KR101475484B1 - 골형성 단백질 4의 정제방법 - Google Patents

골형성 단백질 4의 정제방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101475484B1
KR101475484B1 KR1020130168813A KR20130168813A KR101475484B1 KR 101475484 B1 KR101475484 B1 KR 101475484B1 KR 1020130168813 A KR1020130168813 A KR 1020130168813A KR 20130168813 A KR20130168813 A KR 20130168813A KR 101475484 B1 KR101475484 B1 KR 101475484B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
column
nacl
bmp4
buffer
tris
Prior art date
Application number
KR1020130168813A
Other languages
English (en)
Inventor
김인근
박남호
김영식
이성백
장주웅
심영복
Original Assignee
주식회사 셀루메드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 셀루메드 filed Critical 주식회사 셀루메드
Priority to KR1020130168813A priority Critical patent/KR101475484B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101475484B1 publication Critical patent/KR101475484B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 a) BMP4를 함유하는 용액을 분획 박막 필터를 이용하여 농축하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 수득된 용액에 이온교환 크로마토그래피를 적용하는 단계; c) 상기 b) 단계에서 수득된 용액에 친화성 크로마토그래피를 적용하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에서 수득된 용액에 소수성 상호작용 크로마토그래피를 적용하는 단계를 포함하는, BMP4의 정제방법에 관한 것이다.

Description

골형성 단백질 4의 정제방법{METHOD FOR PURIFYING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 4}
본 발명은 BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4, 골형성 단백질 4)를 고순도 및 고회수율로 정제하기 위한 방법에 관한 것이다.
골형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP)은 형질전환 성장인자 (Transforming Growth Factor β, TGF-β) 상과에 속하는 펩티드 성장 인자이다. BMP는 포유동물에서 줄기세포가 골세포 및 연골세포로 분화되는 것을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Jiwang Zhang, Linheng Li. BMP signaling and stem cell regulation(2005) Developmental Biology 284 1-11 참조). 골 유도성 BMP들은 골형성 과정에서 줄기세포가 골모세포로 분화할 때 최초의 신호 분자로 작용하며, 특히 골절 치유 과정 중에서 골이 형성될 때에는 BMP2, 4, 7이 주로 작용하는 것으로 보고되었다(M. Egermann, C.A. Lill, and K. Criesbeck, Effects of BMP-2 gene transfer on bone healing in sheep (2006) Gene Therapy, Vol.13, No.17, 1290-1299 참조). 또한, BMP4 및 6은 골 및 연골을 유도하는 기능을 가지고 있다는 보고도 있다(Morone MA, Boden SD, Hair G et al. Gene expression during autograft lumbar spine fusion and the effect of bone morphogenetic protein 2 (1998) Clin Orthop (351) 252; Gruber R, kandler B. Fuerst G et al, Porcine sinus mucosa holds cells that respond to bone morphogenic protein BMP-6 and BMP-7 with increased osteogenic differentiation in vitro (2004) Clin Oral Implants Res 15(5) 575-580 참조).
이와 같이 골형성 과정에 중요한 역할을 하는 BMP와 관련된 많은 연구가 진행되고 있으며, BMP2를 이용한 제품들은 상용화되어 의료목적으로 사용되고 있으나, BMP4는 BMP2에 비해 진행된 연구도 적으며 상용화된 제품이 아직 없다.
따라서, BMP4에 대한 다양한 연구와 새로운 제품 개발을 위하여, BMP4를 함유하는 세포 배양액으로부터 BMP4 외의 단백질과 배양액 성분에서 유래된 불순물들을 효과적으로 제거하고 BMP4를 높은 순도 및 회수율로 정제하여 수득하는 것이 요구된다.
종래에는, 세포 등의 배양액으로부터 BMP를 높은 순도와 높은 회수율로 수득하기 위하여, 전하, 리간드, 소수성 정도 또는 단백질의 크기를 기준으로 여러 단계의 크로마토그래피를 결합하여 이용하고 있으며, 그 종류 또한 매우 다양하고 그 종류에 따라 순도 및 회수율에 많은 차이를 보인다. 또한, 본 출원인은 BMP2의 정제방법(특허문헌 1: 등록번호 제10-0991203호) 및 BMP7의 정제방법(특허문헌 2: 등록번호 제10-1212499호)을 개발하여 특허등록 받은바 있다. 그러나, BMP4의 경우 BMP2 또는 BMP7과 등전점(pI), 크기 등 단백질이 가지는 고유 성질이 다르고 배양액의 성분도 다르기 때문에, BMP2 또는 BMP7을 정제하는 방법에 의해서는 고순도 및 고효율로 정제할 수 없다(후술하는 본 명세서의 비교예 1 내지 4 참조). 또한, 산업적 규모로 고순도의 BMP4 단백질을 정제하여 대량생산하기 위해서는 저렴한 수지와 완충용액을 선정할 필요가 있다.
등록번호 제10-0991203호(등록일: 2010.10.26.) 등록번호 제10-1212499호(등록일: 2012.12.10.)
본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점 등을 인식하고 이를 해결하기 위하여, BMP4의 화학적 및 물리적 특징, 크로마토그래피의 종류, 각각의 크로마토그래피에 사용되는 수지, 완충액, 세척액 또는 용출액의 종류, 농도 및 pH 등을 달리 하여 다양한 실험들을 수행한 결과, 정제에 필요한 시간을 단축시키며, 기존 방법보다 비용을 절감하는 동시에 높은 순도와 회수율로 BMP4를 정제할 수 있는 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 BMP4의 정제방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 정제방법은 특히 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) BMP4를 함유하는 용액을 분획 박막 필터(cut-off membrane filter)를 이용하여 농축하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 수득된 용액에 이온교환 크로마토그래피를 적용하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 수득된 용액에 친화성 크로마토그래피를 적용하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 수득된 용액에 소수성 상호작용 크로마토그래피를 적용하는 단계.
바람직하게는, 상기 BMP4를 함유하는 용액은 CHO 세포배양액이다.
바람직한 일구현예에서, 상기 a) 단계는 10kDa 컷 오프의 분획 박막 필터를 이용하여 BMP4를 함유하는 용액의 부피를 1/10로 농축한다.
