PL212891B1 - Warianty alergenu glównego Phl p 1 tymotki lakowej, sposoby ich otrzymywania i oczyszczania, kodujace je czasteczki DNA i wektory ekspresyjne zawierajace takie czasteczki, oraz ich zastosowanie do wytwarzania leków i diagnozy alergii in vitro - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy wariantów genetycznych alergenu głównego Phl p 1 tymotki łąkowej, które cechują się tym, że ich otrzymywanie, dotychczas niemożliwe, w formie monomerycznych cząsteczek rozpuszczalnych i stabilnych w środowiskach fizjologicznych może być przeprowadzone przy użyciu prokariotycznych systemów ekspresyjnych i dalszego ich oczyszczania. Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania i oczyszczania takich wariantów, warianty takie jako leki, cząsteczki DNA kodujące takie warianty i rekombinowane wektory ekspresyjne zawierające takie cząsteczki, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie warianty alergenu i wektory, zastosowanie takich wariantów alergenu i wektorów do wytwarzania leku oraz zastosowanie takich wariantów alergenu do diagnozy in vitro alergii.

Alergie typu I mają duże znaczenie w skali światowej. Aż 25% populacji państw uprzemysłowionych cierpi na schorzenia o podłożu alergicznym takie jak katar sienny, zapalenie spojówek, czy też dychawica oskrzelowa. Alergie te wywoływane są przez znajdujące się w powietrzu alergeny (aeroalergeny), które pochodzą z różnych źródeł takich jak pyłki roślin, kleszcze, koty lub psy. Z kolei aż u okoł o 40% alergików należących do opisywanego typu I wystę puje specyficzna reaktywność IgE (immunoglobulina E) w przypadku pyłków traw (Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-201).

Do substancji wywołujących alergię typu I należą białka, glikoproteiny oraz polipeptydy. Po przeniknięciu błony śluzowej alergeny takie reagują u osób uczulonych z cząsteczkami IgE związanymi z powierzchnią komórek tucznych. Mostkowanie cząsteczek IgE przy udziale alergenu prowadzi do uwolnienia mediatorów (np. histaminy i prostaglandyn) oraz cytokin przez komórkę efektorową, a przez to do pojawienia się odpowiednich symptomów klinicznych.

U alergików, w zależnoś ci od częstości względnej posiadanych przeciwciał IgE względem określonych alergenów, wyróżnia się alergeny główne i alergeny słabe (minor allergens). W przypadku tymotki łąkowej (Phleum pratense) jako alergeny główne zidentyfikowano dotychczas: Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen i Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 49-54) i Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993), a jako alergeny słabe zidentyfikowano Phl p 4 (Lowenstein, 1978, Prog. Allergy 25: 1-62) oraz grupę 10 i 11 alergenów życicy trwałej (Lolium perenne) (Ansari et. al., 1987, J Allergy Clin. Immunol. 80: 229-235).

Grupa 1, obejmująca alergen tymotki łąkowej Phl p 1, jest sklasyfikowana jako jedna z najbardziej istotnych grup alergenów pyłków traw (Tamborini, E. et al., Eur. J. Biochem. 1997, 249: 886-894). Inni przedstawiciele grupy 1 pochodzący od innych traw wykazują w niektórych przypadkach homologię do Phl1 sięgającą ponad 95% (Petersen, A., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-994). Dzięki takim wysokim homologiom, w przypadku uczulenia na pyłki trawy występują reakcje również na alergeny innych gatunków reakcji krzyżowych. Z tego powodu, cząsteczki te posiadają nadrzędne znaczenie dla odpowiednich metod diagnostycznych i terapeutycznych.

W przypadku terapeutycznego zastosowania tych alergenów, wykorzystuje się reakcję z limfocytem T pomocniczym, w której następuje reorientacja patologicznych komórek TH2 w komórki typu TH1. Proces ten wywołuje zmianę profilu cytokinowego w ten sposób, że limfocyty B są stymulowane do tworzenia IgG zamiast IgE.

Klasycznym podejściem do efektywnego terapeutycznego leczenia alergii jest właściwa immunoterapia lub odczulanie (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6), 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4), 558-562), w której wstrzykuje się pacjentowi podskórnie stopniowo zwiększane dawki ekstraktu naturalnego alergenu.

Niemniej jednak, w takiej metodzie istnieje ryzyko wystąpienia reakcji alergicznych lub nawet szoku anafilaktycznego. W celu zminimalizowania takiego ryzyka stosuje się innowacyjne preparaty w postaci alergoidów. Są one chemicznie zmodyfikowanymi ekstraktami alergenowymi, które posiadają znacząco zredukowaną reaktywność IgE, przy czym jednocześnie posiadają identyczną reaktywność limfocytu T w porównaniu z ekstraktem niezmodyfikowanym (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382).

Przygotowując alergeny technikami rekombinacyjnymi możliwa byłaby nawet bardziej znacząca optymalizacja terapii. Określone koktajle, opcjonalnie dopasowane do poszczególnych pacjentów, zawierające wysoce czyste alergeny przygotowane technikami rekombinacyjnymi mogłyby zastąpić ekstrakty naturalnych źródeł alergenów, ponieważ zawierają one poza różnymi alergenami stosunkowo dużą ilość immunogennych choć nie-alergicznych białek towarzyszących. Realne perspektywy,

PL 212 891 B1 które mogą prowadzić do niezawodnego odczulania na produkty ekspresji, są oferowane przez specyficznie zmodyfikowane genetycznie alergeny rekombinacyjne, w których epitopy IgE są specyficznie usunięte bez uszkadzania epitopów limfocytu T, mających podstawowe znaczenie dla terapii (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406- 2414).

