DE69219015T2 - Verfahren zur Herstellung eines antimikrobiellen Peptids in hoher Reinheit und im grossen Masstab - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines antimikrobiellen Peptids in hoher Reinheit und im grossen MasstabInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Massenherstellung eines potenten antimikrobiellen Peptids (im folgenden bezeichnet als Lactoferricin (Schutzmarke)) in hoher Reinheit. Im speziellen betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Lactoferricins, das geeignet ist zum Herstellen eines sicheren und wirkungsvollen antimikrobiellen Mittels von mindestens 90 % Reinheit in beträchtlichen Mengen, d.h. mindestens Grammengen.
- Lactoferrin ist ein nicht-häm Eisen bindendes Glycoprotein, das in verschiedenen biologischen Fluiden von Säugern vorkommt, was Milch, Speichel, Tränenflüssigkeit, Samen und Schleimsekretionen beinhaltet. Es ist ein multifunktionelles Protein mit Eisen absorbierenden, Zellwachstum fördernden, immunmodulierenden und antimikrobiellen Aktivitäten. Große Mengen an Rinderlactoferrin können durch Extraktion dieses Proteins aus roher Magermmilch oder Käsemolke, die von Kuhmilch stammen, extrahiert werden und folglich ist Rinderlactoferrin als ein Handelsprodukt der Molkereiindustrie leicht verfügbar.
- Lactoferricin, auch als LFCIN (Schutzmarke) bezeichnet, ist ein potentes antimikrobielles Peptid von wirtschaftlichem Wert, das von Rinderlactoferrin durch enzymatische Spaltung abgeleitet ist und z.B. aus einer einzigen Peptidkette aus 25 Aminosäureresten besteht, die die Sequenz Phe-Lys-Cys-Arg-Arg- Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys- Val-Arg-Arg-Ala-Phe hat, wie in europäischer Patentanmeldung Nr. 91 308 172.5, EP-A-0 474 506 offenbart. Lactoferricin hat potente, Breitspektrum-antimikrobielle Eigenschaften. Es ist bei geringen Konzentrationen gegen verschiedene Arten von gram- positiven und gram-negativen Bakterien und Hefen wirksam, was Stämme beinhaltet, die bekannt sind, Krankheiten in Menschen und Tieren zu verursachen. Die Wirkung von Lactoferricin ist mikrobizid, d.h. letal für Mikroorganismen, was zu schnellem Verlust der mikrobiellen Fähigkeit zur Koloniebildung führt. Die meisten anderen antimikrobiellen Mittel, was alle klinisch verwendeten Antibiotika einschließt, sind strukturell komplexe Chemikalien, die dem Körper von Mensch und Tier fremd sind. Auf der anderen Seite wird Lactoferricin als ein gesundes und sicheres Produkt angesehen, weil es ein natürliches Peptid ist, das keine ungewöhnlichen Aminosäuren oder fremden chemischen Gruppen beinhaltet. Es wird wahrscheinlich natürlich im Magen von Menschen durch gastrischen Pepsinverdau von Rinderlactoferrin, das in Kuhmilch gefunden wird, einem häufig verzehrten Lebensmittel, hergestellt. Entsprechend hat Lactoferricin wirtschaftlichen Wert als ein sicheres und wirkungsvolles antimikrobielles Mittel zur Verwendung bei zahlreichen Anwendungen, was z.B. Augenpflegeprodukte, Mundhygieneprodukte, Kosmetik- und Hautpflegeprodukte, klinische Nahrungsmittel, Haustierhygieneprodukte etc. beinhaltet.
- Für viele solcher Anwendungen wird es als vorteilhaft angesehen, eher Lactoferricin mit mindestens 90 % Reinheit zu verwenden als eine grobe Aufbereitung. Von Lactoferricin hoher Reinheit wird angenommen, daß es weniger wahrscheinlich unerwünschte Veränderungen in den funktionellen Eigenschaften eines Produkts wie etwa Geschmack, Geruch, Farbe, Struktur, Immunogenität etc. bewirkt, im Vergleich zu einer groben Aufbereitung, da eine kleinere Menge von gereinigtem Lactoferricin benötigt wird, um eine gewünschte antimikrobielle Wirkung zu erreichen. Außerdem ist es möglich, daß unerwünschte Veränderungen in den funktionellen Eigenschaften eines Produkts durch andere Bestandteile als Lactoferricin vermittelt werden können, die in einer groben Aufbereitung von Lactoferricin enthalten sind.
- Ein Verfahren zur Massenherstellung von Lactoferricin in hoher Reinheit ist wesentlich, um beträchtliche Mengen dieses Produkts zur gewerblichen Verwendung bereitzustellen. Sehr kleine Mengen an Lactoferricin, d.h. bis zu ungefähr 1 mg, können in hoher Reinheit in einem analytischen Maßstab mit einem Verfahren der Reverse-Phase Hochdruckflüchtigkeitschromatographie, wie offenbart in europaischer Patentanmeldung Nr. 91308172.5, erhalten werden. Dieses Verfahren im analytischen Maßstab ist geeignet zum Prüfen der Reinheit von Lactoferricin, aber es ist nicht in der Lage, beträchtliche Mengen dieses Produkts für den gewerblichen Gebrauch bereitzustellen. Ein geeignetes Verfahren zur Massenherstellung von Lactoferricin ist eines, welches in der Lage ist, Lactoferricin mit mindestens 90 % Reinheit in beträchtlichen Mengen bereitzustellen, d.h. mindestens Grammengen. Kein Verfahren zur Herstellung solcher Mengen Lactoferricin in hoher Reinheit ist vorher beschrieben worden.