바람직한 일구현예에서, 상기 b) 단계의 이온교환 크로마토그래피는 누비아 Q(Nuvia Q) 수지가 사용되며, 특히 i) Tris를 함유하는 완충액으로 컬럼을 평형화 하는 단계, ii) 상기 컬럼에 상기 a) 단계에서 농축된 BMP4를 함유하는 용액을 로딩하는 단계, iii) Tris 및 NaCl을 함유하는 완충액으로 상기 컬럼을 세척하는 단계, 및 iv) Tris 및 NaCl을 함유하는 완충액으로 상기 BMP4를 함유하는 용액을 용출하는 단계로 이루어진다.
특히, 상기 b) 단계의 이온교환 크로마토그래피에서 사용되는 완충액은 pH의 범위가 6 내지 8, 바람직하게는 7 내지 8, 더 바람직하게는 7.8이다. 또한, 상기 b) 단계의 이온교환 크로마토그래피에서 사용되는 Tris의 농도는 5 내지 50mM, 바람직하게는 10 내지 30mM, 더 바람직하게는 20mM이다. 또한, 상기 b) 단계의 이온교환 크로마토그래피에서 사용되는 NaCl의 농도는 0.1 내지 1M, 바람직하게는 0.1 내지 0.4M이다.
바람직한 일구현예에서, 상기 c) 단계의 친화성 크로마토그래피는 셀루핀 설페이트(Cellufine Sulfate) 수지가 사용되며, 특히 i) 히스티딘 및 NaCl을 함유하는 완충액으로 컬럼을 평형화하는 단계, ii) 상기 컬럼에 b) 단계의 용출액을 로딩하는 단계, iii) 히스티딘, NaCl 및 아르기닌을 함유하는 완충액으로 상기 컬럼을 세척하는 단계, 및 iv) 히스티딘, NaCl 및 아르기닌을 함유하는 완충액으로 용출하는 단계로 이루어진다.
특히, 상기 c) 단계의 친화성 크로마토그래피에서 사용되는 완충액은 pH의 범위가 6 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7, 더 바람직하게는 6.5이다. 또한, 상기 c) 단계의 친화성 크로마토그래피에서 사용되는 히스티딘의 농도는 5 내지 50mM, 바람직하게는 10 내지 30mM, 더 바람직하게는 20mM이다. 또한, 상기 c) 단계의 친화성 크로마토그래피에서 사용되는 NaCl의 농도는 0.05M 내지 1.0M, 바람직하게는 0.1M 내지 0.5M이다. 또한, 상기 c) 단계의 친화성 크로마토그래피에서 사용되는 아르기닌의 농도는 0.5M 내지 1M, 더 바람직하게는 0.6M이다.
바람직한 일구현예에서, 상기 d) 단계의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 부틸 HP(Butyl HP(High Performance)) 수지가 사용되며, 특히 i) Tris 및 NaCl을 함유하는 완충액으로 컬럼을 평형화하는 단계, ii) 상기 컬럼에 c) 단계의 용출액을 로딩하는 단계, iii) Tris, NaCl 및 프로필렌글리콜을 함유하는 완충액으로 상기 컬럼을 세척하는 단계, 및 iv) Tris, NaCl 및 프로필렌글리콜을 함유하는 완충액으로 용출하는 단계로 이루어진다.
특히, 상기 d) 단계의 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 사용되는 완충액은 pH의 범위가 6 내지 8, 바람직하게는 7 내지 8, 더 바람직하게는 7.8이다. 또한, 상기 d) 단계의 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 사용되는 Tris의 농도는 5 내지 50mM, 바람직하게는 10 내지 30mM, 더 바람직하게는 20mM이다. 또한, 상기 d) 단계의 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 사용되는 NaCl의 농도는 0.1M 내지 1M, 바람직하게는 0.2M 내지 0.4M이다. 또한, 상기 d) 단계의 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 사용되는 프로필렌글리콜의 농도는 0.5 부피% 내지 15 부피%, 더 바람직하게는 10 부피%이다.
본원에서 사용된 용어 "SDS-PAGE"는 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 약어로서, 전기영동 이동성(예컨대, 폴리펩티드쇄의 길이 또는 분자량과 같은 인자)을 이용하여 단백질을 분리하는 기술이다. 이 경우, 작은 분자량의 단백질은 이동거리가 더 멀리 나타나며, 분자량-마커를 이용하여 Rf(Rate of flow, 이동률) 값을 구하면 목적 단백질의 분자량을 구하거나 목적 단백질을 동정할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "Tris"는 화학식 (HOCH2)3CNH2을 가지며, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄으로 알려진 유기 화합물의 약어를 가리킨다.
본 발명에 따른 BMP4의 정제방법은 종래의 BMP2 또는 BMP7의 정제방법으로는 BMP4를 배양액으로부터 정제할 수 없기 때문에 새롭게 고안된 방법이다.
본 발명에 따른 정제방법에서는 별도의 완충용액 교환 과정을 거치지 않으므로, BMP4를 정제하는데 소요되는 시간을 유의적으로 단축시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 정제방법에서는 저렴한 이온교환 크로마토그래피 수지를 먼저 사용하고 더 비싼 친화성 크로마토그래피 수지를 그 후에 사용하기 때문에, 앞 단계에서 필요한 크로마토그래피 수지의 양이 후속 단계에서 필요한 크로마토그래피 수지의 양보다 더 많다는 점을 고려해본다면, 정제과정에 소요되는 총 비용을 크게 절감시킬 수 있다. 더욱이, 본 발명의 정제방법에 있어서 용출액에 사용하는 시료의 성분으로서 주로 NaCl을 사용하므로, 정제 원가를 더 절감시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 정제방법은 종래의 정제방법에 비해 BMP4를 훨씬 더 적은 시간과 비용으로 회수할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 회수율과 높은 순도를 동시에 달성할 수 있으며, 산업적 규모로 대량생산할 수 있는 유리한 이점을 가지고 있다.
