JP2004510742A - 乳汁から誘導された骨の健康用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、乳汁の酸性タンパク質画分から誘導された骨の健康用組成物、特に乳清の酸性タンパク質画分から誘導された骨の健康用組成物、かかる骨の健康用組成物を製造する方法、かかる骨の健康用組成物を含む処置方法、およびかかる骨の健康用組成物の医薬的使用に関する。
【0002】
発明の背景
骨の生理学および病気
最も広がっておりかつ犠牲の大きい骨の病気の一つは、骨の漸進的な疎化および弱化により特徴づけられる骨粗しょう症である。この劣化が未処置のまま進行する場合、骨は、非常にわずかな外傷でもって破壊または骨折しそうである。
【0003】
骨損失の過程は30代の中ごろないし後半にて徐々に始まるけれども、それは非常に遅いので、被っている者がそれに気付くようになる前に多くの年数がかかり得る。一般に、女性は、男性より骨粗しょう症を発現する危険性が大きい。これは、閉経後、女性はエストロゲンの産生の減少に因り、骨格からの骨の速い損失を経験する故である。
【0004】
ヒトは約40まで、破骨細胞および骨芽細胞によりそれぞれ骨を破壊(吸収)および蓄積(再生)する過程は、ほぼ完全に結合されたシステムであって、一方の段階が他方の段階を刺激する。骨は、骨の細胞(骨細胞)が散在した細胞外タンパク質マトリックス(たいてい膠原原線維)を含み、しかもこの上に、カルシウム塩および他の無機質(ナトリウム、マグネシウムおよびフッ化物を含めて)から成る無機質成分がある。破骨細胞は特定部位にて骨を吸収し、そして次いでプログラム細胞死を受ける。骨芽細胞は、タンパク質マトリックス(類骨)を置換しそしてその再無機質化を仲介する。再無機質化中、骨芽細胞は石灰化物質内に包埋され、そして骨細胞すなわち骨の構造を維持するのを助ける細胞になる。破骨細胞および骨芽細胞により仲介される骨代謝回転は一生を通して行われ、そして「リモデリング」として知られている。エストロゲン欠乏は破骨細胞のプログラム細胞死すなわちアポプトシスを遅延させ、かくして正味の骨損失に通じると信じられる。
【0005】
ヒトは年を取るにつれて、リモデリングシステムが壊れ、そして2つの過程(吸収および再生)は同調化しなくなる。これについての理由は、明らかでない。ある個体は、骨の非常に高い代謝回転速度を有する。ある個体は非常に漸進的代謝回転を有するが、しかし骨の破壊が究極的に蓄積をしのぐ。骨を再生するおよび吸収するパターンはしばしば患者ごとに変動する故、専門家は多数の異なる因子がこの問題の原因であると信じている。細胞成長に影響を及ぼすところの、エストロゲン、副甲状腺ホルモン、ビタミンDおよび血液因子のような重要ホルモンがこの過程に関与する。これらの因子のいずれの因子のレベル変化も、骨粗しょう症の発現に役割を果たし得る。
【0006】
閉経後の女性は、しばしば、天然エストロゲンレベルの減少を補償するために、ホルモン置換療法(HRT)を受ける。HRTは、通常、患者が骨粗しょう症性骨折に通じ得る骨損失の臨界限度に非常に近くなる前には処方されない。
【0007】
カルシウムは骨の必須成分であるので、食餌にてまたはサプリメントにてのどちらかにて十分なカルシウム摂取をすることが必要であると信じられる。ビタミンDなしではカルシウムは骨中に取り込まれ得ず、それ故十分なビタミンD摂取も必要とされる。
乳汁および乳タンパク質
良好なタンパク質源であるのみならず、ウシの乳汁(「牛乳」)は、しばしば、カルシウムおよびビタミンDの主要な食餌的源である。乳タンパク質、および骨の病気に対するそれらの効果が、多量の研究の焦点であってきた。乳汁中に存在するタンパク質は、免疫グロブリン、成長因子、ウシ血清アルブミン(BSA)、アルファ−ラクトアルブミン、ベータ−ラクトグロブリンおよび多数のカゼイン(それらはすべて、リンタンパク質である)を包含する。これらのタンパク質は、カゼインは例外として、乳清中にも存在する。乳汁は、様々な細胞分裂誘起タンパク質および骨リモデリングに直接的に関与し得るタンパク質を含有すると知られている。
【0008】
カゼイノグリコマクロペプチド(CGMP)は、チーズ製造過程のレンネット仲介カゼイン凝固工程(キモシンの作用を通じて)中カッパ−カゼインから放出されるペプチドであり、またスイートホエーまたはチーズ乳清として知られている乳清画分中に存在する。CGMPは、時には、単にGMP(グリコマクロペプチド)と称される。チーズ乳清タンパク質は、15%ないし20%のCGMPから成る。CGMPは、WO00/49885に開示されているように、乳汁の骨の健康増進成分の一つとして考慮されてきた(下記に論考される)。
【0009】
乳酸乳清は、乳酸菌での発酵によりあるいはカゼイン塩またはカテージおよびリコッタチーズの製造中乳酸の直接添加により製造される。鉱酸乳清は、カゼイン塩の製造中鉱酸の添加により製造される。乳酸乳清および鉱酸乳清は、CGMPを含有しない。これらの2つの方法の基本原理は、キモシンの作用を用いて沈殿を引き起こすこととは反対に、pHを約4.6に下げてカゼインを沈殿させることである。
【0010】
それ故、キモシンに暴露されなかったいかなる乳製品も、CGMPを含有しない。
【0011】
成長因子(IGF−インスリン様成長因子、TGF−形質転換成長因子、等)、免疫グロブリン、BSAおよびいくつかのベータ−ラクトグロブリンは、乳汁または乳清からカチオン交換クロマトグラフィーにより回収される。いくつかの成長因子は、中性タンパク質として回収される。CGMPは、アニオン交換により回収され得る酸性タンパク質画分である。
【0012】
オステオポンチン(OPN)は、あらゆる体液(乳汁を含めて)中におよび無機質化組織の細胞外マトリックス中に存在する高度にリン酸化およびグリコシル化されたタンパク質である。骨中のより豊富にある非コラーゲンタンパク質の一つであるOPNは、無機質化組織において細胞−マトリックスおよびマトリックス−マトリックス界面に局在し、しかしてそこにおいて破骨細胞作用の結果として沈着される。OPNは、暴露骨表面を保護しまたは後続の細胞−マトリックス相互作用のためにそれをプライム化し得る。OPNがオプソニンとして作用して、マクロファージの接着および微粒状無機質化組織屑の食作用を容易する、ということが提案された。OPNはトランスグルタミナーゼにより架橋され得、またそれはI型コラーゲン、フィブロネクチンおよびオステオカルシンを含めて様々な細胞外分子に結合し得る。これは、物理的強度を細胞外マトリックスに付加することが期待され得る。OPNは、骨マトリックスへの骨細胞の接着を促進するように思える。OPNは脊椎動物の血清中に比較的高濃度にて存在し、そしてかくしてまた哺乳類の乳汁中に排出される(Denhardt, D.T.およびNoda, M.,オステオポンチンの表現および機能:骨リモデリングにおける役割,J. Cell Biochem.増補版30/31:92〜102(1998))。
