BRPI0313613B1 - variantes do principal alérgeno phl p 1 de capim-timóteo, suas formas de enovelamento lm e hm, seus usos e seus processos de preparação e de purificação, molécula de dna, vetor de expressão de dna recombinante e seu uso, e composições farmacêuticas - Google Patents

Abstract

"variantes do principal alérgeno phl p1 de capim-timóteo". a presente invenção refere-se a variantes do principal alérgeno phl p 1 de capim-timóteo, caracterizadas pelo fato de que uma preparação, até então não possível, de moléculas monoméricas que são solúveis e estáveis no meio fisiológico, pode ser realizada com a ajuda de sistemas de expressão procariótica e subseqüente purificação das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTE DO PRINCIPAL ALÉRGENO PHL P 1 DE CAPIM-TIMÓTEO, SUAS FORMAS DE ENOVELAMENTO LM E HMf SEUS USOS E SEUS PROCESSOS DE PREPARAÇÃO E DE PURIFACAÇÃO, MOLÉCULA DE DNA, VETOR DE EXPRESSÃO DE DNA RECOMBI-NANTE E SEU USO, E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS".

[001] A presente invenção se refere a variantes do principal alér-geno Phl p 1 de capim-timóteo, caracterizadas pelo fato de que uma preparação, até então não possível, de moléculas monoméricas que são solúveis e estáveis no meio fisiológico, pode ser realizada com a ajuda de sistemas de expressão procariótica e subsequente purifica-ção das mesmas.

Antecedentes da Invenção [002] As alergias do tipo 1 são de importância em todo o mundo. Aproximadamente, até 25% da população de países industrializados, sofre de queixas do tipo, rinite alérgica, conjuntivite ou asma bronquial, que são causados por alérgenos de diversas origens presentes no ar (alérgenos aéreos), tais como, pólen de plantas e ácaros, também presentes em gatos ou cães. Até 40% desses sofredores de alergia tipo 1, por sua vez, mostram reatividade específica de IgE {imunoglo-bulina E) no caso do pólen de gramas (Freídhoff e outros, 1986, J. Af-íergy Cfin. Immunof, 78, 1190-201).

[003] As substâncias que iniciam a alergia tipo 1 são proteínas, glicoproteínas ou polipeptídeos. Após absorção através das membranas mucosas, esses alérgenos reagem com as moléculas de IgE ligadas à superfície das células mastócitas em pessoas sensíveis. Se duas moléculas de IgE forem reticuladas entre si por meio de um alérge-no, isso resulta na liberação de mediadores (por exemplo, histamina, prostaglandinas) e citocinas pela célula efetora e, assim, nos correspondentes sintomas clínicos.

[004] Dependendo da freqüência relativa com que os sofredores de alergia apresentam anticorpos contra certos alérgenos, é feita uma distinção entre os alérgenos principais e secundários. No caso do ca-pim-timóteo (Phleum pratense), o Phl p 1 (Petersen e outros, 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796), Phl p 5 (Matthiesen e Lõwen-stein, 1991, Clin. Exp. ALIergy 21, 297-307), Phl p 6 (Petersen e outros, 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) e Phl p 2/3 (Dolecek e outros, 1993) foram até então caracterizados como principais alérgenos e o Phl p 4 (Lõwenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) e grupo 10 e grupo 11 de Lolium perenne (Ansari e outros, 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235) como alérgenos secundários.

[005] O grupo 1, que inclui Phl p 1 do capim-timóteo, é classificado como um dos mais importantes grupos de alérgenos do capim-timóteo (Tamborini E. e outros, Eur. J. Biochem. 1997, 249:886-894). Os outros representantes do grupo 1, de outras gramas, apresentam homologias, em alguns casos, superiores a 95% para o Phl p 1 (Petersen A. e outros, J. Allergy Clin. Immunol. 1995, 95:987-994). Devido a essas altas homologias, reações a alérgenos de outras espécies reativas cruzadas também ocorrem no caso de sensibilização com uma grama. Por essa razão, essas moléculas são de suma importância para correspondentes aproximações de diagnósticos e propriedades terapêuticas.

[006] No uso terapêutico desses alérgenos, é feito uso da reação com as células auxiliares T, onde ocorre a reorientação das células patológicas TH2 no tipo TH1. Isso provoca uma mudança no perfil da citocina, de modo que as células B são estimuladas a formar IgG, ao invés de IgE.

