JP4668616B2 - オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌｐ１の変異体 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１の変異体であって、従来不可能であった、生理学的媒体に可溶かつ安定なモノマー分子の製造が、原核生物発現系とその後の精製とにより遂行可能であることを特徴とする、前記変異体に関する。

発明の背景
I型アレルギーは、世界的に重要である。工業国の２５％までの人口が、植物花粉、ダニ、ネコまたはイヌなどの、空気中に存在する種々の起源のアレルゲン（エアロアレルゲン）により引き起こされるアレルギー性鼻炎、結膜炎もしくは気管支喘息などの疾患に苦しんでいる。これらのI型アレルギー患者の４０％までが、草本花粉の場合、特異的なＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）反応性を示す（Freidhoff et al., 1986, J. Allergy. Clin. Immunol. 78, 1190-201）。

Ｉ型アレルギーを誘導する（initiate）物質は、タンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。これらのアレルゲンは、粘膜を介して取り込まれた後、感作された人々の肥満細胞の表面に結合したＩｇＥ分子と反応する。２つのＩｇＥ分子がアレルゲンによって互いに架橋すると、エフェクター細胞によるメディエーター（例えばヒスタミン、プロスタグランジン）およびサイトカインの放出、ひいては対応する臨床症状がもたらされる。

あるアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を有するアレルギー患者の相対的頻度に依存して、主要アレルゲンとマイナーアレルゲンとの間の区別がなされる。オオアワガエリ（Phleum pratense）の場合、これまでに、Ｐｈｌ ｐ１（Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796）、 Ｐｈｌ ｐ５（Matthiesen and Loewenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307）、Ｐｈｌ ｐ６（Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54）およびＰｈｌ ｐ２／３（Dolecek et al., 1993）が主要アレルゲンとして、そして、Ｐｈｌ ｐ４（Loewenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1 62）およびホソムギ（Lolium perenne）からのグループ１０および１１（Ansari et. al., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235）が、マイナーアレルゲンとして特徴化されている。

オオアワガエリからのＰｈｌ ｐ１を含むグループ１は、草本花粉の最も関係するアレルゲン群の１つに分類されている（Tamborini, E. et al., Eur. J. Biochem. 1997, 249:886-894）。他の草本からのグループ１の他の典型例は、いくつかのケースでは、Ｐｈｌ ｐ１に対して９５％を超える相同性を有している（Petersen, A., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-994）。この高い相同性のために、草本による感作のケースではまた、他の交差反応性の種のアレルゲンに対する反応が生じる。この理由から、これらの分子は、対応する診断および治療アプローチにとって最も重要である。
これらのアレルゲンの治療的使用においては、ヘルパーＴ細胞との反応が用いられており、そこでは、病原性のＴＨ２細胞のＴＨ１型への方向転換が起こる。これはサイトカインプロファイルの変化をもたらし、Ｂ細胞はＩｇＥの代わりにＩｇＧを形成するよう刺激される。

アレルギーの有効な治療的処置への古典的なアプローチは、特異的な免疫療法または減感作であり（Fiebig, 1995, Allergo J. 4 （6）, 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol. 102（4）, 558-562）、そこで患者は、増加する用量の天然アレルゲンエキスを皮下に注射される。
しかしながら、この方法には、アレルギー反応、またはアナフィラキシーショックのリスクさえ存在する。これらのリスクを最小化するために、アレルゴイド（allergoid）の形態の革新的な製剤が用いられている。これらは化学的に修飾されたアレルゲンエキスであり、未処理エキスに比べて顕著に低いＩｇＥ反応性を有するが、同等のＴ細胞反応性を有する（Fiebig, 1995, Allergo J. 4 （7）, 377-382）。

