ES2291896T3 - Producto inmunomodulador obtenido a partir de un cultivo de bifidobacterium y composiciones que lo contienen. - Google Patents
Producto inmunomodulador obtenido a partir de un cultivo de bifidobacterium y composiciones que lo contienen. Download PDFInfo
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Abstract
Producto inmunomodulador, caracterizado porque se obtiene de acuerdo con un procedimiento de preparación que comprende las siguientes etapas: - siembra e incubación en condiciones aerobias o anaerobias, preferiblemente anaerobias, y a una temperatura comprendida entre aproximadamente 30 y 40ºC, de Bifidobacterium que comprende al menos la cepa Bifidobacterium breve I-2219 en un sustrato acuoso que presenta un pH comprendido entre aproximadamente 6 y 8 que comprende al menos los siguientes ingredientes: i) permeado de lactosuero. ii) un hidrolizado de proteínas de lactosuero. iii) lactosa, - eliminación de los Bifidobacterium del sustrato acuoso; - ultrafiltración del sustrato acuoso en membranas de filtración que tengan un umbral de corte comprendido entre 100 y 300 kDa para obtener un retentado concentrado; - deshidratación del retentado concentrado; - disolución del retentado deshidratado en un tampón; - cromatografía de exclusión en gel en una columna que presenta un umbral deexclusión de 600 kDa de la solución del retentado; - recuperación de la fracción excluida después de la cromatografía que constituye el producto inmunomodulador.
Description
Producto inmunomodulador obtenido a partir de un
cultivo de Bifidobacterium y composiciones que lo
contienen.
La presente invención se refiere a un producto
inmunomodulador obtenido a partir de un cultivo de
Bifidobacterium, a su utilización, particularmente como
medicamento o como ingrediente alimentario, así como a composiciones
farmacéuticas o alimentarias que lo contiene.
El género Bifidobacterium forma parte de
la familia de los Actinomycetaceae, reúne a bacilos Gram
positivos, anaerobio estrictos, que fermentan glucosa por la vía de
la fructosa 6-fosfato fosfocetolasa. Su pH óptimo
de crecimiento está comprendido entre 6 y 7 y su temperatura óptima
de crecimiento está comprendida entre 37 y 46ºC.
Las bifidobacterias forman parte de la flora
intestinal humana norma y se les reconocen numerosos efectos
beneficiosos para la salud. Se sabe particularmente que los
lactantes a los que se da el pecho, que poseen una flora intestinal
en la que predominan las bifidobacterias resisten mejor a las
infecciones y presentan particularmente un riesgo de diarrea más
reducido que los lactantes alimentados con preparaciones lácteas
industriales convencionales.
El papel de las bifidobacterias en esta
resistencia aumentada contra infecciones no se ha determinado
completamente. Diferentes estudios indican que poseen un poder
inmunomodulador que implicaría sustancias a base de polisacáridos
asociadas a la pared bacteriana, o secretadas por las bacterias
durante la fermentación anaerobia. Gomez et al., (FEMS
Microbiol. Lett., 1988, 56, 47-52) describen el
efecto inmunomodulador de las fracciones exocelulares ricas en
polisacáridos producidas por Bifidobacterium adolescentis; la
solicitud de patente FR 2 652 590 describe un exopolímero
inmunopotenciador de naturaleza polisacarídica producido por una
cepa del continuum Bifidobacterium infantis longum; Honoso
et al., (Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61,
312-316 y Bioscience Microflora, 1998, 17,
97-104) describen polisacáridos inmunopotenciadores
producidos por diferentes especies de Bifidobacterium. La
acción inmunomoduladora de las bacterias se manifiesta también
mediante la regulación de la microflora intestinal en particular en
detrimento del desarrollo de especies bacterianas patógenas. Romond
et al. (Anaerobe, 1997, 3, 137-143 y J. Dairy
Sci., 1998, 81, 1229-1235) describen por lo tanto
fracciones ricas en glicoproteínas, producidas por
Bifidobacterium breve en condiciones de fermentación
anaerobia, e inducen in vivo un efecto regulador de la
microflora intestinal.
Por lo tanto en el mercado se encuentran
numerosos productos fementados por bifidobacterias, opcionalmente
asociadas a otras bacterias lácticas y cuya ingestión permite
beneficiarse de dichos efectos inmunomoduladores de las
bifidobacterias y de sus productos de fermentación.
Sin embargo, y en el caso particular de la
alimentación infantil, estos presentan el inconveniente de ser muy
ácidos y presentar particularmente en el caso de productos en polvo,
un aspecto no homogéneo después de la reconstitución, debido a la
coagulación de proteínas de la leche por la acidez generada durante
la fermentación. Por lo tanto, a veces son mal aceptados por el
niño y la madre.
Para remediar estos inconvenientes se ha
propuesto ya en la solicitud internacional WO 01/01785, un
procedimiento de preparación de un producto lácteo
inmunoestimulador por bioconversión, sin fermentación y por lo tanto
sin acidificación del producto final, de un sustrato lácteo con
ayuda de bifidobacterias y en particular de la cepa
Bifidobacterium breve, depositada según el tratado de
Budapest el 31 de mayo de 1999, con el número
I-2219 en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de
Microorganismos) que posee el Instituto Patear, 25 rue du Docteur
Roux, en Paris.
Sin embargo, el procedimiento de preparación
descrito en esta solicitud internacional no permite preparar
productos alimentarios diferentes de productos lácteos y necesita
condiciones de puesta en práctica exigentes desde el punto de vista
industrial, particularmente el mantenimiento de condiciones de
cultivo aerobias, el mantenimiento del medio de cultivo a una
presión osmótica correspondiente a de 0,93 a 0,97 de actividad de
agua (AW) y/o el mantenimiento del medio de cultivo a una
temperatura comprendida entre 40 y 48ºC.
Por otro lado, las bacterias del género
Bacteroides fragilis representan aproximadamente del 30 al
50% de la flora presente en las materias fecales del ser humano. Su
ubicación es mayoritariamente a nivel del colón (10^{11}
bacterias por gramo de excrementos). Sin embargo, en caso de
proliferación anormal, las bacterias del género Bacteroides
fragilis son responsables del 80% de las infecciones bacterianas
anaerobias y son cada vez más frecuentes debido a su resistencia
creciente a los tratamientos con antibióticos. Su proliferación
anormal en el organismo puede conllevar:
- la formación de abscesos (abdominal, del
cerebro, del hígado, de la pelvis, del pulmón, del bazo),
- septicemia,
- diarreas, principalmente en niños
pequeños,
- endocarditis,
- peritonitis,
- neumonías, particularmente necrotizantes.
Se ha informado de una tasa de mortalidad del
60% en caso de falta de tratamiento de las infecciones por
Bacteroides fragilis.
Por lo tanto puede ser interesante poder
disponer de un producto que permita controlar la proliferación de
Bacteroides fragilis.
Por lo tanto, para remediar el conjunto de los
inconvenientes que presentan los productos descritos en la técnica
anterior y para proporcionar un producto inmunomodulador que pueda
incorporarse en cualquier tipo de producto alimentario o utilizarse
para las preparación de composiciones farmacéuticas
inmunomoduladoras, los inventores han puesto a punto el objeto de
la invención.
