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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von Sialinsäure in großen Mengen aus von Lipiden
befreitem Eigelb, das als Rückstand bei der Herstellung
polarer Lipide, neutraler Lipide, Cholesterin und anderer
Substanzen aus Hühnereigelb erhalten wird, wobei die
Sialinsäure hohe Reinheit besitzt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Sialinsäure bzw. Sialsäure (wobei der letztere Ausdruck
weniger geläufig ist) ist der allgemeine Ausdruck für die
Acylderivate von Neuraminsäure. Sie tritt natürlich in Form
einer großen Vielzahl von Derivaten auf, wobei
N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) die häufigste ist.
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In den vergangenen Jahren wurde gefunden, daß Sialinsäure
als Virusrezeptor wirkt und verschiedene physiologische
Wirkungen, wie die Zellerkennung, die
Choleratoxinneutralisierung, die Unterdrückung von Infekten mit pathogenen
Escherichia coli, die Expektoranzwirkung und die Kontrolle der
hämatologischen Halbwertszeit von Blutproteinen, vermittelt.
Mit der zunehmenden Beachtung der Sialinsäure zusammen mit
dem Verstehen ihrer biologischen Rollen besteht ein
zunehmender Bedarf ihrer Anwendung in Pharmazeutika.
Beispielsweise besteht ein starker Bedarf für ihren Zugang in großen
Mengen.
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Obgleich Sialinsäure natürlich vielfach in den
nichtreduzierten Terminalen von Glycoproteinen und Glycolipiden in
vivo vorkommt, ist es schwierig, Sialinsäure aus natürlichen
Substanzen, die sie enthalten, sowohl in großen Mengen als
auch zu niedrigen Kosten zu erzeugen und sie sowohl in
industriellem Maßstab als auch mit hoher Reinheit zu erhalten.
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Es wurden Verfahren zur Herstellung von Sialinsäure
beschrieben, einschließlich des Verfahrens, das in der
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 34995/1989
beschrieben wird, bei dem Sialinsäure aus Kükenmekonium
gebildet wird, und das Verfahren, das in der geprüften
japanischen Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 16042/1968
beschrieben wird, bei dem Sialinsäure aus Chalaza und
Ovomuzin, erhalten aus Hühnereiweiß, gebildet wurde. Keines
dieser Verfahren erlaubt die Herstellung von Sialinsäure sowohl
in industriellem großem Maßstab als auch mit niedrigen
Kosten, da es kein System für den industriellen Zugang der
Ausgangsmaterialien gibt.
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Andererseits ist es eine bekannte Tatsache, daß Sialinsäure
in Eigelb vorhanden ist. Jedoch wird Eigelb nur als
Rohmaterial für Mayonnaise, Kuchen und andere Nahrungsmittel
verwendet. Die industrielle Verwendung seiner Komponenten ist
auf die Verwendung von Eigelb lipid als Material für
Kosmetika, Pharmazeutika und einige Nahrungsmittel beschränkt.
Bis jetzt hat noch niemand versucht, industriell Sialinsäure
aus Eigelb abzutrennen.
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Dies ist darauf zurückzuführen, daß Eigelb Nachteile
besitzt, da das Herstellungsverfahren für Sialinsäure
schwierig ist und die Kosten nicht günstig sind, da eine große
Menge an Lipid, das in dem Eigelb enthalten ist, nach der
Elektrolyse bei der Abtrennung von Sialinsäure aus Eigelb
stark die Eigelblösung emulgiert, wodurch das folgende
Reinigungsverfahren stark gehemmt wird.
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In Chem. Abs., 1971, Bd. 74, Abs. 20775n und Agri. Biol.
Chem., 1982, Bd. 46, 5. 2587-9 wird beschrieben, daß von
Lipiden befreites Eigelb Sialinsäure enthält, aber es wird
nicht angegeben, wie die Säure in großen Mengen und großer
Reinheit aus dem Eigelb extrahiert werden kann.