[007] Uma abordagem clássica para um efetivo tratamento terapêutico de alergias é a imunoterapia específica ou hipossensibilização (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6), 336-339, Bousquet e outros, 1998, J. Al- lergy Clin. Immunol. 102(4), 558-562), na qual o paciente é injetado pela via subcutânea com extratos alérgenos naturais em doses crescentes.

[008] Entretanto, existe um risco nesse método de reações alérgicas ou até mesmo de choque anafilático. A fim de minimizar esses riscos, novas preparações na forma de alergóides estão sendo utilizadas. Estes são extratos de alérgenos quimicamente modificados, apresentando reatividade de IgE significativamente reduzida, mas idêntica reatividade à célula T, quando comparado com o extrato não-tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7), 377-382).

[009] Uma otimização de terapia ainda mais substancial seria possível com alérgenos preparados através de métodos recombinan-tes. Coquetéis definidos, opcionalmente dosados para pacientes individuais, de alérgenos altamente puros, preparados através de métodos recombinantes, poderíam liberar extratos de fontes naturais de alérgenos, desde que, estes, além dos diversos alérgenos, contivessem um número relativamente grande de proteínas acompanhantes imunogê-nicas, mas não alergênicas. Perspectivas realísticas que podem resultar em confiável hipossensibilização com produtos de expressão são oferecidas por alérgenos recombinantes especificamente mutados, em que os epítopos de IgE são especificamente deletados, sem prejudicar os epítopos da célula T, que são essenciais para a terapia (Schramm e outros, 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414).

[0010] Uma adicional possibilidade para influenciamento terapêutico do equilíbrio perturbado da célula Th em sofredores de alergia é o tratamento com DNA expresso, que codifica os alérgenos importantes. Uma evidência experimental inicial do influenciamento de alérgeno específico de resposta imune foi proporcionada em roedores mediante ejeção do DNA codificador de alérgeno (Hsu e outros, 1996, Nature Medicine 2 (5), 540-544).

[0011] O Phl ρ 1 é uma proteína compreendendo 240 aminoácidos e um sítio de n-glicosilação. A fração de glicosilação é de 5% do peso molecular, o qual, na proteína natural é de cerca de 30-35 kDa (Peter-sen e outros, Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-994; Suck e outros, J. Immunol. Meth. 1999, 229:73-80). A seqüência de ácido nucléico do Phl p 1 é conhecida (Laffer e outros, J. Allergy Clin. Immunol. 1994, 94: 689-698; Petersen e outros, J. Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-94) e pode, assim, ser utilizada para preparação recombinante da molécula.

[0012] Tentativas anteriores para preparar a molécula através de métodos recombinantes em sistemas bacterianos e eucarióticos, tais como, por exemplo, levedura, em um modo tal que fosse obtida uma forma monomérica estável, entretanto, não foram bem sucedidas devido a sua fraca solubilidade: [0013] No caso da expressão bacteriana, o Phl p 1 é depositado como corpos de inclusão (Vrtala e outros, J. Allergy Clin. Immunol. 1996; 97: 781-7) e inicialmente tem de ser desnaturado antes da purificação. O agente de desnaturação é subseqüentemente removido. No entanto, até o momento, não foi conseguido uma completa replicação da proteína dentro da conformação solúvel natural (Andersson Lidholm, Int. Arch. Allergy Immunol. 2003, 130:87-107). Uma possível razão que previne a formação de uma conformação estável tem sido a ausência da glicosilação. No entanto, um Phl p 1 estável não foi obtido mesmo em sistemas eucarióticos em que a glicosilação é possível (K. Grobe, Dissertation, 1998, Universidade de Hamburgo). Ao contrário, uma causa da falta de solubilidade é suposta como sendo a atividade proteolítica, que resulta em uma auto-degradação da molécula (Grobe e outros, Eur. J. Biochem. 1999; 263: 33-40; Kirsten Gehlhar, Dissertation, 1998, Medicai University of Lübeck, Alemanha). Além disso, as interações hidrofóbicas entre as moléculas são também possíveis co- mo causa da agregação.

[0014] O fundamento no qual a presente invenção é baseada consistiu, portanto, na provisão de variantes do principal alérgeno de Phl p 1 do capim-timóteo, que são distinguidas pela aperfeiçoada solubilida-de e também pela integral retenção das propriedades imunológicas terapêutica e díagnostícamente importantes, que, assim, podem ser purificadas em uma forma farmaceuticamente adequada.