Los inventores han tomado también como objetivo
proporcionar una composición alimentaria o farmacéutica que tenga
un efecto regulador de la microflora intestinal, en particular en
detrimento del desarrollo de especies bacterianas patógenas,
particularmente Bacteroides fragilis.
La presente invención se refiere por lo tanto en
primer lugar a un producto inmunomodulador caracterizado porque se
obtiene de acuerdo con un procedimiento de preparación que comprende
las siguientes etapas:
- siembra e incubación en condiciones aerobias o
anaerobias, preferiblemente anaerobias, y a una temperatura
comprendida entre 30 y 40ºC aproximadamente, de
Bifidobacterium que comprende al menos la cepa
Bifidobacterium breve I-2219 en un sustrato
acuoso que presenta un pH comprendido entre aproximadamente 6 y 8, y
que comprende al menos los siguientes ingredientes:
- i)
- permeado de lactosuero.
- ii)
- un hidrolizado de proteínas de lactosuero.
- iii)
- lactosa,
- eliminación de los Bifidobacterium del
sustrato acuoso;
- ultrafiltración del sustrato acuoso en
membranas de filtración que tengan un umbral de corte comprendido
entre 100 y 300 kDa para obtener un retentado concentrado,
- deshidratación del retentado concentrado,
preferiblemente por liofilización;
- disolución del retentado deshidratado en un
tampón;
- cromatografía de exclusión en gel en una
columna que presenta un umbral de exclusión de 600 kDa de la
solución del retentado;
- recuperación de la fracción excluida después
de la cromatografía que constituye el producto inmunomodulador.
La fracción excluida obtenida empleando el
procedimiento de acuerdo con la invención presenta propiedades
inmunomoduladoras; en particular permite estimular la proliferación
de Bifidobacterium y disminuir la población de
Bacteroides fragilis en la flora intestinal.
De acuerdo con la invención, el permeado de
lactosuero que entra en la composición del sustrato acuso puede
presentarse en forma de polvo, obtenido por ultrafiltración de
lactosuero, después del secado (por pulverización o por cualquier
otra técnica de secado) de la fracción líquida, desmineralizada o
no, que atraviesa la membrana durante la ultrafiltración del
lactosuero.
Los hidrolizados de proteínas de lactosuero
utilizables en el marco de la presente invención pueden obtenerse
mediante métodos utilizados habitualmente para la preparación de
hidrolizados de proteínas, particularmente hidrólisis enzimática de
proteínas de lactosuero con ayuda de proteasas, tales como tripsina,
quimiotripsina, etc. Se conocen y están disponibles en el mercado
numerosos concentrados o aislados de proteínas del suero al igual
que los hidrolizados de proteínas de lactosuero, adecuados para la
puesta en práctica de la invención.
Antes de su utilización, el sustrato acuosos se
filtra preferiblemente en membranas, tales como por ejemplo
polietersulfona que tienen un umbral de corte comprendido entre 100
y 300 kDa y después el permeado se esteriliza en un autoclave a una
temperatura de aproximadamente 120ºC durante aproximadamente 30
minutos para evitar cualquier contaminación bacteriana indeseable
del medio de cultivo.
Antes del empleo, el pH del sustrato acuoso
puede ajustarse al valor deseado con ayuda de cualquier agente
alcalinizante utilizado de forma convencional por el especialista en
la técnica, tal como por ejemplo sosa o postasa.
Los Bifidobacterium se siembran,
preferiblemente, en el sustrato acuoso a razón de 1\cdot10^{4} a
4\cdot10^{9} unidades formadoras de colonias (UFC) por ml de
sustrato. Esta siembra puede realizarse por ejemplo por adición al
sustrato acuoso, en proporciones adecuadas, de un concentrado
congelado de Bifidobacterium o de un precultivo en un medio
que permita el crecimiento de bifidobacterias.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, el pH del sustrato acuoso se mantiene a un valor
comprendido entre aproximadamente 6 y 8 durante todo el periodo de
incubación y aún más preferiblemente entre 6,5 y 7,5. El
mantenimiento del pH se realiza preferiblemente mediante una
neutralización continua del sustrato acuoso con ayuda de un agente
alcalinizante tal como se ha descrito anteriormente o con una
solución de amoniaco diluido (preferiblemente a la mitad).
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la temperatura del sustrato se mantiene a un valor
comprendido entre aproximadamente 37 y 40ºC durante todo el periodo
de incubación, estando esta generalmente comprendida entre 10 y 20
horas.
De acuerdo con una realización preferida del
procedimiento de acuerdo con la invención, los ingredientes del
sustrato acuoso están presentes en las siguientes cantidades:
- i)
- permeado de lactosuero: de aproximadamente 3 a 80 g, y aún más preferiblemente de aproximadamente de 40 a 60 g,
- ii)
- hidrolizado de proteínas de lactosuero: de aproximadamente 2 a 80 g y aún más preferiblemente de aproximadamente 5 a 15 g,
- iii)
- lactosa: de aproximadamente 5 a 50 g, y aún más preferiblemente de aproximadamente 10 a 30 g,
estando dadas estas cantidades por litro de
sustrato acuoso.
De acuerdo con una realización particular de la
invención, el sustrato puede comprender además al menos un
ingrediente adicional seleccionado entre extractos de levadura,
sales tamponantes y clorhidrato de cisteína.
Cuando el sustrato acuso comprende una sal
tamponante, ésta se selecciona preferiblemente entre
dihidrogenofosfato de sodio y dihidrogenofosfato de potasio y
representa preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 5 g y aún más
preferiblemente de aproximadamente 1,5 a 3 g por litro de sustrato
acuoso.
Cuando el sustrato acuoso comprende un extracto
de levadura, éste representa preferiblemente de aproximadamente 0,5
a 5 g y aún más preferiblemente de aproximadamente 1,5 a 3 g por
litro de sustrato acuoso.
Cuando el sustrato acuoso comprende clorhidrato
de cisteína, éste representa preferiblemente de aproximadamente 100
a 500 mg y aún más preferiblemente de aproximadamente 200 a 400 mg
por litro de sustrato acuoso.
Al finalizar el periodo de incubación, la
eliminación de los Bifidobacterium del medio de cultivo puede
realizarse por ejemplo mediante microfiltración o mediante
centrifugado del sustrato acuoso. De acuerdo con una realización
preferida de la invención, la eliminación de los
Bifidobacterium del medio de cultivo se realiza por
centrifugado del sustrato acuosos, por ejemplo a una velocidad de
3000 g durante aproximadamente 1 hora.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, el procedimiento comprende además, después de la etapa
de eliminación de los Bifidobacterium, una etapa
suplementaria de destrucción de las actividades enzimáticas
residuales contenidas en el sustrato acuoso después de la
incubación, por ejemplo por un tratamiento térmico de éste a una
temperatura de aproximadamente 75ºC durante aproximadamente 3
minutos.
La etapa de ultrafiltración del sustrato acuoso
se realiza preferiblemente en membranas de polieterosulfona, a una
temperatura inferior a aproximadamente 60ºC.
Al finalizar la etapa de ultrafiltración, el
retentado concentrado obtenido de este modo se lava preferiblemente
varias veces, por ejemplo con agua permutada antes de reconcentrarse
finalmente, antes de deshidratarse por ejemplo por
liofilización.