組換え的方法で製造されたアレルゲンにより、治療のより一層有効な最適化が可能となる。任意に個別の患者に適合させた、組換え的方法で製造された高純度のアレルゲンのディファインドカクテル（defined cocktail）は、エキスを、天然のアレルゲン給源から解放することができる。なぜなら、これらは、種々のアレルゲンのほかに、免疫原性であるが、非アレルギー性である比較的多数の付随タンパク質（accompanying protein）を含有するからである。発現産物での信頼できる減感作によりもたらされる現実的な展望は、特異的に変異された組換えアレルゲンによって提供され、そこでは、治療に重要なＴ細胞エピトープを損なうことなく、ＩｇＥエピトープが特異的に削除されている（Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414）。

アレルギー患者の乱されたＴｈ細胞のバランスに治療的な影響を与えるためのさらなる可能性は、関係するアレルゲンをコードする発現可能なＤＮＡによる処置である。免疫応答にアレルゲン特異的に影響を与える最初の実験的な証拠は、げっ歯類において、アレルゲンをコードするＤＮＡを放出することによりもたらされた（Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 （5）, 540-544）。

Ｐｈｌ ｐ１は、２４０個のアミノ酸と、ｎ−グリコシル化部位とを含むタンパク質である。グリコシル化部分は、分子量の５％であり、これは、天然のタンパク質では約３０〜３５ｋＤａである（Petersen et al., Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-994; Suck et al., J. Immunol. Meth. 1999, 229:73-80）。Ｐｈｌ ｐ１の核酸配列は知られており（Laffer et al., J. Allergy Clin Immunol. 1994, 94: 689-698; Petersen et. al., J. Allergy Clin. Immunol., 1995, 95: 987-94）、したがって、当該分子の組換え的製造に用いることができる。

しかしながら、当該分子を、細菌もしくは真核生物系、例えば、酵母などにおいて、安定なモノマー形態が得られるように組換え的方法により製造する従前の試みは、その低い可溶性のために成功しなかった。
細菌による発現の場合、Ｐｈｌ ｐ１は封入体として沈着し（Vrtala et al., J. Allergy Clin. Immunol, 1996; 97: 781-7）、精製の前に、まず最初に変性させなければならい。変性剤は、後で除去される。しかしながら、当該タンパク質の天然の可溶性コンホメーションへの完全な再折り畳みは、これまで達成されていない（Andersson, Lidholm, Int. Arch. Allergy Immunol. 2003;130:87-107）。

安定なコンホメーションの形成を妨げる１つの可能な理由は、グリコシル化の欠如である可能性があった。しかしながら、安定なＰｈｌ ｐ１は、グリコシル化が可能な真核生物系においても得られなかった（K. Grobe, Dissertation, 1998, University of Hamburg）。
この代わりに、可溶性の欠如の原因は、タンパク質分解活性であり、これが当該分子の自己分解をもたらすと推測されている（Grobe et al., Eur. J. Biochem. 1999; 263: 33-40; Kirsten Gehlhar, Dissertation, 1998, Medical University of Luebeck, Germany）。さらに、分子間の疎水性相互作用もまた、凝集の原因として考えられる。

本発明が基にする目的は、したがって、改善された可溶性と同時に、治療的および診断的に重要な免疫学的特性を完全に保持し、かつこれにより医薬に適した形態に精製することが可能な、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１の変異体を提供することである。

図面
図１：野生型ｎＰｈｌ ｐ１（ｎ＝天然）と、アレルゲン変異体ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃ（ｒ＝組換え）の折り畳み変異体（fold variant）ＬＭおよびＨＭの、還元条件（ジチオスレイトールＤＴＴの存在下）および非還元条件（ＤＴＴなし）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
トラック１：分子量標準（１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１６０、２２０ｋＤａ、ベンチマークタンパク質ラダー、Invitrogen, Karlsruhe, Germany）
トラック２：Phleum pratense花粉からのエキス
トラック３：ｎＰｈｌ ｐ１
トラック４：ｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭ
トラック３：ｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭ

図２：ｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭおよびｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭによる、Sephacryl S100カラムでのゲルろ過
図は、２つの折り畳み変異体が、異なる見掛けの分子量を有することを示す。
図３：折り畳み変異体ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃ−ＬＭおよび−ＨＭのＩｇＥ結合の定量のための酵素アレルゲン吸着試験（Enzyme allergo-sorbent test: EAST）
ＩｇＥ−ｎＰｈｌ ｐ１結合の阻害剤の濃度をｍｏｌ／ｌで横軸にプロットし、阻害の程度を「％」で縦軸に示した。測定は、固相上のｎＰｈｌ ｐ１、および、草本花粉アレルギー患者の典型的な血清で行った。

発明の詳細な説明
驚くべきことに、追加のシステイン残基を、好ましくは当該分子のカルボキシ末端部分（特にアミノ酸位置１４０から、極めて特に好ましくはアミノ酸位置２３０と２４０との間）に導入することにより、ＩｇＥ活性とＴ細胞反応性を変化させずに、本発明による改善された可溶性がもたらされることが、今回見出された。
本発明は、したがって、野生型に比べて追加のＣｙｓ残基を有するオオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１の変異体、および、当該基本分子に由来する、同一のもしくは類似の有利な特性を有する断片および変異体に関する。

本発明はさらに、本発明の組換え主要アレルゲンｒＰｈｌ ｐ１の変異体の製造方法であって、自体公知の方法により、Ｃｙｓ残基をコードする塩基のトリプレットを挿入もしくは置換により導入し、このようにして改変した遺伝子を宿主生物で過剰発現させ、そして、過剰発現により得たアレルゲン変異体を精製することを特徴とする前記方法に関する。
原核生物による組換え的製造および精製は、融合要素が遺伝子工学により導入されることを伴って、もしくは伴わずに行うことができ、そして常に同一の産物をもたらす。融合要素を用いる場合、Ｈｉｓタグが好ましい。精製方法は、発現ベクターまたは発現系に応じて変わる。

本発明は、したがって、組換えアレルゲンｒＰｈｌ ｐ１の特異的に改変された一次配列であって、これの細菌もしくは他の発現系における組換え的製造およびその後の精製を容易にするものを包含する。
本発明はまた、したがって、本発明のアレルゲン変異体をコードするＤＮＡ分子にも関する。
組換えタンパク質は、自己タンパク質分解的に（autoproteolytically）不活性であり、したがって、用途に応じて、生理溶液、緩衝液またはその他の溶液中に、安定したモノマー形態で貯蔵することができる。Ｔ細胞刺激は、組換えＰｈｌ ｐ１と天然Ｐｈｌ ｐ１との間で有意な差を示さない。

組換えアレルゲン変異体、および由来する断片または変異体は、したがって、草本花粉誘導性アレルギー疾患の治療に用いることができる。
この医薬的な適性のために、本発明はまた、医薬としての特性における新規なアレルゲン変異体にも関する。
組換え的方法により製造されたアレルゲン変異体および断片はさらにまた、花粉アレルギーの診断に用いることもできる。

遺伝子工学により改変された、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１の製造では、アミノ酸置換は、例えばＰＣＲを利用した、標的化ヌクレオチド置換（targeted nucleotide exchange）により行われる。特に好ましい態様である、配列番号２による変異体ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃにおいては、２３６位のアラニンはシステインにより置換されている。しかしながら、置換部位はまた、当該分子の任意の所望の他の部位であってもよい。しかしながら、一般的に、それは当該分子のＣ−末端領域、好ましくは１４０位から、特に２３０位と２４０位との間に位置するだろう。
置換の結果、Ｐｈｌ ｐ１において知られているタンパク質分解活性は、同時に消失する。

