DE69925870T2

DE69925870T2 - Verfahren zur bereitstellung von wachstumsfaktozubereitungen (tgf-beta und igf-1) mit niedriger gegenseitiger verunreinigung aus milchprodukten

Info

Publication number: DE69925870T2
Application number: DE69925870T
Authority: DE
Inventors: Gerardus Marinus KIVITS; Wilhelm Andor HENDRICKS; Franciscus Leonard MALLEE
Original assignee: Campina Melkune BV; Nutricia NV
Current assignee: Campina Melkune BV; Nutricia NV
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2019-10-07
Also published as: DE69925870D1; AU6232999A; AU782573B2; WO2001025276A1; CA2387686A1; DK1218410T3; EP1218410A1; ATE297948T1; EP1218410B1; NZ518217A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Fraktion, die im Wesentlichen in Abwesenheit des Insulin-artigen Wachstumsfaktors (IGF-1) den transformierenden Wachstumsfaktor β(TGF-β) umfasst, und einer Fraktion, die im Wesentlichen in Abwesenheit von TGF-β IGF-1 umfasst, aus Milchprodukten (Milch oder Molke).β
Es ist bereits seit einiger Zeit bekannt, dass Milchprodukte Wachstumsfaktoren enthalten, die eine vorteilhafte Aktivität aufweisen können. Diese Wachstumsfaktoren liegen in sehr niedrigen Konzentrationen in dem Milchprodukt vor, weshalb sie gelegentlich als Mikronährstoffe bezeichnet werden. Sie können durch ihren isoelektrischen Punkt, der verhältnismäßig hoch ist im Vergleich zu anderen Milchproteinen, und durch ihr Molekulargewicht charakterisiert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Wachstumsfaktoren TGF-β und IGF-1.
TGF-β ist ein multifunktionales Protein, das in allen Säugetier-Geweben zu finden ist. Derzeit sind fünf Formen von TGF-β bekannt, nämlich β1 bis β5. Es ist beteiligt an der Entwicklung, der Differenzierung und dem Wachstum von Gewebe und der Kontrolle der Immunsystem-Funktion und der Carcinogenese. TGF-β kann aus natürlichen Quellen (z.B. aus Blutplättchen), aus Säugetiermilch oder Kolostrum (Vormilch) isoliert werden oder durch rekombinante Zellen hergestellt werden.
IGF-1, ein Anabolikum, d.h. ein das Wachstum fördernder Wachstumsfaktor, ist ein kleines Protein (Molekulargewicht etwa 7800), das eine wichtige Rolle im Knochen stoffwechsel spielt. Es wurde bereits gezeigt, dass es das Wachstum von Zellen in Kultur stimuliert. Tierisches Wachstum wird auch stimuliert in hypophysären Defizit-, normalen und katabolischen Zuständen. Die Nierenfunktion wird ebenfalls verbessert. Es kann hergestellt werden unter Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie, durch Festphasenpeptidsynthese, durch Isolierung desselben aus dem Blutserum oder aus Säugetiermilch, wie z.B. Rinder(Kuh)- oder Humanmilch.
Wie vorstehend beschrieben, ist es bekannt, dass IGF-1 und TGF-β aus Milchprodukten, wie z.B. Milch oder Molke, extrahiert werden können. Mit den bisher angewendeten Methoden unter Anwendung eines wirtschaftlich durchführbaren Verfahrens ohne viele Reinigungsstufen war es nur möglich, eine Mischung dieser Wachstumsfaktoren zu erhalten. Für einige Verwendungszwecke, insbesondere für bestimmte therapeutische Anwendungen, ist es jedoch, wie gefunden wurde, bevorzugt, eine an IGF-1 reiche Fraktion zu verwenden, die im Wesentlichen frei von TGF-β ist, und eine an TGF-β reiche Fraktion zu verwenden, die im Wesentlichen frei von IGF-1 ist.
Ein Beispiel für eine solche therapeutische Verwendung ist diejenige, wie sie in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung der gleichen Anmelderin beschrieben ist. In diesem Dokument wird die Verwendung von TGF-β zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung der Schädigung der Intestinal-Schleimhaut als Folge einer Chemotherapie oder einer Radiotherapie beschrieben. Es wurde gefunden, dass in diesem Fall das IGF-1 die Aktivität von TGF-β beeinflusst. Bei dieser Anwendung ist es daher erforderlich, TGF-β im Wesentlichen in Abwesenheit von IGF-1 dem Patienten zuzuführen. Bisher war ein solches relativ reines TGF-β nur erhältlich durch rekombinante DNA-Verfahren oder durch Anwendung eines unwirtschaftlichen Verfahrens zur Isolierung aus Milch (Mehrstufen-Isolierung nach dem US-Patent 5 221 734). Diese Produkte sind jedoch ziemlich teuer und würden die oben genannte Behandlung für große Gruppen von Patienten unzugänglich machen.
In WO 92/00 994 und WO 95/29 933 sind Verfahren zur Isolierung einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren aus Milch oder Molke beschrieben. Wie vorstehend angegeben, ist es nicht immer erwünscht, eine Mischung von Wachstumsfaktoren zur Verfügung zu haben, weil einige Wachstumsfaktoren einen negativen Einfluss auf die Aktivität anderer Wachstumsfaktoren haben können. Das Verfahren gemäß WO 95/29 933 hat ferner den Nachteil, dass eine Ansäuerung angewendet wird. Dies führt zur Abtrennung der Wachstumsfaktoren von Bindungsproteinen und inaktiviert außerdem die Lactoperoxidase. Die Bindungsfaktoren fördern das Überleben der Wachstumsfaktoren während des Durchgangs durch das Intestinum, in dem Verdauungsenzyme die Wachstumsfaktoren abbauen können, was zu einem (partiellen) Verlust an Aktivität führt.
In EP 0 489 884 oder seinem Äquivalent WO 92/00 014 ist ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Wachstumsfaktoren aus Kolostrum durch Kationenaustauschchromatographie und anschließende Adsorptionschromatographie an Hydroxyapatit beschrieben, wobei die an dem Hydroxyapatit zurückgehaltene Fraktion gewonnen wird. Es ist darin angegeben, dass durch Anwendung dieses Verfahrens mehr als 50 % aller Wachstumsfaktoren isoliert werden. Dieses Dokument bezieht sich nur auf eine Mischung von Wachstumsfaktoren und gibt keine Auskunft darüber, wie der viel höhere Gehalt an Immunglobulinen und das praktische Fehlen von Lactoperoxidase im Vergleich zur Milch und/oder Molke die Menge und gegenseitige Verunreinigung von IGF-1 und TGF-β in angereicherten Wachstumsfaktor-Präparaten beeinflussen. Außerdem ist in diesem Dokument nicht angegeben, ob die Wachstumsfaktoren noch an Bindungsfaktoren gebunden sind.
EP 0 335 554 bezieht sich auf eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung für den topischen Auftrag auf Säugetierhaut oder -haar, wobei diese Zusammensetzung einen Wachstumsfaktor, ausgewählt aus der Gruppe TGF-α, TGF-β und IGF-1 oder Fragmente oder Mischungen davon, umfasst.
D.A. Belford et al. beschreiben in "Platelet-derived growth factor, insulin-like growth factors, fibroblast growth factors and transforming growth factor β do not account for the cell growth activity present in bovine milk", abgedruckt in "J. Endocrinology" (1997), 154, 45 – 55, die Anwendung der Kationenaustauschchromatographie zur Isolierung einer Fraktion, die Lactoperoxidase, Immunglobuline und Wachstumsfaktoren enthält, aus Käsemolke.
In EP 0 556 083 ist die Abtrennung von Lactoperoxidase, einer sekretorischen Komponente, und von Lactoferrin aus Milch und verwandten Ausgangsmaterialien durch Verwendung eines Kationenaustauschers beschrieben.
Das US-Patent 5 221 734 beschreibt ein Verfahren zum Isolieren eines Milch-Wachstumsfaktors (MGF) aus Milch oder Molke. Dieses Verfahren erfordert die Durchführung vieler Stufen, wie z.B. einer Ionenaustauschchromatographie (IEC), einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie (HIC) und einer Größenausschlusschromatographie, was zu niedrigen Ausbeuten an TGF-β führt. Dadurch wird dieses Verfahren wirtschaftlich nicht durchführbar.
WO 95/26 984 bezieht sich auf ein Verfahren, das eine Stufe umfasst, in der das Milchprodukt erhitzt wird, um die Lactoperoxidase zu denaturieren. Danach wird die Lactoperoxidase von der Zusammensetzung abgetrennt, wodurch der Wirkungsgrad der Endreinigung der Wachstumsfaktoren verbessert wird. Für die kommerzielle Verwendung als natürliches Konservierungsmittel ist es jedoch bevorzugt, native Lactoperoxidase abzutrennen. Außerdem ist es erwünscht, die spezifische Aktivität der nach der Isolierung der Wachstumsfaktoren zurückbleibenden Lactoperoxidase zu erhöhen.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Isolierung von TGF-β und IGF-1 aus einem Milchprodukt in Form von verhältnismäßig reinen Fraktionen (d.h. mit einem hohen Anteil eines Wachstumsfaktors im Verhältnis zu dem anderen Wachstumsfaktor) bereitzustellen, um eine hohe Ausbeute an Wachstumsfaktoren zu erzielen. Ziel der Erfindung ist es ferner, diese Wachstumsfaktoren in einer Form zur Verfügung zu stellen, die geeignet ist für die orale Verabreichung. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, TGF-β und IGF-1 aus Milchprodukten in Form ver hältnismäßig reiner Fraktionen zu gewinnen und gleichzeitig native Lactoperoxidase in einer hohen Ausbeute zu erhalten.
Erfindungsgemäß wurde nun ein Verfahren gefunden, um Fraktionen, die reich an Wachstumsfaktoren sind und Bindungsfaktoren enthalten, abzutrennen und gleichzeitig eine Lactoperoxidase-Fraktion mit einer hohen Aktivität zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Extrahieren des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) und des Insulin-artigen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) aus einem Milchprodukt, das die folgenden Stufen umfasst:

