DE60206847T2

DE60206847T2 - Verfahren für die Reinigung von Interferon-Proteinen mittels Kationen-Austauschchromatographie

Info

Publication number: DE60206847T2
Application number: DE60206847T
Authority: DE
Inventors: Lucia Scapol; Giuseppe Claudio Viscomi
Original assignee: Alfa Wasserman SpA
Current assignee: Alfa Wasserman SpA
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2022-06-20
Also published as: KR100771252B1; ATE307824T1; CA2388716C; JP2003096092A; ES2250544T3; RU2274471C2; EP1273592A3; HRP20020480B1; KR20030005005A; HRP20020480A2; YU50502A; RU2002117383A; CN1396176A; SI1273592T1; CN100484954C; EG23150A; PL209954B1; CU23149A3; ITBO20010426A1; ITBO20010426A0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein großer Teil der biomedizinischen Wissenschaften basiert selbst auf der Verwendung von pharmakologisch aktiven Proteinen sowohl natürlichen Ursprungs, erhalten durch Extraktionstechniken, als auch synthetischen Ursprungs, erhalten mittels DNA-Rekombinationstechniken. Der Reinheitsgrad der interessierenden Produkte ist in beiden Fällen von Bedeutung, da das Verständnis ihrer Aktivität durch Möglichkeit einer festen Verknüpfung der biologischen Wirkung mit dem Vorliegen einer festgelegten Menge des Proteins bestimmt wird.
In diesem Kontext haben die Reinigungsverfahren pharmakologisch aktiver Proteine eine wichtige Rolle erhalten, da die Reinheit des hergestellten Proteins beachtliche Bedeutung annimmt, wenn aktive Prinzipien oder Exzipientien, die in medizinischen Spezialitäten enthalten sind, involviert sind. Die Möglichkeit, toxische Wirkungen zu verursachen, und/oder nachteilige Wirkungen während der Therapie zu produzieren, haben in der Tat die für die Registrierung und Autorisierung der Vermarktung von Arzneimitteln, die auf Proteinen beruhen, verantwortlichen Stellen dazu getrieben, immer strengere Vorschriften einzuführen, um die Qualität und die Herstellungskonsistenz von aktiven Prinzipien mit Proteinursprung, die in vermarketeten Arzneimitteln enthalten sind, zu bestimmen.
Aus den obigen Ausführungen wird die Bedeutung der Reinigungsverfahren der Proteine deutlich, bei denen die Hauptschwierigkeit in der Tatsache liegt, dass die pharmakologisch aktiven Proteine immer in zusammengesetzten Gemischen zusammen mit vielen anderen Proteinen vorliegen.
Diese Tatsache gilt sowohl für den Fall, dass natürliche Quellen zum Extrahieren des pharmakologisch aktiven Proteins verwendet werden, wie z.B. Blut, Extrakte aus Tier- oder Pflanzenorganen, als auch im Fall der Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken, da die Proteine unabhängig von ihrer Herkunft chemisch-physikalische Eigenschaften zeigen, die ähnlich zwischen ihnen sind.
Aus den obigen Ausführungen wird klar, dass im Fall von Reinigungen pharmakologisch aktiver Proteine, ein Protein, das mit anderen Proteinen mit ähnlichen Eigenschaften und oft im Vergleich zur Menge des gewünschten Proteins in reichlichen Mengen vorkommt, mit einem hohen Reinheitsgrad isoliert werden soll.
Die Aufgabe ist anspruchsvoll und normalerweise werden mehrere Reinigungsschritte verwendet, um die gewünschten Reinheitsgrade zu erreichen. Die Reinigungsverfahren werden auf diese Weise sehr kompliziert und der Erfolg einer industriellen Herstellung eines Proteins ist im Wesentlichen an die Effizienz des Reinigungsverfahrens gebunden, da dieser Letztgenannte weitgehend die Herstellungskosten bestimmt.
Zur Reinigung von Proteinen werden viele Techniken eingesetzt, wie z.B. selektive Präzipitationen in wässrigen und organischen Lösungsmitteln oder mit chaotropen Mitteln; Trennungen mittels Filtrationen und/oder Dialyse; Immunpräzipitationsverfahren mit geeigneten Antikörpern; chromatogaphische Verfahren. Diese Letztgenannten haben in den letzten Jahren weitaus die größere Bedeutung erlangt, hauptsächlich, weil sie die erforderlichen Reinheitsgrade liefern, wie es von Regnier F. E. in J. Chromatogr. 418, 115–143, (1987) beschrieben wird.
In der wissenschaftlichen Literatur sind viele Techniken zitiert und diese können auf der Basis des zur Trennung der Proteine angewendeten Wirkmechanismus klassifiziert werden, z.B. Trennung auf der Basis des Molekulargewichts, Absorption an polaren Matrices, auch normale stationäre Phasen genannt, Absorption an nicht-polaren Matrices, auch stationäre Umkehrphasen genannt, Absorption durch selektive Affinität mit Liganden, die an inerte Matrices gebunden sind, wie Schwermetalle, wie Kupfer, Zink, Eisen und Platin, chemische Farbstoffe, wie Brilliantblau, Proteine, wie Protein A und Protein G, Kohlenhydrate, wie die Polysaccharide und die Glucosaminoglycane, Absorption durch Immunaffinität mit spezifischen Antikörpern, die an inerte Matrices gebunden sind, Absorption durch ionische Wechselwirkung mit elektrostatisch geladenen Liganden, die an inerte Matrices gebunden sind.
Die Selektivität, d.h. die Fähigkeit, das gewünschte Protein selektiv zu erkennen, die Kosten und die Möglichkeit, auf industriellem Level verwendet zu werden, werden als Parameter zur Beurteilung der Leistungsfähigketen der verschiedenen Chromatographietechniken eingesetzt.