Figuras [0015] Figura 1: SDS-PAGE do nPhl p 1 do tipo selvagem (n = natural) e duplicadas variantes LM e HM da variante do alérgeno rPhl p 1-A236C (r = recombinante) sob condições redutoras (na presença de ditiotreitol, DTT) e condições não-redutoras (sem DTT).

[0016] Trilha 1; peso molecular padrão (10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 160, 220 kDa, proteína tipo escada, marca de balcão, invitrogen, Karlshure, Alemanha).

[0017] Trilha 2: Extrato do pólen Phíeum pratense;

[0018] Trilha 3: nPhl p 1;

[0019] Trilha 4: rPhl p 1-LM;

[0020] Trilha 5: rPhl p 1-HM.

[0021] Figura 2: filtração do gel com rPhl p 1-HM e rPhl p 1-LM em uma coluna Sephacryl S100. A figura mostra que as duas variantes de enovelamento apresentam diferentes pesos moleculares aparentes.

[0022] Figura 3: teste de alergo-sorvente da enzima (EAST) para quantificação da ligação de IgE de variantes de enovelamento rPhl p 1-A236C-LM e -HM. A concentração de um inibidor de ligação IgE-nPhl p 1 em mol/l é plotada no eixo horizontal; o grau de inibição (%) é indicado no eixo vertical. As medições são realizadas com nPhl p 1 na fase sólida e em um soro típico de uma pessoa sofredora de alergia de pólen de grama.

Descrição Detalhada da Invenção [0023] Surpreendentemente, foi agora descoberto que a introdução de um adicional resíduo de cisteína, preferencialmente na parte terminada em carboxila (em particular na posição 140 do aminoácido, muito particularmente e preferencialmente, entre as posições 230 e 240 do aminoácido) da molécula, resulta na aperfeiçoada solubilidade em conformidade com a invenção, com atividade de IgE e reatividade à célula T não modificadas.

[0024] Portanto, a invenção se refere a variantes do principal alér-geno Phl p 1 de capim-timóteo, que apresentam um adicional resíduo de Cys, comparado com o tipo selvagem e a fragmentos e variantes derivadas de moléculas básicas que apresentam as mesmas ou similares vantajosas propriedades.

[0025] A invenção se refere ainda a um processo para preparação de variantes de acordo com a invenção do principal alérgeno recombi-nante rPhl p 1, caracterizado pelo fato de que através de métodos conhecidos per si, um tripleto básico codificador de um resíduo de Cys é introduzido dentro do gene Phl p 1, através de inserção ou troca, o gene modificado dessa maneira é superexpresso em um organismo hospedeiro e a variante do alérgeno obtida pela superexpressão é purificada.

[0026] A preparação e purificação recombinante procariótica podem ser realizadas com ou sem um componente de fusão, introduzido por engenharia genética, resultando sempre nos mesmos produtos. Se for usado um componente de fusão, o mesmo, preferencialmente, será um rótulo de His. Os métodos de purificação variam, dependendo do vetor ou sistema de expressão.

[0027] A presente invenção, conseqüentemente, abrange uma se-qüência primária especificamente modificada de alérgeno recombinante rPhl p 1, que facilita a preparação recombinante do mesmo em sistemas bacterianos ou de outra expressão e subseqüente purificação. A invenção, portanto, também se refere a moléculas de DNA que codificam as variantes de alérgeno de acordo com a invenção.

[0028] As proteínas recombinantes são autoproteoliticamente inativas e podem, portanto, ser armazenadas em uma forma monomérica estável, em um meio fisiológico, tamponado ou em outras soluções, dependendo da aplicação. A estimulação da célula T não exibe significativas diferenças entre o Phl p 1 recombinante e o Phl p 1 natural.

[0029] As variantes de alérgenos recombinantes e os fragmentos ou variantes derivados podem, assim, ser utilizados para a terapia de doenças alérgicas induzidas por pólen de grama. Devido a sua ade-quabilidade farmacêutica, a presente invenção também se refere às variantes novas de alérgenos e suas propriedades como medicamentos. As variantes de alérgenos e os fragmentos preparados através de métodos recombinantes podem, além disso, ser utilizados para a diag-nose de alergias ao pólen.