Kolejną możliwością terapeutycznego wpływu na zaburzoną równowagę limfocytów Th u alergików jest leczenie z zastosowaniem DNA ulegającego ekspresji, które koduje odpowiednie alergeny. Wstępne dane eksperymentalne dotyczące wpływu odpowiedzi immunologicznej na określone alergeny zostały uzyskane w wyniku wstrzykiwania gryzoniom sekwencji DNA kodującej alergeny (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5), 540-544).

Phl p 1 jest białkiem składającym się z 240 reszt aminokwasowych oraz miejsca n-glikozylacji. Region glikozylacji stanowi 5% masy cząsteczkowej, który w białku natywnym stanowi około 30-35 kDa (Petersen et al., Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-994; Suck et al., J. Immunol. Meth. 1999, 229: 73-80). Sekwencja kwasu nukleinowego Phl p 1 jest znana (Laffer et al., J. Allergy Clin. Immunol. 1994, 94: 689-698; Petersen et al., J. Allergy Clin. Immunol., 1995, 95: 987-94) a zatem może być wykorzystana podczas otrzymywania cząsteczki techniką rekombinacyjną.

Wcześniejsze próby otrzymania tej cząsteczki technikami rekombinacyjnymi w systemach bakteryjnych lub eukariotycznych, takich jak na przykład drożdże, pozwalające na uzyskanie stabilnej formy monomerycznej, nie zakończyły się jednak powodzeniem ze względu na jej słabą rozpuszczalność.

W przypadku ekspresji bakteryjnej, Phl p 1 odkłada się w postaci ciał ek inkluzyjnych (Vrtala et al., J. Allergy Clin. Immunol, 1996, 97: 781-7), które najpierw muszą być zdenaturowane przed oczyszczaniem. Czynnik denaturujący jest następnie usuwany. Jednakże, jak do tej pory nie osiągnięto pełnej renaturacji takiego białka do natywnej rozpuszczalnej konformacji (Andersson, Lidholm, Int. Arch. Allergy Immunol., 2003, 130: 87-107).

Jednym z możliwych powodów uniemożliwiających utworzenie stabilnej konformacji mogła być nieobecność glikozylacji. Niemniej jednak, stabilne Phl p 1 nie zostało uzyskane nawet w systemach eukariotycznych, w których glikozylacja jest możliwa (K. Grobe, Dissertation, 1998, University of Hamburg).

Natomiast powodem niedostatecznej rozpuszczalności jest przypuszczalnie aktywność proteolityczna, której rezultatem jest samodegradacja cząsteczki (Grobe et al., Eur. J. Biochem. 1999, 263:

33-40; Kristen Gehlhar, Dissertation, 1998, Medical University of Lϋbeck, Niemcy). Dodatkowo, powodem agregacji mogą być również oddziaływania hydrofobowe pomiędzy cząsteczkami.

Dlatego też celem wynalazku jest dostarczenie form genetycznych alergenu głównego Phl p 1 tymotki łąkowej, cechujących się polepszoną rozpuszczalnością przy utrzymaniu wszystkich terapeutycznych i diagnostycznych właściwości immunologicznych, przez co mogłyby one zostać oczyszczone do farmaceutycznie użytecznej postaci.

WYKAZ FIGUR RYSUNKU

Rysunek fig. 1: Elektroforeza SDS-PAGE nPhl p 1 typu dzikiego (n = naturalny) i formy ufałdowania (zwinięcia) LM i HM wariantu alergenu rPhl p 1-A236C (r = rekombinant) w warunkach redukujących (w obecności ditiotreitolu [dithiothreitol] DTT) i w warunkach nieredukujących (bez DTT).

Ścieżka 1: standard masy cząsteczkowej (10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 160, 220 kDa, bench mark protein Iadder [marker masy - nazwa handlowa], Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy)

Ścieżka 2: ekstrakt z pyłku tymotki łąkowej

Ścieżka 3: nPhl p 1

Ścieżka 4: rPhl p 1-LM

Ścieżka 5: rPhl p 1-HM;

Rysunek fig. 2: filtracja żelowa rPhl p 1-HM i rPhl p 1-LM na kolumnie ze złożem Sephacryl S100. Rysunek ten pokazuje, że dwie formy ufałdowania mają różne wyraźne masy cząsteczkowe.

Rysunek fig. 3: test enzymatyczny EAST (ang. Enzyme Allergo-Sorbent Test) dla ujęcia ilościowego wiązania IgE przez zwinięte formy rPhl p 1-A236C-LM i -HM. Stężenie inhibitora wiązania IgE-nPhl p 1 w mol/l znajduje się na osi x, stopień inhibicji w [%] jest z kolei wskazany na osi y. Pomiar był przeprowadzany z nPhl p 1 w fazie stałej i z typową surowicą alergika uczulonego na pyłki traw.