Auf der Basis dieser Parameter wird die Immunaffinitätschromatographie als die angesehen, die die größte Selektivität gewährleistet, die aber Nachteile, wie hohe Verwendungskosten, Gefahren einer Denaturierung des Antikörpers und Gefahren, die mit der Endsicherheit des gereinigten Produkts in Verbindung stehen, da der Antikörper tierischen Ursprungs ist, zeigt.
Die Chromatographie, die die Ionenwechselwirkung verwendet, auch Ionenaustauschchromatographie genannt, wird als die weniger mit Risiken behaftete Technik zur Beibehaltung der pharmakologischen Aktivität der Proteine und als die einfacher in industriellem Maßstab mit geringen Behandlungskosten durchzuführende angesehen, allerdings zeigt sie den Nachteil, dass sie schlecht selektiv ist.
Daher wäre es sehr vorteilhaft, Ausführungsbedingungen einer Ionenaustauschchromatographie zu finden, die ihre Selektivität erhöht, so dass sie unter dem Gesichtspunkt der Reinheit des erhaltenen Produktes mit den anderen Techniken konkurrenzfähig gemacht wird.
Die Ionenaustauschchromatographie wird üblicherweise unter Verwendung von Säulen verschiedener Größen, die mit festen Matrices, welche chemische Gruppen enthalten, die permanent oder unter besonderen Bedingungen elektrostatisch geladen sind, gefüllt sind, durchgeführt.
Eine Verbindung, die in eine Ionenaustauschsäule gegeben wird, wechselwirkt durch Coulomb-Anziehung/Abstoßung mit den an die Matrix gebundenen Ladungen. Unterschiedliche Verbindungen, die in einem Gemisch enthalten sind, werden fähig sein, als Funktion der Menge der besessenen Ladung an die stationäre Phase selbst zu binden und sie werden folglich mehr oder weniger zurückgehalten, was ihre Trennung am Säulenausgang definiert.
Die Chromatographie wird Kationenaustauschchromatographie genannt, wenn die Ladungen der Matrix negativ sind und die Kationen zurückgehalten werden, während sie Anionenaustauschchromatographie genannt wird, wenn die Ladungen der Matrix positiv sind.
Die Proteine sind Verbindungen, die hohes Molekulargewicht haben, nämlich höher als 10.000 Dalton, die aus heterogenen Aminosäurepolymeren hergestellt sind; einige Aminosäuren haben in ihrer Seitenkette funktionelle Gruppen, die als Funktion des pH der Lösung in negativer Weise ionisiert werden können, saure Aminosäuren, oder in positiver Weise, basische Aminosäuren, und daher besitzen alle Proteine eine große Anzahl negativer und positiver Ladungen. Der isoelektrische Punkt, pI, eines Proteins ist der pH, bei dem das Protein neutral ist, da die Verteilung der negativen Ladungen gleich der der positiven Ladungen ist: ein Protein, das in ein elektronisches Feld gebracht wird, wird bei pI von keiner der Polaritäten des elektrischen Felds angezogen.
Die Zahl der negativen Ladungen nimmt bei einem pH, der höher als pI ist, zu und das Protein erreicht eine negative Nettoladung, während das Gegenteil bei einem pH auftritt, der niedriger als pI ist, und das Protein erreicht eine positive Nettoladung. Jedes Protein hat seinen eigenen charakteristischen pI, der sich von den anderen unterscheidet, und einige Proteine tendieren dazu, am isoelektrischen Punkt unlöslich zu werden.
Wenn ein Protein in einer Lösung mit einem pH unter pI ist, hat es eine positive Nettoladung und kann daher mit einer negativ geladenen Matrix wechselwirken und kann einer Kationenaustauschchromatographie unterworfen werden, während das Protein bei einem pH, der über seinem pI liegt, einer Anionenaustauschchromatographie unterzogen werden kann, wie es von Regnier F. E., Science, 238, 319–323, (1987) und von Yamamoto S. et al., Chromatographic Science Series, 43, (1988), Marcel Dekker, Inc., Hrsg., New York beschrieben wurde.
Dagegen haben wir unerwarteterweise gefunden, und auf dieser Tatsache basiert der Gegenstand der vorliegenden Erfindung selbst, dass es möglich ist, einen Bereich von pH-Werten zu finden, die höher sind als der entsprechende pI des Proteins, wobei bei diesem pH das Protein noch an Kationenaustauschchromatographie-Matrices absorbiert bleibt, so dass es noch möglich ist, Kationenaustauschchromatographien durchzuführen. Eine solche Situation ist besonders wichtig, da unter diesen Bedingungen eine hohe Selektivität zwischen den Proteinen erzielt wird, da auch sehr geringe Differenzen des pI zwischen Proteinen ausreichend werden, um deutliche Trennungen zu erhalten, so dass eine hocheffiziente Reinigung erzielt wird.
Dieser zuletzt genannte Aspekt ist in Reinigungsverfahren rekombinanter Proteine besonders wichtig, in denen das gewünschte Produkt oft von in Korrelation stehenden Verunreinigungen, d.h. hergestellt durch sehr kleine Strukturänderungen des Produktes, begleitet ist, wie z.B. unterschiedliche Oxidationszustände, Acetylierungen, Verlust der Amidfunktion usw. Diese Art der Verunreinigungen ist sehr schwierig zu entfernen, und zwar auch mit Hilfe von Immunaffinitätschromatographien, da die Antikörper in den meisten Fällen nicht fähig sind, diese zu unterscheiden.
Der Mechanismus, der das gefundene Phänomen erklären kann, beruht selbst auf der Tatsache, dass die Verteilung der Ladungen entlang der äußeren Oberfläche der Proteine nicht gleichmäßig ist, so dass, auch wenn der pH wenig höher als der pI ist und das Protein eine negative Gesamtnettoladung hat, es noch einige positive Ladungen gibt, die im Molekül lokalisiert sind und mit einer negativen stationären Phase wechselwirken können.
