EP1335992A2 - Hefestamm für den verzehr - Google Patents

Hefestamm für den verzehr

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Publication number
EP1335992A2
EP1335992A2 EP01997547A EP01997547A EP1335992A2 EP 1335992 A2 EP1335992 A2 EP 1335992A2 EP 01997547 A EP01997547 A EP 01997547A EP 01997547 A EP01997547 A EP 01997547A EP 1335992 A2 EP1335992 A2 EP 1335992A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
yeast
seq
primer
primer pairs
sequences
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01997547A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Reiner Grabowski
Manuela Braunschweiger
Alexander Gasch
Kornelia Berghof
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotecon Diagnostics GmbH
Original Assignee
Biotecon Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotecon Diagnostics GmbH filed Critical Biotecon Diagnostics GmbH
Publication of EP1335992A2 publication Critical patent/EP1335992A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the present invention relates to a new yeast strain with improved properties for human or animal consumption and a method for characterizing yeast.
  • the yeast Saccaromyces cerevisiae was used in the ancient times for the production of fermented drinks.
  • the best known beverages fermented by yeast are beer and wine.
  • the beer that is brewed according to the Purity Law issued in 1516 can be understood as beer in the strict sense. According to this, only barley, hops, water and Saccharomyces cerevisiae may be used to produce "beer".
  • yeast strains used generally belong to the Saccharomyces genus, their physiological properties differ significantly from one another.
  • Probiotics are living microorganisms for nutritional supplements with beneficial effects on the host organism e.g. B. by improving the intestinal, microbiological balance.
  • Scientific and medical research has increasingly been carried out in recent years, emphasizing the essential importance of gastrointestinal microflora for the health and resistance of humans and animals.
  • Probiotics should be living microorganisms that have certain antagonistic properties to the predominant intestinal flora so that they can integrate positively into the natural symbiosis. Yeasts used as probiotics can often fit into the biofilm of the intestinal surface and then form a protective barrier against potential pathogens. They prevent the multiplication and the settlement of bacteria ingested with the food. Duck clostridia Robacteria or Campylobacter, which can form enterotoxins, are limited in their growth by a healthy intestinal flora.
  • Saccharomyces cerevisiae as an apathogenic germ, cannot multiply or permanently settle in the human host.
  • Gram-positive germs such as lactobacilli, are synergistically promoted in their growth due to the vitamin content of the yeast.
  • the immune system is stimulated by the antigenic properties of the yeast cells.
  • the activities of intestine-associated disaccharidases such as saccharase, lactase and maltase are increased. Disaccharides are split and then reabsorbed.
  • Enteropathogenic E.coli can be bound to yeast cells with their mannose-sensitive surface appendages so that they cannot attach to the intestinal wall.
  • the lining of the intestinal epithelium by yeasts prevents pathogenic germs from attaching.
  • the yeast's vitamin B content also has positive effects on the skin.
  • Saccharomyces cerevisiae can prevent prophylactically the dangers of diarrhea. Diarrhea is particularly likely if the intestinal flora is reduced after antibiotics. Antibiotic-resistant E. coli can multiply and, as an indirect consequence of the suppression of gram-positive germs, penetrate more into the upper parts of the intestine. A precondition for their pathogenicity is adherence to the intestinal epithelium, which is made possible by certain microbial pathogenicity factors. An infection can have very different courses depending on the E.co// strain. In addition to bacterial enterocolitis and diarrhea, more severe forms of the disease, such as hemorrhagic uraemic syndrome, can also be caused. Another prophylactic application of S. cerevisiae is against Candida albicans mycoses. Oral intake of S. cerevisiae can reduce the intestinal Candida cell count.
  • the present invention was based on the technical problem of specifying a new yeast strain which is suitable for human or animal consumption, with the least possible impairment of the taste of the yeast-containing agent. Another technical problem was to provide a method with which any strains of yeast can be clearly distinguished from one another.
  • the first problem is solved according to the invention by a yeast strain, which in the molecular genetic characterization by means of PCR with primer pair 3, comprising SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6, with primer pair 4 comprising SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8, with the primer pair 7 comprising SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14 and with the primer pair 9 comprising SEQ ID No. 17 and SEQ ID No. 18, the band pattern shown in FIG. 1 provides.
  • the second problem is solved according to the invention by a method for identifying and characterizing yeast comprising the step: performing a PCR analysis of the genetic material of the yeast with at least one of the primer pairs 1 to 13, preferably with at least 4 different primer pairs, very particularly preferably with all Primer pairs 1 - 13.
  • the yeast strain according to the invention can best be characterized and identified on the basis of its genetic fingerprint, which can easily be created by means of PCR and primer combinations according to the invention.
  • Primer combinations 1 to 13 can be used in any combination with one another to produce the genetic fingerprint. The most detailed information is of course obtained when all 13 primer pairs are used to analyze the yeast genome. However, the combination of primer pairs 3, 4, 7 and 9 already provides a particularly characteristic pattern. Patterns created and combinations of primer pairs represent a clear genetic fingerprint of the respective yeast strain and even allow the differentiation of genetically very closely related yeast strains.
  • a particularly preferred strain Sacharomyces BCD No. 14143 was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH under the accession number DSM 13850.
  • Derivatives derived therefrom are also particularly preferred.
  • a “derivative” is understood to mean a yeast strain which differs from the stored strain by one or more nucleotide exchanges, the essential characteristics being retained, in particular the genetic fingerprint as it is with a combination of primer pairs, for example the primer pairs 3, 4, 7 and 9, particularly preferably with all primer pairs 1-13.
