DE602004006157T2

DE602004006157T2 - Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein

Info

Publication number: DE602004006157T2
Application number: DE602004006157T
Authority: DE
Inventors: Mara Rossi; Thierry Ziegler; Laure Valognes
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2024-11-05
Also published as: SI1689777T1; HRP20070196T3; AU2004291341B2; ATE360647T1; NO330538B1; CA2544146A1; RS50516B; US7820800B2; NO20062545L; DE602004006157D1; IL175431A; EP1689777A1; CY1106683T1; PT1689777E; CA2544146C; ES2285543T3; DK1689777T3; JP4741504B2; AU2004291341A1; US20070037734A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich der Proteinreinigung. Im Spezielleren betrifft sie die Reinigung von IL-18-Bindungsprotein (IL-18BP) durch Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie (HCIC). Vorzugsweise umfasst die Erfindung weiterhin Reinigungsschritte, ausgewählt aus Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC), Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungchromatographie und reverse Phase-Chromatographie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteine sind kommerziell wichtig als Arzneimittel geworden, die auch allgemein als „biologische Mittel" bezeichnet werden. Eine der größten Herausforderungen ist die Entwicklung von kosteneffektiven und effizienten Verfahren zum Reinigen von Proteinen in einem kommerziellen Maßstab. Während nunmehr viele Verfahren für die Herstellung von Proteinen im großen Maßstab verfügbar sind, enthalten Rohprodukte, wie etwa Körperfluide, nicht nur das gewünschte Produkt, sondern auch Verunreinigungen, die schwer von dem gewünschten Produkt abzutrennen sind. Darüber hinaus enthalten biologische Quellen von Proteinen üblicherweise komplexe Gemische von Materialien.
Biologische Quellen, wie etwa Zellkulturüberstände von Zellen, die ein Proteinprodukt in einer rekombinanten Art exprimieren, können weniger Verunreinigungen enthalten, im Speziellen wenn die Zellen in einem serumfreien Medium gezüchtet werden. Jedoch verlangen die Gesundheitsbehörden hohe Standards hinsichtlich der Reinheit für Proteine, die zur Verabreichung an Menschen vorgesehen sind. Zusätzlich können viele Reinigungsverfahren Schritte enthalten, die die Anwendung von niederem oder hohem pH-Wert, hohen Salzkonzentrationen oder anderen extremen Bedingungen erfordern, die die biologische Aktivität eines gegebenen Proteins gefährden können. Daher ist es für jedes Protein eine Herausforderung, ein Reinigungsverfahren zu entwickeln, das eine ausreichende Reinheit erlaubt, während die biologische Aktivität des Proteins beibehalten wird.
Ionenaustauschchromatographiesysteme sind weit verbreitet zur Trennung von Proteinen, die primär auf der Basis von Unterschieden in der Ladung verwendet worden. Bei der Ionenaustauschchromatographie werden geladene Stellen auf der Oberfläche des Soluts angezogen durch entgegengesetzte Ladungen, die an eine Chromatographiematrix gebunden sind, vorausgesetzt die Ionenstärke des umgebenden Puffers ist gering. Flution wird im Allgemeinen erreicht durch Erhöhen der Ionenstärke (d.h. Leitfähigkeit) des Puffers, um mit dem Solut um die geladenen Stellen der Ionenaustauschmatrix zu konkurrieren. Veränderung des pH-Werts und dadurch Variieren der Ladung des Soluts ist ein anderer Weg zum Erreichen einer Flution des Soluts. Die Veränderung der Leitfähigkeit oder des pH-Werts kann graduell (Gradientenelution) oder stufenweise (Stufenelution) erfolgen.
Anionenaustauscher können klassifiziert werden als entweder schwach oder stark. Die Ladungsgruppe auf einem schwachen Anionenaustauscher ist eine schwache Base, die deprotoniert wird und daher ihre Ladung bei hohem pH-Wert verliert. DEAE-Cellulose ist ein Beispiel eines schwachen Anionenaustauschers, worin die Aminogruppe positiv geladen sein kann unterhalb des pH-Werts~9 und graduell ihre Ladung bei höheren pH-Werten verliert. Diethylaminoethyl (DEAE) oder Diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethyl (QAE) weisen z.B. Chlorid als Gegenion auf.
Ein starker Anionenaustauscher enthält auf der anderen Seite eine starke Base, die positiv über den pH-Wert-Bereich bleibt, der normalerweise für Ionenaustauschchromatographie verwendet wird (pH-Wert 1–14). Q-Sepharose (Q steht für quaternäres Ammonium) ist ein Beispiel für einen starken Anionenaustauscher.
Kationenaustauscher können auch als entweder schwach oder stark klassifiziert werden. Ein starker Kationenaustauscher enthält eine starke Säure (wie etwa eine Sulfopropylgruppe), die von pH-Wert 1–14 geladen bleibt; während ein schwacher Kationenaustauscher eine schwache Säure (wie etwa eine Carboxymethylgruppe) enthält, die graduell ihre Ladung verliert, wenn der pH-Wert unter 4 oder 5 abnimmt. Carboxymethyl (CM) und Sulfopropyl (SP) weisen z.B. Natrium als Gegenion auf.
Chromatographiesysteme, die eine hydrophobe stationäre Phase aufweisen, sind ebenfalls weit verbreitet verwendet worden bei der Reinigung von Proteinen. Eingeschlossen in dieser Kategorie sind hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie (HIC) und reverse Phase-Flüssigchromatographie (RPLC). Die physikochemische Grundlage für die Trennung durch HIC und RPLC ist die hydrophobe Wirkung; Proteine werden auf einer hydrophoben stationären Phase basierend auf Unterschieden in der Hydrophobizität aufgetrennt.
In der HIC werden im Allgemeinen Probemoleküle in einem Puffer mit hohem Salzgehalt auf die HIC-Säule aufgebracht. Das Salz im Puffer wechselwirkt mit Wassermolekülen, um die Solvatation der Moleküle in Lösung zu verringern, wobei hydrophobe Regionen in den Probemolekülen freigelegt werden, welche folglich durch die HIC-Säule adsorbiert werden. Umso mehr hydrophob das Molekül ist, umso weniger Salz ist erforderlich, um die Bindung zu fördern. Üblicherweise wird ein abnehmender Salzgradient verwendet, um Proben von der Säule zu eluieren. Wenn die Ionenstärke abnimmt, nimmt die Expositon der hydrophilen Regionen der Moleküle zu und die Moleküle eluieren von der Säule entsprechend zunehmender Hydrophobizität. Probenelution kann ebenfalls erreicht werden durch die Zugabe von milden organischen Modifizierern oder Detergenzien zu dem Elutionspuffer. HIC ist in einer Übersicht z.B. dargestellt in Protein Purification, 2. Ausgabe, Springer-Verlag, New York, Seiten 176–179 (1988).
Bei der HIC sind verschiedene Chromatographie-Träger verfügbar, die verschiedene Liganden aufweisen. Die Liganden unterscheiden sich in Bezug auf ihre Hydrophobizität. Üblicherweise verwendete hydrophobe Liganden sind Phenyl-, Butyl- oder Octylreste.
Hydrophobe Ladungsinduktionschromatographie ist eine Untergruppe von HIC, die Harze verwendet, welche Liganden tragen, wie etwa 4-Mercaptoethylpyridinderivate. Ein Beispiel für ein Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie-Harz ist MEP-HyperCel^® (Boschetti et al., Genetic Engineering Band 20, Nr. 13, Juli 2000, Boschetti und Jungbauer, 2000).
Reverse Phase-Chromatographie ist ein Proteinreinigungsverfahren, das eng verwandt mit HIC ist, da beide auf Wechselwirkungen zwischen durch Lösungsmittel zugänglichen nicht polaren Gruppen auf der Oberfläche von Biomolekülen und hydrophoben Liganden der Matrix basieren. Jedoch sind Liganden, die in der reverse Phase-Chromatographie verwendet werden, höher substituiert mit hydrophoben Liganden als HIC-Liganden. Während das Ausmaß der Substitution von HIC-Adsorbentien im Bereich von 10–50 μmol/ml Matrix von C2-C8-Arylliganden sein kann, werden üblicherweise mehrere hundert μmol/ml Matrix von C4-C8-Alkylliganden verwendet für reverse Phase-Chromatographieadsorbentien.
Hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie und reverse Phase-Chromatographie unterscheiden sich ebenfalls darin, dass hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie unter wässrigen Lösungsbedingungen durchgeführt wird und Veränderungen der Ionenstärke zum Eluieren der Säule verwendet werden. Das Protein bindet typischerweise im nativen Zustand über hydrophobe Gruppen, die auf der Oberfläche des Proteins lokalisiert sind und der native Zustand wird während der Elutionsbedingungen beibehalten. Im Gegensatz hierzu verwendet reverse Phase-Chromatographie ein hydrophobes Lösungsmittel (typischerweise Acetonitril) und die Bindung eines Liganden ist eine Funktion der Phaseverteilung zwischen der hydrophoben Natur des Lösungsmittels und der funktionellen Gruppe der Säule. Proteine werden typischerweise zu einem gewissen Ausmaß in solchen Lösungsmitteln denaturiert und Binden aufgrund der hydrophoben Natur der gesamten Polypeptidsequenz. Da der Hauptteil hydrophober Gruppen lokalisiert ist im Kern eines globulären Proteins ist die Bindung mit dem Ausmaß der Denaturierung des Proteins und der Zugriffsmöglichkeit dieser Gruppen auf die funktionellen Gruppen der Säule verbunden.
Die Source 30RPC-Säule ist eine polymere reverse Phase-Matrix. Sie basiert auf steifen, Polystyrol/Divinylbenzolkügelchen mit einem gleichförmigen Durchmesser von 30 Mikrometer. Ihre Charakteristika können wie folgt zusammengefasst werden: Außergewöhnlich weiter pH-Wert-Bereich (1–12), hohe Selektivität, hohe chemische Resistenz, hohe Kapazität und hohe Auflösung bei hohen Flussraten.
