DE69300674T2

DE69300674T2 - Verfahren zur isolierung von lactoferrin und lactoperoxidase aus milch und milchprodukten.

Info

Publication number: DE69300674T2
Application number: DE69300674T
Authority: DE
Inventors: Marinus Kivits; Klaas Kussendrager; Albert Verver
Original assignee: Campina Melkune BV
Current assignee: Campina Melkune BV
Priority date: 1992-01-15
Filing date: 1993-01-14
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2013-01-15
Also published as: DK0620709T3; CA2128111A1; ES2089797T3; WO1993013676A1; EP0620709B1; US5596082A; EP0620709A1; CA2128111C; FI111326B; FI943368A; NZ249235A; FI943368A0; DE69300674D1; ATE129125T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren des Metallprotein Lactoferrin und des Enzyms Lactoperoxidase aus Milch und Milchprodukten in industriellem Maßstab.
Lactoferrin (LF), ein Metallprotein, tritt in geringen Mengen unter anderem in Milch von Säugern auf. Es kann 2 mol Eisen pro mol Protein binden. Es versorgt somit den jungen Säuger mit Eisen in verwertbarer Form. Es wirkt weiterhin bakteriostat für eisenabhängige patogene Microorganismen.
Das Enzym Lactoperoxidase (LP) katalysiert das Zersetzen von Wasserstoffperoxid in der Gegenwart eines Wasserstoffspenders oder einer oxidierbaren Substanz. In Milch wirkt es bakteriostat unter anderem für patogene Streptokokken und Salmonellen in der Gegenwart von Thiocyanat und Peroxid, die beide in Milch vorhanden sind. Für rohe Kuhmilch wurden Konzentrationen von etwa 200mg/l für Lactoferrin und etwa 30mg/l für Lactoperoxidase berichtet, u.a. je nach der Lactationsstufe und der Brut.
Insbesondere Lactoperoxidase ist thermolabil. Nach dem Pasteurisieren wird dieses Enzym ganz oder teilweise inaktiviert, je nach der Intensität der Wärmebehandlung. Es ist daher klar, daß man zur Isolation dieser beiden Komponenten von Rohmilch ausgeht. Dies ist jedoch technologisch weniger interessant, weil kleine Mengen an LP oder LF von großen Mengen anderer Substanzen (Proteinen, Zuckern, Fetten) abgetrennt werden müssen. Weiterhin ist ungewiß, ob die Milch, aus der LP oder LF abgezogen worden sind, weiterhin als "Milch" im Sinne der gesetzlichen Terminologie für menschlichen Verzehr und/oder als Ausgangsmaterial für Käse und Butter verwendet werden kann.
Es ist daher klar, nicht mit Rohmilch zu beginnen, sondern stattdessen mit einem Nebenprodukt der Herstelllung von Käse oder Butter, nämlich Molke oder Magermilch. Bei der Käseherstellung wird die Milch nur einer geringen Wärmebehandlung unterzogen. Daher ist in der Käsemolke im wesentlichen die gesamte Lactoperoxidase vorhanden. Jedoch bleibt nur ein Teil des Lactoferrins gegenwärtig, nämlich etwa 25%. Nichtsdestoweniger ist Molke ein attraktives Ausgangsmaterial. Sie steht in großen Mengen, billig und vorgereinigt zur Verfügung.
Das Dokument NL-A 8201947 beschreibt ein Verfahren zum Isolieren von LP und LF aus Käsemolke. Molke mit einem pH-Wert zwischen 7,5 und 8,2 wird einer mit gepuffertem Silicagel gefüllten Säule zugeführt. Die in der Säule adsorbierten Proteine können eluiert werden, wodurch eine Lactoferrin- Präparation und eine Lactoperoxidase- Präparation erhalten werden. Die Reinheit der erhaltenen Präparationen ist niedrig, nämlich nur 66%.