El tampón utilizado para la disolución del
retentado deshidratado se selecciona preferiblemente entre tampones
que presentan un pH comprendido entre 6 y 8 tales como el tampón
Tris ajustado al pH deseado mediante adición de ácido
clorhídrico.
La naturaleza de los geles utilizables para
realizar la cromatografía de exclusión no es crítica, dado que
estos presentan un umbral de exclusión de 600 kDa. Como gel pueden
utlilizarse particularmente los geles compuestos por dextrano y
agarosa reticulada tales como el producto comercializado con la
denominación comercial Superdex® 200 por la compañía Amersham
Biosciences.
\newpage
Cuando se termina la cromatografía, la fracción
excluida recuperada puede dializarse a continuación contra agua
destilada y después diluirse opcionalmente para volver a la
concentración inicial de la fracción excluida.
Finalmente, la fracción excluida que constituye
el producto inmunomodulador puede utilizarse directamente o puede
congelarse o liofilizarse para su conservación y posterior
utilización.
Esta fracción excluida está compuesta
esencialmente por un complejo de polisacáridos y proteínas en el que
la fracción glucídica representa aproximadamente del 5 al 30% en
peso, la fracción proteica representa aproximadamente del 70 al 95%
en peso con respecto al peso total de dicho complejo.
De acuerdo con la invención, la fracción
glucídica de la fracción excluida presenta la siguiente composición
de monosacáridos (expresada en proporciones molares con respecto a
ramnosa): galactosa: 5,5 a 8; manosa: 0,8 a 1,3; glucosa: 2,5 a 5;
N-acetilgalactosamina: 0,3 a 1;
N-acetilglucosamina: 0,07 a 0,3; ácido neuramínico
0 a 0,15 y ramnosa: 1.
De acuerdo con la invención la fracción proteica
de la fracción excluida puede comprender al menos un péptido,
obtenido mediante hidrólisis con tripsina, que responde al menos a
una de las siguientes secuencias:
- - RELGIGTPSFLHNGGQWYIYA
- (SEC ID Nº 1)
- - RVLYNPGQYXYVR
- (SEC ID Nº 2)
- - EQATANGQVSSGQQSTGGSAAP
- (SEC ID Nº 3)
La invención también se refiere al producto
inmunomodulador obtenido de acuerdo con el procedimiento descrito
anteriormente como medicamento y en particular como medicamento
inmunomodulador.
Otro objeto de la invención es una composición
farmacéutica caracterizada porque contiene, como principio activo,
al menos un producto inmunomodulador obtenido de acuerdo con el
procedimiento descrito anteriormente y al menos un soporte
farmacéuticamente aceptable.
Por farmacéuticamente aceptable se entiende
cualquier soporte que mientras conserva las propriedades del
producto inmunomodulador obtenido según el procedimiento de acuerdo
con la invención, particularmente sus propiedades
inmunomoduladoras, permiten transportar dicho producto.
La composición farmacéutica de acuerdo con la
invención, puede presentarse en cualquier forma galénica deseada
para una administración por vía oral al ser humano o a un animal,
como por ejemplo en forma líquida para un jarabe o una solución,
una pulverización, o en forma sólida como por ejemplo un polvo, un
comprimido, una gragea, una cápsula, un polvo pulverizado, en sus
diversas formas, de liberación inmediata o programada, una goma,
una pasta, gránulos o en cualquier otra forma adaptada para la
administración por vía oral.
El producto inmunomodulador obtenido según el
procedimiento de acuerdo con la invención también puede
incorporarse, como ingrediente, en composiciones alimentarias.
Por consiguiente, la invención también se
refiere a una composición alimentaria caracterizada porque contiene,
como ingrediente, al menos un producto inmunomodulador obtenido
según el procedimiento de acuerdo con la invención.
Dichas composiciones alimentarias, pueden
destinarse a alimentación humana o animal y pueden presentarse
particularmente en forma de preparación láctea o no, fermentada o
no, de origen animal o vegetal, comprendiendo particularmente
fórmulas infantiles o para adultos y ancianos y en particular en
forma de una preparación láctea infantil, de leche líquida o en
polvo, de productos frescos, de cereales, de galletas (relleno), de
pequeñas copas, de postres, etc., o también en forma de productos
alimentario o dietéticos para adultos, entre los cuales productos
de hospitalización o complementos nutricionales.
La presente invención se entenderá mejor con
ayuda del siguiente complemento de descripción, que se refiere a
ejemplos de preparación del producto inmunomodulador de acuerdo con
la invención, así como a las figuras adjuntas en las que:
- la figura 1 representa el cromatograma
obtenido después de la inyección en una columna forrada con un gel
Superdex® 200, de un medio de cultivo fermentado durante 15 horas
por la cepa Bifidobacterium breve CNCM
I-2219 (absorbancia en milivoltios en función del
tiempo transcurrido en minutos);
- la figura 2 compara los cromatogramas
obtenidos después de la inyección en una columna forrada con un gel
Superdex® 200, de un medio de cultivo fermentado por la cepa
Bifidobacterium breve CNCM I-2219 o por la
cepa B. breve CFPL (Colección de la Facultad de Farmacia de
Lille) C7 (absorbancia en milivoltios en función del tiempo
transcurrido en minutos);
- la figura 3 representa una ampliación de la
figura 2.
Se prepara un medio de cultivo que contiene los
siguientes ingredientes:
- 50 g/l de permeado de lactosuero,
- 10 g/l de hidrolizado de proteínas de
lactosuero,
- 20 g/l de lactosa,
- 2 g/l de extracto de levadura,
- 2,5 g/l de hidrogenofosfato de potasio,
- 0,3 g/l de clorhidrato de cisteína.
El medio de cultivo se ultrafiltra en casetes
Centramate® comercializadas por la compañía PALL, equipadas con
membranas de polietersulfona que tienen un umbral de corte de 200
kDa y el permeado se esteriliza en un autoclave durante 30 minutos
a 120ºC. El pH del medio de cultivo se ajusta entonces a un valor de
6,5 con ayuda de una solución de amoniaco diluido a un cuarto.
El medio de cultivo se siembra a continuación
con las bifidobacterias a razón de 6\textperthousand (v/v) de un
concentrado congelado de la cepa de Bifidobacterium breve
CNCM I-2219 que contienen 5\cdot10^{10} UFC de
bifidobacterias por ml de concentrado congelado. La población
inicial de bacterias es de 3\cdot10^{8} UFC de bifidobacterias
por ml de medio de cultivo. Las bifidobacterias se cultivan en
anaerobiosis a una temperatura comprendida entre 37 y 40ºC. Durante
el cultivo, el pH del medio de cultivo se regula a 6,5 por medio de
una solución de amoniaco diluido a un cuarto. El tiempo de cultivo
es de 15 horas y la población de Bifidobacterium al
finalizar el cultivo es de aproximadamente 2\cdot10^{7} UFC por
ml de medio de cultivo.
Al finalizar el cultivo, las bacterias se
eliminan del medio de cultivo fermentado mediante un centrifugado
de 1 hora a 3000 g. Las actividades enzimáticas residuales
contenidas en el sobrenadante del centrifugado se destruyen
mediante un tratamiento térmico de 3 minutos a 75ºC.
El sobrenadante se ultrafiltra en casetes
Centramate® comercializadas por la compañía PALL, equipadas con
membranas de polietersulfona que tienen un umbral de corte de 300
kDa a una temperatura de aproximadamente 40ºC. De este modo, se
concentra 3 veces y después se lava 3 veces con agua permutada.
