JP3544213B2 - インスリン様増殖因子−１含有組成物の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、インスリン様増殖因子−１含有組成物の製造法に関する。このインスリン様増殖因子−１含有組成物は、骨強化作用を有し、骨粗鬆症の予防や治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化に伴い骨粗鬆症、骨折、腰痛などの各種骨疾患患者が増加している。これは、カルシウムの摂取不足、カルシウム吸収能力の低下、閉経後のホルモンアンバランスなどが原因であるとされている。このような高齢化に伴う骨粗鬆症や骨折などの各種骨疾患を予防するためには、骨量をできるだけ増加させて最大骨量（ｐｅａｋ ｂｏｎｅ ｍａｓｓ）を高めることが有効であるとされている。また、最大骨量を高めるということは、まさしく骨を強化することに他ならない。このような現状の中で、カルシウムの補給を目的として、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、燐酸カルシウムなどのカルシウム塩や牛骨粉、卵殻、魚骨粉などの天然カルシウム剤が用いられている。しかし、これらのカルシウム塩の中には、消化管内で不溶性の塩を形成し、体内に十分吸収されないものもある。また、骨粗鬆症治療や骨強化のための医薬として、ビタミンＤ3 やカルシトニン製剤などが用いられているが、これらの医薬を用いた場合、耳鳴り、頭痛、食欲不振などの副作用を伴うことがある。したがって、骨粗鬆症という疾病の性質上、長期的に経口摂取することができ、その予防または治療効果を期待できるような食品の開発が望まれている。
【０００３】
先に、本発明者らは、骨芽細胞を増殖させて骨を強化することのできる画分を乳清から得ることに成功した（特願平３−３５６７５４号、特願平４−１４２１７０号）。しかしながら、乳清から得られた画分中に含まれる骨芽細胞を増殖させて骨を強化する因子については特定されておらず、実際の製品に応用するに際して、工程管理が難しいという問題があった。
【０００４】
一方、インスリン様増殖因子−１（以下、ＩＧＦ−１と略記する）は、ソマトメジンのクラスに属する分子量約７，８００のポリペプチドであり、骨芽細胞を活性化し、骨量を増加させて骨を強化するなど骨代謝において重要な役割を果たす因子であることが知られている。また、最近になって消化管にＩＧＦ−１のレセプターが存在することが明らかになり、経口摂取されたＩＧＦ−１が消化管のレセプターを介して作用することが示唆さている（ホルモンと臨床、第３９巻、３１〜３７頁、１９９１年）。このＩＧＦ−１については、ヒト乳中に存在することが確認されており（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、第５８巻、９５５〜９５９頁、１９８４年）、それ以外にも血清や肝臓を含む全ての臓器に存在することが確認されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８１巻、９３５〜９３９頁、１９８４年）。また、血清などからＩＧＦ−１を単離する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６１巻、５６９〜５７５頁、１９８６年）や遺伝子組み換えによってＩＧＦ−１を得る方法（特開昭６３─２６９９８４号公報）などが知られている。さらには、牛乳中にもＩＧＦ−１が存在することが確認されており、その化学構造もヒト由来のＩＧＦ−１と全く同じであることが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２５１巻、９５〜１０３頁、１９８８年）。そして、牛乳から酸抽出とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた方法によってＩＧＦ−１を分離する方法が知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２３３巻、２０７〜２１３頁、１９８６年）。