a) Abtrennung einer basischen Fraktion aus dem Milchprodukt durch Kationenaustauschchromatographie;
b) Hindurchlaufenlassen der in der Stufe (a) erhaltenen Fraktion durch eine Hydroxyapatit-Kolonne;
c) sequentielles Eluieren der Hydroxyapatit-Kolonne mit mindestens zwei Eluierungsmitteln mit steigender Salzkonzentration, wobei die Eluierungsmittel ausgewählt werden aus Phosphatpuffern, Natriumchlorid-Lösungen und Kaliumchlorid-Lösungen, wobei das erste Eluierungsmittel einen pH-Wert von 5,5 bis 7 und eine Salzkonzentration von 0,05 bis 0,2 M und das zweite Eluierungsmittel einen pH-Wert von 5,5 bis 7 und eine Salzkonzentration von 0,2 bis 0,3 M aufweisen, zur Bildung von zwei getrennten Fraktionen: i) einer Fraktion, die IGF-1 umfasst, in der das Verhältnis von IGF-1 zu TGF-β mehr als 10 beträgt; und ii) einer Fraktion, die TGF-β umfasst, in der das Verhältnis von TGF-β zu IGF-1 mehr als 5 beträgt.

Auf diese Stufen kann eine weitere Elutionsstufe (d) folgen, in der die Nydroxyapatit-Kolonne mit einem Eluierungsmittel eluiert wird, das eine erhöhte Salzkonzentration oder einen erhöhten pH-Wert im Vergleich zu dem in der Stufe (c) verwendeten Eluierungsmitteln hat, wobei dieses Eluierungsmittel ausgewählt wird aus Phosphatpuffern, Natriumchlorid-Lösungen und Kaliumchlorid-Lösungen, in der Weise, dass erhalten wird

iii) eine Lactoperoxidase umfassende Fraktion.

Das Milchprodukt, das erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial verwendet wird, kann irgendeine Säugetiermilch oder irgendein Säugetiermilch-Derivat sein, das Wachstumsfaktoren enthält, wie z.B. Käse-Molke oder Casein-Molke. Vorzugsweise wird Rindermilch oder ein Rindermilch-Derivat verwendet. Die Milch kann einer Vorbehandlung, beispielsweise einer milden Pasteurisierung, unterworfen werden und/oder sie kann unter Verwendung einer Zentrifuge oder unter Anwendung einer Mikrofiltrationsstufe entfettet werden.
Vorzugsweise wird das Ausgangsmaterial zuerst einer minimalen Wärmebehandlung unterworfen. Dies ist vorteilhaft, weil

1) bei einer solchen Wärmebehandlung ein beträchtlicher Anteil der in natürlicher Weise in der Milch vorkommenden Bakterien abgetötet wird und
2) die Denaturierung von Lactoperoxidase und anderer Milchserumproteine minimiert wird.