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Als Reinigungsverfahren für Sialinsäure wird in der
offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 34995/1989 ein
Verfahren beschrieben, bei dem das Ausgangsmaterial
Kükenmekonium hydrolysiert und dann an einem Anionenaustauschharz
ohne vorhergehende Entsalzung adsorbiert wird, wonach es
dann entsalzt wird.
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In den Patentzusammenfassungen aus Japan, 1995, Bd. 014, Nr.
250 wird die Hydrolysierung von Chalaza und Vitellinmembran
von Hühnerei mit Säure und anschließend die Trennung und
Reinigung der abgetrennten Sialinsäure mit einem Absorbens
beschrieben. Die Säure wird dann entsalzt. Wenn jedoch diese
Verfahren zur Herstellung von Sialinsäure aus von Lipiden
befreitem Eigelb verwendet werden, tritt ein Problem auf, d.
h. sowohl die Ausbeute in Prozent als auch die Reinheit der
Sialinsäure sind niedrig, so daß eine Sialinsäure mit hoher
Reinheit industriell nicht günstig erhalten werden kann.
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In der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr.
40491/1989 wird weiterhin angegeben, daß Sialinsäure durch
Hydrolyse einer Milchsubstanz, wie Kuhmilch, entfetteter Milch,
Buttermilch oder Molke, gereinigt werden kann, das
entstehende Hydrolysat durch Elektrodialyse entsalzt und
anschließend nochmals eine Elektrodialyse durchgeführt wird.
Dieses Verfahren besitzt jedoch die Schwierigkeiten, daß die
Ausbeute in Prozent der Sialinsäure erniedrigt wird, bedingt
durch den Verlust während des Entsalzens und die verringerte
Reinheit der Sialinsäure, bedingt durch die Anwesenheit von
Salzverunreinigungen während der Reinigung als Ergebnis der
Untauglichkeit zur vollständigen Entsalzung.
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In Chem. Abs., 1990, Bd. 113, Abs. 170670n wird die
Extraktion und Reinigung der Sialinsäure aus Chalaza und
Eigelbmembran beschrieben. Es wird angegeben, daß die Reinheit der
Säure größer ist als 95%, jedoch ist die Ausbeute in Prozent
der Säure gering, was eine Schwierigkeit darstellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein
Verfahren zur Herstellung von Sialinsäure in großer Menge
und zu niedrigen Kosten zu entwickeln und zur Verfügung zu
stellen.
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Die genannten Erfinder haben Verfahren zur Herstellung von
Sialinsäure untersucht. Mit der Erkenntnis, daß der
Extraktionsrückstand von Eigelblipid, der nicht effizient
verwendet wird und der nur als Futter für Tiere verwendet wird und
hauptsächlich als industrieller Abfall beseitigt wird, reich
an Sialinsäure ist und mit niedrigen Kosten und in großer
Menge zur Verfügung steht, haben die genannten Erfinder
weitere Untersuchungen durchgeführt und gefunden, daß
Sialinsäure leicht durch Hydrolyse von Eigelb, das von Lipiden
befreit ist, gewonnen werden kann.
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Gegenstand der vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung und Reinigung von Sialinsäure mit hoher
Reinheit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Hydrolyse
eines von Lipiden befreiten Eigelbs mit Säure, die
Entsalzung des Hydrolysats und dann die Reinigung des entsalzten
Hydrolysats durch Behandlung mit einem Ionenaustauschharz
umfaßt.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Sialinsäure bedeutet bei der vorliegenden Erfindung ein
Neu5Ac- oder Neu5ac-gebundenes Oligosaccharid unter den
Neuraminsäureverbindungen. Obwohl der Neu5Ac-Gehalt keinen
Beschränkungen unterliegt, müssen die oben erwähnten
Sialinsäuren je mindestens in Form einer freien Säure vorliegen.
