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Die aus Transplantations- und Amputationsexperimenten erhalte-
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nen Ergebnisse zeigen, daß die Entwicklung von Neuronen (Nervenzellen)
Faktoren erfordern, die sie aus ihrer Umgebung für den Fortbestand und die Entwicklung
erhalten (vgl.
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M. Jacobson, Developmental Neurobiology, 2. Ausgabe, 279-302, Plenum,
New York, 1978). Der direkteste Nachweis für die Beteiligung spezifischer Faktoren
ist der, daß Antikörper eines gut charakterisierten Proteins, des Nervenwachstumsfaktors
(NGF) nach der Injektion in perinatale Säugetiere die peripheren sympathischen und
sensorischen Neuronen zerstören und umgekehrt die Injektion von NGF Neuronen aufrechterhält,
die normalerweise während der Entwicklung eliminiert werden (vgl. z. B. R. Levi-Montalcini
und P. U. Angeletti, Physiol. Rev. 48, 534 - 569, 1968; H. Thoenen und Y. A. Barde,
Physiol. Rev. 60, 1284 - 1335, 1980). Die epigenetische Kontrolle des Fortbestandes
von Neuronen kann ebenfalls auch in vitro gezeigt werden: NGF oder andere Faktoren,
die in Gewebeextrakten und in aus verschiedenen Zellen aufgebauten Medien vorhanden
sind, müssen vorhanden sein, wenn Neuronen in der Kultur überleben sollen (vgl.
z. B. S. Varon und R.
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Adler, Advances in Cellular Neurobiology, Band 2, 115 - 163, Academic
Press, New York, 1981). Bis jetzt konnte jedoch kein definiertes Molekül aus diesen
Medien oder Gewebeextrakten isoliert werden; nicht einmal NGF konnte aus einem Gewebe
oder einer Flüssigkeit, die für die Physiologie der Entwicklung des Nervensystems
relevant ist, charakterisiert werden (vgl. H. Thoenen und Y. A. Barde, Physiol.
Rev. 60, 1284 -1335, 1980). Der chemische Aufbau dieses Proteins wird ausschließlich
von Geweben, wie z. B. der submaxillaren Drüse der erwachsenen männlichen Maus abgeleitet,
wo es aus noch unbekannten Gründen in großen Mengen vorhanden ist. Kürzlich wurde
auch in einem aus Gliom aufgebauten Medium die Gegenwart eines Faktors beschrieben,
der den Fortbestand embryonaler sensorischer Neuronen unterstützt und sich von NGF
durch immunologische und funktionelle Kriterien unterscheidet.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein aus Säugetierhirn isolierter
neuer neurotropher Faktor mit einem Molekulargewicht von 12.300 und einem isoelektrischen
PunktlO,l.
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Der neurotrophe Faktor ist nach dem folgenden Verfahren erhältlich,
das ebenfal]s Gegenstand der vorliegenden Erf indung ist und dadurch gekennzeichnet
ist, daß man Säugetierhirn in schwach saurer wäßriger Lösung homogenisiert, den
Homogenisationsüberstand auf einen pH-Wert von 6,5 bringt und die bis 70 Gew.-%
Ammoniumsulfatsättigung ausfallende Fraktion gewinnt, den so erhaltenen Niederschlag
einer CM-Cellulose-Chromatographie unter Elution mit 0,15 bis 0,5 M gepuffertem
Natriumchlorid unterwirft, die mit 0,5 M Natriumchlorid erhaltene Fraktion einer
Hydroxylapatit-Chromatographie unter Gradientenelution mit 5 bis 700 mb1 Kaliumphosphatpuffer
vom pH = 6,8 unterwirft, die eine Aktivität aufweisenden Fraktionen sammelt, dialysiert
und lyophilisiert.
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Als Säugetierhirn wird zum Beispiel das Hirn von frisch geschlachteten
Schweinen verwendet, das bis zur Aufarbeitung in tiefgefrorenem Zustand, wie z.
B. bei -70 OC, aufbewahrt wird. Die nachfolgenden Verfahrensschritte werden bei
einer Temperatur von 0 bis 4 OC durchgeführt, mit Ausnahme der Elektrophoresen,
die bei Raumtemperatur durchgeführt werden können.
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Bei der Homogenisierung des Hirns kann zweckmäßigerweise bereits eine
Vorfraktionierung durchgeführt werden, indem man mit verdünnter wäßriger Ammoniumsulfatlösung
homogenisiert.