Unter einer minimalen Wärmebehandlung ist ein mittleres Erwärmen auf höchstens 80 °C für nicht mehr als einige wenige Sekunden zu verstehen.
Außerdem ist es höchst vorteilhaft, das Fett von dem Ausgangsmaterial zu entfernen, bevor dieses den Adsorptions- und Elutionsstufen unterworfen wird. Es wurde gefunden, dass nach der Fettentfernung die Kolonne, in der das Kationenaustauscherharz enthalten ist, kaum verfettet oder verstopft wird während der Stufe der Adsorption an dem kationischen Austauscherharz. Dadurch werden ein übermäßig hoher Druckaufbau in der Kolonne und eine unvorteilhafte Verkürzung der Adsorptionszyklen verhindert.
Es ist bevorzugt, Fett durch Mikrofiltration zu entfernen, weil dadurch gleichzeitig eine Verringerung der mikrobiellen Kontamination des Ausgangsmaterials bewirkt wird. In diesem Zusammenhang wird eine Mikrofiltration als Filtrationseinrichtung mit einem Filter mit Öffnungen zwischen 0,1 und 10 μm angesehen.
Das in der Stufe (a) verwendete Kationenaustauscherharz kann ein solches irgendeines auf diesem Gebiet geeigneten Typs sein. Es ist bevorzugt, ein Kationenaustauscherharz mit einer mittleren Teilchengröße von mehr als 100 μm und mit einer ausreichenden mechanischen Festigkeit, um hohen Drucken standzuhalten, zu verwenden. Dies hat den Vorteil, dass das Kationenaustauscherharz gegen hohe Flüssigkeitsbeladungen beständig ist, während die Bindungskapazität aufrechterhalten wird. Dadurch ist es möglich, große Mengen Flüssigkeit innerhalb einer kurzen Zeit zu verarbeiten, was für ein industriell anwendbares Verfahren erforderlich ist. Beispiele für geeignete Kationenaustauscherharze sind S-Keramik Hyper D, SP-Toyopearl, SP-Sepharose FastFlow und SP-Sepharose Big Beads.
Vorzugsweise wird das Kationenaustauscherharz äquilibriert durch Abpuffern mit einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5. Dann lässt man das Milchprodukt durch eine Kolonne mit dem Kationenaustauscherharz laufen, beispielsweise durch Umpumpen, wodurch Mikrokomponenten aus dem Ausgangsmaterial an dem Kationenaustauscherharz adsorbiert werden. Um ein Mikrobenwachstum zu verhindern, werden diese Verfahren normalerweise bei einer Temperatur von 4 bis 7 °C durchgeführt. Die Viskosität bei dieser Temperatur führt jedoch zu einem nicht akzeptablen Druckaufbau. Deshalb wird die Adsorption vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 20 °C durchgeführt, um die Viskosität der Milch oder des Milch-Derivats zu verringern bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung eines relativ hygienischen Zustandes.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ausgangsmaterial mit einer hohen Oberflächengeschwindigkeit (von mehr als 500 cm/h) und mit einer hohen Flüssigkeitsbeladung (100 bis 600 Bettvolumina pro Stunde) über ein Kationenaustauscherharz mit einer mittleren Teilchengröße von 100 bis 300 μm gepumpt, wie in dem US-Patent 5 596 082 beschrieben. Bei dieser Ausführungsform erhält man ein Verfahren, das vom wirtschaftlichen Standpunkt aus betrachtet höchst vorteilhaft ist und für die Anwendung in der Industrie sehr geeignet ist.
Nach der Adsorptionsstufe ist es bevorzugt, aus der Kationenaustauscherharz-Kolonne irgendein restliches Milchprodukt (Ausgangsmaterial) auszuwaschen durch Waschen derselben mit einer Salzlösung (NaCl-Lösung), die auf einen pH-Wert zwischen 5,5 und 7,5 abgepuffert ist und eine Salz-Konzentration von 0,15 M oder weniger aufweist.
Nach der Adsorption der gewünschten Komponenten an dem Ionenaustauscherharz wird eine Elutionsstufe durchgeführt. Vorzugsweise werden die Komponenten mit einer Salzlösung eluiert, die auf einen pH-Wert zwischen 5,5 und 7,5, vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 6,5, abgepuffert ist. Als Salz wird vorzugsweise Natriumchlorid oder Kaliumchlorid verwendet, es können aber auch andere Salze, wie z.B. Ammoniumacetat, verwendet werden. Dies führt zu einer Fraktion, die das gewünschte TGF-β, IGF-1 und Lactoperoxidase enthält.
In der Stufe (b) des Verfahrens wird die nach der Ionenaustauschchromatographie erhaltene Fraktion über eine Hydroxyapatit-Kolonne laufen gelassen. Hydroxyapatit ist ein kristallisiertes Tricalciumphosphat, das als Substrat für die Absorption von Proteinen verwendet wird. Industriell verwendbare Hydroxyapatit-Harze sind Macroprep Ceramic Hydroxyapatite von der Firma Biorad und HA Ultrogel von der Firma Biosepra. Hydroxyapatit weist einzigartige Trennungseigenschaften auf, weil er sowohl Phosphat als auch Calcium enthält, die als Liganden fungieren können. Seit kurzem steht auch ein Hydroxyapatit-Material zur Verfügung, das im Produkttionsmaßstab verwendbar ist. Es wird heute in mehreren Protein-Gewinnungs/Reinigungs-Verfahren im Produktionsmaßstab verwendet.