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Das von Lipiden befreite Eigelb für die vorliegende
Erfindung
bedeutet ein Eigelb, das durch Lipidentfernung von
rohem Eigelb, gepulvertem Eigelb usw. nach einem an sich
bekannten Verfahren unter Verwendung organischer
Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol oder Dimethylether, erhalten
worden ist. Der maximal erlaubte Restlipidgehalt im gesamten
Feststoffgehalt beträgt 20%, wobei ein Eigelb bevorzugt ist
mit einem Restlipidgehalt von nicht mehr als 10%. Gehalte,
die 20% übersteigen, sind unerwünscht, da eine Emulgierung
stattfindet, wodurch das folgende Reinigungsverfahren
gehemmt wird.
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Zur Durchführung der Hydrolyse ist ein Verfahren wesentlich,
mit dem die Sialinsäure im von Lipiden befreiten Eigelb in
freier Form erhalten wird. Es sind sowohl die Säurehydrolyse
als auch die Enzymhydrolyse ohne Beschränkung anwendbar,
aber die Säurehydrolyse ist bevorzugt.
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Bei der Säurehydrolyse sind die hydrolytischen Bedingungen
wie folgt. Die von Lipiden befreite Eigelblösung wird auf
einen pH von 0,6 bis 2,5 durch Zugabe einer Säure, wie
Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure oder Oxalsäure,
eingestellt, und dann von 70 bis 90ºC, bevorzugt von 80 bis 85ºC,
während 30 bis 120 Minuten, bevorzugt 45 bis 90 Minuten,
erhitzt. Danach wird sie mit einem Neutralisationsmittel, wie
Bariumhydroxid, Natriumhydroxid oder Calciumhydroxid,
neutralisiert. Der optimale pH für die Neutralisation liegt
üblicherweise im Bereich von 5 bis 6, wobei bei diesen
Bedingungen die Menge an Sialinsäure, die an dem
Anionenaustauschharz bei dem folgenden Verfahren adsorbiert wird,
erhöht wird. Wenn der pH außerhalb dieses Bereichs liegt, wird
die unvollständige Freisetzung der Sialinsäure oder die
Zersetzung der Sialinsäure ein Problem darstellen.
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Im Falle der Enzymhydrolyse werden ein oder mehrere Enzyme,
wie Neuraminidase, Protease und Zuckerhydrolase entsprechend
dem Zweck ausgewählt und durch Erhitzen nach der Reaktion
bei den entsprechenden optimalen Bedingungen für das
entsprechende
Enzym entaktiviert.
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Dementsprechend ergibt Neuraminidase Neu5Ac, wohingegen
Protease verschiedene Neu5Ac-gebundene Oligosaccharide ergibt.
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Beispielsweise erfolgt die Enzymhydrolyse normalerweise bei
20 bis 60ºC, bevorzugt 35 bis 45cc, in Anwesenheit von
Sialidase, die zu dem Ausgangsmaterial im Verhaltnis von
normalerweise 100 bis 3000 ppm, bevorzugt 500 bis 2000 ppm,
zugegeben wird.
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Das so erhaltene Hydrolysat wird einem bekannten Verfahren,
wie Filtrieren oder Zentrifugieren, zur Entfernung
unlöslicher Substanzen unterworfen, danach wird es bei verringertem
Druck, sofern erforderlich, konzentriert und nach einem
üblichen Verfahren, wie Sprühtrocknen oder Lyophilisierung,
getrocknet, wobei die rohe Sialinsäure erhalten wird.
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Zur Herstellung von Sialinsäure mit hoher Reinheit wird die
rohe Sialinsäure gereinigt. Das Filtrat, welches nach der
Entfernung der unlöslichen Substanzen aus dem Hydrolysat
nach einem bekannten Verfahren, wie Filtrieren oder
Zentrifugieren, erhalten wurde, wird zuerst einer
Entsalzungsbehandlung unterworfen.
