ES2620529T3 - Microcina S. formada bacterialmente, un nuevo péptido antimicrobiano, eficaz contra microorganismos patogénicos, por ejemplo, Escherichia Coli enterohemorrágica (EHEC) - Google Patents

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Abstract

Polipéptido aislado con actividad antimicrobiana, en el que el polipéptido a) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 6 o de SEQ ID No: 7; b) está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70% o más idéntica a una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 ó 2, o un complemento de la misma; o c) está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 ó 2, o un complemento de la misma, en condiciones rigurosas.

Description

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DESCRIPCION
Microcina S. formada bacterialmente, un nuevo peptido antimicrobiano, eficaz contra microorganismos patogenicos, por ejemplo, Escherichia Coli enterohemorragica (EHEC)
Campo de la invencion
[0001] La presente invencion se refiere a un polipeptido aislado, moleculas de acido nucleico aisladas que codifican un polipeptido microcina S. La invencion tambien se refiere a plasmidos y celulas que comprenden las moleculas de acido nucleico, un anticuerpo que se une al polipeptido, las composiciones, as! como procedimientos para producir y usar los polipeptidos. La presente invencion se refiere ademas a usos medicos para el tratamiento o la prevencion de infecciones microbianas, trastornos gastrointestinales funcionales o el tratamiento de un tumor. La invencion se refiere ademas a un procedimiento para la conservacion de alimentos y a un procedimiento para el recubrimiento de material de aposito.
Antecedentes de la invencion
[0002] Las microcinas son peptidos antimicrobianos sintetizados ribosomicamente con una masa molecular baja. Producidas por enterobacterias, principalmente Escherichia coli, la slntesis de microcinas esta fuertemente activada bajo condiciones de estres, tales como la limitacion de nutrientes. Las microcinas ejercen una potente actividad antimicrobiana/antibacteriana frente a especies estrechamente relacionadas, lo que ofrece una ventaja altamente competitiva en la microflora intestinal (Baquero, F., Bouanchaud, D., Martinez-Perez, MC & Fernandez, C. (1978) J. Bacteriol 135, 342-347). Los productores de microcinas son resistentes a la microcina que producen, que esta mediada por al menos un gen que confiere resistencia que se encuentra dentro de un grupo de genes. La mayor parte de las 14 microcinas conocidas son codificadad por plasmidos, pero se han descrito tambien peptidos antimicrobianos/antibacterianos codificados cromosomicamente. La cepa probiotica E. coli Nissle 1917 (EcN) produce las microcinas M y H47 (Patzer, S.I., Baquero, M.R., Bravo, D., Moreno, F. & Hantke, K. (2003) Microbiology 149, 2557-2570). Los probioticos se definen como microorganismos vivos, que tras la ingestion en cierto numero ejercen efectos positivos sobre la salud mas alla de la nutricion basica inherente. Los mecanismos que permiten que una cepa sea probiotica son poco conocidos. Sin embargo, la actividad antimicrobiana de las microcinas puede influir positivamente en el equilibrio intestinal. Suponiendo la ausencia de factores patogenos, as! como una seguridad cllnica bien demostrada, una cepa productora de microcinas puede cumplir claramente con la definicion de un probiotico. A diferencia de las microcinas enterobacterianas, las bacterias del acido lactico de origen alimentario producen antibioticos peptldicos que contienen lantionina. Los denominados lantibioticos de bacterias gram-positivas ya se utilizan para la conservacion de alimentos (Kuipers, A., Rink, R. & Moll, G.N. (2011) Prokaryotic Antimicrobial Peptides: From Genes to Applications (Springer Science + Business Media, Berlin). El uso como agente antitumoral (Hetz, C., Bono, M.R., Barros, L.F. y Lagos, R. (2002) Proc Natl Acad Sci USA. 99, 2696-2701) o como una alternativa a los antibioticos clasicos en enfermedades infecciosas (Dicks, L.M.T., Heunis, T.D.J., van Staden, D.A., Brand, A., Sutyak Noll, K. & Chikindas, ML (2011) Prokaryotic Antimicrobial Peptides: From Genes to Applications (Springer Science + Business Media, Berlin), Gillor, O., Kirkup, B.C. & Riley, M.A. (2004) Adv. Appl Microbiol 54, 129-146) son dos aplicaciones de bacteriocinas descritas adicionalmente.
[0003] Desde hace decadas y en la actualidad, el tratamiento de infecciones bacterianas se basa principalmente en antibioticos clasicos. Sin embargo, la aparicion de patogenos resistentes a estos antibioticos clasicos constituye un problema enorme. En consecuencia, las opciones de tratamiento restantes son aun mas restringidas. Este efecto negativo se ve tambien en otras industrias de importancia economica, tal como, por ejemplo, la industria alimentaria.
[0004] Symbio Pharm: "Symbioflor", documento recuperado de Internet el 12 de noviembre de 2010, da a conocer cepas de E. coli utilizadas para la identificacion de la agrupacion de genes que codifican microcinas de la invencion.
[0005] La base de datos EMBL, no. de acceso EE172646, da a conocer numerosos ejemplos de una secuencia de EST de Zea mays con cierta identidad de secuencia con SEQ ID No: 2.
[0006] NORMAN A. "Genetic Characterizations of IncX-plasmids of the Enterobacteriaceae”, Tesis, 1 de enero de 2009, da a conocer una secuencia y la caracterizacion de plasmidos IncX.
[0007] GILLOR O. et al, Advances in Applied Microbiology, vol. 54, paginas 129-146 revisan el conocimiento de microcinas y sus usos.
[0008] La BASE DE DATOS EMBL, no. de acceso. FP102945, da a conocer una secuencia de un clon de ADN de pez cebra con cierta identidad de secuencia con SEQ ID No: 3.
[0009] ATTIA AHMED S. et al, BMC Microbiology, vol. 9, no. 1, pagina 207, describen la identificacion de un grupo de genes de bacteriocinas en Moraxella catarrhalis con cierta identidad de secuencia con SEQ ID No: 4.
[0010] La BASE DE DATOS EMBL, no. de acceso U47048 describe la region 24 de microcinas de E. coli.
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Descripcion resumida de la invencion Problema tecnico
[0011] La presente invencion se realizo a la luz de la tecnica anterior descrita anteriormente y en vista de la creciente demanda de nuevos agentes antibacterianos y profilacticos en medicina humana y veterinaria. La terapia de cepas de de beta-lactamasa de mayor espectro (ESBL) es cada vez mas desafiante. El objetivo de la presente invencion es la provision de un nuevo polipeptido microcina antimicrobiano que pueda ser utilizado como una alternativa a los antibioticos convencionales y por lo tanto para el control de microorganismos patogenos que son productores de ESBL. En este sentido, un objetivo de la presente invencion es proporcionar un nuevo polipeptido microcina antimicrobiano que puede utilizarse en el tratamiento de bacterias gram negativas incluyendo E. coli productor de ESBL, y, ademas, tambien incluyendo la cepa de E. coli enterohemorragica altamente virulenta (EHEC) que fue el patogeno causante de un brote importante muy reciente en Alemania (Frank, C., et al (2011) N Engl J Med 10.1056/NEJMoa1106483; Mellmann., A., et al (2011) PLoS ONE 6 (7): e22751. doi: 10.1371). Las celulas de EHEC liberan mayores cantidades de toxinas Shiga por tratamiento con ciertos antibioticos. Por lo tanto, se describe que el tratamiento con antibioticos de pacientes esta contraindicado. El nuevo polipeptido microcina debe ser eficaz en el tratamiento y la prevencion de infecciones por EHEC y E. coli enteropatogena (EPEC). Un objetivo adicional de la invencion es proporcionar un nuevo polipeptido microcina antimicrobiano que puede utilizarse en el tratamiento de trastornos gastrointestinales funcionales, en particular, el slndrome del intestino irritable, en adultos y ninos. Un objetivo adicional de la invencion es proporcionar composiciones que comprenden el nuevo polipeptido microcina de celulas que producen el nuevo polipeptido microcina para dichos usos medicos. Un objetivo de la presente invencion es tambien proporcionar un nuevo polipeptido microcina que se puede utilizar en el tratamiento de cancer, que puede utilizarse en la conservacion de alimentos y que puede utilizarse en el recubrimiento de material de aposito.
Descripcion de la invencion
[0012] Para resolver el problema, la presente invencion proporciona, en un aspecto, un polipeptido aislado con actividad antimicrobiana, en el que el polipeptido:
a) comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 70% o mas identica a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o de SEQ ID No: 7;
b) esta codificado por una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 70% o mas identica a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma, en el que las SEQ ID Nos: 3, 4 y 5 se citan solo para referencia;
c) esta codificado por una molecula de acido nucleico que se hibrida con una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma en condiciones rigurosas, en el que las SEQ ID Nos: 3, 4 y 5 se citan solo para referencia. Tambien se describe, pero se cita solo para referencia, un polipeptido que comprende una variante natural alelica de un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o la SEQ ID No: 7.
[0013] En particular, se describe un polipeptido aislado con actividad antimicrobiana, en el que el polipeptido:
a) comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 70% o mas identica a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o la SEQ ID No: 7, comprendiendo el polipeptido la secuencia de aminoacidos con actividad antimicrobiana;
b) esta codificado por una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 70% o mas identica a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma, en el que las SEQ ID Nos: 3, 4 y 5 se citan solo para referencia, comprendiendo la secuencia de nucleotidos la SEQ ID No: 1 que codifica un polipeptido con al menos actividad antimicrobiana; o comprendiendo la secuencia de nucleotidos la SEQ ID No: 2 que codifica un polipeptido con actividad antimicrobiana. Se describe tambien, pero no se incluye en las presentes reivindicaciones, una secuencia de nucleotidos que comprende la SEQ ID No: 1 o 2 que codifica un polipeptido con actividad de auto-inmunidad para microcina S o actividad de transporte para microcina S, comprendiendo la secuencia de nucleotidos la sEq ID No: 3 que codifica un polipeptido con actividad auto-inmunidad para microcina S, comprendiendo la secuencia de nucleotidos la SEQ ID No: 4 que codifica un polipeptido con actividad de transporte para microcina S, y comprendiendo la secuencia de nucleotidos la SEQ ID No: 5 que codifica un polipeptido con actividad de transporte para microcina S;
c) esta codificado por una molecula de acido nucleico que se hibrida con una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma en condiciones rigurosas, en el que las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 se citan solo para referencia, comprendiendo la secuencia de nucleotidos la SEQ ID No: 1 que codifica un polipeptido con actividad al menos antimicrobiana y comprendiendo la secuencia de nucleotidos la SEQ ID No: 2 que codifica un polipeptido con actividad antimicrobiana. Se describe tambien, pero no se incluye en las presentes reivindicaciones, la secuencia de nucleotidos que comprende SEQ ID No: 1 o 2 que codifica un polipeptido con actividad de auto-inmunidad para microcina S o actividad de transporte para microcina S, comprendiendo la
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secuencia de nucleotidos la SEQ ID No: 3 que codifica un polipeptido con actividad auto-inmunidad para microcina S, comprendiendo la secuencia de nucleotidos la SEQ ID No: 4 que codifica un polipeptido con actividad de transporte para microcina S, y comprendiendo la secuencia de nucleotidos la SEQ ID No: 5 que codifica un polipeptido con actividad de transporte para microcina S.
d) Tambien se describe, pero se cita solo para referencia, un polipeptido que comprende una variante natural alelica de un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ iD No: 6 o la SEQ ID No: 7, comprendiendo el polipeptido la secuencia de aminoacidos con actividad antimicrobiana.
[0014] El termino "actividad antimicrobiana" ha de entenderse como una actividad antimicrobiana causada por microcina, especlficamente por microcina S.
[0015] En un aspecto adicional de la invencion, esta disponible una molecula de acido nucleico aislado que codifica un polipeptido microcina S, en el que dicha molecula de acido nucleico:
a) comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 50% o mas identica a una cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma, en el que las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 se citan solo para referencia,
b) comprende una molecula de acido nucleico que se hibrida con una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 o 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma, en condiciones rigurosas, en el que las sEq ID NOs: 3, 4 y 5 se citan solo para referencia;
c) comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 50% o mas identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID No: 6 o de la SEQ ID No: 7.
d) Tambien se describe, pero se cita solo para referencia, un polipeptido que comprende una molecula de acido nucleico que codifica una variante natural alelica de un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o la SEQ ID No: 7.
[0016] Mas especlficamente, se describe una molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido microcina S, un polipeptido con actividad de auto-inmunidad para microcina S (citado solo para referencia) o un polipeptido con actividad de transporte para microcina S (citado solo para referencia), en el que dicha molecula de acido nucleico:
a) comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 70% o mas identica a una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma, en el que las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 se citan solo para referencia, comprendiendo la molecula de acido nucleico la SEQ ID No: 1 que codifica un polipeptido con al menos actividad antimicrobiana o actividad de auto-inmunidad para microcina S o actividad de transporte para microcina S, comprendiendo la molecula de acido nucleico la SEQ ID No: 2 que codifica un polipeptido con actividad antimicrobiana, comprendiendo la molecula de acido nucleico la SEQ ID No: 3 que codifica un polipeptido con actividad auto-inmunidad para microcina S, comprendiendo la molecula de acido nucleico la SEQ ID No: 4 que codifica un polipeptido con actividad de transporte para microcina S, y comprendiendo la molecula de acido nucleico la SEQ ID No: 5 que codifica un polipeptido con actividad de transporte para microcina S;
b) comprende una molecula de acido nucleico que se hibrida con una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las sEq ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma, en condiciones rigurosas, en el que las sEq ID NOs: 3, 4 y 5 se citan solo para referencia, comprendiendo la molecula de acido nucleico la SEQ ID No: 1 que codifica un polipeptido con al menos actividad antimicrobiana o actividad de auto-inmunidad para microcina S (citado solo para referencia) o actividad de transporte para microcina S (citado solo para referencia), comprendiendo la molecula de acido nucleico l la SEQ ID No: 2 que codifica un polipeptido con actividad antimicrobiana, comprendiendo la molecula de acido nucleico la SEQ ID No: 3 que codifica un polipeptido con actividad de auto-inmunidad para microcina S, comprendiendo la molecula de acido nucleico la SEQ ID No: 4 que codifica un polipeptido con actividad de transporte para microcina S, y comprendiendo la molecula de acido nucleico la SEQ ID No: 5 que codifica un polipeptido con actividad de transporte para microcina S;
c) comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 70% o mas identica a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o de la SEQ ID No: 7, teniendo el polipeptido actividad antimicrobiana.
d) Tambien se describe, pero se cita solo para referencia, un polipeptido que comprende una molecula de acido nucleico que codifica una variante natural alelica de un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o la SEQ ID No: 7, teniendo el polipeptido actividad antimicrobiana.
[0017] En varios aspectos, la invencion se refiere a un plasmido que comprende la molecula de acido nucleico segun la invencion y a una celula que comprende la molecula de acido nucleico y/o el polipeptido y/o el plasmido segun la invencion.
[0018] La invencion tambien se refiere a un anticuerpo que se une selectivamente a un polipeptido segun la invencion.
[0019] Un aspecto adicional de la invencion se refiere a una composition que comprende a) un polipeptido segun la invencion; y/o