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Vorzugsweise verwendet man eine 0,1 bis 0,2 M Ammonsulfatlösung. Nach
der Homogenisierung wird der pH-Wert auf etwa 4 bis 5, vorzugsweise auf etwa 4,5
eingestellt, zweckmäßig mittels Salzsäure. Vor dem Abtrennen des unlöslichen Anteils
wird das Homogenisat zweckmäßig mehrere Stunden lang gerührt.
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Dann wird der unlösliche Anteil durch Zentrifugieren abgetrennt und
der Uberstand auf etwa 70 % Ammonsulfatsättigung gebracht. Der gebildete Niederschlag
wird abzentrifugiert,
beispielsweise etwa 40 Minuten bei 20.000
g. Der Niederschlag wird dialysiert. Ein geeigneter Dialysepuffer ist beispielsweise
0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 5,5 bis 6,5, dem man einen Gelatbildner und Phenylmethylsulfonylfluorid
zusetzt.
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Ein geeigneter Gelatbildner ist beispielsweise Äthylendiamintetraessigsäure
(EDTA) in einer Konzentration von 0,2 bis 5 mM.
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Die verwendeten Dialysemembranen haben vorzugsweise eine Molekulargewichtsausschlußgrenze
von etwa 3.000 bis 4.000.
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Die für die anschließende Carboxymethylcellulose-Chromatographie verwendete
Säule wird zweckmäßig erst mit dem gleichen Puffer äquilibriert, mit dem die Dialyse
durchgeführt wurde. Nach dem Aufgeben der dialysierten Lösung wäscht man, bis die
optische Dichte bei 280 mn = OD280 kleiner als 0,1 ist. Anschließend wird unter
Natriumchloridzusatz eluiert und die bei 0,5 M Natriumchlorid erhaltene Fraktion
gewonnen. Zweckmäßig wird vorher die bei 0,1 bis 0,2 M NaCl eluierte Fraktion abgetrennt.
Die bei 0,5 M NaCl erhaltene Fraktion wird gesammelt und für die weitere Reinigung
verwendet.
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Das den Wirkstoff enthaltende Eluat der Ctl-Cellulosechromatographie
wird wiederum durch Dialyse entsalzt. Die Dialyse erfolgt vorzugsweise gegen 5 bis
10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5 bis 7,1. Die entsalzte Lösung wird auf eine Hydroxylapatitsäule
gegeben und einer Gradientenelution unterworfen mit dem gleichen Puffer, wobei man
die Pufferkonzentration auf 600 bis 700 mM steigen läßt. Die gesuchte Aktivität
wird bei etwa 500 mP1 Kaliumphosphat eluiert.
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Die aktiven Fraktionen werden kombiniert, durch Dialyse entsalzt und
dann lyophilisiert.
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Wenn hinsichtlich der Aktivität bereits geeignet, kann das Verfahren
nach einer der in der nachfolgenden Tabelle I angegebenen Stufen I bis VI abgebrochen
und das so erhaltene Produkt verwendet werden.
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Das erfindungsgemäße Gerinnungsverfahren ermöglicht eine Reingewinnung
des neuen Faktors. Gegebenenfalls können jedoch auch weniger reine Präparate für
bestimmte Zwecke geeignet sein, solche Präparate fallen z. B. in den verschiedenen
Stufen des Verfahrens der Erfindung oder bei äquivalenten Reinigungsschritten an.
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Das nachfolgende Beispiel erläutert die Erfindung näher, ohne sie
darauf zu beschränken.
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Beispiel: Ganze Schweinehirne, die frisch von einem Schlachthaus erhalten
wurden, wurden bis zum Gebrauch bei -700C gelagert, und vor dem Gebrauch über Nacht
auf 40C aufgetaut. Alle nachfolgenden Stufen wurden, wenn nicht anders angegeben,
bei 40C durchgeführt.
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1 kg Hirn wurde in 2 1 0,15 M Ammoniumsulfat unter Verwendung eines
Waring-Mischers homogenisiert, dann der pH-Wert durch Zugabe von 1 M Salzsäure auf
4,5 eingestellt und das Homogenisat 2 Stunden gerührt. Nach der Zentrifugation (20
000 x g, 40 Minuten) wurde der pH-Wert des überstandes mit 1 M NaOH auf einen pH-Wert
von 6,5 gebracht und festes Ammoniumsulfat innerhalb von 2 Stunden bis zu einer
Konzentration von 70 Gew.-% zugegeben. Nach der Zentrifugation (20 000 x g, 40 Minuten)
wurde der erhaltene Niederschlag in 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH = 6,0, der
1 mM Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (durch
frische Verdünnung aus einer 200 mM-Vorratslösung in Äthanol erhalten) enthielt,
resuspendiert. Die Suspensionen wurden
gelagert, bis alle aus 3
kg Ausgangsmaterial erhaltenen Suspensionen vereinigt werden konnten und dann gegen
0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH = 6,0 dialysiert (3 x 10 1 während 20 Stunden).