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Man kann irgendeine Entsalzungsbehandlung verwenden, solange
es ein traditionell verwendetes Verfahren ist, wie die
Umkehrosmose (RO), die Membranfiltration, die Elektrodialyse
oder eine dialytische Membranfiltration. Diese Verfahren
können einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Insbesondere ist das Verfahren, bei dem eine RO-Membran und/oder
die Elektrodialyse verwendet wird, bevorzugt. Als Beispiel
für die Entsalzung unter Verwendung einer RO-Membran wird
das Hydrolysat durch eine RO-Membran NTR-7250-S4F
(hergestellt von Nitto Denko Corporation), befestigt an einer RO-
Einheit RSS-11X des Spiralen-Typs (hergestellt von Nitto
Denko Corporation), entsalzt. Als Beispiel für die
Entsalzung
durch Elektrodialyse wird das Hydrolysat durch eine
elektrodialytische Membran Neosepta CM-2 ACS (hergestellt
von Tokuyama Soda Co., Ltd.) entsalzt, die an eine
elektrodialytische Vorrichtung Modell TS-10-360 (hergestellt von
Tokuyama Soda Co., Ltd.) befestigt ist. Als Beispiel für die
Entsalzung unter Verwendung einer dialytischen Membran wird
das Hydrolysat in einen 8/32 inch Zellophanbeutel
(hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gegeben, und
nach dem Versiegeln des Zellophanbeutels wird das Hydrolysat
unter mäßigem Rühren in einem Tank, der Wasser in etwa der
lofachen Menge bezogen auf das Hydrolysat enthält, entsalzt.
Unabhänig von dem Entsalzungsverfahren erfolgt die
Entsalzung, bis die Leitfähigkeit normalerweise 1500 µS/cm,
bevorzugt 900 µs/cm, erreicht. Die Elektrodialyse kann in
mehreren Stufen durchgeführt werden; beispielsweise können die
Sialinsäure und Salze im Filtrat durch eine
elektrodialytische Membran in der ersten Stufe der Elektrodialyse
hindurchgehen, und der Abfluß wird durch eine
Entsalzungsmembran geleitet, wobei nichts außer den Salzen durch die
Membran hindurchgehen kann, wobei eine Lösung der Sialinsäure
(entsalzte Lösung) bei der zweiten Stufe erhalten wird.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muß das
Entsalzungsverfahren dem Durchgang der Lösung der Sialinsäure durch ein
Anionenaustauschharz nach der Hydrolyse vorangehen. Wenn das
Hydrolysat nicht entsalzt wird, kann die erfindungsgemäße
Aufgabe nicht gelöst werden, da die Menge an Sialinsäure,
die an dem Anionenaustauschharz adsorbiert wird,
beträchtlich abnimmt und da die Ausbeute in Prozent und die Reinheit
der Sialinsäure abnehmen. Es wurde gefunden, daß dies dem
Einfluß der Salze, die in großen Mengen in Eigelb, wenn es
von Lipiden befreit ist, vorhanden sind, zuzuschreiben ist.
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Anschließend wird die Sialinsäure in dem entsalzten
Hydrolysat abgetrennt und unter Verwendung eines Adsorbens
gereinigt. Bei diesem Verfahren wird das Anionenaustauschharz als
Sialinsäure-Adsorbens verwendet. In diesem Fall wird
hinsichtlich der Reinheit der Sialinsäure die erhalten wird,
ein verbessertes Ergebnis erhalten, wenn ein
Kationenaustauschharz zusammen mit einem Anionenaustauschharz, falls
erforderlich, verwendet wird. Insbesondere wird das
entsalzte Hydrolysat zuvor durch ein Kationenaustauschharz,
sofern erforderlich, geleitet, damit Verunreinigungen, wie
Aminosäuren, adsorbiert werden, und anschließend wird es
durch ein Anionenaustauschharz geleitet, um die Sialinsäure
daran zu adsorbieren. Beispiele von Kationenaustauschharzen,
die für diesen Zweck verwendet werden können, umfassen Dowex
50W x 2 (hergestellt von Dow Chemical Company, USA),
Amberlite IR-116 (hergestellt von Japan Organo Co., Ltd.) und
Diaion SK-102 (hergestellt von Mitsubishi Chemical
Industries, Ltd.). Beispiele von Anionenaustauschharzen umfassen
Dowex 1 x 8 (hergestellt von Dow Chemical Company, USA),
Amberlite IRA401 (hergestellt von Japan Organo Co., Ltd.) und
Diaion SA11A (hergestellt von Mitsubishi Chemical
Industries, Ltd.).
