DE3877338T2

DE3877338T2 - Isolierung einer immunoglobulinreichen molke-fraktion.

Info

Publication number: DE3877338T2
Application number: DE8888311180T
Authority: DE
Inventors: Robin Charles Bottomley
Original assignee: Express Foods Group Ltd
Current assignee: Express Foods Group Ltd
Priority date: 1987-12-11
Filing date: 1988-11-25
Publication date: 1993-09-23
Anticipated expiration: 2008-11-26
Also published as: US5194591A; EP0320152B1; DK688988A; AU620361B2; EP0320152A3; AU2671488A; DE3877338D1; IE63519B1; GB8729031D0; IE883686L; JPH01230600A; CA1327676C; ATE84193T1; EP0320152A2; DK688988D0; NZ227277A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer immunoglobulinreichen Molke-Fraktion.
Es ist seit langem bekannt, wie Immunglobuline aus verschiedenen Materialien isoliert werden. Während Molke reich an Immunglobulinen ist, ist es jedoch wegen der Art der betreffenden Produkte bis jetzt kommerziell nicht durchführbar, ein immunglobulinreiches Konzentrat aus Molke zu gewinnen.
Schon 1971 wurde die Verwendung von Milch als potentielle Quelle für Antikörper erkannt. In US-Patent Nr. 3,553,317 wurde die Möglichkeit der Gewinnung von Antikörpern aus der Milch einer Kuh oder Ziege vorgeschlagen. Während die Quantität an aus einer solchen Quelle erhältlichem Antikörper als wesentlich erachtet wurde, konnte die praktische Nutzung der Quelle nicht verwirklicht werden.
Es ist dem Biochemiker bekannt, Antikörper durch physikalische Verfahren zu isolieren und zu reinigen, die die Trennung der Gruppen von Molekülen aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften wie Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt, elektrophoretische Mobilität und Löslichkeit in verschiedenen Systemen umfassen. Dieser Methode eigen ist die Tatsache, daß Antikörper, ungeachtet ihrer immunologischen Spezifität, zusammen isoliert würden. Gleichermaßen würde ein Immunologe dazu neigen, sich auf die primären Charakteristiken aller Antikörper, d. h. ihre Fähigkeit mit Spezifischen Antigenen zu reagieren, zu verlassen. Wenn daher ein Antigen einer Mischung zugegeben wird, die einen spezifischen Antikörper enthält, würden das Antigen und der Antikörper einen Komplex bilden und aus der Lösung ausfallen.
Im allgemeinen wurden diese Verfahren auf Serum durchgeführt und bisher hat noch niemand einen erfolgreichen und kommerziell durchführbaren industriellen Prozeß zur Verwendung bei anderen Systemen wie Milchprodukten und insbesondere der von der Käsebereitung übrigen Molke vorgeschlagen.
Die UK-Patentschrift 2044775A offenbart daher ein Verfahren zur Herstellung von Immunglobulin zur intravenösen Verabreichung, das die Reinigung von aus menschlichem Plasma erhaltenem Immunglobulin durch eine Kombination eines fraktionierten Fällungsverfahrens und eines Affinitätschromatographieverfahren umfaßt.
In US-Patent Nr. 4,256,631 wird ein anderes Verfahren zur Herstellung von aus menschlichem Plasma erhaltenem Immunglobulin zur intravenösen Verabreichung beschrieben, wobei das Verfahren eine Kombination, in willkürlicher Abfolge, einer fraktionierten Fällung, in der ein oder mehrere divalente oder trivalente Salze als Fällungsmittel einer wässrigen Lösung solchen Immunglobulins zugesetzt werden, zusammen mit Affinitätschromatographie umfaßt.