Ein weiterer Chromatographietyp, der weit verbreitet verwendet wird zur Proteinreinigung wird als Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) bezeichnet. 1975 führte Porath die Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) zum Fraktionieren von Proteinen ein [J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson und G. Belfrage, Nature (London) 258, 598–599 (1975)]. In Poraths Arbeit umfasst IMAC Derivatisieren eines Harzes mit Iminodiessigsäure (IDA) und Chelatisieren von Metallionen an das IDA-derivatisierte Harz. Die Proteine werden getrennt auf der Basis ihrer Affinität für Metallionen, die durch Chelatisierung immobilisiert worden sind. Proteine binden an die Metallionen über unbesetzte Koordinationsstellen und werden immobilisiert auf der Säule. Von da an wurden andere Liganden als IDA verwendet, um Metallionen an Harze zu chelatisieren. Untersuchungen mit Serumproteinen haben gezeigt, dass IMAC eine extrem spezifische und selektive Trenntechnik ist [J. Porath und B. Olin, Biochemistry 22, 1621–1630 (1983)]. Das Adsorbens wird hergestellt durch Koppeln eines Metallchelat-bildenden Liganden, wie etwa Iminodiessigsäure, an Sepharose oder Superose und Behandeln mit einer Lösung aus einem oder mehreren divalenten Metallionen, wie etwa Zn²⁺, Cu²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Co²⁺, Ni²⁺ oder Fe²⁺. Die Bindungsreaktion ist pH-Wert-abhängig und die Flution wird durchgeführt durch Verringern des pH-Werts und Erhöhen der Ionenstärke des Puffers oder durch Aufnehmen von EDTA im Puffer.
Die tatsächlichen Mechanismen, die zur Bindung von Proteinen an freie Metallionen führen, sind nicht gut verstanden und sind abhängig von einer Vielzahl von Faktoren, von welchen die Konformation des speziellen Proteins nicht der unwichtigste ist. Wenn jedoch die Metallionen immobilisiert sind, kommen zumindest drei limitierende Faktoren ins Spiel, nämlich verringerte Anzahl von verfügbaren Koordinationsstellen auf dem Metall, eingeschränkte Zugriffsmöglichkeit des gebundenen Metalls auf die Bindungsstellen auf dem Protein und, in Abhängigkeit von den Charakteristika des Harzes, limitierter Proteinzugang auf das immobilisierte Metallion. Daher ist es a priori extrem schwierig, festzustellen, welche Proteine eine Affinität für immobilisierte Metallionen zeigen werden und welche keine Affinität zeigen werden.
Interleukin-18-Bindungsprotein (IL-18BP) ist ein natürlich auftretendes lösliches Protein, das ursprünglich Affinitäts-gereinigt wurde, auf einer IL-18-Säule, aus Urin (Novick et al. 1999). IL-18BP hebt IL-18-Induktion von IFN-γ und IL-18-Aktivierung von NF-κB in vitro auf. Zusätzlich inhibiert IL-18BP die Induktion von IFN-γ in Mäusen, denen LPS injiziert wurde.
Das IL-18BP-Gen wurde lokalisiert auf dem humanen Chromosom 11 und kein Exon, das für eine Transmembrandomäne codiert, konnte in der 8.3 kb genomischen Sequenz, die das IL-18BP-Gen umfasst, gefunden werden. Vier Isoformen von IL-18BP, erzeugt durch alternatives mRNA-Spleißen, sind bisher in Menschen identifiziert worden. Sie wurden als IL-18BP a, b, c und d bezeichnet, wobei alle den gleichen N-Terminus aufweisen und sich im C-Terminus unterscheiden (Novick et al., 1999). Diese Isoformen unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit zum Binden von IL-18 (Kim et al., 2000). Von den vier humanen IL-18BP (hIL-18BP)-Isoformen sind die Isoformen a und c dafür bekannt, dass sie ein Neutralisierungsvermögen für IL-18 aufweisen. Die häufigste IL-18BP-Isoform, Isoform a, zeigt eine hohe Affinität für IL-18 mit einer schnellen Anschalt-Rate und einer langsamen Ausschalt-Rate, und einer Dissoziationskonstanten (Kd) von ungefähr 0,4 nM (Kim et al., 2000). IL-18BP wird konstitutiv exprimiert in der Milz und gehört zu der Immunglobulinsuperfamilie. Die Reste, die bei der Wechselwirkung von IL-18 mit IL-18BP umfasst sind, sind beschrieben worden durch die Verwendung von Computer-Modellierung (Kim et al., 2000) und basierend auf der Wechselwirkung zwischen dem ähnlichen Protein IL-1β mit dem IL-1R-Typ I (Vigers et al., 1997).
IL-18BP liegt konstitutiv in vielen Zellen vor (Puren et al., 1999) und befindet sich im Kreislauf gesunder Menschen (Urushihara et al., 2000), was ein einzigartiges Phänomen in der Cytokinbiologie darstellt. Aufgrund der hohen Affinität von IL-18BP für IL-18 (Kd = 0,4 nM) als auch der hohen Konzentration von IL-18BP, die im Kreislauf gefunden wird (20-fach molarer Überschuss gegenüber IL-18) ist spekuliert worden, dass die meisten, wenn nicht alle, der IL-18 Moleküle im Kreislauf gebunden sind an IL-18BP. Daher kann das im Kreislauf befindliche IL-18BP, das mit Zelloberflächenrezeptoren für IL-18 konkurriert, als ein natürliches Anti-Entzündung- und ein Immunsuppression-Molekül wirken.
IL-18BP ist vorgesehen worden als therapeutisches Protein in einer Vielzahl von Erkrankungen und Störungen, wie etwa Psoriasis, Crohnsche Krankheit, rheumatische Arthritis, Psoriasis-Arthritis, Leberschädigung, Sepsis, Ateriosklerose, ischämische Herzerkrankungen, Allergien usw., siehe z.B. WO9909063 , WO0107480 , WO0162285 , WO0185201 , WO02060479 , WO02096456 , WO03080104 , WO02092008 , WO02101049 , WO03013577 . Vorausgesetzt, dass IL-18BP als ein therapeutisches Protein zur Verabreichung z.B. an Menschen, vorgesehen wird, besteht ein Bedarf für geeignete Mengen von IL-18BP in ausreichend hoher Reinheit.
Bisher jedoch ist kein Reinigungsverfahren verfügbar, das gereinigtes IL-18BP bereitstellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entwicklung eines Reinigungsverfahrens für IL-18-Bindungsprotein (IL-18BP).
Daher betrifft die Erfindung unter einem ersten Aspekt die Verwendung von Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie zur Reinigung von IL-18BP.
Unter einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von IL-18-Bindungsprotein (IL-18-BP) aus einem Fluid, umfassend einen Schritt der Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie.
Im Spezielleren umfasst das Reinigungsverfahren der Erfindung weiterhin einen Schritt, ausgewählt aus immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie und reverse Phase-Chromatographie.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine schematische Übersicht über ein bevorzugtes Reinigungsverfahren der Erfindung, das zu gereinigtem IL-18BP („IL-18BP BULK") führt.
2 zeigt die Dosis-Antwort-Kurven von IL-18BP-Referenzmaterial im Kg-1 in vitro-Bioassay in 10 unabhängigen Versuchen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entwicklung eines Reinigungsverfahrens für IL-18BP, das zu gereinigtem IL-18BP führt.
In einer ersten Hinsicht betrifft die Erfindung die Verwendung von Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie zur Reinigung von IL-18BP. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieser Schritt der Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie ausgeführt in Kombination mit einem oder mehreren Schritten, ausgewählt aus immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie und reverse Phase-Chromatographie.
Vorzugsweise wird der Hydrophob-Ladungsinduktionsschritt ausgeführt auf einem 4-Mercaptoethylpyridin-MEP-Harz.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Hydrophob-Ladungsinduktionsschritt durchgeführt in einer Kombination mit einem oder mehreren Schritten, ausgewählt aus Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie, und reverse Phase-Chromatographie. Die einzelnen Chromatographieschritte können in einer beliebigen geeigneten Reihenfolge durchgeführt werden.
In einer zweiten Hinsicht betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von IL-18-Bindungsprotein (IL-18BP) aus einem Fluid, umfassend einen Schritt der Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie.
Der Ausdruck „Harz" betrifft, wie er hier verwendet wird, eine Matrix oder ein Träger-Material, das verwendet wird in einer Chromatographiesäule, wie etwa z.B. Agarose, Sepharose, Superose, Dextran, Sephadex, Polypropylen oder dgl., das derivatisiert sein kann mit Liganden oder funktionellen Gruppen, wie etwa DEAE, CM, MEP, Phenyl; wie z.B. im Detail ausgeführt in „Hintergrund der Erfindung". Die Matrixmaterialien können in verschiedenen quervernetzten Formen vorliegen, in Abhängigkeit von der spezifischen Anwendung. Das Volumen des Harzes, als auch die Länge und der Durchmesser der Säule, die zu verwenden sind, hängen von mehreren Parametern ab, wie etwa dem Volumen des zu behandelnden Fluids, Konzentration an Protein in dem Fluid, das dem Verfahren der Erfindung zu unterziehen ist, usw., und das Bestimmen hiervon ist im Bereich des Fachwissens eines Fachmanns.
Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie wird vorzugsweise durchgeführt auf einem Harz mit 4-Mercaptoethylpyridin (MEP) als immobilisierter Ligand. MEP-Hypercel^® ist ein Harz, das besonders geeignet ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren mindestens einen Schritt, ausgewählt aus Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie und reverse Phase-Chromatographie. Die einzelnen Chromatographieschritte können in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden. Jeder einzelne Schritt kann ebenfalls mehr als einmal, falls dies erforderlich ist, durchgeführt werden.
Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie wird vorzugsweise durchgeführt auf einem chelatisierenden Harz, wie etwa chelatisierender Sepharose.
Der Ionenaustauscherchromatographieschritt kann einen Anionenaustauscher oder einen Kationenaustauscher umfassen. Es ist bevorzugt einen Kationenaustausch-Chromatographiematerial, insbesondere ein schwaches Kationenaustauschmaterial, zu verwenden, und es ist besonders bevorzugt, ein Carboxymethyl-(CM)-Harz zu verwenden, wie etwa CM Sepharose FF, um diesen Schritt des Reinigungsverfahrens durchzuführen.
Der hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie-(HIC)-Schritt kann auf einem beliebigen bekannten HIC-Harz, wie etwa einem Harz mit Alkyl- oder Arylresten als immobilisiertem Ligand, durchgeführt werden. Butyl-, Octyl- oder Phenyl-Sepharose (Agarose) sind weitere Beispiele solcher HIC-Harze. Es ist bevorzugt ein Phenylharz, wie etwa Phenylsepharose FF, für diesen Schritt des Reinigungsverfahrens zu verwenden.
Das Reinigungsverfahren kann weiterhin einen reverse Phase-Chromatographieschritt umfassen. Ein bevorzugtes Material für diesen Schritt ist die Reverse Phase-Source 30 RPC^®.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Reinigung von IL-18BP aus einem Fluid die Schritte:

(a) Unterziehen des Fluids einer Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC);
(b) Unterziehen des Eluats der Metallionen-Affinitätschromatographie einer Hydrophob-Ladungswechselwirkungschromatographie;
(c) Unterziehen des Eluats der Hydrophob-Ladungswechselwirkungschromatographie einer Kationenaustauschchromatographie;
(d) Unterziehen des Durchflusses der Kationenaustauschchromatographie einer Hydrophob-Wechselwirkung-Chromatographie;
(e) Unterziehen des Eluats der Hydrophob-Wechselwirkung-Chromatographie einer reverse Phase-Chromatographie.

Während die Reihenfolge der obigen Schritte (a) bis (e) bevorzugt ist, können die Schritte des Verfahrens der Erfindung in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden, die zu einem gereinigten Proteinprodukt führt. Jeder Reinigungsschritt der Erfindung kann ebenfalls alleine (isoliert) durchgeführt werden, um einen gewissen Reinheitsgrad oder eine gewisse Eliminierung von Wirtszell- oder von aus Medium stammenden Verunreinigungen zu erreichen. Es ist festzuhalten, dass in diesem bevorzugten Reinigungsverfahren IL-18BP nicht an das Kationaustauschharz bindet und daher der Durchfluss dieser Säule für eine weitere Verarbeitung verwendet wird. Die anderen Harze, die im Rahmen des Reinigungsverfahrens der Erfindung verwendet werden, binden IL-18BP, während die Verunreinigungen nicht binden. Nach den Bindungs- und Waschschritten wird IL-18BP unter bestimmten Bedingungen eluiert. In diesen Schritten wird das Eluat jeweils werter verwendet.
Schritt (a) wird vorzugsweise durchgeführt auf einer Chelatierungssepharosesäule, wie etwa einer chelatisierenden Sepharoseschnellflusssäule, mit chelatisierten Zn²⁺-Ionen. Vorzugsweise wird das Binden von IL-18BP bei einem pH-Wert von 8,5 ± 0,1, vorzugsweise in 50 mM Natriumphosphat und 0,5 M NaCl mit diesem pH-Wert durchgeführt. Ein Waschschritt kann mit 15 mM Ammoniumchlorid im Äquilibrationspuffer durchgeführt werden. Flution wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 9,0 ± 0,5, z.B. bei pH-Wert 8,7 oder bei pH-Wert 9, z.B. in 0,075 M Ammoniumacetat oder in 0,06 M Ammoniumacetat mit diesem pH-Wert, durchgeführt.
Schritt (b) wird vorzugsweise auf einer MEP (4-Mercaptoethylpyridinderivat)-Säule, wie etwa MEP HyperCel^® (LifeSciences), durchgeführt. Die Bindung von IL-18BP wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,1 ± 0,1, z.B. in PBS 1X + 1 NaCl mit diesem pH-Wert, durchgeführt. Die Flution wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8,4 ± 0,1, z.B. in 20 mM Phosphatpuffer plus 35 % Propylenglycol, durchgeführt, wobei das Gemisch einen pH-Wert von 8,4 ± 0,1 aufweist.
Schritt (c) wird vorzugsweise auf einer Carboxymethyl-Sepharose (CM)-Säule durchgeführt. Dies ist ein Schritt, in welchem der Durchfluss für eine weitere Reinigung gesammelt wird. Dieser Schritt basiert auf der Tatsache, dass unter spezifischen Umständen, die z.B. mit dem Salz und den pH-Wert-Bedingungen in Verbindung stehen, IL-18BP nicht an das Harz bindet, während Verunreinigungen (z.B. Wirtszellproteine, von Serum stammende Proteine) daran gebunden werden. Vorzugsweise wird Schritt (c) durchgeführt bei einem pH-Wert von 6,0 ± 0,2, zum Beispiel in der Gegenwart von 1 mM MES (N-Morpholinethansulfonsäure).
Schritt (d) wird vorzugsweise auf einer Phenylsepharosesäule, wie etwa einer Phenylsepharose-Fast-Flow-Säule, durchgeführt. Vorzugsweise wird das Binden von IL-18BP durchgeführt bei einem pH-Wert von etwa 9,1 ± 0,2, z.B. in 50 mM Natriumborat und 0,9 M Ammoniumsulfat oder 0,10 M Ammoniumsulfat, welche diesen pH-Wert aufweisen. Die Flution von der Phenylsepharosesäule wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 9,1 ± 0,2 in der Gegenwart einer erhöhten Salzkonzentration durchgeführt, wie etwa in 50 mM Natriumborat, 9,1 ± 0,2, 0,15 M Ammoniumsulfat, mit diesem pH-Wert.
Schritt (e) wird vorzugsweise auf einer Source 30 RPC-Säule durchgeführt. Die Bindung von IL-18BP an das Säulenmaterial wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 9,1 ± 0,2 durchgeführt, z.B. in 50 mM Natriumboratpuffer. Flution wird vorzugsweise durchgeführt unter Verwendung eines Gradienten, wobei IL-18BP bei etwa 28–32 % 0,1 %-iger Trifluoessigsäure (TFA) in Acetonitril eluiert wird.
Es versteht sich, dass die Bedingungen, die oben in Verbindung mit den Schritten (a) bis (e) der Reinigung beschrieben sind, ebenfalls angewendet werden können beim Durchführen einzelner Schritte der Erfindung oder bei der Durchführung von (Unter)-Kombinationen der Schritte.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Reinigungsverfahrens können ein oder mehrere Ultrafiltrationsschritte durchgeführt werden. Ultrafiltration ist geeignet zur Entfernung von Komponenten mit kleinem Molekulargewicht aus den Eluaten, die aus vorhergehenden Chromatographieschritten resultieren. Diese Ultrafiltration erlaubt das Entfernen von organischem Lösungsmittel, TFA und Salzen des vorhergehenden Schritts, um das IL-18BP in dem Massepuffer zu äquilibrieren und zum Konzentrieren des Moleküls auf die gewünschte Konzentration. Eine solche Ultrafiltration kann z.B. durchgeführt werden auf Ultrafiltrationsmedium, das Komponenten ausschließt, die ein Molekulargewicht unter 5 kDa aufweisen.
Vorzugweise wird Ultrafiltration durchgeführt zwischen den Schritten (b) und (c) und/oder nach Schritt (e). Mehr bevorzugt werden zwei Ultrafiltrationsschritte durchgeführt, einer zwischen den Schritten (b) und (c) und einer nach Schritt (e).
Wenn das Protein, das gemäß des Verfahrens der Erfindung gereinigt wird, vorgesehen ist zur Verabreichung an Menschen, ist es weiterhin vorteilhaft ein oder mehrere Schritte der Virusentfernung in dem Verfahren aufzunehmen. Vorzugsweise wird ein Virusentfernungsfiltrationsschritt zwischen den Schritten (d) und (e) durchgeführt. Es ist weiterhin bevorzugt, dass ein Virusentfernungsfiltrationsschritt durchgeführt wird nach Schritt (e). Mehr bevorzugt umfasst das Verfahren mindestens zwei Virusentfernungsschritte, von welchen einer zwischen den Schritten (d) und (e) durchgeführt wird, wobei der andere nach Schritt (e) durchgeführt wird.
Wenn das Anfangsvolumen des Fluids, aus welchem IL-18BP gereinigt wird, groß ist, kann es vorteilhaft sein, das Volumen des Materials zu verringern durch Einfangen des Proteins und sein Resuspendieren in einem kleineren Puffervolumen vor dem eigentlichen Starten des Reinigungsverfahrens.
Daher umfasst das Verfahren der Erfindung weiterhin vorzugsweise einen Anfangseinfangschritt, d.h. einen Schritt, der durchgeführt wird bevor einer der oben genannten Reinigungsschritte durchgeführt wird und vorzugsweise vor Schritt (a) des obigen Verfahrens.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Einfangschritt durch Ionenaustauschchromatographie durchgeführt. Vorzugsweise ist das Ionenaustauschharz, das für den Einfangschritt verwendet wird, eine starke Anionenaustauschermatrix, wie etwa z.B. Q Sepharose Fast Flow. Es ist besonders bevorzugt Trimethylaminoethyl-derivatisiertes Harz, wie etwa TMAE Fractogel^® (oder TMAE HiCap^®), als Ionenaustauschmaterial zu verwenden. Vorteilhafterweise kann der Einfangschritt > 60 % der gesamten Verunreinigungen, die in dem Rohmaterial vorliegen, entfernen.
Zum Erleichtern der Aufbewahrung oder des Transports kann das Material z.B. eingefroren und aufgetaut werden, vor und/oder nach einem Reinigungsschritt der Erfindung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann IL-18BP, das zu reinigen ist, nativ sein, d.h. natürlich auftretendes IL-18BP sein. Es kann so aus jeder natürlichen Quelle oder jedem natürlichen Material gereinigt werden, wie etwa z.B. aus Körperfluiden, wie etwa Urin.
IL-18BP kann ebenfalls von einer tierischen oder humanen Quelle stammen. Vorzugsweise ist das zu reinigende IL-18BP human und mehr bevorzugt ist es rekombinates IL-18BP. Rekombinantes IL-18BP kann in prokaryontischen Expressionssystemen, wie etwa in Bakteriensystemen, wie etwa Escherichia coli, produziert werden. Es kann ebenfalls produziert bzw. erzeugt bzw. hergestellt werden in eukaryontischen Expressionssystemen, wie etwa Hefe, Insekten oder Säugerzellen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, IL-18BP in Säugerzellen, wie etwa tierischen Zelllinien oder in humanen Zelllinien, zu exprimieren. Chinese hamster-Ovarzellen (CHO) sind ein Beispiel einer Zelllinie, die besonders geeignet für die Expression von IL-18BP ist.
Wenn zu reinigendes IL-18BP exprimiert wird durch Säugerzellen, die es sekretieren, ist das Ausgangsmaterial des Reinigungsverfahrens der Erfindung Zellkulturüberstand, der ebenfalls als Ernte- oder rohes IL-18BP bezeichnet wird. Wenn die Zellen in einem Medium kultiviert werden, das Tierserum enthält, enthält der Zellkulturüberstand auch Serumproteine als Verunreinigungen.
Vorzugsweise werden die IL-18BP-exprimierenden Zellen unter serumfreien Bedingungen gezüchtet bzw. kultiviert. In diesem Falle ist das Ausgangsmaterial des Reinigungsverfahrens der Erfindung serumfreier Zellkulturüberstand, der hauptsächlich Wirtszellproteine als Verunreinigungen enthält. Wenn Wachstumsfaktoren zu dem Zellkulturmedium zugegeben werden, wie etwa z.B. Insulin, werden diese Proteine ebenfalls vorzugsweise während des Reinigungsverfahrens eliminiert.
Da IL-18BP ein lösliches, sekretiertes Protein ist, wird es in den Zellkulturüberstand freigesetzt, entweder mittels seines natürlichen Signalpeptids oder mittels eines heterologen Signalpeptids, d.h. ein Signalpeptid, das von einem anderen sekretierten Protein stammt, das mehr effizient in dem speziellen verwendeten Expressionssystem sein kann. Das Fluid, aus welchem IL-18BP gereinigt wird, ist daher vorzugsweise Zellkulturüberstand, wie etwa z.B. CHO-Zell-Überstand. Zellkulturüberstand kann von einem Tier stammendes Serum umfassen, falls Zellen in Serumenthaltendem Medium kultiviert werden. Es ist bevorzugt das Protein von dem Überstand von Zellen zu reinigen, die in serumfreiem Medium gezüchtet wurden, d.h. in Kulturmedium, das kein Serum enthält, das von fötalem Kalb oder anderen tierischen Quellen stammt.
Der Ausdruck „IL-18 Bindungsprotein" wird hier synonym mit „IL-18BP" verwendet. Dieser Ausdruck betrifft IL-18 Bindungsproteine, wie etwa diejenigen, die in WO 99/09063 oder in Novick et al., 1999, definiert sind. Der Ausdruck IL-18BP umfasst Spleiß-Varianten und/oder Isoformen von IL-18 Bindungsproteinen, wie diejenigen, die definiert sind in Kim et al., 2000, im Besonderen humane Isoformen a und c von IL-18BP. Der Ausdruck „IL-18BP", wie er hier verwendet wird, umfasst weiterhin Muteine, funktionelle Derivate, aktive Fraktionen, fusionierte Proteine, im Kreislauf permutierte Proteine und Salze von IL-18BP, wie in WO 99/09063 definiert.
Das IL-18BP, das dem Reinigungsverfahren gemäß der Erfindung unterzogen wird, kann glykosyliert oder nichtglykosyliert sein, es kann aus natürlichen Quellen, wie etwa Urin, stammen oder es kann vorzugsweise rekombinant erzeugt werden. Rekombinante Expression kann in prokaryontischen Expressionssystemen, wie etwa E. coli, oder in eukaryontischen Expressionssystemen, und vorzugsweise in Säugerexpressionssystemen, durchgeführt werden.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Muteine" Analoga eines IL-18BP oder Analoga eines viralen IL-18BP, worin ein oder mehrere der Aminosäurereste eines natürlichen IL-18BP oder viralen IL-18BP ersetzt sind durch verschiedene Aminosäurereste, oder deletiert sind, oder ein oder mehrere Aminosäurereste zu der natürlichen Sequenz eines IL-18BP oder eines viralen IL-18BP hinzugefügt sind, ohne bemerkenswerte Veränderung der Aktivität des resultierenden Produkts im Vergleich mit dem Wildtyp-IL-18BP oder viralen IL-18BP. Diese Muteine werden hergestellt durch bekannte Synthesen und/oder durch stellengerichtete Mutagenesetechniken oder durch eine beliebige andere bekannte Technik, die hierfür geeignet ist.
Muteine gemäß den obigen Ausführungen umfassen Proteine, die durch eine Nukleinsäure, wie etwa DNA oder RNA codiert werden, die an DNA oder RNA hybridisiert, die für ein IL-18BP codiert oder für ein virales IL-18BP codiert (beide offenbart in WO99/09063 ) unter stringenten Bedingungen. Der Ausdruck „stringente Bedingungen" betrifft Hybridisierungs- und nachfolgende Waschbedingungen, die der Fachmann als „stringent" bezeichnet. Siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 und 6.4 (1987, 1992). Ohne Einschränkung umfassen Beispiele stringenter Bedingungen Waschbedingungen von 12–20 °C unter der berechneten Tm des Hybrids, das untersucht wird, in z.B. 2 × SSC und 0,5 % SDS für 5 Minuten, 2 × SSC und 0,1 % SDS für 15 Minuten; 0,1 × SSC und 0,5 % SDS bei 37 °C für 30–60 Minuten und dann 0,1 × SSC und 0,5 % SDS bei 68 °C für 30–60 Minuten. Der Fachmann weiß, dass stringente Bedingungen ebenfalls von der Länge der DNA-Sequenzen, den Oligonukleotidsonden (etwa 10–40 Basen) oder gemischten Oligonukleotidsonden abhängen. Wenn gemischte Sonden verwendet werden, ist es bevorzugt, Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) anstelle von SSC zu verwenden. Siehe Ausubel, supra.
Identität reflektiert eine Beziehung zwischen zwei oder mehreren Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehren Polynukleotidsequenzen, bestimmt durch Vergleichen der Sequenzen. Im Allgemeinen betrifft Identität ein exaktes Entsprechen von Nukleotid zu Nukleotid oder Aminosäure zu Aminosäure von zwei Polynukleotiden bzw. zwei Polypeptidsequenzen über die Länge der zu vergleichenden Sequenzen.
Für Sequenzen, worin kein exaktes Übereinstimmen vorliegt, kann eine „%-Identität" bestimmt werden. Im Allgemeinen werden die zwei zu vergleichenden Sequenzen aligned bzw. ausgerichtet, um eine maximale Korrelation zwischen den Sequenzen zu ergeben. Dies kann das Insertieren von „Gags" bzw. „Lücken" in eine oder beide Sequenzen umfassen, um das Alignment-Ausmaß zu verbessern. Eine %-Identität kann bestimmt werden über die gesamte Länge jeder der Sequenzen, die zu vergleichen sind (sogenanntes globales Alignment), das besonders geeignet ist für Sequenzen mit der gleichen oder sehr ähnlichen Länge, oder über kürzere, definierte Längen (sogenanntes lokales Alignment), das geeigneter für Sequenzen mit ungleicher Länge ist.
Verfahren zum Vergleichen der Identität und Homologie von zwei oder mehreren Sequenzen sind in der Technik allgemein bekannt. So können zum Beispiel Programme, die erhältlich sind in der Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 9.1 (Devereux J. et al., 1984) zum Beispiel die Programme BESTFIT und GAP, verwendet werden, um die %-Identität zwischen zwei Polynukleotiden und die %-Identität und die %-Homologie zwischen zwei Polypeptidsequenzen zu bestimmen. BESTFIT verwendet den „lokale Homologie"-Algorithmus von Smith und Waterman (1981) und findet die beste Ähnlichkeitseinzelregion zwischen zwei Sequenzen. Andere Programme zum Bestimmen der Identität und/oder Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind ebenfalls in der Technik bekannt, zum Beispiel die Programme der BLAST-Familie (Altschul, S.F. et al., 1990, Altschul, S.F., et al., 1997, auf welche zugegriffen werden kann über die Homepage des NCBI unter www.ncbi.nim.nih.gov) und FASTA (Pearson, W.R., 1990).
Jedes solche Mutein weist vorzugsweise eine Sequenz von Aminosäuren auf, die ausreichend duplikativ sind für die eines IL-18BP, oder ausreichend duplikativ sind für ein virales IL-18BP, um im Wesentlichen ähnliche Aktivität wie IL-18BP aufzuweisen. Eine Aktivität von IL-18BP ist seine Fähigkeit zum Binden von IL-18. Solange das Mutein eine wesentliche Bindungsaktivität für IL-18 aufweist, kann es bei der Reinigung von IL-18 verwendet werden, wie etwa mittels Affinitätchromatographie, und so kann es derart betrachtet werden, dass es ähnliche Aktivität wie IL-18BP aufweist. So kann bestimmt werden, ob ein gegebenes Mutein im Wesentlichen die gleiche Aktivität aufweist wie IL-18BP, mittels Routineversuchen, umfassend z.B. das Unterziehen eines solchen Muteins einem einfachen Sandwich-Konkurrenz-Assay, um zu bestimmen, ob es an ein geeignet markiertes IL-18 bindet oder nicht, wie etwa mittels eines Radioimmunoassays oder ELISA-Assays.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat jedes solche Mutein, das zu Reinigen ist, mindestens 40 % Identität oder Homologie mit der Sequenz von entweder einen IL-18BP oder einem viral-codierten IL-18BP-Homologen, wie in WO 99/09063 definiert. Mehr bevorzugt hat es mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 % oder am meisten bevorzugt mindestens 90 % Identität oder Homologie hierzu.
Muteine von IL-18BP-Polypeptiden oder Muteine von viralen IL-18BPs, die gemäß der vorliegenden Erfindung gereinigt werden können, oder Nukleinsäuren, die hierfür codieren, umfassen einen begrenzten Satz von im Wesentlichen entsprechenden Sequenzen als Substitutionspeptide oder Polynukleotide, die routinemäßig erhalten werden können durch den Fachmann, ohne unnötige Versuche, basierend auf den Techniken und Anleitungen, die hier gegeben sind.
Bevorzugte Veränderungen für Muteine gemäß der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die bekannt sind als „konservative" Substitutionen. Konservative Aminosäuresubstitutionen von IL-18BP-Polypeptiden oder Proteinen oder viralen IL-18BPs können synonyme Aminosäuren innerhalb einer Gruppe sein, die ausreichend ähnliche physikochemische Eigenschaften aufweisen, sodass die Substitution zwischen Mitgliedern der Gruppe die biologische Funktion des Moleküls beibehalten werden (Grantham, 1974). Es ist klar, dass Insertionen und Deletionen von Aminosäuren ebenfalls in den oben definierten Sequenzen durchgeführt werden können, ohne Veränderung ihrer Funktion, im Besonderen wenn die Insertionen oder Deletionen nur ein paar wenige Aminosäuren umfassen, z.B. unter dreißig und vorzugsweise unter zehn, und Aminosäuren, die kritisch für eine funktionale Konformation sind, z.B. Cysteinreste, nicht entfernen oder versetzen. Proteine und Muteine, die durch solche Deletionen und/oder Insertionen erzeugt werden, fallen in den Bereich der vorliegenden Erfindung.