Durante el último lavado, se realiza una concentración de 7 veces
de la parte retenida por la membrana. De este modo se obtiene un
concentrado llamado retentado. El retentado se deshidrata por
liofilización y después se vuelve a colocar en un tampón
Tris-NaCl a pH 8.
La composición del retentado se estudia mediante
cromatografía de exclusión.
Para realizar esto, se inyectan 25 \mul de
retentado a un caudal de 0,6 ml por minuto en una columna de gel
Superdex®200 comercializada por la compañía Amersham Biosciences y
que presenta un umbral de exclusión de 600 kDa, acoplada a un
detector UV con un medidor de diodos (200-300 nm).
La integración de la señal se realiza con ayuda del programa
KromaSystem® 2000 comercializado por la compañía Kontron
Instruments. De este modo se separan dos fracciones: una fracción
excluida del gel se eluye después de 12,5 minutos a partir de la
inyección y una fracción filtrada se eluye de 12 a 32 minutos a
partir de la inyección.
Los resultados obtenidos en el retentado después
de 15 horas de fermentación se representan en la figura 1 adjunta
que representa la absorbancia (en milivoltios) en función del tiempo
transcurrido (en minutos) después de la inyección del retentado en
la columna. Estos resultados representan un cromatograma típico que
muestra la fracción excluida y la fracción filtrada del retentado
analizado de este modo.
Las figuras 2 y 3 representan cromatogramas
obtenidos después del análisis de un retentado obtenido a partir de
un cultivo realizado como se ha descrito anteriormente y de un
retentado obtenido a partir de un cultivo realizado en las mismas
condiciones pero con una cepa diferente de bifidobacterias (B.
breve CFPL C7).
La figura 2 representa la absorbancia (en
milivoltios) en función del tiempo transcurrido (en minutos) después
de la inyección en la columna de los retentados correspondientes a
dos cultivos realizados respectivamente con la cepa B. breve
CNCM I-2219 y con la cepa B. breve CFPL C7.
Estos resultado demuestran que, al contrario que el retentado del
cultivo realizado con la cepa B. breve CNCM
I-2219, el cromatograma del retentado del cultivo
realizado con la cepa B. breve CFPL C7 no presenta ningún
pico correspondiente a la fracción excluida ni a la fracción
filtrada del retentado. Por el contrario, la figura 3 que representa
una ampliación de la figura 2, muestra que es necesario aumentar
considerablemente la escala de absorbancia de la figura 2 para
hacer aparecer la fracción excluida y la fracción filtrada del
retentado correspondiente al cultivo realizado con la cepa B.
breve CFPL C7. Estos resultados demuestran de esta manera que la
cepa B. breve CFPL C7 no presenta el potencial de producción
de principios activos que presenta la cepa B. breve CNCM
I-2219.
El retentado concentrado, que se ha vuelto a
colocar previamente en un tampón Tris-NaCl a pH 8,
se somete a una cromatografía preparativa. La separación se realiza
por cromatografía en columna de gel Superdex® 200 comercializado
por la compañía Amersham Biosciences de 50 mm de diámetro y 100 cm
de altura, alimentado con un caudal de 5 ml por minuto y que
presenta un umbral de exclusión de 600 kDa. Las fracciones se
recogen en 10 ml y su absorbancia se mide a 280 nanómetros.
De este modo se separan dos fracciones:
- una fracción excluida del gel de peso
molecular superior a 600 kDa (tiempo de retención de 130 a 180
minutos +/- el 10%),
- una fracción filtrada de peso molecular
comprendido entre 200 y 600 kDa (tiempo de retención de 187 a 370
minutos +/- el 10%).
La fracción excluida o parte activa se dializa
contra agua destilada y después se diluye para volver a la
concentración del retentado. Esta fracción puede conservarse a
continuación en forma congelada o liofilizada. La fracción filtrada
también puede conservarse de la misma manera.
El polvo liofilizado de fracción excluida, tal
como se ha preparado anteriormente en el ejemplo 1 (10 mg), se
recoge con hidrazina anhidra pura (200-300 \mul).
La mezcla se incuba durante una noche a 110ºC, se seca en flujo de
nitrógeno y se recoge en 1 ml de agua. A continuación la solución se
fracciona mediante permeación en gel en columna Fractogel TSK
comercializada con la referencia HW40 por la compañía Merck y la
elución se realiza en agua. La presencia de azúcares en las
diferentes fracciones recogidas se busca mediante el método del
orcinol y mediante cromatografía en capa fina. Los resultados
obtenidos (que no se representan) muestran que la mayoría de los
azúcares están en la fracción no retenida en el gel (> 10 kDa) y
migra muy poco después de la cromatografía en capa fina. La parte
glucídica de la fracción excluida constituye por lo tanto un
polisacárido de masa molar superior a 10 kDa. La parte glucídica de
la fracción excluida representa aproximadamente del 15 al 20% en
masa de ésta.
La composición molar de la fracción de la
fracción glucídica de la parte activa se determina por cromatografía
en fase gaseosa, después se metanoliza con ayuda de una mezcla de
ácido clorhídrico 0,5M y metanol durante 24 horas a 80ºC.
Se analizan dos muestras de la fracción excluida
(muestras 1 y 2 CNCM I-2219: respectivamente M1 y
M2) que proceden de dos ensayos diferentes realizados de acuerdo
con el ejemplo 1.
Como comparación, se han realizado los mismos
análisis sobre una muestra en la que la cepa Bifidobacterium
breve CNCM 1-2219 se ha sustituido con la cepa
Bifidobacterium breve CFPL C7 (muestra C7) cultivada en las
mismas condiciones, así como en una muestra en la que la cepa
Bifidobacterium breve CNCM I-2219 se ha
cultivado en un medio de lactosa no de acuerdo con la invención
(muestra de medio de lactosa; ML) de la siguiente composición:
- 60 g/l de lactosa;
- 2 g/l de extracto de levadura;
- 0,3 g/l de clorhidrato de cisteína.
Siendo las siguientes etapas de extracción y de
purificación comparables en todo momento a las descritas
anteriormente.
Las proporciones molares de monosacáridos dados
(expresados con respecto a la ramnosa) obtenidos para la fracción
excluída de estas diferentes muestras se reúnen en la Tabla 1 a
continuación:
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Puede observarse la ausencia de ramnosa en la
muestra C7 en la que la cepa Bifidobacterium breve CNCM
I-2219 se ha sustituido con la cepa
Bifidobacterium breve CFPL C7. También puede constatarse que
la distribución de los azúcares entre las muestras M1 y M2 es
diferente a la de la muestra ML que corresponde a la cepa
Bifidobacterium breve CNCM I-2219 cultivada
en un medio con lactosa no de acuerdo con la invención. En
particular, las muestras M1 y M2 contienen más galactosa y
N-acetilgalactosamina que la muestra ML y menos
manosa que la muestra ML.
La fracción proteica de la parte activa
representa aproximadamente del 80 al 85% en masa de esta última.
La secuenciación de la parte proteica de la
parte activa se realiza después de una etapa de proteolisis con
ayuda de una solución de tripsina al 1% en un tampón Tris 0,1 M a pH
8,5, como se describe en el artículo Rosenfeld J. et al.,
Analytical Biochemistry, 1992, 203, 173-179.
