DE69106407T2

DE69106407T2 - Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichem gamma-Interferon ohne Cystein und ohne Methionin am N-Terminal.

Info

Publication number: DE69106407T2
Application number: DE1991606407
Authority: DE
Inventors: Ivan Georgiev Ivanov; Vesselin Penkov Ivanov; Vessela Stefanova Ivanova; Ljuben Nikolaev Marekov; Adriana Avram Sarafova; Rossiza Atanassova Vassileva; Rumen Georgiev Zanev
Original assignee: Pharmagen Ltd
Current assignee: Pharmagen Ltd
Priority date: 1990-01-24
Filing date: 1991-01-22
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2011-01-23
Also published as: BG52073B2; DE69106407D1; EP0446582B1; JPH05176789A; ES2066237T3; EP0446582A1; RU2054044C1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichen Cystein-losen Gamma-Interferon ohne Methionin am N-Terminus, welches in der medizinischen Praxis verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichen Cystein-enthaltendem Gamma-Interferon (1, 2, 3) und Cystein- losen Gamma-Interferon (3, 4, 5) durch Expression in Bakterienzellen sind bekannt. In diesen Verfahren enthält das rekombinante Interferon zusätzlich Methionin an seinem N-Terminus, das als initiierende Aminosäure in der bakteriellen Synthese übriggeblieben ist.
Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Cystein-losen Gamma-Interferon ohne Methionin am N-Terminus (6) bekannt, welches auf sekretierbarer Expression in Bakterienzellen und auf der Verwendung von Alpha-Amylase-Promotoren und einer Signalsequenz für die Sekretion beruht.
Die Nachteile der bekannten Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichen Cystein-enthaltenden oder Cystein-losen Gamma-Interferon (1 bis 5) bestehen darin, daß sie dazu führen, daß man ein Protein erhält, das ein zusätzliches Methionin am N-Terminus enthält, dessen Anwesenheit unerwünscht ist, da es das Produkt Immunreaktionen auslösen läßt und seine anhaltende Verabreichung als therapeutisches Mittel zu der Bildung spezifischer Antikörper führen könnte.
Ein Mangel des Verfahrens zur Herstellung von rekombinantem Cystein-losen Gamma-Interferon ohne Methionin am N-Terminus (6) ist, daß die Entfernung von Methionin durch Sekretion in dem periplasmatischen Raum des Bakteriums durchgeführt wird. Während des Transport besteht die Gefahr von Konformationsänderungen, die dazu führen könnten, daß das Mittel Immunreaktionen auslöst. Ein weiterer Nachteil ist die ausschließlich niedrige Ausbeute an Interferon - 3000 000 U/l Kultur.
Hinsichtlich der Art der Reinigung beruhen die bekannten Verfahren auf der Immunanbindung von Gamma-Interferon (7) oder auf der Verwendung von anderen chromatographischen Sorptionsmitteln (2).
Ein Nachteil der Immunanbindung als Verfahren zur Reinigung von Gamma-Interferon ist die Verwendung von teuren, sehr speziellen monoklonalen Antikörpern, deren Herstellung eine separate Technologie erfordert und es gibt die Gefahr, das Endprodukt mit Transformationsfaktoren und Viren, die von Hybridomzell-Linien herkommen, zu verunreinigen. Als ein Ergebnis können Konformationsänderungen von Gamma-Interferon (Denaturierung) voranschreiten, die zu einer Abnahme der biologischen Aktivität führen.
Ein Mangel des chromatographischen Verfahrens ohne Verwendung monoklonaler Antikörper (2) ist, daß das Verfahren auf Chromatographie auf Thiol-Sepharose beruht und nur auf Cystein enthaltende Gamma-Interferone anwendbar ist.
