CN109843910A - 对抗葡萄球菌感染的疫苗构建体及其用途 - Google Patents

对抗葡萄球菌感染的疫苗构建体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种式(I)的融合构建体：X‑A‑接头‑B‑Z(I)，其中：(1)A与B是相同或不同的，且独立地为：(a)一种多肽，其包含：基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌COL(SACOL)基因组的基因命名法，如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中任一个中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中任一个中所述的SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I‑J中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中任一个中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611多肽(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中任一个中所述的SACOL1867多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包括(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体具有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；(2)该接头是至少一个氨基酸的氨基酸序列或不存在；(3)X不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；及(4)Z不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列。本发明还提供了包含该融合物的组合物及试剂盒以及这些融合物、组合物及试剂盒的用途。

Description

对抗葡萄球菌感染的疫苗构建体及其用途
相关专利申请的交叉引用
不适用
关于联邦奖助研究与开发的声明
不适用
技术领域
本发明是关于针对葡萄球菌感染的疫苗构建体及其用途。更具体言的，本发明是关于针对葡萄球菌感染，诸如牛乳房内感染 (intramammary infection；IMI)的组合抗原的疫苗构建体及其用途。
序列表的引用
依照37C.F.R.1.821(c)，在此一起提交2017年10月5日创建且大小为 278千字节的命名为SEQUENCE LISTING USP62411120_ST25的符合 ASCII的文本文件形式的序列表。前述文件的内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
牛乳腺炎(Bovine mastitis)是乳制品制造者最常见且花费最大的疾病，且金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)被认为是最常导致该疾病发生的可传播细菌(Sears等人,2003)。葡萄球菌IMI可导致乳腺炎，很难治疗且常常会复发(Sandholm等人,1990)。
已广泛地研究用于预防及控制金黄色葡萄球菌IMI的疫苗开发，不过迄今为止，尚无调配物展示具有预防功效。此很可能归因于疫苗靶不足(Middleton,2008；Middleton2009)、能够引起乳腺炎的菌株具有较高多样性(Buzzola,2007；Kerro-Dego,2006；Middleton,2008)或无法引起适当免疫反应(Bharathan,2011；Ferens,2000；Fowler,2014；Proctor,2012)。已越来越多地了解到，仅仅基于疫苗诱导的抗体的免疫可能很重要，但不足以诱导对抗金黄色葡萄球菌的保护作用(Middleton 2008；Middleton 2009)。看起来，基于Th1及Th17型反应的细胞介导的免疫(cell mediated immunity；CMI)可能是完成保护必需的(Fowler, 2014；Lin,2009；Proctor,2012；Spellberg,2012)。
在长期感染的母牛中，细菌在活体外对抗生素的敏感性对于治疗功效预测较差(Owens等人,1997)。尽管在乳腺炎治疗后的感染归因于新获得的菌株，但其通常是初始感染性生物体存留的结果(Sandholm等人, 1990；Myllys等人,1997)。因此，现有疗法通常无法消除感染且特别需要发现预防或治疗葡萄球菌IMI的新颖方法。
已注意到可商购的金黄色葡萄球菌疫苗缺乏疫苗功效及保护能力 (Middleton,2008)。因此，特别需要使用已知在IMI期间表达的高效金黄色葡萄球菌抗原作为疫苗组分以防止IMI及乳腺炎。
本发明试图满足这些及其他需求。
本发明说明提及多种文献，其内容以全文引用的方式并入本文中。
发明内容
在第一方面中，本发明提供显示出经增加免疫原性的融合多肽及其作为针对葡萄球菌IMI的疫苗的用途。
葡萄球菌(诸如金黄色葡萄球菌)IMI的特征是金黄色葡萄球菌存留在宿主细胞内的能力。详言的，金黄色葡萄球菌小菌落变体(small colony variant；SCV)一般不会产生侵袭性感染且可被内化于宿主细胞中。因此，在另一方面中，本发明提供基于SCV的表型方面的用于疫苗目的的减毒活金黄色葡萄球菌株，以提供对抗此类菌株的免疫反应且增加疫苗保护功效。
在一方面中，本发明提供以下各项：
第1项：一种式(I)的融合构建体：X-A-接头-B-Z(I)，其中：(1)A与 B相同或不同且独立地为：(a)基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌COL(SACOL)基因组中的基因命名法，包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D 中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的 SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ IDNO:186)、如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611多肽(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867 多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ IDNO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽 (SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；(2)该接头是含至少一个氨基酸的氨基酸序列或不存在；(3)X不存在或是含至少一个氨基酸的氨基酸序列；及(4)Z不存在或含至少一个氨基酸的氨基酸序列。