  • Primers with one of SEQ ID Nos. 1-26, sequences hybridizing therewith and sequences with at least 80% identity to these sequences are regarded as primers according to the invention.
  • “Hybridizing” means that the hybridizing sequence has a degree of identity to the primer sequence in question that allows only the primer sequence to be recognized even in the presence of further sequences, it being within the range of skill in the art that is suitable for this Preferred hybridization conditions correspond to those of the PCR program specified in the examples when using a conventional PCR buffer.
  • “80% identity” means that the same nucleotide is in the reference sequence at 8 out of 10 corresponding positions as in the given one Sequence selected from SEQ ID Nos. 1 - 26.
  • the yeast according to the invention is particularly suitable for producing agents which are intended for ingestion by humans or animals.
  • the addition of the yeast according to the invention leads to practically no taste impairment of the agent to be absorbed.
  • the yeast according to the invention is particularly suitable as a component of a medicament, a probiotic, a fermentation drink, a suspension, an extract or a pastry.
  • Beer, non-alcoholic beer or fermented fruit juices are particularly suitable as fermentation drinks.
  • the yeast according to the invention is introduced into the agent to be administered in lyophilized form.
  • the agent containing the yeast according to the invention is preferably used for the treatment of diarrhea, colitis, intestinal infections, candida infections or skin diseases.
  • the primers according to the invention furthermore allow a method for identifying and characterizing yeasts, the method being able to identify any yeast on the basis of their genetic fingerprint, even if these yeasts are practically indistinguishable from one another by biochemical parameters.
  • the genome of the yeast in question is subjected to a PCR analysis, at least one of the primer pairs 1 to 13 being used.
  • the more primer pairs used in combination to analyze the genome in question the more precisely and in detail the genetic fingerprint will be obtained from the yeast in question. Therefore, if two predetermined yeasts are to be examined to determine whether they are identical or different from one another, their genome is examined using the primer pairs according to the invention, it being possible to use as many combinations of primer pairs until a significant difference in the band pattern is obtained.
  • primer pairs 3, 4, 7 and 9 are primer pairs 3, 4, 7 and 9.
  • the formulation may contain live or dead yeast lines in the administered product.
  • yeast cells can be separated during the production process, so that only the fermented product or the product supplemented with yeast excretions is consumed.
  • a preferred Sacc ⁇ a / Omyces strain can be added to a juice, beer or wine drink as a probiotic suspension.
  • the suspension can also be incubated for some time to cause fermentation.
  • the alcohol produced can be removed from a fermented drink, e.g. to produce a non-alcoholic beer or wine.
  • Saccharomyces BCD can be administered as lyophilized yeast. In this case, it can be used against indications such as diarrhea, colitis, candida infections or general gastrointestinal disorders. It can also be used to improve skin quality.
  • Saccharomyces BCD is in the addition to baking mixes for the production of bread, baked goods, steamed pasta or the like.
  • Extracts of Saccharomyces BCD can be used for any of the applications previously described.
  • individual components of the yeast can be administered in enriched or purified form.
  • Saccharomyces BCD The characterization of Saccharomyces BCD using PCR is shown in FIG. 1. In each case, a closely related comparison strain (left) and Saccharomyces BCD (right) are plotted. The arrows indicate differences between the tribes. The primer pairs PP3, PP4, PP9, PP7 were used.
  • Saccharomyces BCD is a strain of the genus Saccharomyces. On the basis of a molecular biological detection method, this can be clearly distinguished from other Saccharomyces strains, in particular from those of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • the yeast is grown for 2 days at 30 ° C in a medium with 2% glucose.
  • the genomic DNA is isolated from each 2 ml overnight culture using a commercially available kit.
  • a PCR is then set up as follows:
  • primer pairs used in the PCR reactions are summarized in this table.
  • a primer of each pair can be coupled to a dye for better identification.
  • the band pattern is characterized by the number of bands per pair of primers and the size of the bands per pair of primers. Occasionally, an amplification product can also be completely missing. In combination with different pairs of primers, a two-dimensional band pattern is created that allows a direct comparison between different yeast strains. Table 2: Band patterns obtained with different primers for different yeasts
  • the yeast 9, 10 ... 39 shows the band pattern which is obtained with the primer pairs (PP) 3, 4, 7 and 9, respectively. No 2 of the yeasts tested showed the same band pattern for all 4 primer pairs.
  • the results show the separation of the PCR fragments on a sequencing gel, the separation being carried out under the following conditions: A DNA sequencer from LI-COR (Lincoln, USA) was used. The PCR samples (marked with the dye IRD 800) were separated by electrophoresis using an acrylamide gel which is 0.25 mm thick and 50 cm long for about 8 hours at 1500 V.
  • A-M denotes identical band patterns; stands for two different yeasts with PP1 e.g. "E", the two yeasts have the same band pattern with this primer pair.
  • the combination of these patterns characterizes the respective strains. It is remarkable that Saccharomyces cerev / s / ae strains can also be distinguished, their use as brewer's yeast, wine yeast etc. actually is identical.
  • Saccharomyces BCD Saccharomyces BCD No. 14143
  • DSM 13850 German Collection for Microorganisms
  • the Saccharomyces BCD strain was inoculated 2% in DS medium for the preculture and incubated for 20 h at 28 ° C. and 120 rpm. At the time of harvest, the culture has an OD600 of approx. 25.
  • Vitamins and trace elements have also been added to the medium.