[0030] Na preparação do principal alérgeno Phl p 1 de capim-timóteo, modificado por engenharia genética, a troca de aminoácido é efetuada mediante a troca do nucleotídeo almejado, por exemplo, através de reação em cadeia por polimerase (PCR). Numa modalidade particularmente preferida, o mutante rPhl p 1-A236C, em conformidade com a SEQ ID NO. 2, a alanina na posição 236, é substituída por ciste-ína. No entanto, o local de troca pode ser também em qualquer outro local desejado da molécula. No entanto, em geral, o local será localizado na região do terminal C da molécula, preferencialmente, na posição 140, em particular, entre as posições 230 e 240.

[0031] Como conseqüência da troca, a atividade proteolítica conhecida do Phl p 1 é simultaneamente eliminada.

[0032] Como adicional efeito inesperado, duas variantes de eno-velamento que podem ser completamente separadas entre si ocorrem durante o isolamento e purificação da molécula, em conformidade com a invenção. Enquanto a primeira conformação de variante, referida como rPhl-1-LM (LM = baixo peso molecular) exibe comportamento bastante similar para a proteína natural devido a seu comportamento de processamento similar ou idêntico no SDS-PAGE não reduzido (Figura 1) e na filtração de gel (por exemplo, na coluna Sepharcryl S-100, conforme a figura 2) a segunda variante, referida como rPhl p 1-HM (HM = alto peso molecular) existe em uma diferente múltipla forma. A reatividade de IgE também é diferente. Enquanto o rPhl p 1-LM apresenta uma reatividade comparável à proteína natural, o rPhl p 1-HM é menos satisfatoriamente ligado pelos anticorpos de IgE, sendo particularmente adequado para imunoterapia específica devido a sua hipoa-lergenidade (ver a figura 3). Em princípio, entretanto, ambas as formas são adequadas para aplicações terapêuticas e de diagnóstico.

[0033] Além disso, a invenção ainda se refere a diferentes formas de enovelamento da variante do alérgeno rPhl p 1 e ao uso do mesmo para fins terapêuticos e de diagnóstico. Ambas formas de enovelamento são facilmente solúveis, estáveis na forma monomérica e não apresentam atividades proteolitica/autoproteolítica detectáveis.

[0034] As variantes de alérgeno de acordo com a invenção podem ser obtidas, por exemplo, através de dois processos de preparação destacados abaixo, com ou sem componente de fusão artificial: ^) Expressão com componente de fusão artificial (rótulo His) [0035] No caso de uso de um rótulo His, a purificação da proteína bruta inicial mente insolúvel é realizada através de uma pluralidade de etapas de separação bioquímica, compreendendo uma ou mais etapas de cromatografia de afinidade de quelato de íon metálico e remoção do rótulo His. Para execução de pré- e pós-purificação, diversos outros métodos de cromatografia e etapas de desnaturação e renaturação podem ser usados.

[0036] Preparação da forma duplicada de rPhl p 1-LM: - desnaturação de corpos de inclusão isolados do organismo hospedeiro usando cloreto de guanidina; - renaturação da proteína dissolvida em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato; - remoção do rótulo His; - primeira filtração de gel; - cromatografia de afinidade de quelato; - isolamento da proteína alvo a partir da segunda e final filtração de gel, de filtrado, [0037] A outra forma duplicada - rPhi p 1-HM - pode ser obtida nessa purificação de variante através da realização das seguintes etapas de processo: - desnaturação de corpos de inclusão isolados do organismo hospedeiro usando cloreto de guanidina; - renaturação da proteína dissolvida em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato; - remoção do rótulo His; - primeira filtração de gel; - cromatografia de afinidade de quelato; - eluição da proteína alvo com um gradiente de imidazol; - segunda e final filtração de gel. 2) Expressão sem componente de fusão (sem rótulo His) - Desnaturação dos corpos de inclusão isolados do organismo do hospedeiro usando cloreto de guanidina, onde, conforme descrito abaixo, uma ou outra forma duplicada é obtida, dependendo da duração da desnaturação; - Renaturação da proteína dissolvida mediante diluição em solução tampão, onde é preferencial mente usado Trís/HCI 20-50 mM, pH 7-8, mas outros tampões e valores de pH (por exemplo, 7-10,5} são também possíveis. Para diluição, o lote de desnaturação é preferenci- almente adicionado a um múltiplo de seu volume (cerca de 10 a 80 vezes, preferencialmente, 20 a 60 vezes do volume) da solução tampão preferencialmente agitada ou então misturada, por exemplo, através de decantação, pipetação ou bombeamento; entretanto, a solução tampão pode também ser adicionada ao lote de desnaturação. A velocidade de adição não é crítica: assim, a inteira quantidade pode ser adicionada em uma porção em alguns segundos ou, alternativamente -(mas preferencialmente não necessariamente) uniformemente - distribuída no decorrer de um determinado número de horas; - Concentração e purificação da proteína renaturada através de cromatografia de afinidade de quelato e subseqüente eluição com um gradiente de imidazol (é feito uso, preferencialmente, de um gradiente escalonado, mas um gradiente contínuo é também possível). Alternativamente ou adicionalmente à cromatografia de afinidade de quelato, podem ser opcionalmente realizadas uma cromatografia de interação hidrofóbica e/ou uma cromatografia de troca de íons (as moléculas devem ser tratadas completamente por meio de cromatografia); - Filtração final do gel.