도 1a는 실시예 1에서 본 발명의 정제방법에 따라 정제된 BMP4를 SDS-PAGE 방법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 1b는 실시예 1에서 본 발명의 정제방법에 따라 정제된 BMP4를 웨스턴 블롯팅 방법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 비교예 1에서 본 발명의 정제방법에 따라 정제된 BMP2를 SDS-PAGE 방법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 비교예 2에서 본 발명의 정제방법에 따라 정제된 BMP7을 SDS-PAGE 방법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 비교예 3에서 본 출원인이 보유하고 있는 다른 특허등록 제10-0991203호(하기에서는 특허문헌 1이라고 지칭함)의 정제방법에 따라 정제된 BMP4를 SDS-PAGE 방법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 비교예 4에서 본 출원인이 보유하고 있는 다른 특허등록 제10-1212499호(하기에서는 특허문헌 2라고 지칭함)의 정제방법에 따라 정제된 BMP4를 SDS-PAGE 방법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다.
하기에서는, 본 발명에 따라 BMP4를 정제하는 구체적인 실시예를 나타낸다. 단, 본 발명의 권리범위는 하기의 실시예에 의해 제한되지 않으며, 당업자라면 본 발명의 의미 내에서 다양한 변형들을 수행할 수 있을 것이다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 범위 내에 속하는 정제방법의 구현예들 중 대표적인 예에 관한 것이다.
1) 농축:
분획 박막 필터로서 10kDa 컷 오프의 SARTOCON Slice 200(Sartorius사)을 2개 사용하여, BMP4를 함유하는 2000ml의 CHO 세포배양액의 부피를 1/10로 농축하였다(2000ml -> 200ml). 이때, 펌프 유속은 150ml/min로 설정하였다.
상기 농축된 배양액의 부피를 기준으로 1 부피%의 Tween 80 및 0.34 부피%의 트리부틸포스페이트로 상기 농축된 배양액을 처리하여, 배양액에 함유된 바이러스를 불활성화시켰다.
그 후, 기공의 크기가 0.2μm인 필터로 상기 농축된 배양액을 여과하여, 후속되는 크로마토그래피의 컬럼에 주입될 시료를 제조하였다.
2) 이온교환 크로마토그래피
두 번째 단계인 이온교환 크로마토그래피에서 사용한 파라미터는 다음과 같았다:
- 베이스(base) 완충액: 20mM Tris pH 7.8
- 세척 완충액: 20mM Tris + 0.1M NaCl pH 7.8
- 용출 완충액: 20mM Tris + 0.4M NaCl pH 7.8
- 유속: 100 cm/hr(9 ml/min)
- 컬럼 부피: 약 60ml
- 컬럼에 주입한 시료: 1/10로 농축시킨 BMP4 함유 CHO 세포배양액 200ml
- 사용한 수지: 누비아(Nuvia) Q.
누비아 Q 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 180ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고 180ml의 베이스 완충액을 흘려주어 로딩하였다. 그 후, 컬럼에 180ml의 세척 완충액을 흘려주어 컬럼을 세척하고, 컬럼 부피의 2배인 120ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
3) 친화성 크로마토그래피
세 번째 단계인 친화성 크로마토그래피에서 사용한 파라미터는 다음과 같았다:
- 베이스 완충액: 20mM 히스티딘 + 0.1M NaCl pH 6.5
- 세척 완충액: 20mM 히스티딘 + 0.5M NaCl pH 6.5
- 용출 완충액: 20mM 히스티딘 + 0.1M NaCl + 0.6M 아르기닌 pH 6.5
- 유속: 150 cm/hr(4.5 ml/min)
- 컬럼 부피: 약 20ml
- 컬럼에 주입한 시료: 상기 두 번째 단계인 이온교환 크로마토그래피에서 획득한 용출액
- 사용한 수지: 셀루핀 설페이트 수지.
셀루핀 설페이트 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 60ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고, 다시 60ml의 베이스 완충액을 흘려주었다. 그 후, 60ml의 세척 완충액을 흘려주어 컬럼을 세척하고, 컬럼 부피의 2배인 40ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
4) 소수성 상호작용 크로마토그래피
네 번째 단계인 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 사용한 파라미터는 다음과 같았다:
- 베이스 완충액: 20mM Tris + 0.4M NaCl pH 7.8
- 세척 완충액: 20mM Tris + 0.4M NaCl pH 7.8
- 용출 완충액: 20mM Tris + 0.2M NaCl + 10 부피% 프로필렌 글리콜 pH 7.8
- 유속: 150cm/hr(4.5ml/min)
- 컬럼 부피: 약 10ml
- 컬럼에 주입한 시료: 상기 세 번째 단계인 친화성 크로마토그래피에서 획득한 용출액
- 사용한 수지: 부틸 HP 수지.
부틸 HP 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 30ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고, 다시 30ml의 베이스 완충액을 흘려주었다. 그 후, 30ml의 세척 완충액을 흘려주어 컬럼을 세척하고, 컬럼 부피의 2배인 20ml의 용출 완충액을 컬럼에 흘려주어 용출액을 수집하였다.
비교예 1
실시예 1의 정제방법에 따라 BMP2 세포배양액으로부터 BMP2를 정제하였다.
1) 농축
분획 박막 필터로서 10kDa 컷 오프의 SARTOCON Slice 200(Sartorius사)을 2개 사용하여, BMP2를 함유하는 400ml의 CHO 세포배양액의 부피를 1/10로 농축하였다(400ml -> 40ml). 이때, 펌프의 유속은 150ml/min로 설정하였다.
상기 농축된 배양액의 부피를 기준으로 1 부피%의 Tween 80 및 0.34 부피%의 트리부틸포스페이트로 상기 농축된 배양액을 처리하여, 배양액에 함유된 바이러스를 불활성화하였다.
그 후, 기공의 크기가 0.2μm인 필터로 상기 농축된 배양액을 여과하여, 후속되는 크로마토그래피의 컬럼에 주입될 시료를 제조하였다.