Um diesen Mechanismus effektiv zu machen, ist es wichtig, dass der Überschuss an negativen Ladungen nicht zur sehr angehoben wird, da die aus den negativen Ladungen gebildeten elektrischen Felder ansonsten so hoch wären, dass sie die Wechselwirkung des gesamten Proteins mit der negativ geladenen chromatographischen Matrix verhindern würden.
Darüber hinaus ist es notwendig, dass die Ionenstärke der Lösungen, die als Elutionsmittel verwendet werden, in geeigneter Weise kontrolliert wird, da eine hohe Ionenstärke die Wirkung der Abschirmung des Proteins haben würde, so dass dessen Wechselwirkung mit der stationären Phase verhindert würde.
Lampson, G. P. et al., Anal. Biochem., 11, 374–377 (1965), berichten bestätigend den Fall von Proteinen, wie humanem gamma-Globulin, Ribonuclease, Hämoglobin, delta-Chymotrypsin, Globin und Lysozym, bei denen die Erzeugung kleiner pH-Variationen, allerdings Aufrechterhalten einer viel zu hohen Ionenstärke, erreicht durch eine 0,1 M-Phosphatlösung, zur Elution bei Kationenaustauschchromatographien bei einem pH von fast 0,4 Einheiten unter pI führte.
Das oben genannte Prinzip, auf dem die vorliegende Erfindung selbst basiert, wurde nach Kenntnis der Erfinder niemals verwendet, um effiziente Protein-Reinigungsverfahren durchzuführen. Die Möglichkeit der Ausnutzung von Differenzen des isoelektrischen Punkts von Proteinen zur Optimierung der Reinigungsverfahren, die von Kontturi A. K. et al., Acta Chem. Scand., 50 (2), 102–106, (1996), beschrieben wurde, betrifft in der Tat eine herkömmliche Verwendung der Ionenaustauschchromatographie, wobei die Kationenaustauschchromatographie immer bei einem pH unter dem isoelektrischen Punkt durchgeführt wird, während die Anionenaustauschchromatographie bei einem pH über dem isoelektrischen Punkt durchgeführt wird. Das in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebene Verfahren ist so, dass die Kationenaustauschchromatographien im Gegenteil bei einem pH über dem isoelektrischen Punkt des Proteins durchgeführt werden.
Das in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebene Verfahren kann als ein Verfahren allgemeiner Natur angesehen werden, wie es in den angeführten Beispielen gezeigt wird, wobei bewiesen wurde, wie es erfolgreich sowohl auf ein Protein natürlichen Ursprungs als auch ein Protein aus rekombinanter DNA erfolgreich anwendbar ist. Der Unterschied zwischen Protein und Protein liegt in der Ausdehnung des Bereichs des Gebietes des pH, höher als pI, der für die Reinigung des interessierenden Proteins verwendbar ist. Wie es in den folgenden Beispielen gezeigt werden wird, ist tatsächlich ein derartiger Bereich 0,2 pH-Einheiten im Fall der Interferon-Proteine, während er etwa 1 pH-Einheit im Fall von Albumin ist.
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf die Reinigung eines rekombinanten alpha-Interferons (rIFNα), dessen isoelektrischer Punkt 5,9 ist, wie von Thatcher D. und Panayota tos N., Methods Enzymol. 119, 166–177, (1986), beschrieben, wird unter den Beispielen beschrieben und es wird gezeigt, wie es möglich und vorteilhaft ist, dieses in einem Kationenaustausch bei einem pH von 6,1 zu reinigen. Darüber hinaus wird das Beispiel des humanen Serumalbumins angeführt, dessen pI 4,9 ist, wie es von Rylatt D. B. et al., J. Chromatogr., 865, 145–153, (1999), beschrieben ist, und es wird gezeigt werden, wie es möglich und vorteilhaft ist, es im Kationenaustausch bei einem pH von 6,0 zu reinigen.
Die Vorzüge des erfindungsgemäßen Verfahrens sind sehr beachtlich, wenn man Vergleichen mit den Resultaten der Verfahren anstellt, die in wissenschaftlichen Publikationen und/oder Patenten beschrieben sind, die auf die Reinigung von α-Interferon und humanem Serumalbumin gerichtet sind, wobei diese Verfahren üblicherweise drei oder mehr aufeinander folgende Behandlungen benötigen, eine Tatsache, die hohe Industriekosten und eine Verringerung der Ausbeute verursacht. Thatcher D. und Panayotatos N. beschreiben die Reinigung des humanen rekombinanten α-Interferons rIFN-α2, Methods Enzymol., 119, 166–177, (1986), durch fünf aufeinander folgende Behandlungen:
a) Kationenaustauschchromatographie; b) Anionenaustauschchromatographie; c) Affinitätschromatographie für Schwermetalle; d) Behandlung mit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung; e) Molekülausschlusschromatographie.
Das Europäische Patent 0 108 585 beschreibt für die Reinigung des Interferons die aufeinander folgende Verwendung von drei Chromatographietypen: a) Immunoaffinität; b) Kationenaustausch; c) Molekülausschluss. Das U.S. Patent 4,765,903 beschreibt für die Interferonreinigung die sequentielle Verwendung von vier Chromatographietypen: a) Immunaffinität mit monoclonalem Antikörper; b) Umkehrphase; c) Kationenaustausch; d) Molekülausschluss.
Das Europäische Patent 0 679 718 beschreibt ein Verfahren für die alpha-Interferon-Produktion, das die folgenden vier chromatographischen Schritte in Betracht zieht: a) Metallchelatbildung; b) Kationenaustausch; c) Anionenaustausch; d) Gelfiltration.
Andere Publikationen und Patente beschreiben drei oder mehr Behandlungen, die für die Reinigung der Interferon-Proteine notwendig sind, z.B. U.S. Patent 4,732,683, Internationale Patentanmeldung WO 8604067 und die Publikation von Khan F. R. und Rai V. R., Bioprocess Technol., 7, 161–169, (1990).