In US-Patent Nr. 4,229,342 wird ein Verfahren zum Extrahieren von Proteinen aus entrahmter Milch beschrieben. Dieses Patent, das den Stand der Technik von Mai 1977 berücksichtigt, gibt an, daß die Verarbeitung von entrahmter Milch im allgemeinen so durchgeführt wurde, daß zuerst das Kasein durch saure oder enzymatische Koagulation extrahiert wird und dann die Proteine aus dem Milchserum mittels Thermokoagulation, Ultrafiltration oder Ionenaustausch extrahiert werden und schließlich die Lactose abgetrennt wird, die hydrolysiert werden kann. Es gibt ferner an, daß der Nachteil der aus Milchserum durch Thermokoagulation extrahierten Proteine darin liegt, daß sie dadurch einige ihrer biologischen Eigenschaften verlieren und daß dies ebenfalls für Proteine gilt, die durch Ultrafiltration aus Milchserum extrahiert wurden, da die Dauer der Bearbeitung im allgemeinen ein Pasteurisieren des Milchserums erforderlich macht. Darüber hinaus ist die Trennung von Proteinen aus Milchserum durch Ionenaustausch in technischem Maßstab sehr schwierig zu erreichen, weil die bekannten Ionenaustauscher auf Basis von Dextran und Cellulose schwächere mechanische Eigenschaften aufweisen. Es anerkennt, daß während Ionenaustauscher vorgeschlagen wurden, die nicht an diesen Nachteilen leiden, das koagulierte Kasein dennoch ausgefällt in einem teilweise verschlechtertem Zustand ist.
US-Patent 4,229,342 schlägt vor, das Problem dadurch zu lösen, daß die anderen Proteine als Kasein zuerst extrahiert werden, indem die entrahmte Milch mit einem oder mehreren anionischen Ionenaustauschern in Kontakt gebracht wird und durch die Wirkung von Siliciumoxid, wobei das Siliciumoxid dafür verantwortlich ist, die Immunglobuline in der entrahmten Milch selektiv zu fixieren. Die Bindungseffizienz des Siliciumoxids ist jedoch gering und die Ausbeuten würden ein Verfahren in technischem Maßstab nicht tragen.
Das französische Patent Nr. 2520235 beschreibt die Trennung von Proteinen von Kolostrum, indem ein entrahmtes Kolostrum oder ein Kolostrumserum einer Elektrophorese unterzogen wird, so daß sich eine mit Immunglobulinen angereicherte Fraktion bildet und indem die angereicherte Fraktion weiter einer Fraktionierung durch Chromatographie unterzogen wird.
US-Patent 4,436,658 beschreibt die Extraktion von Lactoferrin aus Molke oder konzentrierter Molke oder Molke, aus der andere Proteine als Lactoferrin schon durch Absorption auf einen festen Träger wie Siliciumoxid bei einem schwach basischen pH von 7,7 bis 8,8 entfernt worden sind.
Maubois et al. vom Dairy Research Laboratory INRA beschrieben in einem auf der WPI/IDF International Whey Conference in Chicago, USA im Jahre 1986 vorgetragenen Bericht die Zugabe von Calciumionen zu Molke bei ungefähr 2 ºC, Einstellen des pH auf ungefähr 7,3 und schnelles Erhöhen der Temperatur der Molke auf ungefähr 50 ºC und Halten dieser Temperatur für ungefähr 8 Minuten, um eine Aggregation von Lipoproteinen durch Calciumbindung und Fällung des Aggregats zu bewirken, so daß sich eine geklärte Molke bildet. Maubois et al. stellten fest, daß das Vorhandensein von Lipoproteinen in der Molke das Versagen der früheren Vorschläge zur Fraktionierung von Proteinen aus Molke bedingt, indem die Lipoproteine sowohl amphoterisch als amphiphil sind und daher die Ultrafiltration begrenzen, indem sie stark auf die Membranmaterialien absorbiert werden und irreversibles Fouling bewirken.
Die bevorzugte Extraktion von Lactoferrin und Immunglobulin aus Molke wird in der UK-Patentanmeldung GB 2179947 beschrieben. Das Verfahren umfaßt die 5-fache Konzentrierung von Molke (erhalten nach Entfernung von Kasein und Fett aus Rohmilch) durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Polysulfon-Membran (mit Molekültrennung von 25 000 - 50 000) gefolgt von Diafiltration und Adsorption des Proteins durch Ionenaustauscherbehandlung unter Verwendung eines schwach kationischen Carboxymethylharzes bei pH 5-8,5 und bevorzugt bei 7-8 und Elution beim selben pH. Wiederum sind jedoch die Ausbeuten zu gering für eine Durchführbarkeit im industriellen Maßstab. Die vorliegende Erfindung ist teilweise auf die Erkenntnis gegründet, daß das Problem tatsächlich aus den Bindungscharakteristiken von Immunglobulinen herrührt, indem wenn sie mit ausreichender Wirksamkeit gebunden werden, um eine bedeutende Menge zu extrahieren, die gebundenen Immunglobuline äußerst schwer durch Elution zu entfernen sind, so daß die Gesamtausbeute dennoch zu gering ist für eine Durchführbarkeit in industriellem Maßstab. Harze, bei denen eine Entfernung vergleichsweise einfach ist, leiden unter dem Nachteil, daß sie Immunglobulin von vornherein nicht ausreichend binden.