2) 이온교환 크로마토그래피
두 번째 단계인 이온교환 크로마토그래피에서 사용한 파라미터는 다음과 같았다:
- 베이스 완충액: 20mM Tris pH 7.8
- 세척 완충액: 20mM Tris + 0.1M NaCl pH 7.8
- 용출 완충액: 20mM Tris + 0.4M NaCl pH 7.8
- 유속: 150cm/hr(4.5ml/min)
- 컬럼 부피: 약 25ml
- 컬럼에 주입한 시료: 1/10로 농축시킨 BMP2 함유 CHO 세포배양액 40ml.
누비아 Q 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 80ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고 80ml의 베이스 완충액을 흘려주어 로딩하였다. 그 후, 컬럼에 80ml의 세척 완충액을 흘려주어 컬럼을 세척하고, 컬럼 부피의 2배인 50ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
3) 친화성 크로마토그래피
세 번째 단계인 친화성 크로마토그래피에서 사용한 파라미터는 다음과 같았다:
- 베이스 완충액: 20mM 히스티딘 + 0.1M NaCl pH 6.5
- 세척 완충액: 20mM 히스티딘 + 0.5M NaCl pH 6.5
- 용출 완충액: 20mM 히스티딘 + 0.1M NaCl + 0.6M 아르기닌 pH 6.5
- 유속: 150cm/hr(4.5ml/min)
- 컬럼 부피: 약 20ml
- 컬럼에 주입한 시료: 상기 두 번째 단계인 이온교환 크로마토그래피에서 획득한 용출액
- 사용한 수지: 셀루핀 설페이트 수지.
셀루핀 설페이트 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 60ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고, 다시 60ml의 베이스 완충액을 흘려주어 로딩하였다. 그 후, 60ml의 세척 완충액을 흘려주어 세척하고, 컬럼 부피의 2배인 40ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
4) 소수성 상호작용 크로마토그래피
네 번째 단계인 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 사용한 파라미터는 다음과 같았다:
- 베이스 완충액: 20mM Tris + 0.4M NaCl pH 7.8
- 세척 완충액: 20mM Tris + 0.4M NaCl pH 7.8
- 용출 완충액: 20mM Tris + 0.2M NaCl + 10 부피% 프로필렌 글리콜 pH7.8
- 유속: 150cm/hr(4.5ml/min)
- 컬럼 부피: 약 10ml
- 컬럼에 주입한 시료: 상기 세 번째 단계인 친화성 크로마토그래피에서 획득한 용출액
- 사용한 수지: 부틸 HP 수지.
부틸 HP 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 30ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고, 다시 30ml의 베이스 완충액을 흘려주어 로딩하였다. 그 후, 30ml의 세척 완충액을 흘려주어 컬럼을 세척하고, 컬럼 부피의 2배인 20ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
비교예 2
실시예 1의 정제방법에 따라 BMP7 세포배양액으로부터 BMP7을 정제하였다. 다만, BMP7 세포배양액의 경우, 다른 세포배양액에 비해 단백질의 발현량이 많아서 농축하면 단백질 응집현상이 일어났기 때문에, 비교예 2에서는 농축 과정을 생략하고 정제를 수행하였다.
1) 이온교환 크로마토그래피
이온교환 크로마토그래피에서 사용한 파라미터는 다음과 같았다:
- 베이스 완충액: 20mM Tris pH 7.8
- 세척 완충액: 20mM Tris + 0.1M NaCl pH 7.8
- 용출 완충액: 20mM Tris + 0.4M NaCl pH 7.8
- 유속: 150cm/hr(4.5ml/min)
- 컬럼 부피: 약 25ml
- 컬럼에 주입한 시료: BMP7 함유 CHO 세포배양액 50ml
- 사용한 수지: 누비아(Nuvia) Q.
누비아 Q 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 약 80ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고 약 80ml의 베이스 완충액을 흘려주어 로딩하였다. 그 후, 컬럼에 80ml의 세척 완충액을 흘려주어 컬럼을 세척하고, 컬럼 부피의 2배인 50ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
2) 친화성 크로마토그래피
친화성 크로마토그래피에서 사용한 파라미터는 다음과 같았다:
- 베이스 완충액: 20mM 히스티딘 + 0.1M NaCl pH 6.5
- 세척 완충액: 20mM 히스티딘 + 0.5M NaCl pH 6.5
- 용출 완충액: 20mM 히스티딘 + 0.1M NaCl + 0.6M 아르기닌 pH 6.5
- 유속: 150cm/hr(4.5ml/min)
- 컬럼 부피: 약 20ml
- 컬럼에 주입한 시료: 상기 이온교환 크로마토그래피에서 획득한 용출액
- 사용한 수지: 셀루핀 설페이트 수지.
셀루핀 설페이트 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 60ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고, 다시 60ml의 베이스 완충액을 흘려주어 로딩하였다. 그 후, 60ml의 세척 완충액을 흘려주어 컬럼을 세척하고, 컬럼 부피의 2배인 40ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
3) 소수성 상호작용 크로마토그래피
소수성 상호작용 크로마토그래피에서 사용한 파라미터는 다음과 같았다:
- 베이스 완충액: 20mM Tris + 0.4M NaCl pH 7.8
- 세척 완충액: 20mM Tris + 0.4M NaCl pH 7.8
- 용출 완충액: 20mM Tris + 0.2M NaCl + 10 부피% 프로필렌 글리콜 pH 7.8
- 유속: 150cm/hr(4.5ml/min)
- 컬럼 부피: 약 10ml
- 컬럼에 주입한 시료: 상기 친화성 크로마토그래피에서 획득한 용출액
- 사용한 수지: 부틸 HP 수지.
부틸 HP 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 30ml의 베이스 완충액을 흘려주어 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고, 다시 30ml의 베이스 완충액을 흘려주었다. 그 후, 30ml의 세척 완충액을 흘려주어 컬럼을 세척하고, 컬럼 부피의 2배인 20ml의 용출 완충액을 컬럼에 흘려주어 용출액을 수집하였다.
비교예 3
특허문헌 1에 개시된 BMP2의 정제방법에 따라, BMP4 세포배양액으로부터 BMP4를 정제하였다.
1) 농축
BMP4 함유 CHO 세포배양액 500ml를 50ml로 농축하고, 50mM Tris + 1M NaCl pH 7.3으로 완충용액을 교환하였다.