さらなる予期せざる効果として、互いに完全に分離することのできる２つの折り畳み変異体が、本発明による当該分子の単離および精製の最中に生じる。
ｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭ（ＬＭ＝低分子量）と称せられる第１のコンホメーション変異体は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１）およびゲルろ過（例えば、Sepharcryl S 100でのもの、図２参照）でのその類似もしくは同一の移動挙動（run behavior）のため、天然タンパク質と極めて類似の挙動を示す一方、ｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭ（ＨＭ＝高分子量）と称せられる第２の変異体は、異なる折り畳み形態で存在する。ＩｇＥ反応性も異なる。ｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭが天然タンパク質に匹敵する反応性を有する一方、ｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭは、ＩｇＥ抗体にそれほど良好に結合せず、その低アレルゲン性により特異的免疫療法に特に好適である（図３参照）。
しかしながら、原則として、両方の折り畳み形態は、両方とも治療および診断のために好適である。

したがって、本発明は、さらにまた、本発明のｒＰｈｌ ｐ１アレルゲン変異体の異なる折り畳み形態、および、治療および診断目的のためのこれらの使用に関する。
両方の折り畳み形態は、易溶解性であり、モノマー形態で安定であり、そして、検出可能なタンパク質分解／自己タンパク質分解活性を有しない。
本発明のアレルゲン変異体は、例えば、人工的な融合要素を伴って、または伴わずに、以下に概説する２種の製造方法により得ることができる。

１）人工的な融合要素（Ｈｉｓタグ）を伴う発現
Ｈｉｓタグを用いる場合、最初は不溶性である粗タンパク質の精製は、１もしくは２以上の金属イオンキレートアフィニティークロマトグラフィー工程と、Ｈｉｓタグの除去とを含む、複数の生化学的分離工程を介して行う。前精製および後精製（pre- and post-purification）のために、種々の他のクロマトグラフィー法、および変性および再生工程を用いることができる。

折り畳み形態のｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭの製造：
−グアニジニウムクロリドを用いた、宿主生物から単離した封入体の変性、
−溶解したタンパク質の、キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでの再生、
−Ｈｉｓタグの除去、
−第１のゲルろ過、
−キレートアフィニティークロマトグラフィー
−標的タンパク質の流出液（flow-through）からの単離、第２、最終ゲルろ過。

もう一方の折り畳み形態であるｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭは、以下の処理工程を行うことにより、この精製変異体において得ることができる：
−グアニジニウムクロリドを用いた、宿主生物から単離した封入体の変性、
−溶解したタンパク質の、キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでの再生、
−Ｈｉｓタグの除去、
−第１のゲルろ過、
−キレートアフィニティークロマトグラフィー
−イミダゾール勾配による標的タンパク質の溶出
−第２、最終のゲルろ過。

２）融合要素なし（Ｈｉｓタグなし）の発現
−グアニジニウムクロリドを用いた、宿主生物から単離した封入体の変性。ここで、以下に記載のとおり、一方または他方の折り畳み形態は、変性期間に応じて得られる。
−緩衝液における希釈による、溶解タンパク質の再生。ここで、２０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７〜８が好ましく用いられるが、他のバッファーおよびｐＨ値（例えば７〜１０．５）もまた可能である。希釈のために、変性したバッチを、好ましくはその容量の倍数（容量の約１０〜８０倍、好ましくは２０〜６０倍）の、好ましくは攪拌されているもしくは別様に混合されている緩衝液に、例えばデカント、ピペッティングもしくはポンピングによって添加する。しかしながら、緩衝液を変性バッチに添加することもできる。添加の速度は重要ではない。したがって、全量を一度に数秒以内に、または代替的に、均一に（しかし好ましくは必ずしも均一にではなく）多時間にわたって分配して添加することができる。

−キレートアフィニティークロマトグラフィーによる、再生タンパク質の濃縮および精製と、引き続くイミダゾール勾配による溶出（段階勾配を用いるのが好ましいが、連続勾配も同様に可能である）。キレートアフィニティークロマトグラフィーの代わりに、またはこれに加えて、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／もしくは陰イオン交換クロマトグラフィーを任意に行うこともできる（当該分子は、クロマトグラフィーで完全に処理しなければならない）。
−最終ゲルろ過。

