DE602004008051T2

DE602004008051T2 - Aus einer bifidobakterien-kultur gewonnener immunomodulator und diesen enthaltende zusammensetzungen

Info

Publication number: DE602004008051T2
Application number: DE602004008051T
Authority: DE
Inventors: Valerie Petay; Francis Lecroix; Emmanuel Perrin; Charles Gontier; Jean-Pierre Blareau; Marie-Benedicte Romond; Elisabeth Singer; Marie-Francoise Odou; Catherine Demailly-Mullie
Original assignee: Gervais Danone SA
Current assignee: Gervais Danone SA
Priority date: 2003-04-16
Filing date: 2004-04-08
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2024-04-09
Also published as: CA2522362A1; ATE369145T1; PT1615656E; EP1615656B9; FR2857026B1; PL1615656T3; EP1615656B1; DK1615656T3; US20080248056A1; EP1615656A2; DE602004008051D1; WO2004093898A2; ES2291896T3; WO2004093898A3; FR2857026A1; US8197826B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein aus einer Kultur von Bifidobacterium hergestelltes immunregulatorisches Produkt, dessen Verwendung insbesondere als Medikament oder als Nahrungsmittelbestandteil, sowie dieses enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen oder Nahrungsmittel.
Die Gattung Bifidobacterium gehört zu der Familie der Actinomycetaceae; sie umfasst strikt anaerobe, grampositive Bazillen, welche Glucose über die Fructose-6-Phosphat Phosphoketolase fermentieren. Der für ihr Wachstum optimale pH-Wert liegt zwischen 6 und 7, und die für ihr Wachstum optimale Temperatur liegt zwischen 37 und 46°C.
Bifidobakterien sind Teil der normalen menschlichen Darmflora, und es werden ihnen zahlreiche, für die Gesundheit nutzbringende Effekte zugeschrieben. Insbesondere ist bekannt, dass Säuglinge, die gestillt werden und eine Darmflora besitzen, in der Bifidobakterien überwiegen, gegen Infektionen widerstandsfähiger sind und insbesondere ein geringeres Durchfallrisiko als Säuglinge aufweisen, die mit herkömmlichen industriellen Präparaten genährt werden.
Die Rolle der Bifidobakterien bei dieser erhöhten Widerstandsfähigkeit gegen Infektionen ist nicht vollständig geklärt. Verschiedene Studien deuten an, dass sie eine immunregulatorische bzw. immunmodulatorische Fähigkeit besitzen, was Polysaccharidsubstanzen implizieren würde, die mit der Bakterienwand zusammenhängen oder von den Bakterien im Verlauf der anaeroben Fermentation abgesondert werden. Gomez et al. (FEMS Microbiol. Lett., 1988, 56, 47-52) beschreiben den immunregulatorischen Effekt von polysaccharidreichen exozellulären Fraktionen, die von Bifidobacterium adolescentis produziert werden; die Patentanmeldung FR 2 652 590 beschreibt ein immunstimulierendes Exopolymer polysaccharidischer Art, das von einem Stamm des Kontinuums Bifidobacterium infantis longum produziert wird; Honoso et al. (Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61, 312-316 und Bioscience Microflora, 1998, 17, 97-104) beschreiben immunstimulierende Polysaccharide, die von verschiedenen Spezies von Bifidobacterium produziert werden. Die immunregulatorische Wirkung der Bifidobakterien zeigt sich auch in der Regulierung der Mikrodarmflora, insbesondere mit Hemmung der Entwicklung pathogener Bakterienspezies. Romond et al. (Anaerobe, 1997, 3, 137-143 und J. Dairy Sci., 1998, 81, 1229-1235) beschreiben etwa an Glycoproteinen reiche Fraktionen, die von Bifidobacterium breve unter anaeroben Fermentationsbedingungen produziert werden und in vivo einen Effekt zur Regulierung der Mikrodarmflora induzieren.
Es finden sich somit auf dem Markt zahlreiche Produkte, die mit Bifidobakterien fermentiert sind, gegebenenfalls in Verbindung mit anderen Lactobakterien, und deren Verzehr es ermöglicht, aus den immunregulatorischen Effekten von Bifidobakterien und ihren Fermentationsprodukten Nutzen zu ziehen.
Dennoch, und insbesondere im Sonderfall der Kindernahrung, besitzen diese den Nachteil, dass sie zu sauer sind und besonders im Falle von pulverförmigen Produkten wegen der Koagulation der Milchproteine aufgrund der bei der Fermentation entstandenen Säure nach der Rekonstituierung ein nicht-homogenes Aussehen besitzen. Sie werden daher von Kind und Mutter zuweilen schlecht akzeptiert.
Um diese Nachteile zu beheben, wurde bereits in der Internationalen Anmeldung WO 01/01785 ein Verfahren zur Herstellung eines immunstimulierenden Milchproduktes mittels Biokonversion eines Milchsubstrates, ohne Fermentierung und somit ohne Säuerung des Endproduktes, mittels Bifidobakterien, und insbesondere mittels des Stammes Bifidobacterium breve vorgeschlagen, der unter dem Budapester Vertrag am 31.05.1999 unter der Nr. I-2219 bei der vom Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, in Paris geführten CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) hinterlegt wurde.
Das in dieser Internationalen Anmeldung beschriebene Herstellungsverfahren ermöglicht jedoch nicht die Herstellung von anderen Nahrungsmittelprodukten als Milchprodukten und macht Bedingungen erforderlich, die unter einem industriellen Gesichtspunkt eine Einschränkung darstellen, insbesondere die Aufrechterhaltung von aeroben Kulturbedingungen, das Halten des Kulturmediums auf einem osmotischen Druck, der einer Wasseraktivität (AW) von 0,93 bis 0,97 entspricht, und/oder das Halten des Kulturmediums bei einer Temperatur zwischen 40 und 48°C.
Darüber hinaus stellen Bakterien der Gattung Bacteroïdes fragilis ca. 30 bis 50% der Flora dar, die beim Menschen in der Fäkalmaterie vorhanden ist. Ihre Ansiedelung ist überwiegend auf Höhe des Colons (10¹¹ Bakterien pro Gramm Kot). Im Falle einer anormalen Proliferation sind die Bakterien der Gattung Bacteroïdes fragilis jedoch für 80% der anaeroben bakteriellen Infektionen verantwortlich und werden aufgrund ihrer zunehmenden Resistenz gegen antibiotische Behandlungen immer häufiger. Ihre anormale Proliferation im Organismus kann folgendes hervorrufen:

– Bildungen von Abszessen (des Abdomens, des Gehirns, der Leber, des Beckens, der Lunge, der Milz),
– Sepsen,
– Durchfälle, hauptsächlich bei Kleinkindern,
– Endokarditen,
– Peritoniten,
– Pneumonien, insbesondere nekrotierende.

Bei fehlender Behandlung von Infektionen mit Bacteroïdes fragilis wurde eine Mortalitätsrate von 60% berichtet.
Es kann daher von Interesse sein, über ein Produkt zu verfügen, das es ermöglicht, die Proliferation von Bacteroïdes fragilis zu kontrollieren.
Die Erfinder haben daher den Gegenstand der Erfindung entwickelt, um die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Produkte insgesamt zu beheben und ein immunregulatorisches Produkt zur Verfügung zu stellen, das in jeglichen Typ von Nahrungsmittelprodukt eingebracht oder für die Herstellung von immunregulatorischen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden kann.
Die Erfinder haben sich ferner die Aufgabe gestellt, eine pharmazeutische Zusammensetzung oder Nahrungsmittelzusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die einen Effekt zur Regulierung der Mikrodarmflora besitzt, insbesondere für eine Hemmung der Entwicklung von pathogenen bakteriellen Spezies, besonders von Bacteroïdes fragilis.
Die vorliegende Erfindung hat daher zum ersten Gegenstand ein immunregulatorisches Produkt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es nach einem Herstellungsverfahren erhalten wird, das die folgenden Schritte umfasst:

- Beimpfen mit und Inkubieren von Bifidobacterium, das wenigstens den Stamm Bifidobacterium breve I-2219 umfasst, unter aeroben oder anaeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen ungefähr 30 und 40°C, in einem wässrigen Substrat mit einem pH zwischen 6 und 8 und das wenigstens die folgenden Bestandteile enthält:
i) ein Molkepermeat,
ii) ein Hydrolysat aus Molkeproteinen,
iii) Lactose, – Entfernen des Bifidobacteriums aus dem wässrigen Substrat; – Ultrafiltrieren des wässrigen Substrats mit Filtermembranen, die eine Ausschlussgrenze zwischen 100 und 300 kDa umfassen, zum Erhalt eines konzentrierten Retentats; – Dehydrieren des konzentrierten Retentats, vorzugsweise durch Lyophilisierung; – Lösen des dehydrierten Retentats in einem Puffer; – Gel-Permeations-Chromatographie der Retentatlösung in einer Säule, die eine Ausschlussgrenze von 600 kDa aufweist; – Gewinnen der Ausschlussfraktion am Ende der Chromatographie, die das immunregulatorische Produkt darstellt.