  • Flavor scale from 1 (very good) to 5 (not sufficient) (average of several test subjects). The judgment of 5-10 test persons served as a taste criterion. In the scale, a digestible kefir, comparable to a fresh yogurt, was rated as very good. The grade 1 (very good) was only given if the kefir had flavors that placed it well above the taste of other types of kefir. A still acceptable deviation in the digestibility of the ideal drink (too acidic, too much gas, slightly bitter aftertaste, etc.) was rated good (2), a strong deviation (kefir is not a pleasure to drink) was rated satisfactory (3). Inedible drinks and nausea-causing drinks would have received a sufficient (4) or insufficient (5) rating. Strains A and B come from the BioteCon Diagnostics strain collection. They are representative of many other yeast strains tested. Stability of the Ivophilized Saccharomyces BCD
  • yeast Saccharomyces BCD For administration as a drug, it may be necessary to lyophilize the yeast Saccharomyces BCD.
  • An experimental series is shown below, showing that the yeast is able to quantitatively survive the process of lyophilization. In particular, it is possible to lyophilize the strain starting from yeast milk.
  • the subsequent fermentation conditions lead to high numbers of living organisms and enable a good survival rate in the subsequent processing.
  • the amount of inoculation for pre-cultivation is 2.5%, ie the cultivation of a 5 m 3 fermenter results in the following setting: 3 I - 125 I -> 5 m 3 (main culture).
  • the preculture stages are used as batch batches for 20 h at 30 ° C.
  • the culture suspension (approx. 5 m 3 ) is first centrifuged and the culture supernatant is discarded. The biomass is then washed with drinking water. This washing step is made up with about 15% water based on the processed yeast suspension.
  • the washed wet biomass is mixed with 20% protective medium (based on the dry substance).
  • the protective medium is used in solid form as a powder in the case of yeast milk or as a 20% aqueous solution for resuspension of a firm yeast mass.
  • the freezing process plays a crucial role in the vitality of the yeast cells. Slow freezing with a temperature change of 1 ° C / min leads to the optimal survival rate in the product. It is lyophilized at a temperature between -20 and -30 ° C. After lyophilization, the product contains at least 2 x 10 10 viable yeast cells and has a water content of ⁇ 5%. With a suspension of 1.5 g of Saccharomyces BCD in 5 ml of water, the eutectic point was determined to be -18 ° C.
  • Saccharomyces BCD can be taken as a suspension for use as a probiotic.
  • the yeast can be suspended in a drink. It is also possible to ferment the drink with the help of the yeast for a few days. Since alcohol is produced in this case, a probiotic beer or a probiotic wine can be produced in this way. In addition, the alcohol can be removed from these alcoholic beverages secondarily, so that probiotic alcohol-reduced or non-alcoholic fermented beverages are produced.
  • Saccharomyces BCD can be lyophilized for administration as a drug. In this case, an uptake by humans or animals is possible in a high cell count. For example, after the administration of Saccharomyces BCD, a significant reduction in diarrhea was found in horses.
  • Saccharomyces BCD as a component of baked foods, such as bread, cakes, pastries and the like. Extracts from this yeast can also be produced. In this case, individual components that are consumed can be enriched or isolated.

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Abstract

Die Erfindung beinhaltet die Verwendung eines Hefestammes für den menschlichen oder tierischen Verzehr. Er kann als Gärgetränk, als Getränkesuspension, als Medikament oder als Komponente einer Backmischung verabreicht werden. Auch können Extrakte aus Zellen des Stammes verzehrt werden.

Description

Neuer Hefestamm für den Verzehr
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Hefestamm mit verbesserten Eigenschaften für den menschlichen oder tierischen Verzehr sowie ein Verfahren zur Charakterisierung von Hefen.
Die Hefe Saccaromyces cerevisiae wurde schon in altertümlichen Zeiten zur Herstellung von Gärgetränken verwendet. Die bekanntesten durch Hefe fermentierten Getränke sind Bier und Wein. Als Bier im strengen Sinne kann das Bier, das nach dem im Jahre 1516 erlassene Reinheitsgebot gebraut wird, verstanden werden. Nach diesem darf zu Herstellung von „Bier" nur Gerste, Hopfen, Wasser und Sac- charomyces cerevisiae verwendet werden.
Weltweit existiert eine Vielzahl von Bieren, die sich teilweise erheblich in den Zutaten unterscheiden. Die verwendeten Hefestämme gehören zwar in der Regel der Gattung Saccharomyces an, sie unterscheiden sich jedoch in ihren physiologischen Eigenschaften signifikant voneinander.
Erst in der Neuzeit wurde die Verwendung von Bakterien und Hefen auch als Probiotika populär. Probiotika sind lebende Mikroorganismen zur Nahrungsergänzung mit förderlichen Effekten auf den Wirtsorganismus z. B. durch Verbesserung des in- testinalen, mikrobiologischen Gleichgewichts. In den letzten Jahren wurden vermehrt wissenschaftliche und medizinische Forschungen durchgeführt, in denen die essentielle Bedeutung der gastrointestinalen Mikroflora für die Gesundheit und die Widerstandskraft von Mensch und Tier herausgestellt wurde.