[0038] As formas alternativas de enovelamento estáveis LM e HM podem ser no caso em questão obtidas, especificamente com a mínima contaminação cruzada, por meio de diferentes tempos de incubação na etapa de desnaturação. Para preparação da forma LM, a incubação, basicamente, pode ser realizada entre cerca de 1 e 50 horas. Em geral, entretanto, uma faixa de 1 a 40 horas, preferencialmente, de 15 a 30 horas, será usada, em que uma faixa de 18 a 22 horas é particularmente preferida.

[0039] Para a variante HM, são necessários tempos de incubação significativamente maiores. Esses tempos são da ordem de 60 a 120 horas. Entretanto, a incubação será normalmente realizada de 70 a 100 horas, particularmente e preferencialmente, numa faixa de 80 a 90 horas. A etapa de desnaturação, em todos os casos, é seguida pela etapa de diluição com solução tampão, conforme descrito acima. O intervalo entre cerca de 50 a 60 horas, representa a fase de nova formação. A etapa de diluição aparentemente fixa o processo de replica-ção, não ocorrendo adicional cinética.

[0040] A purificação fina para a separação de LM e HM é possível através da cromatografia de interação hidrofóbica ou é obtida mediante filtração de gel, pelo que as formas apresentam tempos de retenção significativamente diferentes.

[0041] De acordo com a invenção, as variantes de alérgeno podem ser obtidas em alta pureza e suas variantes de enovelamento LM e HM apresentam importantes propriedades farmaceuticamente valiosas. Assim, elas podem ser empregadas como uma mistura, mas, também individualmente, para diagnose (particularmente, rPhl p 1-LM, devido à retenção da atividade de IgE) e terapia (particularmente, rPhl p 1-HM, devido à reduzida atividade de IgE) de doenças alérgicas.

[0042] Portanto, a invenção também se refere ao uso de variantes de alérgenos e/ou derivados farmaceuticamente utilizáveis das mesmas, incluindo suas misturas em todas as proporções, para preparação de um medicamento para específica imunoterapia (hipossensibili-zação) e diagnose de alergias, em cujo âmbito está envolvido o principal alérgeno Phl p 1 de capim-timóteo.

[0043] Além disso, a invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma variante de alérgeno, de acordo com a invenção, e/ou derivados farmaceuticamente utilizáveis das mesmas, incluindo suas misturas em todas as proporções e, se desejado, exci-pientes e/ou adjuvantes. Os ingredientes ativos, de acordo com a invenção, podem ser convertidos em uma adequada forma de dosagem, junto com pelo menos um excipiente ou adjuvante sólido, líquido e/ou semi-líquido e, se desejado, em mistura com um ou mais outros ingre- dientes ativos.

[0044] Se as moléculas de DNA, nas quais as variantes de alér-genos de acordo com a invenção se fundamentam são ligadas a um adequado vetor de expressão, esses constructos podem adicionalmente ser usados como preparações para imunoterapia (vacinação de DNA).

[0045] Portanto, a invenção também se refere a um vetor de expressão de DNA recombinante, contendo uma molécula de DNA de acordo com a invenção, para o tratamento de alergias, em cujo âmbito está envolvido o principal alérgeno Phl p 1 de capim-timóteo, através de vacinação imunoterapêutica de DNA.

