala Cys Ser Gly Glu Pro Val Val Val His Ile Thr Asp Asp Asn

85 90 95

Glu Glu Pro Ile Ala Ala Tyr His Phe Asp Leu Ser Gly Ile Ala Phe

100 105 110

Gly Ser Met Ala Lys Lys Gly Asp Glu Gln Lys Leu Arg Ser Ala Gly

115 120 125

Glu Val Glu Ile Gln Phe Arg Arg Val Lys Cys Lys Tyr Pro Glu Gly

130 135 140

Thr Lys Val Thr Phe His Val Glu Lys Gly Ser Asn Pro Asn Tyr Leu

145 150 155 160

Ala Leu Leu Val Lys Phe Val Ala Gly Asp Gly Asp Val Val Ala Val

165 170 175

Asp Ile Lys Glu Lys Gly Lys Asp Lys Trp Ile Ala Leu Lys Glu Ser

180 185 190

Trp Gly Ala Ile Trp Arg Ile Asp Thr Pro Glu Val Leu Lys Gly Pro

195 200 205

Phe Thr Val Arg Tyr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Lys Gly Glu Ala Lys

210 215 220

Asp Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys Ala Asp Thr Cys Tyr Glu Ser Lys

225 230 235 240

Claims

1.来自梯牧草的主要过敏原Phl p1的变异体，其特征在于与野生型相比该变异体具有附加的Cys残基。

2.权利要求1所述的过敏原变异体，其特征在于附加的Cys残基位于羧基端区域。

3.权利要求1或2所述的过敏原变异体，其特征在于附加的Cys残基位于比第140位氨基酸更靠后的位置。

4.权利要求1至3中一项或多项所述的过敏原变异体，其特征在于附加的Cys残基位于第230位和第240位的氨基酸之间。

5.权利要求1至4中一项或多项所述的过敏原变异体，其特征在于附加的Cys残基来源于氨基酸置换。

6.权利要求1至5中一项或多项所述的、如SEQ ID NO 2所示的过敏原变异体rPhl p1-A236C，其特征在于已经通过置换Ala 236而导入附加的Cys残基。

7.编码权利要求1至6中一项或多项所述的过敏原变异体的DNA分子。

8.编码权利要求6所述的过敏原变异体的、如SEQ ID NO 1所示的DNA分子。

9.用于制备权利要求1至6中一项或多项所述的主要过敏原rPhlp1的重组变异体的方法，其特征在于通过本身已知的方法，

-通过插入或置换将编码Cys残基的碱基三联体导入相应的基因，

-以这种方式改变的基因在宿主生物体中过表达，以及

-纯化由过表达获得的过敏原变异体。

10.用于制备和纯化权利要求9所述可溶形式的主要过敏原rPhl p1的重组变异体的方法，其特征在于使起初不可溶的粗蛋白变性，然后通过稀释而复性，并经生化纯化步骤进行纯化。

11.用于纯化权利要求9所述可溶形式的主要过敏原rPhl p1的重组变异体的方法，其特征在于从过表达开始，为了纯化的目的使起初不可溶的粗蛋白具有His标记，进行多个生化纯化步骤，包括两级金属离子螯合亲和色谱法，并除去His标记。

12.权利要求1至6中一项或多项所述的过敏原变异体，其特征在于该变异体存在多种折叠形式。

13.权利要求1至6中一项或多项所述的过敏原变异体的折叠形式rPhl p1-LM，其可通过进行下列方法步骤而获得：

-在宿主生物体中过表达具有His标记的rPhl p1过敏原变异体，

-利用盐酸胍使从宿主生物体分离的包涵体变性

-在螯合亲和色谱柱上使溶解的蛋白质复性

-除去His标记

-凝胶过滤

-进一步的螯合亲和色谱分析

-从流过液分离靶蛋白质

-凝胶过滤。

14.权利要求1至6中一项或多项所述的过敏原变异体的折叠形式rPhl p1-HM，其可通过进行下列方法步骤而获得：

-在宿主生物体中过表达具有His标记的rPhl p1过敏原变异体

-利用盐酸胍使从宿主生物体分离的包涵体变性

-在螯合亲和色谱柱上使溶解的蛋白质复性

-除去His标记

-凝胶过滤

-进一步的螯合亲和色谱分析

-用咪唑梯度洗脱靶蛋白质

-凝胶过滤。

15.用作药物的权利要求1至6和12至14中一项或多项所述的过敏原变异体。

16.权利要求15所述的过敏原变异体和/或其药物学上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物在制备用于特异免疫治疗过敏反应的药物中的用途，其中该过敏反应的触发中涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p1。

17.一种药物组合物，所述组合物包括权利要求15所述的过敏原变异体和/或其药物学上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物，并且如果需要，包括赋形剂和/或佐剂。

18.包括权利要求1至6和12至14中一项或多项所述的过敏原变异体和/或其衍生物，包括其所有比例的混合物在用于体外诊断过敏反应中的用途，其中该过敏反应的触发中涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p1。

19.包含权利要求7或8所述DNA分子的重组DNA表达载体，其用于通过免疫治疗性DNA的疫苗接种来治疗过敏反应，其中该过敏反应的触发中涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p1。

20.权利要求19所述的表达载体和/或其衍生物，包括其所有比例的混合物在制备用于通过免疫治疗性DNA的疫苗接种来治疗过敏反应的药物中的用途，其中该过敏反应的触发中涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p1。

21.药物组合物，包括权利要求19所述的表达载体和/或其药物学上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物，并且如果需要，包括赋形剂和/或佐剂的药物组合物，所述组合物用于通过免疫治疗性DNA的疫苗接种来治疗过敏反应，其中该过敏反应的触发中涉及来自梯牧草的主要过敏原Phl p1。