- Mit der Absicht, ein Verfahren zu gestalten, um Lactoferricin zum gewerblichen Gebrauch bereitzustellen, haben die Erfinder die Wechselwirkung von Lactoferricin mit verschiedenen Chromatographiemedien unter verschiedenen Bedingungen untersucht und haben neue Verfahren zur Reinigung dieses antimikrobiellen Peptids ermittelt. Als ein Ergebnis haben sie ein neues Verfahren zur Herstellung beträchtlicher Mengen von Lactoferricin in hoher Reinheit hervorgebracht.
- Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung beträchtlicher Mengen von Lactoferricin in hoher Reinheit.
- D.h. unsere Erfindung beabsichtigt, ein Verfahren bereitzustellen, das besteht aus Inkontaktbringen eines Gemisches von Peptiden, das Lactoferricin enthält, welches durch enzymatisches Hydrolysieren von Rinderlactoferrin oder Rindermilchprotein, welches Lactoferrin enthält, mit einem hydrophoben Chromatographiemedium oder Kationenaustauscherchromatographiemedium, um das Lactoferricin zu adsorbieren, Waschen des Mediums, um andere Peptide als das Lactoferricin zu eluieren, Desorbieren des Lactoferricins in Lösung von dem gewaschenen Medium und Entsalzen der desorbierten Lactoferricinlösung, wobei das Lactoferricin mit mindestens 90 Gew.-% Reinheit erhalten wird.
- Abbildung 1 zeigt ein Beispiel eines Reverse-Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographieprofils einer Probe von Lactoferricin mit einer Reinheit von 90 %.
- Das Ausgangsmaterial, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, ist jedes Gemisch von Peptiden, die Lactoferricin enthalten.
- Vorzugsweise wird das Ausgangsmaterial durch enzymatische Spaltung von reinem Rinderlactoferrin hergestellt. Alternativ ist es möglich, das Ausgangsmaterial durch enzymatischen Verdau einer groben Aufbereitung von Rinderlactoferrin oder jeden Gemisches von Milchproteinen herzustellen, welche Rinderlactoferrin als einen Bestandteil enthalten. Das Enzym, das für diesen Verdau verwendet wird, ist vorzugsweise Pepsin, jedoch kann jede Protease, die in der Lage ist, Rinderlactoferrin zu spalten, um Lactoferricin zu erzeugen, verwendet werden.
- Das Ausgangsmaterial wird vorzugsweise in reinem Wasser gelöst. Alternativ kann eine Pufferlösung oder Salzlösung verwendet werden. Der pH des Ausgangsmaterials ist auf 6,5 bis 7,5 eingestellt, vorzugsweise 7,0.
- Alle vorhandenen unlöslichen Substanzen in dem Ausgangsmaterial werden durch gebräuchliche Methoden entfernt, wie etwa durch Zentrifugation oder Filtration.
- Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung des Ausgangsmaterials ist beispielhaft im folgenden dargestellt. Rinderlactoferrin, isoliert aus Magermilch oder Käsemolke, wird in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 5 % (w/v) gelöst, und der pH wird auf 3,0 durch Zugabe von 1 N HCl eingestellt. Pepsin wird zugegeben bis zu einer Endkonzentration von 3 % (w/w des Substrats) und Hydrolyse wird bei 37º für 4 Stunden durchgeführt. Die Reaktion kann, wenn gewünscht, durch Erhitzen auf 80ºC für 15 Minuten beendet werden, obwohl Beendigung der Reaktion unnötig ist. Der pH des erhaltenen Peptidgemisches wird auf 7,0 durch Zugabe von 1 N NaOH eingestellt. Alle unlöslichen Peptide werden aus dem Ausgangsmaterial durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 30 Minuten entfernt.
- Gegebenenfalls kann das Ausgangsmaterial mit gebräuchlichen Mitteln getrocknet werden, z.B. durch Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen, und bis zur Verwendung als Trockenpulver gelagert werden. Das Trockenpulver wird durch Lösen vorzugsweise in reinem Wasser vor der Verwendung wiederbefeuchtet. Alternativ kann das Ausgangsmaterial in wäßriger Lösung direkt zur Herstellung von Lactoferricin verwendet werden, d.h. ohne Trocknen und Wiederbefeuchten.
- Lactoferricin kann durch jedes der folgenden Verfahren hergestellt werden.