Nieoczekiwanie okazało się, że wprowadzenie dodatkowej reszty cysteiny na pozycji wyższej niż pozycja aminokwasowa 140, a zwłaszcza pomiędzy resztami aminokwasowymi 230 i 240 czą4

PL 212 891 B1 steczki, według wynalazku prowadzi do polepszenia rozpuszczalności przy niezmienionej aktywności IgE i reaktywności limfocytu T.

Istotą wynalazku są zatem warianty alergenu głównego Phl p 1 tymotki łąkowej, które w porównaniu z alergenem typu dzikiego posiadają dodatkową resztę cysteiny (Cys) na pozycji wyższej niż pozycja aminokwasowa 140, oraz fragmenty i formy pochodzące od tych podstawowych cząsteczek, które posiadają takie same lub podobne korzystne właściwości.

Szczególnie korzystne jest przy tym, aby dodatkowa reszta Cys znajdowała się pomiędzy pozycjami aminokwasowymi 230 i 240 i/lub pochodziła z wymiany aminokwasowej.

Istotą wynalazku są ponadto cząsteczki DNA, kodujące warianty alergenów według wynalazku.

Istotą wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania rzeczonych wariantów wykorzystujący odkrycie rekombinacyjnego alergenu głównego rPhl p 1, w którym według wynalazku, metodami znanymi per se, bazowy kodon kodujący resztę Cys jest wprowadzany do genu Phl p 1 poprzez insercję lub wymianę, zmodyfikowany w ten sposób gen ulega nadekspresji w organizmie gospodarza, a wariant alergenu uzyskany w wyniku nadekspresji jest oczyszczany.

Otrzymanie i oczyszczenie rekombinanta prokariotycznego może zostać zrealizowane zarówno z jak i bez zastosowania elementu fuzyjnego wprowadzonego metodą inż ynierii genetycznej i zawsze skutkuje otrzymaniem takich samych produktów. Jeżeli element fuzyjny jest wykorzystywany, to jest nim korzystnie His-tag (sześć reszt histydynowych). Metody oczyszczania zmieniają się w zależności od wektora lub systemu ekspresyjnego.

Wynalazek obejmuje odpowiednio specyficznie zmodyfikowaną główną sekwencje alergenu rekombinacyjnego rPhl p 1, która ułatwia ich rekombinacyjne otrzymanie w bakteryjnych lub innych systemach ekspresyjnych oraz następujące po nim oczyszczanie.

Białka rekombinacyjne są nieaktywne autoproteolitycznie i dlatego mogą być przechowywane w stabilnej postaci monomerycznej w fizjologicznych, buforowych lub innych roztworach w zależności od zastosowania. Stymulacja limfocytu T nie wykazuje żadnych istotnych różnic pomiędzy rekombinacyjnym a natywnym białkiem Phl p 1.

Zatem rekombinacyjne formy genetyczne alergenów i pochodzące od nich fragmenty lub formy mogą być wykorzystane w terapii chorób alergicznych wywołanych pyłkami traw.

W obliczu moż liwości zastosowania terapeutycznego, istotą wynalazku są również leki, w których wykorzystano właściwości nowych wariantów alergenów.

Rzeczone warianty i fragmenty alergenów wytworzone metodami rekombinacyjnymi mogą znaleźć zastosowanie w diagnozie alergii pyłkowych.

W wytwarzaniu alergenu gł ównego tymotki łąkowej Phl p 1 zmodyfikowanego metodami inż ynierii genetycznej, substytucja reszt aminokwasowych jest realizowana poprzez wymianę docelowego nukleotydu, przykładowo za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction - PCR). W szczególnie korzystnej realizacji wynalazku, mutant rPhl p 1-A236C zgodnie z SEQ ID NO 2, alanina w pozycji 236 jest zamieniana na cysteinę. Jednakże, miejscem wymiany może być również dowolne inne wymagane w danym przypadku miejsce w cząsteczce. W zasadzie miejsce to będzie jednak zlokalizowane w regionie C-końca cząsteczki, korzystnie od pozycji 140, a wyjątkowo korzystnie pomiędzy pozycjami 230 i 240.

W konsekwencji takiej wymiany, aktywność proteolityczna Phl p 1 jest jednocześnie eliminowana.

Kolejnym nieoczekiwanym rezultatem wynalazku jest fakt, że podczas procesu izolacji i oczyszczania cząsteczki według wynalazku występują dwie formy zwinięcia, które mogą być od siebie całkowicie odseparowane.

Podczas gdy pierwsza forma konformacyjna, oznaczona jako rPhl p 1-LM (LM = niska masa cząsteczkowa), wykazuje bardzo podobne zachowanie do białka natywnego dzięki podobnemu lub identycznemu zachowaniu podczas elektroforezy SDS-PAGE (fig. 1) i filtracji żelowej (przykładowo na złożu Sepharcryl S-100, patrz fig. 2), druga forma konformacyjna, oznaczona jako rPhl p 1-HM (HM = wysoka masa cząsteczkowa), występuje w innej formie zwinięcia. Również reaktywność IgE różni się w ich przypadku. Podczas gdy rPhl p 1-LM posiada reaktywność porównywalną z białkiem natywnym, to rPhl p 1-HM jest gorzej wiązane przez przeciwciała IgE i dzięki swojej hypoalergeniczności jest szczególnie odpowiednie dla właściwej immunoterapii (zobacz rysunek fig. 3).