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b) una celula segun la invention.
[0020] Tambien se describen el polipeptido, la celula y la composition de la invencion para su uso en terapia o prevention.
[0021] En un aspecto, el polipeptido, la celula y la composicion de la invencion son para su uso en el tratamiento o prevencion de infecciones microbianas, preferiblemente la infection microbiana comprende infecciones con E. coli enteropatogena y/o E. coli enterohemorragica (EPEC, EHEC) o preferiblemente la infeccion microbiana comprende el slndrome uremico hemolltico (SUH), preferiblemente el slndrome uremico hemolltico enteropatico.
[0022] En otro aspecto, el polipeptido, la celula y la composicion de la invencion son para su uso en el tratamiento de trastornos gastrointestinales, preferiblemente trastornos gastrointestinales funcionales.
[0023] En un aspecto adicional, el polipeptido, la celula y la composicion de la invencion son para su uso en el tratamiento de un tumor.
[0024] La invencion presenta un procedimiento para producir el polipeptido de la invencion, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
i) introducir en una celula la molecula de acido nucleico, segun la reivindicacion 2 y/o el plasmido, segun la reivindicacion 3, cada uno tal como se describe anteriormente ,
ii) y cultivar la celula en condiciones que permiten la expresion del polipeptido a partir de dicha molecula de acido nucleico o dicho plasmido, o sintetizar el polipeptido segun la invencion y tambien en la reivindicacion 1 por medio de tecnicas de slntesis de peptidos en fase solida o en fase en solution.
[0025] Los polipeptidos aislados segun la invencion pueden producirse por dicho procedimiento para producir el polipeptido.
[0026] En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento in vitro para la identification de bacterias que son sensibles a microcina S, en el que el procedimiento comprende poner en contacto el polipeptido segun la invencion o el polipeptido codificado por la molecula de acido nucleico segun la invencion, tal como se especifica tambien en la reivindicacion 2, o la composicion segun la invencion, tal como se especifica tambien en la reivindicacion 6, con una celula, en el que la reduction de la eficacia de adhesion de la celula a las celulas epiteliales intestinales es indicativa de la sensibilidad de la celula a microcina S.
[0027] La invencion tambien se refiere a un procedimiento para conservar alimentos, comprendiendo el procedimiento:
anadir a los alimentos al menos un tipo de un agente antimicrobiano natural, en el que el agente es
a) el polipeptido segun la invencion; y/o
b) la composicion segun la invencion, tal como se especifica tambien en la reivindicacion 6.
[0028] En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un procedimiento para recubrir material de aposito, en el que el material de aposito esta recubierto con:
a) el polipeptido segun la invencion; y/o
b) la composicion segun la invencion, tal como se especifica tambien en la reivindicacion 6.
Efectos ventajosos de la invencion
[0029] Es decir, los presentes inventores han identificado el polipeptido microcina S que es una nueva microcina, no descrita previamente, cuyo secuencia de nucleotidos y de aminoacidos es unica. Los genes que son responsables para los efectos de la microcina S han sido identificados y sus efectos se han caracterizado funcionalmente. Los inventores han encontrado sorprendentemente que, a diferencia de la mayorla de los antibioticos de beta-lactama clasicos, la microcina S muestra un efecto inhibidor de EHEC, incluyendo la cepa del brote O104:H4 productora de ESBL, as! como un aislado de EHEC O128:H2 y O157:H7 (Figura 5). Por lo tanto, se ha encontrado que la microcina S es eficaz en el tratamiento de infeccion por E. coli enterohemorragica (EHEC) y E. coli enteropatogena (EPEC) mas. Por lo tanto, la microcina S podrla utilizarse como una alternativa a los antibioticos convencionales y por lo tanto para el control de microorganismos patogenos. Ademas, es posible su uso para la conservation de alimentos, y la presente invencion se completo de esta manera. Se ha encontrado ademas que el grupo de genes de microcina S (MCC) (SEQ ID No: 1) de E. coli G3/10, codificada por el plasmido pSYM1 (Figura 1), consiste en los cuatro genes agrupados mcsS (SEQ ID No: 2), mcsl (SEQ ID No: 3), mcsa (SEQ ID No: 4) y mcsb (SEQ ID No: 5). Dado que E. coli G3/10 es un probiotico bien probado utilizado, por ejemplo, para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, la microcina S no necesariamente tiene que purificarse a partir de la cepa. MccS deberla ser ventajosamente eficaz in vivo.
[0030] Las ventajas son que la microcina S no es toxica, no puede inducir alergias, y es diflcil que los microbios patogenos desarrollen resistencia en contra.
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[0031] Otras caracterlsticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente description detallada y de las reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
[0032]
La figura 1 es un mapa vectorial de megaplasmido pSYMI que codifica el operon MccS.
La figura 2 es un dibujo esquematico de la secuencia de aminoacidos del gen mcsS que codifica el precursor de microcina S (panel superior). Un peptido llder probable esta subrayado. Los asteriscos indican la Cys posiblemente implicada en la formation de un enlace disulfuro tlpico para las microcinas de clase II. El grupo de genes de microcina S MccS (panel inferior) en el megaplasmido pSYMI consiste en los cuatro genes agrupados mcsS, mcsl, mcsA y mvsB.
La figura 3 representa la eficacia de la adhesion de EPEC E2348/69 en las celulas epiteliales intestinales humanas despues de la preincubacion con cepas de E. coli MDS42 y G4/9 (de tipo salvaje) y mutantes de complementation de plasmido adecuados. Significado del asterisco utilizado: *p < 0,01.
La figura 4 representa la eficacia de la adhesion de EPEC E2348/69 de tipo salvaje y mutantes complementados de plasmidos a celulas epiteliales intestinales humanas despues de la preincubacion con diferentes cepas que expresan y no expresan microcinas. Significado de los asteriscos utilizados: * p < 0,01, **p < 0,05. pAZ8 [mcsA, mcsB, mcsl], pAZ13 [mcsl], pAZ14 [mcsl, truncado].
La figura 5 muestra la eficacia de la adhesion de las cepas EHEC 86-24 serotipo O157:H7 (A), EHEC O104:H4 aislado en Dresden (B) y EHEC O104:H4 (C) y O128:H2 (D) aislado en Frankfurt (Oder) en celulas epiteliales intestinales humanas despues de la preincubacion con EcN o E. coli G3/10. Significado del asterisco utilizado: *p < 0,01 en comparacion con el control negativo.
La figura 6 ilustra los resultados de un cribado de mcsS usando PCR multiplex y el gen recA como control de inhibicion.
Breve descripcion de la lista de secuencias
[0033]
SEQ ID No: 1 es la secuencia de nucleotidos del operon de microcina S de E. coli G3/10.
SEQ ID No: 2 es la secuencia de nucleotidos del gen mcsS de E. coli G3/10.
SEQ ID No: 3 es la secuencia de nucleotidos del gen mcsl de E. coli G3/10.
SEQ ID No: 4 es la secuencia de nucleotidos del gen mcsA de E. coli G3/10.
SEQ ID No: 5 es la secuencia de nucleotidos del gen mcsB de E. coli G3/10.
SEQ ID No: 6 es la secuencia de aminoacidos del polipeptido precursor de microcina S de E. coli G3/10 que incluye una secuencia llder.
SEQ ID No: 7 es la secuencia de aminoacidos del polipeptido microcina S de E. coli G3/10 sin el peptido llder.
SEQ ID NOs: 8 - 26 son cebadores de oligonucleotidos utilizados para amplificar los genes contenidos en el operon de microcina S (SEQ ID No: 1) o sondas para cribar el gen mcsS (sEq ID No: 2) que codifica el polipeptido microcina S.
Descripcion detallada de la invencion Definiciones
[0034] A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por el experto en la materia a la que pertenece esta invencion. En caso de conflicto, regira la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.
[0035] Los artlculos "un", "una" o "el/la" se refieren a "uno" o "varios" cada vez que se utiliza en el presente documento, es decir, significa "uno", "al menos uno" o "uno o mas". Por ejemplo, el termino "una celula" puede referirse a una sola celula, as! como a una pluralidad de celulas.
[0036] El termino "comprende" incluye tambien realizaciones en las que el termino "comprende" significa "consiste en".
[0037] Tal como se utiliza en el presente documento “identidad” de aminoacido o molecula de acido nucleico es equivalente a “homologla” de aminoacido o molecula de acido nucleico.
[0038] La frase "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones en las que una molecula de acido nucleico sonda se hibridara con su secuencia de molecula de acido nucleico diana, habitualmente en una mezcla compleja de moleculas de acido nucleico, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias mas largas se hibridan especlficamente a temperaturas mas altas. Los parametros de hibridacion de acidos nucleicos se pueden encontrar en referencias que recopilan tales procedimientos, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al, eds,
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Segunda Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser de aproximadamente 5-10°C mas baja que el punto de fusion termico (Tf) para la secuencia especlfica a un pH de fuerza ionica definida. La Tf es la temperatura (bajo una fuerza ionica, pH, y concentracion de acido nucleico definidos) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio (dado que las secuencias diana estan presentes en exceso, a Tf, el 50% de las sondas estan ocupadas en equilibrio). Las condiciones rigurosas seran aquellas en las que la concentracion de sal es menor que aproximadamente 1,0 M de ion de sodio, habitualmente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentracion de iones de sodio (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleotidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleotidos). Las condiciones rigurosas tambien se pueden lograr con la adicion de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Para una hibridacion de alta rigurosidad, una senal positiva es al menos dos veces la base, preferiblemente 10 veces la hibridacion de base. Las condiciones de hibridacion rigurosas o de alta rigurosidad de ejemplo incluyen: 50% de formamida, 5x SSC y SDS al 1% incubacion a 42°C o 5x SSC y SDS al 1%, incubacion a 65°C, con un lavado en 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 65°C.
[0039] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "actividad de tipo microcina" de un polipeptido significa que el polipeptido ejerce una potente actividad antibacteriana/antimicrobiana contra especies estrechamente relacionadas. Significa, ademas, que los productores de microcina son resistentes a la microcina que producen, que esta mediada por al menos un gen que confiere resistencia situado dentro de un grupo de genes.
[0040] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "plasmido" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de replicacion en una celula y a la que otra molecula de acido nucleico puede estar unida operativamente a fin de llevar a cabo la replication del segmento unido. Los plasmidos capaces de dirigir la expresion de un gen estructural que codifica un polipeptido de la invention se denominan en el presente documento como "plasmidos de expresion".
[0041] Tal como se utiliza en este documento, la expresion "unida operativamente" significa que la molecula de acido nucleico de la invencion se une al plasmido de modo que la expresion del gen estructural formado por la molecula de acido nucleico esta bajo el control del plasmido.
[0042] El termino "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion).
[0043] En este documento, el termino "plasmido conjugativo" se refiere a un plasmido que se puede mover de una celula a otra durante el proceso de conjugation.
[0044] Tal como se utiliza en el presente documento, los terminos "transformation" y "transfection" pretenden referirse a una variedad de tecnicas reconocidas en el sector para introducir un acido nucleico exogeno (por ejemplo, ADN) en una celula huesped, incluyendo coprecipitacion de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofeccion, o electroporation.
[0045] El termino "probiotico", como se utiliza en el presente documento, se refiere a microorganismos vivos, que tras la ingestion en cierto numero, ejercen efectos positivos sobre la salud mas alla de la nutrition basica inherente.
[0046] Tal como se utiliza en el presente documento una "composicion farmaceutica" se refiere a una preparation de uno o mas de los principios activos descritos en el presente documento, es decir, el polipeptido segun la invencion (o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo) o la celula segun la invencion con otros componentes qulmicos, tales como portadores y excipientes fisiologica y farmaceuticamente aceptables. El proposito de una composicion farmaceutica es facilitar la administration de un compuesto a un organismo.
[0047] En lo sucesivo, las expresiones "portador fisiologicamente aceptable" y "portador farmaceuticamente aceptable" que se pueden utilizar indistintamente se refieren a un portador o un diluyente que no causa irritation significativa a un organismo y no anula la actividad biologica y las propiedades del compuesto administrado. Uno de los ingredientes incluidos en el portador farmaceuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), un pollmero biocompatible con un amplio rango de solubilidad en medios organicos y acuosos (Mutter et al. (1979).
[0048] En este documento el termino "excipiente" se refiere a una sustancia inerte anadida a una composicion farmaceutica para facilitar aun mas la administracion de un principio activo. Ejemplos, sin limitation, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azucares y tipos de almidon, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
[0049] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "creai" se refiere a prevenir, curar, revertir, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir o detener los efectos perjudiciales de un proceso de enfermedad. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "sujeto" se refiere a un sujeto que puede beneficiarse de la presente invencion, tal como un animal o mamlfero (por ejemplo, canino, felino, ovino, porcino, equino, bovino, humano), preferiblemente un
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sujeto humano.
[0050] En este documento, el termino "trastorno gastrointestinal funcional" abarca una serie de trastornos idiopaticos separados que afectan a diferentes partes del tracto gastrointestinal.
Polipeptidos
[0051] El polipeptido microcina S de la presente invencion se caracteriza por su secuencia de restos de aminoacidos y nuevas propiedades funcionales. Los polipeptidos se pueden aislar usando procedimientos conocidos en la tecnica. Es decir, un polipeptido S microcina de origen natural o producido de manera recombinante se puede aislar de celulas o fuentes de tejido mediante un esquema de purificacion apropiado usando tecnicas de purificacion de protelnas convencionales. Sin embargo, los polipeptidos microcina S pueden ser de origen natural en una celula o pueden producirse mediante tecnicas de ADN recombinante o alternativamente a la expresion recombinante, un polipeptido microcina S se puede sintetizar qulmicamente utilizando tecnicas de slntesis de peptidos estandar. En este documento, el polipeptido microcina S se clasifica como un microcina de E. coli que se ha caracterizado fenotlpicamente y se ha denominado como microcina S. La figura 2 muestra una secuencia de aminoacidos de precursor de microcina S en el panel superior. Un peptido llder doble de glicina esta subrayado. Los asteriscos indican cistelnas posiblemente implicadas en la formacion de un enlace disulfuro tlpico para microcinas de clase II. La secuencia de aminoacidos representa un peptido rico en glicinas con un sitio de escision de doble glicina. Los polipeptidos que tienen la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o la SEQ ID No: 7 o variantes biologicamente activas de polipeptidos que tienen la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o la SEQ ID No: 7 se pueden utilizar en los procedimientos descritos en el presente invencion.
[0052] Por lo tanto, en una realizacion preferida, el polipeptido comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que es al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, 98% o mas identica a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 7.
[0053] Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o de dos secuencias de acidos nucleicos, las secuencias se alinean para propositos de comparacion optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda de aminoacidos o acido nucleico para la alineacion optima).