In allen Dialysen wurden Dialysenmembranen mit einer Molekulargewichtsgrenze von
3 500 verwendet.
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Die erhaltene Lösung wurde auf eine CM-Cellulosesäule (600 ml Füllkörpervolumen,
Durchmesser 4,5 cm, Fließgeschwindigkeit 120 ml/ Std.), die mit dem Phosphatpuffer
äquilibriert war, aufgebracht. Danach wurde gewaschen, bis der Ausfluß eine optische
Dichte bei 280 nm (OD280) von weniger als 0,1 besaß,und in einer ersten Stufe 0,15
M Natriumchlorid zum Puffer zugefügt und die Säule eluiert, bis der OD280 kleiner
als 0,05 war. Die dann mit einem Elutionsmittel, das 0,5 M Natriumchlorid enthielt,
eluierte Fraktion wurde gesammelt.
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Das 0,5 M Natriumchlorid-Eluat der CM-Cellulosesäule wurde gegen 5
mM Kaliumphosphatpuffer vom pH = 6,8 dialysiert (2 x 5 1, über Nacht) und auf eine
Hydroxylapatit-Säule (12 ml Füllkörpervolumen, Durchmesser 9 mm, Durchflußgeschwindigkeit
20 ml/Std.) aufgebracht. Die Proteine wurden mit 100 ml Kaliumphosphatpuffer vom
pH = 6,8 (linearer Gradient, 5 bis 700 mM) eluiert und 5 ml-Fraktionen gesammelt.
Die gesamte erhaltene Aktivität war in den ein oder zwei Fraktionen, die mit ca.
500 mZl Kaliumphosphat eluiert wurden. Das aktive Material wurde erschöpfend gegen
Wasser dialysiert und lyophilisiert.
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250 rg Protein (das entspricht ca. der Hälfte der nach dieser Stufe
erhaltenen Substanz) wurden in 200 Wl 0,25 M Kaliumacetatpuffer vom pH = 5,8, der
6 M Harnstoff und Pyronin-Gelb als Kennfarbstoff enthielt, gelöst und, wie in R.
A. Reisfeld et al, Nature 195, 281 - 283, 1962 beschrieben, auf ein 10 %-iges (Gewicht/Volumen)
Polyacrylamidplattengel (14 x 7 x 0,3 cm, pH = 4,5, enthaltend 6 M Harnstoff), das
mit einem 1,5 cm dicken Schichtgel überzogen war, aufgebracht. Nach der Elektrophorese
bei 35 mA während ca. 5,5 Stunden bei Raumtempe-
ratur befand sich
die Farbstofffront ca. 7 mm vom Gelboden entfernt und die gesamte Zone (ohne Schichtgel)
wurde herausgeschnitten und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang mit Laemmli-Puffer
(vgl. U. K. Laemmli, Nature 227, 680 - 685, 1970), der so modifiziert war, daß die
Natriumdodecylsulfat(SDS)-Konzentration auf 0,1 % (Gewicht/Volumen) reduziert war
und kein Mercaptoäthanol (welches die Aktivität vollständig zerstört) zugegeben
wurde, äquilibriert. Die Zone wurde dann horizontal auf ein Polyacrylamid/SDS-Plattengel
(mit einem exponentiellen Gradienten von 10 - 25 %; 14 x 7 x 0,3 cm, überzogen mit
einem Schichbgel; vgl. U. K. Laemmli, Nature 227, 680 - 685, 1970) aufgebracht.
Eine Lösung von 60 ßg Cytochrom C (aus Pferdeherz; von der Fa. Serva) in dem modifizierten
Laemmli-Puffer wurde auf beide Seiten der herausgenommenen Zone aufgebracht und
die Elektrophorese bei Raumtemperatur über Nacht bei 12 mA durchgeführt. In vorausgehenden
Versuchen wurde festgestellt, daß sich beim direkten Aufbringen des nach der Hydroxylapatit-Chromatograhie
erhaltenen Materials auf ein solches SDS-Gel die gesamte Aktivität auf dem Niveau
des Cytochrom C befindet. pa dieses Protein ohne Anfärbung sichtbar ist, wurde das
Gel beim Niveau des Cytochrom C in Scheiben von der Größe 1,5 x 4 x 3 mm geschnitten.