しかし、この方法では工程が煩雑であり、必ずしも実用的であるとは言えない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ヒト由来のＩＧＦ−１と同一の化学構造を持ち、同様の効果を示すことが期待されるウシ由来のＩＧＦ−１を牛乳から効率良く分離する方法について鋭意検討したところ、特定の条件で原料を処理することにより、骨粗鬆症の予防や治療に有効な高濃度のＩＧＦ−１を含有する組成物を得るに至り、本発明を完成させた。したがって、本発明は、骨強化作用や骨粗鬆症の予防または治療効果を有するウシ由来のＩＧＦ−１を高濃度に含有する組成物を製造する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
次に、本発明のＩＧＦ−１含有組成物の製造法について述べる。本発明では、牛乳、脱脂乳、乳清およびそれらの濃縮物または乾燥物を出発原料とする。牛乳、脱脂乳、乳清としては、未殺菌及び殺菌したものを挙げることができる。また、牛乳、脱脂乳、乳清の濃縮物または乾燥物としては全粉乳、脱脂粉乳、ホエー粉、ホエー蛋白濃縮物（ＷＰＣ）、ホエー蛋白単離物（ＷＰＩ）を挙げることができる。さらに、これらの牛乳、脱脂乳、乳清およびそれらの濃縮物または乾燥物を還元したものを限外濾過、逆浸透、クロマトグラフィー、透析などの処理により、蛋白質含量を高めたものも用いられる。次に、この原料を下記の式に示す条件で１００℃以下に加熱する。
Ｔ≧−５（ｐＨ）＋１００
（但し、Ｔは温度を表し、ｐＨの範囲は２≦ｐＨ≦７である。）加熱時間は１０分間程度で十分である。そして、加熱によって生じた沈澱を遠心分離などの処理で除去した後、上清を分画分子量１０ｋＤａ以下の膜を用いて濃縮する。この際に用いる膜の材質や運転条件については特に制限はなく、通常の方法に従って行うことができる。なお、分画分子量が１０ｋＤａを超える膜を用いた場合、ＩＧＦ−１が透過液側に流出してしまう。さらに、必要に応じて、この濃縮液をダイアフィルトレーション、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、電気透析などの処理で脱塩した後、凍結乾燥や噴霧乾燥などの処理を行い、ＩＧＦ−１含有組成物粉末を得ることができる。このＩＧＦ−１は熱安定性が高いので、通常の殺菌工程を加えることも可能である。
【０００７】
ここで、本発明の加熱条件について説明する。市販のＷＰＣを脱イオン水で溶解して１０％ＷＰＣ溶液を調製し、温度とｐＨ条件を変えて加熱した。なお、加熱時間は全て１０分間とした。その結果を図１に示す。図中、◎印はＩＧＦ−１含量２０μｇ／ｇ以上の組成物を得ることができた条件であり、○印はＩＧＦ−１含量１０μｇ／ｇ以上の組成物を得ることができた条件であり、×印はＩＧＦ−１含量１０μｇ／ｇ未満の組成物しか得ることができなかった条件である。そして、下記の式の条件で１００℃以下に加熱することにより、ＩＧＦ−１含量１０μｇ／ｇ以上の組成物を得ることができることが判明した。
Ｔ≧−５（ｐＨ）＋１００
（但し、Ｔは温度を表し、ｐＨの範囲は２≦ｐＨ≦７である。）
【０００８】
以上のように、本発明では、ウシ由来のＩＧＦ−１含量が１０μｇ／ｇ以上の組成物を提供することができる。このＩＧＦ−１含有組成物は骨強化作用を有するので、飲食品、医薬、飼料など添加して、骨粗鬆症の予防や治療などの効果を賦与することができる。そして、このＩＧＦ−１含有組成物を含んだ飲食品、医薬、飼料などには、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、卵殻あるいは乳由来のカルシウムなど、吸収性の良好なカルシウムをさらに添加することにより、効果を増すことができる。なお、このウシ由来のＩＧＦ−１含有組成物については、ラットによる動物試験の結果、急性毒性は認められなかった。