Vorzugsweise sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, die in Tabelle 1 definiert sind. Mehr bevorzugt sind die synonymen Aminosäuregruppen, diejenigen, die in Tabelle 2 definiert sind; und am meisten bevorzugt sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, die in Tabelle 3 definiert sind. TABELLE 1 Bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren

Aminosäuren	synonyme Gruppe
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val. Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

TABELLE II Mehr bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren

Aminosäure	synonyme Gruppe
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gln, Arg
Gln	Glu, Gln, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gln
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp

TABELLE III Am meisten bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren

Aminosäure	synonyme Gruppe
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gln	Gln
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Met

Beispiele der Erzeugung von Aminosäuresubstitutionen in Proteinen, die verwendet werden können zum Erhalten von Muteinen von IL-18BP Polypeptiden oder Proteinen oder Muteinen von viralen IL-18BPs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen alle bekannten Verfahrensschritte, wie etwa dargestellt in den U.S. Patenten 4,959,314 , 4,588,585 und 4,737,462 von Mark et al.; 5,116,943 von Koths et al., 4,965,195 von Namen et al.; 4,879,111 von Chong et al.; und 5,017,691 von Lee et al.; und Lysin-substutierte Proteine, die im U.S. Patent Nr. 4,904,584 (Shaw et al.) dargestellt sind.
Der Ausdruck „fusioniertes Protein" betrifft ein Polypeptid, umfassend ein IL-18BP oder ein virales IL-18BP, oder ein Mutein oder ein Fragment davon, fusioniert mit einem anderen Protein, das z.B. eine ausgedehnte Verweilzeit in Körperfluiden hat. Ein IL-18BP oder ein virales IL-18BP kann so fusioniert sein an ein anderes Protein, Polypeptid oder dgl., z.B. ein Immunglobulin oder ein Fragment davon.
Wie hier verwendet, umfassen „funktionelle Derivate" Derivate von IL-18BPs oder einem viralen IL-18BP und ihre Muteine und fusionierten Proteine, die hergestellt werden können aus den funktionellen Gruppen, die als Seitenketten auf den Resten oder den N- oder C-terminalen Gruppen auftreten, durch im Stand der Technik bekannte Mittel, und sind von der Erfindung umfasst, solange sie pharmazeutisch verträglich bleiben, d.h., dass sie die Aktivität des Proteins nicht zerstören, welche im Wesentlichen ähnlich der Aktivität von IL-18BP oder viralen IL-18BPs ist und keine toxischen Eigenschaften auf Zusammensetzungen übertragen, die sie enthalten.
Diese Derivate können z.B. Polyethylenglykolseitenketten umfassen, die antigene Stellen maskieren können und die Verweilzeit eines IL-18BP oder eines viralen IL-18BP in Körperfluiden ausdehnen können. Andere Derivate umfassen aliphatische Ester der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen durch Reaktion mit Ammoniak oder mit primären und sekundären Aminen, N-Acylderivate freier Aminogruppen der Aminosäurereste, gebildet mit Acylgruppen (z.B. Alkanoyl- oder carbocyclische Aroylgruppen) oder O-Acylderivate freier Hydroxylgruppen (z.B. diejenigen mit Seryl oder Threonylresten), gebildet mit: Acylgruppen.
Als „aktive Fraktionen" eines IL-18BP oder eines viralen IL-18BP, Muteine und fusionierte Proteine, umfasst die vorliegende Erfindung jedes Fragment oder alle Vorläufer der Polypeptidkette des Proteinmoleküls alleine oder zusammen mit assoziierten Molekülen oder Resten, die daran gebunden sind, z.B. Zucker- oder Phosphatreste oder Aggregate des Proteinmoleküls oder die Zuckerreste an sich, vorausgesetzt, dass die Fraktion im Wesentlichen ähnliche Aktivität wie IL-18BP aufweist.
Der Ausdruck „Salze" betrifft hier sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säurezugabesalze von Aminogruppen von IL-18-Inhibitormolekülen oder Analoga davon. Salze einer Carboxylgruppe können gebildet werden durch in der Technik bekannte Mittel und umfassen anorganische Salze, z.B. Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen-(III)- oder Zinksalze und dgl. und Salze mit organischen Basen, wie etwa diejenigen, die z.B. gebildet werden mit Aminen, wie etwa Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und dgl.. Säurezugabesalze umfassen z.B. Salze mit Mineralsäuren, wie etwa z.B. Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie etwa z.B. Essigsäure oder Oxalsäure. Natürlich muss jedes solche Salz die biologische Aktivität des IL-18-Inhibitors beibehalten, wie etwa Induktion von IFN-Gamma in Blutzellen.
Die Sequenzen von IL-18BP und seiner Spleißvarianten/Isoformen können aus WO99/09063 von Novick et al., 1999 als auch von Kim et al., 2000, entnommen werden.
Funktionale Derivate von IL-18BP können konjugiert werden an Polymere, um die Eigenschaften des Proteins zu verbessern, wie etwa die Stabilität, Halbwertszeit, Bioverfügbarkeit, Toleranz durch den humanen Körper oder Immunogenität. Zum Erreichen dieses Ziels kann IL-18BP z.B. verknüpft werden mit Polyethylenglykol (PEG). PEGylierung kann durchgeführt werden durch bekannte Verfahren, die z.B. beschrieben sind in WO 92/13095 . Daher umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform das funktionelle Derivat mindestens eine Gruppe, die an eine oder mehrere funktionelle Gruppen gebunden ist, die als eine oder mehrere Seitenketten auf den Aminosäureresten auftreten. Eine Ausführungsform, worin die Gruppe eine Polyethylenglykol (PEG)-Gruppe ist, ist besonders bevorzugt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst IL-18BP eine Immunglobulinfusion, d.h. der Inhibitor von IL-18 ist ein fusioniertes Protein, umfassend das gesamte oder einen Teil eines IL-18-Bindungsproteins, das an das gesamte oder einen Teil eines Immunglobulins fusioniert ist. Verfahren zum Herstellen von Immunglobulinfusionsproteinen sind in der Technik allgemein bekannt, wie etwa diejenigen, die in WO 01/03737 zum Beispiel beschrieben sind. Der Fachmann in der Technik wird verstehen, dass das resultierende Fusionsprotein der Erfindung die biologische Aktivität von IL-18BP erhält, im Besonderen die Bindung an IL-18. Die Fusion kann direkt sein oder über ein kurzes Linkerpeptid, das so kurz sein kann, wie etwa 1 bis 3 Aminosäurereste in der Länge oder länger, z.B. 13 Aminosäurereste in der Länge. Der Linker kann ein Tripeptid mit der Sequenz E-F-M (Glu-Phe-Met) zum Beispiel sein, oder eine 13 Aminosäurelinkersequenz, umfassend Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, eingeführt zwischen der IL-18BP-Sequenz und der Immunglobulinsequenz. Das resultierende Fusionsprotein hat verbesserte Eigenschaften, wie etwa eine ausgedehnte Verweilzeit in Körperfluiden (Halbwertszeit), erhöhte spezifische Aktivität, erhöhten Expressionsgrad oder die Reinigung des Fusionsproteins ist erleichtert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird IL-18BP fusioniert an die konstante Region eines Ig-Moleküls. Vorzugsweise wird es fusioniert an schwere-Kette-Regionen, wie die CH2- und CH3-Domänen von humanem IgG1 zum Beispiel. Die Erzeugung von spezifischen Fusionsproteinen, umfassend IL-18BP und einen Teil eines Immunglobulins, sind zum Beispiel beschrieben in Beispiel 11 von WO 99/09063 . Andere Isoformen von Ig-Molekülen sind ebenfalls geeignet für die Erzeugung von Fusionsproteinen gemäß der vorliegenden Erfindung, wie etwa die Isoformen IgG₂ oder IgG₄ oder andere Ig-Klassen, wie IgM oder IgA zum Beispiel. Fusionsproteine können monomer oder multimer, hetero- oder homomultimer sein.
Unter einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Protein, das gereinigt wird durch das Reinigungsverfahren gemäß der Erfindung. Im Folgenden wird ein solches Protein auch als „gereinigtes IL-18BP" bezeichnet. Ein solches gereinigtes IL-18BP ist vorzugsweise hochgereinigtes IL-18BP. Hochgereinigtes IL-18BP wird z.B. bestimmt durch das Vorliegen einer einzelnen Bande in einem Silberfärbe-PAGE-Gel nach Aufbringen von Protein in der Menge von 2 mcg pro Bahn. Gereinigtes IL-18BP kann ebenfalls als einzelnes sich bewegendes Signal bei der HPLC definiert werden. Gereinigtes IL-18BP kann auch definiert werden als einzelnes sich bewegendes Signal in der HPLC.
Das erhaltene IL-18BP-Präparat aus dem Reinigungsverfahren der Erfindung kann weniger als 20 % Verunreinigung, vorzugsweise weniger als 10 %, 5 %, 3 %, 2 % oder 1 % Verunreinigungen enthalten, oder es kann bis zur Homogenität gereinigt sein, d.h. frei von Proteinverunreinigungen.
Nachdem nunmehr diese Erfindung vollständig beschrieben ist, wird es der Fachmann zu schätzen wissen, dass dieselbe innerhalb eines weiten Bereichs äquivalenter Parameter, Konzentrationen und Bedingungen durchgeführt werden kann, ohne vom Geist und dem Bereich der Erfindung abzuweichen und ohne unnötige Versuche.
Während diese Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, versteht es sich, dass weitere Modifikationen möglich sind. Diese Anmeldung soll alle Variationen, Anwendungen oder Anpassungen der Erfindung umfassen, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen und solche Abweichungen von der vorliegenden Erfindung umfassen, die sich ergeben innerhalb bekannter oder üblicher Praxis innerhalb der Technik, welche die Erfindung betrifft, und welche angewendet werden auf die wesentlichen Merkmale, die hier wie folgt im Bereich der anhängigen Ansprüche angegeben sind.
Die Bezugnahme auf bekannte Verfahrensschritte, herkömmliche Verfahrensschritte, bekannte Verfahren oder herkömmliche Verfahren ist kein Eingeständnis, dass ein Aspekt, eine Beschreibung oder Ausführungsform der vorliegenden Erfindung offenbart, gelehrt oder nahegelegt ist in der relevanten Technik.
Die vorstehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen wird so vollständig die allgemeine Natur der Erfindung aufzeichnen, dass andere durch Anwendung des Wissens aus dem Stand der Technik (einschließlich der Inhalte der hier zitierten Referenzen) im Hinblick auf eine verschiedene Anwendung solcher spezifischer Ausführungsformen leicht Modifikationen und/oder Anpassungen durchführen können, ohne von dem allgemeinen Konzept der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Daher ist vorgesehen, dass solche Anpassungen und Modifikationen innerhalb der Bedeutung und des Bereichs von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen sind, basierend auf den hier aufgezeigten Lehren und Anleitungen. Es versteht sich ebenfalls, dass die Ausdrucksweise oder Terminologie, die hier verwendet werden, zum Zweck der Beschreibung und nicht zur Begrenzung dienen, sodass die Terminologie oder Ausdrucksweise der vorliegenden Beschreibung durch den Fachmann in Anbetracht der Lehren und Anleitungen, die hier angegeben werden, in Kombination mit dem Wissen des Fachmanns zu interpretieren sind.
BEISPIEL 1: REINIGUNG VON REKOMBINANTEM, HUMANEN IL-18BP AUS SERUMFREIEM CHO-ZELLÜBERSTAND
1. Einfangschritt
IL-18BP, das in 300 l serumfreiem Zellkulturüberstand von IL-18BP-exprimierenden CHO-Zellen vorliegt, wurde eingefangen auf Q Sepharose FF-Harz. Das eingefangene Material wurde auf pH-Wert 8,5 ± 0,1 und eine Leitfähigkeit von 50 ± 5 mS/cm eingestellt durch Zugeben von einigen Tropfen 35 %-iger ortho-Phosphorsäure (H₃PO₄) und festem NaCl, in einer Menge entsprechend etwa 0,35 M.
2. Reinigungsverfahren
Das Reinigungsverfahren, ist, beginnend bei dem eingefangenen Material gemäß obigem Punkt (1), im Detail unten beschrieben. Ein Fließdiagramm des Reinigungsverfahrens ist in 1 dargestellt.
Im Allgemeinen betreffen pH- und Leitfähigkeitswerte Werte bei einer Temperatur von +25 °C. Die Säulen wurden kontinuierlich mit UV-Geräten, die die Absorption bei 280 nm messen, beobachtet.
2.1. Schritt a: IMAC auf Chelating Sepharose Fast Flow
Ausstattung