[0046] Além disso, a invenção se refere ao uso do dito vetor de expressão e/ou derivados do mesmo, incluindo misturas dos mesmos em todas as proporções, para a preparação de um medicamento para o tratamento de alergias, em cujo âmbito está envolvido o principal alérgeno Phl p 1 de capim-timóteo, através de vacinação imunoterapêutica de DNA.

[0047] Finalmente, a invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o dito vetor de expressão e/ou derivados far-maceuticamente utilizáveis do mesmo, incluindo misturas dos mesmos em todas as proporções e, se desejado, excipientes e/ou adjuvantes, para o tratamento de alergias, em cujo âmbito está envolvido o principal alérgeno Phl p 1 de capim-timóteo, através de vacinação imunoterapêutica de DNA.

[0048] Para fins da presente invenção, as composições farmacêuticas podem ser usadas como agentes terapêuticos na medicina humana ou medicina veterinária. Excipientes adequados incluem as substâncias orgânicas ou inorgânicas, que são adequadas para administração parenteral e não reagem com as variantes de alérgenos de acordo com a invenção, do principal alérgeno Phl p 1 do capim- timóteo. Adequadas para administração parenteral, são, em particular, soluções, preferencialmente, soluções aquosas à base de óleo ou aquosas, além de suspensões, emulsões ou implantes. As variantes de alérgenos de acordo com a invenção, podem ser também liofiliza-das e os resultantes produtos liofilizados, usados, por exemplo, para a preparação de formulações de injeções. As composições indicadas podem ser esterilizadas e/ou compreender adjuvantes, tais como, lubrificantes, conservantes, estabilizadores e/ou agentes umectantes, emulsificantes, sais para modificação de pressão osmótica, substâncias tampões e/ou uma pluralidade de outros ingredientes ativos. Além disso, as composições de liberação retardada podem ser obtidas mediante correspondente formulação das variantes de alérgenos de acordo com a invenção, por exemplo, mediante adsorção em hidróxido de alumínio.

[0049] Adicionais modificações seletivas em diferentes posições e outras modificações - por exemplo, para aumento da hipoalergenidade - são, logicamente, também possíveis através das mutações de acordo com a invenção. Essas modificações podem ser, por exemplo, modificações químicas do extrato do alérgeno (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7), 377-382). No entanto, elas também podem ser realizadas no nível de DNA através de engenharia genética, onde, por exemplo, são adequadas inserções, deletações e trocas de aminoácidos, divagem da proteína em fragmentos e fusão da proteína ou fragmentos da mesma em outras proteínas ou peptídeos.

[0050] Em vista das altas homologias de seqüência dentro do grupo 1 dos principais alérgenos de pólen de grama, todos os efeitos aqui descritos para o Phl p 1 relativos ao aperfeiçoamento na solubilidade através da introdução de um resíduo de cis e a ocorrência de variantes de enovelamento, pode também ser esperado para os outros representantes desse grupo.

[0051] Mesmo sem adicionais comentários, é suposto que uma pessoa versada na técnica seja capaz de utilizar a descrição acima em seu escopo mais amplo. As modalidades ilustradas abaixo nas Tabelas 1 e 2 através de exemplo para a variante rPhl p 1-A236C devem, portanto, ser simplesmente consideradas como uma divulgação descritiva, o que é absolutamente de nenhum modo límitativo. Todo o material cromatográfíco é comercialmente disponível da Amersham Biosci-ence (Freiburg, Alemanha).

[0052] A escolha do íon metálico nos métodos descritos de croma-tografia de afinidade de quelato não é crítica, porém, Ni e Cu podem ser usados.