代替的な安定折り畳み形態であるＬＭおよびＨＭは、ここで、変性工程における異なるインキュベーション時間により、最小限の交差汚染で特異的に得ることができる。ＬＭ形態の製造のためには、インキュベーションは、基本的に約１〜５０時間の間行うことができる。しかしながら、一般的には、１０〜４０時間、好ましくは１５〜３０時間の範囲が用いられ、ここで、１８〜２２時間の範囲が特に好ましい。
ＨＭ変異体については、顕著に長いインキュベーション時間を要する。これは、６０〜１２０時間のレベルである。しかしながら、インキュベーションは、通常７０〜１００時間、特に好ましくは８０〜９０時間の範囲で行われる。

変性工程の後には、すべての場合において、緩衝液による上記の希釈工程が続く。
その間の間隔（約５０〜６０時間）は、再構成フェーズ（re-formation phase）である。希釈工程は、折り畳み過程を整える（fix）と考えられ、さらなる運動（kinetics）は生じない。
ＬＭとＨＭとの分離のための高品質な精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより可能であり、または、これらの形態が顕著に異なる保持時間を有するゲルろ過により達成される。

本発明によるアレルゲン変異体は、その折り畳み変異体であるＬＭおよびＨＭにおいて高純度で得ることができ、有効な医薬的に関係する特性を有している。したがって、これらは、アレルギー疾患の診断（ＩｇＥ活性を保持しているため、特にｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭ）および治療（低減されたＩｇＥ活性のため、特にｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭ）のために混合物として使うことができるが、単独でも使うことができる。
したがって、本発明はさらに、アレルゲン変異体および／またはその医薬的に使用可能な誘導体（あらゆる比率のそれらの混合物を含む）の、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１が誘発に関与しているアレルギーの、特異的免疫療法（減感作）および診断のための医薬の製造への使用に関する。

本発明はさらにまた、本発明のアレルゲン変異体および／またはその医薬的に使用可能な誘導体（あらゆる比率のそれらの混合物を含む）と、所望により、賦形剤および／または添加物（adjuvant）とを含む医薬組成物に関する。本発明の有効成分は、ここで、少なくとも１種の固体、液体および／もしくは半液体の賦形剤または添加物と共に、および、所望により、１種もしくは２種以上のさらなる有効成分と組み合わせて適切な投薬形態に転換することができる。

本発明のアレルゲン変異体が基礎とするＤＮＡ分子が好適な発現ベクターに連結している場合、これらの構築物は、追加的に、免疫療法（ＤＮＡワクチン接種）のための製剤として用いることができる。
したがって、本発明はさらに、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的なＤＮＡワクチン接種による処置のための、本発明のＤＮＡ分子を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。
本発明は、さらにまた、該発現ベクターおよび／またはその誘導体（あらゆる比率のそれらの混合物を含む）の、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的なＤＮＡワクチン接種による処置のための医薬の製造への使用に関する。

最後に、本発明は、該発現ベクターおよび／またはその医薬的に使用可能な誘導体（あらゆる比率のそれらの混合物を含む）と、所望により、賦形剤および／または添加物とを含む、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的なＤＮＡワクチン接種による処置のための医薬組成物に関する。

本発明の目的のために、医薬組成物は、ヒト医療または獣医療において治療剤として用いることができる。好適な賦形剤は、非経口投与に好適であり、本発明の、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１のアレルゲン変異体と反応しない、有機または無機物質である。非経口投与に好適なのは、特に、溶液、好ましくはオイルベースまたは水性の溶液、さらにまた、懸濁液、乳液またはインプラントである。本発明のアレルゲン変異体はまた、凍結乾燥させ、得られた凍結乾燥物を、例えば、注射製剤の製造に用いることができる。上記の組成物は滅菌されていてもよく、および／または、滑剤、保存剤、安定剤および／もしくは湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調節するための塩、緩衝物質などの添加物、および／もしくは複数のさらなる有効成分を含んでもよい。
さらにまた、遅延放出組成物を、本発明のアレルゲン変異体を対応する製剤化、例えば、水酸化アルミニウムへの吸着により得ることができる。