[0054] En una realizacion preferida, el polipeptido esta codificado por una molecula de acido nucleico que comprende o consiste en una secuencia de nucleotidos que es al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95%, 98% o mas identica a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma.
[0055] Los residuos en las posiciones correspondientes se comparan a continuacion y cuando una posicion en una secuencia esta ocupada por el mismo residuo que la posicion correspondiente en la otra secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre dos secuencias, por lo tanto, es funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las dos secuencias (es decir,% de identidad = # de posiciones identicas/# total de posiciones x 100). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que se introducen para la alineacion optima de las dos secuencias.
[0056] La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matematico. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 5873. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403. Las busquedas de nucleotidos por BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST puntuacion = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a las moleculas de acido nucleico de la invencion. Las busquedas de protelnas por BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de protelna de la invencion. Para obtener alineamientos con huecos con fines de comparacion, Gapped BLAST se puede utilizar tal como se describe en Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Research 25 (17): 3389. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Ver
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido no limitante de un algoritmo utilizado para la comparacion de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (version 2.0 o 2.OU) que es parte del paquete de software de alineacion de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoacidos, se puede utilizar una tabla de peso de residuo PAM120, una longitud de penalization de hueco de 12 y una penalization por hueco de 4. Los algoritmos adicionales para el analisis de secuencia son conocidos en la tecnica, e incluyen ADVANCE y ADAM, descritos en Torelli y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10: 3; y FASTA, descrito en Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444.
[0057] En una realizacion adicional, el polipeptido tiene actividad de tipo microcina, actividad antimicrobiana,
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antibacteriana o antitumoral. El polipeptido es un polipeptido bacteriano, preferiblemente microcina S. bacteriana. Ademas, el polipeptido inhibe la adhesion bacteriana a las celulas epiteliales intestinales humanas. Es decir, tiene que entenderse que el polipeptido proporciona actividad antimicrobiana/antibacteriana frente a especies estrechamente relacionadas, mientras que el polipeptido no ejerce actividad antibacteriana/antimicrobiana contra su productor que es resistente a la microcina que produce. Por lo tanto, el polipeptido inhibe la adhesion de las especies bacterianas estrechamente relacionadas con las celulas epiteliales intestinales humanas.
[0058] Preferiblemente, el polipeptido es obtenible a partir de una cepa de E. coli, mas preferiblemente de E. coli G3/10. En otras realizaciones, el E. coli G3/10 es E. coli G3/10 DSM 16443.
[0059] Se prefiere ademas que el polipeptido sea biodegradable.
Moleculas de acido nucleico
[0060] El genoma del probiotico E. coli cepa G3/10 se secuencio completamente utilizando la tecnologla "pirosecuenciacion" y, posteriormente, se anoto de forma automatica y se edito posteriormente de forma manual.
[0061] E. coli G3/10 tiene un genoma de 4.935.403 pb y seis plasmidos con un tamano de entre 1,3 kb y 50 kb. 40 kb del plasmido de 50 kb llamado pSYM1 son casi completamente identicos (99% de homologla) con pMAS2027 de una E. coli uropatogena (Ong, CL, Beatson, SA, McEwan, AG & Schembri, MA (2009) Appl Environ Microbiol 75, 6783-6791). Los 10 kb restantes contienen marcos de lectura con ninguna o solo una baja homologla con secuencias de nucleotidos y de aminoacidos depositadas en las bases de datos del NCBI y ExPASy. Cuatro de estos genes codifican una microcina de E. coli de clase IIA completamente nueva, no descrita previamente, que incluye la inmunidad y el sistema de transporte. Este grupo de genes de microcina S (SEQ ID No: 1) que consiste en los cuatro genes agrupados mcsS (SEQ ID No: 2), mcsI (SEQ ID No: 3), mcsA (SEQ ID No: 4) y mcsB (SEQ ID No: 5) se ha aislado. Esta microcina se caracterizo genotlpicamente y denomino microcina S. Los dos genes de exportacion de MccS son mcsA y mcsB (figura 2). El gen mcsA es un miembro de la familia de hemolisinas HlyD de E. coli y muestra una pequena homologla con la protelna de secrecion de colicina cvaA. El gen mcsB codifica un transportador ABC con dos regiones de dominios transmembrana y un dominio peptidasa. Ambos genes de exportacion de MccS que son mcsA y mcsB codifican polipeptidos que son responsables para el transporte de microcina S desde el citoplasma celular, particularmente citoplasma bacteriano, al espacio extracelular.
[0062] Una molecula de acido nucleico de la presente invencion, por ejemplo, una molecula de acido nucleico que tiene la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 5 o de una cualquiera de las SEQ ID NOs 8-26 o una parte de la misma, puede aislarse utilizando tecnicas estandar de biologla molecular y la information de la secuencia proporcionada en este documento. Por ejemplo, usando toda o una parte de la secuencia de acido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 5 o de una cualquiera de SEQ ID NOs 8-26 como sonda de hibridacion, las moleculas de acido nucleico de microcina S se pueden aislar utilizando las tecnicas de hibridacion y donation estandar (por ejemplo, tal como se describe en Sambrook, J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.).
[0063] Un acido nucleico de la invencion puede amplificarse usando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genomico, como plantilla y cebadores de oligonucleotidos apropiados segun tecnicas estandar de amplification por PCR. En el presente documento se describen a continuation mas cebadores utiles. El acido nucleico as! amplificado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizarse por analisis de secuencia de ADN. Ademas, los oligonucleotidos correspondientes a las secuencias de nucleotidos de microcina S se pueden preparar mediante tecnicas sinteticas estandar, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado.
[0064] En una realization preferida, la molecula de acido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleotidos que es al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o mas identica a una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma.
[0065] En otra realizacion preferida, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos que es al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o mas identica a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 6 o a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 7.
[0066] En una realizacion adicional, la molecula de acido nucleico codifica un polipeptido bacteriano, preferiblemente microcina S bacteriana.
[0067] Preferiblemente, la molecula de acido nucleico se puede obtener a partir de una cepa de E. coli, mas preferiblemente de E. coli G3/10. En una realizacion especlfica, la molecula de acido nucleico se puede obtener a partir de E. coli G3/10 DSM 16443.
Cebador o sonda de acido nucleico
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[0068] La secuencia de nucleotidos determinada a partir de la clonacion de genes de microcina S permite la generacion de sondas y cebadores disenados para su uso en la amplificacion del gen de microcina S de la invencion y/o la identification de genes de microcina S en otras especies.
[0069] Por lo tanto, la presente invencion proporciona ademas moleculas de acido nucleico como cebadores o sondas que comprenden una secuencia que se hibrida con una molecula de acido nucleico segun la invencion en condiciones rigurosas. Dicho cebador o sonda de acido nucleico comprende una secuencia de al menos 15 bases consecutivas.
[0070] El cebador o sonda de acido nucleico comprende habitualmente un oligonucleotido sustancialmente purificado.
[0071] En una realization preferida, el cebador o sonda de acido nucleico se hibrida a al menos aproximadamente 12 o 15, preferiblemente aproximadamente 20 o 25, mas preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, o 100 nucleotidos consecutivos de una secuencia de sentido de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma o de una variante alelica de origen natural o mutante de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5. En una realizacion, el cebador o sonda de acido nucleico se hibrida a una secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5 o un complemento de la misma en condiciones rigurosas.
[0072] En una realizacion mas preferida, el cebador o sonda de acido nucleico comprende al menos una de SEQ ID No: 8 a SEQ ID No: 26. Las secuencias de cebadores o sondas de acido nucleico habituales se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1: Oligonucleotidos (sintetizados por Biomers, Alemania)
Oligonucleotido
Secuencia (5' -> 3') Funcion
contig49 for SEQ ID N°: 8
cagctggatatcctgcgcg cebador de secuenciacion pSYM1
contig49 rev SEQ ID No: 9
ggttgcccggcatccaacg secuenciacion de cebador pSYM1
pSYM1-Sa1IHF SEQ ID No: 10
tcaattgtgtcgactcaattactcttgtgag cebador de clonacion pAZ6/pAZ8
pSYM1-NheI SEQ ID No: 11
catgtaatagtgctagcatgttaaaatttataag clonacion del cebador pAZ6
pSYM1-NheIac SEQ ID No: 12
caaaaataatagctagcaagtgatgttttgtaatg clonacion del cebador pAZ8, pAZ12
ac-EcoRI SEQ ID No: 13
ctcgaattcatccattacaaaacatcac cebador de clonacion pAZ9
ac-PstI SEQ ID No: 14
ctggctgcagtaattgttcaggaagtaacg cebador de clonacion pAZ9
pSYM1 44-EcoRI SEQ ID No: 15
taggaattcagaggaactattggtggg
pSYM1 44-PstI SEQ ID No: 16
ctccgctgcagacttacttatcgactacaggtaccac cebador de clonacion pAZ10
ab-EcoRI SEQ ID No: 17
gttagaattcataagagggatttttatgtcaaatatc cebador de clonacion pAZ11
ab-PstI SEQ ID No: 18
gttgatactgcagcttatcgactacaggtaccacc cebador de clonacion pAZ11
pAZ9-HindIII SEQ ID No: 19
cccaagcttagttaaatgtgctaatgctgtc cebador de clonacion pAZ12
pAZ9-SalI SEQ ID No: 20
ggcatcggtcgacgcaac cebador de clonacion pAZ12
pSYM1 43-NheI SEQ ID No: 21
cattgctagccatcacagataaactggataac cebador de clonacion pAZ14
pSYM1 43-Sal I SEQ ID No: 22
ccctgagtcgactcatggttataaaatattttg cebador de clonacion pAZ13, pAZ14
recA-ff SEQ ID N°: 23
atggctatcgacgaaaacaaac control de inhibition interna
recA-rev SEQ ID N°: 24
ttaaaaatcttcgttagtttctgc control de inhibicion interna
mcsS-ff SEQ ID No: 25
atgtcaaatatcagagaattgag cebador de cribado mcsS
mesS-rev
ttatcgactacaggtaccacc cebador de cribado mcsS
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SEQ ID No: 26
[0073] Los cebadores o sondas de acido nucleico segun la invention se usan para amplificar o cribar una molecula de acido nucleico segun la invencion.
[0074] Por lo tanto, las moleculas de acido nucleico o partes de las mismas se pueden amplificar, por ejemplo, por PCR u otra tecnica de amplification bien conocida en el sector, y las moleculas de acido nucleicos amplificadas o partes de las mismas se pueden secuenciar por procedimientos conocidos en la tecnica. La reaction en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento de amplificacion de acidos nucleicos, que comprende la desnaturalizacion, hibridacion y extension de acidos nucleicos, y durante el proceso de hibridacion, tiene lugar la hibridacion de una sonda y un acido nucleico diana. Las condiciones para la PCR pueden alterarse segun el grado de homologla entre la sonda y el acido nucleico diana. Cuando se eleva la temperatura de hibridacion bajo condiciones de PCR determinadas, disminuye el rendimiento de los productos de hibridacion no especlfica, mientras que, cuando se disminuye la temperatura de hibridacion, se aumenta el rendimiento de productos de hibridacion no especlfica. Vease, por ejemplo, J. Sambrook y David W. Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2000).
[0075] Las sondas descritas en este documento se pueden usar ademas para detectar moleculas de acido nucleico de la invencion en diversos tipos de celulas. Por ejemplo, los cebadores o sondas de acido nucleico segun la invencion se pueden utilizar para cribar una molecula de acido nucleico segun la invencion usando PCR multiplex. Una PCR multiplex permite la amplificacion simultanea de diferentes genes que estan destinados a la amplificacion, en la misma reaccion. Es decir, los diferentes conjuntos de cebadores que son capaces de amplificar sus respectivas secuencias diana se colocan en un reactor, y se realizan simultaneamente amplificaciones de las secuencias diana en una sola reaccion PCR (vease, por ejemplo Wittwer CT, et al., Real-time multiplex PCR assays. Methods 25 (4): 430-442, (2001); Markoulatos P., et al, Multiplex PCR: rapid DNA cycling in a conventional termal cycler. J. Clin Lab Anal 17 (4): 108-112, (2003); O. Henegariu, et al, Multiplex PCR: Critical parameters an Step-by-Step Protocol. BioTechniques 23: 504-511, (1997); y Markoulatos P., et al, Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. J. Clin Lab Anal 16 (1): 47-51, (2002).
Plasmidos
[0076] Los plasmidos son un tipo de un vector, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Ciertos plasmidos son capaces de replication autonoma en una celula huesped en la que se producen o en la que se introducen (por ejemplo, plasmidos bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores de mamlferos episomales).
[0077] Ademas, ciertos plasmidos son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan unidos operativamente. Tales vectores se denominan en el presente documento como "plasmidos de expresion".
[0078] E. coli G3/10 tiene seis plasmidos con un tamano entre 1,3 kb y 50 kb. 40 kb del plasmido de 50 kb llamado pSYM1 (Figura 1) son casi completamente identicos (99% de homologla) con pMAS2027 de una E. coli uropatogena. Los 10 kb restantes contienen marcos de lectura con ninguna o solo una baja homologla con las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos depositadas en las bases de datos del NCBI y ExPASy. Cuatro de estos genes codifican una microcina de E. coli de clase IIA completamente nueva, no descrita previamente, que incluye la inmunidad y el sistema de transporte. Este grupo de genes de microcina S (SEQ ID No: 1) que consiste en los cuatro genes agrupados mcsS (SEQ ID No: 2), mcsI (SEQ ID No: 3), mcsA (SEQ ID No: 4) y mcsB (SEQ ID No: 5) se ha aislado.
[0079] Por lo tanto, un plasmido puede comprender la molecula de acido nucleico de la invencion. En una realization preferida, el plasmido es un plasmido de expresion.
[0080] Los plasmidos de expresion de la invencion comprenden un acido nucleico de la invencion en una forma adecuada para la expresion de la molecula de acido nucleico en una celula, lo que significa que los vectores de expresion de origen natural o recombinante incluyen una o mas secuencias reguladoras, seleccionadas segun las celulas huesped a utilizar para la expresion, que estan operativamente ligadas a la secuencia de acido nucleico a expresar.
[0081] Por consiguiente, se prefiere adicionalmente que un elemento regulador del plasmido se una operativamente a la molecula de acido nucleico de la invencion.
[0082] En otra realizacion, el plasmido es un plasmido conjugativo.
[0083] Los plasmidos utilizados en este documento se muestran en la Tabla 2:
TABLA 2. Plasmidos utilizados
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Plasmido
Resistencia Genotipo relevante Origen
pSYM1
mcsS, mcsI, mcsA, mcsB este trabaio
pST76-A
Ampr oriTS(30»C) Posfai, G., M.D. Koob, H.A. Kirkpatrick, y F.R. Blattner. 1997. J. Bacteriol. 179: 4426-4428
pSYM1-ST76An
Ampr mcsS, mcsI, mcsA, mcsB este trabajo
pAZ6
Ampr mcsS, mcsI, mcsA, mcsB este trabajo
pAZ8
Ampr mcsI, mcsA, mcsB este trabajo
pAZ9
Cmr mcsS este trabajo
pAZ10
Cmr ORF1 este trabajo
pAZ11
Cmr ORF2 este trabajo
pAZ12
Cmr mcsSl93-363 este trabajo
pAZ13
Ampr mcsI este trabajo
pAZ14
Ampr mcsI361-651 este trabajo
Celulas
[0084] Una celula puede ser una celula huesped que puede ser cualquier celula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipeptido microcina S se puede expresar en celulas bacterianas, tales como E. coli, que se prefiere en el presente documento, o celulas de insecto, celulas de levadura o de mamlfero (tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas COS). Otras celulas huesped adecuadas son conocidas por los expertos en la tecnica.