Während daher viel Forschung und Versuche unternommen wurden, ergab sich kein einfaches und wirksames Verfahren für die Extraktion von Immunglobulin aus Molke in industriellem Maßstab.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Extraktion eines Konzentrats mit einem hohen Gehalt an Immunglobulinen aus Molke in einem industriell durchführbaren Maßstab ermöglicht.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß trotz der Gegenwart von Lipoproteinen Ultrafiltrationsverfahren entweder allein oder in Kombination mit Anionaustauscherbehandlung angewendet werden können, um eine solche Extraktion auszuführen. Das Verfahren kann mit Molke gebildet oder mit flüssigen Molkeproteinkonzentraten, entweder direkt aus Molke gebildet oder aus Molkeproteinkonzentratpulver rekonstituiert, durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung zur Herstellung eines immunglobulinreichen Molkeproteinkonzentrats, das umfaßt Fraktionierung von Molkeproteinen in eine immunglobulinreiche Fraktion und eine immunglobulinarme Fraktion und Konzentrierung mindestens der immunglobulinreichen Fraktion, dadurch gekennzeichnet, daß eine Molke oder ein flüssiges Molkeproteinkonzentrat einer Ultrafiltration durch eine Membran mit einer Molekulargewichtstrennung von im wesentlichen 500000 unterzogen wird, wodurch ein immunglobulinreiches Konzentrat zusammen mit Fett direkt erzeugt wird, wobei das Permeat mindestens einen Hauptanteil der restlichen Molkeproteine enthält.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verfügung zur Herstellung eines Molkeproteinkonzentrats mit Immunglobulinen, dadurch gekennzeichnet, daß Molke oder ein flüssiges Molkeproteinkonzentrat der Wirkung eines Anionaustauscherharzes unterzogen wird, um ein Effluens zu erzeugen, dessen Molkeproteine einen höheren Anteil an Immunglobulinen enthalten als die in der ursprünglichen Molke oder dem Molkeproteinkonzentrat oder dem rekonstituierten Molkeproteinkonzentratpulver und ein Eluat, dessen Molkeproteingehalt einen verarmten Anteil an Immunglobulinen enthält, und mindestens das Effluens einer Konzentration durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einer Molekulargewichtstrennung von im wesentlichen 500000 Dalton unterzogen wird.
Wenn gewünscht kann auch ein Entfetten ausgeführt werden. Entfetten kann dabei mit der ursprünglichen Molke, Molkeproteinkonzentrat oder rekonstituiertem Konzentrat durchgeführt werden, wobei das Konzentrat aus Ultrafiltration durch die Membran mit einer Trennung von im wesentlichen 500 000 resultiert oder das Effluens aus der obigen anfänglichen Ionenaustauscherbehandlung resultiert.
Wenn der anfängliche Ionenaustauscherschritt durchgeführt wird, wird entweder direkt gebildetes oder aus Molkeproteinkonzentratpulver rekonstituiertes flüssiges Molkeproteinkonzentrat mit einem Anionaustauscherharz in Kontakt gebracht wie Spherosil QMA Harz (Rhone-Poulenc), Sepharose Fast Flow Q (Pharmacia) oder Trisacryl Q Harz (IBF), um ein Effluens zu bilden, das an Immunglobulin reich ist (insbesondere Immunglobulin G) und das all das restliche Fett im ursprünglichen Molkeproteinkonzentrat zusammen mit einigen der anderen Molkeproteine enthält. Die gebundenen Proteine, die einen geringeren Anteil der Immunglobuline umfassen, können aus dem Ionenaustauscherharz mit verdünnter Natriumchloridlösung, z. B. 0,3 M NaCl eluiert werden und die Säule zur Wiederverwendung mit verdünnter Salzsäure, d. h. 0,1 M HCl gefolgt von demineralisiertem Wasser, gereinigt werden. Obwohl die Salzsäure gebundenes Protein auch eluiert, zerstört die Säure die Struktur und Aktivität von verbliebenem gebundenem Immunglobulin. Das Fett kann dann aus dem Effluens abgetrennt werden oder alternativ kann das Fett zuerst aus dem Konzentrat entfernt werden und das entfettete Konzentrat mit dem Anionaustauscherharz in Kontakt gebracht werden.