• Chromatographiesäule: XK1,6 × 20 cm (Amersham Biosciences);
• UV-Überwachungsgerät (optische Weglänge 2,5 mm), ausgestattet mit einem Zweikanalaufzeichnungsgerät (Amersham Biosciences oder Äquivalent);
• Peristaltikpumpe (Minipuls Gilson oder Äquivalent);
• UV-Spektrophotometer (Shimadzu oder Äquivalent);
• pH-Meter (Metrohm oder Äquivalent);
• Leitfähigkeitsmessgerät (Metrohm oder Äquivalent);
• Waage (Mettler Toledo oder Äquivalent).

Materialien

• Chelating Sepharose Fast Flow-Harz (Amersham Biosciences);
• Natriumhydroxidpellets-(Merck);
• Kupfersulfat (Merck);
• Eisessig (Merck);
• Ethylendiamintetraessigsäure-EDTA-(Fluka);
• Natriumchlorid-NaCl-Merck;
• Reinwasser (Modulab oder Äquivalent);
• Di-Natriumhydrogenphosphatdihydrat-Merck;
• Ammoniumacetat-Merck;
• 25 %-ige Ammoniaklösung-Merck;
• 85 %-ige ortho-Phosphorsäure-Merck;
• 50 %-ige Natriumhydroxidlösung-Baker.

Puffer und Lösungen

• Metallbeschickungslösung: 0,2 M Kupfersulfat
• angesäuertes Wasser
• Gleichgewichtspuffer: 50 mM Natriumphosphat pH-Wert 8,5 ± 0,1, 0,5 M NaCl.
• Elutionspuffer: 0,075 M Ammoniumacetat, pH-Wert 9,0 ± 0,1
• Regenerationslösung: 20 mM Natriumphosphat, pH-Wert 5,8 ± 0,3, 0,5 M NaCl, 50 mM EDTA
• Desinfektionslösung: 0,5 M NaOH

Die Säule wurde gepackt mit Chelating Sepharose Fast Flow-Harz unter Befolgung der Anleitungen des Herstellers. Zur Desinfektion wurde die Säule mit mindestens 3 BV NaOH, 0,5 M, gespült, inkubiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur und dann wurde die Säule mit 3 BV gereinigtem Wasser gespült.
220 bis 300 mg konzentriertes r-hIL-18BP, erhalten aus dem Einfangschritt, der oben unter (1) angegeben ist, wurden aufgetaut und auf pH-Wert 8,5 ± 0,1, Leitfähigkeit 50 ± 5 mS/cm durch Zugabe einiger Tropfen 35 %-iger ortho-Phosphorsäure (H₃PO₄) und festem NaCl in einer Menge, entsprechend etwa 0,35 M, eingestellt.
Die Chromatographiesäule wurde zuerst gespült mit 5–6 BV (Bettvolumina) angesäuertem Wasser bis der pH-Wert < 4,5 war. Dann wurde die Säule gespült mit 3 BV 0,2 M Kupfersulfat und 4 BV angesäuertem Wasser bis die Absorption die Grundlinie erreichte.
Dann wurde die Säule äquilibriert durch Spülen von 6 oder mehr BV Gleichgewichtspuffer, 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 8,5 ± 0,1, 0,5 M NaCl, Leitfähigkeit 50 ± 5 mS/cm durch die Säule. Der pH-Wert und die Leitfähigkeit wurden überprüft und das Waschen wurde fortgesetzt falls die Parameter des Ausflusses der Säule außerhalb der Zielwerte, d.h. pH-Wert 8,5 ± 0,1, Leitfähigkeit 50 ± 5 mS/cm, liegen.
Das Ausgangsmaterial, d.h. Post-Einfang r-hIL-18BP (Post Capture r-hIL-18BP), wie oben hergestellt, wurde dann auf die Säule aufgebracht. Nach Abschluss der Probenaufbringung wurde die Säule gespült mit 5–10 BV Äquilibrierungspuffer. Diese Fraktionen wurden verworfen, da sie nur Zellkulturverunreinigungen enthielten.
Die Flution wurde begonnen mit 0,075 M Ammoniumacetat, pH-Wert 9,0 ± 0,1, Leitfähigkeit 7,6 ± 0,5 mS/cm. r-hIL-18BP begann als ein Hauptsignal nach etwa 0,5 BV, ausgehend vom Start, zu eluieren.
3–5 BV des Hauptsignals wurden gesammelt, wobei das Hauptsignal begann wenn die On-line-OD steil zunahm. Diese Fraktion enthielt halbgereinigtes r-hIL-18BP.
Nach Abschluss der Flution wurde die Säule gespült mit 3–5 BV Regenerationspuffer, enthaltend EDTA. Die beprobten Fraktionen enthielten Kupfer, das aus dem Harz verdrängt wurde, als auch Zellkulturverunreinigungen.
Zur Desinfektion wurde die Säule gespült mit mindestens 3 BV NaOH, 0,5 M, inkubiert für 1 Stunde und dann wurde die Säule gespült mit 3 BV Reinwasser. Die Säule wurde dann mit mindestens 3 BV Aufbewahrungslösung, 10 mM NaOH gespült und wird aufbewahrt bei Raumtemperatur bis zum nächsten Zyklus.
2.2. Schritt (b): HIC/IEC auf MEP-Hypercel
Dieser Schritt wird durchgeführt auf MEP-Harz, ein Hydrophob-Ladungsinduktionchromatographieharz, das ein Gemisch zwischen hydrophob Wechselwirkungschromatographie (HIC) und Ionenaustauschchromatographie (IEC) ist.
Ausstattung

• Chromatographiesäule: XK 1,6 × 20 cm (Amersham Biosciences);
• UV-Überwachungsgerät (optische Weglänge 2,5 mm), ausgestattet mit einem Zweikanalaufzeichnungsgerät (Amersham Biosciences oder Äquivalent);
• Peristaltikpumpe (Minipuls Gilson oder Äquivalent);
• UV-Spektrophotometer (Shimadzu oder Äquivalent);
• pH-Meter (Metrohm oder Äquivalent);
• Konduktometer (Metrohm oder Äquivalent);
• Waage (Mettler Toledo oder Äquivalent).

Materialien

• Post IMAC r-hIL-18BP;
• MEP HyperCel^®-Harz (BioSepra-Cypergen Biosystems);
• Natriumhydroxidpellets-(Merck);
• Kaliumchlorid-(Merck);
• Ethylendiamintetraessigsäure-EDTA-(Fluka);
• Natriumchlorid-NaCl-Merck;
• Reinwasser (Modulab oder Äquivalent);
• Di-Natriumhydrogenphosphateptahydrat-Merck;
• Di-Natriumhydrogenphosphat, monobasisches Dihydrat-Merck;
• Kaliumphosphat-Merck;
• 1-2-Propandiol (Propylenglykol)-Merck;
• 85 %-ige ortho-Phosphorsäure-Merck;
• 50 %-ige Natriumhydroxidlösung-Baker.