Die angeführten Beispiele decken das relevanteste Material ab, das über die Reinigung von Interferon im Allgemeinen und von alpha-Interferon im Besonderen berichtet wurde. Sie zeigen, wie die Reinigung dieses Letztgenannten besonders schwierig ist und viele Reinigungsschritte erfordert. Darüber hinaus muss betont werden, wie hohe Reinheitsgrade insbesondere durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern murinen Ursprungs erhalten werden. Allerdings verursacht das Vorliegen einer derartigen chromatographischen Technik in Verfahren einer industriellen Produktion, die auf die Herstellung aktiver Prinzipien zur pharmazeutischen Verwendung beim Menschen abzielt, das Risiko möglicher viraler Kontaminationen aus Viren murinen Ursprungs wegen des Vorliegens möglicher immunogener Fragmente, die aus den murinen Immunglobulinen kommen, im Endprodukt und wegen der Schwierigkeiten, die chromatographischen Matrices unter industriellem Gesichtspunkt zu bewerten.
Aus den kurz erläuterten Beispielen resultiert, dass Kationenaustauschchromatographie in großem Umfang zu verwenden ist, allerdings niemals als einzige Trenntechnik, da ihre Leistungsfähigkeiten bezüglich der Erhöhung der Reinheitsgrade begrenzt sind.
Die Publikationen von Babu K. R. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53 (6), 655–660, (2000) und Bouyon R. et al., Biotecnologia Aplicada, 14, 189–192, (1997), beschreiben Reinigungsverfahren von alpha-Interferon in einem Schritt mittels Ionenaustauschchromatographie in einem Salzgradienten. Um jedoch in beiden Fällen ein ausreichend reines Produkt zu erhalten, mussten die Autoren nur einige der chromatographischen Fraktionen, in denen das alpha-Interferon enthalten ist, isolieren, um so sehr geringe Ausbeuten bis zu einem Minimum von 7,5% zu erhalten. Darüber hinaus sind die beschriebenen Chromatographie-Reinigungsverfahren in Salzgradient nicht geeignet, auf industriellem Level verwendet zu werden.
Auch im Fall des humanen Albumins sind viele chromatographische Reinigungstechniken beschrieben worden, die von Albuminpräparaten ausgehen, die durch Fraktionierung von humanem Serum oder durch DNA-Rekombinationstechniken erhalten werden, Techniken, die komplex und kaum auf den industriellen Level übertragbar sind und die bestätigen, wie das Problem einer wirksamen Reinigung von humanem Albumin, sowohl natürlichen wie auch rekombinantem Ursprungs, noch besteht.
Die U.S. Patente 6,150,504 und 5,521,287 beschreiben die Reinigung des Albumins mittels Ionenaustauschchromatographie und hydrophober Wechselwirkung. Das im U.S. Patent 6,034,221 beschriebene Reinigungsschema zieht die Albuminreinigung durch zwei chromatographische Schritte, ein Ultrafiltrationsverfahren und zwei weitere Schritte einer chromatographischen Reinigung in Betracht.
Weniger konventionelle Verfahren der Albuminreinigung, bei denen Anionenaustauschchromatographien im Fließbett oder Affinitätschromatographien, die mit im Handel verfügbaren Matrices, wie die von Streamline^® oder geeigneterweise hergestellte, wie Partikel aus modifiziertem Zirkonium oder Emulsionen von Perfluorkohlenwasserstoffen wechselwirken, verwendet werden, werden im U.S. Patent 5,962,649 und in den Publikationen von Sumi A. et al., Bioseparation, 8 (1–5), 195–200, (1999), Mullick A. und Flickinger M. C., Biotechnol. Bioeng., 65(3), 282–290, (1999) und Mc Creath G. E. et al., J. Chromatogr., 597 (1–2), 189–196, (1992), beschrieben.
Schließlich wurden auch Albumin-Reinigungstechniken an Schwermetallen von Yang L. et al., Sheng Wu Kung Cheng Hsueh Pao, 16 (1), 74–77, (2000), und Affinitätstechniken an Matrices, an welche Farbstoffmoleküle, wie Cibacron Blue F3G gebunden sind, von Companini A. et al., J. Chromatogr. A, 736(1–2), 115, (1996), beschrieben.
U.S. 6,194,553 offenbart das Verfahren zur Reinigung von alpha-1-Proteinaseinhibitor unter Verwendung einer Kationenaustauschchromatographie an einer festen Matrix, wobei die Kationenaustauschchromatographie bei einem basischeren pH als dem pH, der dem isoelektrischen Punkt entspricht, durchgeführt wird.
EP 0 203 382 offenbart ein Verfahren für die Reinigung von alpha-Interferon unter Verwendung einer Kationenaustauschchromatographie bei pH 4,5 bis 5,0.
Alle diese Techniken zeigen in verschiedener Weise Probleme der Durchführungskomple xität und hoher Kosten, so dass das Problem, neue Reinigungsverfahren für pharmakologisch aktive Proteine mit sowohl einfacher wie auch effizienter industrieller Durchführbarkeit, die wirtschaftlich vorteilhaft sind, zu unterscheiden, noch nicht gelöst ist.
Die unten beschriebene Erfindung liefert eine Antwort auf diese wichtigen Anforderungen, indem ein Verfahren für die Reinigung von Interferon-Proteinen mit einfacher industrieller Verwertung und niedrigen Kosten bei beachtlichen wirtschaftlichen Vorteilen bereitgestellt wird.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von Interferon- Proteinen, bestehend aus der Durchführung einer Kationenaustauschchromatographie an einer festen Matrix bei einem basischeren pH als dem pH, der dem isoelektrischen Punkt pI der zu reinigenden Proteine entspricht, wobei bei diesem pH die Proteine noch absorbiert bleiben, und Eluierung der Proteine durch Erhöhen der Ionenstärke und/oder des pH der wässrigen Pufferlösungen.