Das Entfetten des Molkeproteinkonzentrats wird bevorzugt durch Sedimentation ausgeführt unter Verwendung von Fischleim als Fällungsmittel (Konzentration an Fischleim z. B. 1 %), wobei das Molkeproteinkonzentrat vor dem Entfetten auf ungefähr 1 % Proteinkonzentration verdünnt wird. Wenn gewünscht kann auch das Entfettungsverfahren von GB 2190273 angewendet werden.
Das Entfetten des Molke oder des Säuleneffluens aus dem Ionenaustausch kann auch durch Sedimentation unter Verwendung von Fischleim als Fällungsmittel ausgeführt werden, vorausgesetzt, daß das Verhältnis von Asche/Protein kleiner ist als 0,08 : 1. Wenn das Verhältnis von Asche/Protein größer ist als 0,08 : 1, dann muß die Molke oder das Effluens demineralisiert werden, wie beispielsweise durch Ionenaustausch, Elektrodialyse oder Ultrafiltration, um das Verhältnis von Asche/Protein unter 0,08 : 1 zu bringen. Teilweise Ultrafiltration des Säuleneffluens kann bedingt durch den geringen Feststoffgehalt des Effluensstroms sehr effizient ausgeführt werden.
Ultrafiltration kann bei Temperaturen im Bereich von 4 ºC bis 60 ºC, bevorzugt 48 bis 55 ºC ausgeführt werden. Der Ionenaustausch-Schritt kann bei Temperaturen im Bereich von 4 ºC bis 55 ºC, bevorzugt 4 ºC bis 10 ºC ausgeführt werden.
Der pH des Anionaustauscherharzes kann von 2,0 bis 6,5 betragen, liegt aber bevorzugt bei 3,5 bis 4,0. Der pH der dem Ionenaustausch unterzogenen Flüssigkeit kann von 5,5 bis 7,0 betragen, liegt aber bevorzugt bei 6,0 bis 6,4.
Die zur Ultrafiltration verwendeten Membranen können von jedem im Handel erhältlichen Typ sein, sind aber bevorzugt Polysulfon-Membranen. Zur Herstellung eines Ausgangsmolkeproteinkonzentrats kann die Molekulargewichtstrennung (Cut off) der Membran von 3 000 bis 10 000 betragen. Wenn eine Membran mit einer Molekulargewichtstrennung von im wesentlichen 500 000 bei Molke oder entfetteter Molke verwendet wird, wurde jedoch überraschenderweise gefunden, daß, obwohl Immunglobulin G&sub1; und G&sub2;, die etwa 75 % der in Molke vorhandenen Immunglobuline ausmachen, Molekulargewichte unter 200 000 (oder 160 000) besitzen, trotzdem fast der gesamte Gehalt an rückgewinnbaren Immunglobulinen der Molke im Konzentrat verbleibt und das Permeat, obwohl es einen wesentlichen Anteil der anderen Molkeproteine enthält, nur eine sehr geringe Menge an Immunglobulinen enthält. Es wurde beispielsweise gefunden, daß ungefähr 88 Gewichts-% der Immunglobuline in der Molke im Konzentrat verbleiben, wobei nur ungefähr 4,5 Gewichts-% der Immunglobuline ihren Weg ins Permeat finden, wobei der Rest (etwa 7 %) das Ergebnis des üblichen Verarbeitungsverlustes sind. Das so hergestellte Konzentrat enthält alles Fett der ursprünglichen Molke, aber vorausgesetzt das Vorhandensein des Fetts ist nicht störend, kann direkt als Immunglobulinkonzentrat verwendet werden. Wenn das Fett störend ist, kann ein Entfetten des Konzentrats ausgeführt werden, oder die ursprüngliche Molke kann vor der Ultrafiltration entfettet werden. Das Konzentrat kann gemäß der Erfindung weiter behandelt werden, indem das Konzentrat der Wirkung eines Anionaustauscherharzes unterzogen wird, das die anderen Molkeproteine bindet, aber nur geringe oder keine Bindungskapazität für Immunglobuline besitzt. Die Molkeproteine im Effluens weisen einen höheren Anteil an Immunglobulinen auf, als die des Konzentrats.