- In einem am meisten bevorzugten Verfahren wird Lactoferricin hergestellt durch Inkontaktbringen des Ausgangsmaterials, d.h. ein Gemisch von Peptiden, das Lactoferricin enthält, mit einem Butylrest enthaltenden hydrophoben Interaktionschromatographiemedium, Waschen des Mediums, um ungebundene Peptide zu entfernen, Desorbieren des Lactoferricins bei einem konstanten pH, vorzugsweise pH 4,8 - 5,2 und Entsalzen des Lactoferricinprodukts. Jedes Butyl enthaltende, hydrophobe Interaktionschromatographiemedium kann verwendet werden. Ein geeignetes Medium ist z.B. BUTYL- TOYOPEARL (Tosoh Corp.) oder BUTYL-SEPHAROSE (Pharmacia), aber BUTYL-TOYOPEARL ist bevorzugt. Außerdem haben die Erfinder zum ersten Mal gezeigt, daß Lactoferricin Affinität zu hydrophoben Materialien und Oberflächen hat, worauf seine Affinität zu einem Medium mit einem Butylrest hindeutet und folglich ist es für den Fachmann naheliegend, daß andere hydrophobe Medien, wie etwa diejenigen, die eine Hexyl-, Octyl- Phenyl- oder Octylamin-Komponente enthalten, ähnlich wirkungsvoll zur Verwendung bei diesem Verfahren sein sollten. Das hydrophobe Medium wird gewaschen und mit Wasser vor der Verwendung äquilibriert. Das Verfahren kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Rührtankreaktors oder einer Chromatographiesäule oder einer Kombination beider.
- Vorzugsweise wird das Ausgangsmaterial am Anfang mit dem Medium in einem Rührtankreaktor in Kontakt gebracht, dann wird die Flüssigkeit gesammelt, das Medium wird in eine Chromatographiesäule überführt, und die gesammelte Flüssigkeit wird wieder mit dem Medium in der Säule in Kontakt gebracht. Nach Inkontaktbringen des Ausgangsmaterials mit dem hydrophoben Medium, wird das Medium mit Wasser gewaschen, um die ungebundenen Peptide zu entfernen, welche als ein nützliches Nebenprodukt des Verfahrens, das einen Ernährungswert hat, zurückgewonnen werden. Waschen des Mediums wird fortgesetzt, bis der Proteininhalt des eluierten Wassers von dem Medium auf einen geringen Wert absinkt, was angezeigt wird durch eine Absorption bei 280 nm von ungefähr 0,06 oder weniger. Nach Waschen des Mediums mit Wasser wird ein Puffer in das System eingeführt. Es ist möglich, den Puffer durch Waschen des hydrophoben Mediums mit dem Puffer direkt einzuführen. Alternativ und bevorzugt wird der Puffer durch Desorbieren der gebundenen Peptide, die Lactoferricin beinhalten, von dem Medium mit einer verdünnten Säurelösung, Mischen des Puffers mit den desorbierten Peptiden, Wiederinkontaktbringen der erhaltenen gepufferten Peptidlösung mit dem hydrophoben Medium und Waschen des Mediums mit dem gleichen Puffer eingeführt. Eine geeignete Säure ist z.B. eine ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HCl, H&sub2;SO&sub4;, H&sub3;PO&sub4;, Essigsäure und Zitronensäure, aber HCl ist bevorzugt. Die Endkonzentration der Säure ist 1 bis 30 mM, vorzugsweise 10 mM. Ein geeigneter Puffer ist z.B. einer ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus NaH&sub2;PO&sub4;-Na&sub2;HPO&sub4;, KH&sub2;PO&sub4;-K&sub2;HPO&sub4;, NaH&sub2;PO&sub4;-K&sub2;HPO&sub4;, KH&sub2;PO&sub4;-Na&sub2;HPO&sub4;, Zitronensäure- Na&sub2;HPO&sub4;, Essigsäure-Natriumacetat, aber Zitronensäure-Na&sub2;HPO&sub4; ist bevorzugt. Die Endkonzentration des Puffers ist 20 - 200 mM, vorzugsweise 100 - 200 mM und der endgültige pH des Puffers ist 6,5 - 7,5, vorzugsweise pH 7,0. Lactoferricin wird selektiv von dem Medium bei einem konstanten pH desorbiert, wobei derselbe Puffer eingestellt auf einen endgültigen pH von 4,5 - 5,5 benutzt wird, vorzugsweise 4,8 - 5,2. Entsalzen der Lactoferricinlösung, die so erhalten wurde, wird wie unterhalb beschrieben, durchgeführt. Anderes Material, welches an das hydrophobe Medium gebunden bleibt, kann als ein Nebenprodukt des Verfahrens durch Desorbieren des Materials mit einer verdünnten Säurelösung, vorzugsweise 10 - 20 mM HCl, zurückgewonnen werden, und da dieses Nebenprodukt einiges Lactoferricin enthält, kann es in Anwendungen verwendet werden, die kein Lactoferricin von hoher Reinheit erfordern. Das hydrophobe Medium wird mit Wasser gewaschen, und derart behandelt kann es wieder verwendet werden.