W zasadzie jednak obie formy zwinię cia formy rPhl p 1 są odpowiednie zarówno dla zastosowań terapeutycznych jak i diagnostycznych.

Istotą wynalazku są także różne formy zwinięcia formy genetycznej alergenu rPhl p 1 według wynalazku oraz ich zastosowanie dla celów terapeutycznych i diagnostycznych.

PL 212 891 B1

Obie formy zwinięcia są łatwo rozpuszczalne, stabilne w formie monomerycznej i nie wykazują żadnej wykrywalnej aktywności proteolitycznej/autoproteolitycznej.

Formy genetyczne alergenu według wynalazku mogą być przykładowo uzyskane w wyniku dwóch, opisanych poniżej schematycznie, sposobów otrzymywania z lub bez wykorzystania sztucznego elementu fuzyjnego:

1) Ekspresja ze sztucznym elementem fuzyjnym (peptyd His-tag)

W przypadku zastosowania etykiety His, oczyszczanie wstępnie nierozpuszczalnego surowego białka jest przeprowadzane w wyniku wielu różnych etapów separacji biochemicznej, obejmujących jeden lub większą liczbę etapów chromatografii powinowactwa (ang. Metal-Chelate Affinity Chromatography - MCAC) oraz usuwanie His-tagu. Zarówno przed jak i po oczyszczaniu, można zastosować różne inne metody chromatografii oraz etapy denaturacji i renaturacji.

Otrzymanie formy zwiniętej rPhl p 1-LM:

- denaturacja ciałek inkluzyjnych wyizolowanych z organizmu gospodarza z zastosowaniem chlorku guanidyny,

- renaturacja rozpuszczonego białka na kolumnie chromatografii powinowactwa chelatowego,

- usunięcie etykiety His,

- pierwsza filtracja żelowa,

- chromatografia powinowactwa chelatowego,

- izolacja białka docelowego z eluentu,

- druga, końcowa filtracja żelowa.

Druga pofałdowana forma zwinięcia - rPhl p 1-HM - może być uzyskana w pewnym wariancie powyżej opisanego oczyszczania obejmującym następujące etapy:

- denaturacja ciałek inkluzyjnych wyizolowanych z organizmu gospodarza z zastosowaniem chlorku guanidyny,

- renaturacja rozpuszczonego białka na kolumnie chromatografii powinowactwa chelatowego,

- usunięcie etykiety His,

- pierwsza filtracja żelowa,

- chromatografia powinowactwa chelatowego,

- elucja białka docelowego w gradiencie imidazolu,

- druga, końcowa filtracja żelowa.

2) Ekspresja bez elementu fuzyjnego (bez etykiety His)

- denaturacja ciałek inkluzyjnych wyizolowanych z organizmu gospodarza z zastosowaniem chlorku guanidyny, gdzie, jak opisano poniżej, uzyskuje się jedną lub drugą formę zwinięcia w zależności od czasu trwania denaturacji;

- renaturacja rozpuszczonego białka poprzez rozcieńczanie w roztworze buforowym, przy czym korzystne jest użycie 20-50 mM Tris/HCI pH 7-8, choć możliwe jest również zastosowanie innych buforów oraz roztworów o innych wartościach pH (przykładowo 7-10.5). Dla rozcieńczenia objętość wsadu denaturującego dodawanego do roztworu buforowego stanowi korzystnie wielokrotność objętości (około 10 do 80 razy, najlepiej 20 do 60 razy) roztworu buforowego, korzystnie wymieszanego lub wymieszanego w inny sposób (na przykład przez dekantację, pipetowanie lub pompowanie); jednak roztwór buforowy może także zostać dodany do wsadu denaturującego. Szybkość procesu dodawania nie jest parametrem krytycznym: tak więc cała ilość może być dodana w jednej porcji w czasie kilku sekund lub alternatywnie (ale niekoniecznie) proces dodawania może być rozłożony równomiernie na wiele godzin;

- stężanie i oczyszczanie zrenaturowanego białka poprzez chromatografię powinowactwa i następującą po niej elucję w gradiencie imidazolu (wykorzystuje się gradient stopniowy ale możliwe jest również zastosowanie gradientu ciągłego). Alternatywnie lub dodatkowo w stosunku do chromatografii powinowactwa, może zostać przeprowadzona chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) i/lub opcjonalnie chromatografia jonowymienna (IC) (cząsteczki muszą być poddane chromatografii w sposób całościowy);

- końcowa filtracja żelowa.

Alternatywne stabilne formy zwinięcia LM i HM mogą być specyficznie otrzymane z minimalnym zanieczyszczeniem krzyżowym stosując różne czasy inkubacji na etapie denaturacji. Zasadniczo dla otrzymania formy LM inkubacja może być prowadzona od około 1 do około 50 godzin. Jednakże zazwyczaj zakres ten obejmuje od 10 do 40 godzin, korzystnie od 15 do 30 godzin, a szczególnie korzystnie od 18 do 22 godzin.