Die gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung angewendete Anionaustauscherbehandlung versucht nicht, die Immunglobuline selektiv auf dem Harz zu binden, sondern vielmehr die anderen Molkeproteine zu binden und auf diese Weise mindestens eine Teil davon von den Immunglobulinen zu trennen, die in das Effluens durchtreten, das danach durch weitere Ultrafiltration konzentriert wird.
Die der Anionaustauscherharzbehandlung folgende Ultrafiltration bietet auch eine weitere Fraktionierung, wobei einem größeren Anteil von Proteinen, die keine Immunglobuline sind, ermöglicht wird, in das Permeat zu gelangen.
Die Erfindung kann auch ein Permeat zur Verfügung stellen, das im wesentlichen frei ist von Immunglobulinen und das dann weiterer Fraktionierung unterzogen werden kann, z. B. durch ein Verfahren der europäischen Patentanmeldung Nr. 88308906.2, um eine Fraktion herzustellen, die reich ist an α-Lactalbumin. Die Erfindung wird weiter erläutert mit Bezug zu den folgenden Beispielen die nur zur Erläuterung dienen.

Präparat 1

1500 Liter Cheddar-Molke mit einer echten Proteinkonzentration von 4,8 Gramm pro Liter wurden unter Verwendung einer Romicon PM10 Membran mit einer Fläche von 10 m² konzentriert, um ein Molkeproteinkonzentrat mit 75 % Protein auf Gesamtfeststoff zu erzeugen. Das Molkeproteinkonzentrat (entsprechend als WPC 75 bekannt) wurde dann auf 1 % Protein (680 Liter) verdünnt und durch Sedimentierung unter Verwendung von Fischleim als Fällungsmittel (Konzentration an Fischleim 1 %) entfettet. Der erhaltene Überstand enthielt ungefähr 50 % Immunglobulin. Dieser wurde weiter gereinigt, indem der pH mit Kaliumhydroxid auf 6,2 eingestellt und der Überstand auf eine Pharmacia Bio Process 252 Säule gepackt mit Spherosil QMA Harz (Rhone-Poulenc, Frankreich) aufgegeben wurde. Da das Volumen dieser Ionenaustauschersäule nur 50 Liter betrug, wurde der Überstand in Chargen von jeweils 210 Liter verarbeitet.
Das Eluens, d. h. das Material, das unverzögert durch die Säule läuft, wurde gesammelt. Es wurden 702 Liter Eluens gesammelt.

Präparat 2

Ein flüssiges Molkeproteinkonzentrat (WPC 60) wurde auf eine 45 Liter Säule mit Spherosil QMA Harz (Rhone-Poulenc, Frankreich) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 Litern pro Minute aufgegeben und mit demineralisiertem Wasser durchgewaschen. Es wurden 95 Liter unbehandelt durch die Säule laufendes Effluens gesammelt.
Die gebundenen Proteinfraktionen wurden eluiert durch:
1. Die Verwendung von 0,3 molarem Natriumchlorid;
2. Die Verwendung von 0,1 molarer Salzsäure; und
3. Dann Waschen der Säule in demineralisiertem Wasser bis ein pH von 3,5 erreicht wurde. Die Säule wurde dann für weitere Durchgänge verwendet.
Die Ergebnisse ausgedrückt in Gramm des Ausgangsmaterials und der drei Ionenaustauscherfraktionen sind in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1 Gesamt-Feststoff Echte Proteine Fett Immunglobulin-Fraktion IgG1 Ausgangs-WPC Effluens NaCl-Eluat HCl-Eluat * (0,1 molare HCl zerstört Immunglobulin-Struktur und -Aktivität).