第2项：如第1项的构建体，其中(1)(a)是包含如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的 SACOL0442多肽、如图23I-K中所描绘的序列(SEQ IDNO:11及109至 120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽或如图25D中所描绘的序列 (SEQID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽的多肽。
第3项：如第2项的构建体，其中A与B中的至少一个是(a)包含如图 24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的 SACOL0029多肽的多肽；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13 个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的 SACOL1867多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包含(a')或(b')的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中的任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(d')中任一个的至少12个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
第4项：如第2项的构建体，其中A与B中的至少一个是(a)包含如图 22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的 SACOL0442多肽的多肽；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图 23I-K中所描绘的序列(SEQ IDNO:11及109至120)中的任一个中所述的 SACOL0720多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包括含(a')或(b')的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中的任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(d')中任一个的至少12个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
第5项：如第2项构建体，其中A与B相同或不同且是(a)包含如图 23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的 SACOL0720多肽的多肽；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(d)中任一个的至少13 个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
第6项：如第1至2及4项中任一项的构建体，其中该免疫原性片段 (d)包含以下氨基酸序列中的一或多个：KDTINGKSNKSRNW(SEQ ID NO:34)；及KDGGKYTLESHKELQ(SEQ IDNO:1)。
第7项：如第6项的构建体，其中该免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一或多个：
STQNSSSVQDKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLY
DRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRV YTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVIN TKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTADIKNVTFKLVKSVNDIEQ V(SEQID NO:30)；
DKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRN WVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLK ELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVINTK(SEQ ID NO:32)；及 DKQL
QKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPL NENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFA HISYGLYMGEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTADIKNVTFKLVKSVNDIEQV(SEQ ID NO:33)。
第8项：如第1至2及4项至第5项中任一项的构建体，其中该免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一或多个：
QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)；TIKDQQKANQLAS(SEQ ID NO:22)；KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)；及
DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。
第9项：如第8项的构建体，其中该免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一或多个：RASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASEL NNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPN TDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRK DINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDL KHKKDALALEKAKNKVDKSIETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO: 12)；ASLSSEI
KYTAPHDVTIKDQQKANQLASELNNQKIPHFYNYKEVIHTKLYK DNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPNTDLKRGQADLFVAEGSIKDLV KHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLN DKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALALEKAKNKVDKSI ETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO:13)；
ASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASEL
NNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPN TDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRK DINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQE(SEQ ID NO:14)；
KDINKIYFMT
DVDLGGPTFVLNDKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO:15)；KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKD(SEQ ID NO:16)；KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDY(SEQ ID NO:
17)；KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:19)；
SQFGFDLK HKKDALA(SEQ ID NO:18)；及
KHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:20)。
第10项：如第1项至第3项中任一项的构建体，其中该免疫原性片段 (c')包含以下氨基酸序列中的一或多个：PYNGVVSFKDATGF(SEQ ID NO:165)；AHPNGDKGNGGIYK(SEQ IDNO:167)；SISDYP GDEDISVM(SEQ ID NO:169)；RGPKGFNFNENVQA(SEQ ID NO: 172)；QFESTGTIKRIKDN(SEQ ID NO:175)；及 GNSGSPVLNSNNEV(SEQ ID NO:178)。
第11项：如第10项的构建体，其中该免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列：
TQVKDTNIFPYNGVVSFKDATGFVIGKNTIITNKHVSKDY
KVGDRITAHPNGDKGNGGIYKIKSISDYPGDEDISVMNIEEQAVER GPKGFNFNENVQAFNFAKDAKVDDKIKVIGYPLPAQNSFKQFEST GTIKRIKDNILNFDAYIEPGNSGSPVLNSNNEVIGVVYGGIGKIGSEYNGAVYFTPQIKDFIQKHIEQ(SEQ ID NO:39)。
第12项：如第1项至第11项中任一项的构建体，其中该接头包含至少四个选自由以下组成的群的相同或不同氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及赖氨酸。
第13项：如第1项至第12项中任一项的构建体，其中该接头包含 (GGGGS)n(SEQ IDNO:67)、(ERKYK)n(SEQ ID NO:61)；或 (EAAAK)n(SEQ ID NO:63)，其中n＝1至5。
第14项：如第1项至第13项中任一项的构建体，其中该X包括含6至10个氨基酸的聚组氨酸。
第15项：如第1项至第13项中任一项的构建体，其中该X不存在。
第16项：如第1项至第15项中任一项的构建体，其中该Z不存在。
第17项：一种分离的核酸分子，其编码如第1项至第16项中任一项的构建体。
第18项：一种载体，其包含如第17项的分离的核酸。
第19项：一种宿主细胞，其包含如第18项的载体。
第20项：如第19项的细胞，其是金黄色葡萄球菌的减毒存活形式。
第21项：如第20项的细胞，其中该金黄色葡萄球菌的减毒存活形式具有稳定小菌落变体(SCV)表型。
第22项：如第21项的细胞，其中该具有稳定SCV表型的金黄色葡萄球菌的减毒存活形式是ΔhemBΔ720S金黄色葡萄球菌。
第23项：一种组合物，其包含：(A)至少一种如第1项至第16项的构建体；至少一种如第17项的核酸分子；至少一种如第18项的载体；或至少一种如第19项至第22项中任一项的细胞；及(B)(i)如第1项至第11项中任一项所定义的多肽；(ii)减毒活金黄色葡萄球菌；(iii)可药用的赋形剂；(iv)佐剂；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合。
第24项：如第23项的组合物，其中该金黄色葡萄球菌的减毒存活形式表达：(a)基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌 COL(SACOL)基因组中的基因命名法，包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的 SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ IDNO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442 多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-K中所描绘的序列 (SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、 SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611(SEQID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽、 SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包括含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
第25项：如第23项或第24项的组合物，其中该金黄色葡萄球菌的减毒存活形式具有稳定小菌落变体(SCV)表型。
第26项：如第23项至第25项中任一项的组合物其中该佐剂包含矾、油(例如乳化油、矿物油)、皂素(例如Quil-ATM)、环状-二鸟苷-5'-单磷酸(c-di-GMP)、聚磷腈、吲哚力西丁(indolicidin)、病原体相关分子模式(PAMPS)或其中至少两种的组合。
第27项：一种用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染 (IMI)的方法，该方法包含向该哺乳动物投与有效量的如第1项至第16项中任一项的构建体；如第17项的核酸分子；如第18项的载体；如第19项至第22项中任一项的细胞；或如第23项至第26项中任一项的组合物。
第28项：如第27项的方法，其中该葡萄球菌IMI是由一或多种金黄色葡萄球菌株引起。
第29项：如第27项或第28项的方法，其中该哺乳动物是母牛。
第30项：一种有效量的(i)如第1项至第16项中任一项的构建体；(ii) 如第17项的核酸分子；(iii)如第18项的载体；如第19项至第22项中任一项的细胞；(iv)如第23项至第26项中任一项的组合物；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合的用途，其是用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)。