Los péptidos se purifican con HPLC de fase
inversa en una columna Ultrasphere® ODS (octadecilsilano) de un
diámetro de 2 mm y una longitud de 200 mm comercializada por la
compañía Beckmann. La elución se realiza con un gradiente lineal de
acetonitrilo en una solución de ácido trifluoroacético al 0,1%.
Los péptidos aislados se secuencian (de acuerdo
con el método descrito en el artículo de Rosenfeld J. et al.,
mencionado anteriormente) en un aparato de referencia Procise 492
comercializado por la compañía Perkin-Elmer.
A continuación se comparan las secuencias a las
contenidas en las siguientes bases de datos: GenBank CDS traslation,
PDB (Protein Data Bank), SwissProt, PIR (Protein Information
Resource), PRF (Protein Reserach Foundation), utilizando el
programa BLAST 2.2 (Basic Local Alignment Search Tool) del
NCBI (Nacional Center for Biotechnology Information).
Este análisis ha permitido demostrar que la
fracción proteica de la parte activa está constituida principalmente
por péptidos del medio lácteo (lactoferrina,
beta-lactoglobulina, albúmina del suero), que por un
lado presenta una buena homología (mínimo del 60%) con una
secuencia de proteínas de Bifidobacterium longum
(RELGIGTPSFLHNGGQWYIYA (SEC ID Nº 1) y de la que, por otro lado, no
se ha podido determinar homología significativa con secuencias
conocidas y que poseen las siguientes secuencias:
- - RVLYNPGQYXYVR
- (SEC ID Nº 2)
- - EQATANGQVSSGQQSTGGSAAP
- (SEC ID Nº 3).
Se ha estudiado el efecto de la fracción
excluida (parte activa), obtenida de acuerdo con el procedimiento
descrito anteriormente en el ejemplo 1, sobre la evolución de la
flora intestinal de ratones.
El ensayo se ha realizado en ratones macho C3H
que son ratones de segunda generación de una línea de animales
axénicos, a los que se les ha implantado una flora intestinal de ser
humano adulto (procedente del CDTA, Centro de Distribución,
Tipificación y Archivo Animal, CNRS, Orleáns, Francia).
Los ratones se mantienen en jaulas de
aislamiento para evitar cualquier modificación de su nueva flora
intestinal. En el momento de su recepción, los ratones tienen
8-10 semanas de edad. Se deja a los ratones un
periodo de adaptación de al menos 2 semanas después de la recepción
para suprimir cualquier estrés debido al transporte y para que se
aclimaten a su nuevo entorno.
Durante todo este periodo de adaptación y hasta
el comienzo del experimento, cada ratón dispone de agua estéril
como bebida.
Durante toda el periodo del experimento, el
alimento utilizado como base alimentaria es un régimen convencional
de gránulos RO3 comercializados por la compañía UAR esterilizados
mediante irradiación que contienen el 25% de proteínas, el 49,8% de
glúcidos, el 5% de lípidos y el 4% de celulosa.
Durante los 21 días de ensayo, el agua de los
biberones se sustituye con diferentes productos a ensayar, es decir
la fracción filtrada y la fracción excluida a razón de 6 ml por día
y por ratón. Se realiza un cambio diario de los biberones para
evitar cualquier modificación de la composición de los productos a
ensayar por proliferación bacteriana. Se recogen los excrementos
para el análisis antes del tratamiento (T0) y después al 7º, al
15º, y al 21^{er} día durante la administración del producto. (T7,
T15, T21).
Cada producto se ensaya en un lote de al menos 6
ratones y se sigue la evolución de las bacterias
Bifidobacterium y Bacteroides fragilis en la flora
intestinal de los ratones.
Las extracciones de excremento se realizan en
tubos de hemolisis estériles y se pesan de forma aséptica y después
se diluyen en solución pre-reducida de Ringer,
diluida a un cuarto y suplementada con clorhidrato de cisteína (0,3
g/l), para obtener diluciones a un décimo que varían entre 10^{-1}
y 10^{-4}. El contenido se deposita finalmente a razón de 100
\mul por placa, en diferentes medios de cultivo contenidos en
placas de Petri.
- medio de Beerens (Be) (constituido por 35 g/l
de base de agar-agar Columbia, 5 g/l de glucosa, 0,3
g/l de clorhidrato de cisteína, el 0,5% de ácido propiónico y
ajustado a pH 5) para la búsqueda y el recuento de
Bifidobacterium, después de la presentación de diluciones que
varían de 10^{-1} a 10^{-4};
- medio Bacteroides Bile Esculine (BBE)
(constituido por 37 g/l de triptona, 32 g/l de Bile Esculin
Agar (DIFCO), 0,5 g/l de esculina, 0,5 g/l de citrato de hierro
amoniacal, el 0,2% de una solución de hemina a 5 mg/ml, el 0,25% de
una solución de gentamicina a 40 mg/ml y 10 g/l de agar; ajustado a
pH 7 y esterilizado en un autoclave 15 minutos a 120ºC) para la
búsqueda y el recuento de Bacteroides fragilis, después de
la presentación de diluciones que varían de 10^{-1} a
10^{-3}.
La presentación se realiza con ayuda de esferas
de vidrio estériles sobre los medios indicados y la lectura de los
medios se realiza después de 5-7 días de incubación
en anaerobiosis a 37ºC.
La identificación de las bacterias se realiza,
por un lado, después de la descripción de las colonias obtenidas en
cada uno de los medios y, por otro lado, con ayuda de una tinción de
Gram.
Los resultados que se refieren a la evolución de
Bifidobacterium y Bacteroides fragilis en los
excrementos de los ratones se presentan respectivamente en las
siguientes Tablas II y III:
\vskip1.000000\baselineskip
En estas tablas, los resultados obtenidos se
expresan en media y desviación típica del log del número de UFC/g
de excrementos y n es el número de ratones utilizados para cada
producto y días ensayados (comparación de rango mediante el ensayo
de Wilcoxon para muestras emparejadas), los asteriscos indican los
resultados significativos con respecto al tiempo T0. En estas
tablas, la cifra mencionada entre paréntesis corresponde al número
de ratones en los que la bacteria en cuestión está presente por
debajo del umbral de detección. Los resultados correspondientes al
medio no sembrado son similares al valor obtenido en T0 y permanecen
constantes a lo largo del tiempo durante los 21 días del
experimento (resultados que no se representan en las tablas).
Estos resultados demuestran que la
administración de una cualquiera de las dos fracciones (excluida o
filtrada) conduce efectivamente a un aumento de los
Bifidobacterium pero que únicamente la fracción excluida es
eficaz para provocar una disminución de la población de
Bacteroides fragilis en la flora intestinal de los
ratones.
La medición de la translocación intestinal de
los microorganismos en ratones se realiza en ratones machos de la
línea C3H con flora de ser humano adulto (criada en el
CDTA-CNRS, Orleáns, Francia). Durante todo el
periodo de adaptación y hasta el comienzo del experimento, estos
ratones disponen de agua estéril como bebida.
Durante todo el periodo del experimento, estos
ratones se alimentarán con gránulos RO3 esterilizados mediante
irradiación.