Wie aus der Analyse von Tabelle 1 ersichtlich ist, enthielt die Effluensfraktion einen hohen Prozentsatz an Fett sowie an Immunglobulinen. Daher wurde ein Entfetten durchgeführt. Dies wurde durch ein Absetzverfahren ausgeführt, wobei der pH durch Zugabe von Salzsäure auf 4,3 eingestellt wurde und Flokkulation durch Zugabe von Fischleim (1 %ige Lösung) direkt in das Effluens induziert wurde. Es wurden zwei Entfettungsvorgänge ausgeführt, deren Ergebnisse in Tabelle 2 ersichtlich sind. TABELLE 2 Volumen Effluens Volumen Überstand Gesamtfeststoff im Überstand Echtes Protein im Überstand Fett im Überstand Immunglobuline im Überstand Liter

Präparat 3

1820 Liter Milch wurden durch normale kommerzielle Verfahren in Cheddar-Käse und Molke überführt. Die Molke wurde geklärt und auf einem Westfalia-Zentrifugenseparator getrennt, um überschüssiges restliches Fett zu entfernen, so daß sich 1500 Liter abgetrennter Molke ergeben. Unter Verwendung der bei Präparat 1 beschriebenen Vorgehensweisen wurde die abgetrennte Molke zur Herstellung von 185 Liter UF-Konzentrat konzentriert, entfettet, durch Ionenaustausch gereinigt, so daß sich 682 Liter Säuleneffluens ergeben. Das gesamte Protein in der Ausgangsmilch und den Zwischenprodukten sind unten in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3 Gesamtprotein (%) Milch Abgetrennte Molke UF-Konzentrat Säuleneffluens Endprodukt

Beispiel

80 Liter süße weiße Cheddar-Molke (pH 6,05) wurden auf einer Romicon PM500 Membran (Typ Hohlfaser-Kartusche; Membranfläche 0,46 m²) konzentriert. Während des Durchlaufs wurde die Temperatur auf 10 bis 12 ºC gehalten bis zu den Endstufen der Konzentration, als sie auf 18 ºC stieg. Der Durchlauf dauerte 5 Stunden und das Endkonzentratvolumen betrug 3,5 Liter; Molke-/Konzentratfluß wurde durchgehend auf einer hohen Geschwindigkeit gehalten (2,2 m/sec) und der durchschnittliche Permeatfluß betrug 34 l/m²/h. Das Endkonzentrat wurde gefriergetrocknet und wies die folgende Zusammensetzung auf:
Gesamtfeststoff: 96,0 %
Gesamtprotein: 51,4 %
Fett: 7,1 %
Der IgG-Gehalt (als Prozentsatz des echten Proteins) sowohl des PM500 Konzentrats als auch des Permeats wurden direkt von RID-Platten bestimmt unter Verwendung der Radial-Immuno- Diffusion. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammen mit denen für Molke (Ergebnisse erhalten Tnit einer WPC 75 Konzentrat guter Qualität) als Vergleich gezeigt. TABELLE 4 PM 500 Konzentrat Molke PM 500 Permeat
Die Ausbeuten für das PM500 Konzentrat und PM500 Permeat sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 PM500 Konzentrat PM500 Permeat Gesamtfeststoff Gesamtprotein Echtes Protein
Das PM500 Permeat wurde durch Ultrafiltration durch eine PM10 Membran konzentriert und gefriergetrocknet. Einzelheiten der Analyse für die Molke und das gefriergetrocknete Konzentrat sind als Prozentsätze in Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 6 Molke PM500 Permeat ultrafiltriert und gefriergetrocknet Feststoffe Fett Gesamtprotein Asche
Es wurden auch Chromatographieprofile für das PM500 Konzentrat, die Molke und das PM500 Permeat erzeugt und sind in den begleitenden Zeichnungen gezeigt, in denen Fig. 1 ein Profil des PM500 Konzentrats ist, Fig. 2 ein Profil der Molke ist und Fig. 3 ein Profil des PM500 Permeats ist. In jeder Figur entspricht die schraffierte Fläche den Immunglobulinen. Die HPLC-Profile wurden auf LDC-Geräten mit einer TSK G2000 SW Säule erzeugt unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer bei einem pH von 6,2 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,7 ml/min. Die Proben waren 20 ul mit 1 Gewichts-% Konzentration und der Nachweis erfolgte durch UV-Absorption bei 220 nm.