先行技術
先行技術における公表された特許の大部分は、塩基性タンパク質すなわちカチオン交換の使用により誘導されたものの骨成長活性に焦点を当ててきた。
【0013】
ニュージーランド国特許明細書503608は、乳汁または加熱乳清からカチオン交換クロマトグラフィーにより、骨吸収防止剤を製造することについて教示する。シスタチン、またはシスタチンの酵素加水分解生成物が、骨吸収を抑制するのに有効であると開示されている。骨、骨・関節および歯周の病気は、シスタチンまたはその加水分解生成物が存在する飲料、食料製品または飼料を摂取することにより予防(または処置)され得る。
【0014】
ニュージーランド国特許明細書282898は、乳汁、脱脂乳、チーズ乳清、復元式還元された乳清、WPC、WPI、粉乳、乳清粉末または初乳からカチオン交換クロマトグラフィーにより精製されるウシIGF−1様成長因子を開示する。これらの物質は、好ましくは、カチオン交換工程の前に加熱される。結合は、タンパク質対カチオン交換体の規定比率を用いて、4と40度Cの間の温度にて行われる。この製剤の成長促進効果は、培養骨芽細胞様細胞(MC3T3−E1細胞)において示された。この組成物は、骨および関節の病気、特に骨粗しょう症を予防または処置するために有用であると主張されている。ヒトに成長期中に投与される場合、ピーク骨量は増加され得る。原料成分として、請求の範囲に記載された物質は、飲料、食料、薬および動物用食餌に組み込むために有用である。
【0015】
欧州特許明細書EP0787499(日本国特許アブストラクト8045566に対応する)は、ウシの血漿および乳汁中に存在するキニノーゲンが骨形成を促進しそして骨吸収を阻止することを教示する。全キニノーゲン、キニノーゲンのフラグメント1.2、およびキニノーゲンの酵素分解生成物(分子量範囲0.1〜70kDa(キロダルトン))はすべて、活性であると主張されている。この特許は、かかる生成物群について飲料、食料、薬および飼料における使用をカバーする。
【0016】
ニュージーランド国特許明細書314286は、高移動性群(HMG)タンパク質およびアンホテリシンのN末端配列、またはそれらの分解生成物を、骨成長促進剤および骨吸収阻止剤として開示する。活性である該分解生成物は、0.1〜20kDaの分子量を有する。請求の範囲に記載された製剤は、カルシウムが含まれている食料、飲料、薬または飼料の成分として用いられ得る。他の体液から回収されたHMGタンパク質およびアンホテリシンもまた、同様に作用する。与えられた例において、乳汁のHMGタンパク質はカチオン交換クロマトグラフィーにより単離され、そして引き続いてS−セファロースおよびモノQ(Mono−Q)カラムにて精製される。
【0017】
ニュージーランド国特許明細書246211は、酸性化乳清をエタノールで沈殿させることにより得られかつ5〜28kDaの間の分子量を有するところの、乳清からの骨芽細胞成長/骨増強因子について教示する。この活性剤は、エタノールで沈殿された画分の水抽出物として回収される。その代わりに、該因子は、加熱乳清が30kDa膜を通じて限外濾過される場合の透過物にて回収され得る。この製剤の等電点は、4と9の間にある。アニオン交換クロマトグラフィーは用いられない。
【0018】
ニュージーランド国特許明細書314097は、骨芽細胞増殖効果、骨強化効果および骨吸収阻止効果を有するところの、7.5〜11.0の間の等電点を持った2と24kDaの間の分子量の乳汁誘導タンパク質を開示する。この活性タンパク質はカチオン交換クロマトグラフィーにより回収され、そして0.1M〜1.0M塩で溶離される。かかる製剤を含有する食料、飲料、薬および飼料もまた、請求の範囲に記載されている。
【0019】
ニュージーランド国特許明細書301362(日本国特許アブストラクトJP207508に対応する)は、破骨細胞阻害タンパク質、それをエンコードするDNAおよび該DNAの表現方法について教示する。該タンパク質は、還元条件下で60kDaそして非還元条件下で60〜120kDaである。該タンパク質は、カチオン交換によりまたはヘパリンカラムへの結合により精製され得る。該タンパク質の生物学的活性は、56度Cにて10分間加熱することにより減少される。
【0020】
欧州特許明細書EP704218は、塩基性乳汁を基材としたタンパク質画分および乳汁を基材とした塩基性ペプチド画分の製造を開示する。これらは、乳汁または乳清のカチオン交換クロマトグラフィーにより誘導される。両方の生成物、およびそれらの加水分解物は、経口投与される場合、骨成長を促進しそして破骨細胞の吸収を抑制する。食料または飲料製品として提供され得る。記載された組成物は、骨粗しょう症のような様々な骨の病気を処置または予防するために有用であると主張されている。
【0021】
PCT特許明細書WO00/49885は、骨または歯の疾患の予防または処置用の組成物であって、乳タンパク質加水分解物を含む組成物を開示する。好ましい具体的態様において、乳タンパク質加水分解物は、カゼインの加水分解物、特に、カゼイノグリコマクロペプチド(CGMP)、その擬似体、相同体またはフラグメント(骨吸収もしくは骨損失を阻止するまたはカルシウムの吸収、保持もしくは石灰化を援助するまたはそれらの組合わせをなすCGMPの能力を保持する生物学的利用可能な形態にて)である。該組成物は、スイートホエーから濃縮および弱アニオンクロマトグラフィーにより製造される。
【0022】
Bayless等(牛乳からのオステオポンチンの単離および生物学的性質,Protein Expression and Purification 9(3):309〜314(1997))は、生脱脂乳中に存在するオステオポンチンを、4度Cにて一晩混合されたDEAEセファセル(DEAE−Sephacel)を用いて(6.6の中性乳pHにて)精製する方法を開示する。未結合画分は除去され、そして他の結合タンパク質は0.25M−NaCl洗浄液で除去された。オステオポンチン含有画分は、0.3Mの溶離により回収された。オステオポンチン含有画分は集められ、塩中で4Mにされ、そして次いでフェニルセファロースカラムにて疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製された(2回)。生脱脂乳からの単離は商業上受け入れられ得ず、そして富化生成物流でない高度に精製された試料に焦点が当てられる。
【0023】