Probiotika sollten lebende Mikroorganismen sein, die bestimmte antagonistische Eigenschaften zur vorherrschenden Darmflora haben, so dass sie sich positiv in die natürliche Symbiose integrieren können. Als Probiotika verwendete Hefen können sich häufig in den Biofilm der Darmoberfläche einfügen und dann eine Schutzbarriere gegen potentielle Krankheitserreger bilden. Sie verhindern die Vermehrung und die Ansiedelung von mit der Nahrung aufgenommenen Bakterien. Clostridien, Ente- robakterien oder Campylobacter, die Enterotoxine bilden können, werden durch eine gesunde Darmflora in ihrem Wachstum begrenzt.
Verschiedene Stämme der Gattung Saccharomyces werden in unterschiedlichen Bereichen der Medizin zu Therapiezwecken, zur Behandlung von Akne, zur Prophylaxe und Therapie von antibiotikainduzierter Diarrhöe und Reisediarrhoe eingesetzt. Allgemein läßt sich sagen, dass Saccharomyces cerevisiae als apathogener Keim sich in dem Wirt Mensch nicht vermehren oder permanent ansiedeln kann. Grampositive Keime, wie Laktobacillen werden durch den Vitamingehalt der Hefen synergistisch in ihrem Wachstum gefördert. Das Immunsystem wird durch die anti- genen Eigenschaften der Hefezellen stimuliert. Die Aktivitäten darmassoziierter Dis- saccharidasen, wie Saccharase, Lactase und Maltase werden gesteigert. Disaccha- ride werden gespalten und dann resorbiert. Ungespalten könnten sie in tiefere Darmabschnitte gelangen und zu Diarrhöen führen. Enteropathogene E.coli können mit ihren mannosesensitiven Oberflächenanhängseln an Hefezellen gebunden werden, so dass sie sich nicht an die Darmwand anheften können. Das Auskleiden des Darmepithels durch Hefen verhindert somit die Anheftung pathogener Keime. Außerdem werden durch den Vitamin B-Gehalt der Hefen positive Wirkungen auf die Haut hervorgerufen.
Insbesondere den Gefahren einer Diarrhöe kann Saccharomyces cerevisiae prophylaktisch vorbeugen. Eine Diarrhöe droht insbesondere, wenn die intestinale Darmflora nach Antibiotikagaben reduziert ist. Antibiotikaresistente E.coli können sich vermehren und als indirekte Folge der Zurückdrängung grampositiver Keime stärker in die oberen Darmabschnitte vordringen. Voraussetzung für ihre Pathoge- nität ist die Adhärenz an das Darmepithel, die durch bestimmte mikrobielle Patho- genitätsfaktoren ermöglicht wird. Eine Infektion kann je nach E.co//-Stamm sehr unterschiedliche Verläufe haben. Außer einer bakteriellen Enterokolitis und Diarrhöe können auch schwerere Krankheitsformen, wie das hämorrhagisch urämische Syn- drom, hervorgerufen werden. Eine weitere prophylaktische Applikation von S. cerevisiae besteht in der Anwendung gegen Candida albicans Mykosen. Durch orale Aufnahme von S. cerevisiae kann die intestinale Candida-Zellzahl reduziert werden.
Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, einen neuen Hefestamm anzugeben, der zum Verzehr durch Mensch bzw. Tier geeignet ist, wobei es zu einer möglichst geringen Beeinträchtigung des Geschmacks des hefehal- tigen Mittels kommen soll. Ein weiteres technisches Problem bestand darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem beliebige Hefestämme eindeutig voneinander unterscheidbar sind.
Das erste Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch einen Hefestamm, der bei der molekulargenetischen Charaktisierung mittels PCR mit dem Primerpaar 3, umfassend SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6, mit dem Primerpaar 4 umfassend SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8, mit dem Primerpaar 7, umfassend SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14 und mit dem Primerpaar 9 umfassend SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18, das in Figur 1 gezeigte Bandenmuster liefert.
Das zweite Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von Hefen umfassend den Schritt: Durchführen einer PCR-Analyse des genetischen Materials der Hefe mit mindestens einem der Primerpaare 1 bis 13, vorzugsweise mit mindestens 4 verschiedenen Primerpaaren, ganz besonders bevorzugt mit sämtlichen Primerpaaren 1 - 13.
Der erfindungsgemäße Hefestamm läßt sich am besten charakterisieren und identifizieren anhand seines genetischen Fingerabdrucks, der mittels PCR und erfin- dungsgemäßer Primerkombinationen leicht erstellt werden kann. Zum Herstellen des genetischen Fingerabdrucks sind die Primerkombinationen 1 bis 13 in beliebigen Kombinationen miteinander verwendbar. Die detaillierteste Aussage wird natürlich erhalten, wenn sämtliche 13 Primerpaare zur Analyse des Hefegenoms eingesetzt werden. Ein besonders charakteristisches Muster liefert jedoch bereits die Kombination der Primerpaare 3, 4, 7 und 9. Das mit den verschiedenen Primerpaa- ren und Kombinationen an Primerpaaren erzeugte Muster stellt einen eindeutigen genetischen Fingerabdruck des jeweiligen Hefestamms dar und erlaubt selbst die Unterscheidung genetisch sehr eng verwandter Hefestämme. Ein besonders bevorzugter Stamm (Saccharomyces BCD Nr. 14143) wurde hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Hinterlegungsnummer DSM 13850. Hiervon abgeleitete Derivate sind ebenfalls besonders bevorzugt. Unter einem „Derivat" versteht man dabei einen Hefestamm, der sich von dem hinterlegten Stamm durch einen oder mehrere Nukleotidaustausche unterscheidet, wobei die wesentlichen Charakteristika beibehalten werden, insbesondere der genetische Fingerprint, wie er mit einer Kombination von Primerpaaren, z. B. der Primerpaare 3, 4, 7 und 9, besonders bevorzugt mit sämtlichen Primerpaaren 1 - 13, erhalten wird.