異なる位置でのさらなる選択的改変、およびその他の改変、例えば、低アレルゲン性を向上させるためのものも、本発明の変異によりもちろん可能である。これらの改変は、例えば、アレルゲンエキスの化学的修飾であってもよい（Fiebig, 1995, Allergo J. 4 （7）, 377-382）。しかしながら、これらは遺伝子工学によりＤＮＡレベルで行うこともでき、ここでは、例えば、アミノ酸の挿入、欠失および置換、タンパク質の断片への切断、およびタンパク質もしくはその断片の、他のタンパク質もしくはペプチドへの融合が好適である。
グループ１草本花粉主要アレルゲンの高い配列相同性を考慮すると、本明細書に記載したＰｈｌ ｐ１についての、Ｃｙｓ残基の導入による可溶性の向上および折り畳み変異体の発生に関するすべての効果は、このグループの他の代表例に対しても予想することができる。

さらなるコメントがなくとも、当業者は、上記記載をその最も広い範囲で利用できるものと仮定される。以下の表１および２に、変異体ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃについての例として記載された態様は、したがって、単に説明のための開示とみなされるべきであり、決して制限するものではない。
すべてのクロマトグラフィー材料は、Amersham Biosciences（Freiburg, Germany）から市販されている。
記載されたキレートアフィニティークロマトグラフィー法における金属イオンの選択は重要ではなく、ＮｉおよびＣｕの両方を用いることができる。

例１：ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃ−ＬＭおよび−ＨＭの単離
−Ｈｉｓタグによる精製法
Ｐｈｌ ｐ１をコードする配列を、ＰＣＲにより、５’−および３’−特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅し、ＥｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で、ｐＰｒｏＥｘベクター（GIBCO, La Jolla, USA）中にライゲーションした。３’プライマーは、塩基位置７０６／７０７にてＧＣからＴＧへ改変され、これによりアラニンをコードするトリプレットがシステインをコードするトリプレットに変換された（Essential Molecular Biology; T.A. Brown ed., IRL Press, Oxford, 1994）。形質転換は、大腸菌origamiで行った。選択された開始ベクターｐＰｒｏＥｘは、後にＴＥＶプロテアーゼのための認識配列が続く、Ｎ末端側終端に位置する６ｘＨｉｓ配列を供給する。細菌による発現の後、不溶性の凝集として存在する一次的に６ｘＨｉｓタグを有する組換えｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃ分子は、６Ｍグアニジニウムクロリド（ＧｄｍＣｌ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）にて前精製の後溶解する。この後、２段階Ｎｉキレートアフィニティークロマトグラフィーが続く。

最初の工程では、変性条件下、キレートセファロースに結合したタンパク質を、勾配により、９０分間の経過にわたり、変性溶液から５０ｍＭリン酸バッファーと５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）とからなるバッファーに移した。この後、リン酸バッファー中の５００ｍＭイミダゾールによる段階的な溶出を引き続いて行った。再生された融合タンパク質は、特異的ＴＥＶプロテアーゼにより、ｒＰｈｌ ｐ１と６ｘＨｉｓ融合要素とに切断されている。
第２のアフィニティークロマトグラフィーの準備のため、Sephadex G 25と、溶離液としてリン酸バッファーとを用いてゲルろ過を行ない、この結果イミダゾールが除去された。

再緩衝化（rebuffered）タンパク質混合物を、次に、第２のＮｉキレートアフィニティークロマトグラフィーに用いた。ここにおいて、流出液に、いくらかの成功裏に切断されたｒＰｈｌ ｐ１が見出された。これは、当該分子のＬＭ形態である。未切断分子のほかに、コンホメーション変異体ＨＭもカラムに付着したままであるが、これは、露出したヒスチジン残基によるものと考えられる。この切断変異体は、イミダゾール勾配において、未切断融合タンパク質の前に溶出し、この形態も高純度で得ることができる。最後の工程では、最終精製のためにSuperdex 75によるゲルろ過と所望の溶媒への移行とを行った。