Die effektive Leistungsfähigkeit der vorliegenden Erfindung erfordert die Individuation der richtigen Kombination aus der zu verwendenden chromatographischen Matrix, dem pH-Wert, der höher als der pI ist, und der Ionenstärke, die in den chromatographischen Elutionsmitteln eingesetzt wird, da, sobald die chromatogaphische Matrix einmal definiert ist, effiziente Reinigungen erhalten werden können, indem begrenzte Variationen von pH und/oder Ionenstärke, oft von Zehntel pH-Einheiten und/oder Variationen der Ionenstärke von wenigen hundert μS durchgeführt werden.
Alle die funktionalisierten festen Matrices, die üblicherweise als stationäre Phasen für Kationenaustauschchromatographien eingesetzt werden, können verwendet werden, insbesondere sind allerdings die stationären Phasen, die für starken Kationenaustausch genannt werden, bevorzugt, wenn der pI des zu reinigenden Proteins unter 6 liegt, während stationäre Phasen mit sowohl starkem wie auch schwachem Kationenaustausch ohne Ausnahme für Proteine, die pI-Werte von höher als 6 haben, verwendet werden können. Diese stationären Phasen können eine Siliciumdioxid- oder Polymermatrix haben, die durch Sulfon- oder Carboxylgruppen, sowohl in Protonform als auch Alkalisalzform, funktionalisiert sind. Im Handel verfügbare stationäre Phasen, wie z.B. Source^® S (Pharmacia Biotech.), Sepharose^® SP-Fast Flow, Sepharose^® SP-High Performance, Sp Sepharose^® XL (Pharmacia Biotech), Fractogel^® S (Merck, Darmstadt), Mustang^® S (Pall Corporate), CM Sepharose^® FF (Pharmacia Biotech), Dowex^®, Bio-Rad^® AG (Bio-Rad), Poros^® S (PerSeptive Biosytems), Shodex^®-S, Toyopearl^® SP (Tosohass) können mit Erfolg eingesetzt werden.
Der Bereich der pH-Werte, bei dem die vorliegende Erfindung effizient durchgeführt werden kann, ist sehr breit, hängt von den isoelektrischen Punkten der Interferon-Proteine, die zu reinigen sind, ab und liegt zwischen 2 und 11, vorzugsweise zwischen 4 und 8,5. Die Ausdehnung des Bereichs der pH-Werte, die höher als pI sind, in dem das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren anwendbar ist, kann von pH-Werten, die dem pI der Interferon-Proteine entsprechen, bis zu 1 pH-Einheit über dem pI variieren, was deutliche Differenzen von Protein zu Protein zeigt.
Beispielsweise wurde festgestellt, dass es im Fall des rekombinanten alpha-2b-Interferon (rIFNα-2b) möglich ist, die Absorption des Proteins an einer Kationenaustauschmatrix bis 0,2 pH-Einheiten über seinen pI von 5,9 zu erhalten, und folglich ist es möglich, seine Reinigung mittels Kationenaustauschchromatographie durchzuführen, während festgestellt wurde, dass im Fall des humanen Serumalbumins (Vergleichsbeispiel) das Protein bis eine pH-Einheit über seinem pI absorbiert bleibt.
Der Bereich der Salzkonzentrationen der wässrigen Lösungen, die als effizient einsetzbare Eluierungsmittel verwendet werden, hängt von der Art der zu reinigenden Interferon-Proteine ab und es wurde festgestellt, dass er zwischen Werten von 1 mM und 100 mM, vorzugsweise zwischen 1 mM und 30 mM liegt. Im Fall der Reinigung des rekombinanten alpha-2b-Interferons (rIFNα-2b) liegt die Konzentration der wässrigen Salzlösungen zwischen 1 mM und 30 mM, vorzugsweise zwischen 5 und 15 mM.
Die Notwendigkeit, feste und stabile pH-Werte für die Elutionsmittel zu haben, die für die Chromatographien gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, macht es sehr nützlich, wenn nicht absolut notwendig, wässrige Lösungen zu verwenden, die in geeigneter Weise gepuffert sind, die 5 bis 100 mM, vorzugsweise 10 bis 20 mM, gepufferte Gemische enthalten. Jede chemische Substanz oder jedes Gemisch chemischer Substanzen mit Puffervermögen im Bereich des pH zwischen 2 und 11 kann vorteilhafterweise verwendet werden, da die pH-Werte der Elutionsmittel, die verwendet werden können, zwischen 2 und 11 liegen.
Viele wässrige Pufferlösungen können vorteilhafterweise bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden; diese umfassen solche, die enthalten: Glycin und Natriumchlorid, Maleinsäure und Natriumhydroxid, Malonsäure und Natriumhydroxid, Milchsäure und Natriumhydroxid, Ameisensäure und Natrium- oder Lithiumhydroxid, Bernsteinsäure und Natriumhydroxid, N-Methylpiperazin und Salzsäure, Piperazin und Salzsäure oder Essigsäure, L-Histidin und Salzsäure, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure und Natrium- oder Lithiumhydroxid, N-Methyldiethanolamin und Schwefelsäure, N-Methyldiethanolamin und Salzsäure oder Essigsäure, Pyridin und Ameisensäure, dibasisches Natriumcitrat und Natriumhydroxid, monobasisches Kaliumphthalat und Salzsäure, monobasisches Kaliumphthalat und Natriumhydroxid, monobasisches Kaliumphosphat und dibasisches Natriumphosphat, Bicin und Natriumhydroxid, Natriumbarbital und Salzsäure, Natriumborat und Salzsäure, Natriumborat und Natriumhydroxid, 1,3-Diaminopropan und Salzsäure, Citronensäure und dibasisches Natriumphosphat, Natriumacetat und Essigsäure, Imidazol und Salzsäure, Triethanolamin und Salzsäure oder Essigsäure, Tris(hydroxymethylaminomethan) und Salzsäure, Natriumcarbonat und saures Natriumcarbonat, Ethanolamin und Salzsäure, Piperidin und Salzsäure, Trimethylamin und Ameisensäure, Pyridin und Essigsäure, Trimethylamin und Essigsäure, Trimethylamin und Salzsäure, Ammoniumhydroxid und Essigsäure, Trimethylamin und Natriumcarbonat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumhydroxid.