Gamma-Interferon wie viele andere rekombinante Proteine kann leicht in Lösungen, die keine denaturierenden oder chaotropischen Mittel enthalten, aggregiert werden. Nach der Entfernung von Guanidinchlorid nach einigen der wohlbekannten Verfahren (Ultrafiltration, Gelfiltration, Dialyse) aggregiert Gamma-Interferon. Als ein Ergebnis kann die Ausbeute von löslichem, biologisch aktivem Gamma-Interferon als eine Funktion der Temperatur, Anfangskonzentration des Proteins, Austauschrate des Lösungsmittels, der Anwesenheit von mono- und bivalenten Ionen und wahrscheinlich weiterer derzeit unbekannter Faktoren variieren. All dies behindert die Standardisierung der Technologie, es verringert die Ausbeute und macht das Endprodukt teurer.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichen Cystein-losen Gamma-Interferon ohne Methionin am T-Terminus zur Verfügung zu stellen, das eine hohe Ausbeute und einen hohen Reinheitsgrad des Produkts ebenso wie eine vollständige Auflösung in wäßrigen biologisch verträglichen Lösungen, die keine denaturierenden und chaotropischen Substanzen enthalten, garantieren kann.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichen Cystein-losen Gamma-Interferon ohne Methionin am N-Terminus durch Expression des synthetischen Gens von Gamma-Interferon in Mikroorganismen der Gattung E. Coli, insbesondere eines Stamms E. Coli, der in der Nationalen Bank zur Hinterlegung industrieller Mikroorganismen und Zellkulturen unter der Nr. 845 erhalten wird und eingetragen ist, gelöst, wodurch der rekombinante Stamm, der Expressionsplasmid pIBM enthält, im Nährmedium mit tryptisch zerkleinertem Pepton und Hefe-Extrat als Quellen für Stickstoff, die mit L-Triptophan und L-Methionin angereichtert sind, und in Anwesenheit von Tetracyclin gezüchtet wird. Die Parameter der Fermentation sind so ausgewählt, daß sie ein schnelles Auftreten von exponentiellem Wachstum garantieren, welches während dem Voranschreiten des Verfahren durch Hinzufügen von Glukose gesteuert wird. Die Unterbrechung der Belüftung am Ende des Verfahrens begünstigt die Entfernung von Methionin am N-Terminus ebenso wie die Bildung von Einschlußkörpern, die einen hohen Prozentsatz an Interferon in dem intrazellulären Raum des Bakteriums enthalten. Nach der Extraktion wird das rekombinante menschliche Cystein-lose Gamma-Interferon zusätzlicher chromatographischer Behandlung auf einer Säule aus Carboxymethylsepharose, um das Lösungsmittel zu entfernen, und Renaturierung unterzogen.
Nach der Herstellung von Interferon in Guanidinchlorid ist es im Hinblick darauf, das Gamma-Interferon auf dem Ionen-Austauscher zu adsorbieren und zu erhalten, nötig, daß die Konzentration von Guanidinchlorid niedriger als 0,35 M, nicht aber unterhalb 0,1 M ist. Bei einer niedrigeren Konzentration von Guanidinchlorid aggregiert das Interferon sehr schnell.
Um gute Ergebnisse zu erzielen, wird der Extrakt, der Gamma- Interferon enthält, mit eiskaltem Puffer mit pH 5,0 bis 8,5 und Molarität 0,005 bis 0,1 M verdünnt, bis eine Guanidinchlorid-Konzentration von 0,7 bis 1,0 M erreicht ist. Unmittelbar, bevor die Säule mit Carboxymethylsepharose beladen wird, werden die Lösungen von Gamma-Interferon und eiskaltem Puffer vermischt, so daß die Verdünnung eine schließliche Guanidinchlorid-Konzentration von 0,35 M bereitstellt, die durch die Säule hindurchzuleiten ist. Das Guanidinchlorid wird durch anhaltendes Waschen der Säule mit dem jeweiligen Puffer entfernt. Gamma-Interferon wird durch einen Gradienten an Natriumchlorid von 0,1 bis 0,6 M in dem jeweiligen Puffer herausgespült.