Das Dokument EP-A 0 253 395 beschreibt eine Isolierung von Lactoferrin allein aus Rohmilch und Molke. Milch oder Molke wird mit einem schwach sauren Ionentauscher mit Carboxymethylgruppen als aktive Gruppen in Kontakt gebracht. Verschiedene Arten von Tauschern werden verglichen und durch eine Bindekapazität für Hämoglobin charakterisiert. Die Beispiele beschreiben lange Kontakt- und Eluierungszeiten. Die Experimente wurden sowohl säulenweise wie auch chargenweise durchgeführt. Diese beinhalten, daß das in dem Dokument EP-A 0 253 395 beschriebene Verfahren für großindustrielle Herstellung weniger geeignet ist. Weiterhin wird nur Lactoferrin isoliert, während Lactoperoxidase nicht isoliert wird.
Das Dokument EP-A 418 704 beschreibt die Extraktion von Lactoperoxidase und Lactoferrin mittels Affinitätschromatographie in einer Säule mit sulfonierten Polysaccharinharzen. LP und LF werden adsorbiert und nachfolgend eluiert und gereinigt. In den beschriebenen Beispielen wird eine kleine Flüssigkeitslast verwendet (etwa 80 Bettvolumina pro Stunde), was zu einer guten Separierung von LP und LF führt.
Das Dokument EP 352 678 beschreibt ein Verfahren zum Separieren und Wiedergewinnen von Proteinen (wie etwa LP/LF) mittels einer sogenannten Rotationssäule. Diese Vorrichtung soll für Strömungsradien bis zu Vs < 100 V&sub0; effizient sein, was eine Flüssigkeitslast von weniger als 100 Bettvolumina pro Stunde bedeutet. Eine Rotationssäule mit einer Soll-Länge von 265 cm und einem Zylindervolumen von 5,0 Litern soll eine Kapazität von 180 l von entrahmter Milch pro Stunde haben, was eine berechnete Oberflächengeschwindigkeit von 44 cm/h und eine Flüssigkeitslast von 36 Bettvolumina pro Stunde bedeutet.
Das Dokument WO-A 89/04608 beschreibt ein Verfahren, bei dem ausgehend von Käsemolke LP und LF in einem semiindustriellen Maßstab isoliert werden können. Hier ist der Durchsatz von 1 bis 1,5 Bettvolumina pro Minute ebenfalls ein beschränkender Faktor im Hinblick auf große Volumina von Käsemolke, die durch die Säulen geführt werden müssen.
Die vorstehend erwähnten Verfahren basieren auf bekannten chromatographischen Techniken für die Extraktion und Reinigung von Proteinen aus einer Matrix, die viele anwesende Substanzen wie etwa Kohlehydrate, Fette und Salze enthält. Die erwähnten Techniken werden insbesondere im Laboratoriumsmaßstab und auch in einem halbindustriellen Maßstab benutzt. Das Harz und der Ionentauscher, die in diesen Techniken typischerweise verwendet werden, sind besonders durch eine selektive Bindung der gewünschten Proteine/Proteinfraktionen, optimale Bindungskapazität und der bestmöglichen Auflösung charakterisiert. Dies bedeutet, daß sehr feine Partikel (etwa 100 um) verwendet werden, die optimalen Betriebsablauf im Hinblick auf die Selektivität, Bindungskapazität und Ausbeute ermöglichen. bin Nachteil feinkörniger Säulenpackungen besteht in ihrem hohen Strömungswiderstand. Dies bedeutet, daß nur geringe Oberflächengeschwindigkeiten verwendet werden können (beispielsweise bis zu 500 cm/h). Dies bedeutet in analytischen und/oder präparatorischen Verfahren zum Isolieren von Proteinen kein Problem, insbesondere nicht, wenn die Konzentration der Ausgangsmaterialien genügend hoch ist. Wenn die Konzentrationen sehr niedrig sind, wie etwa für LF und LP in Molke, müssen große Mengen an Flüssigkeit durch die Säulen geleitet werden. Wenn die Oberflächengeschwindigkeit erhöht wird, steigt der Druck auf die Säule und das Säulenmaterial. Der Maximaldruck, dem der Ionentauscher selbst standhalten