Takada等による初期の研究(乳汁の乳清タンパク質は卵巣摘出ラットにおいて骨破壊力を高める,Nutrition Research 17,1709〜1720(1997))は、骨強化成分が乳清中に存在することを示す。これらの活性成分は熱安定性であり、そして乳清の低分子量の30〜70%エタノール沈殿性部分中に存在する。乳清の分画はなされなかった。
【0024】
Yun S.S.等(チーズ乳清タンパク質濃厚物からの細胞分裂誘起性グリコホスホペプチドの単離,Bioscience Biotechnology and Biochemistry,60(3):429〜433(1996))は、指標としてネズミ脾臓細胞における細胞分裂誘起活性を用いて、チーズ乳清タンパク質濃厚物(CWPC)の免疫学的機能を調査した。CWPCのゲル濾過およびアニオン交換クロマトグラフィーにより単離された画分は、高い細胞分裂誘起活性を示した。この調査結果は、チーズ乳清が強い細胞分裂誘起活性を有するグリコホスホペプチド(GPP)を含有することを示した。
【0025】
Sorensen E.S.等(牛乳のプロテオースペプトン画分から単離された3種のタンパク質の精製および特性決定,Journal of Dairy Research,60(2):189〜197(1993))は、牛乳のプロテオースペプトンから3種の主要タンパク質を単離した。これらは、セファデックスG−75ゲルクロマトグラフィー、Q−セファロースイオン交換および尿素の存在下での追加的セファデックスG−75ゲルクロマトグラフィーにより精製された。傾斜SDS−PAGEにおける移動度から、これらのタンパク質は17、28および60kDaの分子質量を有すると分かった。17kDaタンパク質のN末端アミノ酸配列は、ラクダの乳清タンパク質と相同であると分かった。このタンパク質は、牛乳において以前には記載されていなかった。SDS−PAGEの結果から、28kDaタンパク質は、プロテオースペプトンの主要タンパク質であって、総量のおおよそ25%を成すと判定された。そのN末端アミノ酸配列は、いかなる公知タンパク質配列に対しても相同性を示さなかったが、しかしアミノ酸組成は、28kDaタンパク質が牛乳のプロテオースペプトン画分からのPP3成分またはその一部と同一であることを指摘した。60kDaタンパク質は、細胞接着を仲介するところのArg−Gly−Asp配列を有する非常に高度にリン酸化されたタンパク質であるウシオステオポンチンであると分かった。
【0026】
科学刊行物および特許文献は、乳汁(または乳清)の酸性画分が骨吸収防止剤の(潜在的)源を与えることを示していない。
【0027】
発明の目的
それ故、本発明の種々の観点の目的は、乳汁の酸性タンパク質画分から、特に乳清の酸性タンパク質画分から誘導された骨の健康用組成物、かかる組成物を製造する方法、該組成物を含む処置方法、該組成物の医薬的使用を提供すること、および/または少なくとも公衆に有用な選択を与えることである。
【0028】
発明の概要
本発明の一つの観点によれば、乳汁の酸性タンパク質画分、乳汁の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド(CGMP)を含有しない骨の健康用組成物が提供される。
【0029】
本発明の第2観点によれば、乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分、乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド(CGMP)を含有しない骨の健康用組成物が提供される。
【0030】
本発明の第3の観点によれば、乳清の酸性タンパク質画分、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド(CGMP)を含有しない骨の健康用組成物が提供される。
【0031】
好ましくは、本発明の組成物は、アニオン交換クロマトグラフィー一層好ましくは強アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造される。
【0032】
好ましくは、本発明の組成物は、70重量%またはそれ以上のタンパク質を含み、しかも該タンパク質の80重量%またはそれ以上好ましくは90重量%またはそれ以上がオステオポンチンおよびプロテオースペプトンより成る。好ましくは、プロテオースペプトンは、プラスミンの作用によりカゼインから生じたペプチドを含み、かつプロテオースペプトン5(PP5)、プロテオースペプトン8−スロー(PP8−スロー)、プロテオースペプトン8−ファスト(PP8−ファスト)並びに非カゼインプロテオースペプトン3(PP3)より成る群から選択されたタンパク質の一つまたはそれ以上を含む。
【0033】
好ましくは、本発明の組成物中のタンパク質は、SDS−PAGEにより測定された場合、3,000ないし65,000の分子量分布を有する。
【0034】
好ましくは、本発明の組成物のシアル酸含有率は、0.8%ないし6.5%の範囲にある。好ましくは、本発明の組成物のホスフェート含有率は、0.5%ないし3%の範囲にある。
【0035】
好ましくは、本発明の組成物は、再結合式還元された(recombined)または新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された(reconstituted)全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物(MPC)、乳タンパク質単離物(MPI)、乳清タンパク質単離物(WPI)、乳清タンパク質濃厚物(WPC)、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導され、あるいはいずれかの乳加工流から誘導され、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および/または精密濾過により得られた透過物から誘導される。好ましくは、供給原料は、ウシおよび他の乳源(たとえば、ヤギもしくはヒツジまたは他の乳産生哺乳類)の一つまたは組合わせから得られる。適当な加工流の例は、LactalbuminTMまたはTMPTM(Total Milk Protein)単離物の製造中生成されるものを包含する。更に一層好ましくは、本発明の組成物は、乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導される。乳清の商業的製造のために適した方法は、J G Zadow(編者)「Whey and Lactose Processing」(Elsevier Applied Science,ロンドンおよびニューヨーク,1992)並びにT SienkiewiczおよびC Riedel(編者)「Whey and whey utilisation」(Verlag,独国,1990)に記載されている。
【0036】