- In einem alternativen Verfahren wird Lactoferricin hergestellt durch Inkontaktbringen des Ausgangsmaterials mit einem Carboxymethylgruppe enthaltenden Kationenaustauscherchromatographiemedium, Waschen des Mediums, um die ungebundenen Peptide zu entfernen, Desorbieren des Lactoferricins mit einer Salzlösung bei pH 7 - 8 und Entsalzen des Produktes. Jedes Kationenaustauschermedium, welches eine Carboxymethylgruppe enthält, kann verwendet werden. Ein geeignetes Medium ist z.B. eines ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CARBOXYMETHYL-TOYOPEARL (Tosoh Corp.), CARBOXYMETHYL-SEPHADEX (Pharmacia), CARBOXYMETHYL-BIO-GEL A AGAROSE (BioRad Laboratories) und CARBOXYMETHYL-CELLULOSE (BioRad Laboratories), aber CARBOXYMETHYL-TOYOPEARL ist bevorzugt. Das Kationenaustauschermedium wird gewaschen und mit einem Puffer vor der Verwendung äquilibriert. Ein geeigneter Puffer ist z.B. einer ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus NaH&sub2;PO&sub4;-Na&sub2;HPO&sub4;, KH&sub2;PO&sub4;-K&sub2;HPO&sub4;, NaH&sub2;PO&sub4;-K&sub2;HPO&sub4;, KH&sub2;PO&sub4;-Na&sub2;HPO&sub4;, Zitronensäure-Na&sub2;HPO&sub4;, Essigsäure-Natriumacetat und Glycin-NaOH, aber NaH&sub2;PO&sub4;-Na&sub2;HPO&sub4; oder KH&sub2;PO&sub4;-K&sub2;HPO&sub4; ist bevorzugt. Die Endkonzentration des Puffers ist 10 bis 200 mM. Das Verfahren kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Rührtankreaktors oder einer Chromatographiesäule oder einer Kombination von beiden. Vorzugsweise wird das Ausgangsmaterial am Anfang mit dem Medium in einem Rührtankreaktor in Kontakt gebracht, dann wird die Flüssigkeit gesammelt, das Medium wird in eine Chromatographiesäule überführt und die gesammelte Flüssigkeit wird wieder mit dem Medium in der Säule in Kontakt gebracht. Nach Inkontaktbringen des Ausgangsmaterials mit dem Kationenaustauschermedium, wird das Medium mit dem Puffer gewaschen, um ungebundene Peptide zu entfernen, welche als ein nützliches Nebenprodukt des Verfahrens, das Ernährungswert hat, zurückgewonnen werden können. Waschen des Mediums wird fortgesetzt, bis der Proteininhalt des von dem Medium eluierten Puffers auf einen geringen Wert sinkt, was durch eine Absorption bei 280 nm von ungefähr 0,06 oder weniger angezeigt wird. Das Lactoferricin wird von dem Kationenaustauschermedium mit einer Salzlösung desorbiert. Ein geeignetes Salz ist eines ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid, KCl und NaCl, aber Ammoniumacetat oder Ammoniumchlorid ist bevorzugt. Die Endkonzentration des Salzes ist 1 - 4 M, vorzusweise 2 M oder mehr. Im Fall des Ammoniumchlorids oder Ammoniumacetats wird die Salzlösung in Wasser hergestellt, jedoch im Fall von NaCl oder KCl wird die Salzlösung in dem oben bezeichneten Puffer hergestellt. Der endgültige pH der Salzlösung wird auf 7 - 8 eingestellt.
- Entsalzen der Lactoferricinlösung, die so erhalten wurde, wird wie unterhalb beschrieben durchgeführt. Das Kationenaustauschermedium wird mit dem Puffer gewaschen, und so behandelt, kann es wieder verwendet werden.
- Entsalzen der Lactoferricinlösung, die durch eines der vorhergehenden Verfahren erhalten wurde, kann wie folgt erreicht werden.
- Vorzugsweise wird Entsalzen der Lactoferricinlösung erreicht durch Verwendung des hydrophoben Interaktionschromatographiemediums. Die Lactoferricinlösung wird auf pH 7 - 8 eingestellt und dann mit dem hydrophoben Medium in Kontakt gebracht. Das Medium wird mit Wasser gewaschen, um die Puffersalze zu entfernen, und Lactoferricin wird mit einer verdünnten Säurelösung, vorzugsweise 10 mM HCl, desorbiert, um das Endprodukt zu erhalten. Das hydrophobe Medium wird durch Waschen mit Wasser aufbereitet, und so behandelt, kann es wiederverwendet werden.
- Alternativ kann Entsalzen der Lactoferricinlösung durch übliche Mittel erreicht werden, wie etwa durch Elektrodialyse oder Ultrafiltration, z.B. unter Verwendung einer semipermeablen Membran oder einer Hohlfaserfilterkartusche mit einer Molekulargewichtsausschlußgröße von 3.000 oder weniger, welche das Lactoferricin zurückhält, aber es erlaubt den Salzen durchzuwandern, wobei die Entfernung der Salze gefördert wird.
- Gegebenenfalls kann das so erhaltene entsalzte Lactoferricin mit üblichen Mitteln getrocknet werden, z.B. durch Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen, um ein weißes Pulver zu ergeben.
- Das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Lactoferricin hat eine Reinheit von mindestens 90 %.
- Das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Lactoferricin ist funktionell aktiv und hat potente Breitspektrum-antimikrobielle Aktivität.
- Entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jede gewünschte Menge an Lactoferricin hoher Reinheit hergestellt werden. Die Menge des erhaltenen Lactoferricins hängt nur von der Menge des Lactoferricins in dem Ausgangsmaterial und der Menge des verwendeten Chromatographiemediums ab. Unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung können bis zu ungefähr 0,3 bis 0,5 g Lactoferricin hergestellt werden bei Verwendung von 100 ml Chromatographiemedium, und bis zu ungefähr 3 - 5 g Lactoferricin können hergestellt werden bei Verwendung von 1.000 ml Chromatographiemedium. D.h. die Ausbeute an Lactoferricin kann durch Erhöhen der Menge des Chromatographiemediums um ein 10faches und durch geeignetes Erhöhen der Menge des verwendeten Ausgangsmaterials ungefähr 10fach erhöht werden. Offensichtlich stellt die vorliegende Erfindung durch weiteres Hochdimensionieren des Verfahrens das Mittel zur Verfügung, um Lactoferricin hoher Reinheit in jeder gewünschten Menge, z.B. mehrere Hundert Gramm oder mehrere Hundert Kilogramm oder mehr herzustellen.