[0085] El ADN de plasmido puede ser de origen natural en la celula o se puede introducir en celulas procariotas o eucariotas mediante tecnicas de transformacion o transfeccion convencionales. Los procedimientos adecuados para transformar o transfectar celulas huesped pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989.), y en otros manuales de laboratorio.
[0086] Por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a una celula que comprende la molecula de acido nucleico de la presente invencion, y/o el polipeptido de la reivindicacion 1 y/o un plasmido de la presente invencion.
[0087] La molecula de acido nucleico puede estar integrada en el genoma de la celula de la invencion (celula objeto) o, preferiblemente en un plasmido en la celula objeto.
[0088] Se prefiere que la celula objeto sea una celula bacteriana. Por ejemplo, la celula es una celula de E. coli, preferiblemente de E. coli DSM 17252, lo mas preferiblemente una celula de E. coli G3/10.
[0089] La celula objeto tambien puede ser una celula huesped recombinante.
[0090] En una realization preferida, la celula objeto es una celula probiotica. Por tanto, la celula tiene actividad antimicrobiana, antibacteriana o antitumoral. Tiene que entenderse que la celula proporciona actividad antimicrobiana contra las especies estrechamente relacionadas, mientras que la celula no ejerce actividad antimicrobiana contra su productor que es resistente a la microcina que produce.
[0091] Por tanto, la celula objeto inhibe la adhesion bacteriana a celulas epiteliales intestinales humanas.
[0092] Las celulas que comprenden de forma natural los acidos nucleicos, polipeptidos o plasmidos de la invencion y que especlficamente no estan en forma aislada se excluyen de las reivindicaciones de la presente solicitud.
Anticuerpos
[0093] Se utiliza un inmunogeno no microcina S inmunogena habitualmente para preparar anticuerpos inmunizando un sujeto adecuado, (por ejemplo, conejo, cabra, raton u otro mamlfero) con el inmunogeno. Una preparation inmunogenica apropiada puede contener, por ejemplo, un polipeptido microcina S de origen natural o expresado de forma recombinante o un peptido microcina S sintetizado qulmicamente. La preparacion puede incluir ademas un adyuvante, tal como un adyuvante completa o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulador similar. La inmunizacion de un sujeto adecuado con una preparacion de microcina S inmunogenica induce una respuesta de anticuerpos policlonales anti-microcina S. Tales procedimientos son conocidos en la tecnica.
[0094] Por lo tanto, se pueden preparar anticuerpos policlonales anti-S microcina tal como se describe anteriormente inmunizando un sujeto adecuado con un inmunogeno de microcina S. Si se desea, las moleculas de anticuerpo dirigidas contra el polipeptido microcina S se pueden aislar de un mamlfero (por ejemplo, de la sangre) y purificarse adicionalmente mediante tecnicas bien conocidas, tales como cromatografla de protelna A para obtener la fraction
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IgG. En un momento apropiado despues de la inmunizacion, por ejemplo, cuando los tltuios de anticuerpo anti- microcina S son mas altos, las celulas productoras de anticuerpos pueden obtenerse del sujeto y utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante tecnicas estandar, tales como la tecnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497 (vease tambien, Brown et al (1981) J. Immunol 127: 539-46; Brown et al (1980) J. Biol Chem 255: 4980-83; Yeh et al (1976) Proc Natl Acad Sci USA. 76: 2927-31; y Yeh et al (1982) Int J. Cancer 29: 269-75), la tecnica de hibridoma de celulas B humanas mas recientes (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), la tecnica de hibridoma de EBV (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o tecnicas de trioma. La tecnologla para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales es bien conocida (vease en general Kenneth, R.H. en Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Publishing Corp., Nueva York, Nueva York (1980); Lerner, EA (1981) Yale J. Biol. Med 54: 387-402; Gefter, ML et al (1977) Somatic Cell Genet., 3: 231-36). Brevemente, una llnea celular inmortal (habitualmente un mieloma) se fusiona a linfocitos (habitualmente esplenocitos) de un mamlfero inmunizado con un inmunogeno de microcina S, tal como se describe anteriormente, y los sobrenadantes de cultivo de las celulas de hibridoma resultantes se criban para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal anticuerpo que se une especlficamente a un polipeptido microcina S.
[0095] Por consiguiente, en realizaciones, la presente invencion tambien se refiere a anticuerpos que se unen selectivamente a un polipeptido que es un polipeptido microcina S. En vista del principio bien establecido de reactividad inmunologica cruzada, la presente invencion por lo tanto contempla variantes relacionadas antigenicamente del polipeptido de SEQ ID No: 6 o de la SEQ ID No: 7. Una "variante relacionada antigenicamente" es un polipeptido que incluye al menos una parte de secuencia de seis residuos de aminoacidos de un polipeptido de la SEQ No: 6 o de la SEQ ID No: 7 y que es capaz de inducir moleculas de anticuerpos que reaccionan inmunologicamente con un polipeptido de SEQ ID No: 6 o de SEQ ID No: 7. Los anticuerpos pueden ser sinteticos, monoclonales, o policlonales y se pueden producir mediante tecnicas bien conocidas en el sector.
Composiciones y composiciones farmaceuticas
[0096] El polipeptido microcina S o incluso una celula de la invencion se pueden incorporar en una composicion o una composicion farmaceutica que son adecuadas para la administracion. En consecuencia, la presente invencion contempla una composicion que comprende un polipeptido segun la invencion o una celula segun la invencion.
[0097] En una realizacion preferida adicional, la composicion es una composicion acuosa.
[0098] En una realizacion adicional, la composicion tiene actividad antimicrobiana, antibacteriana o antitumoral. Por tanto, la composicion inhibe la adhesion bacteriana a celulas epiteliales intestinales humanas.
[0099] En una realizacion preferida, la composicion es una composicion probiotica. Preferiblemente, la composicion probiotica comprende una mezcla de microorganismos probioticos, de preferencia de E. coli DSM 17252. Por ejemplo, la composicion comprende celulas y/o autolisados de al menos uno de E. coli G1/2 (DSM 16441), G3/10 (DSM 16443), G4/9 (DSM 16444), G5 (DSM 16445), G6/7 (DSM 16446) y G8 (DSM 16448) o una mezcla de los mismos. Una composicion puede contener autolisatos as! como las celulas en una cantidad de 3,00 x 106 a 2,25 x 108 celulas por 1 ml, preferiblemente de 1,5 a 4,5 x 107 celulas por 1 ml. Preferiblemente, la composicion comprende autolisados, as! como celulas, de bacterias de E. coli y aditivos adicionales. Pos consiguiente, la invencion proporciona una composicion probiotica que comprende al menos una de las cepas bacterianas E. coli G1/2 (DSM 16441), G3/10 (DSM 16443), G4/9 (DSM 16444), G5 (DSM 16445), G6/7 (DSM 16446) y G8 (DSM 16448), es decir, una de las cepas mencionadas anteriormente o cualquier cepa bacteriana seleccionada por el procedimiento de la invencion, en la que la composicion comprende al menos 1 cepa, preferiblemente de 2 a 3 cepas, mas preferiblemente de 2 a 4 cepas, incluso mas preferiblemente de 2 a 5 cepas y lo mas preferiblemente de 2 a 6 cepas, y en la que cada una de las cepas esta presente en la composicion en una proporcion de 0,1% a 99,9%, preferiblemente de 1% a 99%, mas preferiblemente de 10% a 90%. En una realizacion preferida, la composicion comprende al menos una de las cepas bacterianas de la invencion junto con otra cepa o mezcla de las cepas, en la que la mezcla comprende preferiblemente de 2 a 6 cepas, mas preferiblemente de 2 a 4 cepas, lo mas preferiblemente de 2 a 3 cepas y en la que cada una de las cepas esta presente en la composicion en una proporcion de 0,1% a 99,9%, preferiblemente de 1% a 99%, mas preferiblemente de 10% a 90%. Las composiciones probioticas de la invencion estan preferiblemente en una forma liofilizada, en forma congelada o incluso muerta. En una realizacion preferida, una composicion probiotica comprende uno o mas microorganismos probioticos y un portador que funciona para transportar dicho uno o mas microorganismos probioticos en el tracto gastrointestinal, el portador puede comprender almidon resistente modificado o no modificado en forma de almidones ricos en amilosa o mezclas de los mismos. El portador actua como un medio de crecimiento o mantenimiento para microorganismos en el tracto gastrointestinal de manera que los microorganismos probioticos estan protegidos durante el paso al intestino grueso u otras regiones del tracto gastrointestinal.
[0100] En una realizacion preferida, la composicion puede ser ademas una composicion farmaceutica. Por tanto, la composicion farmaceutica comprende ademas un portador farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica puede contener una cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido o la celula y uno o mas adyuvantes, excipientes, portadores, y/o diluyentes. Los diluyentes, portadores y excipientes aceptables
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normalmente no afectan negativamente a la homeostasis de un receptor (por ejemplo, el equilibrio de electrolitos). Los portadores aceptables incluyen sales biocompatibles, inertes o bioabsorbibles, agentes tamponantes, oligosacaridos o polisacaridos, pollmeros, agentes mejoradores de la viscosidad, conservantes y similares. Mas detalles sobre tecnicas para la formulacion y administracion de las composiciones farmaceuticas se pueden encontrar en, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa.).
[0101] Entre los ejemplos de aditivos incluyen glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidon, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, acido estearico, sacarina sodica, talco, carbonato de magnesio y similares. Ejemplos de aditivos que se pueden anadir para proporcionar un color deseable, sabor, estabilidad, capacidad tamponante, dispersion u otras caracterlsticas deseables conocidas son oxido de hierro rojo, gel de sllice, lauril sulfato de sodio, dioxido de titanio, tinta blanca comestible y similares. Se pueden utilizar diluyentes similares para preparar comprimidos.
[0102] En realizaciones, los compuestos activos suplementarios tambien se pueden incorporar en las composiciones.
[0103] Las composiciones farmaceuticas de la invencion se formulan para ser compatibles con su via de administracion prevista. Los ejemplos de vlas de administracion incluyen parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradermica, subcutanea, oral, transdermica (topica), transmucosal, y rectal.
[0104] Las soluciones o suspensiones usadas para aplicacion parenteral, intradermica, o subcutanea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril, tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencllico o metilparabenos; antioxidantes, tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como el acido etilendiaminotetraacetico; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sodico o dextrosa. El pH se puede ajustar con acidos o bases, tales como acido clorhldrico o hidroxido de sodio. La preparacion parenteral puede incluirse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de multiples dosis fabricados de vidrio o plastico.
[0105] Las composiciones adecuadas para su uso inyectable incluyen soluciones acuosas esteriles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para la administracion intravenosa, los portadores adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solucion salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composicion debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que exista una facil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe conservarse contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un medio disolvente o de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol llquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
[0106] La administracion oral se puede aplicar en forma de una capsula, llquido, comprimido, plldora, o formulacion de liberacion prolongada.
[0107] Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehlculo comestible. Pueden estar incluidos en capsulas de gelatina o comprimidos en comprimidos. Para el proposito de la administracion terapeutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos, o capsulas. Las composiciones orales tambien se pueden preparar usando un portador fluido, en el que el compuesto en el portador fluido se aplica por via oral y se agita y se expectora o se traga. Se pueden incluir como parte de la composicion agentes de union farmaceuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes. La composicion oral puede contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: una sal, tal como cloruro de sodio o sulfato de magnesio, tal como sulfato de magnesio ■ 7 H2O, cloruro de potasio, cloruro de calcio, tal como cloruro de calcio ■ 2 H2O, cloruro de magnesio, tal como cloruro de magnesio ■ 6 H2O, agua purificada, un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente disgregante, tal como acido alglnico, Primogel, o almidon de malz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante, tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante, tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
[0108] Para la administracion por inhalacion, los compuestos se suministran en forma de una pulverization de aerosol de envase a presion o dispensador que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dioxido de carbono, o un nebulizador.
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[0109] La administracion sistemica tambien puede ser por via transmucosal o transdermica. Para la administracion transmucosal o transdermica, se utilizan penetrantes apropiados para la barrera a permear en la formulacion. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, para la administracion transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de acido fusldico. La administracion transmucosal puede lograrse a traves del uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administracion transdermica, los compuestos activos se formulan en pomadas, balsamos, geles o cremas, tal como se conoce generalmente en la tecnica.
[0110] Los compuestos tambien se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retention para la administracion rectal.
[0111] En una realization, los compuestos activos se preparan con portadores que protegeran el compuesto contra la elimination rapida del cuerpo, tal como una formulacion de liberation controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se puedne utilizar pollmeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno- acetato de vinilo, polianhldridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Los procedimientos para la preparation de tales formulaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Los materiales tambien pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales para antlgenos virales) tambien se pueden usar como portadores farmaceuticamente aceptables. Estos se pueden preparar segun procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.522.811.
[0112] Es especialmente ventajoso formular composiciones orales en forma unitaria de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. La forma de dosificacion unitaria, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades flsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de dosificacion unitaria de la invention estan dictadas por y dependen directamente de las caracterlsticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular a conseguir, y las limitaciones inherentes en la tecnica de componer dicho compuesto activo para el tratamiento de los individuos.
[0113] En una realizacion alternativa, la composition puede ser un desinfectante para superficies. Por lo tanto, el uso de la composicion de desinfeccion de superficies tambien se contempla en el presente documento.
[0114] En una realizacion preferida, la composicion de desinfeccion comprende, ademas, cuando proceda, una sustancia tensioactiva (tensioactivo) o mezcla de sustancias, sustancias aromaticas, adyuvantes y aglutinantes.
[0115] En otra realizacion, la composicion de desinfeccion comprende adicionalmente un aglutinante y, opcionalmente, sustancias aromaticas y colorantes y adyuvantes, tales como sustancias para ablandar el agua, cargas y similares, y esta disponible en forma llquida, en forma de comprimidos o en forma de granulado.
[0116] Preferiblemente, la composicion de desinfeccion es seguro para los alimentos.
[0117] La composicion de desinfeccion ademas protege contra microbios patogenos con resistencia a los antibioticos.