2) 소수성 상호작용 크로마토그래피
- 베이스 완충액: 50mM Tris + 0.85M NaCl + 5 부피% 이소프로판올 pH 7.3
- 세척 완충액: 50mM Tris + 0.85M NaCl + 5 부피% 이소프로판올 pH 7.3
- 용출 완충액: 50mM Tris + 0.6M NaCl + 15 부피% 이소프로판올 pH 7.3
- 유속: 150cm/hr
- 컬럼 부피: 약 25ml
- 컬럼에 주입한 시료: 상기 농축 단계에서 획득한 BMP4 함유 CHO 세포배양액 50ml
- 사용한 수지: 부틸 4-FF(Fast Flow) 수지.
부틸 4-FF 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 약 3배인 80ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고 80ml의 베이스 완충액을 흘려주었다. 그 후, 컬럼 부피의 2배인 50ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
3) 완충용액의 교환
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 획득한 용출액을 30kDa 막 필터를 사용하여 여과하고, 50mM Tris + 0.6M NaCl + 0.5M 아르기닌 + 5 부피% 이소프로판올 pH 7.3을 용출액 부피의 10배 부피로 사용하여 완충용액을 교환하였다. 그 후, 상기 시료의 부피가 3ml가 될 때까지 농축하였다.
4) 크기배제 크로마토그래피
- 베이스 완충액: 50mM Tris + 0.6M NaCl pH 7.3
- 용출 완충액: 50mM Tris + 0.6M NaCl pH 7.3
- 유속: 30cm/hr
- 컬럼 부피: 약 120ml
- 컬럼에 주입한 시료: 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 획득한 후 완충용액을 교환한 용출액
- 사용한 수지: 세파크릴(Sephacryl) S-100.
세파크릴 S-100 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 1배인 120ml의 베이스 완충액을 흘려주어 컬럼을 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하고, 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
비교예 4
특허문헌 2에 개시된 BMP7의 정제방법에 따라, BMP4 세포배양액으로부터 BMP4를 정제하였다.
1) 친화성 크로마토그래피
- 베이스 완충액: 50mM Tris pH 7.3
- 세척 완충액: 50mM Tris + 0.3M 아르기닌 pH 7.3
- 용출 완충액: 50mM Tris + 0.8M 아르기닌 pH 7.3
- 유속: 150cm/hr
- 컬럼 부피: 약 5ml
- 컬럼에 주입한 시료: BMP4 함유 CHO 세포배양액 105ml
- 사용한 수지: 셀루핀 설페이트 수지.
셀루핀 설페이트 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 15ml의 베이스 완충액을 컬럼에 흘려주어 평형화시킨 후, 상기 시료를 주입하였다. 그 후, 15ml의 세척 완충액을 흘려준 뒤 컬럼 부피의 2배인 10ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
이어서, 상기 용출액에 NaCl을 최종 농도가 1M이 되도록 혼합하고, 0.2μm의 필터로 여과하였다.
2) 소수성 상호작용 크로마토그래피
- 베이스 완충액: 50mM Tris + 1M NaCl pH 7.3
- 세척 완충액: 50mM Tris + 1M NaCl pH 7.3
- 용출 완충액: 50mM Tris + 1M 아르기닌 + 10 부피% 프로필렌 글리콜 pH 7.3
- 유속: 150cm/hr
- 컬럼 부피: 약 5ml
- 컬럼에 주입한 시료: 상기 친화성 크로마토그래피에서 획득한 용출액
- 사용한 수지: 부틸 S-FF(Butyl Sepharose S Fast Flow).
부틸 S-FF 수지로 충진된 컬럼에 대해, 컬럼 부피의 3배인 15ml의 베이스 완충액을 흘려주어 평형화시킨 후 상기 시료를 주입하였다. 다시 15ml의 세척 완충액을 흘려주어 컬럼을 세척한 후, 컬럼 부피의 2배인 10ml의 용출 완충액을 흘려주어 용출액을 수집하였다.
정제된 단백질의 분석
ELISA 방법을 이용하여 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 4에 따라 정제된 단백질의 회수율을 분석하였으며, 그 결과는 하기의 표 1 내지 표 5에 나타내었다.
또한, SDS-PAGE 방법을 이용하여 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 4에 따라 정제한 단백질의 순도를 분석하였으며, 그 결과는 각각 도 1a, 및 도 2 내지 도 5에 나타내었다.
마지막으로, 웨스턴 블롯팅(western blotting) 방법을 이용하여 상기 실시예 1에 따라 정제한 단백질의 순도를 분석하였으며, 그 결과는 도 1b에 나타내었다.
1) 실시예 1
시료 희석배수
( Dilution Factor ) 		농도
( pg / ml ) 		부피
( ml ) 		총
BMP4
(μg) 		회수율
(%) 		총
회수율
(%)
BMP4 배양액 10000 121.56 1800 2188.01 100.0
BMP4 농축, SD 처리 100000 110.13 165 1817.19 83.1
누비아 Q에 결합되지 않고 배출된 용액 1000 70.76 140 9.91 0.5
누비아 Q 세척액 1000 33.08 80 2.65 0.1
누비아 Q 용출액 10000 893.95 120 1072.74 59.0 49.0
누비아 Q 자동세척액 10000 129.46 40 51.78 2.4
셀루핀 설페이트에 결합되지 않고 배출된 용액 10000 135.54 130 176.21 8.1
셀루핀 설페이트 세척액 100 283.80 10 0.28 0.0
셀루핀 설페이트 용출액 100000 287.05 25 717.62 66.9 32.8
셀루핀 설페이트 제자리세척액 100000 71.32 5 35.66 1.6
부틸 HP에 결합되지 않고 배출된 용액 100 376.67 30 1.13 0.1
부틸 HP 용출액 100000 266.05 20 532.09 74.1 24.3
부틸 HP 제자리세척액 10000 119.39 5 5.97 0.3
상기 표 1에 따르면, ELISA를 이용한 BMP4 정량 결과 최종 정제 단계 후의 BMP4 회수율이 24.3%로 나왔다.