Die durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene Ausschlussfraktion besitzt immunregulatorische Eigenschaften; sie ermöglicht es insbesondere, die Proliferation von Bifidobacterium zu stimulieren und die Population von Bacteroïdes fragilis innerhalb der Darmflora zu verringern.
Gemäß der Erfindung kann das in der Zusammensetzung des wässrigen Substrats vorhandene Molkepermeat in Form eines Pulvers vorliegen, das durch Ultrafiltrieren von Molke nach dem Trocknen (durch Sprühen oder jegliche andere Trocknungsmethode) der entmineralisierten oder nicht entmineralisierten flüssigen Fraktion erhalten wird, welche beim Ultrafiltrieren der Molke die Membran durchquert.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Hydrolysate von Molkeproteinen können mit den üblichen Verfahren erhalten werden, die für die Herstellung von Hydrolysaten von Proteinen verwendet werden, insbesondere mittels enzymatischer Hydrolyse von Molkeproteinen mithilfe von Proteasen wie etwa Trypsin, Chymotrypsin usw. Zahlreiche Konzentrate bzw. Isolate von Serumproteinen, ebenso wie Hydrolysate von Molkeproteinen, die für die Anwendung der Erfindung in Frage kommen, sind an sich bekannt und im Handel verfügbar.
Vor seiner Verwendung wird das wässrige Substrat vorzugsweise mit Membranen wie z.B. mit Membranen aus Polyethersulfon mit einer Ausschlussgrenze von zwischen 100 und 300 kDa filtriert, woraufhin das Permeat bei einer Temperatur von ca. 120°C während ca. 30 min autoklaviert wird, um so jegliche unerwünschte bakterielle Kontaminierung des Kulturmediums zu vermeiden.
Vor der Verwendung kann der pH-Wert des wässrigen Substrats mithilfe eines jeglichen klassischen Alkalisierungsmittels, das vom Fachmann verwendet wird, wie z.B. Soda oder Pottasche, auf den gewünschten Wert eingestellt werden.
Die Bifidobacterium werden bevorzugt in einem Verhältnis von 1 × 10⁴ bis 4 × 10⁹ kolonienbildenden Einheiten (UFC) pro ml Substrat in das wässrige Substrat eingeimpft. Dieses Beimpfen kann beispielsweise durchgeführt werden, indem dem wässrigen Substrat angepasste Anteile eines tiefgekühlten Konzentrats von Bifidobacterium oder einer Vorkultur auf einem Medium, welches das Wachstum von Bifidobakterien ermöglicht, zugegeben werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der pH des wässrigen Substrats während der Gesamtdauer der Inkubation auf einem Wert zwischen ungefähr 6 und 8, und bevorzugter zwischen 6,5 und 7,5 gehalten. Das Halten des pH wird vorzugsweise mittels einer kontinuierlichen Neutralisierung des wässrigen Substrats mithilfe eines Alkalisierungsmittels gemäß der vorstehenden Beschreibung oder mit einer (vorzugsweise auf die Hälfte) verdünnten Ammoniaklösung durchgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Temperatur des Substrats für die Gesamtdauer der Inkubation, die im Allgemeinen zwischen 10 und 20 h beträgt, auf einem Wert zwischen ungefähr 37 und 40°C gehalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen die Bestandteile des wässrigen Substrats in den folgenden Mengen vor:

i) Molkepermeat: ungefähr 3 bis 80 g, und bevorzugter ungefähr 40 bis 60 g,
ii) Hydrolysat von Molkeproteinen: ungefähr 2 bis 80 g, und bevorzugter ungefähr 5 bis 15 g,
iii) Lactose: ungefähr 5 bis 50 g, und bevorzugter ungefähr 10 bis 30 g, wobei diese Mengen pro Liter wässriges Substrat angegeben werden.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann das wässrige Substrat ausserdem wenigstens einen zusätzlichen Bestandteil, ausgewählt aus Hefeextrakten, Puffersalzen und Cysteinchlorhydrat, umfassen.
Wenn das wässrige Substrat ein Puffersalz umfasst, ist dieses bevorzugt aus Natriumdihydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat ausgewählt und liegt vorzugsweise in einer Menge von ungefähr 0,5 bis 5 g und bevorzugter ungefähr 1,5 bis 3 g pro Liter des wässrigen Substrats vor.
Wenn das wässrige Substrat ein Hefeextrakt umfasst, liegt dieses vorzugsweise in einer Menge von ungefähr 0,5 bis 5 g, und bevorzugter von ungefähr 1,5 bis 3 g pro Liter des wässrigen Substrats vor.
Wenn das wässrige Substrat Cysteinchlorhydrat umfasst, liegt dieses in einer Menge von vorzugsweise ungefähr 100 bis 500 mg und bevorzugter ungefähr 200 bis 400 mg pro Liter des wässrigen Substrats vor.
Am Ende der Inkubationsperiode kann das Entfernen des Bifidobacteriums aus dem Kulturmedium beispielsweise durch Mikrofiltration oder durch Zentrifugation des wässrigen Substrats durchgeführt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Entfernen des Bifidobacteriums aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation des wässrigen Substrats, beispielsweise mit einer Geschwindigkeit von 3000 g, während einer Zeitdauer von ungefähr 1 h durchgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren ausserdem nach dem Schritt des Entfernens des Bifidobacteriums einen zusätzlichen Schritt des Zerstörens der nach dem Inkubieren im wässrigen Substrat vorhandenen enzymatischen Restaktivität, beispielsweise durch eine Wärmebehandlung des wässrigen Substrats bei einer Temperatur von ungefähr 75°C während ca. 3 min.
Der Schritt des Ultrafiltrierens des wässrigen Substrats wird vorzugsweise mit Membranen aus Polyethersulfon bei einer Temperatur von weniger als ungefähr 60°C durchgeführt.
Am Ende des Ultrafiltrationsschrittes wird das auf diese Weise erhaltene konzentrierte Retentat vorzugsweise mehrere Male gewaschen, beispielsweise mit im Ionenaustauscher behandeltem Wasser, bevor es endgültig aufkonzentriert wird, bevor es, beispielsweise durch Lyophilisierung, dehydriert wird.
Der zum Lösen des dehydrierten Retentats verwendete Puffer ist vorzugsweise aus Puffern mit einem pH von zwischen 6 und 8 ausgewählt, wie beispielsweise Tris-Puffer, der durch Zugabe von Salzsäure auf den gewünschten pH eingestellt ist.
Die Art der Gele, die für die Durchführung der Ausschlusschromatographie verwendbar sind, ist nicht von entscheidender Wichtigkeit, solange sie eine Ausschlussgrenze von 600 kDa aufweisen. Als Gel sind insbesondere aus Dextran und vernetzter Agarose zusammengesetzte Gele verwendbar, wie etwa das von der Fa. Amersham Biosciences unter der Handelsbezeichnung Superdex^® 200 vertriebene Produkt.
Nach Beendigung der Chromatographie kann die gewonnene Ausschlussfraktion dann gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend gegebenenfalls so verdünnt werden, dass wieder die anfängliche Konzentration der Ausschlussfraktion hergestellt wird.
Die Ausschlussfraktion, die das immunregulatorische Produkt darstellt, kann schließlich unmittelbar verwendet oder für die Aufbewahrung und nachfolgende Verwendung tiefgekühlt oder lyophilisiert werden.
Diese Ausschlussfraktion besteht im Wesentlichen aus einem Komplex von Polysacchariden und Proteinen, in dem die kohlenhydrathaltige Fraktion ungefähr 5 bis 30 Gewichtsprozent und die Proteinfraktion ungefähr 70 bis 95 Gewichtsprozent im Verhältnis zum Gesamtgewicht des Komplexes darstellt.
Gemäß der Erfindung weist die kohlenhydrathaltige Fraktion der Ausschlussfraktion die folgende Zusammensetzung an Monosacchariden auf (ausgedrückt in molaren Verhältnissen im Verhältnis zur Rhamnose): Galactose: 5,5 bis 8; Mannose: 0,8 bis 1,3; Glucose: 2,5 bis 5; N-Acetylgalactosamin: 0,3 bis 1; N-Acetylglucosamin: 0,07 bis 0,3; Neuraminsäure 0 bis 0,15, und Rhamnose: 1.
Gemäß der Erfindung kann die Proteinfraktion der Ausschlussfraktion wenigstens ein durch Trypsinhydrolyse erhaltenes Peptid umfassen, das wenigstens einer der folgenden Sequenzen entspricht:

– RELGIGTPSFLHNGGQWYIYA (SEQ ID Nr. 1)
– RVLYNPGQYXYVR (SEQ ID Nr. 2)
– EQATANGQVSSGQQSTGGSAAP (SEQ ID Nr. 3)

Die Erfindung hat ferner das gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene immunregulatorische Produkt als Medikament, und insbesondere als immunregulatorisches Medikament, zum Gegenstand.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als aktiven Bestandteil wenigstens ein gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenes immunregulatorisches Produkt und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließt.
Unter pharmazeutisch verträglich ist ein jeglicher Träger zu verstehen, der es unter Bewahrung seiner Eigenschaften, insbesondere seiner immunregulatorischen Eigenschaften, in dem gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten immunregulatorischen Produkt ermöglicht, das Produkt zu transportieren.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in jeglicher gewünschten galenischen Form für eine Verabreichung auf oralem Wege an Mensch oder Tier vorliegen, wie beispielsweise in flüssiger Form für einen Sirup oder eine Lösung, ein Spray, oder in fester Form wie beispielsweise ein Pulver, eine Tablette, eine Gelatinekapsel, eine Kapsel, ein Pulverspray, in ihren verschiedenen Formen mit unmittelbarer oder gesteuerter Freisetzung, ein Gummi, eine Paste, ein Granulat, oder in jeglicher anderen Form, die für die Verabreichung auf oralem Wege geeignet ist.
Das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte immunregulatorische Produkt kann auch als Bestandteil in Nahrungsmittelzusammensetzungen eingebracht sein.
Von daher hat die Erfindung auch eine Nahrungsmittelzusammensetzung zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als Bestandteil wenigstens ein gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes immunregulatorisches Produkt umschließt.
Solche Nahrungsmittelzusammensetzungen können für die menschliche oder tierische Nahrung bestimmt sein und können insbesondere in Form eines milchhaltigen oder nicht milchhaltigen, fermentierten oder nicht fermentierten Präparates tierischen oder pflanzlicher Herkunft vorliegen, darunter insbesondere Babynahrung oder für Erwachsene und Senioren, und insbesondere in Form eines milchhaltigen Milchpräparates für Kinder, von Milch in flüssiger Form oder Pulverform, von Frischprodukten, von Cerealien, von Keksen (Trockenfutter), von Snacks, von Desserts usw., oder auch in Form von Nahrungsmittel- oder Diätprodukten für Erwachsene, darunter Krankenhausprodukten, oder Nahrungsergänzungsmitteln.
Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung ergibt sich durch die nachfolgende Beschreibung unter Bezugnahme auf Beispiele für die Herstellung des erfindungsgemäßen immunregulatorischen Produktes, sowie auf die beigefügten Figuren, in denen:
1 das Chromatogramm darstellt, das nach Einbringung eines während 15 h durch den Stamm Bifidobacterium breve CNCM I-2219 fermentierten Kulturmediums auf eine mit einem Superdex^®200-Gel beladene Säule erhalten wird (Absorptionskoeffizient in Millivolt als Funktion der verstrichenen Zeit in Minuten);
2 die Chromatogramme vergleicht, die nach Einbringung eines durch den Stamm Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 oder durch den Stamm B. breve CFPL (Collection de la Faculté de Pharmacie de Lille) C7 fermentierten Kulturmediums auf eine mit einem Superdex^®200-Gel beladene Säule erhalten werden (Absorptionskoeffizient in Millivolt als Funktion der verstrichenen Zeit in Minuten);
3 eine Vergrößerung von 2 darstellt.
BEISPIEL 1: HERSTELLUNG EINES DURCH KULTIVIEREN VON BIFIDOBACTERIUM ERHALTENEN IMMUNREGULATORISCHEN PRODUKTES
Es wird ein Kulturmedium bereitet, das die folgenden Bestandteile enthält:

– 50 g/l Molkepermeat,
– 10 g/l Hydrolysat von Molkeproteinen,
– 20 g/l Lactose,
– 2 g/l d'Hefeextrakt,
– 2,5 g/l Kaliumdihydrogenphosphat,
– 0,3 g/l Cysteinchlorhydrat.

Das Kulturmedium wird mit Centramate^®-Kassetten ultrafiltriert, die von der Fa. PALL vertrieben werden und mit Polyethersulfon-Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 200 kDa ausgerüstet sind, und das Permeat wird während 30 min bei 120°C autoklaviert. Der pH des Kulturmediums wird daraufhin mithilfe einer auf ein Viertel verdünnten Ammoniaklösung auf einen Wert von 6,5 eingestellt.
Das Kulturmedium wird anschließend mit Bifidobakterien in einem Verhältnis von 6 ‰(v/v) eines tiefgekühlten Konzentrates des Stammes Bifidobacterium breve CNCM I-2219 beimpft, das 5 × 10¹⁰ UFC Bifidobakterien pro ml tiefgekühltes Konzentrat enthält. Die anfängliche Bakterienpopulation beträgt 3 × 10⁸ UFC Bifidobakterien pro ml Kulturmedium. Die Bifidobakterien werden in Anaerobiose bei einer Temperatur zwischen 37 und 40°C kultiviert. Während der Kultur wird der pH des Kulturmediums mittels einer auf ein Viertel verdünnten Ammoniaklösung auf 6,5 reguliert. Die Kultivierungszeit beträgt 15 h, und die Population von Bifidobacterium am Ende der Kultur beträgt ungefähr 2 × 10⁷ UFC pro ml Kulturmedium.
Am Ende der Kultur werden die Bakterien durch Zentrifugieren während 1 h bei 3000 g aus dem fermentierten Kulturmedium entfernt. Die im Überstand der Zentrifugation enthaltenen enzymatischen Restaktivitäten werden durch eine Wärmebehandlung von 3 min bei 75°C zerstört.
Der Überstand wird mit Centramate^®-Kassetten, die von der Fa. PALL vertrieben werden und mit Polyethersulfon-Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 300 kDa ausgerüstet sind, bei einer Temperatur von ungefähr 40°C ultrafiltriert. Es wird dann 3-mal konzentriert, daraufhin 3-mal mit im Ionenaustauscher behandeltem Wasser gewaschen. Während der letzten Waschung wird eine Konzentration des 7-fachen des von der Membran zurückgehaltenen Teils hergestellt. Dadurch wird ein als Retentat bezeichnetes Konzentrat erhalten. Das Retentat wird durch Lyophilisierung dehydriert und daraufhin in einem Tris-Puffer-NaCl à pH 8 aufgenommen.
1) Untersuchung der Zusammensetzung des erhaltenen Retentats
Die Zusammensetzung des Retentats wird mittels Ausschlusschromatographie untersucht.
Hierzu werden 25 μl Retentat mit einer Flussrate von 0,6 ml pro Minute in eine Säule mit Superdex^®200-Gel eingebracht, die von der Fa. Amersham Biosciences vertrieben wird und eine Ausschlussgrenze von 600 kDa aufweist, gekoppelt mit einem UV-Detektor mit einer Diodenanordnung (200-300 nm). Die Integration des Signals wird mithilfe der Software KromaSystem^® 2000 durchgeführt, die von der Fa. Kontron Instruments vertrieben wird. Zwei Fraktionen werden dadurch abgetrennt: eine Ausschlussfraktion des Gels wird nach 12,5 min ab der Einbringung eluiert, und eine filtrierte Fraktion wird von 16 bis 32 min ab der Einbringung eluiert.
Die an dem Retentat nach 15 h Fermentation erhaltenen Ergebnisse sind in der beigefügten 1 abgetragen, die den Absorptionskoeffizienten (in Millivolt) als Funktion der verstrichenen Zeit (in Minuten) ab der Einbringung des Retentats auf der Säule darstellt. Diese Ergebnisse stellen ein typisches Chromatogramm dar, welches die Ausschlussfraktion und die filtrierte Fraktion des auf diese Weise analysierten Retentats zeigt.
Die 2 und 3 stellen die Chromatogramme dar, die nach Analyse eines Retentats durchgeführt wurden, das von einer Kultur gemäß der vorstehenden Beschreibung stammt, und eines Retentats, das von einer Kultur stammt, die unter den gleichen Bedingungen, jedoch mit einem unterschiedlichen Stamm von Bifidobakterien (B. breve CFPL C7) durchgeführt wurden.
2 stellt den Absorptionskoeffizienten (in Millivolt) als Funktion der verstrichenen Zeit (in Minuten) ab der Einbringung von Retentaten auf die Säule dar, die den zwei Kulturen entsprechen, die jeweils mit dem Stamm B. breve CNCM I-2219 und mit dem Stamm B. breve CFPL C7 durchgeführt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass anders als bei dem Retentat der Kultur, die mit dem Stamm von B. breve CNCM I-2219 durchgeführt wurde, das Chromatogramm des Retentates der mit dem Stamm von B. breve CFPL C7 durchgeführten Kultur keine der Ausschlussfraktion und der filtrierten Fraktion des Retentats entsprechende Spitze aufweist. 3 wiederum stellt eine Vergrößerung von 2 dar, die zeigt, dass es nötig ist, den Maßstab des Absorptionskoeffizienten von 2 beträchtlich zu vergrößern, damit die Ausschlussfraktion und die filtrierte Fraktion des Retentats erscheinen, welche der mit dem Stamm B. breve CFPL C7 durchgeführten Kultur entsprechen. Diese Ergebnisse zeigen also, dass der Stamm B. breve CFPL C7 nicht das Potential für die Produktion von Wirkstoffen besitzt, das der Stamm B. breve CNCMI-2219 darstellt.
2) Bereitung der Ausschlussfraktion des Retentats
Das konzentrierte Retentat, das vorausgehend in einem Tris-NaCl-Puffer pH 8 aufgenommen wurde, wird einer präparativen Chromatographie unterzogen. Die Separation wird durch Chromatographie auf einer Säule mit Superdez^®200-Gel durchgeführt, die von der Fa. Amersham Biosciences vertrieben wird, mit einem Durchmesser von 50 mm und einer Höhe von 100 cm, die mit einer Flussrate von 5 ml pro Minute versorgt wird und eine Ausschlussgrenze von 600 kDa besitzt. Die Fraktionen werden zu jeweils 10 ml gesammelt, und ihr Absorptionskoeffizient wird bei 280 nm gemessen.
Es werden somit zwei Fraktionen abgetrennt:

– eine Ausschlussfraktion des Gels mit einem Molekulargewicht von über 600 kDa (Rückhaltezeit 130 bis 180 min +/–10%),
– eine filtrierte Fraktion mit einem Molekulargewicht von zwischen 200 und 600 kDa (Rückhaltezeit 187 bis 370 min +/–10%).

Die Ausschlussfraktion bzw. der aktive Teil wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und daraufhin so verdünnt, dass die Konzentration des Retentats wieder erreicht wird. Diese Fraktion kann anschließend in tiefgekühlter oder lyophilisierter Form konserviert werden. Die filtrierte Fraktion kann auch auf die gleiche Weise konserviert werden.
BEISPIEL 2: ANALYSE DER KOHLEHYDRAT- UND PROTEIN-ZUSAMMENSETZUNG DES AUS EINER BIFIDOBACTERIUM-KULTUR BEREITETEN AKTIVEN TEILS (AUSSCHLUSSFRAKTION)
1) Analyse der Kohlehydratzusammensetzung des aktiven Teils
Das lyophilisierte Pulver der Ausschlussfraktion, wie es vorstehend in Beispiel 1 (10 mg) bereitet wurde, wird in reinem wasserfreien Hydrazin (200-300 Mikroliter) aufgenommen. Die Mischung wird über Nacht bei 110°C inkubiert, unter Stickstofffluss getrocknet, und in 1 ml Wasser aufgenommen. Die Lösung wird anschließend mittels Gelpermeation über eine Fractogel TSK-Säule fraktioniert, die unter der Bezeichnung HW40 von der Fa. Merck vertrieben wird, und das Eluieren wird in Wasser durchgeführt. Das Vorhandensein von Zuckern in den verschiedenen aufgefangenen Fraktionen wird mit dem Orcinolverfahren und mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse (nicht dargestellt) zeigen, dass sich die Mehrheit der Zucker in der Fraktion befindet, die nicht auf dem Gel zurückgehalten wird (> 10 kDa) und nach Dünnschichtchromatographie nur wenig abwandert. Der Kohlehydratanteil der Ausschlussfraktion stellt somit ein Polysaccharid mit einer molaren Masse von mehr als 10 kDa dar. Der Kohlehydratanteil der Ausschlussfraktion stellt ungefähr 15 bis 20% (Masse) von dieser dar.
Die molare Zusammensetzung der kohlenhydrathaltigen Fraktion des aktiven Teils wird mittels Gasphasenchromatographie nach Methanolyse mithilfe einer Mischung aus 0,5 M Salzsäure und Methanol während 24 h bei 80°C bestimmt.
Es werden zwei Proben der Ausschlussfraktion (Proben 1 und 2 CNCM I-2219: E1 bzw. E2) analysiert, die aus zwei unterschiedlichen Versuchen stammen, welche gemäß Beispiel 1 durchgeführt wurden.
Zum Vergleich wurden die gleichen Analysen an einer Probe durchgeführt, in der der Stamm Bifidobacterium breve CNCM I-2219 durch den unter den gleichen Bedingungen kultivierten Stamm Bifidobacterium breve CFPL C7 (Probe C7) ersetzt war, sowie an einer Probe, in der der Stamm Bifidobacterium breve CNCMI-2219 auf einem nicht erfindungsgemäßen Lactosemedium (Lactosemedium-Probe: ML) kultiviert worden war, mit der folgenden Zusammensetzung:

– 60 g/l Lactose,
– 2 g/l d'Hefeextrakt,
– 0,3 g/l Cysteinchlorhydrat.

Die darauf folgenden Extraktions- und Reinigungsschritte waren hierbei in allen Punkten den vorstehend beschriebenen vergleichbar.

Die für die Ausschlussfraktion dieser verschiedenen Proben erhaltenen molaren Verhältnisse an gegebenen Monosacchariden (ausgedrückt im Verhältnis zur Rhamnose) sind in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführt: TABELLE I

	E1	E2	C7*	ML*
Galactose	6,50	7,60	2,00	3,80
Mannose	0,92	1,10	2,70	6,20
Glucose	3,20	4,30	3,50	2,70
N-Acetylgalactosamin	0,80	0,47	1,00	0,10
N-Acetylglucosamin	0,17	0,10	0,38	0,10
Neuraminsäure	0,08	–	0,49	–
Rhamnose	1,00	1,00	0	1,00
*: nicht zur Erfindung gehörende Vergleichsprobe

In der Probe C7, in welcher der Stamm Bifidobacterium breve CNCM I-2219 durch den Stamm Bifidobacterium breve CFPL C7 ersetzt war, ist die Abwesenheit von Rhamnose festzustellen. Es ist ferner festzustellen, dass die Verteilung der Zucker zwischen den Proben E1 und E2 von derjenigen der Probe ML verschieden ist, welche dem auf einem nicht erfindungsgemäßen Lactosemedium kultivierten Stamm Bifidobacterium breve CNCM I-2219 entspricht. Insbesondere enthalten die Proben E1 und E2 mehr Galactose und N-Acetylgalactosamin als die Probe ML und weniger Mannose als die Probe ML.
2) Analyse der Proteinzusammensetzung des aktiven Teils
Die Proteinfraktion des aktiven Teils stellt ungefähr 80 bis 85% (Masse) von diesem dar.
Die Sequenzanalyse des Proteinanteils des aktiven Teils wird nach einem Proteolyseschritt mithilfe einer 1%-igen Trypsinlösung in einem 0,1 M Tris-Puffer mit pH 8,5 gemäß der Beschreibung in dem Artikel Rosenfeld J. et al., Analytical Biochemistry, 1992, 203, 173-179, durchgeführt.
Die Peptide werden durch Umkehrphasen-HPLC über eine Säule Ultrasphere^® ODS (Octadecylsilan) mit einem Durchmesser von 2 mm und einer Länge von 200 mm gereinigt, die von der Fa. Beckmann vertrieben wird. Das Eluieren wird mit einem linearen Acetonitrilgradienten in einer 0,1%-igen Lösung von Trifluoressigsäure durchgeführt.
Die isolierten Peptide werden (gemäß dem in dem vorgenannten Artikel von Rosenfeld J. et al. beschriebenen Verfahren) auf einem Gerät mit der Bezeichnung Procise 492, das von der Fa. Perkin-Elmer vertrieben wird, sequenziert.
Die Sequenzen werden anschließend unter Verwendung des Programms BLAST 2.2 (Basic Local Alignment Search Tool) von NCBI (National Center for Biotechnology Information) mit denen verglichen, die in den folgenden Datenbanken enthalten sind: GenBank CDS translation, PDB (Protein Data Bank), SwissProt, PIR (Protein Information Resource), PRF (Protein Research Foundation).
Diese Analyse ermöglichte den Nachweis, dass die Proteinfraktion des aktiven Teils mehrheitlich aus Peptiden des milchhaltigen Mediums (Lactoferrin, Beta-Lactoglobulin, Serumalbumin ...) besteht, einem Teil, der eine gute Homologie (mindestens 60%) mit einer Proteinsequenz von Bifidobacterium longum (RELGIGTPSFLHNGGQWYIYA (SEQ ID Nr. 1) aufweist, und einem Teil, für den keine signifikante Homologie mit bekannten Sequenzen bestimmt werden konnte und der die folgenden Sequenzen aufwies:

– RVLYNPGQYXYVR (SEQ ID Nr. 2)
– EQATANGQVSSGQQSTGGSAAP (SEQ ID Nr. 3)

BEISPIEL 3: UNTERSUCHUNG DER IMMUNREGULATORISCHEN AKTIVITÄT DER AUSSCHLUSSFRAKTION DES RETENTATS
1) Auswirkung der Ausschlussfraktion auf die Darmflora von Mäusen
Es wurde die Auswirkung der gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren in Beispiel 1 erhaltenen Ausschlussfraktion (aktiver Teil) auf die Entwicklung der Darmflora von Mäusen untersucht.
Der Test wurde an männlichen C3H Mäusen durchgeführt, bei denen es sich um Mäuse der zweiten Generation einer Linie von axenischen Tieren handelt, denen eine Darmflora von erwachsenen Menschen implantiert worden war (vom CDTA, Centre de Distribution, Typage & Archivage animal, CNRS, Orléans, Frankreich stammend).
Die Mäuse werden in Isolierbehältern gehalten, um jegliche Modifikation ihrer neuen Darmflora zu vermeiden. Bei ihrem Empfang sind die Mäuse 8-10 Wochen alt. Nach dem Empfang wird den Mäusen eine Anpassungszeit von mindestens 2 Wochen gewährt, um jeglichen Stress infolge des Transports abzubauen, und damit sie sich an ihre neue Umgebung gewöhnen.
Während dieser gesamten Anpassungszeit und bis zum Beginn des Experiments erhalten diese Mäuse steriles Wasser als Getränk.
Während der gesamten Zeitdauer des Experiments ist das als Nahrungsbasis verwendete Futter eine Standarddiät von RO3-Granulat, das von der Fa. UAR vertrieben wird, durch Bestrahlung sterilisiert, mit einem Gehalt von 25% Proteinen, 49,8% Kohlehydraten, 5% Lipiden und 4% Cellulose.
Während der 21 Versuchstage wird das Wasser der Saugfläschchen durch die verschiedenen zu testenden Produkte, d.h. die filtrierte Fraktion, und die Ausschlussfraktion in einem Verhältnis von 6 ml pro Tag und pro Maus ersetzt. Ein tägliches Auswechseln der Saugfläschchen wird durchgeführt, um jegliche Modifikation der Zusammensetzung der zu testenden Produkte infolge einer bakteriellen Proliferation zu vermeiden. Kot wird für die Analyse vor der Behandlung (T0), daraufhin am 7., am 15. und am 21. Tag während der Verabreichung des Produktes (T7, T15 und T21) gesammelt.
Jedes Produkt wird an einer Gruppe von mindestens 6 Mäusen getestet, und die Entwicklung der Bakterien Bifidobacterium und Bacteroïdes fragilis in der Darmflora der Mäuse wird verfolgt.
Die Kotproben werden in sterilen Hämolyseröhrchen genommen und aseptisch gewogen, daraufhin in auf ein Viertel verdünnter Ringer-Lösung verdünnt und mit Cysteinchlorhydrat (0,3 g/l) aufgefüllt, so dass zehnfache Verdünnungen in einem Bereich von 10^–1 bis 10^–4 erhalten wurden. Der Inhalt wird schließlich in einem Verhältnis von 100 μl pro Schale auf unterschiedliche Kulturmedien aufgebracht, die in Petrischalen enthalten sind:

– Beerens-Medium (Be) (zusammengesetzt aus 35 g/l Gelosebasis Columbia, 5 g/l Glucose, 0,3 g/l Cysteinchlorhydrat, 0,5% Propionsäure und auf pH 5 eingestellt) für die Suche und Zählung von Bifidobacterium nach dem Ausbreiten von Verdünnungen in dem Bereich von 10^–1 bis 10^–4;
– Bacteroides Bile-Esculine (BBE)-Medium (zusammengesetzt aus 37 g/l Trypton, 32 g/l Bile-Esculin-Agar (DIFCO), 0,5 g/l Esculin, 0,5 g/l ammoniakalischem Eisencitrat, 0,2% einer Heminlösung à 5 mg/ml, 0,25% einer Gentamicinlösung von 40 mg/ml und 10 g/l Agar; auf pH 7 eingestellt und 15 min bei 120°C autoklaviert) für die Suche und Zählung von Bacteroïdes fragilis nach dem Ausbreiten von Verdünnungen in einem Bereich von 10^–1 bis 10^–3.

Das Ausbreiten wird mithilfe von sterilen Glaskügelchen auf den angegebenen Medien durchgeführt, und die Auswertung der Medien wird nach 5-7 Tagen Inkubation in Anaerobiose bei 37°C durchgeführt.
Die Identifizierung der Bakterien wird einerseits nach Beschreibung der auf jedem der Medien erhaltenen Kolonien und andererseits mithilfe einer Gram-Färbung durchgeführt.

Die Ergebnisse bezüglich der Entwicklung von Bifidobacterium und von Bacteroïdes fragilis im Kot der Mäuse sind jeweils in den nachfolgenden Tabellen II und III aufgeführt: TABELLE II

Bifidobacterium
	T0	T7	T15	T21
Filtrierte Fraktion	3,8 ± 0,5 (9)	4,3 ± 0,55 (11)	4,75 ± 1,15 (9)*	nd
Filtrierte Fraktion	n = 18	n = 18	n = 18	–
Ausschlussfraktion	4,02 ± 0,74 (8)	4,54 ± 1,0 (11)	4,56 ± 0,36 (12)*	4,76 ± 0,27 (6)*
Ausschlussfraktion	n = 18	n = 18	n = 12	n = 6
nd: nicht bestimmbar, *: p < 0,025

TABELLE III

Bacteroïdes fragilis
	T0	T7	T15	T21
Filtrierte Fraktion	4,4 ± 0,7 (15)	4,4 ± 0,5 (12)	4,3 ± 0,7 (12)	4,1 ± 0,9 (7)
Filtrierte Fraktion	n = 18	n = 18	n = 18	n = 12
Ausschlussfraktion	4,28 ± 0,35 (18)	3,99 ± 0,37(8)	3,74 ± 0,28 (9)	3,2 ± 0,16 (4)**
Ausschlussfraktion	n = 18	n = 18	n = 12	n = 6
nd: nicht bestimmbar, : p < 0,025; *p < 0,05

In diesen Tabellen sind die erhaltenen Ergebnisse als Durchschnitt und Standardabweichung des Log der Anzahl von UFC/g Kot ausgedrückt, und n ist die Anzahl von Mäusen, die für jedes Produkt und jeden Testtag (Rangvergleich mittels Wilcoxon-Test für gepaarte Proben) verwendet wurden; die Asterisken zeigen die signifikanten Ergebnisse bezogen auf den Zeitpunkt T0 an. In diesen Tabellen entspricht die in Klammern angegebene Zahl der Anzahl von Mäusen, bei denen das betreffende Bakterium über dem Erfassungsschwellwert vorhanden ist. Die dem nicht beimpften Medium entsprechenden Ergebnisse sind ähnlich dem an T0 erhaltenen Wert und bleiben über den Zeitverlauf während der 21 Tage des Experimentes konstant (Ergebnisse in den Tabellen nicht dargestellt).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verabreichung einer beliebigen der beiden Fraktionen (Ausschluss oder filtriert) effektiv zu einer Proliferation von Bifidobacterium führt, dass jedoch einzig die Ausschlussfraktion wirksam ist, um eine Verringerung der Population an Bacteroïdes fragilis in der Darmflora der Mäuse hervorzurufen.
2) Auswirkung der Ausschlussfraktion auf die Regulierung der intestinalen Translokation der Mikroorganismen
Die Messung der intestinalen Translokation der Mikroorganismen bei den Mäusen wird an den männlichen Mäusen der Linie C3H mit Flora von erwachsenen Menschen (Aufzucht am CDTA-CNRS, Orléans, France) vorgenommen. Während der gesamten Anpassungsperiode und bis zum Beginn des Experimentes erhalten diese Mäuse steriles Wasser als Getränk.
Während der gesamten Zeitdauer des Experimentes werden die Mäuse mit RO3-Granulat ernährt, das mittels Bestrahlung sterilisiert war.
Im Alter von 10-12 Wochen, bei Beginn des Experimentes, werden drei Gruppen erstellt: eine Gruppe von Mäusen, die während der Gesamtdauer des Experimentes die Ausschlussfraktion der Metaboliten von Bifidobacterium breve CNCM I-2219 anstelle des Wassers der Saugfläschchen in einem Verhältnis von 8-10 ml pro Tag und pro Maus erhält, während zwei andere Gruppen von 12 und 23 Mäusen die filtrierte Fraktion erhalten bzw. weiterhin steriles Wasser (Kontrollgruppe) erhalten.
Am 21. Tag wird eine Entnahme von Kot gemäß der vorausgegangenen Beschreibung durchgeführt, und die Mäuse werden für die Durchführung einer bakteriologischen Untersuchung geopfert.
Zwei Arten von Daten werden ausgehend von der Analyse der Organe der geopferten Mäuse erhalten:

– die Translokation nach Zielorgan, d.h. die Bewertung der Anzahl von Mäusen mit einem kontaminierten Zielorgan und des Prozentanteils der Population, die eine Kontaminierung des Zielorgans aufweist.
– die bakterielle Dissemination, d.h. die Intensität der bakteriellen Dissemination, dargestellt durch die Anzahl von positiven Organen sowie die Anzahl von Mäusen und den Prozentanteil der Population, die eine Dissemination mit einer gegebenen Intensität aufweist.

Für die Entnahme der zu analysierenden Organe wird das Tier aus dem Isolierbehälter herausgenommen, unter aseptischen Bedingungen unter eine Abzugshaube mit laminarer Strömung verbracht, und durch Inhalation von Chloroform geopfert.
Die Haut wird mit Alkohol 70° dekontaminiert, daraufhin werden bei allen Mäusen die Organe auf aseptische Weise in der folgenden Reihenfolge entnommen: Herzblut, Lunge, Leber, Milz und Niere. Nach der Bewertung seines Gewichtes wird eine Fraktion von jedem Organ in 9 ml einer Ringer-Lösung (auf ein Viertel verdünnt, mit Cysteinchlorhydrat (0,3 g/l) aufgefüllt und in kochendem Wasser während 15 min regeneriert) suspendiert. Die Organe werden anschließend mithilfe einer sterilen Einweg-Pasteurpipette "Pastette^®", die von der Fa. VWR vertrieben wird, oder "Liquipette^®", die von der Fa. Gosselin vertrieben wird, zerkleinert. Anschließend werden 100 μl der Stammsuspension und der darauf folgenden dezimalen Verdünnung mithilfe von steri len Glaskügelchen auf Gelose Columbia (von der Fa. Beckton-Dickinson vertrieben) ausgebreitet, mit Glucose (5 g/l), Cysteinchlorhydrat (0,3 g/l) und Pferdeblut (5% v/v, vertrieben von der Fa. Eurobio) aufgefüllt. Nach einer Inkubation in Anaerobiose während 7 Tagen bei 37°C wird die Zählung von jedem Typ von Kolonien durchgeführt, woraufhin die Morphologie der Bakterien nach einer Gram-Färbung bestimmt wird.

Die hinsichtlich der Analyse der Translokation nach Zielorgan erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV aufgeführt: TABELLE IV

Zielorgan	Kontrollgruppe	Ausschlussfraktion	Filtrierte Fraktion	P^c
Niere	12^a (52,2)^b	8 (66,7)	7 (38,9)	NS
Milz	13 (56,5)	9 (75,0)	3 (16,7)*	P < 0,01
Leber	10 (43,5)	8 (66,7)	5 (27,8)	NS
Lunge	11 (47,8)	7 (58,3)	2 (11,1)*	P < 0,02
^a = Anzahl von Mäusen mit kontaminiertem Zielorgan ^b = Prozentanteil der Population, die eine Kontaminierung des Zielorgans aufweist ^c = Vergleich der Gruppen, die eines der Produkte eingenommen haben, bezogen auf die Kontrollgruppe mit dem exakten Test nach Fisher.

Die Gruppe, die eine beträchtliche Differenz aufweist, ist mit einem Asterisken * gekennzeichnet.
Die derart erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Milz und die Lunge in der Population, bei der das Trinkwasser mit der Ausschlussfraktion ersetzt war, weniger häufig kontaminiert sind als in der Kontrollpopulation von Mäusen, die Wasser als Getränk erhielten.
Darüber hinaus lassen diese Ergebnisse erkennen, dass die filtrierte Fraktion ohne Auswirkung auf die Regulierung der bakteriellen Translokation ist.

Die hinsichtlich der bakteriellen Dissemination erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle V aufgeführt: TABELLE V

Intensität der Dissemination	Kontrollgruppe	Filtrierte Fraktion	Ausschlussfraktion	p^d
Gering (0-1)^a	8^b (35)^c	3 (25)	12 (66,7)*	P < 0,043
Mittel (2)	4 (17)	1 (8,3)	5 (27,8)	NS
Hoch (3-4)	11 (48)	8 (66,7)	1 (5,5)*	P < 0,004
^a = Intensität der bakteriellen Dissemination, dargestellt durch die Anzahl von positiven Organen (in Klammern), ^b = Anzahl von Mäusen, die eine Dissemination einer gegebenen Intensität aufweisen, ^c = Prozentanteil der Population, die eine Dissemination einer gegebenen Intensität aufweist, ^d = Vergleich der Gruppen, die eines der Produkte aufgenommen haben, bezogen auf die Kontrollgruppe mit dem exakten Test nach Fisher. Die Gruppe, die eine beträchtliche Differenz aufweist, ist mit einem Asterisken * gekennzeichnet.