kann, beschränkt die Oberflächengeschwindigkeit. Der Druck, oder besser der Druckabfall, wird üblicherweise in bar pro Meter Betthöhe ausgedrückt. Dementsprechend wird die Betthöhe zu einem beschränkenden Faktor. Dies bedeutet, daß der Durchmesser der Säule groß gewählt wird, wenn große Mengen an Flüssigkeit pro Zeiteinheit verarbeitet werden sollen (hohe Strömungsraten) . Dies erfordert, daß die Konstruktion der Säule extrem hohe Normen erfüllen muß, um die erforderliche mechanische Robustheit und adäquate Verteilung der Flüssigkeit zu erhalten. Dies hat Folgen für die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens, einerseits im Hinblick auf die Kosten solcher Säulen und andererseits im Hinblick auf die hohen Kosten des Harzes.
Es wurde jetzt ein Verfahren gefunden, das es möglich macht, die bioaktiven Proteine LP und LF aus Milch oder einem Milchderivat in industriellem Maßstab zu isolieren durch:
a) Adsorbieren dieser Proteine an einem Kationentauscher durch Hindurchleiten der Milch oder des Milchderivats mit einer hohen Oberflächengeschwindigkeit (mehr als 500 cm/h) und einer hohen Flüssigkeitslast (100-600 Bettvolumina pro Stunde);
b) Eluieren dieser Proteine separat oder gleichzeitig durch Eluieren mit einem oder mehreren Salzlösungen um ein oder mehrere Eluate zu bilden, dem auf Wunsch
c) das Trocknen der Eluate folgt.
In der bevorzugten Ausführungsform ist das Ausgangsmaterial Käsemolke (aus der Käseherstellung) oder neutralisierte Kaseinmolke (pH 6,5), die aus entrahmter Milch (nach Kasein-Ausfällung) erhalten wurde. Eine Bedingung besteht darin, daß die Wärmebehandlung in vorangehenden Verfahren so sanft ist, daß eine genügende Menge an LP und LF noch vorhanden ist.
Käsemolke, die in konventioneller Weise bei der Käseherstellung erhalten worden ist, ist geeignet. Da das Verfahren im Ganzen eine relativ lange Zeitspanne benötigt, und die Käsemolke als Ergebnis der Käseausfällung Microorganismen enthält, ist zu empfehlen, die Zahl der Microorganismen in dieser Phase zu reduzieren. Aus den oben erwähnten Gründen kommt die konventionelle Wärmepasteurisierung nicht in Betracht, jedoch kommen Baktofugation, Ultrafiltration über ein Grobfilter oder Microfiltration in Betracht. Ein zusätzlicher hier auftretender Vorteil besteht darin, daß grobe Verunreinigungen sowie Protein- und Fettagglomerate gleichzeitig entfernt werden. Diese Molke wird anschließend mit hoher Geschwindigkeit über einen grobgekörnten Ionentauscher geleitet, der auch eine große Zahl von funktionalen Gruppen enthält.
Der erfindungsgemäß verwendete Kationentauscher besitzt vorzugsweise einen mittleren (Zahl) Partikeldurchmesser von wenigstens 100 um, vorzugsweise wenigstens 125 um, und im besonderen wenigstens 150 um. Die obere Grenze für den Partikeldurchmesser liegt vorteilhafterweise bei 300 um, da größere Durchmesser keine zusätzlichen Vorteile erwarten lassen. Die Verwendung derartiger Partikelgrößen schafft die Möglichkeit hoher Oberflächengeschwindigkeiten in der Adsorption.
Ferner ist es vorteilhaft, daß der Kationentauscher eine so hohe physikalisch-mechanische Stabilität besitzt, daß ein Druckabfall angewandt werden kann, der üblichen Werte von 10 bar/m Betthöhe überschreitet, wie etwa 40 bar/m Betthöhe.
Es wurde festgestellt, daß ein Tauscher wie der SP-Sepharose Big Beads (Pharmacia) die Kriterien erfüllt und demzufolge hervorragend funktioniert.