次に、本発明の実施例を挙げて具体的に説明する。
【０００９】
【実施例１】
乳清蛋白濃縮物（ＷＰＣ）を１０％濃度となるよう蒸留水で十分溶解し、４０ｌの乳清蛋白溶液（ｐＨ６．８）を調製した。次に、この乳清蛋白溶液を５ｌずつ分取し、各温度に保持して１０分間加熱した後、１７，０００×Ｇで遠心分離を行って上清を回収した。そして、この上清を分画分子量８ｋＤａのＵＦ膜で濃縮し、凍結乾燥してＩＧＦ−１含有組成物粉末を得た。また、ＩＧＦ−１含有組成物の粉末中に含まれるＩＧＦ−１濃度をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定した。なお、比較として、乳清蛋白溶液（ｐＨ６．８）を調製した後に、この乳清蛋白溶液を５ｌ分取し、上記記載の条件式から外れる６５℃に保持して１０分間加熱したものについてもＩＧＦ−１濃度を測定した。
その結果を表１に示す。
【表１】
【００１０】
【参考例１】
未殺菌の乳清（ｐＨ６．８）２０ｌを６５℃で１０分間加熱した後、１７，０００×Ｇで遠心分離を行って上清を得た。この上清を分画分子量８ｋＤａのＵＦ膜で濃縮し、凍結乾燥してＩＧＦ−１含有組成物粉末６３ｇを得た。このＩＧＦ−１含有組成物の粉末中に含まれるＩＧＦ−１濃度をＲＩＡで測定したところ、１５．２μｇ／ｇであった。
【００１１】
【実施例２】
殺菌牛乳２０ｌを１２Ｎの塩酸でｐＨを４．５に調整した後、９０℃で１０分間加熱し、１７，０００×Ｇで遠心分離を行って上清を得た。この上清を分画分子量８ｋＤａのＵＦ膜で濃縮し、凍結乾燥してＩＧＦ−１含有組成物粉末１０６ｇを得た。このＩＧＦ−１含有組成物の粉末中に含まれるＩＧＦ−１濃度をＲＩＡで測定したところ、１１．５μｇ／ｇであった。
【００１２】
【実施例３】
殺菌脱脂乳２０ｌを１２Ｎの塩酸でｐＨを４．５に調整した後、９０℃で１０分間加熱し、１７，０００×Ｇで遠心分離を行って上清を得た。この上清を分画分子量８ｋＤａのＵＦ膜で濃縮し、凍結乾燥してＩＧＦ−１含有組成物粉末８５ｇを得た。このＩＧＦ−１含有組成物の粉末中に含まれるＩＧＦ−１濃度をＲＩＡで測定したところ、１２．７μｇ／ｇであった。
【００１３】
【試験例１】
実施例１で得られたＩＧＦ−１含有組成物の骨芽細胞増殖促進効果について調べた。培養骨芽細胞様株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）を９６穴の平底細胞培養プレートに撒き込み、０．３％ウシ血清を含むα─ＭＥＭ培地（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で１８時間培養した。なお、培養に際しては、培地１００μｌに対し、０．５％濃度のＩＧＦ−１含有組成物を溶解した溶液２μｌを添加した。培養後、トリチウムでラベルしたチミジンを添加し、２時間後に細胞に取り込まれたチミジンの放射活性を測定することにより、骨芽細胞の増殖活性を求めた。その結果を図２に示す。図２では、培地にＩＧＦ−１含有組成物を添加しなかった群の放射活性を１００％とし、放射活性によってＩＧＦ−１含有組成物を添加した群の細胞増殖活性を示した。７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃及び１００℃の加熱条件で処理したＩＧＦ−１含有組成物を培地に添加した場合、培地のみと比べて１．７〜２倍の細胞増殖活性を示した。
【００１４】
【試験例２】
実施例２で得られたＩＧＦ−１含有組成物の骨強化作用について調べた。
実験動物は５週齢のＳＤ系雌ラットを用い、１試験群７匹で試験を行った。骨粗鬆症モデルラットは、１週間予備飼育した後、卵巣摘出手術を施し、さらに、低カルシウム食で５週間飼育することによって作製した。また、疑似手術を施し、卵巣を摘出しないシャムラットも作製した。そして、骨粗鬆症モデルラットを対照群とＩＧＦ−１含有組成物投与群の２群に分け、それぞれ被験飼料で３週間飼育した。
なお、被験飼料の組成を表２に示す。
【表２】