第31项：如第30项的用途，其中该葡萄球菌IMI是由一或多种金黄色葡萄球菌株引起。
第32项：如第30项或第31项的用途，其中该哺乳动物是母牛。
第33项：如第1项至第16项中任一项的构建体；如第17项的核酸分子；如第18项的载体；如第19项至第22项中任一项的细胞；如第23项至第26项中任一项的组合物或其中至少两种的组合，其是用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)。
第34项：如第33项的构建体、核酸分子、载体、细胞、组合物或组合，其中该葡萄球菌IMI是由一或多种金黄色葡萄球菌株引起。
第35项：如第33项或第34项的构建体、核酸分子、载体、细胞或组合物，其中该哺乳动物是母牛。
第36项：一种用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染 (IMI)的试剂盒，其包含：(A)(i)至少一种如第1项至第16项中任一项的构建体；(ii)至少一种如第17项核酸分子；(iii)至少一种如第18项的载体；(iv)至少一种如第19项至第22项中任一项的细胞；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合，及(B)(i)如第1项至第11项中任一项所定义的多肽； (ii)减毒活金黄色葡萄球菌；(iii)可药用的赋形剂；(iv)佐剂；(v)有关使用该试剂盒预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的说明书；或(vi)(i)至(v)中至少两种的组合。
附图说明
在附图中：
图1A-D.显示在第二次免疫接种之后四周(在即将实验性感染之前)，经疫苗接种(9)及安慰剂(10)母牛对疫苗中各抗原,即SACOL0029、 SACOL0442、SACOL0720、SACOL1867、SACOL1912及 SACOL2385的血清总IgG(图1A)、IgG1(图1B)及IgG2(图1C)效价。在图1D中，呈现经疫苗接种的母牛的IgG2/IgG1比率。在图1A、B及C 中，空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料，黑色正方形(■)表示安慰剂母牛的资料。每一符号表示一头母牛的效价。水平线表示中值：虚线表示经疫苗接种的母牛的中值，而连续线表示安慰剂母牛的中值。在图 1A、B及C中，经疫苗接种的母牛的效价高于安慰剂母牛的效价 (P<0.0001)。在图1D中，符号表示每头母牛的IgG2/IgG1比率。水平线表示中值。不同字母显示统计差异。＊＊＊，P<0.001。
图2.显示在针对各抗原第二次免疫接种之后四周，来自经疫苗接种的母牛(9)及安慰剂母牛(10)的血液CD4+细胞的抗原依赖性增殖情况。每个符号表示在与阳性对照(ConA)或各抗原，即SACOL0029、 SACOL0442、SACOL0720、SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385一起培育一周之后，每头母牛中增殖的CD4+细胞的百分含量。空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料，黑色正方形(■)表示安慰剂母牛的资料。水平线表示中值：虚线表示经疫苗接种的母牛的中值，而连续线表示安慰剂母牛的中值。统计分析：SAS的混合程序。符号＊显示针对抗原SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及 SACOL1912，疫苗接种组与安慰剂组的间的统计差异(＊，P<0.05)。此外，对于除抗原SACOL0720的外的所有抗原，经疫苗接种的母牛及安慰剂母牛的CD8+细胞增殖类似，对于抗原SACOL0720，在经疫苗接种的母牛中观察到较高CD8+细胞增殖(数据未显示)。
图3.显示在奶牛中进行的实验性金黄色葡萄球菌乳房内感染。在第二次免疫接种之后四周及4天，在晚间挤奶时将63个菌落形成单位 (CFU)的金黄色葡萄球菌输注至经疫苗接种的母牛(9)及安慰剂母牛 (10)4个乳区中的3个中(第1天，图3中的箭头)。在早晨挤奶时取得无菌牛奶样品且由Valacta(Ste-Anne-de-Bellevue,QC)测定体细胞计数 (SCC)。空心圆(○)及虚线表示经疫苗接种的母牛的资料，而黑色正方形 (■)及连续线表示安慰剂母牛的资料。每个空心圆表示经疫苗接种母牛的所有经感染乳区(27个)的平均SCC，而每个正方形表示安慰剂母牛所有经感染乳区(30个乳区)的平均SCC。在激发时间段内，发现牛奶中的体细胞计数在经疫苗接种母牛中明显低于安慰剂母牛(＊＊＊；P<0.001)。
图4A-C.图4A显示CFU与每头母牛的SCC的间的相关性，且图4B 显示针对SACOL0442的血清IgG1效价与每头母牛的SCC的间的相关性。每个符号表示一头母牛的资料。在图4A中，其表示自感染开始至结束3个经感染乳区的平均SCC及CFU。在图4B中，其表示自感染开始至结束3个经感染乳区的平均SCC以及在第二次免疫接种之后四周及即将实验性感染之前针对SACOL0442的血清IgG1效价。空心圆表示经疫苗接种的母牛的资料，且黑色正方形表示安慰剂母牛的资料。SCC/ml 与CFU/ml的间存在较强相关性且SCC与针对SACOL0442的IgG1效价的间存在负相关性。在图4C中，显示在实验性感染之后十天(第二次免疫接种之后6周)，每头母牛的SCC或CFU相对于针对SACOL0029的牛奶IgG2效价之间的相关性。每个符号表示在实验性感染之后十天一头母牛的数据。在早晨挤奶时取得无菌牛奶样品且藉由10倍稀释并涂铺于胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)板上来测定金黄色葡萄球菌活菌计数，同时由 Valacta(Ste-Anne-de-Bellevue,QC)测定SCC。每头母牛的SCC及CFU数据是在实验性感染之后十天3经感染乳区的平均数据。用于测定牛奶 IgG2效价的牛奶样品系在实验性感染之后10天(第二次免疫接种之后6 周)，来自每头母牛的4个乳区的等体积牛奶的混合物。黑色正方形(■) 表示安慰剂母牛的资料，空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料。
图5.显示经疫苗接种的母牛对包含融合抗原SACOL0029及 SACOL1867(显示为SACOL0029-1867)以及抗原SACOL0442及 SACOL0720的疫苗中各抗原的血清总IgG效价。在ELISA中，靶抗原是SACOL0029-1867、SACOL0029、SACOL1867、SACOL0442及 SACOL0720。每个空心圆表示在第二次免疫接种之后四周11头母牛各自的效价，而每个黑色菱形表示免疫前效价。水平线表示中值：实线表示免疫前血清，点线表示在免疫接种之后四周取得的样品。经疫苗接种的母牛的效价高于免疫前血清的效价(＊＊，P<0.01；对于测试的其他抗原，＊＊＊，P<0.001)。