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Die Sialinsäure, die an einem Anionenaustauschharz
adsorbiert ist, wird nach der Eluierung mit einer organischen
oder anorganischen Säure, wie Ameisensäure oder
Chlorwasserstoffsäure, oder mit einem Salz, wie Natriumchlorid,
gewonnen.
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Dieses Eluat der Sialinsäure, welches nach einem an sich
bekannten Verfahren, wie Gelfiltration oder Elektrodialyse
sofern erforderlich, entsalzt wurde, wird bei verringertem
Druck durch Membrantrocknen, Sprühtrocknen oder
Lyophilisierung konzentriert, wobei Sialinsäure mit hoher Reinheit
erhalten wird. Die so erhaltene Sialinsäure mit hoher Reinheit
kann als Ausgangsmaterial für Reagentien und Pharmazeutika
und für andere Zwecke verwendet werden.
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Wie oben angegeben, ermöglicht die vorliegende Erfindung die
Herstellung und das Zurverfügungstellen von Sialinsäure
sowohl in großer Menge als auch zu niedrigen Kosten, was nach
den bisher bekannten Verfahren schwierig zu realisieren war.
Die vorliegende Erfindung wird signifikant zu der Technik
beitragen, wenn sie mit der Herstellung von Eigelböl
kombiniert wird, wobei dann das Eigelb wirksamer ausgenutzt
werden kann.
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Erfindungsgemäß ist es weiterhin möglich, die Sialinsäure
aus von Lipiden befreitem Eigelb in industriellem Maßstab zu
reinigen, was in der Vergangenheit, bedingt durch den
Einfluß der Salze, die in großen Mengen in von Lipiden
befreitem Eigelb vorhanden waren, nicht möglich war. In anderen
Worten erlaubt die vorliegende Erfindung die Herstellung von
Sialinsäure mit einer fast 100%igen Ausbeute und Reinheit
durch Entsalzen des Hydrolysats, bevor es durch ein
Anionenaustauschharz geleitet wird.
BEISPIELE
Testbeispiel 1
Herstellung von Eigelbproben, die von Lipiden befreit sind.
quantitative Bestimmung der Lipide und Emulgiertest
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100 g gepulvertes Eigelb wurden durch Erhitzen auf 50ºC in
einem Ovalrundkolben, der mit einem Kühler ausgerüstet war,
bei den folgenden Bedingungen von Lipiden befreit. Die
Temperatur bei der Lipidbefreiung betrug 32 C im Falle von
Diethylether alleine.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1
Lipidextraktion aus Eigelb
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Je 50 g der von Lipiden befreiten Eigelbproben A bis L, die
in Tabelle 1 angegeben sind, und eine Eigelbprobe, die nicht
von Lipiden befreit war, wurden zweimal mit 500 ml Aceton
bei Raumtemperatur und dann zweimal mit 500 ml eines 2:
1-Gemisches von Chloroform und Methanol bei 50ºC unter
Verwendung eines Kühlers extrahiert, und die extrahierten Lipide
wurden quantitativ bestimmt. Dann wurden 10 g der jeweiligen
von Lipiden befreiten Eigelbproben A bis L und eine nicht
von Lipiden befreite Eigelbprobe unter Verwendung eines
Homomischers in Anwesenheit von 30 ml einer 0,1
N-Schwefelsäure gerührt, danach wurde das Gemisch bei 80ºC eine Stunde
hydrolysiert, der pH wurde auf 5,0 mit einer gesättigten
Bariumhydroxidlösung eingestellt, und dann wurde filtriert.
Das Filtrat wurde auf seinen Emulgierzustand geprüft. Die
quantitativ bestimmten Lipide waren Aceton-lösliche Lipide
(%) und Lipide, die in einem Gemisch aus Chloroform-Methanol
löslich waren (%). Der Emulgierzustand wurde in drei
Bewertungen bewertet: das Filtrat ist transparent und nicht
emulgiert ( ), das Filtrat ist etwas trübe (Δ), das gesamte
Filtrat ist vollständig emulgiert (X).