表２に示すように、カゼイン２％分の窒素量に置換してＩＧＦ−１含有組成物３．２５％を添加した。また、飼料中のカルシウム量とリン量は、全ての群で等しくなるように調整し、それぞれ飼料１００ｇあたり、３００ｍｇ、２３０ｍｇとした。
【００１５】
３週間後に各群のラットの両側大腿骨を摘出し、破断特性測定装置で骨強度を測定した。その結果を図３に示す。大腿骨破断応力は、対照群に比べて組成物投与群で統計的に有意に高い値を示した。
次に、本発明で製造したＩＧＦ−１含有組成物添加製品の参考例を示す。
【００１６】
【参考例２】
常法に従い、下記の組成を有するＩＧＦ−１含有組成物入り飲料を製造した。
混合異性化糖 １５．０（重量％）
果汁 １０．０
クエン酸 ０．５
ＩＧＦ−１含有組成物 ０．５
香料 ０．１
カルシウム ０．１
水 ７３．８
【００１７】
【参考例３】
常法に従い、下記の組成を有するＩＧＦ−１含有組成物入り錠剤を製造した。
含水結晶ブドウ糖 ７３．５（重量％）
ＩＧＦ−１含有組成物 ２０．０
カルシウム ５．０
シュガーエステル １．０
香料 ０．５
【００１８】
【発明の効果】
本発明の方法により、ＩＧＦ−１を高濃度に含有する組成物を提供することが可能となる。このＩＧＦ−１含有組成物は、骨強化作用を有することから、各種の骨関節疾患、特に骨粗鬆症の予防あるいは治療に有用である。また、成長期に摂取させることにより、最大骨量を増加させることができる。したがって、このＩＧＦ−１含有組成物は、飲食品、医薬、飼料などの素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、加熱条件とＩＧＦ−１含量の関係を示したものである。
図２は、試験例１におけるＩＧＦ−１含有組成物の骨芽細胞増殖促進効果について示したものである。
図３は、試験例２のＩＧＦ−１含有組成物の骨強化作用について示したものである。
【産業上の利用分野】
本発明は、インスリン様増殖因子−１含有組成物の製造法に関する。このインスリン様増殖因子−１含有組成物は、骨強化作用を有し、骨粗鬆症の予防や治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化に伴い骨粗鬆症、骨折、腰痛などの各種骨疾患患者が増加している。これは、カルシウムの摂取不足、カルシウム吸収能力の低下、閉経後のホルモンアンバランスなどが原因であるとされている。このような高齢化に伴う骨粗鬆症や骨折などの各種骨疾患を予防するためには、骨量をできるだけ増加させて最大骨量（ｐｅａｋ ｂｏｎｅ ｍａｓｓ）を高めることが有効であるとされている。また、最大骨量を高めるということは、まさしく骨を強化することに他ならない。このような現状の中で、カルシウムの補給を目的として、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、燐酸カルシウムなどのカルシウム塩や牛骨粉、卵殻、魚骨粉などの天然カルシウム剤が用いられている。しかし、これらのカルシウム塩の中には、消化管内で不溶性の塩を形成し、体内に十分吸収されないものもある。また、骨粗鬆症治療や骨強化のための医薬として、ビタミンＤ3 やカルシトニン製剤などが用いられているが、これらの医薬を用いた場合、耳鳴り、頭痛、食欲不振などの副作用を伴うことがある。したがって、骨粗鬆症という疾病の性質上、長期的に経口摂取することができ、その予防または治療効果を期待できるような食品の開発が望まれている。
【０００３】
先に、本発明者らは、骨芽細胞を増殖させて骨を強化することのできる画分を乳清から得ることに成功した（特願平３−３５６７５４号、特願平４−１４２１７０号）。しかしながら、乳清から得られた画分中に含まれる骨芽細胞を増殖させて骨を強化する因子については特定されておらず、実際の製品に応用するに際して、工程管理が難しいという問題があった。
【０００４】