Kits
[0118] Tambien se proporcionan kits que comprenden, en uno o mas recipientes, una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz de la composicion de la invencion. El kit puede incluir opcionalmente instrucciones para realizar los usos medicos destinados, tal como se describe en el presente documento, o para llevar a cabo los procedimientos proporcionados.
Usos medicos del polipeptido, la celula, las composiciones y el kit
[0119] Dado que el polipeptido; la celula y la composicion muestran actividad antimicrobiana, antibacteriana o antitumoral, la invencion se refiere ademas a sus usos medicos en terapia o prevencion.
[0120] Especlficamente, se pueden usar en el tratamiento o la prevention de infecciones microbianas. Ademas, se utilizan en el tratamiento y la profilaxis de trastornos gastrointestinales, por ejemplo, trastornos gastrointestinales funcionales, en una realizacion en el tratamiento y la profilaxis de la diarrea.
[0121] En una realizacion preferida, la infection microbiana comprende infecciones con E. coli enteropatogena y/o enterohemorragica (EPEC, EHEC). En una realizacion adicional, la infeccion microbiana comprende el slndrome uremico hemolltico (SHU), preferiblemente slndrome uremico hemolltico enteropatico. La invencion, sin embargo, no
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se limita a enfermedades causadas por EPEC o EHEC, sino tambien comprende el tratamiento o profilaxis de enfermedades causadas por otros microorganismos que son responsables de trastornos gastrointestinales, tales como la diarrea, por ejemplo, Salmonella spec., Shigella spec. y Yersinia spec.
[0122] En una realizacion preferida, la infeccion microbiana comprende una infeccion por E. coli enterohemorragica (EHEC). Es decir, la cepa del brote H4:O104 de E. coli enterohemorragica o cualquier otra EHEC susceptible a microcina S. En una realizacion mas preferida, la infeccion microbiana comprende una infeccion por E. coli que produce la toxina Shiga. La E. coli productora de la toxina Shiga puede ser una E. coli enterohemorragica. Junto a otros factores de virulencia, las toxinas Shiga (Stx 1; Stx 2; Stx 1,2) son responsables de la diarrea severa, sobre todo con sangre, y la aparicion del slndrome uremico hemolltico. Las celulas de EHEC liberan mayores cantidades de toxinas Shiga por tratamiento con ciertos antibioticos. Por lo tanto, se describe que el tratamiento de pacientes con antibioticos esta contraindicado. Mediante el tratamiento de la infeccion microbiana usando el polipeptido objeto; la celula objeto o la composicion de la invencion, se puede inhibir la produccion de la toxina Shiga.
[0123] En otras realizaciones, la infeccion microbiana comprende una infeccion por E. coli enteropatogena.
[0124] En realizaciones, la infeccion microbiana comprende una infeccion por enterobacterias que producen beta- lactamasa de espectro mejorado. Preferiblemente, la infeccion microbiana comprende una E. coli productora debeta- lactamasas de espectro mejorado.
[0125] En realizaciones, el polipeptido objeto; la celula objeto o la composicion de la invencion inhiben los microbios que causan la infeccion microbiana en una proporcion de 1:1000, preferiblemente 1:500, mas preferiblemente 1:100, incluso mas preferiblemente 1:50, lo mas preferido 1:20 o incluso de 1:1 a 1:10.
[0126] En una realizacion alternativa, el polipeptido objeto; la celula objeto; la composicion de la invencion o el kit de la invencion son para su uso en el tratamiento de trastornos gastrointestinales funcionales, el slndrome del intestino irritable preferiblemente. Se prefiere que se utilicen en el tratamiento de adultos y ninos.
[0127] En otra realizacion alternativa, el polipeptido; la celula; la composicion o el kit es para su uso en el tratamiento de un tumor. Son capaces, aunque en diversos grados, de inhibir el crecimiento de celulas tumorales. Preferiblemente, un polipeptido S microcina puede inducir apoptosis en llneas celulares humanas. Por ejemplo, el polipeptido, la molecula de acido nucleico, la celula o una composicion segun la invencion se pueden aplicar a un sujeto usando vlas de administracion, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, por via intravenosa. El polipeptido, la molecula de acido nucleico o de la celula se pueden acumular en un tumor. Si se administra la celula objeto, la celula puede acumularse en el tumor y producir el polipeptido segun la invencion. El polipeptido tambien puede expresarse a partir de la molecula de acido nucleico objeto o puede liberarse de la composicion. La microcina S se puede colocar bajo el control de un promotor activo de tumor. El polipeptido; la celula o la composicion se administran a sujetos en una forma biologicamente compatible adecuada para la administracion farmaceutica.
[0128] El polipeptido; la celula; la composicion o el kit deben inducir a niveles significativos la apoptosis en las celulas tumorales, a la vez que no den lugar a ningun efecto en los sistemas de celulas normales.
[0129] Los ejemplos no limitantes de enfermedades o trastornos que pueden tratarse y/o prevenirse mediante el uso del polipeptido; la celula; la composicion o el kit son tumores en general, en particular cancer colon-rectal, cancer de hlgado, gliomas, neuroblastomas, carcinoma oral escamocelular, tumores linfoides, cancer de la glandula prostatica, cancer de la vejiga, cancer de mama, cancer de la pleura y el peritoneo.
[0130] En algunas realizaciones descritas en este documento, el polipeptido; la celula o la composicion, se pueden administrar a un sujeto en forma parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradermica, subcutanea, oral, transdermica (topica), transmucosal, y rectal, preferiblemente en una forma oral.
[0131] El polipeptido; la celula o la composicion, se pueden administrar a un sujeto en una cantidad farmaceuticamente eficaz. La administracion de una cantidad farmaceuticamente eficaz del polipeptido; la celula o las composiciones de la presente invencion se define como una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad farmaceuticamente eficaz de un polipeptido; una celula o una composicion pueden variar segun factores, tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del polipeptido; la celula o las composiciones para provocar una respuesta deseada en el individuo. El regimen de dosificacion puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente tal como se indica por las exigencias de la situation terapeutica.
[0132] Con el fin de optimizar la eficacia terapeutica, un polipeptido S microcina se administra a diferentes reglmenes de dosificacion en diferentes puntos de tiempo.
[0133] Al sujeto se le puede administrar una sola dosis eficaz farmaceuticamente o dosis multiples
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farmaceuticamente eficaces, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o mas. Especlficamente, al sujeto se le puede administrar una sola dosis farmaceuticamente eficaz 2, 3, 4, 5, 6, 7 o mas veces al dla.
[0134] Especlficamente, al sujeto se le puede administrar una dosis de 5-15 gotas de una composicion acuosa. Mas preferiblemente, se administra una dosis de 10 gotas. En dicha realizacion, 1 ml contiene aproximadamente 14 gotas.
[0135] Una cantidad farmaceuticamente eficaz (es decir, una dosis farmaceuticamente eficaz) oscila de aproximadamente 0,001 a 30 mg/kg de peso, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 25 mg/kg de peso, mas preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, y aun mas preferiblemente de aproximadamente 1 a 10 mg/kg, 2 a 9 mg/kg, 3 a 8 mg/kg, 4 a 7 mg/kg, o 5 a 6 mg/kg de peso.
[0136] Las administraciones de dosis multiples pueden separarse por intervalos de horas, dlas, semanas o meses. En otras realizaciones, se administran al menos una vez, dos veces o tres veces al dla con las comidas dentro de agua, preferiblemente tres veces al dla con las comidas dentro de agua.
[0137] Se pueden opcionalmente administrar al sujeto durante un periodo limitado de tiempo y/o en un numero limitado de dosis. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la administracion al sujeto se puede terminar (es decir, no se suministran mas administraciones) durante, por ejemplo, un ano, seis meses, un mes, o dos semanas. Por ejemplo, la administracion suministrada se puede terminar despues de seis meses. En enfermedades cronicas, puede ser necesario aumentar el periodo hasta seis meses.
[0138] En algunas realizaciones, la dosis puede aumentarse al cabo de 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, tres semanas, cuatro semanas o mas. La dosis a administrar a un sujeto puede aumentarse a 15-25 gotas, mas preferiblemente a 20 gotas, de una composicion acuosa.
[0139] En los ninos, se pueden administrar en una forma oral de 5-15 gotas de una composicion acuosa. Mas preferiblemente, se administran 10 gotas a un nino. En otras realizaciones, se administran a un nino al menos una vez, dos veces o tres veces al dia con las comidas dentro de agua, preferiblemente una vez al dia con las comidas dentro de agua.
[0140] En todas las realizaciones de uso medico, el polipeptido; la celula; la composicion o el kit de la invention, se administran, al inicio del tratamiento a un adulto, 10 gotas tres veces al dia con las comidas dentro de agua y la dosis se incrementa despues de 1 semana a 20 gotas y para un nino 10 gotas de una vez por dia con las comidas dentro del agua.
Procedimiento para producir el polipeptido microcina S
[0141] Los polipeptidos de la presente invencion pueden ser un producto purificado de forma natural, o un producto de procedimientos sinteticos quimicos, o producido por tecnicas recombinantes a partir de un huesped procariota o eucariota (por ejemplo, por celulas de bacterias, levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamiferos en el cultivo).
[0142] Especlficamente, una celula de la invencion, tal como una celula huesped procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (es decir, expresar) un polipeptido microcina S. Por consiguiente, la invencion proporciona ademas procedimientos para producir un polipeptido microcina S usando las celulas de la invencion.
[0143] En el presente documento se contempla un procedimiento para producir el polipeptido objeto, microcina S. Dicho procedimiento comprende: el uso de una molecula de acido nucleico, un cebador o sonda de acido nucleico, un plasmido o una celula segun la invencion, o
la sentesis del polipeptido segun la invencion por medio de tecnicas de sintesis de peptidos en fase solida o en fase en solution.
[0144] En una realizacion preferida, el procedimiento comprende las etapas de i) introducir en una celula la molecula de acido nucleico segun la invencion y especificada adicionalmente en la reivindicacion 2 y/o el plasmido segun la invencion y especificada adicionalmente en la reivindicacion 3, ii) y cultivar la celula en condiciones que permiten la expresion del polipeptido a partir de dicha molecula de acido nucleico o dicho plasmido, o sintetizar el polipeptido segun la invencion y tambien especificada en la reivindicacion 0 por medio de tecnicas de sintesis de peptidos en fase solida o en fase en solucion.
[0145] En una realizacion preferida, el procedimiento comprende ademas la etapa de (iii) recuperar el polipeptido producido.
[0146] El polipeptido objeto aislado se produce po tanto mediante dicho procedimiento.
[0147] En algunas realizaciones, los polipeptidos microcina S son producidos por celulas de origen natural o,
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alternativamente, por tecnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido microcina S puede estar ya codificado por un plasmido o puede ser insertado en un plasmido, por ejemplo, un plasmido de expresion. Utilizando el plasmido, la molecula de acido nucleico puede introducirse en una celula mediante procedimientos recombinantes. Cuando se expresa en una celula, la celula se cultiva preferiblemente en condiciones que permiten la expresion de un polipeptido microcina S. El polipeptido microcina S se puede recuperar de una suspension celular si se desea. Tal como se utiliza en este documento, "recuperado" significa que el polipeptido microcina S se extrae de aquellos componentes de una celula o medio de cultivo en el que esta presente antes del proceso de recuperacion. El proceso de recuperacion puede incluir una o mas etapas de replegamiento o purificacion. Los tampones y procedimientos para inducir el plegado de un polipeptido microcina S desnaturalizado son conocidos en la tecnica.
[0148] Los polipeptidos dentro del alcance de la presente invencion se pueden sintetizar usando tecnicas en fase en solucion o en fase solida estandar conocidas en la tecnica (por ejemplo, R.B. Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide”. J. Am Chem Soc 85 (14): 2149-2154). Por lo tanto, el polipeptido objeto puede producirse mediante la condensacion de un peptido parcial o aminoacido. Cuando el peptido parcial o aminoacido tiene un grupo protector, el grupo protector se separa, despues de lo cual se produce el polipeptido objeto. La slntesis en fase solida, que es una resina, se inicia a partir de aminoacidos o peptidos cuyos grupos a- amino y grupos funcionales de la cadena lateral se han protegido adecuadamente. Se condensan sobre la resina segun la secuencia del polipeptido objeto mediante diversas tecnicas de condensacion que son conocidas per se. Al final de la serie de reacciones, el peptido o el peptido protegido se eliminan de la resina y los grupos protectores se eliminan para obtener el polipeptido objetivo. Por ejemplo, la slntesis en fase solida se inicia desde el extremo carboxi terminal del peptido utilizando un aminoacido protegido. Los grupos protectores BOC o FMOC se pueden utilizar para todos los grupos amino, incluso cuando otros grupos protectores son adecuados. Por ejemplo, BOC- Lys-OH se puede esterificar a soportes de resina de poliestireno clorometilado. El soporte de resina de poliestireno es preferiblemente un copollmero de estireno con aproximadamente 0,5 a 2% de divinilbenceno como agente de reticulacion que hace que el pollmero de poliestireno sea completamente insoluble en ciertos disolventes organicos. Ver Stewart et al, Solid-Phase Peptide Synthesis (1969), WH Freeman Co., San Francisco.; y Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) 85: 2149-2154. Estos y otros procedimientos de slntesis de peptidos tambien se ejemplifican en la patente de Estados Unidos N° 3.862.925; 3.842.067; 3.972.859; y 4.105.602.
[0149] La slntesis de polipeptidos puede usar tecnicas manuales o utilizando automaticamente, por ejemplo, un Sintetizador de Peptidos Applied Biosystems 403A (Foster City, California) o un sintetizador de peptidos automatico Biosearch SAM II (Biosearch, Inc., San Rafael, California), siguiendo las instrucciones proporcionadas en el manual de instrucciones suministrado por el fabricante.
Procedimiento para la conservacion de alimentos
[0150] La invencion tambien se refiere a un procedimiento para conservar alimentos, comprendiendo el procedimiento:
anadir a los alimentos al menos un tipo de un agente antimicrobiano natural, en el que el agente es
a) el polipeptido segun la invencion; y/o
b) la composition segun la invencion.
[0151] Dado que las bacterias Gram positivas y Gram negativas se encuentran casi siempre juntas en los alimentos, los polipeptidos, las moleculas de acido nucleico, la celula o las composiciones dentro del alcance de la presente invencion muestran eficacia hacia las bacterias, por ejemplo, Salmonella, Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas o Listeria. Mas especlficamente, las bacterias tales como Salmonella typhimurium, otras especies de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides gingivalis, Listeria monocytogenes y otras.
[0152] Se ha de entender que el agente se anade en una cantidad suficiente para inhibir las bacterias contaminantes.
[0153] Preferiblemente, el polipeptido, la molecula de acido nucleico, la celula o la composicion anadida a un alimento alcanzan un efecto protector. En una realization, el polipeptido, la celula o la composicion no afectan al consumo de alimentos. Por ejemplo, no tienen sabor y son no toxicos para los seres humanos y animales.
[0154] Por lo tanto, los polipeptidos, las moleculas de acido nucleico, la celula (citada solo para referencia) o las composiciones dentro del alcance de la presente invencion son particularmente adecuados para el control y prevention de la contamination de materias primas, alimentos procesados y bebidas por patogenos bacterianos y otros organismos de desecho microbiano. Se pueden usar en conexion con un producto alimenticio que es susceptible al crecimiento bacteriano o degradacion. Los usos potenciales relacionados con los alimentos incluyen el tratamiento de carnes, especialmente las aves de corral, huevos, queso, productos lacteos, frutas, productos derivados de vegetales, granos y productos derivados de cereales, alimentos enlatados, aderezos para ensaladas, bebidas fermentadas y mariscos, como el pescado, o muchos otros alimentos. Ejemplos de productos lacteos incluyen, pero no se limitan a, queso, leche, nata, y productos lacteos fermentados, tales como el yogur. Ejemplos