好ましくは、本発明の組成物は、生理学上容認され得る量のカルシウム、マグネシウム、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK2および/または亜鉛を更に含む。
【0037】
本発明の第4観点によれば、骨の健康用組成物を製造する方法であって、次の工程すなわち
(a)CGMPを含有しない水溶液であって、再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物(MPC)、乳タンパク質単離物(MPI)、乳清タンパク質単離物(WPI)、乳清タンパク質濃厚物(WPC)、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導され、あるいはいずれかの乳加工流から誘導され、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および/または精密濾過により得られた透過物から誘導される水溶液を用意し、
(b)この水溶液を約pH3から約pH4.9のpHにてアニオン交換クロマトグラフィーに付し、
(c)このアニオン交換媒質を洗浄し、
(d)このアニオン交換媒質から乳清の酸性タンパク質画分を溶離する
工程を含む方法が提供される。
【0038】
好ましくは、供給原料は、ウシおよび他の乳源(たとえば、ヤギもしくはヒツジまたは他の乳産生哺乳類)の一つまたは組合わせから得られる。
【0039】
好ましくは、工程(a)において用意される水溶液は、乳酸乳清または鉱酸乳清である。好ましくは、工程(a)において用意される水溶液は、乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導される。好ましくは、工程(a)において用意される水溶液は、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物を含む。
【0040】
好ましくは、アニオン交換クロマトグラフィーは、強アニオン交換クロマトグラフィーである。好ましくは、工程(b)は、約pH4と約pH4.7の間にて更に一層好ましくはpH4.5にて行われる。用いられ得るアニオン交換体の典型例は、Q−セファロース、Q−セファロース・ファストフロー(Q−Sepharose, Fast Flow)、Q−セファロース・ビッグビーズ(Q−Sepharose, Big Beads)、およびQ−セファデックスのような、マクロ孔質の親水性アガロースを基材としたアニオン交換体である。その代わりに、セルロースを基材としたマクロ孔質のギブコセル(Gibcocel)QAアニオン交換体およびワットマン(Whatman)QAセルロースが用いられ得る。やはり用いられ得る他のアニオン交換体は、ポリスチレンを基材としたマクロペプ(Macropep)Qおよびジアニオン(Diaion)アニオン交換体を包含する。
【0041】
好ましくは、工程(c)は、媒質を洗浄するために脱塩水の使用を含む。
【0042】
好ましくは、工程(d)は、NaClもしくはKClまたはそれらの混合物を用いて行われる。好ましくは、工程(d)は、1M−NaClを用いて行われる。好ましくは、工程(d)は、酸を用いて行われる。好ましくは、工程(d)は、異なるpHを有する2種またはそれ以上の溶離液を用いて行われる。好ましくは、工程(d)は、5.0と9.0の間のpHおよび1.0Mまでの塩濃度を有する溶離液を用いて行われる。
【0043】
好ましい形態において、本発明の方法は、工程(a)の前に1つまたは複数の工程を更に含み、しかもこれらの1つまたは複数の工程は、熱処理、低温殺菌、脂肪を除去するための遠心分離、水溶液を濃縮するための限外濾過および/もしくは精密濾過、または製剤を脱イオンするための逆浸透、電気透析もしくはイオン交換クロマトグラフィーより成る群から選択された一つまたはそれ以上の工程を含む。
【0044】
本発明の第4観点の方法により製造された組成物はまた、カルシウム、マグネシウム、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK2および/または亜鉛を含み得る。
【0045】
本発明の好ましい具体的態様において、本発明の骨の健康用組成物、および本発明の方法により製造されたものは、食餌サプリメント、食料もしくは飲料中に組み込まれまたは食餌サプリメント、食料添加物もしくは飲料添加物として与えられ得る。
【0046】
本発明の更なる好ましい具体的態様は、本発明の骨の健康用組成物および本発明の方法により製造されたものを含むところの、食餌サプリメント、栄養薬剤、食料添加物または飲料添加物を含む。
【0047】
本発明の更なる好ましい具体的態様は、本発明の骨の健康用組成物および本発明の方法により製造されたものを含むところの、乳汁、粉乳および粉乳を基材とした処方物を含有する無機質サプリメント、強化ジュース製品、シリアルまたは糖果バー並びにこれらを利用する製品、UHTおよび低温殺菌乳、ヨーグルト、発酵乳、並びに直接酸性化乳を含む。
【0048】
本発明の高度に好ましい具体的態様において、本発明の骨の健康用組成物、および本発明の方法により製造された組成物は、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、プロテオースペプトン3、プロテオースペプトン5、プロテオースペプトン8、それらから得られたシアル酸化(sialyated)およびリン酸化タンパク質およびペプチド、並びにアルファ−s1−カゼインホスホペプチドより成る群から選択された一つまたはそれ以上の組成物を含む。
【0049】
好ましくは、本発明の組成物、または本発明の方法により製造された組成物は、有益な骨健康性質を示すところの、該タンパク質画分内のいずれかのペプチドまたはペプチド画分を含む。
【0050】
本発明の第5観点によれば、骨の健康を維持または改善する方法であって、本発明の組成物または本発明の方法により製造された組成物を患者に投与することを含む方法が提供される。
【0051】
本発明の第6観点によれば、正味の骨損失を処置または防止する方法であって、本発明の組成物または本発明の方法により製造された組成物を患者に投与することを含む方法が提供される。
【0052】
本発明の第7観点によれば、本発明の組成物または本発明の方法により製造された組成物の、骨の健康を維持または改善するための処方物の製造における使用が提供される。
【0053】
本発明の第8観点によれば、本発明の組成物または本発明の方法により製造された組成物の、正味の骨損失を処置または防止するための処方物の製造における使用が提供される。
【0054】