A la edad de 10-12 semanas,
comienzo del experimento, se forman tres grupos, un grupo de 18
ratones que recibirá durante todo el periodo del experimento la
fracción excluida de los metabolitos de Bifidobacterium breve
CNCM I-2219 en lugar del agua de los biberones, a
razón de 8-10 ml por día y por ratón, mientras que
los otros dos grupos de 12-23 ratones recibirán
respectivamente la fracción filtrada o continuarán recibiendo agua
estéril (grupo de control).
En el 21^{er} día, se realiza una extracción
de excrementos como se ha descrito anteriormente y los ratones se
sacrifican para realizar un estudio bacteriológico.
Se obtienen dos tipos de datos a partir del
análisis de los órganos de los ratones sacrificados:
- la translocación por órgano diana, es decir la
evaluación del número de ratones que tengan el órgano contaminado y
el porcentaje de la población que presenta una contaminación del
órgano diana.
- diseminación bacteriana, es decir la
intensidad de la diseminación bacteriana representada por el número
de órganos positivos así como el número de ratones y el porcentaje
de la población que presenta una diseminación de una intensidad
dada.
Para extraer los órganos a analizar, el animal
se saca de la jaula de aislamiento, se transfiere en condiciones
asépticas a una campana de flujo laminar y se sacrifica por
inhalación de cloroformo.
La piel se descontamina con alcohol de 70º, y
después se extraen los órganos de cada ratón de forma aséptica en
el siguiente orden: sangre del corazón, pulmones, hígado, bazo, y
riñón. Para evaluar el peso, se suspende una fracción de cada
órgano en 9 ml de una solución de Ringer (diluida a un cuarto,
suplementada con clorhidrato de cisteína (0,3 g/l) y regenerada en
agua hirviendo durante 15 minutos). A continuación se trituran los
órganos con ayuda de una pipeta Pasteur estéril de uso único
"Pastette®" comercializada por la compañía VWR o
"Liquipette®" comercializada por la compañía Gosselin. A
continuación, se presentan 100 \mul de la suspensión madre y de
la siguiente dilución decimal, con ayuda de esferas de vidrio
estériles en agar-agar Columbia (comercializado por
la compañía Beckton-Dickinson) suplementado con
glucosa (5 g/l), clorhidrato de cisteína (0,3 g/l) y sangre de
caballo (al 5% v/v, comercializa por la compañía Eurobio). Después
de una incubación en anaerobiosis durante 7 días a 37ºC, se realiza
el recuento de cada tipo de colonias y después se determina la
morfología de las bacterias después de una tinción de Gram.
Los resultados obtenidos en relación con el
análisis de la translocación por órgano diana, se reúnen en la
siguiente Tabla IV:
Los resultados obtenidos de este modo muestran
que el bazo y el pulmón se contaminan con menor frecuencia en la
población para la que el agua de bebida se ha sustituido con la
fracción excluida que en la población controlada de ratones que han
recibido agua como bebida.
Por otro lado, estos resultados demuestran que
la fracción filtrada no tiene efectos sobre la regulación de la
translocación bacteriana.
Los resultados obtenidos con respecto a la
diseminación bacteriana se reúnen en la siguiente Tabla V:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El número de ratones que presentan menos de un
órgano contaminado (intensidad de diseminación débil) es mayor en
la población para que el agua de bebida se sustituyó con la fracción
excluida que en la población de control de ratones que recibieron
agua como bebida.
Además, el número de ratones que presentan al
menos tres órganos contaminados (intensidad de diseminación fuerte)
es menor en la población para la que el agua de bebida se ha
sustituido con la fracción excluida que en la población de control
de ratones que recibieron agua como bebida.
Se constata por lo tanto que la diseminación de
las bacterias es menos intensa en ratones que han recibido agua de
bebida complementada con la fracción excluida. En este caso, la
regulación de la translocación bacteriana es más eficaz.
La medición de la expresión de las galectinas 1
y 3 se realiza en ratones con flora de ser humano adulto descritos
anteriormente.
A la edad de 12-14 semanas,
comienzo del experimento, se forman dos grupos de ratones, un grupo
de ratones que recibirá durante toda el periodo del experimento la
fracción excluida que contiene los metabolitos de
Bifidobacterium breve CNCM I-2219 en lugar
del agua de los biberones, a razón de 10 ml por día y por ratón,
mientras que otro grupo de ratones continuará recibiendo agua (grupo
de control).
Al 7º, 15º y 21^{er} días se sacrifica un lote
de ratones para realizar un estudio biológico sobre la expresión de
las galectinas 1 y 3, evaluada mediante la dosificación de ARNm que
codifica estas galectinas mediante RT-PCR
cuantitativa (Polymerase Chain Reaction) (Reacción en Cadena
de la Polimerasa). Los órganos extraídos de los ratones del grupo
de control sacrificados al 7º, 15º y 21^{er} día se han reunido
por órgano para constituir una reserva que sirva como control
durante todo el experimento.
La modificación de la expresión de las
galectinas 1 y 3 en los órganos ensayados constituye un indicador
del efecto de los metabolitos producidos por la cepa de
Bifidobacterium breve CNCM I-2219 contenidos
en la fracción excluida.
Las galectinas 1 y 3 se dosifican en el bazo y
en los pulmones de ratones que se han sacrificado como se ha
descrito anteriormente.
Para hacer esto, una fracción de pulmón (un
lóbulo) y la mitad del bazo se extraen de forma estéril y en este
orden para cada ratón. A continuación los fragmentos se depositan en
placas de Petri tratadas anteriormente durante 24 horas con una
solución estéril de agua y de DEPC (DiEthyl PyroCarbonate,
comercializado por la compañía Sigma) a 1/1000. A continuación se
perfunden los órganos una primera vez con tampón PBS con ayuda de
una jeringa y de una aguja estéril para eliminar la sangre. A
continuación los órganos se transfieren a otra placa de Petri que
contiene 200 microlitros de PBS con la adición de 50 unidades de
inhibidor de ARNasa (comercializado por la Compañía Applied
Biosystems) y se perfunden de nuevo con esta solución. Finalmente
los órganos se cortan en láminas inferiores a 5 ml que se depositan
en tubo Biopur® (Eppendorf) que contiene 0,5 ml de una solución de
estabilización de ARN, comercializada con la referencia
RNA-Lafer® por la compañía Qiagen. A continuación
los órganos se almacenan en un congelador a -20ºC hasta el
análisis.
El ARN total se extrae de los tejidos después de
la lisis celular de acuerdo con el protocolo de utilización del kit
de extracción NReasy protect® comercializado con la referencia 74126
por la compañía Qiagen.
Para hacer esto, la solución de estabilización
se retira y se añaden una esfera de tungsteno tratado con DEPC así
como 600 microlitros de una solución de lisis (tampón RLT contenido
en el kit) a cada órgano. A continuación se trituran con ayuda de
un triturador RETSCH MM2000, y después se centrifugan a 13000 g
durante 3 minutos a 4ºC. El sobrenadante se coloca en un tubo de
1,5 ml que contiene 600 \mul de etanol al 70% y después se
homogeneiza. Una parte de esta solución (700 \mul) se deposita a
continuación en una columna de filtración que permite atrapar los
ARN, para centrifugarse a 8000 g durante 1 minuto a 4ºC. Después de
vaciar el tubo colector, se añaden 700 microlitros de un tampón de
lavado (tampón RW1 contenido en el kit) en la columna que se
centrifugará a 8000 g durante 1 minuto a 4ºC. El tubo colector se
vacía de nuevo y se añaden 500 microlitros de un segundo tampón de
lavado que contiene etanol al 70% (tampón RPE contenido en el kit)
en la columna para centrifugarse a 8000 g durante 1 minuto a 4ºC.