Die Proteine wurden dann aus diesen Scheiben durch Elektrophorese herausgeholt und
gleiche Anteile der so erhaltenen Lösungen wurden nochmals unter den in Fig. 1 beschriebenen
Bedingungen einer Elektrophorese unterworfen, um den Proteingehalt der aktiven Scheiben
zu bestimmen. Zur Bestimmung der biologischen Aktivität wurde Pferdeserum und Harnstoff
bis zu einer Endkonzentration von 5 Vol.-% bzw.
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6 M zugefügt, und SDS nach der Methode von Weber und Kuter (J. biol.
Chem. 246, 4504 - 4509, 1971) durch Ionenaustausch quantitativ entfernt, mit der
Ausnahme, daß Mercaptoäthanol weggelassen wurde. Die Proben wurden dann zuerst bei
40C über Nacht gegen 5 mM Phosphatpuffer vom pH = 7,4, der 150 mM Natriumchlorid
enthielt, dialysiert und dann 6 Stunden gegen F-14-Gewebskulturmedium, das für die
Bioanalyse verwendet wird. Wie bei allen Tests auf biologische Aktivität wurde dann
Pferdeserum (10 Vol.-%) zugefügt und die Proben einer Sterilfiltration unterworfen,
bevor sie verdünnt und für eine Kultur aus spinalen sensorischen Neuronen verwendet
wurden.
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Wie die nachstehende Tabelle I zeigt, führt dieses Verfahren zur Isolierung
von 2 iig Protein aus 3 kg Schweinehirn. Bei nochmaliger Elektrophorese an Acrylamid/SDS-Gel
wandert die Aktivität als eine Bande (vgl. Fig. 1), und das Molekulargewicht wurde
mit 12 300 bestimmt. Dieser Wert entspricht dem Molekulargewicht, das bei der molekularen
Ausschlußchromatographie in Abwesenheit von SDS bestimmt wurde. Der isoelektrische
Punkt wurde durch isoelektrisches Fokussieren des nach der Hydroxylapatit-Säulenchromatographie
erhaltenen aktiven Materials in einem 5 %-igen (Gewicht/Volumen) Polyacrylamid-Gel,
das eine Ampholin-Mischung vom pH 7 bis 11 und 6 M Harnstoff enthielt, bestimmt.
Das Material wurde auf die Anode aufgebracht und nach dem Fokussieren (25 w, 2,5
Std. - bei 40C) war die Aktivität in der -alkalischen Fraktion mit dem pH-Wert von
10,1. Der pI des Faktors ist deshalb gleich oder größer als 10,1. Dieser Wert steht
im Einklang mit dem Verhalten des Faktors während der Säure-Harnstoff-Gelelektrophorese,
wo er vor dem Cytochrom C (pI = 9,3) mit der ungefähren Beweglichkeit von Eiweiß-Lysozym
(pI = 10,5) wandert. Aufgrund der durch Harnstoff und SDS hervorgerufenen teilweisen
Denaturierung kann der Gesamt-Reinheitsgrad des Faktors aus seiner endgültigen spezifischen
Aktivität nicht berechnet werden. Wenn aber angenommen wird, daß die gesamte Aktivität
durch die nach der Elektrophorese erhaltene Bande repräsentiert wird, dann zeigt
der Proteingehalt dieser Bande am Verfahrensendpunkt eine 1,4 x 106-fache Reinigung
an. Von der gleichen Voraussetzung ausgehend, kann eine endgültige spezifische Aktivität
von 0,4 ng/E berechnet werden, die nahe an der für NGF (0,2 ng/E) liegt.
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Die Fig. 1 veranschaulicht die bei einer Polyacrylamid/SDS-Gel (axponentieller
Gradient 10 bis 25 %)-Elektrophorese erhaltenen Ergebnisse. Die Zone 1 entspricht
0,5 ßg Cytochrom C aus Pferdeherz. Die Zone 2 ist der nach der Stufe VI erhaltene
gereinigte Faktor. Das obere und untere Ende des Trenngels
werden
durch Pfeile angezeigt, ebenso die Bromphenol blau-Front. Als Molekulargewicht-Standards
wurden Cytochrom C, Chymotrypsinogen A, Ovalbumin und Rinderserumalbumin verwendet.