PL 212 891 B1

Dla formy HM wymagane są znacznie dłuższe okresy inkubacji. Zalecane okresy wynoszą od 60 do 120 godzin. Niemniej jednak inkubacja jest zwykle przeprowadzana przez okres od 70 do 100 godzin, szczególnie korzystnie przez czas od 80 do 90 godzin.

We wszystkich przypadkach po etapie denaturacji następuje opisany powyżej etap rozcieńczania w roztworze buforowym.

Występujący między tymi dwoma etapami okres przerwy (od około 50 do około 60 godzin) odpowiada fazie reformacji. Etap rozcieńczania wyraźnie zatrzymuje proces zwijania, po czym nie występuje już żadna dalsza kinetyka.

Zrealizowanie precyzyjnego oczyszczania dla separacji LM i HM jest możliwe z wykorzystaniem chromatografii oddziaływań hydrofobowych lub jest osiągane poprzez filtrację żelową, w których rzeczone formy wykazują znacznie odmienne czasy retencji.

Formy genetyczne alergenów według wynalazku mogą być otrzymane w postaci ich form zwinięcia LM i HM o wysokiej czystości i posiadają istotne wartościowe właściwości farmaceutyczne. Tak więc mogą one być zastosowane jako kompozycja, ale również indywidualnie, w celu diagnozy (w szczególności rPhl p 1-LM z uwagi na retencję aktywności IgE) i terapii (w szczególności rPhl p 1-HM z uwagi na zredukowaną aktywność IgE) chorób alergicznych.

Z tego powodu istotą wynalazku jest również zastosowanie form genetycznych alergenu i/lub ich farmaceutycznie użytecznych pochodnych, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach, dla otrzymania leku dla właściwej immunoterapii (odczulania) i diagnozy alergii, w wywoływanie których zaangażowany jest alergen główny tymotki łąkowej Phl p 1.

Istotą wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna zawierająca formę genetyczną alergenu według wynalazku i/lub jego farmaceutycznie użyteczne pochodne, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach, oraz opcjonalnie rozczynniki i/lub substancje pomocnicze. Aktywne składniki według wynalazku mogą w takim wypadku być przekształcone do odpowiedniej dawki wraz z co najmniej jednym stałym, płynnym i/lub półpłynnym rozczynnikiem lub substancją pomocniczą oraz opcjonalnie w połączeniu z jednym lub większą liczbą kolejnych aktywnych składników.

Jeśli cząsteczki DNA, na których oparte są formy genetyczne alergenu według wynalazku są Iigowane do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, to konstrukty te takie mogą być dodatkowo zastosowane jako preparaty dla immunoterapii (szczepionka DNA).

Dlatego istotą wynalazku jest również rekombinowany wektor ekspresyjny DNA zawierający cząsteczkę DNA według wynalazku stosowany dla leczenia alergii, w wywoływanie których zaangażowany jest alergen główny tymotki łąkowej Phl p 1, poprzez immunoterapeutyczne szczepienie cząsteczką DNA.

Ponadto istotą wynalazku jest zastosowanie rzeczonego wektora ekspresyjnego i/lub jego pochodnych, włączając w to mieszaniny w dowolnych stosunkach, do wytwarzania leków do leczenia alergii, w wywoływanie których zaangażowany jest alergen główny tymotki łąkowej Phl p 1, poprzez immunoterapeutyczne szczepienie cząsteczką DNA.

Istotą wynalazku jest w końcu kompozycja farmaceutyczna zawierająca rzeczony wektor ekspresyjny i/lub jego farmaceutycznie użyteczne pochodne, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach, oraz opcjonalnie rozczynniki i/lub substancje pomocnicze, dla leczenia alergii, w wywoływanie których zaangażowany jest alergen główny tymotki łąkowej Phl p 1, poprzez immunoterapeutyczne szczepienie cząsteczką DNA.

Podsumowując istotą wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca wariant alergenu według wynalazku i/lub jego farmaceutycznie użyteczne pochodne, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach, albo rekombinowany wektor ekspresyjny DNA zawierają cy czą steczki DNA kodujące takie warianty i/lub jego pochodne, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach i, jeśli pożądane, rozczynniki i/lub substancje pomocnicze, w szczególności przeznaczona do leczenia alergii, w wywoływaniu których uczestniczy alergen główny Phl p 1 tymotki łąkowej, poprzez immunoterapeutyczne szczepienie DNA, jak również zastosowanie wariantu alergenu według wynalazku i/lub jego farmaceutycznie użytecznych pochodnych włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach albo wektora ekspresyjnego DNA zawierającego cząsteczkę DNA kodującą takie warianty i/lub jego pochodnych, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach, do wytwarzania leku.

Dla celów wynalazku rzeczone kompozycje farmaceutyczne mogą znaleźć zastosowanie jako środki terapeutyczne w medycynie i weterynarii. Odpowiednimi rozczynnikami mogą być organiczne lub nieorganiczne substancje, które nadają się do podawania pozajelitowego i które nie reagują z formami genetycznymi alergenu głównego tymotki łąkowej Phl p 1 według wynalazku. Do podawania

PL 212 891 B1 pozajelitowego korzystne są roztwory, oraz zawiesiny, emulsje i implanty. Formy genetyczne alergenu według wynalazku mogą być liofilizowane, a otrzymany Iiofilizat wykorzystany np. do produkcji preparatów do iniekcji. Wymienione kompozycje mogą być sterylizowane i/lub mogą zawierać substancje pomocnicze takie jak lub rykanty, środki konserwujące, stabilizatory i/lub substancje zwilżające, emulgatory, sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, substancje buforowe i/lub wiele innych składników aktywnych.