Esta última etapa se repite pero realizando un centrifugado a 13000
g durante 2 minutos a 4ºC. Finalmente, se añaden 30 microlitros de
un tampón de elución que permite separar los ARN de la columna
(tampón RNase free contenido en el kit). A continuación se
centrifuga el eluato a 8000 g durante 1 minuto a 4ºC después de
haberlo incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos. La etapa
de elución se realiza de nuevo y las muestras obtenidas de este modo
se congelan rápidamente a -80ºC.
Se añade una cantidad equivalente a una unidad
de ADNasa, comercializada por la compañía Boehringer, a cada
muestra que a continuación se incuba al baño maría a 37ºC durante 15
minutos.
Para evaluar la cantidad de ARN total de las
muestras, éstas se diluyen a 1/8^{tavo} en agua estéril que se
coloca en una microcubeta que permite la lectura de la absorbancia a
260 nm en un espectrofotómetro UV de referencia Genquant,
comercializado por la compañía Pharmacia. Para obtener la
concentración de ARN total de las muestras, el valor de la densidad
óptica (DO) obtenido de este modo se multiplica por el factor de
dilución y por 40 (una unidad de DO= 40 microgramos/ml de ARN).
la RT-PCR cuantitativa se
realiza con ayuda del kit qPCR^{TM} Core Kit comercializado por la
compañía Eurogentec en un termociclador de referencia Abi Prism
7700 (Sequence Detection System, Applied Biosystems)
comercializado por la compañía Perkin Elmer. Se realiza la mezcla
de reacción que se resumen en la Tabla VI a
continuación:
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La mezcla de reacción se somete al siguiente
programa: 10 minutos a 65ºC para eliminar las estructuras
secundarias de los ARN, 30 minutos a 42ºC para activar la
transcriptasa inversa, 10 minutos a 95ºC para activar la polimerasa,
15 segundos a 95ºC para desnaturalizar las hebras de ADN y 1 minuto
a 61ºC para la hibridación y la elongación a partir de los
cebadores. Se realizan 40 ciclos para las dos últimas etapas.
La expresión de las galectinas 1 y 3 se evalúa
con respecto a la expresión de un gen de referencia, tal como el
que codifica para \beta-actina cuya expresión es
constante.
Las sondas y los cebadores utilizados y
seleccionados gracias al programa Primer Express® comercializado por
la compañía Perkin Elmer son los siguientes:
Galectina-1:
| Sentido: | 5'-TCA ATC ATG GCC TGT GGT CTG-3' | (SEC ID Nº 4) |
| Antisentido: | 5'-AAG CTC TTG GCG TCC GAG G-3' | (SEC ID Nº 5) |
| Sonda: | 5'-TCG CCA GCA ACC TGA ATC AAC CTG-3' | (SEC ID Nº 6) |
Galectina-3:
| Sentido: | 5'-ATT GGC AGA CAG CTT TTC G-3' | (SEC ID Nº 7) |
| Antisentido: | 5'-GAT CAT GGC GTG GTT AGC-3' | (SEC ID Nº 8) |
| Sonda: | 5'-TTC CAC TTT AAC CCC CGC TTC AAT GAG AAC-3' | (SEC ID Nº 9) |
\beta-actina:
| Sentido: | 5'-TGG CGC TTT TGA CTC AGG ATT-3' | (SEC ID Nº 10) |
| Antisentido: | 5'-GGG ATG TTT GCT CCA ACC AAC-3' | (SEC ID Nº11) |
| Sonda: | 5'-GCC GTC GCC TTC ACC GTT CCA GTT TTT-3' | (SEC ID Nº 12) |
Para validar cada microplaca sometida a los
ciclos de PCR, se prepara un calibrador a partir de órganos de un
lote de 6 ratones C3H con flora de ser humano sometidos a un régimen
alimentario convencional (agua estéril y gránulos RO3) en los que
se han extraídos los pulmones y el bazo. Los ARN totales de cada
órgano se han extraídos con ayuda del protocolo descrito
anteriormente para los órganos de los lotes de los ratones a
ensayar. Los diferentes extractos obtenidos de este modo se reúnen
a continuación para cada órgano para constituir una reserva que
sirve como calibrador durante todo el periodo del análisis.
Durante el análisis, las extracciones a ensayar
se depositan por duplicado y la gama patrón realizada a partir de
la muestra calibradora se deposita por triplicado. Se realiza
entonces una media a partir de cada extracción y para la muestra
calibradora.
Los resultados de la expresión relativa de la
galectina 1 con respecto a \beta-actina se reúnen
en la siguiente Tabla VII:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados de la expresión relativa de la
galectina-3 con respecto a
\beta-actina se reúnen en la siguiente Tabla
VIII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que se observa un
aumento de la expresión de galectina-1 en el bazo de
ratones para los que el agua de bebida se ha sustituido con la
fracción excluida. La expresión de la galectina-1
(inducción de apoptosis celular, en particular de linfocitos T
activados) en animales de control es dos veces mayor con respecto a
la de la actina, lo que parece estar en relación con la
contaminación bacteriana del órgano (la expresión de la
galectina-1 es significativamente inferior en
ausencia de bacterias en el bazo U = 15, p < 0,05 -y aumenta en
función del índice de contaminación bacteriana cuando hay
bacterias-correlación r = 0,77, p < 0,05, ensayo
de Spearman). La expresión de la galectina-1 se
normaliza después de 7 días de toma de la fracción excluida y
después aumenta posteriormente en un factor de 4 a 10
respectivamente a los 15 y 21 días de toma (independientemente de
la contaminación bacteriana residual del órgano). En los pulmones,
la expresión relativa de la galectina-1 es normal en
los ratones de control y la disminución reducida pero significativa
después de 7 días de toma de la fracción excluida viene seguida de
un aumento (transitoriamente significativo a los 15 días de toma) y
después de una normalización de la expresión de la
galectina-1 después de 21 días de toma de la
fracción excluida.
Estos resultados muestran también que se observa
una disminución de la expresión de galectina-3 en
los pulmones de ratones para los que el agua de bebida se ha
sustituido con la fracción excluida.
El conjunto de estos resultados demuestra que la
fracción excluida (producto inmunomodulador obtenido según el
procedimiento de acuerdo con la invención) tiene un efecto
inmunomodulador y permite aumentar la población de
Bifidobacterium y disminuir la población de Bacteroides
fragilis.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no
forma parte del documento de patente Europea. Aunque se ha tenido
gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden
excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a
este respecto.
- \bullet FR 2652590
- \bullet FR 0304746
- \bullet WO 0101785 A
- \bullet FR 0403158
\bulletGOMEZ et al., FEMS
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\bulletHONOSO et al.,
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\bulletROSENFELD J. et al.
Analytical Biochemistry, 1992, vol. 203,
173-179.