Insbesondere im Fall der Reinigung des rekombinanten alpha-2b-Interferons (rIFNα-2b) können alle die Pufferlösungen verwendet werden, die Puffervermögen bei einem pH zwischen 5,9 und 6,1 haben, vorzugsweise Pufferlösungen bei einem pH zwischen 5,9 und 6,1, die monobasisches Kaliumphosphat und dibasisches Natriumphosphat, monobasisches Kaliumphthalat und Natriumhydroxid, dibasisches Natriumcitrat und Natriumhydroxid, Citronensäure und dibasisches Natriumphosphat, Imidazol und Salzsäure enthalten, während im Fall der Reinigung des humanen Serumalbumins Pufferlösungen verwendet werden können, die dieselben Gemische von chemischen Verbindungen enthalten, die eine Pufferkapazität bei einem pH zwischen 4,9 und 6,0 aufweisen.
Die wässrigen Lösungen, die als Elutionsmittel verwendet werden, können zusätzlich zu den chemischen Substanzen, die zum Puffern des pH verwendet werden, auch chemische Substanzen enthalten, die das Ziel haben, die Ionenstärke der Lösung zu modifizieren. Zu diesem Zweck können vorteilhafterweise sowohl organische Salze, z.B. Carboxylate, Alkylsulfonate, Phthalate, oder anorganische Salze, wie z.B. Sulfate, Chloride, Phosphate, die mit Natrium, Kalium, Ammonium, primären, sekundären, tertiären oder aromatischen Aminen ein Salz bilden können, eingesetzt werden.
Diese Verbindungen können vorteilhafterweise bei einer Konzentration zwischen Werten von 1 mM bis 100 mM, vorzugsweise zwischen 1 mM und 30 mM, verwendet werden.
Im Fall der Reinigung des rekombinanten alpha-2b-Interferons (rIFNα-2b) kann z.B. die Konzentration dieser Verbindungen zwischen 1 mM und 30 mM, vorzugsweise zwischen 2 und 20 mM, variieren.
Die Effizienz der Reinigung kann vor der Elution der Interferon-Proteine durch einen oder mehrere Waschgänge erhöht werden, die mit Elutionsmitteln durchgeführt werden, die einen geeigneten pH und geeignete Ionenstärke haben, so dass die Säule immer bei einem pH ist, der höher als pI ist. Im Fall des rekombinanten alpha-2b-Interferons (rIFNα-2b), dessen pI 5,9 ist, können Waschvorgänge mit Pufferlösungen mit einem pH, der zwischen 6,0 und 6,1 liegt, durchgeführt werden. Die Menge an Elutionsmittel, die während dieser Waschgänge durchgeführt wird, ist variabel, liegt normalerweise zwischen 5 und 100 Säulenvolumina (CV), im Fall des rekombinanten alpha-2b-Interferons (rIFNα-2b) zwischen 10 und 80 CV.
Die Menge des zu reinigenden Produktes, die in die Säule gegeben werden kann, hängt von den verwendeten Chromatographiematrices ab, und kann bis zu einem Maximum von 100 Milligramm Gesamtproteine pro jedem Milliliter stationäre Phase erreichen, wenn auch üblicherweise geringere Mengen verwendet werden, die zwischen 5 und 20 mg/ml liegen.
Die Elutionsmittel können mit einer linearen Geschwindigkeit, die mit den stationären Phasen kompatibel ist, die Säule passieren, und zwar bis zu einem Maximumwert von 10 cm/min. Das oben erläuterte Reinigungsverfahren kann auf alle Interferon-Proteine, insbesondere auf die Interferone alpha, beta, gamma, delta, omega, tau, auf das natürliche alpha-Interferon aus Leukozyten, auf rekombinantes alpha-2b und Consensus-Interferone natürlichen und rekombinanten Ursprungs angewendet werden.
Der Rahmen des oben beschriebenen Reinigungsverfahrens soll in industrieller und wirtschaftlicher Weise pharmakologisch aktive Proteine mit einem solchen Reinheitsgrad ergeben, dass sie direkt zur Herstellung der medizinischen Spezialitäten, die sie enthalten, zu verwenden sind. Die medizinischen Spezialitäten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, sind insbesondere solche, die Interferon enthalten, noch bevorzugter solche, die rekombinantes alpha-2b-Interferon (rIFNα-2b) natürlichen und rekombinanten Ursprungs enthalten.
Im Folgenden werden einige erläuternde Beispiele für das Verfahren der vorliegenden Erfindung angeführt.
BEISPIEL 1
Produktion des rekombinanten alpha-2b-Interferon (rIFNα-2b)
Ein Teil der Zellen des Escherichia coli BL21 DE3-Stamms war mit 5 ng des pET9a-IFNα-2b-Plasmids transformiert worden, das durch Klonieren eines synthetischen Gens, das die humane Gensequenz von IFNα-2b reproduziert, das geeignet modifiziert ist, um die Sequenz an die in Escherichia coli häufigeren Codons anzupassen, in das pET9a-Plasmid (Novagen) erhalten wurde.
Die von den Escherichia coli-Zellen, die wie oben angegeben modifiziert worden waren, exprimierte Proteinsequenz entspricht der, die in Methods in Enzymology, Interferons, Teil C, Hrsg. Pestka S., 119, 3–14, (1986), veröffentlicht von Academic Press Inc., beschrieben sind.