Exemplo 1: Isolamento de rPhl p 1-A236C-LM e -HM; Purificação da variante com rótulo His [0053] A seqüência codificadora para Phl p 1 foi amplificada por meio de PCR com oligonucleotídeos específicos 51 e 3", e ligada em um vetor pProEx (GIBCO, La Jolla, USA} através dos sítios de restrição Ehe I e Hind III. O marcador 3' foi modificado de GO para TG, na posição de base 706/707, de modo que um trípleto codificador de ala-nina é convertido em um tripleto codificador de cisteína (Essential Molecular Biology; T.A. Brown, ed. IRL Press, Oxford, 1994). A transformação foi realizada em um origami de E. coü. O vetor de partida selecionado pProEx supre a seqüência 6xHis, localizada na extremidade do terminal N, seguido de uma seqüência de reconhecimento para a protease TEV. As moléculas recombínantes, principalmente rPhl p 1-A236C rotuladas de 6xHis presentes como agregados insolúveis após a expressão bacteriana são dissolvidas, após a pré-purificação, em cloreto de guanidina 6M (GdmCI), Tris/HCI 50 mM, NaCI 500 mM, pH 8,0), Isso é seguido de cromatografia de afinidade de quelato de Ni em dois estágios: [0054] Em uma primeira etapa, as proteínas ligadas a uma coluna de Sefarose quelatante sob condições de desnaturação, são transferidas por meio de um gradiente, no decorrer de 90 minutos, da solução de desnaturação em um tampão consistindo em tampão de fosfato 50 mM e NaCI 500 mM (pH 7,4). Em seguida, se executa a etapa de elui-ção com imidazol 500 mM em tampão de fosfato. A proteína de fusão desnaturada é clivada em rPhl p 1 e no componente de fusão 6xHis por meio de uma específica protease TEV. Para preparação de uma segunda cromatografia de afinidade, é realizada uma filtração de gel em uma coluna Sephadex G-25 e o tampão de fosfato como eluente, resultando na remoção do composto de imidazol. A mistura de proteína retamponada é depois utilizada em uma segunda cromatografia de afinidade de quelato de Ni. Nesta, alguma quantidade de rPhl p 1 cli-vado com êxito é encontrada no filtrado. Esta é a forma LM da molécula. Além de moléculas não-clivadas, a conformação HM da variante também permanece aderente à coluna, aparentemente devido aos resíduos de histidina expostos. Essa variante clivada elui antes das proteínas de fusão não-clivadas em um gradiente de imidazol, possibilitando essa forma também ser obtida em alta pureza. Numa etapa final, é realizada uma filtração de gel com Superdex 75, para uma purificação final e transferência em um solvente desejado.

Tabela 1 Roteiro do processo de preparação e purificação, de acordo com a invenção, usando um rótulo His. 1. Expressão 2. Isolamento dos corpos de inclusão 3. Desnaturação 4. Cromatografia de afinidade de quelato de Ni 1 (renatu-ração) 5. Remoção do rótulo His 6. Filtração do gel (Sephadex G-25) 7. Cromatografia de afinidade de quelato de Ni 2: Filtrado: rPhl p 1-LM

Eluato: rPhl p 1-HM

Proteína de fusão não-clivada His-rPhl p 1 8. Filtração do gel (Superdex 75) Exemplo 2: Isolamento de rPhl p 1-A236C-LM e -HM; purificação da variante sem rótulo His [0055] Inicialmente é seguido o procedimento em conformidade com o Exemplo 1, mas em que o vetor selecionado não supre uma proteína de fusão como produto principal.

[0056] As moléculas recombinantes, principalmente rPhl p 1-A236C presentes como agregados insolúveis (corpos de inclusão) após a expressão bacteriana são dissolvidas após pré-purificação em cloreto de guanidina 6M (GdmCI), Tris/HCI 50 mM, pH 8,0. Em seguida, é feita uma diluição para 40 vezes em Tris 20 mM, pH 8,0. Para tal fim, a solução de desnaturação é decantada dentro da solução de diluição e agitada usando um agitador magnético.

a) preparação da forma LM

[0057] Os corpos de inclusão são incubados na solução de desnaturação durante 20 horas e depois diluídos conforme descrito acima.

b) Preparação da forma HM

[0058] Os corpos de inclusão são incubados na solução de desnaturação durante 85 horas e depois diluídos conforme descrito acima.

[0059] Adiciona-se NaCI 500 mM ao respectivo lote de diluição (renaturação). As moléculas dissolvidas no lote de renaturação são concentradas através de cromatografia de afinidade de quelato de Cu, depois eluídas com imidazol 200 mM em um tampão de fosfato como um estágio (ou gradualmente com imidazol 500 mM em tampão de fosfato), [0060] A cromatografia de afinidade de quelato pode, opcional- mente, ser utilizada para condicionamento antes da eluição da proteína, mediante, por exemplo, uso de uma solução de NaCI 3M para lavagem e uma solução de NaCI 3M, imidazol 200 mM para eluição, O eluato, que apresenta um alto teor de sal, pode depois ser empregado diretamente para cromatografia de interação hidrofóbica.

[0061] Em uma etapa final, é realizada uma filtração de gel com Superdex 75, para uma purificação final e transferência em um solvente desejado.