图6显示免疫接种相等摩尔量的融合蛋白(SACOL0029-1867；融合物)、独立蛋白质的组合(SACOL0029+SACOL1867；组合)、单独 SACOL0029蛋白质(0029)或单独SACOL1867蛋白质(1867)的小鼠中针对SACOL1867抗原的血清总IgG效价。空心圆(○)表示免疫前效价资料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。对于免疫前效价，相等地混合各免疫接种组中5只小鼠的间的免疫前血清以获得免疫前池效价，以每组一个空心圆表示。对于免疫效价，每个正方形符号表示一只小鼠的效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线(及空心圆) 表示免疫前血清池的中值。融合物、组合及1867组中经疫苗接种小鼠的效价高于免疫前小鼠的效价P<0.001)，且发现仅接受SACOL0029单价抗原的小鼠的效价与免疫前池针对SACOL1867的效价无明显不同。显示融合物组相对于组合及两个单价疫苗组的免疫效价的间的统计显著性 (＊＊＊：P<0.001)。
图7.针对SACOL0442的氨基酸序列片段
(GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD，SEQ ID NO:2)中所含B细胞表位序列KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)且自免疫接种由SACOL0442及SACOL0720编码的肽的融合物 KDGGKYTLESHKELQEAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTF VLND(SEQ ID NO:3)(第1组)或由SACOL0442编码的肽 KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)(第2组)的小鼠获得的血清总IgG(如在ELISA分析法中藉由O.D.450nm所量测)。每组由4只动物(n ＝4)构成，间隔2周向这些动物注射等摩尔量的序列 KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)(对应于第1组100μg KDGGKYTLESHKELQEAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTF VLND(SEQ ID NO:3)及第2组31.25μgKDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1))，且由最后一次注射之后一周收集的血液制备血清。ELISA 分析法是用稀释100000倍的血清样品进行且使用来自SACOL0442的片段(GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD， (SEQ ID NO:2))作为含有肽表位KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)的靶抗原。个体资料在图上以圆形表示且中值以线条表示。发现各组的间的差异是统计显著的(p<0.0286，Kuskal-Wallis检验， GraphPadPrismTM 7.00)。
图8A-B.金黄色葡萄球菌ATCC29213及Δ720菌株中hemB缺失。(图 8A)藉由同源重组且用ermA卡匣替代使野生型(WT)病毒株ATCC29213 及其同基因突变株Δ720中的hemB基因缺失，由此分别建立突变株ΔhemB及Δ720ΔhemB。粗线及数字表示B中所描绘的亲本(1)及hemB缺失(2)菌株的PCR扩增区。(图8B)WT菌株及其同基因ΔhemB突变株的 PCR产物(用Δ720及Δ720ΔhemB菌株获得类似结果)。
图9A-C.显示金黄色葡萄球菌ΔhemB、Δ720及ΔhemBΔ720突变对 MAC-T细胞感染性的影响。用四种菌株分别感染MAC-T细胞3小时，接着将其与溶葡球菌酶一起再培育30分钟(t＝3小时)、12小时或24小时，并溶解以量测存活细胞内细菌(CFU)。t＝3小时在细胞内发现的(图 9A)针对Δ720及(图9B)针对ΔhemBΔ720突变株的初始接种物的相对回收率。结果分别根据所获得的关于ATCC 29213(WT)或ΔhemB的结果标准化，且以平均值加SD表示(＊＊，P≤0.01；＊＊＊，P≤0.001；不成对t检验)。(图9C)在12小时(左)及24小时(右)针对WT及突变株的细胞内CFU 的平均值加SD。使用双因素变异数分析(two-way ANOVA)及Tukey多重比较检验(＊：P≤0.05；＊＊＊：P≤0.001)。所有值指示三个独立实验的平均值，各一式三份进行。
图10.显示在MAC-T细胞内金黄色葡萄球菌ATCC 29213(WT)及同基因突变株随时间持续存在。用四种菌株分别感染MAC-T细胞3小时，接着将其与溶葡球菌酶一起再培育30分钟、12小时或24小时，并溶解以量测细胞内细菌(CFU)。细胞内细菌CFU是以转换成以10为底的对数值之后的初始接种物的百分含量表示(Log10CFU/ml)。值指示三个独立的一式三份实验的平均值加标准偏差。
图11A-B.显示经金黄色葡萄球菌ATCC 29213(WT)及同基因突变株感染的MAC-T细胞的活力。用四种菌株分别感染MAC-T细胞3小时，接着将其与溶葡球菌酶一起培育12小时(A)或24小时(B)。接着，利用 Kubica等人,2008中所描述的方法进行MTT活力分析。结果报导为相对于未感染细胞的活力百分比且以一式三份进行的三个独立实验的平均值加SD表示。带有(Φ)符号的统计显著性是与WT相比较(双因素变异数分析及Tukey多重比较检验：＊或Φ：P≤0.05；＊＊：P≤0.01；＊＊＊： P≤0.001；ΦΦΦΦ：P≤0.0001)。
图12.显示用亲本(WT)及ΔhemBΔ720(ΔΔ)菌株处理的鼠类IMI。如先前所描述感染小鼠且在感染之后指定小时数(h)或天数(D)收集腺体。每个条柱表示一组腺体的细菌CFU计数的中值，且范围是以线条指示。除WT菌株(2个腺体：仅一只小鼠存活)外，在D7使用每组最少六个腺体。在特定时间点时小鼠的死亡率是由箭头指示。星号指示自腺体清除ΔhemBΔ720(低于每个腺体10CFU的检测限)。
图13.在感染之后的前24小时，双重突变株(Δ720ΔhemB)刺激乳腺中嗜中性球的流入量达到与WT类似的水平。如材料及方法中所描述，感染小鼠，且对照组(PBS)小鼠接受无菌PBS注射。如材料及方法中所描述，在指定时间收集腺体，均质化且针对MPO活性进行动力学分析。每个点表示一个腺体的MPO单位数，其显示为以腺体的公克数调整的原始值。平均值由粗线表示。
图14.在用金黄色葡萄球菌ATCC 29213(WT)及双重突变株Δ720ΔhemB(ΔΔ)进行小鼠IMI之后24小时，较大R4及L4乳腺的目测炎症。如材料及方法中所描述，感染小鼠，且对照组(PBS)小鼠接受无菌 PBS注射。图片显示在24小时之后收集的腺体。在各图中，显示R4(左) 及L4(右)腺体。
图15A.在清除双重突变株Δ720ΔhemB之后，嗜中性球浸润恢复正常水平。如材料及方法中所描述，感染小鼠，且对照组(PBS)小鼠接受无菌PBS注射。如材料及方法中所描述，在指定时间采集腺体，均质化且针对MPO活性进行动力学分析。条柱表示以腺体的公克数调整的一组6个腺体(PBS对照组4个)的平均MPO单位数，且误差条说明标准偏差。感染后第4天与第12天组的间的统计显著性由(Φ)符号显示。使用单因素变异数分析及Tukey多重比较检验(ΦΦ：P≤0.01；NS：各组的间无显著差异)。