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de carnes incluyen, por ejemplo, jamon, carne de res, embutido, pollo y pavo, incluyendo partes enteras o productos carnicos procesados a partir de ellas. Otros productos alimenticios incluyen productos alimenticios procesados, incluyendo comidas preparadas, entrantes y carnes, ensaladas envasadas, mayonesa, aderezos (incluidos los aderezos para ensalada), salsas y condimentos, pastas, sopas, aceites comestibles, pescado y productos de pescado, productos de huevo, bebidas, alimentos envasados asepticamente, as! como mezclas de los anteriores. Otros usos relacionados con los alimentos incluyen el tratamiento de los envases de alimentos y el equipo de manipulacion. Otros usos incluyen como conservante de alimentos, tales como por ejemplo en queso procesado, nata, leche, productos lacteos y en la limpieza de las aves de corral, pescado, carnes o verduras.
[0155] Los polipeptidos, las moleculas de acido nucleico, la celula (citada solo para referencia) o las composiciones de la presente invencion se pueden utilizar mediante la mezcla con y/o la aplicacion en un producto alimenticio mezclable, pero pueden aplicarse a una superficie de productos alimenticios solidos mediante inmersion, enjuague, o pulverizacion o por aplicacion al interior de dichos productos, por ejemplo, mediante inyeccion. Se pueden aplicar como un adobo, empanado, mezclar con condimentos, glaseado, mezcla con colorantes, y similares, o como un ingrediente para mezclar con e incorporarse en el producto alimenticio. En otros aspectos, los polipeptidos, las moleculas de acido nucleico, la celula o las composiciones pueden ponerse indirectamente en contacto con la superficie del alimento mediante la aplicacion de la composicion a materiales de envasado de alimentos, tales como un revestimiento o una pellcula, y la aplicacion a acontinuacion del envasado a la superficie del alimento, de manera que la composicion entra en contacto con la superficie del alimento externo. La cantidad optima a utilizar dependera del producto alimenticio particular a tratar y el procedimiento utilizado para aplicar la composicion al alimento y/o la superficie del alimento, pero puede determinarse mediante experimentacion de rutina.
[0156] Las ventajas son que los polipeptidos, la celula (citada solo por referencia) o las composiciones de la presente invencion son faciles de digerir, son no toxicos, no pueden inducir alergias, y es diflcil que los microbios patogenos desarrollen resistencia en contra.
Procedimiento para la identificacion de bacterias que son sensibles al polipeptido microcina S:
[0157] La invencion se refiere ademas a un procedimiento in vitro para la identificacion de bacterias que son sensibles al polipeptido microcina S. En dicho procedimiento, se puede usar el polipeptido objeto; la molecula de acido nucleico objeto, el cebador o sonda de acido nucleico objeto, la celula citada solo por razones de referencia, el anticuerpo objeto o la composicion objeto.
[0158] En una realizacion, el procedimiento comprende la etapa de poner en contacto las bacterias patogenas que causan una infeccion microbiana con el polipeptido objeto; la molecula de acido nucleico objeto, el cebador o sonde de acido nucleico objeto, la celula objeto (citada solo por razones de referencia), o la composicion objeto, en el que la reduccion de la eficacia de adhesion de la celula a las celulas epiteliales intestinales (enterocitos) es indicativa de la sensibilidad de la celula a microcina S.
[0159] Debe entenderse que la microcina S se puede anadir a las bacterias patogenas en forma de un polipeptido ojeto. Sin embargo, tambien puede anadirse una molecula de acido nucleico objeto a partir del cual la microcina S puede expresarse. Ademas, es posible anadir una celula objeto que produce microcina S. Finalmente, la composicion objeto que comprende microcina S puede anadirse a las bacterias patogenas.
[0160] En una realizacion preferida, el procedimiento comprende las etapas de proporcionar un primer conjunto de celulas;
preincubar un primer conjunto de celulas con el polipeptido objeto; la molecula de acido nucleico objeto, la celula objeto, el anticuerpo objeto o la composicion objeto; proporcionar un segundo conjunto de celulas;
infeccion del primer conjunto de celulas y el segundo conjunto de celulas con bacterias patogenas que causan una infeccion microbiana;
medir la eficacia de la adhesion del primer conjunto de celulas y del segundo conjunto de celulas;
comparar la eficacia de adhesion del primer conjunto de celulas con la eficacia de adhesion del segundo conjunto de
celulas,
en el que, cuando la eficacia de adhesion del primer conjunto de celulas es menor que la del segundo conjunto de celulas, entonces las celulas del primer conjunto de celulas son sensibles a microcina S.
[0161] Una reduccion en la eficacia adhesion de un primer conjunto de celulas en comparacion con un sistema correspondiente de un segundo conjunto de celulas, en el que la microcina S no se ha agregado en forma de un polipeptido objeto; una molecula de acido nucleico objeto, una celula objeto o la composicion objeto es indicativa de la sensibilidad del primer conjunto de celulas a microcina S.
[0162] En realizaciones preferidas las celulas del primer conjunto de celulas y del segundo conjunto de celulas son celulas epiteliales intestinales humanas.
[0163] En una realizacion preferida, el procedimiento in vitro para la identificacion de bacterias es una prueba de
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difusion en agar modificado. En una primera etapa, las bacterias que causan una infeccion microbiana se aplican a una placa de cultivo. En una segunda etapa, se impregna un disco de papel de filtro con el polipeptido objeto; la molecula de acido nucleico objeto, el cebador o sonda de acido nucleico objeto, la celula objeto, el anticuerpo objeto o la composicion objeto. A continuacion, el papel de filtro se coloca en la superficie del agar sobre la placa de cultivo.
[0164] Esto tiene el efecto que la microcina S se difunde desde el papel de filtro al agar. Se establece un gradiente de concentracion, en el que la concentracion de microcina S es mas alta junto al disco, y disminuye con la distancia al disco.
[0165] Si la microcina S es eficaz contra las bacterias a una cierta concentracion, ninguna colonia crecera donde la concentracion en el agar es mayor que o igual a la concentracion efectiva. Esta es la zona de inhibicion. Por lo tanto, el tamano de la zona de inhibicion es una medida de la eficacia del compuesto: cuanto mayor es el area clara alrededor del disco de filtro, mas eficaz sera el compuesto.
Procedimiento para recubrir material de aposito:
[0166] Dentro del ambito de la invencion se encuentra un procedimiento para recubrir material de aposito, en el que el material de aposito se recubre con
a) el polipeptido segun la invencion; y/o
b) la composicion segun la invencion.
[0167] Dado que el nuevo polipeptido microcina S de la presente invencion muestra efectos antimicrobianos, se puede utilizar para recubrir material de aposito. Se debe entender que los apositos recubiertos para grupos de sujetos, por ejemplo, tal como para los pacientes con quemaduras de primer y segundo grado, es ventajoso. Dichos sujetos necesitan proteccion contra las infecciones bacterianas. En una realization preferida, el material de aposito son apositos antisepticos. En una realizacion mas preferida, los apositos antisepticos son parches o vendas. En realizaciones, el material de aposito recbierto proporciona proteccion contra Pseudomonas aeruginosa, que es un patogeno asociado con heridas por quemaduras.
Ejemplos
Ejemplo 1: Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento
[0168] Las cepas bacterianas utilizadas en este documento se enumeran en la Tabla 3.
TABLA 3: Cepas bacterianas utilizadas
Cepa
Genotipo pertinente Origen
E. coli Nissle 1917
tipo salvaje Mutaflor®
E. coli G1/2a
tipo salvaie Symbioflor 2®, SymbioPharm
E. coli G3/10a
tipo salvaje Symbioflor 2®, SymbioPharm
E. coli G4/9a
tipo salvaje Symbioflor 2®, SymbioPharm
E. coli G5a
tipo salvaje Symbioflor 2®, SymbioPharm
E. coli G6/7a
tipo salvaje Symbioflor 2®, SymbioPharm
E. coli G8a
tipo salvaje Symbioflor 2®, SymbioPharm
E. coli MDS42
cepa de deletion multiple K-12 Posfai, G., G. Plunkett III; T. Feher, D. Frisch, G.M. Keil; K. Umenhoffer, V. Kolisnychenko, B. Stahl, S.S. Sharma, M. de Arruda, V. Burland, S.W. Harcum, y F.R. Blattner 2006. Emergente Properties of Reduced- Genome Escherichia coli. Science 312: 1044-1046
EPEC
Ampr (pUC19), Kanar (pUC4K) o Cmr Donnenberg, M.S. y Kaper, J.B.
E2348/69
(pACYC184) 1992. Enteropathogenic Escherichia
O127:H6
coli. Infect. Immun. 60: 3953-3961.
EHEC 86-24
stx2, eaeA, EHEC-WyA, astA, Smr Griffin, P.M., S.M. Ostroff, R.V.
O157:H7
Tauxe, K.D. Greene, J.G. Wells, J.H. Lewis, y P.A. Blake. 1988. Illnesses associated with Escherichia coli 0157:H7 infections. A broad clinical spectrum. Ann. Intern. Med. 109: 705-712.
EHEC O104:H4
tipo salvaje, stx2, ESBL (ctxM) aislado humano, Dresden
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
EHEC
tipo salvaje, stx2, ESBL (ctxM) aislado humano, Frankfurt (Oder)
O104.H4
EHEC
stxl, stx2, EHEC-hlyA, Ampr aislado humano, Frankfurt (Oder)
O128.H2
(pUC4K)
a DSM17252
Ejemplo 2: Identificacion de un grupo de genes que codifican microcina en E. coli G3/10
[0169] Se secuenciaron los genomas de seis E. coir. E. coli G1/2, G3/10, G4/9, G5, G6/7 y G-8. La anotacion no revelo microcina conocida en el genoma de la E. coli G3/10. E. coli G3/10 contiene un gran plasmido conjugativo pSYM1 (Figura 1) con un tamano de 50,6 kb. El plasmido es un 99% identico al plasmido pMAS2027 de un aislados de E. coli uropatogeno. Ademas, contiene un fragmento de insercion de 10 kb, pero el analisis BLAST revelo solo los genes no caracterizados y sin nombre. Para identificar el origen de la accion bactericida se intento curar la cepa de E. coli G3/10 a partir de su megaplasmido pSYM1. A pesar de la realizacion de muchos de los procedimientos de curado comunes, por ejemplo mitomicina C o tratamiento con calor, la cepa no se pudo curar. Por lo tanto, el plasmido pSYM1 se transfirio a E. coli G4/9 por conjugacion. Para permitir un cribado de conjugantes, en primer lugar, se integro un casete de resistencia a la ampicilina en pSYM1 dando lugar a pSYM1-ST76An. El E. coli G4/9 pSYM1-ST76An resultante fue capaz de inhibir la adhesion a EPEC significativamente (Figura 3). Se concluyo que el plasmido pSYM1 lleva genes que son responsables para el efecto mostrado. Un fragmento de 4,7 pb del plasmido pSYM1 se clono en pBR322 dando como resultado el plasmido pAZ6, que a continuacion se transformo en E. coli G4/9. El pAZ6 permite E. coli G4/9 inhibir la eficacia de adhesion de EPEC significativamente (Figura 3), indicando que el fragmento de 4,7 kb de pSYM1 es responsable del efecto de inhibicion de la adhesion a EPEC de E. coli/ G3/10 (Figura 2). El analisis BLAST de los marcos de lectura abiertos (ORF) anotados automaticamente revelo pequenas homologlas con protelnas o familias de protelnas caracterizadas, lo que indica una relacion con operones que codifican microcina s. Sin embargo, la propia microcina no se detecto. Tres genes, llamados mcsl, mcsa y mcsb, se clonaron en pBR322 dando lugar a pAZ8. Se clonaron pequenos ORFs en direccion 5' de este operon (Figura 2), que son posibles genes que codifican microcina, en pACYC184 y se subclonaron en E. coli G4/9 pAZ8. Con esta etapa, se facilito la codificacion separada del plasmido de la probable microcina y protelnas auxiliares de la microcina. Solo los plasmidos pAZ8 y pAZ9 que contenlan E. coli G4/9 inhibieron significativamente la adhesion a EPEC, mientras que G4/9 pAZ8 afecta a la adhesion a EPEC de forma similar a G4/9 de tipo salvaje (Figura 3). El gen pequeno, denominado mcsS, codifica una microcina, que se denomino microcina S.
Ejemplo 3: Caracterizacion funcional de la microcina S y elucidacion de su autoinmunidad
[0170] La adhesion bacteriana es una primera etapa crucial de muchas enfermedades infecciosas. Por lo tanto, un sistema de prueba que cuantifica la inhibicion de la adhesion a celulas epiteliales intestinales humanas es adecuado para demostrar un efecto beneficioso para el huesped. En un primer experimento, se preincubaron monocapas confluentes de celulas CACO-2 o LOVO con cepas de prueba bacterianas EcN, E. coli G3/10, E. coli G4/9 o E. coli G4/9 pAZ6 a una MOI de 100.1 de E. coli con respecto a las celulas huesped. Despues de dos horas de incubacion, las celulas se lavaron y se infectaron con EPEC E2348/69 usando una MOI de 100.1 de EPEC con respecto a las celulas huesped. E. coli G3/10 y E. coli G4/9 pAZ6 fueron capaces de inhibir la adhesion de EPEC de forma similar a EcN. La inhibicion de adhesion a EcN mostro ser dependiente de la actividad de las microinas en las cepas. La eficacia de la adhesion en % se expresa como la adhesion de EPEC en relacion con la adhesion sin ninguna preincubacion (control negativo), que se fija al 100%. Los datos son la media ± SD de al menos tres experimentos separados en pocillos duplicados. La figura 4 muestra la eficacia de adhesion de la EPEC E2348/69 de tipo salvaje y mutantes complementados con plasmido que llevan mcsl a las celulas epiteliales intestinales humanas despues de la preincubacion con diferentes cepas que expresan microcina (E. coli G3/10, G4/9 pAZ6 y ECN) y que no expresan microcina (E. coli G4/9). Como resultado, mcsl podrla identificarse, sin duda, como el gen de autoinmunidad de la microcina S.
Ejemplo 4: Impacto sobre E. coli enterohemorragica
[0171] La E. coli enterohemorragica se adhiere a celulas epiteliales intestinales. En un segundo experimento, las monocapas confluentes de celulas LOVO se preincubaron con cepas de prueba de bacterias a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 100.1 de E. coli con respecto a las celulas huesped. Se probo la influencia de EcN y E. coli G3/10. Despues de dos horas de incubacion, las celulas se lavaron y se infectaron con EHEC utilizando una MOI de 100.1 de EHEC con respecto a las celulas huesped. Se probaron tres aislados de EHEC como cepas indicadoras utilizando el ensayo de adhesion in vitro. Se utilizo EHEC 86-24 serotipo O157.H7 asociada a HUS y dos aislados diferentes de la cepa del brote EHEC O104.H4, as! como un aislado del paciente EHEC O128.H2. Dado que los aislados de EHEC O104.H4 son productores de ESBL, el tratamiento medico es limitado. La eficacia en la adhesion en % se expresa como la adhesion de EHEC en relacion con la adhesion sin ninguna preincubacion (control negativo), que se fija al 100%. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes en pocillos duplicados. La adhesion de EHEC solamente fue inhibido por E. coli G3/10, lo que indica un mecanismo de accion diferente de MccM/H47 de EcN y MccS de E. coli G3/10. La figura 5 muestra la eficacia de adhesion de las cepas de EHEC 86-24 serotipo O157.H7 (A), EHEC O104.H4 aislada en Dresden (B) y EHEC O104.H4 (C) y O128.H2 (D) aisladas en Frankfurt (Oder) en celulas epiteliales intestinales humanas despues de la preincubacion con EcN o E.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
coli G3/10.
Ejemplo 5: Cribado del gen de microcina S mccS en diversos E. coli y otras enterobacterias
[0172] La secuencia de la microcina S es desconocida en las bases de datos de nucleotidos y aminoacidos. El cribado del conjunto de genes MccS se realizo en 38 cepas de E. coli, 2 de Shigella y 2 de Salmonella usando PCR multiplex y el gen recA como control de inhibition. Las cepas probadas son las cepas comunes de laboratorio, aislados de muestras cllnicas humanas y aislados de muestras veterinarias de diferente origen. El gen McsS no se pudo detectar en ninguno de los 42 aislados de muestras humana y veterinaria probados, ni en las cepas de laboratorio. Los resultados se representan en la Figura 6.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Technische Universitat Dresden and Symbio Gruppe GmbH & Co KG Gunzer, Flori an
<120> MICROCINA S. FORMADA BACTERIALMENTE, UN NUEVO PEPTIDO ANTIMICROBIANO, EFICAZ CONTRA MICROORGANISMOS PATOGENICOS, POR EJEMPLO, EHEC
<130> P31501-WO
<140> 2011-08-12
<141> EP 11 177 451.9
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 4679
<212> ADN