Ponadto poprzez odpowiednią formulację form genetycznych alergenu według wynalazku, na przykład poprzez adsorpcję na wodorotlenku glinu, można otrzymać preparaty o opóźnionym uwalnianiu.

Ponadto poprzez mutacje według wynalazku możliwe jest zrealizowanie selektywnych modyfikacji na różnych pozycjach i innych modyfikacji, na przykład dla zwiększenia hipoalergiczności. Modyfikacje te mogą przykładowo być chemicznymi modyfikacjami ekstraktu allergenowego (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382). Jednak mogą być one także przeprowadzane na poziomie DNA przy zastosowaniu metod inżynierii genetycznej, gdzie właściwe są przykładowo insercje, delecje i substytucje reszt aminokwasowych, rozpad rzeczonego białka na fragmenty i fuzja białka lub jego fragmentów z innymi bia ł kami lub peptydami.

Mając na uwadze wysokie homologie sekwencyjne w obrębie alergenów głównych pyłków traw grupy 1, również dla innych reprezentantów tej grupy można spodziewać się występowania tych samych efektów, które zostały przedstawione w opisie dla Phl p 1 w odniesieniu do polepszenia rozpuszczalności przez wprowadzenie reszty Cis i występowania form zwinięcia.

Nawet bez dalszych komentarzy, należy przypuszczać, że znawcy dziedziny, do której odnosi się wynalazek, będą zdolni do wykorzystania powyższego opisu w jego najszerszym zakresie. Przykłady realizacji opisane poniżej w Tabeli 1 i Tabeli 2 dla formy rPhl p 1-A236C powinny być rozważane wyłącznie jako opisowe ujawnienie, które nie ogranicza w żaden sposób zakresu wynalazku.

Wszystkie materiały chromatograficzne są komercyjnie dostępne od Amersham Biosciences (Freiburg, Germany).

Wybór jonu metalu w opisanych metodach chromatografii powinowactwa nie jest czynnikiem krytycznym i zarówno jony niklu Ni jak i miedzi Cu mogą zostać wykorzystane.

P r z y k ł a d 1:

Izolacja rPhl p 1-A236C-LM i -HM - wariant oczyszczania z etykietą His.

Sekwencja kodująca Phl p 1 została amplifikowana za pomocą PCR z 5'- i 3'- specyficznym oligonukleotydami i zligowana z wektorem pProEx (GIBCO, La Jolla, USA) poprzez miejsce restrykcyjne Ehe I i Hind III. 3'-primer został zmodyfikowany poprzez zamianę nukleotydów GC na TG w pozycji 706/707 w taki sposób, że kodon kodujący alaninę został przekształcony w kodon kodujący cysteinę (Essential Molecular Biology; T.A. Brown ed., IRL Press, Oxford, 1994). Transformacja ta została przeprowadzona w szczepie E. coli. Wybrany wektor startowy pProEx dostarcza sekwencji 6xHis zlokalizowanej na N-końcu, po której występuje sekwencja rozpoznawcza dla proteazy TEV. Rekombinowane, wstępnie 6xHIS- znakowane cząsteczki rPhl p 1-A236C, występujące w postaci nierozpuszczalnych agregatów po ekspresji bakteryjnej ulegają rozpuszczeniu po wstępnym oczyszczaniu w 6 M chlorku guanidyny (GdmCI), 50 mM Tris/HCI, 500 mM NaCI (pH 8.0). Następnie wykonywana jest dwuetapowa chromatografia powinowactwa na złożu z immobilizowanymi jonami Ni (niklu):

W pierwszym etapie, białka związane z Sepharose w warunkach denaturujących są transportowane przez gradient w ciągu 90 minut z roztworu denaturującego do buforu zawierającego 50 mM buforu fosforanowego i 500 mM NaCI (pH 7.4). Kolejno następuje etap elucji z 500 mM imidazolem w buforze fosforanowym. Renaturowane białko fuzyjne zostaje rozcię te na rPhl p 1 i element fuzyjny 6xHis za pomocą specyficznej proteazy TEV.

W celu otrzymania kolejnej chromatografii powinowactwa, przeprowadza się filtrację żelową na złożu Sephadex G-25 z wykorzystaniem bufora fosforanowego jako eluentu, w wyniku której usuwany jest imidazol.

Powtórnie zawieszona w buforze mieszanina białkowa jest następnie wykorzystywana w drugim etapie chromatografii powinowactwa na złożu z jonami Ni. Na etapie tym, niektóre z powodzeniem przecięte rPhl p 1 znajdują się w eluencie. Jest to forma LM rzeczonej cząsteczki. Poza nierozciętymi cząsteczkami, forma konformacyjna HM również przylega do kolumny, najwyraźniej z powodu odkrytych reszt histydynowych. Ta przecięta forma ulega elucji w gradiencie imidazolu wcześniej niż nieprzecięte połączone białka fuzyjne, dzięki czemu możliwe jest uzyskanie także i tej formy w wysoce czystej postaci. W końcowej fazie przeprowadzana jest filtracja żelowa z zastosowaniem złoża Superdex 75 w celu ostatecznego oczyszczenia i przeniesienia do pożądanego rozpuszczalnika.