Puffer und Lösungen

• Äquilibrierungspuffer: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1X, pH-Wert 6,1 ± 0,1, 1 NaCl, Leitfähigkeit 95 ± 5 mS/cm
• Waschpuffer: PBS 1X, pH-Wert 6,1 ± 0,1, Leitfähigkeit 16 ± 2 mS/cm
• Elutionspuffer: 20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 8,4 ± 0,1, 35 %-iges Propylenglykol, Leitfähigkeit 1,1 ± 0,3 mS/cm
• Regenerationslösung 1: Reinwasser
• Regenerationslösung 2: 100 mM EDTA
• Desinfektionslösung: 1 M NaOH

Die Säule wurde gepackt mit MEP HyperCel^®-Harz entsprechend den Anleitungen des Herstellers.
Post-IMAC IL-18BP, resultierend aus Schritt (a), wurde ergänzt mit 1 M NaCl unter Rühren bis zu einer Leitfähigkeit von 95 ± 5 mS/cm.
Zur Säulendesinfektion wurde die Säule gespült mit mindestens 1 BV NaOH, 0,5 M, dann gespült mit 3–5 BV Reinwasser.
Zur Säulenäquilibrierung wurde die Säule gespült mit 6 oder mehr BV Äquilibrierungspuffer, PBS 1X pH-Wert 6,1 ± 0,1, 1 NaCl, Leitfähigkeit 95 ± 5 mS/cm. pH-Wert und Leitfähigkeit wurden überprüft und das Waschen wurde fortgesetzt falls die Parameter des Säulenausflusses außerhalb von Zielwerten liegen, d.h. pH-Wert 6,1 ± 0,1, 1 NaCl, Leitfähigkeit 95 ± 5 mS/cm.
Dann wurde das Material mit dem aus Schritt (a) resultierenden Material aufgebracht.
Nach dem Aufbringen wurde die Säule gespült mit 6 BV Äquilibrierungspuffer PBS 1X pH-Wert 6,1 ± 0,1, 1 NaCl, Leitfähigkeit 95 ± 5 mS/cm. Diese Fraktion wurde verworfen, da sie nur Zellkulturverunreinigungen enthielt. Im Falle einer Überladung der Säule kann diese Fraktion etwas r-hIL-18BP enthalten.
Dann wurde die Säule durchgespült mit 10 BV Waschpuffer PBS 1X pH-Wert 6,1 ± 0,1, Leitfähigkeit 16 ± 2 mS/cm. Diese Fraktion wurde ebenfalls verworfen, da sie nur Zellkulturverunreinigungen enthielt. Die Fraktion kann etwas r-hIL-18BP im Falle von Säulenüberladung enthalten.
Dann wurde die Flution begonnen mit dem Elutionspuffer, 20 mM Phosphatpuffer pH-Wert 8,4 ± 0,1, 35 % Propylenglykol, Leitfähigkeit 0,8 ± 0,1 mS/cm. r-hIL-18BP begann als ein Hauptsignal nach etwa 0,5 BV, vom Start beginnend, zu eluieren. 8–10 BV des Hauptsignals wurden gesammelt, ausgehend von dem steilen Anstieg der Absorption, ungefähr nach den ersten 0,5 BV (verworfen), entsprechend des Chromatographieprofils. Dieses Eluat enthielt halb-gereinigtes r-hIL-18BP.
Zur Regeneration wurde die Säule gespült mit mindestens 6 BV Regenerationslösung 1, gefolgt von 10 BV Regenerationslösung 2. Die Säule wurde in Regenerationslösung über Nacht belassen, um die Regenerationswirkung weiter zu verbessern. Die Säule wurde dann gespült mit mindestens 6 BV Reinwasser. Diese Zellkulturverunreinigungenenthaltenden Fraktionen wurden verworfen.
Zur Desinfektion wurde die Säule mit mindestens 6 BV 1M NaOH gespült, der Fluss für 1 Stunde angehalten und die Säule dann mit mindestens 6 BV Reinwasser gespült.
Zur Aufbewahrung wurde die Säule mit mindestens 3 BV Aufbewahrungslösung, 0,1 M NaOH gespült und bei Raumtemperatur bis zum nächsten Zyklus aufbewahrt.
2.3. Zwischenschritt: ULTRAFILTRATION
Ausstattung

• Ultrafiltrationsvorrichtung Vivaflow 200, Grenze 5000 D (RC, PES oder HydroSart)-Sartorius oder Äquivalent;
• Peristaltikpumpe, Typ Masterflex oder Äquivalent;
• UV-Spektrophotometer (Shimadzu oder Äquivalent);
• pH-Meter (Metrohm oder Äquivalent);
• Konduktometer (Metrohm oder Äquivalent);
• Waage (Mettler Toledo oder Äquivalent).

Materialien

• Post-MEP r-HIL-18BP-Zwischenprodukt;
• Natriumhydroxidpellets-Merck;
• Reinwasser (Modulab oder Äquivalent).

Lösungen zur Diafiltration

• Reinwasser von Modulab oder Milli Q Systems.
• Desinfektionslösung: 0,5 M NaOH

Verfahren
Der Ultrafiltrationsschritt wurde bei Raumtemperatur (+ 20 ± 5 °C) durchgeführt.
Zur Ultrafilterdesinfektion wurden etwa 500 ml 0,5 M NaOH für mindestens 30 Minuten filtriert und dann wurde der Ultrafilter gespült mit Reinwasser bis der Permeat-pH-Wert unter 7,5 ist.
Die Post-MEP-Fraktion wurde 1:2 mit Reinwasser verdünnt und filtriert mit dem Ultrafilter. Die Lösung wurde auf ungefähr 1–2/10 des Ausgangsvolumens konzentriert und die Retenat-Fraktion dialysiert gegen Reinwasser bis die Leitfähigkeit des Retenats < 100 μS/cm war. Die Leitfähigkeit des Retenats wurde nach Verdünnung mit Wasser auf ein Volumen von etwa 150–200 ml eingestellt.
Die Retenatfraktion wurde gesammelt und der Ultrafilter gewaschen mit Reinwasser. Die Waschfraktionen wurden gesammelt und mit der Retenatfraktion zusammengefasst (Endvolumen 200–250 ml).
Der Ultrafilter wurde durch Filtrieren von 500 ml 0,5 M NaOH für nicht weniger als 30 Minuten und nachfolgendes Waschen des Ultrafilters mit Reinwasser bis der pH-Wert des Permeats unter 7,5 war, desinfiziert.
Der Ultrafilter wurde in 0,05 M NaOH bei + 4 °C ± 3 °C bis zum nächsten Zyklus aufbewahrt.
2.4. Schritt (c): IEC auf CM-Sepharose Fast Flow
Ausstattung

• Chromatographiesäule: AC10/20 cm (Amersham Biosciences);
• UV-Überwachungsgerät (optische Weglänge 2,5 mm) ausgestattet mit einem Zweikanalaufzeichnungsgerät (Amersham Biosciences oder Äquivalent);
• Peristaltikpumpe (Minipulse Gilson oder Äquivalent);
• UV-Spektrophotometer (Shimadzu oder Äquivalent);
• pH-Meter (Metrohm oder Äquivalent);
• Konduktometer (Metrohm oder Äquivalent);
• Waage (Mettler Toledo oder Äquivalent).

Materialien

• Ultrafiltriertes r-hIL-18BP Post-MEP-Zwischenprodukt;
• CM Sepharose FF Harz (Amersham Biosciences);
• Natriumhydroxidpellets-Merck;
• MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) (Sigma oder Äquivalent);
• Reinwasser (Modulab oder Äquivalent);
• Natriumchlorid-Merck.

Puffer und Lösungen

• Voräquilibrierungspuffer: 20 mM MES pH-Wert 5,0 ± 0,5, Leitfähigkeit 150 ± 50 μS/cm
• Äquilibrierung: 1 mM MES, pH-Wert 6,0 ± 0,2, Leitfähigkeit 45 ± 15 μS/cm
• Regenerationslösung: 1,5 M NaCl
• Desinfektionslösung: 0,5 M NaOH
• Aufbewahrungslösung: 0,01 M NaOH

Die Säule wurde gepackt mit CM Sepharose Fast Flow-Harz, unter Beachtung der Anleitungen des Herstellers.
Ultrafiltriertes r-hIL-18BP Post-MEP (siehe Schritt (b)) wurde auf pH-Wert 6,0 ± 0,2 mit einigen Tropfen 20 mM MES, pH-Wert 5 ± 0,5, und auf eine Leitfähigkeit von 100 ± 15 μS/cm unmittelbar vor Aufbringung auf die Säule gebracht.
Zur Säulendesinfektion wurde die Säule gespült mit 1 BV NaOH, 0,5 M, und gespült mit 15–20 BV Reinwasser.
Dann wurde die Säule durch Spülen durch die Säule von 15–20 BV 20 mM MES, pH-Wert 5 ± 0,5, Leitfähigkeit 150 ± 50 μS/cm, voräquilibriert. Der pH-Wert und die Leitfähigkeit wurden überprüft und das Waschen wurde fortgesetzt falls die Parameter des Ausflusses der Säule außerhalb der Zielwerte lagen, d.h. pH-Wert 5,0 ± 0,5, Leitfähigkeit 150 ± 50 μS/cm.
Dann wurde die Säule durch Spülen der Säule mit 5 oder mehr BV Äquilibrierungspuffer, 1 mM MES, pH-Wert 6,0 ± 0,2, Leitfähigkeit 45 ± 15 μS/cm, äquilibriert. pH-Wert und Leitfähigkeit wurden überprüft und das Waschen wurde fortgesetzt, falls die Parameter des Säulenausflusses außerhalb der Zielwerte, pH-Wert 6,0 ± 0,2, Leitfähigkeit 45 ± 15 μS/cm, lagen.
Nach Äquilibrierung wurde r-hIL-18BP, hergestellt wie oben beschrieben, aufgebracht. Der Durchfluss wurde gesammelt sobald die Absorption anzusteigen begann, da diese Fraktion das halb-gereinigte r-hIL-18BP enthält.
Als die Probenbeschickung abgeschlossen war, wurde die Säule gewaschen mit 3–4 BV Äquilibrierungspuffer, 1 mM MES, pH-Wert 6 ± 0,2, Leitfähigkeit 45 ± 15 μS/cm und der Durchfluss wurde kontinuierlich gesammelt bis die Absorption die Grundlinie erreichte.
Nach dem Sammeln wurde die Lösung unmittelbar auf pH-Wert 9,1 ± 0,1 durch Zugabe von 50 mM festem Natriumtetraborat gebracht. Die gesammelten Fraktionen enthielten halbgereinigtes r-hIL-18BP.
Zur Säulenregeneration wurde die Säule mit mindestens 4 BV Regenerationspuffer, 1,5 M NaCl gespült. Proben wurden genommen und die Fraktion verworfen. Diese Fraktion enthält Zellkulturverunreinigungen und mehr basische Isoformen von r-hIL-18BP.
Zur Desinfektion wurde die Säule mit mindestens 3 BV NaOH, 0,5 M, gespült der Fluss für 1 Stunde angehalten und dann wurde die Säule mit 3 BV Reinwasser gespült.
Zur Aufbewahrung wurde die Säule mit mindestens 3 BV Aufbewahrungspuffer gespült und dann bis zum nächsten Zyklus aufbewahrt.
2.5. Schritt (d): Hydrophobe Wechselwirkung auf Phenyl-Sepharose FF HS
Ausstattung

• Chromatographiesäule: XK 16/20 (Amersham Biosciences);
• UV-Überwachungsgerät (optische Weglänge 2,5 mm), ausgestattet mit Zweikanalaufzeichnungsgerät (Amersham Biosciences oder Äquivalent);
• Peristaltikpumpe (Minipulse 2 Gilson oder Äquivalent);
• UV-Spektrophotometer (Shimadzu oder Äquivalent);
• pH-Meter (Metrohm oder Äquivalent);
• Konduktometer (Metrohm oder Äquivalent);
• Waage (Mettler Toledo oder Äquivalent).

Materialien

• r-hIL-18BP Post-CM-Zwischenprodukt;
• Phenyl-Sepharose FF HS-Harz (Amersham Biosciences);
• Di-Natriumtetraboratdecahydrat-Merck;
• Ammoniumsulfat (Merck);
• gereinigtes Wasser von Modulab oder Äquivalent;
• Natriumhydroxidpellets-Merck;
• 50 %-ige NaOH-Lösung-J.T. Baker.

Puffer und Lösungen

• Äquilibrierungspuffer: 50 mM Natriumborat 9,1 ± 0,2, 0,9 M Ammoniumsulfat, Leitfähigkeit 122 ± 6 mS
• Elutionspuffer: 50 mM Natriumborat 9,1 ± 0,2, 0,15 M Ammoniumsulfat, Leitfähigkeit 30 ± 2 mS/cm
• Regenerationspuffer: gereinigtes Wasser 9 Desinfektionslösung: 0,5 M NaOH
• Die Säule wurde gepackt mit Phenyl-Sepharose FF HS-Harz entsprechend den Anleitungen des Herstellers.