Das Produkt wird mit pyrogenfreiem Wasser bis zu einer physiologischen Konzentration von Natriumchlorid verdünnt, und es wird mit einer 10 %-Lösung von Dextran, das als ein Stabilisator (3) verwendet wird, bis zu einer Endkonzentration von 2 % vermischt.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß Gamma- Interferon hergestellt wird, dessen Methionin am N-Terminus intrazellulär entfernt worden ist und nicht durch Sekretion, daß die Ausbeute des Gamma-Interferons sehr hoch ist und 1 000 000 000 U/l Kultur übersteigt, daß das hergestellte rekombinante menschliche Cystein-lose Gamma-Interferon eine Reinheit über 99,6 % hat, daß es seine biologische Aktivität nach Gefriertrocknen bei Anwesenheit eines geeigneten Stabilisators behält und es in wäßrigen Lösungen löslich ist, die keine denaturierenden oder chaotropischen Mittel enthalten, daß die Technologie die Anwendung monoklonaler Antikörper zum Reinigen des rekombinanten Proteins, die das Produkt bei Verwendung billiger chromatographischer technischer Vorrichtungen, die weitverbreitet in der pharmazeutischen Praxis angewandt werden, verunreinigen könnten, vermeidet, und daß es die Möglichkeit für automatisierte Herstellung im großen Maßstab unter Verwendung eines Ionen-Austauscher bietet, der für mehrfache industrielle Ausnutzung regeneriert und sterilisiert werden kann.
Die Erfindung wird durch die folgende beispielhafte Ausführungsform veranschaulicht. Ein Stammproduzent E. Coli LE 392, Träger des rekombinanten Plasmids pIBM wird bei -70ºC in einer 15 % Glyzerinkultur gelagert. Nach der Kontrolle der Reinheit und der Aktivität wird das Saatmaterial während 7 Stunden bei 37 ºC durch Schütteln in einem Nährmedium, das identisch zu dem Fermentationmedium ist, in 10 % Volumen des Arbeitsvolumens des Fermentators gezüchtet. Die Fermentierung wird in einem bakteriologischen Fermentator vom Standardtyp, der mit einer Rührvorrichtung ausgestattet ist und ein Arbeitsvolumen von 4 l hat, in einem Nährmedium mit der folgenden Zusammensetzung (für 1 Liter) durchgeführt:
Pepton, tryptisch zerkleinert 25 g
Hefeextrakt 5g
Natriumchlorid 5g
Na&sub2;HPO&sub4; 6g
K&sub2;HPO&sub4; 3g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 3g
MgSO&sub4; - 1M 2 ml
CaCl&sub2; - 100 mM 100 ml
Glucose 20% 50 ml
L-Triptophan 20 mkg/ml 5 ml
L-Methionin 20 mkg/ml 5 ml
Tetracyclin 10 mkg/ml 1,2 ml
Die Fermentation beginnt bei einem Anfangs-pH von 7,1 bis 7,2 und einem anfänglichen Belüftungsvolumen von 0,5 l/1 l Volumen/min, Temperatur 37,2 ºC und 400 U/min der Rührvorrichtung.
Wenn die Kultur die exponentielle Wachstumsphase erreicht, wird das Belüftungsvolumen auf 1 l/1 l Volumen/min erhöht. Zur sechsten Stunde vom Beginn der Fermentation an werden der Kultur 40 ml 20 % Glukose hinzugefügt und nach Beendigung des exponentiellen Wachsens wird die Belüftung unterbrochen, und die Kultur während einer weiteren Stunde mit 400 U/min. gerührt.
Die Kulturflüssigkeit wird abgekühlt, und die Biomasse wird gesammelt. Die Ausbeute ist ungefähr 20 g Zellmasse/Liter Kultur. Die Biomasse wird aufgeschlossen, und das Gamma-Interferon wird von den Protein-Teilchen extrahiert und dann teilweise durch stufenweise Fällung (2) gereinigt.