또한, 도 1a 및 도 1b에서 볼 수 있듯이, 부틸 HP 용출액에서 정제된 단백질이 양성 대조군(positive control)(Gibco사 시약)과 동일한 30kDa의 위치에서 나타났는바, 상기 정제된 단백질은 BMP4임을 알 수 있고, 상기 BMP4의 순도는 97.9%로 측정되었다.
또한, 상기 부틸 HP 용출액 및 양성 대조군을 환원하여 비교한 결과, 모두 15kDa와 20kDa 사이에서 하나의 단백질 밴드만이 나타났다. 이는 부틸 HP 용출액에서 정제된 단백질이 양성 대조군과 같이 단량체가 결합된 이량체 단백질이라는 점을 의미한다.
상기 결과에 비추어 볼 때, 정제된 BMP4의 회수율은 상대적으로 매우 높지는 않지만, 이와 같이 정제된 BMP4의 순도가 97.9%로 매우 높게 측정되었는바, 본 발명에 따른 정제방법은 BMP4를 높은 순도로 정제할 수 있는 유리한 정제방법이라는 것이 입증되었다.
2) 비교예 1
시료 희석배수
( Dilution Factor ) 		농도
( pg / ml ) 		부피
( ml ) 		총
BMP2
(μg) 		총
회수율
(%)
BMP2 배양액 100000 566.21 32 1811.87 100.0
누비아 Q에 결합되지 않고 배출된 용액 10000 101.57 35 35.55 2.0
누비아 Q 세척액 10000 101.97 25 25.49 1.4
누비아 Q 용출액 100000 382.72 45 1722.22 95.1
셀루핀 설페이트에 결합되지 않고 배출된 용액 10000 106.45 55 58.55 3.2
셀루핀 설페이트 세척액 10000 102.04 10 10.20 0.6
셀루핀 설페이트 용출액 100000 543.02 20 1086.03 59.9
셀루핀 설페이트 제자리세척액 10000 198.13 5 9.91 0.5
부틸 HP에 결합되지 않고 배출된 용액 10000 102.47 30 30.74 1.7
부틸 HP 용출액 100000 290.63 30 871.89 48.1
부틸 HP 제자리세척액 10000 210.48 5 10.52 0.6
상기 표 2에 따르면, 본 발명의 정제방법으로 BMP2 배양액에서 BMP2를 정제함에 따라 달성된 최종 회수율은 48%로, 특허문헌 1에 따른 정제방법에 의해 달성되는 88%에 비해 절반 수준으로 낮게 나타난다는 것을 확인했다.
또한, 도 2에서 볼 수 있듯이, BMP2에 대응되는 30kDa 부근에서 하나의 단백질 밴드가 발견되었으나, 15kDa와 20kDa 사이에서 두 개의 단백질 밴드가 더 발견되었다. 특히, 30kDa 부근에서 발견된 단백질 밴드의 BMP2의 순도는 66.5%로 상대적으로 낮게 나타났다.
상기 결과에 비추어 볼 때, 본 발명의 제조방법으로는 BMP2를 높은 순도와 원하는 회수율로 정제할 수 없다는 것을 알 수 있다.
3) 비교예 2
시료 희석배수
( Dilution Factor ) 		농도
( pg / ml ) 		부피
( ml ) 		총
BMP7
(μg) 		총
회수율
(%)
BMP7 배양액 100000 400.65 55 2203.56 100.0
누비아 Q에 결합되지 않고 배출된 용액 1000 74.80 50 3.74 0.2
누비아 Q 세척액 100 150.66 35 0.53 0.0
누비아 Q 용출액 100000 348.93 45 1570.16 71.3
누비아 Q 자동세척액 1000 1031.17 5 5.16 0.2
셀루핀 설페이트에 결합되지 않고 배출된 용액 100000 262.16 55 1441.89 65.4
셀루핀 설페이트 용출액 10000 503.02 20 100.60 4.6
셀루핀 설페이트 제자리세척액 1000 2565.02 5 12.83 0.6
부틸 HP에 결합되지 않고 배출된 용액 100 1030.82 30 3.09 0.1
부틸 HP 용출액 100 1219.43 30 3.66 0.2
부틸 HP 제자리세척액 1000 2059.13 5 10.30 0.5
부틸 HP 제자리세척액 10000 704.92 10 70.49 3.2
상기 표 3에 따르면, 상당량, 즉 65.4%의 BMP7이 본 발명의 정제방법의 c) 단계에 해당되는 셀루핀 설페이트를 이용한 친화 크로마토그래피에서 컬럼에 결합하지 못하고, 컬럼 세척단계에서 용리되었다는 것을 알 수 있다. 더욱이, 최종 정제 단계 후의 BMP4 회수율이 불과 0.2%로 나왔다.
또한, 도 3에서 볼 수 있듯이, SDS-PAGE로 단백질의 순도를 확인해본 결과 BMP7의 순도는 100%로 나타났으나, 회수된 양이 너무 적어서 100배 농축한 후에 전기영동을 해야 육안으로 밴드를 확인할 수 있었다.
상기 결과에 비추어 볼 때, 본 발명의 정제방법에 의해 BMP7을 정제하는 경우, 순도는 높지만 극히 소량의 BMP7만을 정제할 수 있기 때문에, 본 발명의 정제방법은 BMP7을 정제하는 데에는 적합하지 않다는 것을 알 수 있다.
4) 비교예 3
시료 희석배수
( Dilution Factor ) 		농도
( pg / ml ) 		부피
( ml ) 		총
BMP4
(μg) 		총
회수율
(%)
농축완충용액 교환된 BMP4 배양액 20000 445.17 50 445.17 100.0
부틸 4-FF에 결합되지 않고 배출된 용액 10000 424.20 60 254.52 57.2
부틸 4-FF 용출액 10000 13.86 20 2.77 0.6
부틸 4-FF 제자리 세척액 10000 0.00 15 0.00 0.0
완충용액 교환농축된 부틸 4-FF 용출액 10000 83.35 3 2.50 0.6
세파크릴 S-100 용출액 1000 57.23 66 2.06 0.5
상기 표 4에 따르면, 상당량, 즉 57.2%의 BMP4가 부틸 4-FF에 결합하지 않고 컬럼 세척 과정에서 용리되었다는 것을 알 수 있다. 또한, 최종 정제 단계 후의 BMP4의 회수율은 0.5%에 불과하였다.