Als erfindungsgemäße Primer werden Primer mit einer der SEQ ID Nrn. 1 - 26, hiermit hybridisierende Sequenzen sowie zu diesen Sequenzen zu mindestens 80% Identität aufweisende Sequenzen angesehen. Dabei bedeutet „Hybridisieren", dass die hybridisierende Sequenz einen Grad an Identität zu der fraglichen Primerse- quenz aufweist, die es erlaubt, das auch in Anwesenheit weiterer Sequenzen nur die Primersequenz erkannt wird, wobei es im Bereich des fachmännischen Könnens liegt, die hierfür geeigneten Hybridisierungsbedingungen zu bestimmen. Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen entsprechen denen des in den Beispielen angegebenen PCR-Programms bei Verwendung eines üblichen PCR-Puffers. „80% Identität" bedeutet, dass sich in der Referenzsequenz an 8 von 10 korrespondierenden Positionen das gleiche Nukleotid befindet wie in der vorgegebenen Sequenz ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 1 - 26.
Die erfindungsgemäße Hefe ist besonders geeignet zum Herstellen von Mitteln, die für die Aufnahme durch Mensch oder Tier vorgesehen sind. Der Zusatz der erfin- dungsgemäßen Hefe führt zu praktisch keinerlei geschmacklicher Beeinträchtigung des aufzunehmenden Mittels. Die eriϊndungsgemäße Hefe ist insbesondere geeignet als Bestandteil eines Medikamentes, eines Probiotikums, eines Gärgetränks, einer Suspension, eines Extrakts oder eines Gebäcks.
Als Gärgetränk kommen insbesondere in Betracht Bier, alkoholfreies Bier oder fermentierte Fruchtsäfte.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Hefe in lyophilisierter Form in das zu verabreichende Mittel eingebracht.
Das Mittel enthaltend die eriϊndungsgemäße Hefe wird vorzugsweise eingesetzt zur Behandlung von Diarrhöe, Colitis, Darminfektionen, Candida-Infektionen oder Hauterkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Primer erlauben weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von Hefen, wobei das Verfahren beliebige Hefen anhand ihres genetischen Fingerabdrucks identifizieren kann, selbst wenn diese Hefen praktisch durch biochemische Parameter nicht mehr voneinander unterscheidbar sind. Zu dieser Charakterisierung/Identifizierung wird das Genom der fraglichen Hefe einer PCR-Analyse unterzogen, wobei mindestens eines der Primerpaare 1 bis 13 eingesetzt wird. Je mehr Primerpaare in Kombination zur Analyse des fraglichen Genoms eingesetzt werden, umso genauer und detaillierter wird der genetische Fingerabdruck von der fraglichen Hefe erhalten werden. Sind daher zwei vorgegebene Hefen dahingehend zu untersuchen, ob sie identisch oder verschieden voneinander sind, wird deren Genom mittels der erfindungsgemäßen Primerpaare untersucht, wobei so viele Kombinationen an Primerpaaren eingesetzt werden können, bis ein signifikanter Unterschied im Bandenmuster erhalten wird. In der Regel sind bereits vier verschiedene Primerpaare ausreichend, um einen wirklich einzigartigen genetischen Fingerabdruck abzuliefern. Eine besonders bevorzugte Kombination an Primerpaaren in dieser Hinsicht stellen die Primerpaare 3, 4, 7, und 9 dar. Beim verabreichten Produkt kann die Formulierung lebende oder tote Hefezeilen enthalten. Außerdem können die Hefezellen während des Produktionsprozesses abgetrennt werden, so dass lediglich ein Verzehr des vergorenen oder durch Hefeausscheidungen ergänzten Produktes erfolgt.
Ein bevorzugter SaccΛa/Omyces-Stamm, BCD genannt, kann einem Saft, Bier oder Weingetränk als probiotische Suspension beigegeben werden. Die Suspension kann auch einige Zeit inkubiert werden, um eine Vergärung herbeizuführen. Außerdem kann einem vergorenen Getränk sekundär der entstandene Alkohol entzogen werden, um z.B. ein alkoholfreies Bier oder einen alkoholfreien Wein zu erzeugen.
In einer Darreichungsform als Medikament für Tiere und Menschen kann Saccharomyces BCD als lyophilisierte Hefe verabreicht werden. In diesem Fall kann sie gegen Indikationen wie Diarrhöe, Colitis, Candida-Infektionen oder allgemeine Magen- und Darmstörungen eingesetzt werden. Des weiteren kann sie zur Verbesserung der Hautqualität verwendet werden.
Eine weitere Verwendung von Saccharomyces BCD besteht in der Beigabe zu Backmischungen für die Herstellung von Broten, Gebacken, Dampfnudeln oder Ähnlichem.
Extrakte von Saccharomyces BCD können für jede der zuvor beschriebenen Anwendungen verwendet werden. In diesem Fall können einzelne Komponenten der Hefe in angereicherter oder gereinigter Form verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele und die Figur erläutern die Erfindung. Fiqurenbeschreibunα:
Die Charakterisierung vom Saccharomyces BCD mit Hilfe der PCR ist in Figur 1 dargestellt. Es ist jeweils alternierend ein naher verwandter Vergleichsstamm (links) und Saccharomyces BCD (rechts) aufgetragen. Die Pfeile kennzeichnen Unterschiede zwischen den Stämmen. Verwendet wurden die Primerpaare PP3, PP4, PP9, PP7.