一方、インスリン様増殖因子−１（以下、ＩＧＦ−１と略記する）は、ソマトメジンのクラスに属する分子量約７，８００のポリペプチドであり、骨芽細胞を活性化し、骨量を増加させて骨を強化するなど骨代謝において重要な役割を果たす因子であることが知られている。また、最近になって消化管にＩＧＦ−１のレセプターが存在することが明らかになり、経口摂取されたＩＧＦ−１が消化管のレセプターを介して作用することが示唆さている（ホルモンと臨床、第３９巻、３１〜３７頁、１９９１年）。このＩＧＦ−１については、ヒト乳中に存在することが確認されており（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、第５８巻、９５５〜９５９頁、１９８４年）、それ以外にも血清や肝臓を含む全ての臓器に存在することが確認されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８１巻、９３５〜９３９頁、１９８４年）。また、血清などからＩＧＦ−１を単離する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６１巻、５６９〜５７５頁、１９８６年）や遺伝子組み換えによってＩＧＦ−１を得る方法（特開昭６３─２６９９８４号公報）などが知られている。さらには、牛乳中にもＩＧＦ−１が存在することが確認されており、その化学構造もヒト由来のＩＧＦ−１と全く同じであることが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２５１巻、９５〜１０３頁、１９８８年）。そして、牛乳から酸抽出とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた方法によってＩＧＦ−１を分離する方法が知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２３３巻、２０７〜２１３頁、１９８６年）。しかし、この方法では工程が煩雑であり、必ずしも実用的であるとは言えない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ヒト由来のＩＧＦ−１と同一の化学構造を持ち、同様の効果を示すことが期待されるウシ由来のＩＧＦ−１を牛乳から効率良く分離する方法について鋭意検討したところ、特定の条件で原料を処理することにより、骨粗鬆症の予防や治療に有効な高濃度のＩＧＦ−１を含有する組成物を得るに至り、本発明を完成させた。したがって、本発明は、骨強化作用や骨粗鬆症の予防または治療効果を有するウシ由来のＩＧＦ−１を高濃度に含有する組成物を製造する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
次に、本発明のＩＧＦ−１含有組成物の製造法について述べる。本発明では、牛乳、脱脂乳、乳清およびそれらの濃縮物または乾燥物を出発原料とする。牛乳、脱脂乳、乳清としては、未殺菌及び殺菌したものを挙げることができる。また、牛乳、脱脂乳、乳清の濃縮物または乾燥物としては全粉乳、脱脂粉乳、ホエー粉、ホエー蛋白濃縮物（ＷＰＣ）、ホエー蛋白単離物（ＷＰＩ）を挙げることができる。さらに、これらの牛乳、脱脂乳、乳清およびそれらの濃縮物または乾燥物を還元したものを限外濾過、逆浸透、クロマトグラフィー、透析などの処理により、蛋白質含量を高めたものも用いられる。次に、この原料を下記の式に示す条件で１００℃以下に加熱する。
Ｔ≧−５（ｐＨ）＋１００
（但し、Ｔは温度を表し、ｐＨの範囲は２≦ｐＨ≦７である。）加熱時間は１０分間程度で十分である。そして、加熱によって生じた沈澱を遠心分離などの処理で除去した後、上清を分画分子量１０ｋＤａ以下の膜を用いて濃縮する。この際に用いる膜の材質や運転条件については特に制限はなく、通常の方法に従って行うことができる。なお、分画分子量が１０ｋＤａを超える膜を用いた場合、ＩＧＦ−１が透過液側に流出してしまう。さらに、必要に応じて、この濃縮液をダイアフィルトレーション、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、電気透析などの処理で脱塩した後、凍結乾燥や噴霧乾燥などの処理を行い、ＩＧＦ−１含有組成物粉末を得ることができる。このＩＧＦ−１は熱安定性が高いので、通常の殺菌工程を加えることも可能である。