Die erhaltene Lösung von Gamma-Interferon wird unter Rühren mit eiskaltem 0,05 M Natriumacetat bei pH 6,0 zu einer Konzentration des Guanidinchlorids von 0,7 M verdünnt. Die so hergestellte Lösung wird auf eine Säule mit Carboxymethylsepharose (Farmazia 2,6 x 10 cm, ausgeglichen in 0,05 M Natriumacetat- Puffer mit pH 6,0) geladen, wodurch unmittelbar vor der Adsorption die Lösung von Gamma-Interferon durch Pumpe und Mixer mit eiskaltem Puffer auf eine Konzentration von Guanidinchlorid von 0,35 M verdünnt wird. Die Beladung wird mit einer Rate von 1100 ml/Stunde durchgeführt. Die Säule wird mit 3 bis 4 Volumen Puffer ausgewaschen, und es wird ein 20 Min-Gradient, 2 x 60 ml, von 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid in 0,05 M Natriumacetatpuffer mit pH 6,0 bei einer Eluierrate von 2 ml/min. hinzugefügt. Gamma-Interferon wird bei einer Konzentration von 0,40 bis 0,44 Natriumchlorid eluiert. Die Ausbeute an reinem Gamma-Interferon ist fast 1 mg reines Protein für 1 g Bakterienmasse.
Die Bestimmung der Reinheit des erhaltenen Gamma-Interferons wird nach zwei unterschiedlichen Arten durchgeführt:
Bei Elektrophorese in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat und folgender Densitometrie der Streifen und durch Chromatographie bei hohem Druck auf der Säule Pro-RPC (Farmazia, Sweden, 5 x 20 mm), Elutionsrate 0,6 ml/min., Gradient - 20 min, 0,01 % Trifluoressigsäure-100 % Acetonitril in 0,01 % Trifluoressigsäure und Adsorption bei 280 nm ist die Reinheit des Produkts 99,9 % bei Verwendung der Elektrophorese und über 99,9 % bei Anwendung von analytischer Chromatographie.
Die Bestimmung der Aminosäure am N-Terminus des erhaltenen rekombinanten Cystein-losen Gamma-Interferon wird durch Fluoreszenz-Markierung der Aminosäure am N-Terminus mit Dansylchlorid durchgeführt. Als Aminosäure am N-Terminus des somit hergestellten rekombinanten menschlichen Cystein-losen Gamma-Interferon wird Glutamin identifiziert. Keine Anwesenheit von Methionin oder von anderen Aminosäuren ist festgestellt worden
Die Bestimmung des Verhältnisses von löslichem/aggregiertem Interferon wird bei Zentrifugieren der Interferonlösung bei 25 000 U/min durchgeführt. Das Sediment (unlösliches Interferon) wird erhalten. Das in der überstehenden Flüssigkeit lösliche Interferon wird mit 20 % Trichloressigsäure ausgefällt. Nach Zentrifugieren während 30 min. bei 10 000 U/min wird das Sediment in einem Puffer für Eiektrophorese gelöst, und es wird mit Polyacrylamidgel in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat parallel mit dem Niederschlag des unlöslichen Interferons analysiert. Nach Färben des Gels wird die Menge des Proteins in den Streifen durch Densitometrie bestimmt. Die densitometrische Bestimmung zeigt, daß das ganze Protein (100 %) in einem löslichen Zustand ist.
Die Konzentration von Gamma-Interferon in einer Lösung wird unabhängig bei Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten &epsi;&sub2;&sub8;&sub0; = 11 700 (5) bestimmt. Die Bestimmung der biologischen Aktivität wird auf der Grundlage der Schutzwirkung von Interferon hinsichtlich des zytopatischen Effekts des Virus von vesikularer Stomatitis auf der menschlichen Zell-Linie WISH durchgeführt. Die Analyse wird in Titrier-Platten bei einer abnehmenden Interferon-Konzentration durchgeführt. Als eine Aktivitäts-Einheit wird die Konzentration des Interferons genommen, bei der ein 50 % Schutz der Zellen beobachtet wird. Ein kalibrierter Labor-Standard wird gemäß einem internationalen Standard für Interferon-α verwendet.