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Vor der Elektrophorese wurden alle Proben 3 Minuten bei 90"C mit Laemmli-Puffer,
der 2,25 % (Gew./Vol.) SDS und kein Mercaptoäthanol enthielt, inkubiert.
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In der Tabelle 1 ist die nach den verschiedenen Verfahrensstufen aus
3 kg Schweinehirn erhaltene neurotrope Aktivität zusammengestellt. Das zur Bestimmung
der biologischen Aktivität verwendete Analysensystem bestimmt das überleben von
kultivierten spinalen sensorischen Neuronen aus 10 Tage alten Kükenembryos. Die
Methode entspricht der von Bande et al (Proc. nat. Acad. Sci. USA 77, 1199 - 1203,
1980) beschriebenen Methode, mit der Ausnahme, daß Gewebskulturen-Platten mit 24
Vertiefungen verwendet wurden. 4000 bis 7000 Zellen wurden aufgebracht und die über
lebenden Neuronen nach zwei Tagen gezählt. Wie von Barde et al (l.c.) beschrieben,
konnten unter Kontrollbedingungen (F14 + 10 Vol.-% Pferdeserum) nach zwei Tagen
keine überlebenden Neuronen festgestellt werden. Die Aktivität jeder Probe wurde
durch Serienverdünnungen bestimmt, wobei eine Einheit als diejenige Proteinkonzentration
(ng/ml) definiert ist, die das überleben der Hälfte der Maximalzahl von Neuronen
unterstützt, was bei dieser Entwicklungsstufe ca.
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2/3 der mit NGF erhaltenen entspricht (vgl. Barde et al, l.c.). Bei
den Stufen 1 bis V wurden die Proteine durch die Folin-Methode (O. H. Lowry et al,
J. biol. Chem. 193, 265 -275, 1951) bestimmt, wobei als Standard Rinderserumalbumin
verwendet wurde. Die nach Stufe VI erhaltene Proteinmenge wurde durch Reelektrophorese
eines aliquoten Teils der aktiven Fraktion und Vergleich mit der Intensität von
mit Silber angefärbten Banden (vgl. B. R. Oakley et al, Analyt. Biochem.
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105, 361 - 363 (1980) bestimmt, wobei verschiedene Mengen von Cytochrom
C als Standards dienten.
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Tabelle I Reinigungsstufen und neurotrope Aktivität (aus 3 kg Schweinehirn)
Stufe Protein Spezifische Aktivität Reinheitsgrad (Faktor) Ausbeute (µg) (ng/E)
(%) I Homogenisat 5,2 x 107 5 x 105 1 100 II ¹berstand 2,8 x 107 1,5 x 105 3,3 179
III 70 % (NH4)2SO4 1,8 x 107 1,5 x 105 3,3 115 IV CM-Cellulose 3,5 x 104 2,5 x 103
2 x 10² 13,5 V Hydroxylapatit 555 100 5 x 10³ 5,3 VI 2-dimensionale Gel-Elektrophorese
2 - 1,4 x 106* -* Dieser Reinheitsgrad leitet sich nicht von der Messung der spezifischen
Aktivität, sondern von Proteinbestimmungen ab, und basiert auf der im Beispiel genannten
Voraussetzung
Die Tabelle II zeigt die Wirkung von NGF und des
erfindungsgemäßen neurotropen Faktors auf Kulturen von spinalen sensorischen Neuronen.
Die überlebenden sensorischen Neuronen wurden 2 Tage nach Beginn der Kultur gezählt.
Bei der verwendeten Verdünnung blockiert das Anti-NGF-Schaf-Antiserum die Wirkung
von 50 ng/ml NGF. Es blockiert aber nicht die Wirkung des erfindungsgemäßen Faktors,
selbst wenn die Konzentration auf das 5-fache (1 : 200) erhöht wird.
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Tabelle II Zugabe von Konzentration Zahl der überlebenden Neuro-(ng/ml)
nen (pro Ansatz + SD) Kontrolle - 0 NGF 5 1779. + 205 (n = 3) Faktor 40 1195 + 180
(n = 3) Faktor + Antiserum (1 : 1000) 40 1043 + 54 (n = 2) Faktor 40 + NGF + 5 2981
+ 107 (n = 3)