本発明はまた、広範には、本願の明細書において個々にまたは集合的に言及または指摘された構成部分、要素および特徴、並びにかかる構成部分、要素または特徴のいずれか二つまたはそれ以上のいずれかのまたはすべての組合わせに存すると言われ得、また特定の完全体が本明細書において挙げられそして本発明が関する技術において公知の等価物がある場合、かかる公知の等価物は、あたかも個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれているとみなされる。
【0055】
本発明は以上の記載に存しそしてまた諸構成を想定し、しかして諸構成について以下の記載は例を与える。
発明の詳細な記載
本発明者は、乳汁の、乳汁の成分のおよび特に乳清の酸性タンパク質画分が正味の骨損失を減少または防止し得ることを見出した。
【0056】
表現「酸性タンパク質画分」は、4.9またはそれ以下の等電点を有するタンパク質を含む乳タンパク質の画分を意味するよう意図されている。
【0057】
本発明の酸性タンパク質画分は、多数の小量酸性乳清タンパク質を含有することが示された。これらは、オステオポンチン、プロテオースペプトン3、プロテオースペプトン5(PP5)(β−カゼイン−5P(f1−105)またはβ−カゼイン−5P(f1−107)としても知られている)、プロテオースペプトン8−スロー(PP8−スロー)(β−カゼイン−1P(f29−105)またはβ−カゼイン−1P(f29−107)としても知られている)、シアル酸化およびリン酸化タンパク質、アルファ−s1−カゼインホスホペプチド、並びにまたこれらのタンパク質から自然タンパク質分解により誘導されたペプチドの混合物を包含する。非常に少量のラクトシル化アルファ−およびベータ−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン並びに免疫グロブリンもまた存在する。
【0058】
酸性タンパク質画分は、天然に存在する乳プロテアーゼプラスミンの加水分解作用により生じたところの、これらのタンパク質から誘導されたペプチドを含有することが示された。乳酸乳清から回収された酸性タンパク質画分の特定の場合において、乳酸菌プロテアーゼの作用によりおよびプラスミンにより自然に生じたより広い範囲のペプチドがある。
【0059】
骨に対する閉経の効果を模する動物モデル(卵巣摘出ラット−OVXラット)を用いて、本発明の酸性タンパク質画分が、究極的に骨粗しょう症のような病気に通じ得るところの閉経後に通常見られる骨吸収を阻止することが分かった。かくして、本発明の酸性タンパク質画分は、骨粗しょう症および変形性関節症のような病気を処置または予防する手段として有用である。
【0060】
本発明の酸性タンパク質画分は、0.8%ないし6.5%の範囲の全シアル酸含有率および0.5と3%の間のホスフェート含有率を有する。
【0061】
酸性タンパク質画分は、3,000ダルトン(加水分解生成物)からおおよそ65,000ダルトン(プロテオースペプトン3集塊)の範囲にある広範囲の分子量を有するタンパク質およびペプチドを含有する。
【0062】
本発明の酸性タンパク質画分の商業的回収用の可能な供給原料は、再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物(MPC)、乳タンパク質単離物(MPI)、乳清タンパク質単離物(WPI)、乳清タンパク質濃厚物(WPC)、乳清、復元式還元された乳清粉末を包含し、あるいはいずれかの乳加工流から誘導され、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および/または精密濾過により得られた透過物から誘導される。可能な供給原料は、スイートホエーから誘導されたものを排除する。これらの可能な供給原料のいずれも、ウシおよび他の乳源(たとえば、ヤギもしくはヒツジまたは他の乳産生哺乳類)の一つまたはそれ以上から誘導され得る。その代わりに、可能な供給原料は、LactalbuminTMまたはTMPTM(Total Milk Protein)単離物の製造中生成されるもののような、いずれかの乳加工流から誘導され得る。乳清の商業的製造のために適した方法は、J G Zadow(編者)「Whey and Lactose Processing」(Elsevier Applied Science,ロンドンおよびニューヨーク,1992)並びにT SienkiewiczおよびC Riedel(編者)「Whey and whey utilisation」(Verlag,独国,1990)に記載されている。
【0063】
本発明の酸性タンパク質画分は、アニオン交換クロマトグラフィー好ましくは強アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造される。アニオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは約pH3.0とpH4.9の間一層好ましくは約pH4.0とpH4.7の間更に一層好ましくはpH4.5にて行われる。これらのpH条件はアニオン交換クロマトグラフィーによる酸性タンパク質画分の回収のために最適であり、何故ならこの範囲において活性成分はカラムに結合されそして不所望タンパク質は未結合画分にてほとんど完全に排除されるからである。これらは、アルファ−ラクトアルブミン、ベータ−ラクトグロブリンおよびウシ血清アルブミン(測定活性について希釈剤としてのみ働く)のような大量乳清タンパク質を包含する。
【0064】
工業的適用
本発明の組成物、および本発明の方法により製造された組成物は、食料または飲料中への組込みによる機能性飲食物の製造のために、並びに変形性関節症、骨粗しょう症および歯の疾患を含めて骨の欠陥(すべての年齢群)の処置、管理および/または予防のために用いられ得る。
【0065】
本発明の組成物は、衰弱性骨疾患の開始を遅延または防止するために、栄養薬剤または食餌サプリメントとして日ベースで摂取される、ということが想定される。
【0066】
例
例1 鉱酸乳清から誘導された酸性タンパク質画分
10%固形分およびpH4.5における鉱酸乳清タンパク質濃厚物(Alacen 342−ニュージーランド国ウェリントンのNZMPから入手できる)の20L溶液を、110ml/minの流速にてQ−セファロースBB(オーストラリア国のAmrad Pharmacia)の2Lカラムに通した。カラムを5Lの脱塩水で洗浄し、そして塩化ナトリウムの1.0M溶液(pH6.0)で溶離した。タンパク質の吸着および溶離は、280nmにおける吸光度を測定することにより監視された。
【0067】
カラムから溶離された酸性タンパク質画分を、Amicon 3K NMCO Spiral限外濾過装置(米国のMilliporeから入手できる)を用いて、おおよそ6.25倍に濃縮した。濃縮されたタンパク質保留物を水で透析し、そして次いで凍結乾燥した。