- Das oben Offenbarte beschreibt allgemein die vorliegende Erfindung. Ein noch vollständigeres Verstehen kann unter Bezug auf die folgenden Tests für die verschiedenen Aspekte der Erfindung erhalten werden.
- Die Reinheit des erhaltenen Lactoferricins kann durch Reverse- Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographie wie folgt erhalten werden. Die Testprobe mit Lactoferricin wird auf einer TSK-GEL 120T Säule (0,6 x 150 mm; Tosoh Corp.) fraktioniert, eluiert mit einem Gemisch 80 : 20 von Eluierungsmitteln A (0,005 % Trifluoressigsäure) und B (90 % Acetonitril in 0,05 % Trifluoressigsäure) für 10 Minuten, gefolgt durch einen linearen Gradienten von A : B von 80 : 20 bis 40 : 60 für 30 Minuten bei einer Flußrate von 0,8 ml/min. Die Absorption bei 280 nm der eluierten Peptide wird auf einem Schreiber-Plotter aufgezeichnet und die relativen Konzentrationen der Peptidbestandteile in der aufgetragenen Probe werden aus den relativen Größen der Peptidpeaks bestimmt. Z.B. ist das Reverse-Phase Hochdruckchromatographieprofil einer Probe von Lactoferricin mit einer Reinheit von 90 %, hergestellt wie unterhalb beschrieben in Beispiel 2, in Abbildung 1 dargestellt.
- Die Auswirkungen von verschiedenen Puffern und pH-Bedingungen auf Elution von Lactoferricin von dem Butylrest enthaltenden hydrophoben Interaktionschromatographiemedium sind beispielhaft wie folgt dargestellt.
- Zur Verwendung als Ausgangsmaterial werden 2,0 g des in Beispiel 1 erhaltenen Peptidgemisches in Wasser mit einer Endkonzentration von 5 % (w/v) gelöst. BUTYL-TOYOPEARL 650 M wurde vor der Verwendung mit Wasser gewaschen und äquilibriert In einer Reihe von Experimenten wurden 100 mg des Ausgangsmaterials in wäßriger Lösung mit 5,0 ml des hydrophoben Mediums in Kontakt gebracht, das Medium wurde mit Wasser gewaschen, um ungebundene Peptide zu entfernen, dann mit Puffer (Waschpuffer, Tabelle 1) gewaschen. Das gebundene Lactoferricin wurde mit Puffer (Elutionspuffer, Tabelle 1) eluiert. Unter diesen Puffern wurde McIlvaine Puffer durch Verbinden geeigneter Volumina 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; hergestellt, um den End-pH, der in Tabelle 1 angegeben ist, zu erhalten. Die Konzentration aller anderen verwendeten Puffer war 100 mM. Die Ausbeute (mg) von Lactoferricin, die unter Verwendung verschiedener Puffer und pH-Bedingungen erhalten wurde, wurde aus der Gleichung [Y = A/2,203 x V] bestimmt, worin Y die Ausbeute an Lactoferricin, A die Absorption bei 280 nm der eluierten Lactoferricinlösung, V das Gesamtvolumen der eluierten Lactoferricinlösung und 2,203 die Absorption einer Standardlösung (1,00 mg/ml) von gereinigtem Lactoferricin ist. Die Reinheit (%) des Lactoferricins wurde auch durch Reverse- Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographie, wie beschrieben in Test 1, bestimmt.
- Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß die höchste Ausbeute und Reinheit von Lactoferricin erhalten werden durch Einstellen des pH des Elutionspuffers auf 4,8 - 5,2, vorzugsweise 5,0. Die Ergebnisse deuten weiterhin darauf hin, daß McIlvaine Puffer, NaH&sub2;PO&sub4;-NaH&sub2;PO&sub4;-, KH&sub2;PO&sub4;-KH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0 oder sauerer Natriumacetatpuffer verwendet werden können. Tabelle 1
- ND: nicht bestimmt
- HAc: Essigsäure
- NaAc: Natriumacetat
- Die Auswirkungen von verschiedenen Säuren auf Elution von Lactoferricin von dem hydrophoben Interaktionschromatographiemedium, das zum Entsalzen verwendet wird, sind wie folgt beispielhaft dargestellt. BUTYL-TOYOPEARL 650 M wurde mit McIlvaine Puffer pH 7,0 (hergestellt durch Verbinden von Lösungen aus 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; in einem Verhältnis von 177 : 824) vor Verwendung gewaschen und äquilibriert In einer Reihe von Experimenten wurden 4 mg gereinigtes Lactoferricin in McIlvaine Puffer, pH 7,0 mit 5,0 ml des hydrophoben Mediums in Kontakt gebracht, das Medium wurde mit Wasser gewaschen, dann wurde das gebundene Lactoferricin mit 15 ml einer Säurelösung wie beschrieben eluiert. Die Gewinnung (%) von Lactoferricin, das erhalten wurde durch Verwendung von verschiedenen Säurelösungen, wurde mit der Gleichung [R = (A/2,203 x V)/4 x 100] bestimmt, worin R die Gewinnung von Lactoferricin ist, A die Absorption bei 280 nm der eluierten Lactoferricinlösung ist, V das Gesamtvolumen der eluierten Lactoferricinlösung ist and 2,203 die Absorption einer Standardlösung (1,00 mg/ml) des gereinigten Lactoferricins ist und 4 die Menge des gereinigten Lactoferricins (mg) ist, die anfänglich mit dem hydrophoben Medium in Kontakt gebracht wurde.
- Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß das Lactoferricin bei Säurekonzentrationen von 1 - 30 mM eluiert wird, aber die Ausbeute ist am höchsten bei Konzentrationen von 10 mM und mehr. Um die Menge an Säure, die in dem Endprodukt enthalten ist, zu minimieren, wird die geringste wirksame Konzentration an Säure bevorzugt. D.h. die bevorzugte Konzentration der Säure zur Elution ist 10 mM. Die Ergebnisse deuten weiterhin darauf hin, daß HCl, H&sub2;SO&sub4;, H&sub3;PO&sub4;, Essigsäure und Zitronensäure zur Elution von Lactoferricin verwendet werden können. Tabelle 2
- Die Auswirkungen von verschiedenen Salzen auf Elution von Lactoferricin von der Carboxymethylgruppe-enthaltenden Chromatographiemedium sind wie folgt beispielhaft dargestellt.
- CARBOXYMETHYL-TOYOPEARL 650 S wurde mit 10 mM KH&sub2;PO&sub4;-K&sub2;HPO&sub4; Puffer, pH 7,8 vor der Verwendung gewaschen und äquilibriert. In einer Reihe von Experimenten wurden 4 mg gereinigtes Lactoferricin in demselben Puffer mit 5 ml des Kationenaustauschermediums in Kontakt gebracht, das Medium wurde mit dem Puffer gewaschen, dann wurde das gebundene Lactoferricin mit 15 ml Salzlösung wie in Tabelle 3 angegeben eluiert. In diesen Lösungen wurden NH&sub4;-Acetat und NH&sub4;Cl in Wasser gelöst, NaCl und KCl wurden in 10 mM KH&sub2;PO&sub4;-K&sub2;HPO&sub4; Puffer gelöst, und alle Lösungen wurden auf pH 7,8 eingestellt. Die Ausbeute (%) des Lactoferricins, das unter Verwendung verschiedener Salzlösungen erhalten wurde, wurde in der gleichen Weise wie in Test 3 bestimmt.
- Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß das Lactoferricin bei Salzkonzentrationen von 1 bis 4 M eluiert werden, aber die Ausbeute am höchsten bei Konzentrationen von 2 M oder mehr ist. Die Ergebnisse deuten weiterhin darauf hin, daß NaCl, KCl, NH&sub4;- Acetat und NH&sub4;Cl zur Elution von Lactoferricin verwendet werden können. Tabelle 3
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung genauer. Diese Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
- Herstellung eines Peptidgemisches, das Lactoferricin enthält, ist im folgenden beispielhaft dargestellt.
- Rinderlactoferrin (2,0 kg; Morinaga Milk Industry Co., Ltd; Reinheit ungefähr 90 %), isoliert aus Magermilch, wurde in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 5 % (w/v) gelöst und der pH wurde auf 3,0 durch Zugabe von 1 N HCl eingestellt. Kristallines Pepsin (Difco Laboratories) wurde bis auf eine Endkonzentration von 3 % (w/w des Substrats) zugegeben und Hydrolyse wurde bei 37ºC für 4 Stunden durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 80ºC für 15 Minuten beendet. Der pH des erhaltenen Peptidgemisches wurde auf 7,0 durch Zugabe von 1 N NaOH eingestellt und unlösliche Peptide wurden durch Filtration entfernt. Die Peptidlösung wurde sprühgetrocknet, um 1,9 kg pulverförmiges Material zu erhalten.
- Herstellung von Lactoferricin in hoher Reinheit unter Verwendung eines Carboxymethylgruppe-enthaltenden Kationenaustauscherchromatographiemediums ist im folgenden beispielhaft dargestellt.
- Zur Verwendung als Ausgangsmaterial wurden 50 g des Peptidgemisches, erhalten in Beispiel 1, in destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 5 % (w/v) gelöst. CARBOXYMETHYL-TOYOPEARL 650 S (Tosoh Corp.) wurde mit 100 mM KH&sub2;PO&sub4;-K&sub2;HPO&sub4; Puffer, pH 7,8 vor der Verwendung gewaschen und äquilibriert und ca. 400 ml dieses Kationenaustauschermediums wurden verwendet. Das Ausgangsmaterial war anfänglich mit dem Kationenaustauschermedium in einem Rührtankreaktor in Verbindung gebracht worden, dann wurde die Flüssigkeit gesammelt und das Medium wurde in eine Chromatographiesäule (10 cm x 8 cm i.D.) überführt. Die gesammelte Flüssigkeit wurde wieder mit dem Medium in der Säule in Kontakt gebracht, dann wurde das Kationenaustauschermedium mit dem Puffer bei einer Flußrate von ungefähr 20 ml/min gewaschen, um die ungebundenen Peptide zu entfernen. Waschen des Mediums wurde fortgeführt, bis der Proteingehalt des von dem Medium eluierten Puffers auf einen niedrigen Wert abnahm, was durch eine Absorption bei 280 nm auf ungefähr 0,06 angezeigt wird. Das Lactoferricin wurde von dem Medium bei konstantem pH mit 2 M Ammoniumacetat, pH 7,8 desorbiert. Entsalzen der so erhaltenen Lactoferricinlösung wurde erreicht durch Verwendung von 0,5 Liter BUTYL-TOYOPEARL 650 M (Tosoh Corp.). Die Lactoferricinlösung wurde mit dem hydrophoben Medium in einer Chromatographiesäule (10 x 8 cm i.D.) in Kontakt gebracht und das Medium wurde mit ungefähr 5 Litern Wasser gewaschen, um die Puffersalze zu entfernen. Schließlich wurde Lactoferricin mit 10 mM HCl desorbiert und gefriergetrocknet, um 1,4 g pulverförmigen Produkts zu erhalten. Die Reinheit des erhaltenen Lactoferricins war 92 %, was geschätzt wurde durch Reverse-Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
- Herstellung von Lactoferricin in hoher Reinheit unter Verwendung eines Butylrest-enthaltenden hydrophoben Interaktionschromatographiemediums ist wie folgt beispielhaft dargestellt.