In dieser Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die in der Stufe (a) erhaltene Milchfraktion durch die Hydroxyapatit-Kolonne laufen gelassen, beispielsweise durch Umpumpen, wodurch Mikrokomponenten aus dem Ausgangsmaterial von dem Hydroxyapatit adsorbiert werden. Die Adsorption wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von mehr als 5,5 und einer Phosphat-Konzentration von 5 bis 100 mmol/l durchgeführt.
Nach der Absorptionsstufe wird die Hydroxyapatit-Kolonne sequentiell eluiert mit geeigneten Elutionsflüssigkeiten. Verwendbare Eluierungsmittel sind Phosphatpuffer, Natriumchlorid- und Kaliumchlorid-Lösungen. Für die verschiedenen Fraktionen müssen diese Eluierungsmittel eine steigende Salzkonzentrationen aufweisen. Es ist auch möglich, einen steigenden pH-Gradienten anzuwenden. Weitere geeignete Eluierungsmittel sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Es ist bevorzugt, dass der Gesamtkonzentrationsbereich der verwendeten Salzlösungen zwischen 0,01 und 1,0 M liegt.
Erfindungsgemäß wird zur Herstellung einer an IGF-1 angereicherten Fraktion die Kolonne in der Regel mit einem Phosphatpufer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 7 und einer Phosphat-Konzentration von 0,05 bis 0,2 M, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 6,0 und einer Phosphat-Konzentration von 0,15 M, eluiert. Zur Herstellung einer an TGF-β angereicherten Fraktion wird die Kolonne anschließend mit einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 7 und einer Phosphatkonzentration von 0,2 bis 0,3 M, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 6,0 und einer Phosphatkonzentration von 0,25 M, eluiert.
Insgesamt führt das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung sowohl von IGF-1 als auch von TGF-β von etwa 25 bis 50 % der Mengen, die in dem Ausgangsmaterial enthalten sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine weitere Elutionsstufe durchgeführt, um eine Lactoperoxidase-Fraktion zu erhalten. Bei dieser Ausführungsform wird die Hydroxyapatit-Kolonne mit einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 8 und einer Phosphatkonzentration von 0,3 bis 0,5 M, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 7 und einer Phosphatkonzentration von 0,5 M, eluiert. Dies führt zu einer nativen Lactoperoxidase-Fraktion mit einer hohen Aktivität, die einen zusätzlichen Vorteil der vorliegenden Erfindung darstellt.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Fraktionen können nach allgemein bekannten Verfahren in ihre jeweiligen Komponenten weiter aufgetrennt werden. Beispiele für Trennverfahren, die angewendet werden können, sind die Ionenaustauschchromatographie, die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und die Größenausschlusschromatographie.
Die Endprodukte können nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weiter verarbeitet werden, um ein Salz daraus zu entfernen und/oder sie einzuengen. Zur Salzentfernung kann beispielsweise die Ultrafiltration oder Gelfiltration angewendet werden. Zum Einengen können die Fraktionen lyophilisiert oder sprühgetrocknet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die verschiedenen Fraktionen von Wachstumsfaktoren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden. Die Erfindung umfasst somit außerdem ein Produkt, das eine an TGF-β reiche Fraktion enthält, die im Wesentlichen frei von IGF-1 ist, in der das Verhältnis von TGF-β zu IGF-1 größer als 5, vorzugsweise größer als 50, ist. Dieses Produkt enthält insbesondere mehr als 200 μg TGF-β pro Gramm Protein und weniger als 40 μg IGF-1 pro Gramm Protein, bestimmt durch ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Im Allgemeinen enthalten diese Fraktionen höchstens 2000 μg TGF-β pro Gramm Protein.
Die Erfindung betrifft ferner ein Produkt, das eine an IGF-1-reiche Fraktion umfasst, die im Wesentlichen frei von TGF-β ist, wobei das Verhältnis von IGF-1 zu TGF-β mehr als 10, vorzugsweise mehr als 100, beträgt. Dieses Produkt enthält insbesondere mehr als 50 μg IGF-1 pro Gramm Protein und weniger als 10 μg TGF-β pro Gramm Protein. In der Regel enthält ein solches Produkt höchstens 500 μm IGF-1 pro Gramm Protein.
Wie vorstehend beschrieben, kann dann, wenn eine Schluss-Extraktionsstufe angewendet wird, ein Produkt erhalten werden, das Lactoperoxidase mit mindestens 1200 Einheiten pro mg enthält, bestimmt nach dem ABTS-Verfahren, im Wesentlichen nach Shindler et al. (1976), "European Journal of Biochemistry" 65, 325 – 331.
Die IGF- und TGF-Fraktionen enthalten ferner etwa 30 bis 50 % Immunglobuline, bezogen auf das Protein. Ihre Hauptfunktion besteht darin, mit schädlichen Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, in Wechselwirkung zu treten. Dadurch wird verhindert, dass die Mikroorganismen in das Blutzirkulationssystem eindringen. Diese Situation tritt insbesondere auf, wenn die Intestinal-Schleimhaut des Patienten als Folge einer chemotherapeutigen Behandlung geschädigt worden ist.