In Fällen, in denen die Aktvität eines gefriergetrockneten Mittels untersucht wird, werden die Ampullen mit 1 ml pyrogenfreiem Wasser bei unterschiedlichen Zeitdauern (7 Tage bis 3 Monate) nach dem Gefriertrocknen wieder hergestellt. Die untersuchten Interferon-Mittel zeigten eine spezifische Aktivität in der Nähe von 5 x 10&sup7; U/mg.
Das Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichen Cystein-losen Gamma-Interferon ohne Methionin am N-Terminus wird zur Herstellung des wertvollen therapeutischen Mittels Gamma-Interferon verwendet. Es stellt eine Produktausbeute bereit, die 1,10 U/l Kultur übersteigt, wodurch es keinen Bedarf gibt, monoklonale Antikörper zum Reinigen anzuwenden. Das somit erhaltene Gamma-Interferon, in dem Methionin am N-Terminus intrazellulär entfernt wurde, hat eine Reinheit von über 99,6 %, es erhält seine biologische Aktivität nach Gefriertrocknen aufrecht und ist in wäßrigen Lösungen löslich. Das Verfahren wird durchgeführt, indem das Plasmid pIBM im Stamm Escherichia Coli LE 392, welcher in dem Nationalen Zentrum zur Hinterlegung industrieller Mikroorganismen und Zellkulturen unter Nr. 845 registriert ist, exprimiert wird und dann in einem Fermentator bei Temperaturen von 36 bis 38 ºC unter Belüftungsbedingungen gezüchtet wird, danach wird das somit erhaltene Produkt gereinigt, renaturiert und eluiert, während die begleitenden Lösungsmitel und Beimischungen entfernt werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichen Cystein-losen Gamma-Interferon ohne Methionin am N-Terminus mit der Beteiligung von Mikroorganismen der Gattung Escherichia Coli, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pIBM - Träger des synthetischen Gens von rekombinantem menschlichen Cystein-losen Gamma-Interferon in dem Wirtsstamm E. Coli, welcher in der Nationalen Bank zur Hinterlegung von industriellen Mikroorganismen und Zellkulturen unter Nr. 845 registriert ist, unter Züchtung in einem Fermentator bei Temperaturen von 36 º bis 38 ºC unter Belüftungsbedingungen exprimiert wird, und das erhaltene Produkt auf einem Feststoff-Träger gereinigt und renaturiert wird, wodurch die begleitenden Lösungsmittel und Beimischungen entfernt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß während der Fermentierung die Belüftung vergrößert wird, wenn die Kulturen in die exponentielle Phase eintreten, während bei Erreichen der stationären Phase die Belüftung mindestens eine Stunde unterbrochen wird, bevor die Biomasse gesammelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Interferon adsorbierende Feststoff-Träger ein Kationen-Austauscherharz ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kationen-Austauscherharz Carboxymethylsepharose ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption von Gamma-Interferon auf dem Feststoff-Träger in einer Lösung aus Guanidinchlorid mit einer Konzentration zwischen 0,10 und 0,35 M durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Waschen zum Entfernen der Lösungsmittel mit apyrogenischem Wasser, das mit biologisch verträglichen Puffer-Verbindungen in Konzentrationen von 0,005 bis 0,050 M gepuffert ist, bewirkt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung von Spuren bakterieller Proteine und weiterer Beimischungen mit einer Lösung aus biologisch verträglichen Salzen mit der Konzentration 0,10 bis 0,35 M bewirkt wärd.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution von Interferon mit biologisch verträglichen Salzen mit der Konzentration 0,4 bis 0,55 M durchgeführt wird.