Beispiele:
Identifizierung des Hefestammes
Bei Saccharomyces BCD handelt es sich um einen Stamm der Gattung Saccharomyces. Dieser ist auf der Grundlage eines molekularbiologischen Nachweisverfahrens eindeutig von anderen Saccharomyces-Stämmen, insbesondere von solchen der Spezies Saccharomyces cerevisiae unterscheidbar.
Die molekularbiologische Charakterisierung dieses Stammes ist nachfolgend beschrieben.
Die Hefe wird 2 Tage bei 30°C in einem Medium mit 2% Glukose gezogen. Aus je 2 ml Übernachtkultur wird die genomische DNA mit einem handelsüblichen Kit isoliert. Anschließend wird eine PCR wie folgt angesetzt:
2 μl genomische DNA
1/10 vol. 10 x konz. PCR-Puffer
2 mM MgCI2
0,2 mM dNTP
0,4 pmol je Primer (ein Primerpaar je Reaktion)
Taq 1 ,5 U Tabelle 1: verwendete Primerpaare
In dieser Tabelle sind die in den PCR-Reaktionen verwendeten Primerpaare zusammengefasst. Zur besseren Identifizierung kann ein Primer eines jeden Paares mit einem Farbstoff gekoppelt sein. PCR-Programm:
5 min 95°C
5 min 72°C
6 μl des PCR-Produktes werden mit 3 μl Stoppuffer versetzt und 5 min bei 95°C denaturiert. 1 ,5 μl dieser Probe werden auf ein auf 50°C vortemperiertes Sequenziergel aufgetragen. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung wird das Bandenmuster analysiert. Die Bandenmuster sind charakteristisch für den Hefestamm. In mehr als 50 Experimenten konnten Unterschiede zwischen Hefestämmen immer problemlos nachgewiesen werden.
Das Bandenmuster ist charakterisiert durch die Zahl der Banden je Primerpaar und durch die Größe der Banden je Primerpaar. Vereinzelt kann auch ein Amplifikati- onsprodukt völlig fehlen. In Kombination mit verschiedenen Primerpaaren entsteht ein zweidimensionales Bandenmuster, dass einen unmittelbaren Vergleich zwischen verschiedenen Hefestämmen erlaubt. Tabelle 2: Erhaltene Bandenmuster mit verschiedenen Primern bei verschiedenenen Hefen
Gezeigt ist für die Hefen 9, 10 ... 39 das Bandenmuster, das jeweils mit den Primerpaaren (PP) 3, 4, 7 und 9 erhalten wird. Keine 2 der getesteten Hefen ergeben das gleiche Bandenmuster für alle 4 Primerpaare. Die Ergebnisse zeigen die Auftrennung der PCR-Fragmente auf einem Sequenziergel, wobei die Trennung unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurde: verwendet wurde ein DNA-Sequencer der Firma LI-COR (Lincoln, USA). Die PCR-Proben (markiert mit dem Farbstoff IRD 800) wurden über ein Acrylamidgel, das 0,25 mm dick und 50 cm lang ist über ca. 8 Stunden bei 1500 V gelektrophoretisch aufgetrennt. Dabei wurde einfach konzentrierter TBE- Puffer verwendet (45 mM Trisborat, 1 mM EDTA; Herstellung des 10-fach konzentrierten Puffers: 108 g Tris-Base, 55 g Borsäure und 40 ml 0,5 M EDTA pH8,0 ad 1 I H2Q. Tabelle 3: Schematische Darstellung der Differenzierung von Hefen mittels der Primerpaare 1-13 aus obiger Tabelle
Mit A-M werden jeweils identische Bandenmuster bezeichnet; steht also bei zwei verschiedenen Hefen mit PP1 z.B. „E", besitzen die beiden Hefen mit diesem Primerpaar das gleiche Bandenmuster. Die Kombination dieser Muster charakterisiert die jeweiligen Stämme. Bemerkenswert ist, daß sich auch Saccharomyces cerev/s/ae-Stämme unterscheiden lassen, deren Anwendung als Brauhefe, Weinhefe etc. eigentlich identisch ist.
Die oben beschriebene PCR-Methode wurde verwendet, um Saccharomyces BCD zu charakterisieren und gegen eng verwandte Hefestämme abzugrenzen. Einige exemplarische Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt: es ist zu erkennen, daß von den 4 gezeigten Primerpaaren zwei eindeutig unterschiedliche Bandenmuster ergeben (Fig. 1, durch Pfeile dargestellt). In der Figur 1 ist dies Ergebnis noch einmal schematisch ausgewertet.
Tabelle 4: Erhaltene Banden mit Primerpaaren 3, 4, 7, 9 bei BCD und einem Referenzstamm
Der Stamm Saccharomyces BCD ( = Saccharomyces BCD Nr. 14143) ist bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig unter der Nummer hinterlegt DSM 13850 hinterlegt worden. In einem Vergleich mit mehr als 30 anderen Stämmen der Gattung Saccharomyces nach der oben dargestellten Methode weist Saccharomyces BCD einzigartige molekularbiologische Eigenschaften auf. Kultivierung von Saccharomyces BCD
Der Stamm Saccharomyces BCD wurde 2%ig in DS-Medium für die Vorkultur inokuliert und 20 h bei 28°C und 120 Upm inkubiert. Zum Erntezeitpunkt hat die Kultur eine OD600 von ca. 25.