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
TABELLE 2
Wirkung der Lipidkonzentration auf Eigelbpulver
bei der Emulgierung
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Aus den Testergebnissen der Tabelle 2 folgt, daß eine
Emulgierung nicht stattfindet, so daß das folgende Reinigungs
verfahren nicht gehemmt wird, wenn der gesamte Lipidgehalt
einschließlich der neutralen Lipide und Phospholipide nicht
mehr als 20% beträgt.
Beispiel 1
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40 kg der von Lipiden befreiten Eigelbprobe B von
Testbeispiel 1 wurden in 300 1 Wasser suspendiert. Nach der Zugabe
von 6 N-Schwefelsäure zur Einstellung des pH auf 1,4
erfolgte die Säurehydrolyse unter mäßigem Rührem bei 80ºC für
60 Minuten. Nach Beendigung der Hydrolyse wurde eine
gesättigte Lösung aus Bariumhydroxid zur Einstellung des pH auf
5,0 zugegeben. Nach dem Filtrieren des Gemisches durch einen
Filter unter Druck zur Entfernung der unlöslichen Substanzen
wurde das Filtrat bei verringertem Druck konzentriert, wobei
eine Ausbeute von 2,7 kg roher Sialinsäure mit einer
Ausbeute in Prozent von 6,75%, bezogen auf 40 kg der von
Lipiden befreiten Eigelbprobe B, erhalten wurden. Die Ausbeute
in Prozent bezogen auf die theoretische Menge Sialinsäure,
die in 40 kg von Lipiden befreiter Eigelbprobe B vorhanden
war, wurde als 93% berechnet [unter der Annahme, daß der
theoretische Prozentgehalt an Sialinsäure in Eigelb, wenn es
von Lipiden befreit ist, 0,2% beträgt (Agricultural and
Biological Chemistry, 46 (10), 2587-2589, 1982); das gleiche
gilt für die folgenden Ausführungen]. Der Neu5Ac-Gehalt war
2,8% als Reinheit, gemäß dem Resorcinverfahren bestimmt.
Hier beruht das Resorcinverfahren auf "The Sialic Acid",
'XI. A Periodate-Resorcinol Method for the Quantitative
Estimation of Free Sialic Acids and Their Glycosides',
beschrieben im Journal of Biological Chemistry, 246 (2), 430-
435, 1971.
Beispiel 2
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40 kg der von Lipiden befreiten Eigelbprobe C von
Testbeispiel 1 wurden in 300 1 Wasser suspendiert. Nach der
Reaktion mit 1,0 kg Protease [Protease von Papaya (Typ III),
hergestellt von Sigma] bei einem pH von 7,3 und einer
Temperatur von 37ºC während 12 Stunden wurde das
Reaktionsgemisch bei 90ºC für 10 Minuten zur Inaktivierung des Enzyms
erhitzt. Das entstehende Hydrolysat wurde dem
kontinuierlichen Zentrifugieren unterworfen, und der Niederschlag wurde
entfernt. Der so erhaltene Überstand wurde sprühgetrocknet,
wobei 4,7 kg rohe Sialinsäure (Neu5Ac-gebundene
Oligosaccharide) mit einer Ausbeute in Prozent von 11,7%, bezogen auf
40 kg von Lipiden befreite Eigelbprobe C, erhalten wurden.
Die Ausbeute in Prozent, bezogen auf die theoretische Menge
an Sialinsäure, die in 40 kg von Lipiden befreiter
Eigelbprobe C vorhanden ist, betrug 91%. Zur Freisetzung von
Neu5Ac aus diesem Sialinsäureprodukt wurde die Hydrolyse
durchgeführt, nachdem der Neu5Ac-Gehalt als 1,5% Reinheit
gemäß dem Resorcinverfahren bestimmt wurde.