Der Escherichia coli BL21 DE3-Stamm, der mit dem pET9a-IFNα-2b-Plasmid transformiert war, wurde in einem Kolben in einem geeigneten Kulturmedium, z.B. einer Lösung, die 12 g/l Phytopepton (Phyto peptoton, BBL), 24 g/l Hefeextrakte (Yeast extract, DIFCO), 4 g/l Glycerin (BDH) und Neomycin enthält, bei 37°C für eine Zeit, die ausreicht, um einen Wert der optischen Dichte bei 600 nm von 0,6–0,8 zu erreichen, üblicherweise in 7–9 Stunden, kultiviert. Die so erhaltene Kultur wird dann in einer Verdünnung von 1 bis 100 verwendet, um einen 5 l-Fermenter zu inokulieren, in dem ein Kulturmedium gleich dem des Kolbens, wie vorstehend beschrieben, enthalten war. Die Kultur wird 14 Stunden bei 37°C mit einer Belüftung von einem Luftvolumen je Minute, bezogen auf das Kulturvolumen, gehalten.
Die Bakterienzellen werden durch Zentrifugation bei 6000 Umdrehungen pro Minute (UpM) am Ende der Kultur gesammelt, sie werden in einer geeigneten wässrigen Lösung, die 1 mM Dithiothreitol (DTT) in einer Menge von nicht mehr als 6 ml pro Gramm Nassgewicht der zentrifugierten Bakterien suspendiert. Die Bakteriensuspension wird mittels konsolidierter und beschriebener Techniken, wie z.B. Brechen durch Ultraschallwellen oder durch hydraulischen Druck einer Zelllyse unterworfen.
Die resultierende Suspension wird durch Zentrifugation isoliert und der feste Teil wird in 50 ml Salzlösung, die 1 mM DTT enthält, suspendiert und erneut zentrifugiert.
Die feste Komponente, die einen Bestandteil der eingeschlossenen Körper bildet, wird gesammelt und unter kräftigem Rühren bei Raumtemperatur in 450 ml einer Lösung, die 6 M Guanidiniumchlorid, 50 mM Tris-HCl mit pH 8 und 0,1 mM EDTA enthält, suspendiert. Die Suspension wird zentrifugiert und der Überstand wird in einem Verhältnis von 1 zu 100 bis 1 zu 200 in einer Salzlösung, die 50 mM Tris-HCl mit pH 8 und 0,1 mM EDTA mit pH 8 enthält, die zur Renaturierung des Proteins geeignet ist, verdünnt. Die Lösung für die Renaturierung kann Aminosäuren, wie z.B. Glycin oder Arginin; Gemische von Verbindungen, die Sulfide in der oxidierten oder reduzierten Form mit der gebildeten Disulfidbrücke enthalten, wie z.B. Glutathion, Ethanolamin, Cystein. Die Renaturierung wird unter kräftigem Rühren der Lösung bei 4°C für fast 72 Stunden durchgeführt und dann wird die Lösung filtriert und danach mit Hilfe eines Diafiltrationsverfahrens gegen einen Puffer, der aus 40 mM Tris-HCl mit pH 8 hergestellt ist, konzentriert, und zwar bis zu einem Endkonzentrierungsfaktor von 5- bis 10-fach. Die Endkonzentration der Lösung liegt üblicherweise zwischen 0,4 und 1,0 mg/ml.
BEISPIEL 2
Reinigung des rekombinanten alpha-2b-Interferon (rIFNα-2b)
Eine 1 M Natriumacetatlösung wird zu einer Endkonzentration von 20 mM zu dem Proteingemisch gegeben, welches rIFNα-2b aus Beispiel 1 enthält, und das Gemisch wird mit Essigsäure auf pH 5,5 gebracht. Die so erhaltene Lösung wird auf die Säule eines starken Kationenaustauschers gebracht, die die im Handel erhältliche chromatographische Matrix Mustang^® S (Pall Corporate) enthält. Die Kationenaustauschsäule wird vor Auftragen der Proteinlösung mittels einer 20 mM Natriumacetatlösung mit pH 5,5 in einer Menge, die 20 Säulenvolumina (CV) entspricht, konditioniert. Die Proteinlösung wird dann in einer solchen Menge aufgetragen, dass der 10 mg-Wert an Proteinen, aufgetragen pro Milliliter stationäre Phase, nicht überschritten wird, vorzugsweise aber in Mengen zwischen 6 und 8 mg/ml.
Nach dem Auftragen werden die an die stationäre Phase gebundenen Produkte einem ersten Waschzyklus mit einer Salzlösung mit pH 6,1, die durch ein Gemisch aus monobasischem Kaliumphosphat und dibasischem Natriumphosphat mit einer Gesamtkonzentration zwischen 5 und 15 mM hergestellt worden war, unterworfen. Die optimale Konzentration der Lösung ist jedenfalls durch die Tatsache fixiert, dass die Leitfähigkeit etwa 1800 μS nicht übersteigt. Es wird eine Gesamtmenge an Lösung, die zwischen 5 und 60 CV, vorzugsweise zwischen 25 und 35 CV, liegt, verwendet.
Dann wird ein zweiter Waschzyklus durchgeführt, indem dieselbe Lösung des ersten Waschzyklus, der eine Menge Kaliumchlorid bis zu einer Endkonzentration, die 3 mM, vorzugs weise 2 mM, nicht übersteigt, zugesetzt ist, verwendet wird; es wird eine Gesamtlösungsmenge zwischen 10 und 100 CV, vorzugsweise zwischen 30 und 60 CV, verwendet.
Nach den Waschzyklen wird eine Elutionsphase durchgeführt, indem eine Lösung wie die des ersten Waschzyklus mit einer Endmenge an Kaliumchlorid bei einer Konzentration zwischen 15 und 25 mM verwendet wird. Eine Lösungsgesamtmenge, die zwischen 15 und 40 CV, vorzugsweise zwischen 20 und 30 CV, liegt, wird zur Elution verwendet.