- Zur Verwendung als Ausgangsmaterial wurden 256 g des Peptidgemisches, erhalten in Beispiel 1, in destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 5 % (w/v) gelöst. BUTYL- TOYOPEARL 650 M (Tosoh Corp.) wurde mit Wasser vor der Verwendung gewaschen und äquilibriert und ca. 1100 ml dieses hydrophoben Mediums wurden verwendet. Das Ausgangsmaterial wurde am Anfang mit dem hydrophoben Medium in einem Rührtankreaktor in Kontakt gebracht, dann wurde die Lösung gesammelt und das Medium wurde in eine Chromatographiesäule (22 cm x 8 cm i.D.) überführt. Die gesammelte Lösung wurde wieder mit dem Medium in der Säule in Kontakt gebracht, dann wurde das hydrophobe Medium mit Wasser bei einer Flußrate von 100 ml/min gewaschen, um die ungebundenen Peptide zu entfernen. Waschen des Mediums wurde fortgesetzt, bis der Proteingehalt des von dem Medium eluierten Wassers bis auf einen niedrigen Wert abnahm, was durch eine Absorption bei 280 nm von ungefähr 0,06 angezeigt wird. Die gebundenen Peptide, die Lactoferricin beinhalten, wurden von dem Medium mit 10 mM HCl desorbiert und mit einem gleichen Volumen von McIlvaine Puffer, pH 7, (hergestellt durch Verbinden der Lösungen 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; in einem Verhältnis von 177 : 824) gemischt. Die erhaltene gepufferte Peptidlösung wurde mit dem hydrophoben Medium in Kontakt gebracht und das Medium wurde mit ungefähr 2 Litern desselben Puffers gewaschen. Lactoferricin wurde selektiv von dem Medium bei einem konstanten pH mit ungefähr 3 Litern des McIlvaine Puffers, pH 5,0 (hergestellt durch Verbinden der Lösungen 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; in einem Verhältnis von 485 : 515) desorbiert. Das hydrophobe Medium wurde durch Waschen mit 10 mM HCl und dann mit Wasser aufbereitet. Entsalzen der so erhaltenen Lactoferricinlösung wurde erreicht durch Verwendung des aufbereiteten BUTYL- TOYOPEARL 650 M. Die Lactoferricinlösung wurde auf pH 7,0 durch Zugabe von 1 N NaOH eingestellt und mit dem hydrophoben Medium in Kontakt gebracht, dann wurde das Medium mit ungefähr 10 Litern Wasser gewaschen, um die Puffersalze zu entfernen. Schließlich wurde Lactoferricin mit 10 mM HCl desorbiert und gefriergetrocknet, um 3,5 g pulverförmiges Produkt zu erhalten. Die Reinheit des erhaltenen Lactoferricins war 98 %, was geschätzt wurde durch Reverse-Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
- Herstellung von Lactoferricin in hoher Reinheit unter Verwendung eines Butylrest-enthaltenden hydrophoben Interaktionschromatographiemediums ist weiter wie folgt beispielhaft dargestellt.
- Zur Verwendung als Ausgangsmaterial wurden 233 g des Peptidgemisches, erhalten in Beispiel 1, in destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 5 % (w/v) gelöst. Mit dem Ausgangsmaterial wurde wie in Beispiel 3 beschrieben verfahren, wobei 1100 ml von BUTYL-TOYOPEARL 650 M (Tosoh Corp.) verwendet wurden, außer daß Entsalzen durch Ultrafiltrationsdialyse unter Verwendung einer Romicon Modell 1,0-43- PM1 Hohlfilterkartusche mit einer Molekulargewichtsausschlußgröße von 1000 erreicht wurde. Die erhaltene Lactoferricinlösung wurde gefriergetrocknet, um 1,6 g pulverförmigen Produktes zu erhalten. Die Reinheit des erhaltenen Lactoferricins war 98 %, was geschätzt wurde durch Reverse-Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
- Herstellung von Lactoferricin in hoher Reinheit unter Verwendung eines Butylrest-enthaltenden hydrophoben Interaktionschromatographiemediums ist weiter wie folgt beispielhaft dargestellt.