Die Immunglobuline können aus der Milch von Säugetieren isoliert werden, die gegenüber bestimmten Pathogenen hyperimmunisiert worden ist, oder sie können aus normaler Rindermilch (Kuhmilch) oder Molke isoliert werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man unter Verwendung von normaler Rindermilch (Kuhmilch) als Ausgangsmaterial ein Präparat, das reich an Immunglobulinen ist, das IgG und IgA umfasst. 30 bis 50 % der Protein-Fraktion besteht aus Immunglobulinen vom IgG- und IgA-Typ.
Die erfindungsgemäß erhaltenen TGF-β- und IGF-1-Fraktionen enthalten Bindungsfaktoren, die beim Ansäuern freigesetzt werden. Die latenten und aktiven Formen beider Wachstumsfaktoren können auf diese Weise bestimmt werden, indem man jeweils beispielsweise einen Wachstumsfaktor-spezifischen ELISA-Test in Gegenwart oder Abwesenheit einer Säurebehandlung der Probe durchführt. Die Bindungsfaktoren spielen eine Rolle bei der Modulation der Wachstumsfaktor-Aktivität und sie können die Wachstumsfaktoren während des Durchgangs durch den Gastrointestinaltrakt schützen.
Die erfindungsgemäß erhaltenen IGF- und TGF-Fraktionen können für verschiedene Zwecke verwendet werden, von denen einer die Verwendung während der Chemotherapie und Radiotherapie für die Behandlung und/oder Prävention einer Schädigung der Intestinalschleimhaut ist.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die 1, welche die Identifikation von Immunglobulinen in einer IGF-1 -reichen Fraktion zeigt, näher erläutert. In den Beispielen wurden die folgenden Verfahren zum Analysieren der erhaltenen Produkte angewendet.
Test-Kits zur Bestimmung von TGF-β und IGF-1 sind im Handel erhältlich. Verwendeter Test-Kit: Quantikine^® zur Bestimmung des Human-TGF-β von der Firma R & D Systems.
TGF-β wird bestimmt unter Anwendung einer quantitativen Sandwich-Enzym-Immunoassay-Technik (ELISA). Ein monoklonaler Antikörper, der für Human-TGF-β2 spezifisch ist, wird zum Vorbeschichten einer Mikroplatte verwendet. Human- und Rinder-TGF-β sind identisch, sodass der Antikörper die Rinder-Form nachweist. Standards und Proben werden in die Vertiefungen pipettiert und ein eventuell vorhandener TGF-β wird durch den immobilisierten Antikörper gebunden. Da der TGF-β in der Milch in latenter Form vorliegt, wird er vor dieser Stufe zuerst durch eine Säurebehandlung aktiviert, um die TGF-β-Gesamtkonzentration zu bestimmen. Diese Aktivierungsstufe wird weggelassen, um die Menge des aktiven TGF-β zu bestimmen.
Nach dem Abwaschen irgendwelcher ungebundener Substanzen wird in die Vertiefungen ein Enzym-gebundener polyklonaler Antikörper eingeführt, der spezifisch für TGF-β2 ist. Nach dem Waschen zur Entfernung eines ungebundenen Antikörper-Enzym-Reagens wird eine Substrat-Lösung in die Vertiefungen eingeführt und proportional zur Menge des in der Anfangsstufe gebundenen TGF-β2 entwickelt sich eine Farbe. Die Farbentwicklung wird gestoppt und die Intensität der Farbe wird gemessen. Der TGF-β in den Proben wird in μg/g Protein ausgedrückt.
IGF-1: verwendeter Test-Kit: IGF-1 ELISA DSL-10-2800 von der Firma Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
IGF-1 wird ebenfalls bestimmt durch einen enzymatisch verstärkten "Zwei-Stufen"-Sandwich-Immunoassay ähnlich dem TGF-β. Proben, Kontrollen und unbekannte Vorverdünnungen werden in Mikrotitrations-Vertiefungen inkubiert, die mit Anti-IGF- 1-Antikörper beschichtet worden sind. Der IGF-1 in der Milch kann an Bindungsproteine gebunden werden und dadurch wird zur Bestimmung der IGF-1-Gesamtkonzentration eine Aktivierungsstufe, in der eine Säure verwendet wird, ähnlich wie bei TGF-β angewendet. Die Menge an freiem IGF-1 wird bestimmt, wenn die Aktivierungsstufe weggelassen wird. Der IGF-1 in den Proben wird ausgedrückt in μg/g Protein.
Protein
Das Protein in den Proben wird nach dem Bradford-Verfahren unter Verwendung von Lactoferrin bestimmt zur Aufstellung der Standardkurve.
Beispiel 1: Isolierung von IGF-1, TGF-β und Lactoperoxidase aus Milch
Eine Ionenaustauschchromatographie-Kolonne (IEC) mit einem Durchmesser von 10 cm wurde mit 1 L eines starken Kationenaustauschers (SP Sepharose Big Beads, Pharmacia) gefüllt. Die Kolonne wurde unter Verwendung eines Phosphatpuffers (pH 6,5, 0,025 M Phosphat) vorkonditioniert. Die Fettfraktion der Milch wurde durch Zentrifugieren entfernt und 360 L der resultierenden Magermilch wurden bei Raumtemperatur mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 100 BVH (Bettvolumina pro Stunde) über die Kolonne laufen gelassen. Die Kolonne wurde mit 5 L einer 0,10 M NaCl-Lösung von pH 6,5 gewaschen. Die adsorbierten Proteine wurden dann fraktioniert durch anschließendes Eluieren der Kolonne mit:

a) 5 L einer 0,24 M NaCl-Lösung, pH 6,5
b) 5 L einer 1,00 M NaCl-Lösung, pH 6,5

Die Fraktion (a) enthält überwiegend Lactoperoxidase und ist reich an IGF-1 und TGF-β. Die Fraktion (b) ist reich an Angiogenin und Lactoferrin. Je nach den Ergebnissen enthält die Fraktion (a) 9 g Protein einschließlich 7 g LP, 200 μg IGF-1 und 1000 μg TGF-β. Dann wird die eluierte Fraktion (a) auf das 20-fache verdünnt und auf eine Kolonne aufgegeben, die 0,5 L Hydroxyapatit (Biorad ceramic HAP Typ 1, 40 μm) enthält, mit einer Geschwindigkeit von 15 BVH. Die Kolonne wird mit einem Puffer gewaschen, der 60 mM Phosphat enthält, pH 6,0. Die adsorbierten Proteine werden dann fraktioniert durch anschließendes Eluieren der Kolonne mit:

c) 0,15 M Phosphat, pH 6,0
d) 0,25 M Phosphat, pH 6,0
e) 0,50 M Phosphat, pH 7,0.

Die Fraktion (c) enthält 100 μg IGF-1 (150 μg/g Protein) und weist einen geringen Gehalt an TGF-β (1 μg TGF-β/g Protein) auf. Die Fraktion (d) enthält 660 μg TGF-β (1000 μg/g Protein) und weist einen geringen Gehalt an IGF-1 (5 μg IGF-1/g Protein) auf. Die Fraktion (e) enthält 7 g LP (1200 Einheiten/mg).
Beispiel 2: Isolierung von IGF-1, TGF-β und Lactoperoxidase aus Käsemolke
800 L mikrofiltrierte Käsemolke wurden auf 1 L SP Sepharose Big Beads mit einer Geschwindigkeit von 150 BVH aufgegeben. Nach dem Waschen der Kolonne mit 5 L einer 0,10 M NaCl-Lösung, pH 6,5, wurden die absorbierten Proteine fraktioniert durch anschließendes Eluieren der Kolonne mit:

f) 5 L einer 0,24 M NaCl-Lösung, pH 6,5
g) 5 L einer 1,00 M NaCl-Lösung, pH 6,5

Die Fraktion (f) enthält überwiegend Lactoperoxidase und ist reich an IGF-1 und TGF-β. Die Fraktion (g) ist reich an Angiogenin und Lactoferrin. Je nach den Ergebnissen enthält die Fraktion (f) 8 g Protein einschließlich 6 g LP, 170 μg IGF-1 und 150 μg TGF-β. Dann wird die eluierte Fraktion auf das 20-fache verdünnt und auf eine Kolonne aufgegeben, die 0,5 L Hydroxyapatit (Biorad ceramic HAP Typ 1, 40 μm) enthält, mit einer Geschwindigkeit von 15 BVH. Die Kolonne wird mit einem Puffer gewaschen, der 60 mM Phosphat enthält und einen pH-Wert von 6,0 hat. Die adsorbierten Proteine werden dann fraktioniert durch anschließendes Eluieren der Kolonne mit:

h) 0,15 M Phosphat, pH 6,0
i) 0,25 M Phosphat, pH 6,0
j) 0,50 M Phosphat, pH 7,0

Die Fraktion (h) enthält 80 μg IGF-1 (120 μg/g Protein) und weist einen niedrigen Gehalt an TGF-β (< 1 μg TGF-β/g Protein) auf. Die Fraktion (i) enthält 100 μg TGF-β (600 μg/g Protein) und weist einen niedrigen Gehalt an IGF-1 (8 μg IGF-1/g Protein) auf. Die Fraktion (j) enthält 6,5 g LP (1200 Einheiten/mg).
Beispiel 3 Isolierung von von IGF-1, TGF-β und Lactoperoxidase aus Milch unter Anwendung unterschiedlicher IEC-Elutions-Bedingungen
Die Reinheit der IEC-Fraktionen kann weiter erhöht werden durch Eluieren der Kolonne unter strengeren Bedingungen.
Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden eine IEC-Kolonne mit Magermilch beladen. Die Kolonne wurde mit 5 L einer 0,15 M NaCl/10 mM Ammoniumacetat-Lösung, pH 5,5, gewaschen. Die an dem Wachstumsfaktor reiche Fraktion wurde dann eluiert durch Hindurchlaufenlassen von 3,5 L einer 0,28 M NaCl/10 mM Ammoniumacetat-Lösung, pH 5,5, durch die Kolonne.
Obgleich die Ausbeute an Wachstumsfaktoren und Lactoperoxidase in dieser Stufe geringfügig niedriger war, war die spezifische Aktivität der in dieser Fraktion vorhandenen Wachstumsfaktoren höher als in der Fraktion, die unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen erhalten wurde, d.h. sie betrug 40 μg IGF/g Protein und 180 μg TGF/g Protein.
Beispiel 4: Isolierung von IGF-1, TGF-β und Lactoperoxidase aus Milch unter Anwendung unterschiedlicher Hydroxyapatit-Eluierungsbedingungen
Die an die Hydroxyapatit-Kolonne gebundenen Fraktionen können auch unter Anwendung anderer Elutionsbedingungen abgetrennt werden.
Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde das IEC-Eluat auf die Hydroxyapatit-Kolonne aufgegeben und die Hydroxyapatit-Kolonne wurde mit einem Puffer gewaschen, der 0,12 M NaCl/25 mM Phosphat enthielt, pH 7,0. Die an IGF-1 reiche Fraktion wurde dann mit einem Puffer, der 0,20 M NaCl/25 mM Phosphat, pH 7,0, enthielt, gewaschen. Die an IGF-1 reiche Fraktion wurde dann mit einem Puffer, der 0,20 M NaCl/25 mM Phosphat, pH 7,0, enthielt, eluiert und danach wurde die an TGF-β reiche Fraktion erhalten durch Eluieren der Kolonne mit einem Puffer, der 0,35 M NaCl/25mM Phosphat, pH 7,0, enthielt. Dann wurde die Lactoperoxidase erhalten durch Hindurchlaufenlassen einer Lösung, die 1 M NaCl/25 mM Phosphat enthielt, durch die Kolonne.
Die an IGF-1-reiche Fraktion enthielt 80 μg IGF-1 (120 μg/g Protein) und wies einen geringen Gehalt an TGF-β (3 μg TGF-β/g Protein) auf. Die an TGF-β reiche Fraktion enthielt 500 μg TGF-β (1100 μg/g Protein) und wies einen geringen Gehalt an IGF-1 (1 μg/g Protein) auf. Bei diesem Verfahren erhielt man 6,5 g LP.
Beispiel 5: Identifizierung der Immunoglobuline in der an IGF-1-reichen Fraktion
Das in Beispiel 1 erhaltene Produkt wurde durch SDS Page bewertet, um die Immunglobuline zu identifizieren und zu quantifizieren (vgl. 1). Ein 15 % Polyacrylamidgel wurde unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen unter Verwendung einer Phastsystem-Apparatur (Pharmacia) laufen gelassen.
Bahn 1: IEC-Fraktion.
Bahn 2: Rinder-IgG.
Bahn 3: an IGF-1-reiche Fraktion; LP: Lactoperoxydase; IgH: schwere Kette von IgG; IgL: leichte Kette von IgG.
Die mit RNase bezeichnete Proteinbande wurde identifiziert duch N-terminale Sequenzierung.
Aus der Figur ist zu ersehen, dass die an IGF-1-reiche Fraktion in der Bahn 3 kein LP enthält. Auf der Basis der Farbintensitäten der Banden liegt die Immunoglobulin- Konzentration in dieser Probe zwischen 30 und 50 %. Die andere Haupt-Proteinkomponente wurde identifiziert als RNase.
Beispiel 6: Bestimmung der latenten und aktiven Formen der Wachstumsfaktoren
Ausgehend von Milch wurden Fraktion erhalten nach anschließenden Elutionen einer Kationenaustauscher- und Hydroxyapatit-Kolonne. Diese Fraktionen wurden gefriergetrocknet, in einem geeigneten Puffer solubilisiert und dann mit ELISA getestet, wie im Wesentlichen in dem vorhergehenden Text beschrieben.
Ein Teil der Probe wurde so wie er erhalten wurde verwendet, und ein Teil wurde nach den Test-Kit-Angaben angesäuert. Das Protein in den Proben wurde nach dem Bradford-Assay unter Verwendung von Lactoferrin als Eich-Protein bestimmt. Die an IGF-1 angereicherte Fraktion enthielt so wie sie erhalten wurde 75 μg IGF-1/g Protein und nach dem Ansäuern 175 μg IGF-1/g Protein. Dies bedeutet, dass 43 % der gesamten IGF-1-Aktivität als freies IGF-1 bestimmt wurde und 57 % der gesamten IGF-1-Aktivität an Bindungsproteine gebunden war. Analog dazu enthielt die an TGF-β angereicherte Fraktion so wie sie erhalten wurde 7 μg TGF-β/g Protein, während nach dem Ansäuern 540 μg TGF-β/g Protein gefunden wurden. Dies zeigt, dass nahezu 99 % des TGF-β in der latenten Form vorlagen.