【０００７】
ここで、本発明の加熱条件について説明する。市販のＷＰＣを脱イオン水で溶解して１０％ＷＰＣ溶液を調製し、温度とｐＨ条件を変えて加熱した。なお、加熱時間は全て１０分間とした。その結果を図１に示す。図中、◎印はＩＧＦ−１含量２０μｇ／ｇ以上の組成物を得ることができた条件であり、○印はＩＧＦ−１含量１０μｇ／ｇ以上の組成物を得ることができた条件であり、×印はＩＧＦ−１含量１０μｇ／ｇ未満の組成物しか得ることができなかった条件である。そして、下記の式の条件で１００℃以下に加熱することにより、ＩＧＦ−１含量１０μｇ／ｇ以上の組成物を得ることができることが判明した。
Ｔ≧−５（ｐＨ）＋１００
（但し、Ｔは温度を表し、ｐＨの範囲は２≦ｐＨ≦７である。）
【０００８】
以上のように、本発明では、ウシ由来のＩＧＦ−１含量が１０μｇ／ｇ以上の組成物を提供することができる。このＩＧＦ−１含有組成物は骨強化作用を有するので、飲食品、医薬、飼料など添加して、骨粗鬆症の予防や治療などの効果を賦与することができる。そして、このＩＧＦ−１含有組成物を含んだ飲食品、医薬、飼料などには、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、卵殻あるいは乳由来のカルシウムなど、吸収性の良好なカルシウムをさらに添加することにより、効果を増すことができる。なお、このウシ由来のＩＧＦ−１含有組成物については、ラットによる動物試験の結果、急性毒性は認められなかった。
次に、本発明の実施例を挙げて具体的に説明する。
【０００９】
【実施例１】
乳清蛋白濃縮物（ＷＰＣ）を１０％濃度となるよう蒸留水で十分溶解し、４０ｌの乳清蛋白溶液（ｐＨ６．８）を調製した。次に、この乳清蛋白溶液を５ｌずつ分取し、各温度に保持して１０分間加熱した後、１７，０００×Ｇで遠心分離を行って上清を回収した。そして、この上清を分画分子量８ｋＤａのＵＦ膜で濃縮し、凍結乾燥してＩＧＦ−１含有組成物粉末を得た。また、ＩＧＦ−１含有組成物の粉末中に含まれるＩＧＦ−１濃度をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定した。なお、比較として、乳清蛋白溶液（ｐＨ６．８）を調製した後に、この乳清蛋白溶液を５ｌ分取し、上記記載の条件式から外れる６５℃に保持して１０分間加熱したものについてもＩＧＦ−１濃度を測定した。
その結果を表１に示す。
【表１】
【参考例１】
未殺菌の乳清（ｐＨ６．８）２０ｌを６５℃で１０分間加熱した後、１７，０００×Ｇで遠心分離を行って上清を得た。この上清を分画分子量８ｋＤａのＵＦ膜で濃縮し、凍結乾燥してＩＧＦ−１含有組成物粉末６３ｇを得た。このＩＧＦ−１含有組成物の粉末中に含まれるＩＧＦ−１濃度をＲＩＡで測定したところ、１５．２μｇ／ｇであった。
【００１１】
【実施例２】
殺菌牛乳２０ｌを１２Ｎの塩酸でｐＨを４．５に調整した後、９０℃で１０分間加熱し、１７，０００×Ｇで遠心分離を行って上清を得た。この上清を分画分子量８ｋＤａのＵＦ膜で濃縮し、凍結乾燥してＩＧＦ−１含有組成物粉末１０６ｇを得た。このＩＧＦ−１含有組成物の粉末中に含まれるＩＧＦ−１濃度をＲＩＡで測定したところ、１１．５μｇ／ｇであった。
【００１２】
【実施例３】
殺菌脱脂乳２０ｌを１２Ｎの塩酸でｐＨを４．５に調整した後、９０℃で１０分間加熱し、１７，０００×Ｇで遠心分離を行って上清を得た。この上清を分画分子量８ｋＤａのＵＦ膜で濃縮し、凍結乾燥してＩＧＦ−１含有組成物粉末８５ｇを得た。このＩＧＦ−１含有組成物の粉末中に含まれるＩＧＦ−１濃度をＲＩＡで測定したところ、１２．７μｇ／ｇであった。
【００１３】
【試験例１】