Die mechanische Stabilität eines solchen Ionentauschers erlaubt einen Druckabfall von wenigstens 40 bar/m Betthöhe. Die Verwendung eines Arbeitsdruckes bis zu 3 bar/10 cm Betthöhe führte zur Oberflächengeschwindigkeiten von etwa 3.000 cm/h und Durchsatzraten von bis zu 600 Bettvolumina pro Stunde. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Kationentauscher in einem Adsorptionsbett in einer Säule vorhanden, wobei die Oberflächengeschwindigkeit der Milch und/oder der Milchderivate 2.000-3.000 cm/h und eine Flüssigkeitslast von 100-300 Bettvolumina pro Stunde betrugen.
Zusätzlich zu dem hohen Strömungsdurchsatz wird die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens auch durch die Bindungskapazität und die Bindungsrate des Harzes bestimmt. Es wurde festgestellt, daß das verwendete Harz mit etwa 60 g Lactoferrin bzw. 30 g Lactoperoxidase pro Liter Harz belastet werden konnte. Dies bedeutet, daß die aktiven Gruppen in dem Harz selbst bei so hohen Flußraten im wesentlichen vollständig verwendet werden. Es hat sich auch ergeben, daß selbst bei der hohen Rate das LP und LF in der Säule im wesentlichen vollständig adsorbiert wurden. Nur wenn die vorstehend erwähnte Bindekapazität nahezu erreicht wurde, trat mehr Leckage auf (mehr als 20%). Nach einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Bindekapazität des Ionentauschers mehr als 10 g Lactoperoxidase und mehr als 10 g Lactoferrin pro Liter Bettvolumen und mehr als 80 % der Proteine werden extrahiert.
Der Ionentauscher wird vorzugsweise vorher konditioniert mit einem Phosphatpuffer des pH = 6,5 (0,025 mol Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4;). Ein Durchsatz von etwa 4 Bettvolumina an Puffer reicht aus, die Säule abzugleichen. Nach Beladen der Säule mit geklärter Käsemolke wird zunächst Puffer über die Säule laufen gelassen, um die letzten Käsemolkereste zu entfernen. Das Lactoferrin und die Lactoperoxidase können aus der Säule entweder separat oder gleichzeitig eluiert werden. Wenn das Eluieren mit einer konzentrierten gepufferten Salzlösung (größer 0,7 molar NaCl) ausgeführt wird, werden LP und LF gleichzeitig eluiert. Das Eluieren mit einer niedrigen Salzkonzentration (etwa 0,2-0,5 molar NaCl) liefert lediglich Lactoperoxidase. Ein nachfolgendes Eluieren mit einer höheren Salzkonzentration (bis zu 2,5 mol NaCl) ergibt dann nur Lactoferrin. Auf diese Weise können die beiden bioaktiven Proteine separat eluiert werden. Diese Eluate sind nicht geeignet, als solche verwendet zu werden, da die Salzkonzentration zu hoch ist. Zum Entsalzen können konventionelle Techniken wie etwa Ionentauscher, Elektrodialyse und Ultrafiltration/Diafiltration ausgewählt werden. Die letzterwähnte Technik wird bevorzugt, weil auf diese Weise jede gewünschte Restsalzkonzentration leicht eingestellt werden kann. Die LP- und LF-Fraktionen, gesalzen oder nicht, können anschließend getrocknet werden, konventionelle Techniken wie Sprühtrocknen, Vakuumtrocknen, Rolltrocknen und Gefriertrocknen stehen zur Verfügung. Im Hinblick auf die Thermolabilität dieser beiden bioaktiven Proteine ist das Gefriertrocknen die wichtigste bevorzugte Option, jedoch die anderen Techniken sind sicherlich ebenfalls anwendbar, wenn geeignete Vorsorge bezüglich der anzuwendenden Wärmelast getroffen wird.
Die Erfindung wird weiter erklärt und erläutert durch die folgenden Beispiele.