图15B-C.用减毒活双重突变株(Δ720ΔhemB)免疫接种小鼠刺激针对常见spa类型的金黄色葡萄球菌牛乳腺炎分离株的较强体液反应。如先前所描述对小鼠免疫接种：在初始免疫接种之前(免疫前)及增强免免疫接种之后十天(免疫)，收集血清。图15B.IgG效价随减毒活菌株Δ720GΔhemB剂量增加而升高：每个点表示一只小鼠针对Δ720GΔhemB 全细胞提取物的总IgG效价。免疫效价的中值由粗线表示且虚线表示免疫前效价。将效价与相应免疫前效价相比较(双因素变异数分析及Tukey 多重比较检验：＊＊＊＊：P≤0.0001)。图15C.免疫接种减毒活突变株Δ720GΔhemB赋予针对常见spa类型的乳腺炎菌株共有的组分的IgG效价。每个点表示一只小鼠针对指定菌株的全细胞提取物的总IgG效价。免疫效价的中值由粗线表示且虚线表示免疫前效价。将所有免疫效价与其相应免疫前效价相比较(P≤0.0001)且在临床菌株的间进行比较(双因素变异数分析及Sidak多重比较检验：NS：无显著差异)。
图16.显示免疫接种蛋白质混合物(由5μg抗原SACOL0029、 SACOL0442、SACOL0720及SACOL0029-1867融合物构成)、单独105 CFU减毒活菌株Δ720ΔhemB或该蛋白质混合物与Δ720ΔhemB菌株的组合的小鼠针对SACOL0029-1867融合蛋白的总血清IgG效价。空心圆(○) 表示免疫前效价资料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线表示免疫前血清的中值。蛋白质混合物组及组合组中经疫苗接种小鼠的效价高于免疫前小鼠的效价(P<0.001)。显示组合组与两个其他经疫苗接种小鼠组的免疫效价的间的统计显著性(＊＊：P<0.01)。
图17.显示免疫接种蛋白质混合物(由5μg抗原SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及SACOL0029-1867融合物构成)、单独105 CFU减毒活菌株Δ720ΔhemB或该蛋白质混合物与Δ720ΔhemB菌株的组合的小鼠针对SACOL0029的总血清IgG效价。空心圆(○)表示免疫前效价资料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的总IgG效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线表示免疫前血清的中值。显示三个小鼠组的免疫效价与免疫前效价的间的统计显著性(＊＊：P<0.01)。
图18.显示免疫接种SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及 SACOL0029-1867蛋白质混合物、单独105CFU减毒活菌株Δ720ΔhemB 或该蛋白质混合物与Δ720ΔhemB的组合的小鼠针对葡萄球菌表面蛋白质ClfA的总血清IgG效价。空心圆(○)表示免疫前效价资料，黑色正方形 (■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线表示免疫前血清的中值。显示免疫前效价与免疫效价的间的统计显著性(＊：P<0.05)。
图19.以下显示免疫接种该蛋白质混合物或该蛋白质混合物与减毒Δ720ΔhemB活菌株的组合的小鼠针对SACOL0029-1867融合多肽的血清 IgG2a/IgG1效价比率。
图20.显示针对SACOL0029抗原的血清比率。空心正方形(□)表示免疫前效价资料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的效价比。水平线表示中值。显示蛋白质混合物组与组合组的间的统计显著性(＊：P<0.05；＊＊：P<0.01)。
图21A-J.I.SACOL0029聚核苷酸(全长序列SEQ ID NO:4)及多肽 (全长、片段及变体序列SEQ ID NO:5至9)。选定的表位加阴影及/或加粗显示；II.SACOL0720聚核苷酸(全长序列SEQ ID NO:10)及多肽(全长、片段及变体序列SEQ ID NO:11至27)。选定的表位加阴影显示； III.SACOL0442聚核苷酸(全长序列SEQ ID NO:28)及多肽(全长、片段及变体序列SEQ ID NO:29至36及1)。选定的表位加阴影显示；IV. SACOL1867聚核苷酸(全长序列SEQID NO:37)及多肽(全长、片段及变体序列SEQ ID NO:38至41)。选定的表位加阴影显示。预测的跨膜 (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)结构域加粗显示；V.SACOL1912聚核苷酸(全长序列SEQ ID NO:42)及多肽(全长及变体序列SEQ ID NO:43至44)。选定的表位加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:45至48)；VI.SACOL2385聚核苷酸(全长SEQ ID NO:49)及多肽(全长及变体序列SEQ ID NO:50至51)。选定的表位加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:52至53)；VII.融合物：(i)SACOL0029-1867融合聚核苷酸序列(SEQ IDNO:54及56)及多肽序列(SEQ ID NO:55、57至58)。在聚核苷酸及多肽序列中，加双下划线的序列(若存在)是聚组氨酸序列，斜体序列是SACOL0029片段的序列，加单下划线的序列是接头序列且加粗序列是SACOL1867片段的序列；(ii)SACOL0720-720融合多肽序列(SEQ IDNO:27)。在多肽序列中，加双下划线的序列(若存在)是聚组氨酸序列，斜体序列是SACOL0720片段的序列且加单下划线的序列是接头序列；(iii)SACOL0442-720融合多肽序列(SEQ ID NO:3)。在聚核苷酸及多肽序列中，加双下划线的序列(若存在)是聚组氨酸序列，斜体序列是SACOL0442片段的序列，加单下划线的序列是接头序列且加粗序列是SACOL0720片段的序列；及VIII.接头序列(SEQ ID NO:59 至70)。
图22A-D呈现I.全长SACOL0442及直是同源物的多个聚核苷酸序列 (SEQ ID NO:71至72、28、73至81)比对；II.全长SACOL0442、直是同源物的多个多肽序列(SEQ ID NO:29及82至92)比对及由此得到的共有序列。在这些序列中，「＊」表示该行中的残基在比对的所有序列中均一致，「:」表示观察到保守取代且「.」表示观察到半保守取代。亦呈现由这些比对得到的共有序列，其中X是任何氨基酸。在这些多肽序列中，选定的表位是加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:1、34、93至97)。