또한, 도 4에서 볼 수 있듯이, 세파크릴 S-100 용출액에 대해 BMP4에 대응되는 뚜렷한 단백질 밴드가 나타나지 않았다. 이는 정제된 BMP4의 순도가 매우 낮다는 것을 의미한다.
상기 결과에 비추어 볼 때, 특허문헌 1의 BMP2 정제방법으로는 BMP4 배양액에서 BMP4를 정제할 수 없다는 것을 알 수 있다.
5) 비교예 4
시료 희석배수
( Dilution Factor ) 		농도
( pg / ml ) 		부피
( ml ) 		총
BMP4
(μg) 		총
회수율
(%)
BMP4 세포배양액 1000 743.848 105 78.10 100.0
셀루핀 설페이트에 결합되지 않고 배출된 용액 1000 547.149 106 58.00 74.3
셀루핀 설페이트 세척액 1000 163.644 15 2.45 3.1
셀루핀 설페이트 용출액 1000 1423.12 12 17.08 21.9
여과된 셀루핀 설페이트 용출액 + NaCl 1000 1250.88 9 11.26 14.4
부틸 S FF에 결합되지 않고 배출된 용액 1000 453.036 15 6.80 8.7
부틸 S FF 용출액 1000 11.6078 10 0.12 0.2
상기 표 5에 따르면, 상당량, 즉 60.4%의 BMP4가 부틸 S-FF에 결합하지 않고 컬럼 세척 과정에서 용리되었다는 것을 알 수 있다. 또한, 최종 정제 단계 후의 BMP4의 회수율은 1.0%에 불과하였다.
또한, 도 5에서 볼 수 있듯이, 6번 줄에 나타난 부틸 S-FF에 결합되지 않고 배출된 용액에서는 BMP4 밴드를 확인할 수 있었지만, 부틸 S-FF 용출액에서는 어떠한 단백질 밴드도 나타나지 않았다. 따라서, 정제의 두 번째 단계인 부틸 S-FF를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 BMP4가 정제되지 않았음을 알 수 있었다.
상기의 결과에 비추어 볼 때, 특허문헌 2의 BMP7 정제방법으로는 BMP4 배양액에서 BMP4를 정제할 수 없는 것을 알 수 있다.
결론
본 발명의 BMP4 정제방법은 농축, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 총 4단계를 포함한다.
본 발명의 BMP4 정제방법에 있어서, 컬럼에서 용출되어 나온 용출액이 완충용액 교환이나 NaCl 처리 등 특별한 전처리 과정 없이, 바로 다음 단계에 주입된다. 이에 따라, 정제과정의 시간을 단축함으로써 단백질의 변성을 최소화할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 일반적으로 배양액이 처음으로 컬럼에 주입되는 단계에서 손상을 많이 받게 되는데, 본 발명의 정제방법에서는 배양액이 처음으로 컬럼에 주입되는 b)단계에서 친화성 수지를 쓰지 않고 이온교환 수지를 사용하기 때문에, 비용절감을 통해 공정 과정으로 용이하게 "스케일 업"할 수 있다는 장점이 있다.
상기한 바와 같이, 실시예 1에 따라 BMP4 배양액에서 BMP4를 정제하고, 이를 SDS-PAGE 방법을 통해 정성분석하고, ELISA 방법을 통해 정량분석한 결과, BMP4 배양액으로부터 BMP4는 97.9%의 고순도 및 24.3%의 최종 회수율로 정제되었다는 것이 입증되었다.
반면, 본 발명의 정제방법에 따라 BMP2를 정제한 비교예 1에서는, BMP2는 66.5%의 순도 및 48%의 최종 회수율로 정제되었다. 상기 BMP2의 정제 순도는 상대적으로 낮으며, 최종 회수율도 특허문헌 1에 비해 매우 낮은 것으로, 본 발명의 정제방법은 BMP2를 정제하는데 적합하지 않다.
또한, 본 발명의 정제방법에 따라 BMP7를 정제한 비교예 2에서는, 대부분의 BMP7(65.4%)가 친화성 크로마토그래피 단계에서 컬럼에 결합되지 세척과정에서 용리되어 회수되지 않았다. 즉, 본 발명의 정제방법은 BMP7를 정제하는데 적합하지 않다.
이에 따라, 비교예 1 및 비교예 2로부터 본 발명의 정제방법의 BMP4에 대한 특이성을 확인할 수 있다.
특허문헌 1의 BMP2 정제방법에 따라 BMP4를 정제한 비교예 3에서는, 대부분의 BMP4 (57.2%)가 부틸 4-FF에 결합하지 않고 용리되었다는 것을 알 수 있다. 또한, 특허문헌 2 BMP7 정제방법에 따라 BMP4를 정제한 비교예 4에서는, 대부분의 BMP4 (60.4%)가 부틸 S-FF에 결합하지 않고 컬럼 세척 과정에서 용리되어 나왔다는 것을 알 수 있다. 즉, 종래의 특허문헌 1 및 특허문헌 2의 정제방법으로는 BMP4를 정제할 수 없다.