Zur Herstellung des Ausgangsmaterials wurde festes Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 0,9 M zu Post-CM-IL-18BP (Ergebnis aus Schritt (c)) gegeben. Nachdem das Lösen des Salzes abgeschlossen war, wurde das Material auf einen pH-Wert von 9,1 ± 0,2 durch Zugeben von 50 %-ger NaOH in Lösung gebracht.
Zur Säulendesinfektion wurde die Säule mit mindestens 1 BV NaOH, 0,5 M, gespült und die Säule mit 6 BV Reinwasser gespült.
Die Säule wurde äquilibriert durch Spülen durch die Säule von 5–7 oder mehr BV Äquilibrierungspuffer: 50 mM Natriumborat, pH-Wert 9,1 ± 0,2, 0,9 M Ammoniumsulfat, Leitfähigkeit 122 ± 6 mS. pH-Wert und Leitfähigkeit wurden überprüft und das Waschen wurde fortgesetzt falls die Parameter des Säulenausflusses außerhalb der Zielwerte, d.h. pH-Wert 9,1 ± 0,2, Leitfähigkeit 122 ± 6 mS, lagen.
Das Ausgangsmaterial, d.h. r-hIL-18BP-Post-CM wurde dann auf die Säule aufgebracht. Als das Säulenbeladen abgeschlossen war, wurde die Säule mit 7–9 BV Äquilibrierungspuffer gespült. Diese Fraktion enthält restliche Zellkulturverunreinigungen.
Die Flution wurde begonnen mit Elutionspuffer, 50 mM Natriumborat, pH-Wert 9,1 ± 0,2, 0,15 M Ammoniumsulfat, Leitfähigkeit 30 ± 2 mS/cm. r-hIL-18BP begann als ein Hauptsignal nach etwa 0,5–0,8 BV, beginnend vom Start, zu eluieren. 6–8 BV des Hauptsignals wurden gesammelt, beginnend bei der Erhöhung der Absorption. Die Elutionsfraktion enthielt halbgereinigtes r-hIL-18BP.
Nach Abschluss der Flution wurde die Säule regeneriert durch Spülen der Säule mit mindestens 3 BV Reinwasser. Diese Fraktion wurde verworfen, da sie Zellkulturverunreinigungen und Aggregatformen von IL-18BP enthält.
Zur Desinfektion wurde die Säule gespült mit mindestens 3 BV 0,5 M NaOH, der Fluss wurde für 1 Stunde angehalten und dann wurde die Säule mit 6 BV gereinigtem Wasser gespült.
Zur Aufbewahrung wurde die Säule mit mindestens 3 BV Aufbewahrungslösung, 10 mM NaOH, gespült und die Säule bei Raumtemperatur bis zum nächsten Zyklus aufbewahrt.
2.6. Schritt 5 (e): Reverse Phase-Chromatographie auf Source 30 RPC
Ausstattung

• Chromatographiesäule: AC10/20 (Amersham Biosciences);
• UV-Überwachungsgerät (optische Weglänge 2,5 mm), ausgestattet mit Zweikanalaufzeichnungsgerät (Amersham Biosciences oder Äquivalent);
• Peristaltikpumpe (Minipulse 2 Gilson oder Äquivalent);
• UV-Spektrophotometer (Shimadzu oder Äquivalent);
• FPLC-System oder Äquivalent, zum realisieren des linearen Gradienten (Amersham Biosciences);
• pH-Meter (Metrohm oder Äquivalent);
• Konduktometer (Metrohm oder Äquivalent);

Materialien

• IL-18BP Post-HIC;
• Source 30 RPC-Harz (Amersham Biosciences);
• Natriumchlorid-Merck;
• Di-Natriumtetraboratdecahydrat (Merck);
• 50 %-ige NaOH-Lösung-Baker;
• Reinwasser (Modulab oder Äquivalent);
• Acetonitril-Merck;
• Trifluoressigsäure-J.T. Baker;
• Universalindikator, pH-Wert 0–14-Merck.

Puffer und Lösungen

• Lösung A: 0,1 % TFA in Wasser
• Lösung B: 0,1 % TFA In ACN
• Äquilibrierungspuffer: 50 mM Natriumborat, pH-Wert 9,1 ± 0,2, Leitfähigkeit 5 ± 2 mS/cm
• Desinfektionslösung: 0,5 M NaOH

Die Säule wurde entsprechend den Anleitungen des Herstellers mit Source 30 RPC-Harz gepackt.
Zur Säulendesinfektion wurde die Säule rückgespült mit mindestens 3 BV NaOH, 0,5 M, und dann gespült mit 4–5 BV Reinwasser.
Dann wurde die Säule äquilibriert durch Spülen der Säule (Aufwärts-Vorwärts-Strom) mit von 5–6 oder mehr BV Äquilibrierungspuffer, 50 mM Natriumborat, pH-Wert 9,1 ± 0,2, Leitfähigkeit 5 ± 2 mS/cm. Der pH-Wert und die Leitfähigkeit wurden überprüft und das Waschen wurde fortgesetzt, falls die Parameter des Ausflusses der Säule außerhalb der Zielwerte lagen, d.h. pH-Wert 9,1 ± 0,2 und Leitfähigkeit 5 ± 2 mS/cm.
r-hIL-18BP Post-HIC (Ergebnis aus Schritt (d)) bei pH-Wert 9,1 ± 0,2, Leitfähigkeit 30 ± 2 mS/cm, war das Ausgangsmaterial dieses Schritts. Es wurde aufgebracht auf die Säule und als das Aufbringen der Probe abgeschlossen war, wurde die Säule mit 2–3 BV Äquilibrierungspuffer gespült. Diese Fraktion wurde verworfen.
Dann wurde die Säule gewaschen mit Lösung A bis der pH-Wert des Ausflusses der Säule unter 4 war. Diese Fraktion wurde mit dem ersten Teil des Elutionsgradienten (vor 28 % ACN) zusammengefasst. Diese Fraktion enthält einige Rückstände der Zellkulturverunreinigungen und wird daher verworfen.
Die Flution wurde im Gradientenmodus durchgeführt, unter Verwendung der Kombination von Elutionslösung A und Elutionslösung B, wie nachfolgend detailliert dargestellt: Tabelle IV:

Zeit (Minuten) % A % B BV Flussrate (ml/min)

0 100 0 0 5

50 65 35 22 5

60 65 35 26,5 5

65 20 80 29,0 5

75 20 80 33,0 5
r-hIL-18BP begann bei ungefähr 28–32 % Lösung B (siehe oben in Fettdruck) zu eluieren und es war vollständig eluiert innerhalb von 60 Minuten (35 % B). Das Eluat wurde unmittelbar auf pH-Wert 8,0 ± 0,5 durch Verdünnung 1:2 mit 50 M Natriumborat, pH-Wert 9,1 ± 0,2 und Leitfähigkeit 5 ± 2 mS/cm, gebracht.
Die Fraktion enthält gereinigtes r-hIL-18BP.
Die Säulenregeneration wurde am Ende des Elutionsgradienten durchgeführt. Die Regenerationsfraktion wurde entsprechend des Absorptionsprofils gesammelt. Die Fraktion enthält Reste der Zellkulturverunreinigungen und Aggregatformen von IL-18BP.
Zur Desinfektion wurde die Säule gespült mit 2–3 BV Wasser, gespült mit mindestens 3–4 BV NaOH und dann wurde der Fluss für 1 Stunde angehalten. Hiernach wurde die Säule mit 3–4 BV Reinwasser gespült.
Die Säule wurde mit mindestens 3 BV Aufbewahrungslösung gespült und aufbewahrt bis zum nächsten Zyklus.
3. Zusammenfassung der Clearance von Wirtszellproteinen aus der IL-18BP-Herstellung
Die Menge der Wirtszellproteine wurde durch ELISA gemessen, unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums, das in Kaninchen gegen Verunreinigungen, die aus einer CHO-Zelle stammen, die in serumfreiem Zellkulturmedium vorliegt, gebildet wird. Die Menge von Wirtszellproteinen wird als ppm (Teile pro Million) Verunreinigungsproteine in Bezug auf gereinigtes IL-18BP angegeben. Die Menge IL-18BP wurde gemessen durch Bestimmen der optischen Dichte (OD) bei 280 nm (molarer Extinktionskoeffizient ε = 1,26) in dem gereinigten Präparat von IL-18BP, d.h. nach dem Endreinigungsschritt durch reverse Phase-Chromatographie.
Diese Analyse wurde im Rahmen von drei unabhängigen Versuchen durchgeführt. Tabelle V: Clearance von Wirtszellproteinen

Lauf Start-IMAC Post-IMAC Post-MEP Post-CM

1 528966 ppm 470600 ppm 68400 ppm > 4000 ppm

2 475322 ppm 366800 ppm 49800 ppm 558 ppm

3 230400 ppm 236200 ppm 89100 ppm 641 ppm
BEISPIEL 2: MODIFIZIERTES PROTOKOLL ZUR REINIGUNG VON REKOMBINANTEM, HUMANEM IL-18BP AUS SERUMFREIEM CHOZELLÜBERSTAND
Beispiel 1 wurde wie oben angegeben unter den folgenden Veränderungen durchgeführt:
Der Einfangschritt wurde auf Fractogel^® TMAEHiCap^®, bezogen von Merck, durchgeführt.
In Schritt (a), dem IMAC-Reinigungsschritt auf einer Chelating Sepharose Fast Flow-Säule wurde ein zusätzlicher Waschschritt unter Verwendung von 15 mM Ammoniumchlorid in Äquilibrierungspuffer hinzugefügt.
Zusätzlich zu diesem Schritt wurde die Schritt (a)-Elution durchgeführt unter Verwendung von 0,06 M Ammoniumacetat bei pH-Wert 8,7.
In Schritt (d) wurde die Flution begonnen mit Elutionspuffer, 50 mM Natriumborat, pH-Wert 9,1 ± 0,2, 0,10 M Ammoniumsulfat.
Verfahren: Bestimmung der IL-18BP-spezifischen Aktivität
Bestimmung der biologischen Potenz durch den KG-1-Zell-in vitro- Bioassay
Die biologische Charakterisierung eines r-hIL-18BP Referenzmaterials basierte auf der Beurteilung seiner Fähigkeit zum spezifischen Binden von r-hIL-18, unter Neutralisierung seiner biologischen Aktivität auf der humanen akute myelogene Leukämie-Zelllinie KG-1. Diese Zelllinie kann IFN-γ in Reaktion auf humanes IL-18 plus humanes TNF-α in einer dosisabhängigen Art erzeugen, wobei r-hIL-18BP die Produktion von IFN-γ supprimiert.
Kurz gesagt, wurden KG-1-Zellen mit 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung zugegeben in eine Platte mit 96 Vertiefungen, die bereits verschiedene Konzentrationen von r-hIL-18BP enthielt, in der Gegenwart einer festgesetzten Konzentration von r-hIL-18 (40 ng/ml in der Vertiefung) plus einer festgesetzten Konzentration von r-hTNF-α (10 ng/ml in der Vertiefung). Die Konzentration jeder dieser beiden Substanzen, war in der Kombination in der Lage, die submaximale Induktion der Produktion von IFN-γ auf KG-1-Zellen zu ergeben. Nach 24 h bei 37 °C, 5 % CO₂, wurde die Platte bei –20 °C gehalten, um die behandelten Zellen in einen Gefrier/Tau-Zyklus überzuführen, vor Durchführung des Immunoassays zum Bestimmen der Menge von IFN-γ, die in dem Zellüberstand vorliegt. Die Zellüberstände wurden gesammelt und humanes IFN-γ gemessen mittels eines spezifischen Immunoassays (ELISA h-IFN-γ, Duo Set R&D Systems Kit). Die Menge IFN-γ, die durch die behandelten Zellen erzeugt wird, wurde berechnet unter Verwendung der y-Werte (O.D.) auf der IFN-γ-Standardkurve, die mit dem Kit bereitgestellt wird, abgestimmt durch eine sigmoidale Dosisreaktion (4PL) log/log, transformiert, wobei x-Werte erhalten werden (IFN-γ-Konzentrationen) (GraphPad Prism). Die Verdünnung von r-hIL-18BP-Referenzmaterial (ST1P01/r-hIL-18BP)-Lösung, die in der Lage ist zum Inhibieren um 50 % (EC₅₀) des Ausmaßes der IFN-γ-Produktion, die induziert wird durch eine festgesetzte Konzentration von r-hIL-18 + einer festgesetzten Konzentration von r-hTNF-α, wurde als 1 Einheit (U) definiert.
Zehn unabhängige Assays wurden durchgeführt und jede der 10 Dosis-Reaktionskurven wurde aufgetragen durch Angabe der % Erzeugung von IFN-γ auf der y-Achse und der ST1P01/r-hIL-18BP-Verdünnungen auf der x-Achse. Die r-hIL-18BP-Dosisreaktionskurve, die in jedem Versuch erzeugt wird, wurde zuerst normalisiert durch Annehmen des geringsten bzw. höchsten Werts von IFN-γ als gleich 0 % bzw. 100 %.
Der höchste IFN-γ-Wert wurde durch r-hIL-18 plus r-hTNF-α-Kombinationskonzentration in der Abwesenheit von r-hIL-18BP gegeben, während der geringste Wert durch die höhere r-hIL-18BP-Konzentration, die getestet wurde, gegeben wurde. Eine sigmoidale Dosisreaktion mit variablem Steigungsalgorithmus (4PL) wurde dann angewendet, um die normalisierten Werte zu interpolieren und der EC₅₀ für jeden Versuch bestimmt.
Der Titer des Referenzmaterials wurde in jedem Assay wie folgt berechnet: Titer (U/ml) = Reziprokes der Verdünnung bei 50 % der Reaktion × Vorverdünnung
Der ST1P01/r-hIL-18BP-Endtiter wurde berechnet durch Mitteln der 10 einzelnen in jedem Versuch erhaltenen Titer.
2 zeigt die Dosisreaktionskurven von ST1P01/r-hIL-18BP durch KG-1 in vitro-Bioassay, erhalten in 10 unabhängigen Versuchen.
Die Kurven wurden normalisiert indem der niedrigste Wert von INF-γ gleich 0 % bzw. der höchste Wert von INF-γ gleich 100 % angenommen wurde. Der höchste IFN-γ-Wert war gegeben durch die r-IL-18 plus r-hTNF-α-Kombinationskonzentrationen in der Abwesenheit von r-hIL-18BP, während der niedrigste Wert gegeben war durch die höchste r-hIL-18BP-Konzentration, die getestet wurde. Eine sigmoidale Dosisreaktion mit variablem Steigungsalgorithmus (4PL) wurde dann angewendet zum Interpolieren der normalisierten Werte und der EC₅₀ für jeden Versuch mittels GraphPad Prism bestimmt.