Testbeispiel 2
Tests für die Ausbeute in Prozent und die Reinheit von
Sialinsäure
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Entsalzte und nichtentsalzte von Lipiden befreite
Eigelbproben wurden nach der Hydrolyse hergestellt. Die in jeder
Probe enthaltene Sialinsäure wurde an Ionenaustauschharz
adsorbiert, und die Ausbeute in Prozent und die Reinheit der
Sialinsäure wurden unter den Proben verglichen, unter der
Annahme, daß der Sialinsäuregehalt vor dem Einfüllen auf die
Säule 100% betrug. Insbesondere wurden 30 l Wasser zu 10 kg
von jeder der von Lipiden befreiten Eigelbproben zugegeben.
Nach der Hydrolyse von 6 N-Schwefelsäure bei einem pH von
1,6 und einer Temperatur von 80ºC während 1 Stunde wurde das
Hydrolysat auf pH 6,0 mit 6 N-Bariumhydroxid neutralisiert
und filtriert, wobei 28 l Filtrat erhalten wurden.
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Das Filtrat wurde dann mit den folgenden drei Verfahren zur
Bestimmung der Ausbeute in Prozent und der Reinheit der
Sialinsäure unterworfen.
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1) 5 l Filtrat wurden unter Verwendung von TS-10-360
(hergestellt von Tokuyama Soda Co., Ltd.) entsalzt, bis die
Leitfähigkeit 750 µS/cm erreichte, danach wurde die Lösung
durch Dowex 1 x 8 (1 l, Formeat-Typ, hergestellt von Dow
Chemical Company, USA) zur Adsorption der Sialinsäure
geleitet. Nach dem Waschen mit Wasser zur Entfernung der
Verunreinigungen
wurde die Sialinsäure mit Ameisensäure eluiert,
und die Ausbeute in Prozent und die Reinheit wurden
bestimmt.
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2) Die Ausbeute in Prozent und die Reinheit der Sialinsäure
wurden durch die Verwendung von Dowex 1 x 8 auf gleiche
Weise wie bei 1) bestimmt, ausgenommen, daß das Entsalzen
nicht durchgeführt wurde.
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3) Die aus Dowex 1 x 8 eluierten Fraktionen wurden wie in 2)
oben angegeben unter Verwendung von TS-10-360 entsalzt.
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Aus Tabelle 3 folgt, daß, wenn das Entsalzen dem Durchgang
des Filtrats durch das Harz nicht vorhergeht, die Menge an
Sialinsäure, die an dem Harz adsorbiert wird, beachtlich
abnimmt und die Ausbeute in Prozent der Sialinsäure weniger
als 30% beträgt. Zusätzlich ist die Reinheit so niedrig wie
50%. Diese Zahlen erläutern, daß der Einfluß der Salze sehr
groß ist, wenn von Lipiden befreites Eigelb als
Ausgangsmaterial verwendet wird.
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Wenn andererseits auf die Hydrolyse die Entsalzung folgt,
bis die Leitfähigkeit 750 µS/cm erreicht, unter Verwendung
einer Elektrodialysevorrichtung, wie TS-2-10 (hergestellt
von Tokuyama Soda Co., Ltd.), kann Sialinsäure mit einer
Wiedergewinnung in Prozent von fast 100% und einer Reinheit
von fast 100% gemäß dem TBA-Verfahren erhalten werden. Hier
beruht das TBA-Verfahren auf "The Thiobarbituric Acid of
Sialic Acids", beschrieben im "Journal of Biological
Chemistry", Bd. 234, S. 1971-1975.
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Diese Ergebnisse erläutern, daß das Entsalzen dem Durchgang
des Filtrats durch die Säule vorhergehen muß.