<213> Escherichia coli <400> 1

ttaatttttg ttcagcccat catcaatggt gcgcttgtgc ctcagctcca taaagcagcc 60

gtctgccaga tacagaaccc ggtctgcaga ggctatggtt tccgggcgat gggctatcag 120

caggacagga agccccagct gacgtagtgt ctggcttatc tgaatttcac tttcaacatc 180

aagatggctg gtcgcttcat ccagtaataa aaatcccggt ttcttgtaca aagccctggc 240

cagcagaatg cgttgttttt gccctccgga aagccctcca ccggtttcac caatcagcgt 300

ctgatacccc atcggcatag acatgatatc gctgtcgata agtgccagtc tggcgcactg 360

gatcattcgt tcatgattgc ggtctccact gaaaaaaatg atgttatctg caatggagcc 420

cctgaaaaga tggtcatcct gcagtacggt accgattcgc tgacgtacct gaaaataatc 480

cgggtgggta tgcggtatgc caaatgccct gattgttccc tcatccggga tgtggatccc 540

caggataagc ttcaccagtg tcgatttccc gcatccggat tgaccggtaa tggccatcac 600

ctcgccagga tggagtgtca gcgacacccc gcggagtatc ggtttattcc ctcccttgtg 660

gctgaaggtt atatgctcaa gggataaagg aacacgggca ccgtcggcca catccccccg 720

gaatacggac gggaagacag aagtatcatt gtcttcctga gcgggttgtt gctgatagtc 780

ttctgtcggg gtcagcacaa tgtcagccag gcgttcgttg tagatatcaa gcatacgcca 840

ggaaaaatac ttatcggtca ggctgctgat actggatgaa aaacgcatct ggtaggacaa 900

ataagcaacc agcatgccga cggtgaaggt accgttcagt acttccccgg cacctttcca 960

caaaataatc gctgatacca cgctgccggt cagggtgtgt gcaatgtcat agcacatcag 1020
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
22-C
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
ctgacggctc
ctcacggtgc
aaaatgcccg
cggataccac
catttccgga
aataccttcc
ggcattgata
atggaaaacc
ctggcgtgcc
aacggtcagg
aagtggacta
cgcggccagc
atcccgggcg
tcctgcatcc
gctcccgcga
gagagaaagg
accggctgca
ttcgcgcagg
tgccagacca
ccatttaagg
tcccacaaat
ggttcctgtt
tgcccttcat
gttgtacggc
gcggcgaacc
gcatagagtt
gccctgacag
gtcagcgtaa
tgcctgtcca
tcagcagcct
tgcagtgacg
gttccagcca
gcaagcgaca
agtatggcct
tgtcgcagct
gctgtcacgc
gactccctgg
aacgccctca
ctgtacagca
agtacctgcg
cttcccttac
cgggctgtcc
agcgacagca
agacttcgat
ctcagcgtca
agcccgggtg
gtaaaatcac
tgcagggaga
actttataaa
gatttcaggt
cactctatca
gtgggtaaat
cattccgcag
gtatccatta
ggcgggtatc
ttccataagc
tctctttcca
ttatctctcg
gaagtgcaac
ctatctgcag
actgtccctg
agttctcctg
gctcagcttt
ccattgcagt
tagaaacgtc
gttttttata
ggcgcagctc
gctgctgctg
gcgtattcct
cgttaattct
cacctgcgtc
gcacaccgta
gcatcataca
tggtcagcgc
tgcgcgcatc
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gcatctgggt
cggcggcaac
ggatttccag
tcctgcctgt
tggccggcgt
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gcacgacgaa
cttccggctc
gcctctgcag
ctgtctgcag
actctgtctg
cagttttcct
caggctgaca
cagaatgaag
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tctgatcagc
tccggccagt
acggctttcc
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tgcactttta
actgttgtca
gcgaacaatg
caggctcaga
ccaggcatct
gataatggct
gagcgcagtt
ctcctggatg
aaaccagccc
aaaattgacg
cattgacagc
cagcacttca
cgccagggca
cagttggcgc
caactccagc
ccctttgtcc
atggttcatg
cagccggacg
ggtcatcccc
accatgccag
ccggatgagg
ttcaggctcc
tccccctcaa
gtattctcag
gatacggaga
tactgaacgc
ggctgaataa
tcgggaacca
acggcagcaa
tcgtcctgct
ccctgaacga
agaagcccct
tgctggtatt
acggacacgg
atctgtggtt
cgcaattcca
ttgaggttca
ataccgttga
tctgccgact
gccagtacgg
atcacgagca
gtatccacgg
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gacagagtta
agcagcaggg
tcaattacca
aaaatgatga
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gcgacaccgg
gggtcgtgga
ttccagtgga
gcccgggagg
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caggccatca
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gttcgacgat
gtaaatccga
caaacttctg
aaccggcatt
gagtcatgac
cggttccgga
gttgcctgat
tgagatggtt
gacgctgatc
cgatatctga
ccagcgtggc
tcagggaggc
gagtctgctg
gccaggcggc
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gtcgaaggga
ctatcagcgt
acacgtccag
cctcaaaacg
gcaccagatg
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tgcgcgacat
tttttctttc
tgaaatgttt
taaccagcct
gaatgcacgg
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ggggcgcagg
gacgcggtag
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ctgactggtg
cggttcagat
taccggtgac
cccctgcaac
aagatcttct
ctcaacgttt
tacgtaatgc
ctgatgcccg
aattcgctgt
ggaagacagc
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
22-C
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3660
3720
3780
3840
3900
3960
4020
4080
4140
4200
4260
4320
4380
4440
4500
4560
4620
4679
60
120
180
240
atggcatact gagtcttcag ggacatgctc ttgtaatgct cgccgctgat atggtaaaca gaaacagtct gtcgggtgac gtatccggca gaaggcatca ctatacctgt aagatgagcc aatgagacgc tcagaaatat aagtaatgta gcgggtaaga caatatctcc gtactctgta aatatactca tggttataaa atattttgaa ctgaatgtat taacatagga taaaaaaggg gcatagatac aacaaaaagg actgattgat gagagaaaaa caaagatgtt atcacacagg gcagaaatcc aaaggcacag gctctgtata tcatcactaa aactgttatc cagtttatct tgtagcagta aacagctaac tgtatcagaa taactgtagc tgagtctgtt cttattttta ataagtaaac aagagttgaa attagaatct ccagtccaac ataacgcagt gtaaaggttg ccactgcaag aaaaataata gcgctgtatt ccattacaaa acatcacttt atgaaggtta tagcagtgga aaacaaggtg atcaatgtaa aaaaccatga caaatcaata atggaggaac ttaatataaa agacaataat ttaataaaca cgactacagg taccaccgac gttacttcct cctccgttac catttcctcc accggagaga cctctggtca ttcctacagg accaccttta gcattagcac atttaactgt gctcgggtca agtgagttac gggctccggt gttacgacta gcgttgccac cactgactaa tgcaatttca
<210> 2 <211> 363
<212> ADN
<213> Escherichia coli <400> 2
atgtcaaata tcagagaatt gagttttgat aacagtaatt atgaaggagg cggaagtcgt ggacgaaatg caccgacaca catttacagt gtctttagtg gaatggttgg tggtgccatt
atggctgcca gtgtacctgt gccctgcccg ggctcaccgg cagctacgtg ctgaccttct tattgcggtg tgattttcac cagtcctgat ttgcgggtat aactaccata ataaacgaat gcaacggcgc atactgacat gccaaatgac tcactgttat gttctaatgc ttcctccctg tatttaataa tataacaaag gtattcatgc atctgctttt aattctgacc cctaataaca ccagaacatt ataatactga aagtgcatca gaatgataat gttttccttg aaaattgaac cgatctcctc atagtagggt acgaccagtg gtgatggttc gtaatgatat aaatagtctc taattataag gaatgacagg gctgaaaatt ttctacactc aggaaattcc tttaggtaaa ctgtaatgaa cacaatgaaa aatgcaatat gcgataatgt tacaatagtt gatataataa tactatatct aaactggctc gaacgttcat ttatttttgc taaaactata tctgtaaatt ttactatttt tgaaaattcc tcaggcaacg cacttaatag cgcaaaaccc agtaataaac ctgcagtatc ctccgttgat acttacttat gaacaattac tggaaccagc tctgtttccg cactggccga taactgcccc accaatagtt atggcaccac caaccattcc actaaagaca ctgtaaatgt gtgtcggtgc atttcgtccc cgacttccgc ctccttcata attactgttt tcaaaactca attctctgat atttgacat
gaaattgcat tagtcagtgg tggcaacgca agtcgtaaca ccggagcccg taactcactg gacccgagca cagttaaatg tgctaatgct aaaggtggtc ctgtaggaat gaccagagga
5
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65
22-C
300
360
363
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240
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360
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600
651
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180
240
300
360
420
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540
600
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720
780
actattggtg gggcagttat cggccagtgt ctctccggtg gaggaaatgg ggaaacagag ctggttccag taattgttca ggaagtaacg tcggtggtac taa

<210> 3

<211> 651
<212> ADN

<213> Escherichia coli <400> 3
atggatgaac gttcgagcca gtttagatat agtaaataca gcgctattat gtggttatta tatcaactat tgtaacatta tcgccaacct ttacactgcg ctggatattg catttttcat tgtgttcatt acagagattc taatttcaac ttattttacc taaaggaatt tcctgagtgt agaataaaaa taagaacaga gttaaatttt cagccctgtc attccttata attattctga tacagttagc tacagagact atttatatca ttacgaacca tcacagataa actggataac atgacactgg tcgtacccta ctatgaggag atcgtataca gagcctgtgc ctgcgttcaa ttttcaagga aaacattatc attccctgtg tgataacatc tctctgatgc actttcagta ttataatgtt ctggatcaat cagtcctttt atgctgttat taggggtcag aattaaaagc agatcccttt tttatcctat tcaggcatga atacctttgt tatattatta aatattcaaa atattttata