图23A-K呈现I.全长SACOL0720及直是同源物的多个聚核苷酸序列 (SEQ ID NO:98至104、10及105至108)比对；II.全长SACOL0720、直是同源物的多个多肽序列(SEQ IDNO:11及109至120)比对及由此得到的共有序列。。在这些序列中，「＊」表示该行中的残基在比对的所有序列中均一致，「:」表示观察到保守取代且「.」表示观察到半保守取代。亦呈现由这些比对得到的共有序列，其中X是任何氨基酸。在这些多肽序列中，选定的表位是加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:22、19及 21)。
图24呈现全长SACOL0029、直是同源物的多个多肽序列(SEQ ID NO:5及121至131)比对及由此得到的共有序列。在这些序列中，「＊」表示该行中的残基在比对的所有序列中均一致，「:」表示观察到保守取代且「.」表示观察到半保守取代。亦呈现由这些比对得到的共有序列，其中X是任何氨基酸。在这些多肽序列中，选定的表位是加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:132至139)。加粗的表位藉由BCPredTM鉴别。加阴影的表位藉由AAp预测鉴别。
图25A-D.呈现I-全长SACOL1867及直是同源物的多个聚核苷酸序列(SEQ ID NO:140至151)比对；II-全长SACOL1867、直是同源物的多个多肽序列(SEQ ID NO:152至164)比对及由此得到的共有序列。在这些序列中，「＊」表示该行中的残基在比对的所有序列中均一致，「:」表示观察到保守取代且「.」表示观察到半保守取代。亦呈现由这些比对得到的共有序列，其中X是任何氨基酸。在多肽序列中，选定的表位是加阴影显示(参见例如，SEQ IDNO:165至180)且信号肽结构域及/或跨膜结构域的末端用线标记(信号肽及/或跨膜结构域自分泌形式分离)。
图26.I-全长SACOL1715(hemB)的聚核苷酸序列(SEQ ID NO:181)；及II-全长SACOL1715(hemB)的氨基酸序列(SEQ ID NO:182)。
图27.I-全长ClfA(NWMN_0756,newman)的聚核苷酸序列(SEQ ID NO:183)；及II-全长ClfA的氨基酸序列(SEQ ID NO:184)。
具体实施方式
本发明显示，两种抗原的融合物在免疫反应中产生出人意料的协同作用。
此外，本发明亦经由hemB(完全缺失，由此减小反突变成侵袭性表型的可能(Tuchscherr,2011))使葡萄球菌的SCV表型稳定，使其能够用作疫苗递送系统。HemB编码HemB蛋白质/单体，其组合以产生胆色素原合成酶或胺基乙酰丙酸酯脱水酶[EC4.2.1.24]。此外，藉由使本发明的抗原，即基因SACOL0720失活实现进一步减毒，先前已显示该抗原在阳离子肽抗性(Falord,2012；Kawada-Matsuo,2011；Meehl,2007)及在活体内IMI期间(Allard,2013)对于金黄色葡萄球菌极为重要。因此，表达本发明的构建体的该减毒双重突变株可用于针对IMI的免疫接种及保护。
通用定义
呈现的标题及其他标识符，例如(a)、(b)、(i)、(ii)等，仅为了方便阅读本说明书及申请专利范围。在本说明书或申请专利范围中使用标题或其他标识符未必需要按字母或数字次序或者步骤或要素呈现的次序进行步骤或要素。
在本说明书中，广泛地利用多个术语。为了提供对本说明书及申请专利范围(包括给出的此类术语的范畴)的清楚且一致的理解，提供以下定义。
当在申请专利范围及/或说明书中与术语「包含」一词结合使用时，使用词语「一个(种)(a/an)」可意谓「一个(种)」，但其亦与「一或多个(种)」、「至少一个(种)」及「一个(种)或多于一个(种)」的含义相符。
在本申请案全文中，术语「约」用于指示值包括用于测定该值的装置或方法的误差的标准偏差。一般而言，术语「约」意图指示至多10％的可能变化。因此，一个值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、 8％、9％及10％的变化包括在术语「约」内。除非另外指明，否则在一个范围之前使用术语「约」适用于该范围的两端。
如本说明书及申请专利范围中所使用，词语「包含(comprising)」 (及包含的任何形式，诸如「包含(comprise)」及「包含 (comprises)」)、「具有(having)」(及具有的任何形式，诸如「具有 (have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括的任何形式，诸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及含有的任何形式，诸如「含有(contains)」及「含有(contain)」为包容性或开放性的且不排除其他未列出的要素或方法步骤。
如本文所使用，术语「由……组成(consists of)」或「由……组成 (consistingof)」意谓仅包括在特别要求的实施例或请求项中具体陈述的要素、步骤或成分。
多肽、核酸及递送系统
如本文所使用，术语「疫苗」是指能够在宿主体内诱导/引发免疫反应且允许治疗及/或预防感染及/或疾病的任何化合物/试剂(「疫苗组分」)或其组合。因此，此类试剂的非限制性实例包括蛋白质、多肽、蛋白质/多肽片段、免疫原、抗原、肽表位、表位，蛋白质、肽或表位以及分开添加或以相邻序列形式(诸如在核酸疫苗中)添加的核酸、基因或基因部分(编码所关注多肽或蛋白质或其片段)的混合物，及类似物。
在本发明的一方面中，提供一种式I的融合构建体：
X-A-接头-B-Z(式(I))，
其中A与B相同或不同且各自独立地为本发明的抗原多肽(亦即，其天然多肽、片段或变体)。
在一具体实施例中，A及/或B是(a)包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029 多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列 (SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442多肽、 SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-J中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、 SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列 (SEQ IDNO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽、如图 21G-V中所述的SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽 (SEQ ID NO:192)、如图21H上的VI中所述的SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)。在一具体实施例中，以上多肽(a)是如以上所定义多肽的分泌或细胞外片段。可以使用例如软件TMpredTM(ExPASy)
http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html、
http://www.psort.org/psortb/index.html
http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html及/或SignlP 4.1