Beispiel 3
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400 kg von Lipiden befreites Eigelb wurden in 1200 l Wasser
suspendiert. Der pH der Suspension wurde auf 1,6 durch
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Zugabe von 6 N-Schwefelsäure eingestellt, und dann wurde die
Säurehydrolyse unter mäßigem Rühren bei 80ºC während 60
Minuten durchgeführt. Nach Beendigung der Hydrolyse wurde eine
gesättigte Lösung aus Bariumhydroxid zur Einstellung des pH
auf 5,5 zugegeben. Dieses Gemisch wurde durch einen Filter
unter Druck zur Entfernung der unlöslichen Substanzen
filtriert und dann entsalzt. Nach Beendigung der Hydrolyse
wurden 1200 l Hydrolysat entsalzt und auf 50 l unter Verwendung
einer RO-Membran NTR-7250 (hergestellt von Nitto Denko
Corporation) konzentriert. Das entstehende Konzentrat wurde
durch eine Säule, gepackt mit Dowex 50W x 2 (hergestellt von
Dow Chemical Company, USA, H-Typ, 50 l), geleitet und weiter
durch eine Säule aus Dowex 1 x 8 (hergestellt von Dow
Chemical Company, USA, Formeat-Typ, 50 l) zur Adsorption der
Sialinsäure an das Harz geleitet. Die nichtadsorbierten
unerwünschten Substanzen wurden mit 600 l Wasser ausgewaschen.
Dann erfolgte die Eluierung mit einem
Ameisensäure-Dichtegradienten von 0 bis 2 N zur Eluierung der Sialinsäure. Die
Fraktion, welche Sialinsäure enthielt, wurde gesammelt und
bei verringertem Druck getrocknet. Der entstehende trockene
Feststoff wurde in 1 l Wasser gelöst und lyophilisiert,
wobei 675 g Sialinsäure mit einer Ausbeute in Prozent von 84%,
bezogen auf die theoretische Menge an Sialinsäure, die in
400 kg von Lipiden befreitem Eigelb vorhanden ist, erhalten
wurden. Die Reinheit der Sialinsäure wurde gemäß dem TBA-
Verfahren bestimmt, sie beträgt nicht weniger als 97%.
TABELLE 3
Ausbeute in Prozent und Reinheit der entsalzten oder
nichtentsalzten Sialinsäureproben nach Hydrolyse
Beispiel 4
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400 kg von Lipiden befreites Eigelb wurden in 1200 l Wasser
suspendiert. Zu dieser Suspension wurde 6
N-Chlorwasserstoffsäure zugegeben, und die Säurehydrolyse erfolgte auf
gleiche Weise wie in Beispiel 1. Nach Beendigung der
Hydrolyse wurde 4 N-Natriumhydroxid zur Einstellung des pH auf
6,5 zugegeben. Dieses Gemisch wurde durch einen Filter unter
Druck zur Entfernung der unlöslichen Substanzen filtriert
und dann entsalzt. 1200 l des Hydrolysats wurden entsalzt,
bis die Leitfähigkeit 500 µS/cm unter Verwendung einer
Elektrodialysevorrichtung (hergestellt von Tokuyama Soda Co.,
Ltd.) erreichte. Danach wurde sie durch eine Säule, die mit
Diaion SK102 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries
Ltd., H-Typ, 50 l) gepackt war geleitet und weiter durch
eine Säule aus Diaion SA11A (hergestellt von Mitsubishi
Chemical Industries Ltd., Formeat-Typ, 50 l) zur Adsorption der
Sialinsäure an das Harz geleitet. Dann wurden die
nichtadsorbierten unerwünschten Substanzen mit 600 l Wasser
herausgewaschen. Die Eluierung erfolgte mit einem Natriumchlorid-
Dichtegradienten von 0 bis 1 N zur Eluierung der
Sialinsäure. Die Fraktion, welche Sialinsäure enthielt, wurde
gesammelt, durch Elektrodialyse entsalzt und bei verringertem
Druck getrocknet. Der entstehende trockene Feststoff wurde
in 1 l Wasser gelöst und lyophilisiert, wobei eine Ausbeute
von 683 g Sialinsäure mit einer Ausbeute in Prozent von 85%,
bezogen auf die theoretische Menge an Sialinsäure, die in
400 kg von Lipiden befreitem Eigelb enthalten ist, erhalten
wurde. Die Reinheit der Sialinsäure wurde gemäß dem
TBA-Verfahren bestimmt und betrug nicht weniger als 97%.