Alle Lösungen und die aufgeladene Probe gehen mit einer linearen Geschwindigkeit zwischen 0,1 und 1 cm/min, vorzugsweise zwischen 0,4 und 0,7 cm/min, durch die Säule.
Unter diesen Bedingungen wird rIFNα-2b mit einem Reinheitsgrad, der höher als 98% ist, eluiert, wobei der Reinheitsgrad in der Ausgangslösung etwa 40% war; die Wiedergewinnungsausbeute des gewünschten Produkts liegt über 80%.
Die chromatographischen Profile vor und nach der chromatographischen Reinigung sind in den 1a und 1b gezeigt.
1a zeigt das chromatographische Profil der Interferonlösung vor der Reinigung und 1b zeigt das chromatographische Profil nach der Reinigung.
Die chromatographischen Profile wurden durch HPLC mit Hilfe eines Flüssigchromatographen HP 1090 unter Verwendung einer Vydac C18-Säule und eines UV-Detektors, der auf 214 nm eingestellt war, erstellt. Die Elution wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min unter Verwendung eines Gemisches, das aus zwei Elutionsmitteln hergestellt war, durchgeführt: Elutionsmittel A aus 700 ml Wasser, 298 ml Acetonitril und 2 ml Trifluoressigsäure und Elutionsmittel B aus 198 ml Wasser, 800 ml Acetonitril und 2 ml Trifluoressigsäure. Die zwei Elutionsmittel wurden während der Elution nach der folgenden Tabelle vermischt:
BEISPIEL 3
Das Verfahren wird nach der Beschreibung von Beispiel 2 unter Verwendung einer Pufferlösung, die aus einbasischem Kaliumphthalat und Natriumhydroxid hergestellt ist, durchgeführt.
BEISPIEL 4
Das Verfahren wird nach der Beschreibung von Beispiel 2 unter Verwendung einer Pufferlösung, die aus dibasischem Natriumcitrat und Natriumhydroxid hergestellt ist, durchgeführt.
BEISPIEL 5
Das Verfahren wird nach der Beschreibung von Beispiel 2 unter Verwendung einer Pufferlösung, die aus Citronensäure und dibasischem Natriumphosphat hergestellt wurde, durchgeführt.
BEISPIEL 6
Das Verfahren wird nach der Beschreibung von Beispiel 2 unter Verwendung einer Pufferlösung, die aus Imidazol und Salzsäure hergestellt worden war, durchgeführt.

Claims

Verfahren zur Reinigung von Interferon-Proteinen, bestehend aus Durchführung einer Kationenaustauschchromatographie an einer festen Matrix bei einem basischeren pH als dem pH, der dem isoelektrischen Punkt pI, der zu reinigenden Proteine entspricht, wobei bei diesem pH die Proteine noch absorbiert bleiben, und Eluierung der Proteine durch Erhöhen der Ionenstärke und/oder des pH der wässrigen Pufferlösungen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrigen Pufferlösungen 5 bis 100 mM enthalten und wobei die Puffermischungen aus denen ausgewählt werden, die aus einbasigem Natriumphosphat und zweibasigem Natriumphosphat, einbasigem Kaliumphthalat und Natriumhydroxid, zweibasigem Natriumcitrat und Natriumhydroxid, Zitronensäure und zweibasigem Natriumphosphat oder Imidazol und Salzsäure hergestellt sind.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Pufferlösungen 1 bis 100 mM organische oder anorganische Salze enthalten, die geeignet sind, die Ionenstärke der Lösung zu modifizieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Interferon-Proteine Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Gamma-Interferon, Delta-Interferon, Omega-Interferon, Tau-Interferon, natürliches Alpha-Interferon aus Leukozyten, rekombinantes Alpha-2b-Interferon und Konsensus-Interferon sind.
Verfahren zur Reinigung des rekombinanten Alpha-2b-Interferons, rIFNα-2b, nach Anspruch 1, bestehend aus Aufbringen eines Proteingemisches, das aus der Herstellung des rIFNα-2b durch Fermentation, versetzt mit einer 1 M-Natriumacetatlösung und mit Essigsäure auf pH 5,5 gebracht, stammt, auf eine Säule, die mit einem starken Kationenaustauscherharz, das mit Hilfe einer 20 mM Natriumacetatlösung bei pH 5,5 konditioniert worden war, gefüllt ist, derart, dass zwischen 6 und 8 mg Protein für jeden Millimeter stationäre Phase vorhanden sind, Unterwerfen der Säule zwei Waschzyklen, zuerst mit einer Pufferlösung mit pH 6,1 mit einer Konzentration zwischen 5 und 15 mM, danach mit derselben Pufferlösung, die mit 2 mM Kaliumchlorid versetzt ist, und schließlich Eluieren des reinen rIFNα-2b aus der Säule durch Verwendung einer Pufferlösung mit pH 6,1, die Kaliumchlorid in einer Konzentration zwischen 15 und 25 mM enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Harz ein starkes Kationenaustauschmedium ist, das aus einem hydrophilen Polymer mit Sulfonsäuregruppen, vernetzt an einer Polyethersulfonmembran, besteht und die Puffermischungen aus solchen ausgewählt sind, die aus einbasigem Kaliumphosphat und zweibasigem Natriumphosphat, einbasigem Kaliumphthalat und Natriumhydroxid, zweibasigem Natriumcitrat und Natriumhydroxid, Zitronensäure und zweibasigem Natriumphosphat oder Imidazol und Salzsäure hergestellt sind.
Verwendung der Verfahren nach jedem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung der aktiven Prinzipien, die in den medizinischen Spezialitäten auf der Basis von Interferon-Proteinen enthalten sind.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Interferon-Protein das rekombinante α-2b-Interferon ist.