Die einzelnen Titer für das ST1P01/r-hIL-18BP, die in jedem unabhängigen Versuch zusammen mit der Standardabweichung erhalten wurden, der Variationskoeffizient (%) und die 95 %-Vertrauensgrenzen sind unten angegeben. Tabelle VI: Potenzabschätzung des ST1P01/r-hIL-18BP, das in zehn unabhängigen Versuchen erhalten wird

Assay Nr.	ST1P01/r-hIL-18BP (U/ml)
1	794808
2	884412
3	1008216
4	987696
5	1021212
6	980856
7	1117314
8	861156
9	660402
10	642618
Mittel	895869
Standardabweichung	157817
Variationskoeffizient %	17,6
95 % Vertrauensgrenze	obere Vertrauensgrenze	1008760
	untere Vertrauensgrenze	782973

Die mittlere abgeschätzte Potenz des Referenzmaterials ST1 P01/r-hIL-18BP ergab sich als gleich 895869 U/ml mit einem Variationskoeffizienten von 17,6.
KG-1-Zelle-in vitro-Bioassay

Der Assay wurde auf Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	CC	CC	CC	CC	CC	CC	CC	CC	CC	CC	CC	CC
B	300	200	133	88,8	59,2	39,5	26,3	17,5	11,7	0	IL-18	TNF
C	300	200	133	88,8	59,2	39,5	26,3	17,5	11,7	0	IL-18	TNF
D	S1¹	S1¹	S2¹	S2¹	S3¹	S3¹
E	S1²	S1²	S2²	S2²	S3²	S3²
_F
_G
H

CC = Kontrollzellen (nur Kulturmedium zugegeben;
TNF = r-hTNF-α bei 10 ng/m in der Vertiefung
IL-18 = r-hIL-18 bei 40 ng/ml in der Vertiefung
0 = r-hIL-18 + r-hTNF-α bei jeweils 40 + 10 ng/ml in der Vertiefung Reihen B und C – r-hIL-18BP-Dosis-Reaktion-Kurveschritt, Verdünnung 1:1,5
S1, S2 und S3 = Proben bei 2 verschiedenen Konzentrationen, die in den linearen Teil der Dosisreaktionskurve fallen (2 Wiederholungen/Probe) z.B. S1¹ = Probe 1 bei Konzentration 1; S1² = Probe 1 bei Konzentration 2).

Die angegebenen Probepositionen auf der Platte sind ein Beispiel.

• Zugeben von 50 μl Kulturmedium (500 ml IMDM, ergänzt mit 20 % FBS, wärmeinaktiviert 30 min bei 56 °C, 5 ml 2-Mercaptoethanol, 3 mM, 5 ml 2 mM L-Glutamin und 5 ml Pen/Strep; 10.000 U/ml/10.000 μg/ml) in die Vertiefungen 2 bis 12 der Reihen B-C.
• Zugeben von 150 μl r-hIL-18BP-Referenzmaterial mit 1500 ng/ml (300 ng/ml in der Vertiefung) zur ersten Vertiefung der Reihen B–C.
• Verwendung von Multikanalpipettenreihenverdünnungen, 1:1,5, durch Überführen von 100 μl von der Vertiefung in Spalte 1 zur Vertiefung von Spalte 9 (Reihen B-C), Verwerfen des Überschusses von 100 μl von der Vertiefung in Spalte 9.
• Zugeben von 50 μl r-hIL-18BP-Probe, hergestellt mit einer der zwei Konzentrationen, die in den linearen Teil der Dosis-Reaktion-Kurve fallen (z.B. S1¹ bei 600 ng/ml, entsprechend 120 ng/ml in der Vertiefung) in die Vertiefungen in den Spalten 1 bis 2 von Reihe D (zweifach).

N.B.: die nicht angegebenen Probepositionen in der Platte sind als ein Beispiel bereitgestellt.

• Wiederholen von Punkt 4 für die zweiten (S1²) Probekonzentrationen.
• Zugeben von 50 μl r-hIL-18 mit 200 ng/ml (40 ng/ml in der Vertiefung) zu allen Vertiefungen der Reihen B-C, ausgenommen diejenigen in Spalte 12, und in die Vertiefungen, die die Probe enthalten (z.B. Spalten 1–2, Reihen D–E).
• Zugeben von 50 μl r-r-hTNF-α mit 50 ng/ml (10 ng/ml in der Vertiefung) zu allen Vertiefungen der Reihen B-C, ausgenommen diejenigen in Spalte 11, und in die Vertiefungen, die die Probe enthalten (z.B. Spalten 1–2, Reihen D–E).
• Zugeben von 50 μl Kulturmedium in die Vertiefungen in den Spalten 11 und 12 der Reihen B-C.
• Zugeben von 150 μl Kulturmedium in alle Vertiefungen der Reihe A (Kontrollzellvertiefungen).
• Zugeben von 100 μl KG-1 Zellsuspension mit 1 × 10⁶ Zellen/ml in alle Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen.

NB: Das Endvolumen in der Vertiefung ist 250 μl; die Endverdünnung von r-hIL-18BP 1:5. Die Zellsuspension wird hergestellt in einer T75-Flasche, die nicht weniger als 20–24 × 10⁶ Zellen (15 ml Kulturmedium) enthält.

• Inkubieren der Platte für 24 h bei 37 °C, 5 % CO₂
• Entfernen der Platte aus dem Inkubator und Halten bei –20 °C bis der Immunoassay zum Bestimmen der Menge von IFN-γ, die im Zellüberstand vorliegt, durchgeführt wird.
• Der Zellüberstand wird gesammelt und humanes IFN-γ mittels eines spezifischen Immunoassays (ELISA h-IFN-γ, Duo Set R&D Systems Kit) gemessen.

NB: Entsprechend der zugegebenen r-hIL-18BP-Konzentration, Durchführen, falls erforderlich, mehr als einer Verdünnung der Zellüberstandsprobe, um sicherzustellen, dass die gemessenen O.D.-Werte auf der IFN-γ-Standardkurve quantifizierbar sind.
Der ELISA wurde entsprechend dem allgemeinen Protokoll durchgeführt, das mit dem Kit bereitgestellt wird, mit kleineren Veränderungen:

• Die Anzahl der Waschschritte wurde erhöht: von 3 auf 4 und von 4 auf 5 für den letzten.
• Blockierpuffer wurde hergestellt durch Zugeben von 1 % BSA in PBS (weder Sucrose noch NaN₃ wurden zugegeben).
• Das Reagenzverdünnungsmittel wurde hergestellt durch Zugeben von 0,1 % BSA und 0,05 % Tween-20 in PBS anstelle von Tris-gepufferter Kochsalzlösung.

Die Menge des durch die behandelten Zellen hergestellten IFN-γ wurde auf der IFN-γ-Standardkurve (bereitgestellt mit dem Kit) berechnet, log/log transformiert und interpoliert mittels einer sigmoidalen Dosisreaktion mit variable Steigung-Algorithmus (Graph Pad Software).
Berechnung der spezifischen IL-18BP Aktivität
Die spezifische Aktivität von IL-18BP wird berechnet entsprechend der folgenden Formel:
Ergebnisse:

Die folgenden Tabellen zeigen die Ergebnisse, die für mehrere Parameter im Verlauf des Reinigungsverfahrens, wie es in diesem Beispiel beschrieben wird, erhalten werden. Tabelle VII: Clearance von Wirtszellproteinen:

Ausgangsmaterial (nach dem Einfangen)	291042	238636	336538	288739
Post-IMAC	96923	162619	148061	135867
Post-MEP	41563	43781	46708	44017
Post-CM	2138	2689	2550	2459
Post-HIC	372	1543	640	852
Post-RPC	83	111	121	105

Tabelle VIII: Ausbeute und HCP-Gehalt:

Mittelwert aus 3 Chargen	Ausbeute (%)	HCP (ppm)

Ausgangsmaterial (nach dem Einfangen)	NA	288739
Post-IMAC	91	135867
Post-MEP	98	44017
Post-CM	83	2459
Post-HIC	76	852
Post-RPC	70	105

Tabelle IX: Hauptattribute der gereinigten IL-18BP-Masse (Mittel aus 3 Chargen)

Analyse von gereinigtem r-hIL18BP	Einheit	Gehalt
spezifische Aktivität	U/mg	18287
HCP	ppm	165

REFERENZEN

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34. US 4,904,584

Claims

Verwendung einer Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie (HCIC) zur Herstellung von gereinigtem IL-18-Bindungsprotein (IL-18BP).
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie auf einem 4-Mercapto-ethyl-pyridin (MEP)-Harz durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie verwendet wird in Kombination mit einem Schritt, ausgewählt aus Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC), Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie und reverse Phase-Chromatographie.
Verfahren zur Herstellung von gereinigtem IL-18BP, umfassend das Unterziehen eines Fluids einem Schritt der Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie auf einem 4-Mercapto-ethyl-pyridin (MEP)-Harz durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, weiterhin umfassend einen Schritt ausgewählt aus Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie und reverse Phase-Chromatographie.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Metallionen-Affinitätschromatographie auf einem chelatisierenden Harz durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Ionenaustauschchromatographie Kationenaustauschchromatographie ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Kationenaustauschchromatographie auf einem Carboxymethyl (CM)-Harz durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie auf einem Phenylharz durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der Schritt der reverse Phase-Chromatographie auf einer polymeren reverse Phase-Matrix durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die polymere reverse Phase-Matrix die reverse Phase-Quelle 30 RPC ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 12, umfassend die Schritte (a) Unterziehen eines Fluids einer Metallionen-Affinitätschromatographie (b) Unterziehen des Eluats der Metallionen-Affinitätschromatographie einer Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie, (c) Unterziehen des Eluats der Hydrophob-Ladungsinduktionschromatographie einer Ionenaustauschchromatographie, (d) Unterziehen des Durchflusses aus der Kationenaustauschchromatographie einer hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie, (e) Unterziehen des Eluats der hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie einer reverse Phase-Chromatographie.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend einen oder mehrere Ultrafiltrationsschritte.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend einen oder mehrere Virenentfernungsfiltrationsschritte.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend einen Anfangsabfangschritt.
Verfahren nach Anspruch 16, worin der Abfangschritt durch starke Anionen-Austauschchromatographie durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, worin der Abfangschritt auf einem quartären Ammonium (Q)-Harz durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, worin der Einfangschritt auf einem TMAE-Harz durchgeführt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 19, worin das IL-18BP humanes, rekombinantes IL-18BP ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 19, worin das Fluid serumfreier Zellkulturüberstand ist.