<210> 4

<211> 1254
<212> ADN

<213> Escherichia coli <400> 4
atgagtatat tcagggagga agcattagaa cataacagtg atacagagta gtcttacccg cgtcatttgg catgtcagta tgcgccgttg ctacattact agcgtctcat tattcgttta ttatggtagt tatacccgca aggctcatct gtgatgcctt catcaggact ggtgaaaatc acaccgcaat atgccggata cagactgttt cagaaggtca gcacgtagct gccggtgagc ctgtttacca gagcattaca acgggcaggg cacaggtaca ctggcagcca tgagcatgtc cagtatgcca tgctgtcttc ccagcagact ctggaattgc gtgacaacag caggccatac tacagcgaat tgcctccctg aaaccacaga ttaaaagtgc ctgtcgcttg ccgggcatca ggccacgctg gccgtgtccg tcatggagcg ctggctggaa cgcattacgt atcagatatc gaataccagc agaagcaaat acgtcactgc aaaacgttga ggatcagcgt caggggcttc tgcaactaca gaggctgctg aagaagatct taaccatctc atcgttcagg gggaaagccg ctggacaggc agttgcaggg gatcaggcaa cagcaggacg aactggccgg
taacggaggc
ctgtagtcga
ttttcttgca
ttatgttgga
tcttgtttac
ctcagctaca
tgtttactgc
agttttagtg
ctttggattt
tttgtttttc
tgttgtatct
gttaatacat
a
cggagatatt
tatatttctg
tacaggtata
cgtcacccga
tatcagcggc
cctgaagact
tcagcagcag
agagctgcgc
ctataaaaaa
tgacgtttct
cactgcaatg
taaagctgag
acaggagaac
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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22-C
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1080
1140
1200
1260
1320
tttacgctga
cgtcaccggt atccggaacc gttgctgccg tgctgatcag acagggacag
tctgtcaggg
catctgaacc ggtcatgact ctggttcccg acaatgctcg tctgcagata
gaactctatg
ccaccagtca gaatgccggt tttattcagc cggggcagcg tgttgcactt
cggttcgccg
cattccccta tcagaagttt ggcgttcagt acgggactat ccgagagata
agccgtacaa
cgctgacccc ttcggattta ctctccgtat cccctgtgac ctggaaagag
aatgaagggc
actaccgcgt catcgtcgaa cctgagaata ccttcattct ggcttatgga
aaacaggaac
ccctgcgccc cggcatgacc cttgaggggg atgtcagcct ggatacccgc
catttgtggg
agtggctgac cgagccactc tggagcctga aaggaaaact gtaa
<210> 5 <211> 2178 <212> ADN <213> Escherichia coli
<400> 5 atggataccc
ttaaatggac cgggagaaaa cagctccccc tcatccggca gacagagtct
gcggaatgtg
gtctggcatg tctggtcatg atggcctgct ggcatggtct gcagacagat
ttacccaccc
tgcgcgaacg tttcagtatc agcacacagg ggatgaccct gcagaggctg
atagagtgtg
cagccggtat ccggttgtcc tcccgggccg tccggctgga gccggaagac
ctgaaatccc
tttctctccc gtgcattctc cactggaaca tgaaccattt cgtcgtgctt
tataaagttc
gcgggagcag gctggttatc cacgacccgg acaaagggaa gataacgctc
tccctgcagg
atgcaggaaa acatttcacc ggtgtcgcgc tggagttgac gccggccagt
gattttaccg
cccgggatga aagaaaaaaa attcgcctgc gccaactgac aggcaggaca
cccgggctgc
tggccgcgat gtcgcgcatc atcatttttg ccctggcgct ggaaatcctg
acgctgagta
gtccacttct caaccagctg gtaattgatg aagtgctggt tgccgccgat
cgaagtctcc
tgaccgttat aatcattgcc ctgctgctgc tgtcaatgac ccagatgctg
ctgtcgctgg
cacgccagtg ggccagtata actctgtccg tcaattttaa catgcagtgg
acagcccggg
ttttccatca tctggtgcgt ctcccgctgg gctggtttga tgcgcgcagt
aagggaagta
tcaatgcccg ttttgaggcc gtggatacca tccaggaggc gctgaccacg
caggtactgg
aaggtattct ggacgtgttg ctcgtgataa ctgcgctctg tatgatgctg
ctgtacagtc
cggaaatgac gctgatagcc gtactggcag ccattatcta cggtgtgctg
agggcgttgt
ggtatccgtc ccttcgacag tcggcagaag atgcctggga cgcaggtgcc
agggagtccg
ggcattttct tgaaaccctc aacggtattc tgagcctgag aattaacggc
gtgacagcgc
accgtgaggc cgcctggctg aacctcaaca ttgttcgcag gaatacgcag
ctgcgacaga
gccgtcagct gatgtgctat gacattgcac acaccctgac cggcagcgtg
gtatcagcga
ttattttgtg gaaaggtgcc ggggaagtac tgaacggtac cttcaccgtc
ggcatgctgg
ttgcttattt gtcctaccag atgcgttttt catccagtat cagcagcctg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
22-C
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2178
accgataagt atttttcctg gcgtatgctt gatatctaca acgaacgcct ggctgacatt gtgctgaccc cgacagaaga ctatcagcaa caacccgctc aggaagacaa tgatacttct gtcttcccgt ccgtattccg gggggatgtg gccgacggtg cccgtgttcc tttatccctt gagcatataa ccttcagcca caagggaggg aataaaccga tactccgcgg ggtgtcgctg acactccatc ctggcgaggt gatggccatt accggtcaat ccggatgcgg gaaatcgaca ctggtgaagc ttatcctggg gatccacatc ccggatgagg gaacaatcag ggcatttggc ataccgcata cccacccgga ttattttcag gtacgtcagc gaatcggtac cgtactgcag gatgaccatc ttttcagggg ctccattgca gataacatca tttttttcag tggagaccgc aatcatgaac gaatgatcca gtgcgccaga ctggcactta tcgacagcga tatcatgtct atgccgatgg ggtatcagac gctgattggt gaaaccggtg gagggctttc cggagggcaa aaacaacgca ttctgctggc cagggctttg tacaagaaac cgggattttt attactggat gaagcgacca gccatcttga tgttgaaagt gaaattcaga taagccagac actacgtcag ctggggcttc ctgtcctgct gatagcccat cgcccggaaa ccatagcctc tgcagaccgg gttctgtatc tggcagacgg ctgctttatg gagctgaggc acaagcgcac cattgatgat gggctgaaca aaaattaa
<210> 6 <211> 120 <212> PRT
<213> Escherichia coli <400> 6
Met
Ser Asn Ile Arg Glu Leu Ser Phe Asp Glu Ile Ala Leu Val Ser
1
5 10 15
Gly
Gly
Asn Ala Asn Ser Asn Tyr Glu Gly Gly Gly Ser Arg Ser Arg
20 25 30
Asn
Thr Gly Ala Arg Asn Ser Leu Gly Arg Asn Ala Pro Thr Hi s Ile
35 40 45
Tyr
Ser Asp Pro Ser Thr Val Lys Cys Ala Asn Ala Val Phe Ser Gly
50 55 60
Met
Val Gly Gly Ala Ile Lys Gly Gly Pro Val Gly Met Thr Arg Gly
65
70 75 80
Thr
Ile Gly Gly Ala Val Ile Gly Gln Cys Leu Ser Gly Gly Gly Asn
85 90 95
Gly
Asn Gly Gly Gly Asn Arg Ala Gly Ser Ser Asn Cys Ser Gly Ser
100 105 110
Asn
Val Gly Gly Thr Cys Ser Arg
115 120
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

<210> 7
<211> 102 <212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 7
Asn
Ala Asn Ser Asn S_ 1- Glu Gly Gly Gly Ser Arg Ser Arg Asn Thr
1
5 10 15
Gly
Ala Arg Asn Ser Leu Gly Arg Asn Ala Pro Thr Hi s Ile Tyr Ser
20 25 30
Asp
Pro Ser Thr Val Lys Cys Ala Asn Ala Val Phe Ser Gly Met Val
35 40 45
Gly
Gly
Ala Ile Lys Gly Gly Pro Val Gly Met Thr Arg Gly Thr Ile
50 55 60
Gly
Gly
Ala Val Ile Gly Gln Cys Leu Ser Gly Gly Gly Asn Gly Asn
65
70 75 80
Gly
Gly
Gly
Asn Arg Ala Gly Ser Ser Asn Cys Ser Gly Ser Asn Val
85 90 95
Gly
Gly
Thr Cys Ser Arg
100
<210>
8
<211>
19
<212>
ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de secuenciacion pSYMl <400> 8
cagctggata tcctgcgcg

<210> 9

<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de secuenciacion pSYMl <400> 9
ggttgcccgg catccaacg

<210> 10 <211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de clonacion pAZ6/pAZ8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

<400> 10
tcaattgtgt cgactcaatt actcttgtga g

<210> 11 <211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>

<223> Cebador de clonacion pAZ6 <400> 11
catgtaatag tgctagcatg ttaaaattta taag

<210> 12 <211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>

<223> Cebador de clonacion pAZ8, pAZ12 <400> 12
caaaaataat agctagcaag tgatgttttg taatg

<210> 13
<211> 28 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>

<223> Cebador de clonacion pAZ9 <400> 13
ctcgaattca tccattacaa aacatcac

<210> 14

<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>

<223> Cebador de clonacion pAZ9 <400> 14
ctggctgcag taattgttca ggaagtaacg

<210> 15

<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>

<223> Cebador de clonacion pAZ10 <400> 15
taggaattca gaggaactat tggtggg

<210> 16 <211> 37
<212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<213>
Secuenci a arti fi ci al
<220> <223>
Cebador de clonacion pAZlO
<400>
16
ctccgctgca gacttactta tcgactacag gtaccac
<210> <211> <212> <213>
17 37 ADN Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador de clonacion pAZ11
<400> 17 gttagaattc ataagaggga tttttatgtc aaatatc
<210> <211> <212> <213>
18 35 ADN Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador de clonacion pAZ11
<400> 18 gttgatactg cagcttatcg actacaggta ccacc
<210> <211> <212> <213>
19 31 ADN Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador de clonacion pAZ12
<400> 19 cccaagctta gttaaatgtg ctaatgctgt c
<210> <211> <212> <213>
20 18 ADN Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador de clonacion pAZ12
<400> 20 ggcatcggtc gacgcaac
<210> <211> <212> <213>
21 32 ADN Secuencia artificial
<220> <223>
Cebador de clonacion pAZ14
<400>
21
cattgctagc catcacagat aaactggata ac
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

<210> 22 <211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>

<223> Cebador de clonacion pAZl3, pAZl4 <400> 22
ccctgagtcg actcatggtt ataaaatatt ttg

<210> 23
<211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>

<22 3> Control de inhibicion <400> 23
atggctatcg acgaaaacaa ac

<210> 24

<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>

<22 3> Control de inhibicion <400> 24
ttaaaaatct tcgttagttt ctgc

<210> 25

<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>

<22 3> Cebador de cribado de mcsS <400> 25
atgtcaaata tcagagaatt gag
<210> 26 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<22 3> Cebador de cribado de mcsS <400> 26
ttatcgacta caggtaccac c

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    o mas identica a la secuencia de
    secuencia de nucleotidos que es al menos un 70% o mas identica a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 o 2, o un complemento de la misma; o
    c) esta codificado por una molecula de acido nucleico que se hibrida con una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 o 2, o un complemento de la misma, en condiciones rigurosas.
  2. 2. Molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido microcina S con actividad antimicrobiana, en la que dicha molecula de acido nucleico
    a) comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 70% o mas identica a una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 o 2, o un complemento de la misma;
    b) comprende una molecula de acido nucleico que se hibrida con una secuencia de nucleotidos complementaria a una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 o 2, o un complemento de la misma, en condiciones rigurosas; o
    c) comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 70% o mas identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID No: 6 o de la SEQ ID No: 7.
  3. 3. Plasmido que comprende la molecula de acido nucleico, segun la reivindicacion 2, o que codifica un polipeptido, segun la reivindicacion 1.
  4. 4. Procedimiento para obtener una celula que comprende la molecula de acido nucleico, segun la reivindicacion 2, y/o el polipeptido, segun la reivindicacion 1, y/o el plasmido, segun la reivindicacion 3, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    i) introducir en una celula la molecula de acido nucleico, segun la reivindicacion 2 y/o el plasmido, segun la reivindicacion 3,
    ii) y opcionalmente cultivar la celula en condiciones que permiten la expresion del polipeptido a partir de dicha molecula de acido nucleico o dicho plasmido.
  5. 5. Anticuerpo que se une selectivamente a un polipeptido, segun la reivindicacion 1.
  6. 6. Composition que comprende
    a) el polipeptido segun la reivindicacion 1.
  7. 7. Composicion, segun la reivindicacion 6, en la que la composicion es una composicion farmaceutica que comprende ademas un portador farmaceuticamente aceptable o en la que la composicion es un desinfectante para superficies.
  8. 8. Polipeptido, segun la reivindicacion 1, o la composicion, segun la reivindicacion 6, para utilizar en terapia o prevention.
  9. 9. Polipeptido, segun la reivindicacion 1, o la composicion, segun la reivindicacion 6, para utilizar en el tratamiento o prevencion de infecciones microbianas.
  10. 10. Polipeptido para utilizar, segun la reivindicacion 9, comprendiendo la infection microbiana infecciones con E. coli enteropatogena y/o enterohemorragica (EPEC, EHEC) o infecciones bacterianas asociadas con el slndrome uremico hemolltico (HUS).
  11. 11. Polipeptido, segun la reivindicacion 1, o la composicion, segun la reivindicacion 6, para utilizar en el tratamiento o prevencion de trastornos gastrointestinales o trastornos gastrointestinales funcionales o para utilizar en el tratamiento de un tumor.
  12. 12. Procedimiento para producir el polipeptido, segun la reivindicacion 1, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    i) introducir en una celula la molecula de acido nucleico, segun la reivindicacion 2 y/o el plasmido, segun la reivindicacion 3,
    ii) y cultivar la celula en condiciones que permiten la expresion del polipeptido a partir de dicha molecula de acido nucleico o dicho plasmido, o sintetizar el polipeptido, segun la reivindicacion 1, por medio de tecnicas de slntesis de peptidos en fase solida o en fase en solution.
  13. 13. Procedimiento in vitro para la identification de bacterias que son sensibles a microcina S, comprendiendo el
    1. Polipeptido aislado con actividad antimicrobiana, en el que el polipeptido
    a) comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 70% aminoacidos de SEQ ID No: 6 o de SEQ ID No: 7;
    b) esta codificado por una molecula de acido nucleico que comprende una
    procedimiento poner en contacto el polipeptido, segun la reivindicacion 1, o el polipeptido codificado por la molecula de acido nucleico, segun la reivindicacion 2, o la composicion, segun la reivindicacion 6, con una celula, en el que la reduccion de la eficacia de adhesion de la celula a celulas epiteliales intestinales es indicativa de la sensibilidad de la celula a microcina S.
    5
  14. 14. Procedimiento para conservar alimentos, comprendiendo el procedimiento:
    anadir a los alimentos al menos un tipo de un agente antimicrobiano natural, en el que el agente es
    a) el polipeptido, segun la reivindicacion 1; y/o
    b) la composicion, segun la reivindicacion 6.
    10
  15. 15. Procedimiento para recubrir material de aposito, en el que el material de aposito esta recubierto con:
    a) el polipeptido, segun la reivindicacion 1; y/o
    b) la composicion, segun la reivindicacion 6.
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