Beispiel 1

Eine Chromatographie-Tauschersäule mit einem Durchmesser von 1,6 cm wurde mit 20 ml des starken Kationentauschers S Sepharose Big Beads (Pharmacia) geladen. Die Betthöhe betrug 10 cm. Geklärte Käsemolke, die durch Querstrommikrofiltration 1,4 um (Alfa Laval) erhalten wurde, mit einem Feststoffgehalt von 5,6% und einem pH-Wert von 6,6 wurde durch die Säule mit unterschiedlichen Oberflächengeschwindigkeiten (cm/h) bei Zimmertemperatur hindurchgepumpt, bis die Konditionen stabil waren (etwa 10 min.). Der Druckabfall (delta P) über dem Bett des Ionentauschers in der Säule wurde als Funktion der Oberflächengeschwindigkeit gemessen. Eine ähnliche Reihe von Experimenten wurde mit der gleichen Säule ausgeführt, die mit dem starken Kationentauscher S Sepharose Fast Flow (Pharmacia) bepackt war.
Es ergab sich, daß bei Druckdifferenz über etwa 1,5 bar das S Sepharose Fast Flow Säulenbett zunehmend komprimiert wurde. Der Verlust an Porösität als Ergebnis dieser physikalisch-mechanischen Instabilität gab Anlaß zu einem weiteren Anstieg des Druckabfalls, der dieses Harz ungeeignet machte. Der Lieferant dieses Harzes spezifiziert eine Flüssigkeitsgeschwindigkeit von bis zu 400 cm/h bei einem Druckabfall von 1 bar/15cm. Die Meßergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Oberflächengeschw. Käsemolke Bettvolumina/h Druckabfall über dem Säulenbett in bar Sepharose BB Sepharose FF * stabile Bedingungen nicht möglich.
Die S Sepharose BB Säule hält ihre physische und mechanische Stabilität und ihre ausgezeichnete Wirksamkeit bis zu einem Druckabfall von wenigstens 4 bar/10 cm Betthöhe. Dies bedeutet, daß die Säule einer Oberflächengeschwindigkeit von wenigstens 4.500 cm/h widerstehen kann.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde bestimmt, ob die aus Beispiel 1 gewonnenen Daten auch in größerem Maßstab gelten.
Eine Säule eines Pilot-Chromatographiesystems mit einem Durchmesser von 10 cm wurde mit dem Ionentauscher SP Sepharose Big Beads bepackt. Die Betthöhe betrug 11 cm und das Bettvolumen war 0,864 Liter. Geklärte Käsemolke mit einem Feststoffgehalt von 5,6% und einem pH von 6,6 wurde durch die Säule mit unterschiedlichen Oberflächengeschwindigkeiten (cm/h) bei Zimmertemperatur hindurchgepumpt und der Druckabfall über dem Säulenbett wurde als Funktion der Oberflächengeschwindigkeit gemessen. Die Oberflächengeschwindigkeit variierte innerhalb des Bereichs von 300 bis 2.800 cm/h, entsprechend 27 bis 255 Bettvolumina/h.
Eine ähnliche Reihe von Experimenten wurde mit der gleichen Säule ausgeführt, die mit dem Ionentauscher S Sepharose Fast Flow gefüllt war, mit einer Variation der Oberflächengeschwindigkeit innerhalb des Bereichs von 200 bis 880 cm/h, entsprechend 18 bis 80 Bettvolumina/h.
Die Meßergebnisse sind in der Kurve aus Fig. 1 dargestellt, in welcher der Druckabfall (delta P) über dem Säulenbett gegen eine Funktion der Oberflächengeschwindigkeit aufgetragen ist. Es schien, daß bei einem Druckabfall über 1,5 bar das S Sepharose Fast Flow Säulenbett wesentlich komprimiert ist. Es wurde ferner festgestellt, daß bei einem eingestellten Druckabfall von etwa 1 bar die Oberflächengeschwindigkeit über der Zeit abfällt, so daß nach einer gewissen Zeit die Säule für kontinuierliche Verwendung ungeeignet wurde.
Die mit SP Sepharose Big Beads bepackte Säule behält ihre guten Durchströmungseigenschaften und ihre physische Stabilität bis wenigstens zur maximalen Oberflächengeschwindigkeit und dem angewandten Druckabfall.
Fig. 1 zeigt unter anderem, daß bei einem Druckabfall von 1 bar die Oberflächengeschwindigkeit (und damit die Anzahl der Bettvolumina/h etwa dreimal höher mit dem SP Sepharose Big Beads ist als mit dem S Sepharose Fast Flow Bett. Darüber hinaus kann ein viel höherer Druckabfall realisiert werden, wenn die SP Sepharose Big Beads Säule verwendet wird, so daß der Vorteil bezüglich der Oberflächengeschwindigkeit (cm/h) oder der Bettvolumina/h relativ zu der S Sepharose Fast Flow Säule selbst noch immer beträchtlich höher ist, beispielsweise um einen Faktor von 5 oder 6 bei einem Druckabfall von 2,5 bar über dem Säulenbett von SP Sepharose Big Beads.
In der Darstellung der Fig. 2 werden die Ergebnisse der SP Sepharose Big Beads Säule mit jenen aus Fig. 1 verglichen.

Beispiel 3

Die speziellen wirtschaftlichen und technologischen Vorteile des Säulenprozesses für die selektive Adsorption von LP und LF gemäß der Erfindung speziell bezüglich der Dimensionierung und der Verwendung in einem industriellen Maßstab werden durch Vergleich von Situationen mit konventionellen Kationentauschern einerseits und einer verbesserten Type des Kationentauschers mit reduziertem Durchflußwiderstand andererseits erläutert.
Als ein Beispiel einer Dimensionierung in industriellem Maßstab ist der Ausgangspunkt eine Käsemolkelast für die Säule von 20 m³/h, was der Output einer durchschnittlichen niederländischen Käsefabrik ist.