実施例１で得られたＩＧＦ−１含有組成物の骨芽細胞増殖促進効果について調べた。培養骨芽細胞様株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）を９６穴の平底細胞培養プレートに撒き込み、０．３％ウシ血清を含むα─ＭＥＭ培地（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で１８時間培養した。なお、培養に際しては、培地１００μｌに対し、０．５％濃度のＩＧＦ−１含有組成物を溶解した溶液２μｌを添加した。培養後、トリチウムでラベルしたチミジンを添加し、２時間後に細胞に取り込まれたチミジンの放射活性を測定することにより、骨芽細胞の増殖活性を求めた。その結果を図２に示す。図２では、培地にＩＧＦ−１含有組成物を添加しなかった群の放射活性を１００％とし、放射活性によってＩＧＦ−１含有組成物を添加した群の細胞増殖活性を示した。７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃及び１００℃の加熱条件で処理したＩＧＦ−１含有組成物を培地に添加した場合、培地のみと比べて１．７〜２倍の細胞増殖活性を示した。
【００１４】
【試験例２】
実施例２で得られたＩＧＦ−１含有組成物の骨強化作用について調べた。
実験動物は５週齢のＳＤ系雌ラットを用い、１試験群７匹で試験を行った。骨粗鬆症モデルラットは、１週間予備飼育した後、卵巣摘出手術を施し、さらに、低カルシウム食で５週間飼育することによって作製した。また、疑似手術を施し、卵巣を摘出しないシャムラットも作製した。そして、骨粗鬆症モデルラットを対照群とＩＧＦ−１含有組成物投与群の２群に分け、それぞれ被験飼料で３週間飼育した。
なお、被験飼料の組成を表２に示す。
【表２】
【００１５】
３週間後に各群のラットの両側大腿骨を摘出し、破断特性測定装置で骨強度を測定した。その結果を図３に示す。大腿骨破断応力は、対照群に比べて組成物投与群で統計的に有意に高い値を示した。
次に、本発明で製造したＩＧＦ−１含有組成物添加製品の参考例を示す。
【００１６】
【参考例２】
常法に従い、下記の組成を有するＩＧＦ−１含有組成物入り飲料を製造した。
混合異性化糖 １５．０（重量％）
果汁 １０．０
クエン酸 ０．５
ＩＧＦ−１含有組成物 ０．５
香料 ０．１
カルシウム ０．１
水 ７３．８
【００１７】
【参考例３】
常法に従い、下記の組成を有するＩＧＦ−１含有組成物入り錠剤を製造した。
含水結晶ブドウ糖 ７３．５（重量％）
ＩＧＦ−１含有組成物 ２０．０
カルシウム ５．０
シュガーエステル １．０
香料 ０．５
【００１８】
【発明の効果】
本発明の方法により、ＩＧＦ−１を高濃度に含有する組成物を提供することが可能となる。このＩＧＦ−１含有組成物は、骨強化作用を有することから、各種の骨関節疾患、特に骨粗鬆症の予防あるいは治療に有用である。また、成長期に摂取させることにより、最大骨量を増加させることができる。したがって、このＩＧＦ−１含有組成物は、飲食品、医薬、飼料などの素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、加熱条件とＩＧＦ−１含量の関係を示したものである。
図２は、試験例１におけるＩＧＦ−１含有組成物の骨芽細胞増殖促進効果について示したものである。
図３は、試験例２のＩＧＦ−１含有組成物の骨強化作用について示したものである。
Claims (1)
- 牛乳、脱脂乳、乳清およびそれらの濃縮物または乾燥物を下記の式に示す条件で１００℃以下に加熱し、生じた沈殿を除去した後、分画分子量１０ｋＤａ以下の膜で濃縮することを特徴とするインスリン様増殖因子−１含有組成物の製造法。
Ｔ≧−５（ｐＨ）＋１００
（但し、Ｔは温度を表し、ｐＨの範囲は２≦ｐＨ≦７である。）
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-
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