DS-Medium:
Saccharose 50,00 g/l
(NH4)2SO4 5,00 g/l
Na-Glutamat 10,00 g/l
(NH4)H2PO4 3,2 g/l KCI 1,5 g/l
MgS04 0,75 g/l
CaCI2 0,1 g/l myo-lnosit 0,1 g/l
Hefeextrakt 2,5 g/l
Außerdem wurden dem Medium Vitamine und Spurenelemente hinzugefügt.
Für eine Batch-Fermentation wurden 3 I Batch-Medium bis zu einer Anfangs-OD600 von 0,5 inokuliert, entsprechend 50-60 ml Vorkultur. Die Fermentation erfolgte in einem Gesamtvolumen von 3 I. Die Fermentation wird bei 25°C, pH 5,0, 1 wm Belüftung und einer Rührerdrehzahl von 500-700 UpM für ca. 30 Stunden durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt liegt ein TS-Gehalt von ca. 16 g/l bzw. eine OD600 von 63 vor.
Batch-Medium:
Saccharose 50,00 g/l
(NH4)2S04 5,28 g/l
(NH4)H2PO4 0,70 g/l
KCI 0,61 g/l
MgS0 0,32 g/l
CaCI2 0,1 g/l myo-lnosit 0,1 g/l
Hefeextrakt 2,5 g/l Herstellung von Gärqetränken
Die Hefe wurde Kirschsaft zugegeben. Anschließend wurde 2 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Der Geschmack wurde im Vergleich zu anderen Hefen getestet. Das Ergebnis ist in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst.
Fünfteilige Skala: sehr gut, gut, befriedigend, ausreichend, nicht ausreichend
* Als Geschmackskriterium diente das Urteil von 5-10 Probanden. In der Skalierung wurde ein bekömmliches Getränk, entsprechend bei Weingetränken einem Federweißen, mit sehr gut bewertet. Die Note „sehr gut" wurde nur vergeben, wenn die Kirschsaft-Geschmacksvarianten aufwies, die ihn deutlich über den Geschmack anderer Kirschsaftsorten stellten. Eine noch akzeptable Abweichung vom idealen Getränk in der Bekömmlichkeit (zu sauer, zu viel Gas, leichter Beigeschmack nach Kork etc.) wurde mit „gut" eingestuft, eine starke Abweichung (Getränk ist nicht mit Freude zu trinken) mit befriedigend. Ungenießbare Getränke und Übelkeit erregende Getränke hätten die Bewertung ausreichend bzw. nicht ausreichend erhalten. Saccharomyces BCD wurde auch zur Herstellung von Kefir verwendet. Es stellte sich heraus, dass das Kefir-Produkt dem mit anderen Hefen hergestellten geschmacklich überlegen ist. Die nachfolgende Tabelle fasst die Ergebnisse zusammen:
Geschmacksnotenskala von 1 (sehr gut) bis 5 (nicht ausreichend) (Mittelwert der Beurteilung mehrerer Testpersonen). Als Geschmackskriterium diente das Urteil von 5-10 Probanden. In der Skalierung wurde ein bekömmlicher Kefir, vergleichbar einem frischen Joghurt mit sehr gut bewertet. Die Note 1 (sehr gut) wurde nur vergeben, wenn der Kefir Geschmacksvarianten aufwies, die ihn deutlich über den Geschmack anderer Kefirsorten stellten. Eine noch akzeptable Abweichung vom idealen Getränk in der Bekömmlichkeit (zu sauer, zu viel Gas, leichter bitterer Beigeschmack etc.) wurde mit gut (2) bewertet, eine starke Abweichung (Kefir ist nicht mit Freude zu trinken) mit befriedigend (3). Ungenießbare Getränke und Übelkeit erregende Getränke hätten die Bewertung ausreichend (4) bzw. nicht ausreichend (5) erhalten. Die Stämme A und B stammen aus der Stammsammlung von BioteCon Diagnostics. Sie stehen stellvertretend für viele weitere getestete Hefestämme. Stabilität des Ivophilisierten Saccharomyces BCD
Zur Verabreichung als Medikament kann es notwendig sein, die Hefe Saccharomyces BCD zu lyophilisieren. Nachfolgend wird eine experimentelle Reihe dargestellt, in der gezeigt wird, dass die Hefe in der Lage ist, den Prozess der Lyophilisierung quantitativ zu überleben. Insbesondere ist es möglich, den Stamm ausgehend von Hefemilch zu lyophilisieren.
Die nachfolgenden Fermentationsbedingungen führen zu hohen Lebendkeimzahlen und ermöglichen eine gute Überlebensrate bei der nachfolgenden Aufarbeitung.
Zur Vorkultivierung beträgt die Animpfmenge 2,5%, d.h. für die Kultivierung eines 5 m3-Fermenters ergibt sich folgende Anstell-Stufung: 3 I - 125 I --> 5 m3 (Hauptkultur). Die Vorkulturstufen werden jeweils für 20 h bei 30° C als Batchansatz herangezogen.
Für die Hauptkultivierung erfolgt eine Batchfermentation für 25 h bei 30° C. Anschließend an diese Phase erfolgt eine Zufütterung von konzentrierter Saccharoselösung (20-25%ig) in weiteren 4-5 Stunden. Die Gesamtmenge beträgt etwas 10% des Gesamtvolumens der Fermentation.