Bedingungen für den Vergleich:

Üblicher Kationentauscher: SP Sepharose Fast Flow

Der Druckabfall über einer gepackten Säule beladen mit Käsemolke beträgt maximal etwa 6,7 bar/meter Betthöhe bei einer Oberflächengeschwindigkeit von maximalen 400 cm/h.

Verbesserter Kationentauscher: S Sepharose Big Beads

Der Druckabfall über einer gepackten Säule beladen mit Käsemolke, beträgt etwa 25 bar/meter Betthöhe bei einer Oberflächengeschwindigkeit von 3000 cm/h.
Die Vergleichsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt, in welcher
B = Bettvolumina von Käsemolke pro Stunde
KV = Volumen des Säulenbettes in Litern
h = Säulenbetthöhe in m
d = Säulenbettdurchmesser in m bedeuten. S Sepharose h Fast Flow d Big Beads d * optimale Arbeitsbedingungen.
Diese Tabelle zeigt deutlich, daß die exzeptionell hohe Oberflächengeschwindigkeit für die neue Harzart größere Vorteile bezüglich der erlaubten Dimensionen der Säulen (Durchmesser, Betthöhe) und bezüglich der zulässigen Käsemolkelasten in den Säulen (wichtige Parameter für die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens) bieten.

Beispiel 4

Dieses Beispiel soll die Bindungskapazität und die Ausbeute bestimmen.
Eine Säule mit einem Durchmesser von 1,6 cm wurde mit 20 ml S Sepharose Big Beads Ionentauscher bepackt. Die Betthöhe betrug 10 cm. Nach Abgleichen des Harzes mit 0,025 M Phosphatpuffer vom pH 6,5 wurde geklärte Käsemolke durch die Säule mit einer Rate von 150 Bettvolumina/h im ersten Test und mit einer Rate von 200 Bettvolumina/h im zweiten Test hindurchgepumpt. Die Käsemolke enthielt 36 bzw. 40 mg/l Lactoferrin und 17 bzw. 19 mg/l Lactoperoxidase. Der gesamte Durchsatz an Käsemolke betrug 24 l (etwa 1.700 Bettvolumina) im ersten Test und 20 l (etwa 1.000 Bettvolumina) im zweiten Test.
Nach dem Waschen der Säule mit Puffer wurden Lactoperoxidase und Lactoferrin separat in üblicher Weise eluiert mit 0,3 M NaCl im Phosphatpuffer bzw. 0,8 M NaCl im Phosphatpuffer. Die erhaltenen Eluate wurden auf LP und LF Gehalt mittels HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt: Test (Bettvolumina/h) Gebundene Harzmenge in g/l Ausbeute % aus der Molke

Beispiel 5

Eine 10 cm Säule eines Chromatographie Systems einer Pilotproduktion (Bioprocess System Pharamacia) wurde mit SP Sepharose Big Beads Ionentauscher bepackt. Der Durchmesser der Säule betrug 19 cm, die Betthöhe betrug 11 cm und das Bettvolumen war 0,864 Liter.
Nach Abgleich des Harzes bei Zimmertemperatur mit 0,025 M Phosphatpuffer pH 6,5 wurde geklärte Käsemolke durch die Säule über drei Stunden und 35 Minuten mit einer Flußgeschwindigkeit von 180 l/h hindurchgepumpt. Die Oberflächengeschwindigkeit betrug 2.300 cm/h. Die Flüssigkeitslast in diesem Fall betrug 208 Bettvolumina/h. Der gesamte Durchsatz an Käsemolke betrug 650 l.
Nach dem Waschen der Säule mit Pufferlösung wurden Lactoperoxidase (LP) und Lactoferrin (LF) separat eluiert mit 0,35 M NaCl in Phosphatpuffer bzw. 1,0 M NaCl in Phosphatpuffer. Die Flüssigkeitsströmungsrate während des Waschens und des Eluierens betrug 8,6 l/h (10 Bettvolumina/h). Fig. 3 zeigt das Eluierdiagramm.
Somit wurden 2,8 l LP Eluat und 2,2 l LF Eluat erhalten. Der LP Gehalt der LP Fraction wurde nach der enzymatischen Methode und mit HPLC zu 4,6 g/l bestimmt. Die LP Ausbeute betrug 94% relativ zu dem in der Molke enthaltenen LP.
Das LF der LF Fraction wurde durch UV-Adsorption (A280) und HPLC zu 9,0 g/l bestimmt. Die LF Ausbeute betrug 96% des in der Molke enthaltenen LF.
Das LP Eluat und das LF Eluat wurden durch Ultrafiltration/Diafiltration mit dem Pellicon System (Millipore) entsalzt, das mit Polysulfonmembranen ausgerüstet war, die einen Grenzwert von 10 kD besaß und nachher gefriergetrocknet. Die Reinheiten von LP in der LP Präparation und von LF in der LF Präparation, bestimmt durch HPLC, betrugen 93% bzw. 94% berechnet auf Gesamtfeststoffe.
Die Ergebnisse zeigen, daß bei Verwendung dieser Art von Ionentauscher in den Säulen in einem Pilot-Produktionsmaßstab extrem hohe Oberflächengeschwindigkeiten der Molke angewandt werden können und daß weiterhin sehr hohe Ausbeuten und Reinheiten der beiden bioaktiven Proteine erhalten werden.