- Zur Verwendung als Ausgangsmaterial wurden 600 g des Peptidgemisches, erhalten in Beispiel 1, in destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 5 % (w/v) gelöst. BUTYL- TOYOPEARL 650 M (Tosoh Corp.) wurde mit Wasser vor der Verwendung gewaschen und äquilibriert und ca. 3.000 ml dieses hydrophoben Gels wurden verwendet. Das Ausgangsmaterial wurde am Anfang mit dem hydrophoben Medium in einem Rührtankreaktor in Kontakt gebracht, dann wurde die Flüssigkeit gesammelt und das Medium wurde in eine Chromatographiesäule (10 cm x 20 cm i.D.) überführt. Die gesammelte Flüssigkeit wurde wieder mit dem Medium in der Säule in Kontakt gebracht, dann wurde das hydrophobe Medium mit Wasser bei einer Flußrate von ungefähr 100 ml/min gewaschen, um die ungebundenen Peptide zu entfernen. Waschen des Mediums wurde fortgesetzt, bis der Proteingehalt des von dem Medium eluierten Wassers auf einen niedrigen Wert abnahm, was durch eine Absorption bei 280 nm von ungefähr 0,06 angezeigt wurde. Die gebundenen Peptide, die Lactoferricin beinhalten, wurden von dem Medium mit 10 mM HCl desorbiert und mit einem gleichen Volumen McIlvaine Puffer, pH 7,0 (hergestellt durch Verbinden der Lösungen 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; in einem Verhältnis von 177 : 824) gemischt. Die erhaltene gepufferte Peptidlösung wurde mit dem hydrophoben Medium in Kontakt gebracht und das Medium wurde mit ungefähr 6 Litern desselben Puffers gewaschen. Lactoferricin wurde selektiv von dem Medium bei einem konstanten pH mit ungefähr 9 Litern McIlvaine Puffer, pH 5,0 (hergestellt durch Verbinden der Lösungen 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; in einem Verhältnis von 485 : 515) desorbiert. Entsalzen der so erhaltenen Lactoferricinlösung wurde erreicht durch Verwendung derselben 3.000 ml BUTYL-TOYOPEARL 650 M. Die Lactoferricinlösung wurde auf pH 7,0 durch Zugabe von 1 N NaOH eingestellt und mit dem hydrophoben Medium in Kontakt gebracht, dann wurde das Medium mit ungefähr 30 Litern Wasser gewaschen, um die Puffersalze zu entfernen. Schließlich wurde Lactoferricin mit 10 mM HCl desorbiert und gefriergetrocknet, um 10,5 g pulverförmiges Produkt zu erhalten. Die Reinheit des Produkts war 99 %, was geschätzt wurde durch Reverse-Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
Claims (11)
1. Verfahren zur Massenherstellung eines antimikrobiellen
Peptids in hoher Reinheit, welches die Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen eines Gemisches von Peptiden, das
das antimikrobielle Peptid enthält, erhältlich durch
Hydrolysieren von Rinderlactoferrin oder
Rindermilchprotein, das Lactoferrin enthält, mit
einem hydrophoben Chromatographiemedium oder
Kationenaustauscherchromatographiemedium, um das
antimikrobielle Peptid zu adsorbieren,
(b) Waschen des Mediums, um andere Peptide als das
antimikrobielle Peptid zu eluieren,
(c) Desorbieren des antimikrobiellen Peptids in Lösung
von dem gewaschenen Medium und gegebenenfalls,
(d) Entsalzen der desorbierten antimikrobiellen
Peptidlösung, wobei das antimikrobielle Peptid mit
mindestens 90 Gew.-% Reinheit erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das hydrophobe
Chromatographiemedium eine Komponente ausgewählt aus
Butyl, Hexyl, Octyl, Phenyl und Octylamin enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das
hydrophobe Chromatographiemedium, das mit dem Gemisch in
Kontakt gebracht wird, in Schritt (b) mit Wasser oder
einem Puffer gewaschen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Puffer bei einem pH
im Bereich von 6,5 bis 7,5 ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, worin das
gewaschene hydrophobe Chromatographiemedium Desorption des
antimikrobiellen Peptids mit einer verdünnten Säurelösung,
ausgewählt aus Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure,
Essigsäure und Zitronensäure und/oder einem Puffer mit
einem pH im Bereich von 4,5 bis 5,5 unterzogen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das
Kationenaustauscherchromatographiemedium eine
Carboxymethylgruppe enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 6, worin das
Kationenaustauscherchromatographiemedium, das mit dem
Gemisch in Kontakt gebracht wird, mit einem Puffer
gewaschen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Puffer bei einem pH
im Bereich 7 bis 8 ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, worin das gewaschene
Kationenaustauscherchromatographiemedium einer Desorption
des antimikrobiellen Peptids mit einer Lösung, die ein
Salz, ausgewählt aus Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat,
Natriumchlorid und Kaliumchlorid, bei einer Konzentration
von 1 bis 4 Mol/l unterzogen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Entsalzen mit dem
Verfahren der Elektrodialyse oder Ultrafiltration unter
Verwendung einer semipermeablen Membran oder einer
Hohlfaserfilterkartusche mit einer Molekulargewichts-
Ausschlussgrösse von 3000 oder weniger ausgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Entsalzen durch
Inkontaktbringen der desorbierten antimikrobiellen
Peptidlösung mit einem hydrophoben Chromatographiemedium,
Waschen des Mediums mit Wasser und Desorbieren des
antimikrobiellen Peptids von dem gewaschenen Medium mit
einer verdünnten Säurelösung durchgeführt wird.
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