【0068】
この乾燥生成物(56g回収された)は、79%のタンパク質、0.5%未満のカルシウム、おおよそ1.0のリンおよび6.0%のシアル酸の含有率を有していた。溶離されたタンパク質画分のアミノ酸組成は、表1に示されている。
【0069】
表1−鉱酸乳清からの酸性タンパク質画分のアミノ酸分析表
【表1】
【0070】
酸性タンパク質画分を、乳清タンパク質およびプロテオースペプトンについて、Elgar等(Journal of Chromatography A,878(2000),pp183〜196)により記載された方法に従って逆相HPLCにより分析した。分析用アニオン交換モノQカラムHR5/5(オーストラリア国のAmersham−Pharmacia Biotechから得られる)を、酸性タンパク質画分のタンパク質組成を決定するために用いた。これにより、オステオポンチン、アルファ−s1−カゼインホスホペプチド、プロテオースペプトン3、プロテオースペプトン5およびベータ−ラクトグロブリンの存在が検出された。プロテオースペプトン8−スローはPP5と共に共溶離し、従って明確なピークとして現れない。自然タンパク質分解によりこれらのタンパク質から誘導されたペプチドもまた、各成分についての幅広いピークおよび主ピークを取り囲む小さいピークの存在により示されるように検出された。
【0071】
アニオン交換体から回収された凍結乾燥酸性画分をpH8.0の20mMトリス/HCl緩衝液中に溶解し、そしてモノQカラムに充填した。分析的分離を、1M塩化ナトリウム(pH6.0)に対して三相線状傾斜を用いて展開した。タンパク質の吸着および溶離を、214nmにおいて測定した。タンパク質ピーク同定を、我々自身の実験室において作製された標準物質を用いて分析した。標準物質は、PP5、PP3およびオステオポンチンについて作製された。各標準物質の同定はアミノ酸配列決定(N末端配列決定のような)により、そしてそれらの純度はSDS−PAGEおよびHPLC分析により確認された。他の成分を、図1に示されたHPLC実験からの捕捉ピークのアミノ酸配列分析により同定した。
【0072】
これらの分析の結果(図1)により、オステオポンチン、アルファ−s1−カゼインフラグメント、シアル酸化および/またはリン酸化小量タンパク質、プロテオースペプトン5および3並びにこれらのタンパク質から誘導されたペプチドが、鉱酸乳清から回収された酸性タンパク質画分中に存在することが示された。
【0073】
例2 乳酸乳清から誘導された酸性タンパク質画分
10%固形分およびpH4.5における乳酸乳清タンパク質濃厚物(Alacen 312−ニュージーランド国ウェリントンのNZMPから入手できる)の20L溶液を、110ml/minの流速にてQ−セファロースBBの2Lカラムに通した。カラムを5Lの脱塩水で洗浄し、そして塩化ナトリウムの1.0M溶液(pH6.0)で溶離した。タンパク質の吸着および溶離は、280nmにおける吸光度を測定することにより監視された。
【0074】
カラムから溶離されたタンパク質を、Amicon 3K NMCO Spiral限外濾過装置(米国のMilliporeから入手できる)を用いて、おおよそ6.25倍に濃縮した。濃縮されたタンパク質保留物を水で透析し、そして次いで凍結乾燥した。
【0075】
酸性タンパク質画分を、乳清タンパク質およびプロテオースペプトンについて、Elgar等(Journal of Chromatography A,878(2000),pp183〜196)により記載された方法に従って逆相HPLCにより分析した。分析用アニオン交換モノQカラムHR5/5(オーストラリア国のAmersham−Pharmacia Biotechから得られる)を用いて、オステオポンチン、アルファ−s1−カゼインホスホペプチド、プロテオースペプトン3およびプロテオースペプトン5の存在を決定した。これらのタンパク質から誘導されたペプチドの存在もまた、例1において論考されたように認められた。
【0076】
アニオン交換体から回収された凍結乾燥酸性タンパク質画分をpH8.0の20mMトリス/HCl緩衝液中に溶解し、そしてモノQカラムに充填した。分析的分離を、1M塩化ナトリウム(pH6.0)に対して三相線状傾斜を用いて展開した。タンパク質の吸着および溶離を、214nmにおいて測定した。タンパク質ピーク同定を、既知標準物質または捕捉ピークのN末端配列決定を用いて分析した。これらの分析の結果(図2)により、オステオポンチン、アルファ−s1−カゼインフラグメント、シアル酸化および/またはリン酸化小量タンパク質、プロテオースペプトン5および3並びにこれらのタンパク質から誘導されたペプチドが、乳酸乳清から回収された酸性画分中に存在することが示された。図1との比較において、図2は、酸性タンパク質画分のタンパク質から誘導されたペプチドがより多数存在することを示している。
【0077】
例3 効能の試験管内分析
例1からの生成物を、Lowe等(Journal of Bone and Mineral Research(米国),6(12):1277〜1283(1991))により記載された骨器官培養モデルにおいて試験した。図3は、酸性タンパク質画分が10μg/mlくらいの低い投与量にて、骨器官の培養からの細胞に対して吸収防止効果を有していたことを示している。対照と比較してより低いカルシウム放出およびより低いチミジン取込みの両方が、吸収防止効果を示す。
【0078】
例4 効能の生体内分析
卵巣摘出(OVX)ラットにおいてエストロゲン欠乏により誘発される骨損失を減少するべき例1からの酸性タンパク質画分の能力を、16週間の期間にわたって調査した。卵巣摘出ラットモデルは、閉経後起こる骨損失を調査するために広く受け入れられているモデルである。
【0079】
30匹の6月齢の雌スプレーグ−ドーリーラットを、5.5ヶ月の齢における10匹の見せかけ手術動物および20匹のOVX動物として受け取った。見せかけ手術動物は麻酔を受けそして切開がなされるが、しかし卵巣は無傷のままにされる。OVX動物において、卵巣は除去される。到着次第、動物を、3つのグループ(1グループ当たりn=10)に分けた。これらのグループは、表2に示されている。
表2−3つのラットグループについて用いられた処置
【表2】
動物を靴箱型かごに別々に収容し、そして温度(22℃±2℃)および光(12時間の昼/夜サイクル)が制御される室において飼育した。動物は、脱イオン水を自由に入手できた。動物に、15%カゼイン塩、5%セルロース、5%トウモロコシ油、0.5%カルシウム、62%デンプン並びに必要に応じて添加されたビタミンおよび無機質から成るバランスのとれた半合成食餌を与えた。カゼインは、0.3%(w/w)の酸性乳清タンパク質画分(例1により製造された試料)を添加する場合調節された。見せかけ対照グループ(グループA)およびOVX対照グループ(グループB)は、酸性タンパク質画分が添加されていない基礎食餌を受け取った。グループC(OVXラット)は、0.3%(w/w)の例1からの酸性タンパク質画分を含有する食餌を受け取った。動物の毎日の摂取量を測定し、そしてOVXグループにおける体重利得を防ぐために、見せかけグループの体重に従って摂取量を毎週調節した。実験は、毎月測定しながら4ヶ月間行われた。