Beispiel 6

Analog zum Beispiel 5 wurde eine Chromatographiesäule mit einem Durchmesser von 10 cm mit SP Sepharose Big Beads Ionenaustauscher von einer Betthöhe von 4,8 cm bepackt.
Das Bettvolumen betrug 0,377 l.
Nach Abgleich des Ionentauschers gemäß Beispiel 5 wurde geklärte Käse durch die Säule mit einer Flußrate von 513 Bettvolumina/h (193 l/h) gepumpt. Die Oberflächengeschwindigkeit betrug 2.460 cm/h. Eine Gesamtmenge von 250 l wurde durch die Säule geleitet.
Die LP- und LF-beladene Säule wurde gewaschen und eluiert gemäß Beispiel 5 mit einer Flüssigkeitsströmungsrate von 10 Bettvolumina/h.
Die erhaltenen Eluate mit LP und LF von 1,5 l bzw. 1,3 l wurden auf den Gehalt von bioaktiven Proteinen in üblicherweise analysiert.
Die LP-Fraktion enthielt insgesamt 4,70 g LP und die Ausbeute aus der Molke betrug 32%. Die LF Fraktion enthielt insgesamt 6,75 g LF und die Ausbeute aus der Beute betrug 90%.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung bioaktiver Proteine wie Lactoperoxidase und Lactoferrin aus Milch und/oder Milchderivaten, welches Verfahren die nachfolgenden Schritte umfaßt:

a) Adsorption der genannten Proteine an einen Kationenaustauscher dadurch, daß die Milch oder das Milchderivat init hoher Oberflächengeschwindigkeit (mehr als 500 cm pro Stunde) und hoher Flüssigkeitsbelastung (100-600 Bettvolumen pro Stunde) über den Kationenaustauscher geleitet wird.

b) Elution der genannten Proteine, getrennt oder gleichzeitig, unter Verwendung einer oder mehrerer Salzlösungen, zur Bildung eines oder mehrerer Eluate, gegebenenfalls mit anschließendem

c) Trocknen der genannten Eluate.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kationenaustauscher als Adsorptionsbett in einer Kolonne vorgesehen ist, woboi die Oberflächengeschwindigkeit der Milch und/oder Milchderivate 2.000-3.000 cm pro Stunde und die Flüssigkeitsbelastung 100-300 Bettvolumen pro Stunde beträgt.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildungskapazität des Ionenaustauschers mehr als 10 g Lactoperoxidase und mehr als 10 g Lactoferrin pro Liter Bettvolumen beträgt und daß mehr als 80% der genannten Proteine gewonnen wird.

4. Verfahren nach einem dor vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Milchderivat aus der Gruppe, bestehend als Magermilch, Kondensmagermilch, Buttermilch, Milchproteinkonzentrat, Käsemolke, Kaseinmolke, Molkekonzentrat, entsalzter Molke, entsalztem Molkekonzentrat und Molke-Proteinkonzentraten, gewählt ist.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß Milchderivate zuerst durch Entfernung gröberer Verunreinigungen geklärt werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Proteine aus der Kolonne eiuiert werden, getrennt oder gleichzeitig, mit Salzlösungen mit einer Konzentration von höchstens 2,5 Mol, insbesondere 2 Mol.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Eluate durch Vakuumtrocknen, Gefriertrocknen, Sprühtrocknen oder Waizentrocknen getrocknet werden, welchem Trocknen gegebenenfalls eine Entsalzung und/oder Konzentrierung vorangeht.