Tabela 2 Roteiro do processo de preparação e purificação, de acordo com a invenção, sem o uso de um rótulo His. 1. Expressão 2. Isolamento dos corpos de inclusão 3. Desnaturação; LM: duração de 20 horas; HM: duração de 85 horas 4. Diluição 5. Cromatografia de afinidade de quelato de Cu 6. Filtração em gel (Superdex 75) Exemplo 2: Diferentes ligações de IqE do tipo selvagem e de variantes de enovelamento LM e HM da variante de alérqeno rPhl p 1-A236C

[0062] As variantes HM e LM de nPhl p 1 natural e rPhl p 1 re-combinante são comparadas entre si com relação à extensão de sua ligação de IgE no ensaio de inibição de EAST, realizado pelo método de Suck e outros (ini Arch. Allergy Immunol. 2000; 121: 284-291) com um grupo de soro de um indivíduo que sofre de alergia (Figura 3). Foi encontrado que a variante HM é significativamente reduzida na sua ligação de IgE, comparado com a proteína natural Phl p 1, enquanto a variante LM apresenta uma ligação de IgE que é comparável à proteína natural Phl p 1.

Claims (15)

1. Variante do principal alérgeno Phl p 1 de capim-timóteo, caracterizada pelo fato de que apresenta a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que um resíduo de Cys adicional comparado ao tipo selvagem foi introduzido mediante substituição de Ala 236.

2. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que apresenta a SEQ ID NO. 1.

3. Processo para preparação de uma variante do principal alérgeno recombinante rPhl p 1, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: - supexpressar em um organismo hospedeiro a molécula de DNA, como definida na reivindicação 2; e - purificar a variante de alérgeno expressa no organismo hospedeiro.

4. Processo para preparação e purificação de uma variante do principal do alérgeno recombinante de rPhl p 1, em forma solúvel, caracterizado pelo fato de que a proteína bruta inicialmente insolúvel é desnaturada, em seguida renaturada por meio de diluição e purificada.

5. Processo para purificação de uma variante do principal do alérgeno recombinante de rPhl p 1 em forma solúvel, caracterizado pelo fato de que, partindo da proteína bruta superexpressa inicialmente insolúvel com um rótulo His para fins de purificação são realizadas cromatografia de afinidade de quelato de íon metálico de dois estágios e a remoção do rótulo His.

6. Variante de alérgeno, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma variante de enovelamento LM ou HM.

7. Forma de enovelamento LM de uma variante rPhl p 1 de alérgeno, como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pode ser obtida mediante realização das seguintes etapas de pro- cesso: - superexpressão da variante de alérgeno rPhl p 1 fornecida com um rótulo His em um organismo hospedeiro; - desnaturação dos corpos de inclusão isolados do organismo hospedeiro usando cloreto de guanidina; - renaturação da proteína dissolvida em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato; - remoção do rótulo His; - filtração de gel; - cromatografia de quelato adicional; - isolamento da proteína alvo do filtrado; - filtração de gel.

8. Forma de enovelamento HM de uma variante rPhl p 1 de alérgeno, como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pode ser obtida mediante realização das seguintes etapas de processo: - superexpressão da variante de alérgeno rPhl p 1 fornecida com um rótulo His em um organismo hospedeiro; - desnaturação dos corpos de inclusão isolados do organismo hospedeiro usando cloreto de guanidina; - renaturação da proteína dissolvida em uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato; - remoção do rótulo His; - filtração de gel; - cromatografia de quelato adicional; - eluição da proteína alvo com um gradiente de imidazol; - filtração de gel.

9. Variante de alérgeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 6 a 8, caracterizada pelo fato de que é para uso como medicamento.

10. Uso de uma variante de alérgeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1e 6 a 8, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para imunoterapia específica de alergias envolvendo o principal alérgeno Phl p 1 de capim-timóteo.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante de alérgeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 e 5 a 8.

12. Uso de uma variante de alérgeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 e 6 a 8, caracterizado pelo fato de que é para diagnóstico in vitro de alergias envolvendo o principal alérgeno Phl p 1 de capim-timóteo.

13. Vetor de expressão de DNA recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de DNA, como definida na reivindicação 2.

14. Uso de um vetor de expressão, como definido na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para o tratamento de alergias envolvendo o principal alérgeno Phl p 1 de capim-timóteo, através de vacinação imunotera-pêutica de DNA.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão, como definido na reivindicação 13.