【0080】
骨無機質密度(BMD)の測定について、ラットは、麻酔下で4週間ごとにスキャンされた。ラットを体重測定し、そして適切な投与量レベルすなわち0.05ml/100g体重でもって麻酔した。麻酔薬は0.2mlアセプロマジン(ACP)+0.5mlケタミン+0.1キシラジン+0.2ml無菌H2Oの混合物であり、そして25G×5/8″の針および1mlの注射器を用いて腹腔内注射により投与された。ラットは注射後おおよそ5ないし10分して適当な麻酔レベルを獲得し、そして2時間麻酔状態下のままであった。
【0081】
ペンシルビームユニットを用いるHologic QDR4000骨密度計(米国のBedford)を用いて、骨無機質測定を行った。精度を保証するために、毎日の品質管理(QC)スキャンを行った。これは、変動係数を満たすために必要とされた。0.0127インチ(3.23×10−2cm)の点解像および0.0254インチ(6.45×10−2cm)の線間隔を有する0.06インチ(0.1524cm)直径コリメーターを用いて、部位の高解像スキャンを遂行した。ラットは、均一な1.5インチ(3.81cm)厚のアクリル台上に置かれた。各ラットは、脊椎並びに左および右大腿骨の3部位の高解像スキャンを受けた。ラットは、脊椎と大腿骨の間をおよび大腿骨と脛骨の間を直角にして、仰向けに置かれた。
【0082】
図4は、画分の16週間の給餌後の右大腿骨および脊椎のBMDを示す。両方の場合において、対照OVXグループ(グループB)のBMDは見せかけグループAのそれより統計的に有意に低い(統計的に有意な結果は*で印されている)のに対して、酸性乳清タンパク質画分が与えられたグループ(グループC)のBMDは見せかけグループから有意には相違しなかった(p<0.05)。
【0083】
この実験は、対照食餌が与えられたOVXラット(グループB)が見せかけ対照ラット(グループA)と比較して有意量の骨を失ったのに対して、驚くべきことに酸性タンパク質画分が与えられたラット(グループC)は見せかけラットと比較して有意量の骨を失わなかったことを示した。これにより、本発明の酸性タンパク質画分がエストロゲン欠乏に因り起こる骨損失を減少または防止し得ることが示された。
【0084】
以上の記載は本発明のいくつかの好ましい具体的態様を記載し、またいくつかの可能な改変を指摘するが、しかし本発明の範囲から逸脱することなく他の改変がなされ得ることが当業者により理解される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、例1において鉱酸乳清から誘導された酸性乳清タンパク質画分のHPLC(モノQ)分析を示す。
【図2】
図2は、例2において乳酸乳清から誘導された酸性乳清タンパク質画分のHPLC(モノQ)分析を示す。
【図3】
図3は、例3からの培養におけるマウス頭蓋冠(頭蓋の円蓋)細胞に対する酸性乳清タンパク質画分の吸収防止効果を示す。
【図4】
図4は、例4からの生体内給餌実験においてラットの種々のグループの大腿骨および脊椎の骨無機質密度を比較する。
Claims (41)
- 乳汁の酸性タンパク質画分、乳汁の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド(CGMP)を含有しない骨の健康用組成物。
- 乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分、乳汁の成分から誘導された酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド(CGMP)を含有しない骨の健康用組成物。
- 乳清の酸性タンパク質画分、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物またはそれらの組合わせを含む骨の健康用組成物であって、該組成物がカゼイノグリコマクロペプチド(CGMP)を含有しない骨の健康用組成物。
- 酸性タンパク質画分が70重量%またはそれ以上のタンパク質を含み、しかも該タンパク質の80重量%またはそれ以上がオステオポンチンおよびプロテオースペプトンより成る、請求項1から3のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
- 酸性タンパク質画分が70重量%またはそれ以上のタンパク質を含み、しかも該タンパク質の90重量%またはそれ以上がオステオポンチンおよびプロテオースペプトンより成る、請求項1から3のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
- 画分中のタンパク質が、SDS−PAGEにより測定された場合、3,000ないし65,000の分子量分布を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
- プロテオースペプトンが、プラスミンの作用によりカゼインから生じたペプチドを含み、かつプロテオースペプトン5(PP5)、プロテオースペプトン8−スロー(PP8−スロー)、プロテオースペプトン8−ファスト(PP8−ファスト)並びに非カゼインプロテオースペプトン3(PP3)より成る群から選択されたタンパク質の一つまたはそれ以上を含む、請求項4または5に記載の骨の健康用組成物。
- 画分のシアル酸含有率が、0.8%ないし6.5%の範囲にある、請求項1から7のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
- 画分のホスフェート含有率が、0.5%ないし3%の範囲にある、請求項1から8のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
。 - 組成物が、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
- 組成物が、強アニオン交換クロマトグラフィーを用いて製造されている、請求項1から10のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