Die Anzahl von Mäusen, die weniger als ein kontaminiertes Organ aufweisen (geringe Intensität der Dissemination), ist in der Population, bei der das Trinkwasser durch die Ausschlussfraktion substituiert war, größer als in der Kontrollpopulation von Mäusen, die als Getränk Wasser erhalten hatten.
Ausserdem ist die Anzahl von Mäusen, die wenigstens drei kontaminierte Organe aufwiesen (hohe Intensität der Dissemination), in der Kontrollpopulation von Mausen, die als Getränk Wasser erhalten hatten, geringer als als in der Population, bei der das Trinkwasser durch die Ausschlussfraktion substituiert war.
Es ist daher festzustellen, dass die Dissemination der Bakterien bei den Mäusen, die Trinkwasser ergänzt mit der Ausschlussfraktion erhalten hatten, weniger intensiv ist.
In diesem Fall ist die Regulierung der bakteriellen Translokation effektiver.
3) Auswirkung der Ausschlussfraktion auf die Expression von Galectin-1 und -3
Die Messung der Expression von Galectin-1 und -3 wird an den vorstehend beschriebenen Mäusen mit der Flora erwachsener Menschen vorgenommen.
Im Alter von 12-14 Wochen, bei Beginn des Experimentes, werden zwei Gruppen von Mäusen gebildet: eine Gruppe von Mäusen, die während der Gesamtdauer des Experimentes die Ausschlussfraktion, welche die Metaboliten von Bifidobacterium breve CNCM I-2219 enthält, anstelle des Wassers der Saugfläschchen in einem Verhältnis von 10 ml pro Tag und pro Maus erhält, während eine andere Gruppe von Mäusen weiterhin Wasser erhält (Kontrollgruppe).
Am 7., 15. und 21. Tag wird eine Gruppe von Mäusen geopfert, um eine biologische Untersuchung zur Expression von Galectin-1 und -3 durchzuführen, bewertet durch das Assay von mRNA, das für diese Galectine durch quantitative RT-PCR (Polymerase Chain Reaction) codiert. Die an den Mäusen der Kontrollgruppe entnommenen Organe, die am 7., 15. und 21. Tag geopfert wurden, wurden nach Organen zusammengefasst, um einen Pool zu bilden, der für die Gesamtdauer des Experimentes als Kontrolle dient.
Die Modifikation der Expression von Galectin-1 und -3 in den überprüften Organen stellt einen Indikator für die Auswirkung der von dem Stamm von Bifidobacterium breve CNCM1-2219 erzeugten Metaboliten dar, die in der Ausschlussfraktion enthalten sind.
Galectin-1 und -3 werden in der Milz und der Lunge der Mäuse getestet, die gemäß der vorstehenden Beschreibung geopfert worden waren.
Hierzu werden eine Fraktion der Lunge (ein Flügel) und die Hälfte der Milz steril und in dieser Reihenfolge bei jeder Maus entnommen. Die Fragmente werden anschließend in Petrischalen gelegt, die vorausgehend während 24 h mit einer Lösung aus sterilem Wasser und DEPC (DiEthylPyroCarbonat, vertrieben von der Fa. Sigma) von 1/1000 behandelt worden waren. Die Organe werden dann mit einer Spritze und einer sterilen Nadel ein erstes Mal mit PBS-Puffer perfundiert, um das Blut daraus zu entfernen. Die Organe werden anschließend in eine andere Petrischale überfuhrt, die 200 μl PBS mit einem Zusatz von 50 Einheiten RNase-Inhibitor (von der Fa. Applied Biosystems vertrieben) enthält, und erneut mit dieser Lösung perfundiert. Die Organe werden schließlich in Scheiben von weniger als 5 mm geschnitten, die in einem Biopur ^®-Röhrchen (Eppendorf) abgelegt werden, das 0,5 ml einer RNA-Stabilisierungslösung enthält, die unter der Bezeichnung RNA-Later^® von der Fa. Qiagen vertrieben wird. Die Organe werden anschließend im Gefrierschrank bei –20°C bis zur Analyse gelagert.
a) Extrahierung der Gesamt-RNA der entnommenen Organe
Die Gesamt-RNA wird nach zellulärer Lyse gemäß dem Verwendungsprotokoll des Extraktions-Kits RNeasyprotect^®, das unter der Bezeichnung 74126 von der Fa. Qiagen vertrieben wird, aus den Geweben extrahiert.
Hierzu wird die Stabilisierungslösung entfernt, und eine mit DEPC behandelte Wolframkugel sowie 600 μl einer Lyselösung (in dem Kit enthaltener Puffer RLT) werden jedem Organ zugegeben. Diese werden anschließend mithilfe eines Zerkleinerungsgerätes RETSCH MM2000 zerkleinert, daraufhin bei 13000 g während 3 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird dann in einem 1,5 ml-Röhrchen angeordnet, das 600 μl Ethanol 70% enthält, und daraufhin homogenisiert. Ein Teil dieser Lösung (700 μl) wird anschließend auf eine Filtrationssäule verbracht, die ein Binden der RNA ermöglicht, um bei 8000 g während 1 min bei 4°C zentrifugiert zu werden. Nach dem Leeren des Sammelröhrchens werden 700 μl eines Waschpuffers (in dem Kit enthaltener Puffer RW1) auf die Säule zugegeben, die bei 8000 g während 1 min bei 4°C zentrifugiert wird. Das Sammelröhrchen wird erneut geleert und 500 μl eines zweiten Waschpuffers, der Ethanol 70% (in dem Kit enthaltener Puffer RPE) enthält, werden auf die Säule zugegeben, um bei 8000 g während 1 min bei 4°C zentrifugiert zu werden. Dieser letzte Schritt wird erneut durchgeführt, jedoch unter Durchführung einer Zentrifugierung bei 13000 g während 2 min bei 4°C. Schließlich werden der Säule 30 μl eines Elutionspuffers zugegeben, der das Ablösen der RNA von der Säule ermöglicht (in dem Kit enthaltener Puffer RNase free). Das Eluat wird dann bei 8000 g während 1 min bei 4°C zentrifugiert, nachdem es bei Raumtemperatur während 5 min inkubiert wurde. Der Elutionsschritt wird erneut durchgeführt, und die auf diese Weise erhaltenen Proben werden einer schnellen Tiefkühlung bei –80°C unterzogen.
Eine Menge, die zu einer Einheit DNase äquivalent ist, die von der Fa. Boehringer vertrieben wird, wird jeder Probe zugegeben, die anschließend im Wasserbad bei 37°C während 15 min inkubiert wird.
Um die RNA-Gesamtmenge der Proben zu bewerten, werden diese in sterilem Wasser auf 1/8 verdünnt, das in einer Mikroküvette angeordnet ist, welche das Messen des Absorptionskoeffizienten bei 260 nm auf einem UV-Spektrophotometer mit der Bezeichnung Genquant ermöglicht, das von der Fa. Pharmacia vertrieben wird. Um die Konzentration von Gesamt-RNA der Proben zu erhalten, wird der auf diese Weise erhaltene Wert der optischen Dichte (densité optique; DO) mit dem Verdünnungsfaktor und mit 40 multipliziert (eine Einheit DO = 40 Mikrogramm/ml RNA).
b) Quantitative RT-PCR unter Verwendung der TagMan^®-Methodologie

Die quantitative RT-PCR wird mithilfe des Kits qPCR^TM Core Kit, der von der Fa. Eurogentec vertrieben wird, in einem Thermozyklierer mit der Bezeichnung Abi Prism 7700 (Sequence Detection System, Applied Biosystems) durchgeführt, der von der Fa. Perkin Elmer vertrieben wird. Es wird die in der nachfolgenden Tabelle VI aufgeführte Reaktionsmischung hergestellt: TABELLE VI

Reagenzien	Volumen in μl/Röhrchen	Endkonzentration
PCR-Puffer (10 ×)*	5	1 ×
MgCl₂ (50 mM)*	5	5 mM
dNTP (2,5 mM)*	6	300 μM
Vorwärtsprimer (10 pM)	1	200 μM
Rückwärtsprimer (10 pM)	1	200 μM
Sonde (10 pM)	1	200 μM
RNase-Inhibitor (40 Einheiten)	0,5	20 Einheiten
Polymerase Hot Gold Star (5 Einheiten)	0,25	1,25 Einheiten
MuLV (5 Einheiten)	0,25	12,5 Einheiten
Gesamt-RNA	10	100 ng/Röhrchen
Reines Wasser	qsp 50 μl
* mit dem Kit qPCR^TM Core Kit geliefertes Produkt

Die Reaktionsmischung wird dem folgenden Programm unterzogen: 10 min bei 65°C, um die Sekundärstrukturen der RNA zu entfernen, 30 min bei 42°C, um die inverse Transkriptase zu aktivieren, 10 min bei 95°C, um die Polymerase zu aktivieren, 15 s bei 95°C, um die DNA-Stränge zu denaturieren, und 1 min bei 61°C für die Hybridisierung und Verlängerung ausgehend von den Primern. Vierzig Zyklen werden für die beiden letzten Schritte durchgeführt.
Die Expression von Galectin-1 und -3 wird bezogen auf die Expression eines Referenzgens bewertet, wie etwa desjenigen, das für β-Actin codiert, dessen Expression konstant ist.
Die verwendeten Sonden und die Primer, die mit der Software PrimerExpress^®, vertrieben von der Fa. Perkin Elmer, ausgewählt wurden, sind die folgenden:
Um jede Mikroplatte zu validieren, die den PCR-Zyklen unterzogen wurde, wird eine Kalibrierung ausgehend von Organen einer Gruppe von 6 C3H Mäusen mit menschlicher Flora bereitet, die eine Standardernährung (steriles Wasser und RO3-Granulat) erhielten, an denen die Lungen und die Milz entnommen wurden. Die Gesamt-RNA jedes Organs wurde mithilfe des vorausgehend beschriebenen Protokolls für die Organe der Gruppen von zu testenden Mäusen extrahiert. Die auf diese Weise erhaltenen verschiedenen Extrakte werden anschließend für jedes Organ zusammengeführt, um einen Pool zu bilden, der für die Gesamtdauer der Analyse als Kalibrierung dient.
Bei der Analyse werden die zu testenden Proben im Duplikat abgelegt, und der ausgehend von der Kalibrierprobe erstellte Standardbereich wird im Triplikat abgelegt.
Ein Mittelwert wird dann ausgehend von jeder Probe und für die Kalibrierprobe gebildet.

Die Ergebnisse der relativen Expression von Galectin-1 bezogen auf β-Actin sind in der nachfolgenden Tabelle VII aufgeführt: TABELLE VII

Versorgung
Organ	Kontrolle	Ausschlussfraktion
Organ	Kontrolle	7 T	15 T	21 T
Milz	n = 17^a	n = 6	n = 6	n = 3
Milz	2,78^b (1,6-3,47)^c	1,15 (0,72-1,36) U = 0 p < 0,002 Bilateraler Test	4,5 (3,76-6,92) U = 7 p < 0,002 Bilateraler Test	12,51 (9,68-13,74) U = 0 p < 0,002 Bilateraler Test
Lunge	n = 16	n = 6	n = 4	n = 6
Lunge	1,145 (0,69-1,93)	0,8 (0,56-1,08) U = 17,5 p < 0,05 Bilateraler Test	1,72 (1,67-1,88) U = 5 p < 0,05 Bilateraler Test	1,465 (0,86-1,77)

Die Ergebnisse der relativen Expression von Galectin-3 bezogen auf β-Actin sind in der nachfolgenden Tabelle VIII aufgeführt: TABELLE VIII

Versorgung
Organ	Kontrolle	Ausschlussfraktion
		7 T	15 T	21 T
Lunge	n = 16^a	n = 6	n = 3	n = 6
	1,295^b (0,56-2,26)^c	1,04 (0,86-1,16)	0,76 (0,41-1) U = 8 p < 0,05 Unilateraler Test	0,91 (0,75-1,31)

In den Tabellen VII und VIII sind:

– ^a = Anzahl von Mäusen pro Gruppe;
– ^b = Mittelwert der relativen Expression von Galectin;
– ^c = extreme Ergebnisse der relativen Expression von Galectin;
– der mit dem Buchstaben U bezeichnete Wert ist der statistische Wert des Mann-Whitney-Tests;
– p gibt den Signifikanzschwellwert der Methode an.