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4: 골형성 단백질 4)의 정제방법:
    a) BMP4를 함유하는 용액을 10kDa 컷 오프의 분획 박막 필터(cut-off membrane filter)를 이용하여 농축하는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 수득된 용액에 누비아 Q(Nuvia Q) 수지가 충진된 컬럼을 이용한 이온교환 크로마토그래피를 적용하는 단계;
    c) 상기 b) 단계에서 수득된 용액에 셀루핀 설페이트 수지가 충진된 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피를 적용하는 단계; 및
    d) 상기 c) 단계에서 수득된 용액에 부틸 HP 수지가 충진된 컬럼을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 적용하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 BMP4를 함유하는 용액은 CHO 세포배양액인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계에서 분획 박막 필터를 이용하여 BMP4를 함유하는 용액의 부피를 1/10로 농축시키는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계의 이온교환 크로마토그래피는 i) Tris를 함유하는 완충액으로 컬럼을 평형화하는 단계; ii) 상기 컬럼에 상기 a) 단계에서 농축된 BMP4를 함유하는 용액을 로딩하는 단계; iii) Tris 및 NaCl을 함유하는 완충액으로 상기 컬럼을 세척하는 단계; 및 iv) Tris 및 NaCl을 함유하는 완충액으로 상기 컬럼을 용출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 b) 단계의 이온교환 크로마토그래피에서 사용되는 완충액의 pH 범위는 6 내지 8이고, Tris의 농도는 5 내지 50mM이고, NaCl의 농도는 0.1 내지 1M인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계의 친화성 크로마토그래피는 i) 히스티딘 및 NaCl을 함유하는 완충액으로 컬럼을 평형화하는 단계; ii) 상기 컬럼에 상기 b) 단계의 용출액을 로딩하는 단계; iii) 히스티딘, NaCl 및 아르기닌을 함유하는 완충액으로 상기 컬럼을 세척하는 단계; 및 iv) 히스티딘, NaCl 및 아르기닌을 함유하는 완충액으로 상기 컬럼을 용출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 c) 단계의 친화성 크로마토그래피에서 사용되는 완충액은 pH의 범위가 6 내지 8이고, 히스티딘의 농도는 5 내지 50mM이고, NaCl의 농도는 0.05M 내지 1M이고, 아르기닌의 농도는 0.5M 내지 1M인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 d) 단계의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 i) Tris 및 NaCl을 함유하는 완충액으로 컬럼을 평형화하는 단계; ii) 상기 컬럼에 상기 c) 단계의 용출액을 로딩하는 단계; iii) Tris, NaCl 및 프로필렌글리콜을 함유하는 완충액으로 상기 컬럼을 세척하는 단계; 및 iv) Tris, NaCl 및 프로필렌글리콜을 함유하는 완충액으로 상기 컬럼을 용출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 d) 단계의 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 사용되는 완충액은 pH의 범위가 6 내지 8이고, Tris의 농도는 5 내지 50mM이고, NaCl의 농도는 0.1M 내지 1M이고, 프로필렌글리콜의 농도는 0.5 부피% 내지 15 부피%인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
KR1020130168813A 2013-12-31 2013-12-31 골형성 단백질 4의 정제방법 KR101475484B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130168813A KR101475484B1 (ko) 2013-12-31 2013-12-31 골형성 단백질 4의 정제방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130168813A KR101475484B1 (ko) 2013-12-31 2013-12-31 골형성 단백질 4의 정제방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101475484B1 true KR101475484B1 (ko) 2014-12-23

Family

ID=52679671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130168813A KR101475484B1 (ko) 2013-12-31 2013-12-31 골형성 단백질 4의 정제방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101475484B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101759506B1 (ko) * 2016-12-15 2017-07-19 주식회사 셀루메드 Bmp7 복합체의 생산 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100991203B1 (ko) * 2010-05-10 2010-11-01 심영복 골형성 단백질의 정제 방법
KR101212499B1 (ko) * 2012-02-09 2012-12-14 주식회사 코리아본뱅크 골형성 단백질의 정제 방법
US20130196910A1 (en) * 2010-03-24 2013-08-01 Lifenet Health Bmp-4 peptides and methods of use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130196910A1 (en) * 2010-03-24 2013-08-01 Lifenet Health Bmp-4 peptides and methods of use
KR100991203B1 (ko) * 2010-05-10 2010-11-01 심영복 골형성 단백질의 정제 방법
KR101212499B1 (ko) * 2012-02-09 2012-12-14 주식회사 코리아본뱅크 골형성 단백질의 정제 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101759506B1 (ko) * 2016-12-15 2017-07-19 주식회사 셀루메드 Bmp7 복합체의 생산 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schwartz et al. Comparison of hydrophobic charge induction chromatography with affinity chromatography on protein A for harvest and purification of antibodies
KR101683415B1 (ko) 단일클론항체에 대한 정제 방법
US20200283472A1 (en) A process for purification of fc-fusion proteins
JP2005520550A (ja) 所望エリスロポエチングリコアイソフォームプロフィールの製造方法
DK3040346T3 (en) PROCEDURE FOR CLEANING THE GRANULOCYT COLONY STIMULATING FACTOR, G-CSF
KR101831300B1 (ko) 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법
KR101829860B1 (ko) 응고인자 ⅸ와 같은 비타민 ｋ 의존성 단백질을 정제하는 방법
EP2695889A1 (en) Protein purification by ion exchange
Capela et al. Sustainable strategies based on glycine–betaine analogue ionic liquids for the recovery of monoclonal antibodies from cell culture supernatants
CN112210002B (zh) 重组人血清白蛋白的纯化方法
HUE027724T2 (hu) Eljárás G-CSF tisztítására
AU2015279831A1 (en) Methods and reagents for purification of proteins
KR20160131113A (ko) 고나도트로핀의 신규한 정제 방법
EP2768846B1 (en) Methods for purifying erythropoietin analogs having lower isoelectric point
JP2016519144A (ja) 最小限の単量体の分離を伴う組換えポリクローナル多量体の分離
US10377812B2 (en) Method for efficient purification of human serum albumin
KR101475484B1 (ko) 골형성 단백질 4의 정제방법
FI119377B (fi) Menetelmä tekijän IX valmistamiseksi biologisista lähteistä
RU2643365C2 (ru) Способ очистки дарбэпоетина альфа
US20220267411A1 (en) Refining method of ophthalmic protein pharmaceutical
Girot et al. 2-Mercapto-5-benzimidazolesulfonic acid: an effective multimodal ligand for the separation of antibodies
Wang et al. Renaturation with simultaneous purification of rhG‐CSF from Escherichia coli by ion exchange chromatography
JP2014529330A (ja) 単一ユニットクロマトグラフィー抗体精製
KR840001516B1 (ko) 인체 섬유아세포 인터페론의 제조방법
Karabel’skii et al. Purification of the chimeric protein alburon16 from a culture medium of the yeast Pichia pastoris

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181105

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191106

Year of fee payment: 6