PL 212 891 B1

T a b e l a 1

Schemat sposobu otrzymywania i oczyszczania według wynalazku z wykorzystaniem etykiety His.

1. Ekspresja

2. Izolacja ciałek inkluzyjnych

3. Denaturacja

4. Pierwsza chromatografia powinowactwa chelatowego na złożu z jonami Ni (renaturacja)

5. Usunięcie etykiety His

6. Filtracja żelowa (Sephadex G-25)

7. Druga chromatografia powinowactwa chelatowego na złożu z jonami Ni: eluent: rPhl p 1-LM eluat: rPhl p 1-HM

Nieprzecięte białko fuzyjne His-rPhl p 1

8. Filtracja żelowa (Superdex 75)

P r z y k ł a d 2:

Izolacja rPhl p 1-A236C-LM i -HM - wariant oczyszczania bez etykiety His.

Początkowo procedura ta jest przeprowadzana zgodnie z Przykładem 1, jednak wybrany wektor nie dostarcza białka fuzyjnego jako produktu pierwotnego.

Rekombinacyjne, pierwotne cząsteczki rPhl p 1-A236C występujące w postaci nierozpuszczalnych agregatów (ciałka inkluzyjne) po ekspresji bakteryjnej, ulegają rozpuszczeniu po wstępnym oczyszczaniu w 6 M chlorku guanidyny (GdmCI), 50 mM Tris/HCI (pH 8.0). Następnie przebiega rozcieńczanie 40-krotne w 20 mM Tris pH 8.0. W tym celu roztwór denaturujący jest dekantowany do roztworu rozcieńczającego mieszanego za pomocą mieszadła magnetycznego.

a) Otrzymywanie formy LM

Ciałka inkluzyjne są inkubowane w roztworze denaturującym przez 20 godzin, po czym są one rozcieńczane w sposób opisany powyżej.

b) Otrzymywanie formy HM

Ciałka inkluzyjne są inkubowane w roztworze denaturującym przez 85 godzin, po czym są one rozcieńczane w sposób opisany powyżej.

500 mM NaCI jest dodawany do odpowiedniej porcji wsadu rozcieńczającego (renturującego). Cząsteczki rozpuszczone w porcji wsadu renaturującego są zagęszczane poprzez chromatografię powinowactwa na złożu z jonami Cu i eluowane 200 mM imidazolu w buforze fosforanowym (lub stopniowo 500 mM imidazolu w buforze fosforanowym).

Chromatografia powinowactwa może być opcjonalnie wykorzystana dla zrównoważenia przed elucją białka, przykładowo przez zastosowanie roztworu 3 M NaCI do przemywania i roztworu 3 M NaCI, 200 mM imidazolu do elucji. Otrzymany w ten sposób eluat, który posiada wysoką zawartość soli, może być następnie wykorzystany bezpośrednio w chromatografii oddziaływań hydrofobowych.

W końcowym etapie przeprowadzana jest filtracja żelowa z wykorzystaniem złoża Superdex 75 w celu ostatecznego oczyszczenia i przeniesienia do pożądanego rozpuszczalnika.

T a b e l a 2.

Schemat sposobu otrzymywania i oczyszczania według wynalazku bez wykorzystania etykiety His.

1. Ekspresja

2. Izolacja ciałek inkluzyjnych

3. Denaturacja

Czas trwania 20 godzin:

LM Czas trwania 85 godzin: HM

4. Rozcieńczanie

5. Chromatografia powinowactwa na złożu z jonami Cu

6. Filtracja żelowa (Superdex 75)

PL 212 891 B1

P r z y k ł a d 3:

Różne wiązania IgE form typu dzikiego i form zwinięcia LM i HM formy genetycznej alergenu rPhl p 1-A236C.

Natywne nPhl p 1 i formy rekombinacyjne rPhl p 1 HM i LM są porównywane ze sobą ze względu na siłę wiązania przez nie IgE w teście inhibicji EAST przeprowadzonym metodą Suck et al. (Int. Arch. Allergy Immunol. 2000; 121: 284-291) w puli surowicy (ang. serum pool) alergika (rysunek fig. 3). W wyniku powyższego odkryto, że forma HM wykazuje znacząco zredukowane wiązanie IgE w porównaniu z biał kiem natywnym Phl p 1, podczas gdy forma LM wykazuje wią zanie IgE na poziomie porównywalnym z białkiem natywnym Phl p 1.

Claims (20)

1. Wariant alergenu głównego Phl p 1 tymotki łąkowej, znamienny tym, że na pozycji wyższej niż pozycja aminokwasowa 140 posiada dodatkową resztę Cys w porównaniu z alergenem typu dzikiego.

2. Wariant alergenu według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowa reszta Cys znajduje się pomiędzy pozycjami aminokwasowymi 230 i 240.

3. Wariant alergenu według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że dodatkowa reszta Cys pochodzi z wymiany aminokwasowej.

4. Wariant alergenu rPhl p 1-A236C zgodny z SEQ ID NO 2 wedł ug zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że dodatkowa reszta Cys została wprowadzona przez wymianę Ala 236.