Diese Resultate zeigen, dass eine Erhöhung der Expression von Galectin-1 in der Milz von Mäusen zu beobachten ist, bei denen das Trinkwasser mit der Ausschlussfraktion substituiert war. Die Expression von Galectin-1 (Induzierung der zellulären Apoptose, insbesondere von aktivierten T-Lymphocyten) bei den kontrollierten Tieren ist zweimal höher im Vergleich mit der von Actin, was mit der bakteriellen Kontaminierung des Organs in Zusammenhang zu stehen scheint (die Expression von Galectin-1 ist bedeutend geringer bei Abwesenheit von Bakterien in der Milz – U = 15, p < 0,05 – und nimmt in Abhängigkeit von der Rate der bakteriellen Kontaminierung zu, wenn Bakterien vorhanden sind – Korrelation r = 0,77, p < 0,05, Spearman-Test). Die Expression von Galectin-1 normalisiert sich nach 7 Tagen Entnahme der Ausschlussfraktion und steigt weiterhin um einen Faktor 4 bis 10 bei 15 bzw. 21 Tagen Entnahme an (unabhängig von der bakteriellen Restkontaminierung des Organs). In den Lungen ist die relative Expression von Galectin-1 bei den Kontrollmäusen normal, und auf die schwache, aber bedeutsame Verringerung nach 7 Tagen Entnahme der Ausschlussfraktion folgt eine Erhöhung (vorübergehend signifikant bei 15 Tagen Entnahme), daraufhin eine Normalisierung der Expression von Galectin-1 nach 21 Tagen Entnahme der Ausschlussfraktion.
Diese Ergebnisse zeigen auch, dass eine Abnahme der Expression von Galectine-3 in den Lungen der Mäuse zu beobachten ist, bei denen das Trinkwasser mit der Ausschlussfraktion substituiert war.
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt, dass die Ausschlussfraktion (gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes immunregulatorisches Produkt) einen immunregulatorischen Effekt besitzt und es ermöglicht, die Population von Bifidobacterium zu vermehren und die Population an Bacteroïdes fragilis zu verringern. SEQUENCE LISTING

Claims

Immunregulatorisches Produkt, dadurch gekennzeichnet, dass es nach einem Herstellungsverfahren erhalten wird, das die folgenden Schritte umfasst: – Beimpfen mit und Inkubieren von Bifidobacterium, das wenigstens den Stamm Bifidobacterium breve I-2219 umfasst, unter aeroben oder anaeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen ungefähr 30 und 40°C, in einem wässrigen Substrat mit einem pH zwischen 6 und 8 und das wenigstens die folgenden Bestandteile enthält: i) ein Molkepermeat, ii) ein Hydrolysat aus Molkeproteinen, iii) Lactose – Entfernen des Bifidobakteriums aus dem wässrigen Substrat; – Ultrafiltrieren des wässrigen Mediums mit Filtermembranen, die eine Ausschlussgrenze zwischen 100 und 300 kDa umfassen, zum Erhalt eines konzentrierten Retentats; – Dehydrieren des konzentrierten Retentats; – Lösen des dehydrierten Retentats in einem Puffer; – Gel-Permeations-Chromatographie der Retentatlösung in einer Säule, die eine Ausschlussgrenze von 600 kDa aufweist; – Gewinnen der Ausschlussfraktion am Ende der Chromatographie, die das immunregulatorische Produkt darstellt.
Immunregulatorisches Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bifidobakterium mit 1 × 10⁴ bis 4 × 10⁹ kolonienbildenden Einheiten pro ml Substrat in das wässrige Substrat eingeimpft wird.
Immunregulatorisches Produkt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur des Substrats für die Gesamtdauer der Inkubation auf einem Wert zwischen 37 und 40°C gehalten wird.
Immunregulatorisches Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH des wässrigen Substrats für die Gesamtdauer der Inkubation auf einem Wert zwischen 6 und 8 gehalten wird.
Immunregulatorisches Produkt nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der pH des wässrigen Substrats für die Gesamtdauer der Inkubation auf einem Wert zwischen 6,5 und 7,5 gehalten wird.
Immunregulatorisches Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestandteile des wässrigen Substrats in den folgenden Mengen vorliegen: i) Molkepermeat: 3 bis 80 g, ii) Hydrolysat der Molkeproteine: 2 bis 80 g, iii) Lactose: 5 bis 50 g wobei diese Mengen pro Liter Substrat angegeben werden.
Immunregulatorisches Produkt nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestandteile des wässrigen Substrats in den folgenden Mengen vorliegen: i) Molkepermeat: 40 bis 60 g, ii) Hydrolysat der Molkeproteine: 5 bis 15 g, iii) Lactose: 10 bis 30 g wobei diese Mengen pro Liter Substrat angegeben werden.
Immunregulatorisches Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Substrat wenigstens einen zusätzlichen Bestandteil, ausgewählt aus Puffersalzen, Hefeextrakten und Cysteinchlorhydrat umfasst.
Immunregulatorisches Produkt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Substrat ein Puffersalz, ausgewählt aus Natriumdihydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat, umfasst, das in einer Menge von 0,5 bis 5 g pro Liter des wässrigen Substrats vorliegt.
Immunregulatorisches Produkt nach nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Hefeextrakt in einer Menge von 0,5 bis 5 g pro Liter des wässrigen Substrats vorliegt.
Immunregulatorisches Produkt nach nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Cysteinchlorhydrat in einer Menge von 100 bis 500 mg pro Liter des wässrigen Substrats vorliegt.
Immunregulatorisches Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Entfernen des Bifidobakteriums aus dem Kulturmedium durch Mikrofiltration oder durch Zentrifugation des wässrigen Mediums erfolgt.
Immunregulatorisches Produkt nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Entfernen des Bifidobakteriums aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation des wässrigen Mediums erfolgt.
Immunregulatorisches Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren unter anderem, nach dem Schritt des Entfernens des Bifidobakteriums, einen zusätzlichen Schritt des Zerstörens der im wässrigen Substrat nach dem Inkubieren vorhandenen enzymatischen Restaktivität beinhaltet.
Immunregulatorisches Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gel-Permeations-Chromatographie mit einem Dextrangel oder einem vernetzen Agarosegel erfolgt.
Immunregulatorisches Produkt nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausschlussfraktion im Wesentlichen aus einem Polysaccharid- und einem Proteinkomplex besteht, in dem die kohlenhydrathaltige Fraktion 5 bis 30 Gewichtsprozent und die Proteinfraktion 70 bis 95 Gewichtsprozent im Verhältnis zum Gesamtgewicht des Komplexes darstellt.
Immunregulatorisches Produkt nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die kohlenhydrathaltige Fraktion der Ausschlussfraktion folgende Zusammensetzung an Monosacchariden (ausgedrückt in molaren Verhältnissen im Verhältnis zur Rhamnose) aufweist: Galactose: 5,5 bis 8; Mannose: 0,8 bis 1,3; Glucose: 2,5 bis 5; N-Acetylgalactosamin: 0,3 bis 1; N-Acetylglucosamin: 0,07 bis 0,3; Neuraminsäure: 0 bis 0,15 und Rhamnose: 1.
Immunregulatorisches Produkt nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinfraktion wenigstens ein Peptid umfasst, das wenigstens einer der folgenden Sequenzen entspricht: – RELGIGTPSFLHNGGQWYIYA (SEQ ID Nr. 1) – RVLYNPGQYXYVR (SEQ ID Nr. 2) – EQATANGQVSSGQQSTGGSAAP (SEQ ID Nr. 3).
Immunregulatorisches Produkt als Medikament nach einem der vorherigen Ansprüche.
Immunregulatorisches Produkt als immunregulatorisches Medikament nach einem der vorherigen Ansprüche.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als aktiven Bestandteil wenigstens ein immunregulatorisches Produkt einschließt, das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 erhalten wird, und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die orale Verabreichung bestimmt ist und sich in flüssiger oder fester Form befindet.