Nach ca. 30 h Fermentationszeit werden im 5 m3 Fermenter 100 kg Hefe Trockensubstanz produziert. Dies entspricht einer zu lyophilisierenden Suspension mit ca. 20% TS-Gehalt von 500 kg Feuchtprodukt.
Anzuchtmedium:
Saccharose 50,00 g/l
MgSO4 x 7H2O 0,25 g/l (NH4)H2P04 0,25 g/l MgS04x 7 H2O 0,55 g/l NH4CI 2,8 g/l meso-lnosit 0,08 g/l
MgCI2 x 6 H20 0,25 g/l
CaCI2x2H2O 0,1 g/l KH2PO4 2,0 g/l
Na-Glutamat 10,0 g/l Hefeextrakt 2,5 g/l Zur Abtrennung der Biomasse wird die Kultursuspension (ca. 5 m3) zuerst zentrifu- giert und der Kulturüberstand verworfen. Anschließend erfolgt eine Waschung der Biomasse mit Trinkwasser. Dieser Waschschritt wird mit etwa 15% Wasser bezogen auf die verarbeitete Hefesuspension angesetzt.
Zur Gefriertrocknung wird die gewaschene Feuchtbiomasse mit 20% Schutzmedium (bezogen auf die Trockensubstanz) versetzt. Das Schutzmedium wird je nach Feuchtigkeitsgehalt der separierten Hefe in fester Form als Pulver im Falle einer Hefemilch oder als 20%ige wässrige Lösung zur Resuspension einer stichfesten Hefemasse eingesetzt.
Der Einfriervorgang spielt eine entscheidende Rolle für die Vitalität der Hefezellen. Ein langsames Einfrieren mit einer Temperaturänderung von 1 °C/min führt zur optimalen Überlebensrate im Produkt. Es wird bei einer Temperatur zwischen -20 und -30°C lyophilisiert. Nach beendeter Lyophilisierung enthält das Produkt mindestens 2 x 1010 lebensfähige Hefezellen und hat einen Wassergehalt < 5%. Bei einer Suspension von 1 ,5 g Saccharomyces BCD in 5 ml Wasser wurde der eutektische Punkt mit -18°C bestimmt.
Nachfolgend sind die Überlebensraten des lyophilisierten Hefeproduktes bei Verwendung verschiedener Schutzmedien dargestellt.
Anwendung Gesundheit
Zur Anwendung als Probiotikum kann Saccharomyces BCD als Suspension eingenommen werden. In diesem Fall kann die Hefe in einem Getränk suspendiert werden. Es besteht auch die Möglichkeit das Getränk mit Hilfe der Hefe einige Tage zu fermentieren. Da in diesem Fall Alkohol erzeugt wird, kann auf diese Weise ein pro- biotisches Bier oder ein probiotischer Wein erzeugt werden. Außerdem kann diesen Alkoholgetränken sekundär der Alkohol entzogen werden, so das probiotische alkoholreduzierte oder alkoholfreie Gärgetränke entstehen.
Zur Verabreichung als Medikament kann Saccharomyces BCD lyophilisiert werden. In diesem Fall ist eine Aufnahme durch Menschen oder Tiere in hoher Zellzahl möglich. So wurde nach der Verabreichung von Saccharomyces BCD eine deutliche Reduktion von Diarrhöe bei Pferden festgestellt.
Weitere Applikationen bestehen in der Verwendung von Saccharomyces BCD als Komponente von gebackenen Lebensmitteln, wie Brot, Kuchen, Gebäck und ähnliches. Auch können Extrakte von dieser Hefe hergestellt werden. In diesem Fall können einzelne Komponenten angereichert oder isoliert werden, die verzehrt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Hefestamm, der bei der molekulargenetischen Charakterisierung mittels PCR
mit dem Primerpaar 3 umfassend SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6; mit dem Primerpaar 4 umfassend SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8; mit dem Primerpaar 7 umfassend SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14 mit dem Primerpaar 9 umfassend SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18,
das in Figur 1 gezeigte Bandenmuster liefert.
2. Hefestamm nach Anspruch 1 , der das Bandenmuster nach PCR liefert, wie erhalten mit den Primerpaaren 1 - 13.
3. Hefestamm nach Anspruch 1 oder 2, mit der Hinterlegungsnummer DSM 13850 und hiervon abgeleitete Derivate.
4. Primer zur molekulargenetischen Charakterisierung von Hefen ausgewählt aus: einem der Primer mit einer der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 26, Sequenzen, die mit den genannten Primersequenzen hybridisieren, und Sequenzen, die zu mindestens 80% Identität zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 26 aufweisen.
5. Verwendung einer Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Mitteln für die Aufnahme durch Tier- und/oder Mensch.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel ein Medikament, ein Probiotikum, ein Gärgetränk, eine Suspension, einen Extrakt oder Gebäck darstellt.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefe in lyophylisierter Form einem Extrakt davon oder deren Kulturüberstand verabreicht wird.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Behandlung von Diarrhöe, Colitis, Darminfektionen, Candida-Infektionen oder Hauterkrankungen eingesetzt wird.
9. Mittel enthaltend einen Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine lyophilisierte Form davon oder Kulturüberstände oder einem Extrakt davon zur Verabreichung an Mensch und/oder Tier.
10. Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von Hefe umfassend den Schritt:
Durchführen einer PCR-Analyse des genetischen Materials der Hefe mit mindestens einem der Primerpaare 1 - 13, vorzugsweise mit mindestens 4 verschiedenen Primerpaaren, ganz besonders bevorzugt mit sämtlichen Primerpaaren 1 - 13.
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