5. Cząsteczka DNA kodująca wariant alergenu zdefiniowany w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 4.

6. Cząsteczka DNA zgodna z SEQ ID NO 1 kodująca wariant alergenu zdefiniowany w zastrz. 4.

7. Sposób otrzymywania wariantu rekombinacyjnego alergenu g łównego rPhl p 1 zdefiniowanego w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy, realizowane metodami znanymi per se:

- bazowy kodon kodują cy resztę Cys jest wprowadzany do odpowiadającego genu poprzez insercję lub wymianę,

- zmodyfikowany w ten sposób gen ulega nadekspresji w organizmie gospodarza, i - wariant alergenu otrzymany w wyniku nadekspresji jest oczyszczany.

8. Sposób otrzymywania i oczyszczania wariantu rekombinacyjnego alergenu głównego rPhl p 1 według zastrz. 7 w postaci rozpuszczalnej, znamienny tym, że wstępnie nierozpuszczalne surowe białko jest denaturyzowane, następnie renaturyzowane poprzez rozcieńczanie i oczyszczane na etapach oczyszczania biochemicznego.

9. Sposób oczyszczania wariantu rekombinacyjnego alergenu głównego rPhl p 1 według zastrz. 7 w postaci rozpuszczalnej, znamienny tym, że wychodząc z nadekspresowanego, wstępnie nierozpuszczalnego surowego białka posiadającego etykietę His dla celów oczyszczania, przeprowadza się wiele etapów oczyszczania biochemicznego, obejmujących dwuetapową chromatografię powinowactwa chelatowego jonów metalu oraz usunięcie etykiety His.

10. Wariant alergenu według zastrz. 1-4, znamienny tym, że występuje w wielu formach ufałdowania.

11. Zwinięta forma rPhl p 1-LM wariantu alergenu zdefiniowanego w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 4, znamienna tym, że mo ż na ją otrzymać poprzez realizację następujących etapów:

- nadekspresja wariantu alergenu rPhl p 1 posiadają cego etykietę His w organizmie gospodarza,

- denaturacja ciałek inkluzyjnych wyizolowanych z organizmu gospodarza z zastosowaniem chlorku guanidyny,

- renaturacja rozpuszczonego białka na kolumnie chromatografii powinowactwa chelatowego,

- usunię cie etykiety His,

- filtracja ż elowa,

- kolejna chromatografia powinowactwa chelatowego,

- izolacja bia łka docelowego z eluentu,

- filtracja ż elowa.

12. Zwinięta forma rPhl p 1-HM wariantu alergenu zdefiniowanego w jednym lub wielu zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że można ją otrzymać poprzez realizację następujących etapów:

- nadekspresja wariantu alergenu rPhl p 1 posiadają cego etykietę His w organizmie gospodarza,

PL 212 891 B1

- denaturacja ciałek inkluzyjnych wyizolowanych z organizmu gospodarza z zastosowaniem chlorku guanidyny,

- renaturacja rozpuszczonego białka na kolumnie chromatografii powinowactwa chelatowego,

- usunię cie etykiety His,

- filtracja żelowa,

- kolejna chromatografia powinowactwa chelatowego,

- elucja biał ka docelowego w gradiencie imidazolu,

- filtracja żelowa.

13. Wariant alergenu według zastrz.1 - 4 i 10 - 12 do zastosowania jako lek.

14. Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA zawierający cząsteczkę DNA zdefiniowaną w zastrz. 5 albo 6 do leczenia alergii, w wywoływaniu których uczestniczy alergen główny Phl p 1 tymotki łąkowej, poprzez immunoterapeutyczne szczepienie DNA.

15. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca wariant alergenu zdefiniowany w zastrz. 13 i/lub jego farmaceutycznie użyteczne pochodne, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach, albo rekombinowany wektor ekspresyjny DNA zdefiniowany w zastrz. 14 i/lub jego pochodne, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach i, jeśli pożądane, rozczynniki i/lub substancje pomocnicze.

16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 15 do leczenia alergii, w wywoływaniu których uczestniczy alergen główny Phl p 1 tymotki łąkowej, poprzez immunoterapeutyczne szczepienie DNA.

17. Zastosowanie wariantu alergenu zdefiniowanego w zastrz. 13 i/lub jego farmaceutycznie użytecznych pochodnych włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach albo wektora ekspresyjnego DNA zdefiniowanego w zastrz. 14 i/lub jego pochodnych, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach, do wytwarzania leku.

18. Zastosowanie według zastrz. 17 do wytwarzania leku dla specyficznej immunoterapii alergii, w wywoływaniu których uczestniczy alergen główny Phl p 1 tymotki łąkowej.

19. Zastosowanie według zastrz. 17 do otrzymywania leku do leczenia alergii, w wywoływaniu których uczestniczy alergen główny Phl p 1 tymotki łąkowej, poprzez immunoterapeutyczne szczepienie DNA.

20. Zastosowanie wariantu alergenu zdefiniowanego w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 4 i od 10 do 12 i/lub jego farmaceutycznie użytecznych pochodnych, włączając w to ich mieszaniny w dowolnych stosunkach do diagnozy in vitro alergii, w wywoływaniu których uczestniczy alergen główny Phl p 1 tymotki łąkowej.