<110> COMPAÑÍA
GERVAIS-DANONNE
\hskip1cm PETAY, Valérie
\hskip1cm LECROIX, Francis
\hskip1cm PERRIN, Emmanuel
\hskip1cm GONTIER, Charles
\hskip1cm BLAREAU,
Jean-Pierre
\hskip1cm ROMOND,
Marie-Bénédicte
\hskip1cm SINGER, Elisabeth
\hskip1cm ODOU,
Marie-Françoise
\hskip1cm DEMAILLY-MULLIE,
Catherine
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PRODUCTO INMUNOESTIMULADOR OBTENIDO
A PARTIR DE UN CULTIVO DE BIFIDOBACTERIUM Y COMPOSICIONES QUE
LO CONTIENEN
\vskip0.400000\baselineskip
<130> F191 EXT 189
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR0304746
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
16-04-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR0403158
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-03-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PTR
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium breve
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu Leu Gly Ile Gly Thr Pro Ser Phe Leu
His Asn Gly Gly Gln}
\sac{Trp Tyr Ile Tyr Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium breve
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier ácido amino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Val Leu Tyr Asn Pro Gly Gln Tyr Xaa Tyr
Val Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium breve
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Ala Thr Ala Asn Gly Gln Val Ser Ser
Gly Gln Gln Ser Thr}
\sac{Gly Gly Ser Ala Ala Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaatcatgg cctgtggtct g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagctcttgg cgtccgagg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipaatggcagac agcttttcg
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcatggcg tggttagc
\hfill18
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<210> 9
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccacttta acccccgctt caatgagaac
\hfill30
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<210> 10
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de PCR
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskiptggcgctttt gactcaggat t
\hfill21
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<210> 11
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipgggatgtttg ctccaaccaa c
\hfill21
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<210> 12
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> sonda
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipgccgtcgcct tcaccgttcc agtttt
\hfill27
Claims (22)
1. Producto inmunomodulador,
caracterizado porque se obtiene de acuerdo con un
procedimiento de preparación que comprende las siguientes
etapas:
- siembra e incubación en condiciones aerobias o
anaerobias, preferiblemente anaerobias, y a una temperatura
comprendida entre aproximadamente 30 y 40ºC, de
Bifidobacterium que comprende al menos la cepa
Bifidobacterium breve I-2219 en un sustrato
acuoso que presenta un pH comprendido entre aproximadamente 6 y 8
que comprende al menos los siguientes ingredientes:
- i)
- permeado de lactosuero.
- ii)
- un hidrolizado de proteínas de lactosuero.
- iii)
- lactosa,
- eliminación de los Bifidobacterium del
sustrato acuoso;
- ultrafiltración del sustrato acuoso en
membranas de filtración que tengan un umbral de corte comprendido
entre 100 y 300 kDa para obtener un retentado concentrado;
- deshidratación del retentado concentrado;
- disolución del retentado deshidratado en un
tampón;
- cromatografía de exclusión en gel en una
columna que presenta un umbral de exclusión de 600 kDa de la
solución del retentado;
- recuperación de la fracción excluida después
de la cromatografía que constituye el producto inmunomodulador.
2. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque los
Bifidobacterium se siembran en el sustrato acuoso a razón de
1\cdot10^{4} a 4\cdot10^{9} unidades formadoras de colonias
por ml de sustrato.
3. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la temperatura del
sustrato se mantiene a un valor comprendido entre 37 y 40ºC durante
todo el periodo de incubación.
4. Producto inmunomodulador de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque el pH del sustrato acuoso se mantiene a un valor comprendido
entre 6 y 8 durante todo el periodo de incubación.
5. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado porque el pH del sustrato
acuoso se mantiene a un valor comprendido entre 6,5 y 7,5 durante
todo el periodo de incubación.
6. Producto inmunomodulador de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque los ingredientes del sustrato acuoso se presentan en las
siguientes cantidades:
- i)
- permeado de lactosuero: de 3 a 80 g,
- ii)
- hidrolizado de proteínas de lactosuero: 2 a 80 g
- iii)
- lactosa: de 5 a 50 g,
estando estas cantidades dadas por litro de
dicho sustrato acuoso.
7. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado porque los ingredientes del
sustrato acuoso están presentes en las siguientes cantidades:
- i)
- permeado de lactosuero: de 40 a 60 g,
- ii)
- hidrolizado de proteínas de lactosuero: 5 a 15 g,
- iii)
- lactosa: de 10 a 30 g,
estando estas cantidades dadas por litro de
dicho sustrato acuoso.
8. Producto inmunomodulador de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque el sustrato acuoso comprende además al menos un ingrediente
adicional seleccionado entre sales tamponantes, extractos de
levadura y clorhidrato de cisteína.
9. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado porque el sustrato acuoso
comprende una sal tamponante seleccionada entre dihidrogenofosfato
de sodio y dihidrogenofosfato de potasio que representa de 0,5 a 5
g por litro de sustrato acuoso.
10. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado porque el extracto de
levadura representa de 0,5 a 5 g por litro de sustrato acuoso.
11. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado porque el clorhidrato de
cisteína representa de 100 a 500 mg por litro de sustrato
acuoso.
12. Producto inmunomodulador de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque la eliminación de los Bifidobacterium del medio de
cultivo se realiza por microfiltración o por centrifugado del
sustrato acuoso.
13. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 12, caracterizado porque la eliminación de los
Bifidobacterium del medio de cultivo se realiza por
centrifugado del sustrato acuoso.
14. Producto inmunomodulador de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque el procedimiento comprende además, después de la etapa de
eliminación de los Bifidobacterium, una etapa suplementaria
de destrucción de las actividades enzimáticas residuales contenidas
en el sustrato acuoso después de la incubación.
15. Producto inmunomodulador de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque la cromatografía de exclusión se realiza en un gel de
dextrano y de agarosa reticulado.
16. Producto inmunomodulador de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque la fracción excluida está esencialmente constituida por un
complejo de polisacáridos y proteínas en el que la fracción
glucídica representa del 5 al 30% en peso, representando la fracción
proteica del 70 al 95% en peso con respecto al peso total de dicho
complejo.
17. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 16, caracterizado porque la fracción glucídica
de la fracción excluida presenta la siguiente composición de
monosacáridos (expresada en proporciones molares con respecto a
ramnosa): galactosa: 5,5 a 8; manosa: 0,8 a 1,3; glucosa: 2,5 a 5;
N-acetil galactosamina: 0,3 a 1;
N-acetil glucosamina: 0,07 a 0,3; ácido neuramínico
0 a 0,15 y ramnosa: 1.
18. Producto inmunomodulador de acuerdo con la
reivindicación 16, caracterizado porque la fracción proteica
comprende al menos un péptido que corresponde a al menos una de las
siguientes secuencias:
- - RELGIGTPSFLHNGGQWYIYA
- (SEC ID Nº 1)
- - RVLYNPGQYXYVR
- (SEC ID Nº 2)
- - EQATANGQVSSGQQSTGGSAAP
- (SEC ID Nº 3).
19. Producto inmunomodulador de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, como medicamento.
20. Producto inmunomodulador de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, como medicamento
inmunomodulador.
21. Composición farmacéutica,
caracterizada porque contiene, como principio activo, al
menos un producto inmunomodulador obtenido de acuerdo con el
procedimiento tal como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 y al menos un soporte farmacéuticamente
aceptable.
22. Composición farmacéutica según la
reivindicación 21, caracterizada porque esta destinada para
su administración por vía oral y en que se presenta en forma
líquida o sólida.
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