例２：ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃ−ＬＭおよび−ＨＭの単離
−Ｈｉｓタグなしでの精製法
最初に、例１に従った手順が行われるが、ここで、選択されたベクターは、一次産物として融合タンパク質を提供しない。
細菌による発現の後、不溶性の凝集（封入体）として存在する一次的な組換えｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃ分子を、６Ｍグアニジニウムクロリド（ＧｄｍＣｌ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて前精製の後溶解した。この後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に４０倍に希釈した。この目的ために、変性した溶液を、マグネチックスターラーを用いて攪拌されている希釈溶液にデカントした。

ａ）ＬＭ形態の製造
封入体は、変性溶液中２０時間インキュベートした後、上記のとおりに希釈した。
ｂ）ＨＭ形態の製造
封入体は、変性溶液中８５時間インキュベートした後、上記のとおりに希釈した。

５００ｍＭ ＮａＣｌを、各希釈（再生）バッチに添加した。再生バッチ中の溶解した分子は、Ｃｕキレートアフィニティークロマトグラフィーで濃縮し、一段階で、リン酸バッファー中の２００ｍＭイミダゾールで（または、リン酸バッファー中の５００ｍＭイミダゾールで徐々に）溶出した。
キレートアフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質溶出前のコンディショニングのために、例えば、３Ｍ ＮａＣｌ溶液を洗浄用に、および３Ｍ ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール溶液を溶出用に用いて、任意に利用することができる。高い塩含量を有する溶出液は、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィーに直接用いることができる。
最後の工程では、最終精製のためにSuperdex 75によるゲルろ過と所望の溶媒への移行とを行った。

例２：野生型、およびアレルゲン変異体ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃの折り畳み変異体ＬＭおよびＨＭの異なるＩｇＥ結合
天然ｎＰｈｌ ｐ１と、組換えｒＰｈｌ ｐ１変異体ＨＭおよびＬＭとを、これらのＩｇＥ結合の強度に関して、アレルギー患者血清プールでのSuckら（Int. Arch. Allergy Immunol. 2000; 121: 284-291）の方法により行ったＥＡＳＴ阻害アッセイにおいて、相互に比較した（図３）。ＨＭ変異体が、そのＩｇＥ結合について、天然Ｐｈｌ ｐ１タンパク質と比較して有意に低減していたが、ＬＭ変異体が、天然Ｐｈｌ ｐ１タンパク質に匹敵するＩｇＥ結合を有していたことが見出された。

野生型ｎＰｈｌ ｐ１と、アレルゲン変異体ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃの折り畳み変異体ＬＭおよびＨＭの、還元条件および非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。 ｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭおよびｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭによる、Sephacryl S100カラムでのゲルろ過の結果を示した図である。 折り畳み変異体ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃ−ＬＭおよび−ＨＭのＩｇＥ結合の定量のためのＥＡＳＴの結果を示した図である。

Claims (17)

1. オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１の変異体であって、野生型と比較して追加のＣｙｓ残基を有し、該追加のＣｙｓ残基が、アミノ酸位置２３０と２４０との間に位置することを特徴とする、前記アレルゲン変異体。
2. 追加のＣｙｓ残基が、アミノ酸置換に由来することを特徴とする、請求項１に記載のアレルゲン変異体。
3. 追加のＣｙｓ残基が、Ａｌａ２３６の置換により導入されたことを特徴とする、請求項１または２に記載の、配列番号２に記載のアレルゲン変異体ｒＰｈｌ ｐ１−Ａ２３６Ｃ。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載のアレルゲン変異体をコードするＤＮＡ分子。
5. 請求項３に記載のアレルゲン変異体をコードする、配列番号１に記載のＤＮＡ分子。
6. 請求項１〜３のいずれかに記載の組換え主要アレルゲンｒＰｈｌ ｐ１の変異体の製造方法であって、自体公知の方法により、
   −Ｃｙｓをコードする塩基トリプレットを、対応する遺伝子に、挿入または置換により導入すること、
   −このように改変された遺伝子を、宿主生物で過剰発現させること、および
   −過剰発現により得たアレルゲン変異体を精製すること、
   を特徴とする、前記方法。
7. 最初は不溶性である粗タンパク質を変性させ、次いで希釈により再生し、そして生化学的精製工程で精製することを特徴とする、可溶性形態での、請求項６に記載の組換え主要アレルゲンｒＰｈｌ ｐ１の変異体の製造および精製方法。
8. 精製目的のためのＨｉｓタグを有する、過剰発現された、最初は不溶性である粗タンパク質から出発し、２段階金属イオンキレートアフィニティークロマトグラフィーおよびＨｉｓタグの除去を包含する、複数の生化学的精製工程を行うことを特徴とする、可溶性形態での、請求項６に記載の組換え主要アレルゲンｒＰｈｌ ｐ１の変異体の精製方法。
9. ｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭおよびｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭで表される折り畳み形態で存在することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のアレルゲン変異体。
10. 請求項１〜３のいずれかに記載のアレルゲン変異体の折り畳み形態ｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭであって、以下の処理工程：
    −Ｈｉｓタグを有する前記ｒＰｈｌ ｐ１アレルゲン変異体を、宿主生物において過剰発現させる工程、
    −宿主生物から単離した封入体を、グアニジニウムクロリドを用いて変性させる工程、
    −溶解したタンパク質を、キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムで再生する工程、
    −Ｈｉｓタグを除去する工程、
    −ゲルろ過工程
    −さらなるキレートアフィニティークロマトグラフィー工程、
    −標的タンパク質を流出液から単離する工程、
    −ゲルろ過工程、
    を行うことにより得ることができる、前記ｒＰｈｌ ｐ１−ＬＭ。
11. 請求項１〜３のいずれかに記載のアレルゲン変異体の折り畳み形態ｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭであって、以下の処理工程：
    −Ｈｉｓタグを有する前記ｒＰｈｌ ｐ１アレルゲン変異体を、宿主生物において過剰発現させる工程、
    −宿主生物から単離した封入体を、グアニジニウムクロリドを用いて変性させる工程、
    −溶解したタンパク質を、キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムで再生する工程、
    −Ｈｉｓタグを除去する工程、
    −ゲルろ過工程
    −さらなるキレートアフィニティークロマトグラフィー工程、
    −標的タンパク質をイミダゾール勾配により溶出する工程、
    −ゲルろ過工程、
    を行うことにより得ることができる、前記ｒＰｈｌ ｐ１−ＨＭ。
12. 医薬としての、請求項１〜３および９〜１１のいずれかに記載のアレルゲン変異体。
13. 請求項１２に記載のアレルゲン変異体の、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１が誘発に関与しているアレルギーの、特異的免疫療法のための医薬の製造への使用。
14. 請求項１２に記載のアレルゲン変異体と、所望により、賦形剤および／または添加剤とを含む、医薬組成物。
15. オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的ＤＮＡワクチン接種による処置のための、請求項４または５に記載のＤＮＡ分子を含有する組換えＤＮＡ発現ベクター。
16. 請求項１５に記載の発現ベクターの、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的ＤＮＡワクチン接種による処置のための、医薬の製造への使用。
17. 請求項１５に記載の発現ベクターと、所望により、賦形剤および／または添加剤とを含む、オオアワガエリからの主要アレルゲンＰｈｌ ｐ１が誘発に関与しているアレルギーの、免疫療法的ＤＮＡワクチン接種による処置のための、医薬組成物。

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