Obwohl beispielsweise in den Präparaten und Beispielen spezifische Ultrafiltrationsmembranen und Ionenaustauschermedien verwendet wurden, sind diese nicht einzigartig, ähnliche Membranen mit Molekulartrennungen von 500 000 und ähnliche quarternäre und Ammoniumaustauscherharze (z. B. Pharmacia Fast Flow Q, IBF Trisacryl Q), die von anderen Herstellern produziert werden, können verwendet werden. Gleichermaßen kann andere Molke als die bei der Cheddar-Käse-Produktion erzeugte verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines immunglobulinreichen Molkeproteinkonzentrats, das umfaßt Fraktionierung von Molkeproteinen in eine immunglobulinreiche Fraktion und eine immunglobulinarme Fraktion und Konzentrierung mindestens der immunglobulinreichen Fraktion, dadurch gekennzeichnet, daß eine Molke, ein flüssiges Molkeproteinkonzentrat oder ein rekonstituiertes Molkeproteinkonzentratpulver einer Ultrafiltration durch eine Membran mit einer Molekulargewichtstrennung von im wesentlichen 500000 unterzogen wird, wodurch ein immunglobulinreiches Konzentrat zusammen mit Fett direkt erzeugt wird, wobei das Permeat mindestens einen Hauptanteil der restlichen Molkeproteine enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Molke, das flüssige Molkeproteinkonzentrat oder das rekonstituierte Molkeproteinkonzentratpulver zuerst der Wirkung eines Anionaustauscherharzes unterzogen wird, um ein Effluens zu erzeugen, dessen Molkeproteine einen höheren Anteil an Immunglobulinen enthalten als die in der ursprünglichen Molke oder dem Molkeproteinkonzentrat oder dem rekonstituierten Molkeproteinkonzentratpulver und ein Eluat, dessen Molkeproteingehalt einen verarmten Anteil an Immunglobulinen enthält, und mindestens das Effluens einer Konzentration durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einer Molekulargewichtstrennung von im wesentlichen 500000 Dalton unterzogen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauschschritt bei einer Temperatur im Bereich von 4 ºC bis 55 ºC durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur im Bereich von 4 ºC bis 10 ºC liegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des Anionaustauscherharzes im Bereich von 2,0 bis 6,5 liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der dem Ionenaustausch unterzogenen Flüssigkeit zwischen 5,5 und 7,0 liegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Entfetten mit der ursprünglichen Molke, dem Molkeproteinkonzentrat, dem rekonstituierten Konzentratpulver, dem aus dem Verfahren nach Anspruch 1 resultierenden angereicherten Konzentrat oder dem aus der Ionenaustauschbehandlung nach Anspruch 2 resultierenden Effluens durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Entfetten von Molkeproteinkonzentrat oder rekonstituiertem Molkeproteinkonzentratpulver durch Sedimentation unter Verwendung von Fischleim als Fällungsmittel durchgeführt wird, wobei das Konzentrat oder das rekonstituierte Pulver auf im wesentlichen 1 Gewichts-% Proteinkonzentration vor dem Entfetten verdünnt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Entfetten der ursprünglichen Molke oder des aus der Anionaustauschbehandlung nach Anspruch 2 resultierenden Effluens durch Sedimentation unter Verwendung von Fischleim als Fällungsmittel durchgeführt wird, wobei falls notwendig die Molke oder das Effluens zuerst demineralisiert wird, in dem Maße, das erforderlich ist, um das Asche/Protein-Verhältnis auf einen Wert unter 0,08 : 1 zu reduzieren.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Fischleim in einer Menge von im wesentlichen 1 Gewichts-%, bezogen auf die entfettete Flüssigkeit, verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß alle Ultrafiltrationen bei einer Temperatur im Bereich von 4 ºC bis 60 ºC durchgeführt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur im Bereich von 48 ºC bis 55 ºC liegt.