- 再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物(MPC)、乳タンパク質単離物(MPI)、乳清タンパク質単離物(WPI)、乳清タンパク質濃厚物(WPC)、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導された、あるいはいずれかの乳加工流から誘導された、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および/または精密濾過により得られた透過物から誘導された、請求項1から11のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
- 乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導された、請求項1から12のいずれか一項に記載の骨の健康用組成物。
- 骨の健康用組成物を製造する方法であって、次の工程すなわち
(a)CGMPを含有しない水溶液であって、再結合式還元されたまたは新鮮な全乳、再結合式還元されたまたは新鮮な脱脂乳、復元式還元された全または脱脂粉乳、初乳、乳タンパク質濃厚物(MPC)、乳タンパク質単離物(MPI)、乳清タンパク質単離物(WPI)、乳清タンパク質濃厚物(WPC)、乳清、復元式還元された乳清粉末より成る群から選択されたいずれか一つまたはそれ以上の供給原料から誘導され、あるいはいずれかの乳加工流から誘導され、あるいはこれらの供給原料のいずれか一つまたはそれ以上の限外濾過および/または精密濾過により得られた透過物から誘導される水溶液を用意し、
(b)この水溶液を約pH3から約pH4.9のpHにてアニオン交換クロマトグラフィーに付し、
(c)このアニオン交換媒質を洗浄し、
(d)このアニオン交換媒質から乳清の酸性タンパク質画分を溶離する
工程を含む方法。 - 工程(a)において用意される水溶液が、乳酸乳清または鉱酸乳清である、請求項14に記載の方法。
- 工程(a)において用意される水溶液が、乳酸乳清または鉱酸乳清から誘導される、請求項14に記載の方法。
- 工程(a)において用意される水溶液が、乳清の酸性タンパク質画分の加水分解物を含む、請求項14に記載の方法。
- アニオン交換クロマトグラフィーが、強アニオン交換クロマトグラフィーである、請求項14から17のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)が、約pH4と約pH4.7の間にて行われる、請求項14から18のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)が、pH4.5にて行われる、請求項14から18のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)が、媒質を洗浄するために脱塩水の使用を含む、請求項14から20のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)が、NaClもしくはKClまたはそれらの混合物を用いて行われる、請求項14から21のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)が、1M−NaClを用いて行われる、請求項14から21のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)が、酸を用いて行われる、請求項14から21のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)が、異なるpHを有する2種またはそれ以上の溶離液を用いて行われる、請求項14から21のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)が、5.0と9.0の間のpHおよび1.0Mまでの塩濃度を有する溶離液を用いて行われる、請求項14から21のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)の前に1つまたは複数の工程を更に含み、しかもこれらの1つまたは複数の工程は、熱処理、低温殺菌、遠心分離、限外濾過、精密濾過、逆浸透、電気透析またはイオン交換クロマトグラフィーより成る群から選択された一つまたはそれ以上の工程を含む、請求項14から26のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項14から27のいずれか一項に記載の方法により製造された組成物。
- 生理学上容認され得る量のカルシウム、マグネシウム、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK2および/または亜鉛を更に含む、請求項1から13および28のいずれか一項に記載の組成物。
- 組成物が、ウシおよび他の乳源(ヤギもしくはヒツジまたは他の乳産生哺乳類を含めて)の一つまたは組合わせから誘導されている、請求項1から13、28および29のいずれか一項に記載の組成物。
- オステオポンチン、骨シアロタンパク質、プロテオースペプトン3、プロテオースペプトン5、プロテオースペプトン8、それらから得られたシアル酸化およびリン酸化タンパク質およびペプチド、並びにアルファ−s1−カゼインホスホペプチドより成る群から選択された一つまたはそれ以上の組成物を含む、請求項1から13および28から30のいずれか一項に記載の組成物。
- 有益な骨健康性質を示す、請求項1から13および28から31のいずれか一項に記載の組成物またはその画分。
- 請求項1から13および28から32のいずれか一項に記載の組成物を含む食餌サプリメント。
- 請求項1から13および28から32のいずれか一項に記載の組成物を含む食料添加物。
- 請求項1から13および28から32のいずれか一項に記載の組成物を含む飲料添加物。
- 請求項1から13および28から32のいずれか一項に記載の組成物を含む栄養薬剤。
- 請求項1から13および28から32のいずれか一項に記載の組成物を含む製薬。
- 骨の健康を維持または改善する方法であって、請求項1から13および28から32のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
- 正味の骨損失を処置または防止する方法であって、請求項1から13および28から32のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
- 請求項1から13および28から32のいずれか一項に記載の組成物の、骨の健康を維持または改善するための処方物の製造における使用。
- 請求項1から13および28から32のいずれか一項に記載の組成物の、正味の骨損失を処置または防止するための処方物の製造における使用。
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