Claims

Verfahren zum Extrahieren des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) und des Insulin-artigen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) aus einem Milchprodukt, das die Stufen umfasst: a) Abtrennung einer basischen Fraktion aus dem Milchprodukt durch Kationenaustauschchromatographie; b) Hindurchlaufenlassen der in der Stufe (a) erhaltenen Fraktion durch eine Hydroxyapatit-Kolonne; c) sequentielles Eluieren der Hydroxyapatit-Kolonne mit mindestens zwei Eluierungsmitteln mit steigender Salzkonzentration, wobei die Eluierungsmittel ausgewählt werden aus Phosphatpuffern, Natriumchlorid-Lösungen und Kaliumchlorid-Lösungen, wobei das erste Eluierungsmittel einen pH-Wert von 5,5 bis 7 und eine Salzkonzentration von 0,05 bis 0,2 M und das zweite Eluierungsmittel einen pH-Wert von 5,5 bis 7 und eine Salzkonzentration von 0,2 bis 0,3 M aufweisen, zur Bildung von zwei getrennten Fraktionen: i) einer Fraktion, die IGF-1 umfasst, in der das Verhältnis von IGF-1 zu TGF-β mehr als 10 beträgt; und ii) einer Fraktion, die TGF-β umfasst, in der das Verhältnis von TGF-β zu IGF-1 mehr als 5 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Stufe umfasst: d) Eluieren der Hydroxyapatit-Kolonne mit einem Eluierungsmittel, das im Vergleich zu den in der Stufe (c) verwendeten Eluierungsmitteln einen erhöhten Salzgehalt oder pH-Wert aufweist, wobei dieses Eluierungsmittel ausgewählt wird aus Phosphatpuffern, Natriumchlorid-Lösungen und Kaliumchlorid-Lösungen, zur Bildung iii) einer Fraktion, die Lactoperoxidase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Eluierungsmittel zur Bildung der Fraktion (iii) einen pH-Wert von 5,5 bis 8 und eine Salzkonzentration von 0,3 bis 0,5 M aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Eluierungsmittel Phosphatpuffer sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Stufe (a) durchgeführt wird durch Hindurchlaufenlassen des Milchprodukts mit einer hohen Oberflächengeschwindigkeit und einer hohen Flüssigkeitsbeladung durch eine Kolonne, die mit dem Kationenaustauscherharz gefüllt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Milchprodukt eine Säugetier-Milch, vorzugsweise eine Milch ist, aus der das Fett entfernt worden ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Milchprodukt Käsemolke ist.
Produkt, erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das TGF-β im Wesentlichen in Abwesenheit von IGF-1 enthält, wobei das Verhältnis von TGF-β zu IGF-1 mehr als 5 beträgt, und das 30 bis 50 % Immunglobuline, bezogen auf Protein, enthält.
Produkt nach Anspruch 8, worin das Verhältnis von TGF-β zu IGF-1 mehr als 50 beträgt.
Produkt nach Anspruch 8 oder 9, das mehr als 200 μg TGF-β pro Gramm Protein und weniger als 40 μg IGF-1 pro Gramm Protein enthält.
Produkt, erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das IGF-1 im Wesentlichen in Abwesenheit von TGF-β enthält, wobei das Verhältnis von IGF-1 zu TGF-β mehr als 10 beträgt, und das 30 bis 50 % Immunglobuline, bezogen auf Protein, enthält.
Produkt nach Anspruch 11, worin das Verhältnis von IGF-1 zu TGF-β mehr als 100 beträgt.
Produkt, erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das mehr als 50 μg IGF-1 pro Gramm Protein und weniger als 10 μg TGF-β pro Gramm Protein und 30 bis 50 % Immunglobuline, bezogen auf Protein, enthält.
Produkt nach einem der Ansprüche 8 bis 13, das Bindungsfaktoren für die Wachstumsfaktoren enthält, die beim Ansäuern freigesetzt werden können.