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测跨膜结构域。TMpredTM及SignalIP 4.1预测SACOL0720的细胞外结构域为：AA 310至508； SACOL0442为AA 36至203。Enzim预测出跨膜结构域SACOL1867(1- 40)，因此细胞外结构域为：AA 41至239，而
http://www.psort.org/psortb/index.html预测SACOL1867是细胞外蛋白质。由于以上提及的跨膜及/或信号肽结构域是推定的，故本发明涵盖本文呈现的抗原(例如SACOL1867)具有或不具有信号肽及/或跨膜结构域的情形且涵盖相应细胞外片段。在一个实施例中，以上提及的多肽是通常在细菌(例如金黄色葡萄球菌)的表面分泌或表达的多肽。
本发明所涵盖的本文中所列金黄色葡萄球菌基因及其编码的抗原多肽的Genbank登录编号描绘于下表I中：
表I：本文所描述的IMI相关金黄色葡萄球菌基因及编码多肽的 GenBank登录编号
由比对某些上文所列的多肽得到的共有序列呈现于图21至25中。在这些共有序列的具体实施例中，共有序列(例如图21至25中的共有序列) 中的每个X定义为任何氨基酸，或当在比对中呈现的一或多种直是同源物中不存在该位置时不存在。在这些共有序列的具体实施例中，共有序列中的每个X定义为构成该比对中呈现的直是同源物中对应位置中的氨基酸中的任一个的保守或半保守取代的任何氨基酸，或当在该比对中呈现的一或多种直是同源物中不存在该位置时不存在。在图21至25中，保守取代是以符号「:」指示，且半保守取代是以符号「.」指示。在另一个实施例中，每个X是指与该比对中呈现的直是同源物中对应位置中的氨基酸残基中的任一个属于相同种类的任何氨基酸，或当在该比对中呈现的一或多种直是同源物中不存在该位置时不存在。在另一个实施例中，每个X是指在该比对中呈现的直是同源物中的对应位置中的任何氨基酸，或当在该比对中呈现的一或多种直是同源物中不存在该位置时不存在。在一具体实施例中，A及/或B是满足这些共有序列中的任一个或其片段的多肽。
保守氨基酸突变可以包括氨基酸的添加、缺失或取代；保守氨基酸取代在本文中定义为一个氨基酸残基经具有类似化学特性(例如大小、电荷或极性)的另一氨基酸残基取代。此类保守氨基酸取代可以为碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸经同一组的另一氨基酸取代(参见例如下表II)。术语「碱性氨基酸」意谓侧链pK值大于7的亲水性氨基酸，其在生理pH下通常带正电。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸 (Arg或R)及赖氨酸(Lys或K)。术语「中性氨基酸」(又称「极性氨基酸」)意谓侧链在生理pH下不带电，但在具有的至少一个键中两个原子共同共有的电子对更靠近这些原子的一的亲水性氨基酸。极性氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr 或Y)、天冬酰胺(Asn或N)及谷氨酰胺(Gln或Q)。术语「疏水性氨基酸」(又称「非极性氨基酸」)意图包括根据Eisenberg标准化共有疏水性标度(normalized consensus hydrophobicity scale)(1984)，展现大于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(He或 I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(VaI或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸 (Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)及甘氨酸(GIy或G)。「酸性氨基酸」是指具有pK值小于7的侧链的亲水性氨基酸，其在生理 pH下通常带负电。酸性氨基酸包括谷氨酸(GIu或E)及天冬氨酸(Asp或 D)。
半保守氨基酸是一个残基经具有类似空间构形但不共有化学特性的另一残基置换。半保守取代的实施例将包括半胱氨酸经丙氨酸或亮氨酸取代；丝氨酸经天冬酰胺取代；缬氨酸经苏氨酸取代；或脯氨酸经丙氨酸取代。
下表II指示氨基酸所属各氨基酸种类。
氨基酸或核苷酸序列的间的相似性及同一性可以藉由比较比对序列中的每个位置测定。用于比较相似
性及/或同一性的序列的最佳比对可以使用多种算法，例如使用此项技术中熟知的多序列比对程序/软件，诸如ClustalWTM、SAGATM、 UGENETM或T-coffeeTM进行。多序列比对的实施例描述于以下实施例中且描绘于图21A至25中。
基因操纵子
在另一个实施例中，A及/或B是(b)由来自与编码如上文所定义的(a) 的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽。举例而言， SACOL0718是来自与SACOL0720相同的操纵子的基因。
片段
在另一个实施例中，A及/或B是(c)包括含如上文所定义的(a)或(b) 的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽。
蛋白质/多肽的免疫原性片段定义为蛋白质/多肽中能够在宿主体内诱导/引发免疫反应的部分。在一个实施例中，免疫原性片段能够引发与该蛋白质/多肽种类相同但未必量相同的免疫反应。蛋白质/多肽的免疫原性片段较佳包含该蛋白质/多肽的一或多个表位。蛋白质/多肽的表位定义为该蛋白质/多肽中能够引发特异性抗体及/或带有能够特异性结合该表位的受体的免疫细胞(例如T细胞或B细胞)的至少约4或5个氨基酸长度的片段。存在两种不同类型的表位：线性表位及构形表位。线性表位包含一段连续氨基酸。构形表位通常是由在适当位置折迭且一起形成适当折迭的蛋白质中的表位的若干段连续氨基酸形成。如本文所使用，免疫原性片段是指这些表位类型中的一种或两种。在单独使用免疫原性片段(亦即，不与较大多肽构建体融合(例如与其他抗原片段融合))的一个实施例中，蛋白质/多肽的免疫原性片段包含至少16个氨基酸残基。在另一实施例中，免疫原性片段包含天然蛋白质/多肽的至少16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160个连续氨基酸。在一具体实施例中，该片段具有该天然蛋白质/多肽的至少18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46,47、48、49、50或50或更多个连续氨基酸。在至少一个免疫原性片段形成较大多肽构建体的一部分 (例如与其他抗原多肽、片段或其变体融合)的一个实施例中，该免疫原性片段包含该多肽的至少13个连续氨基酸残基。不受此限制，本发明所涵盖的片段包括含以下中的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段：如图21中所示的SACOL029(及SACOL029直是同源物(例如图24中所描绘)中的相应片段)；如图21中所示的SACOL0442(及SACOL0442直是同源物 (例如图22中所描绘)中的相应片段)；如图21中所示的SACOL0720(及 SACOL0720直是同源物(例如图23中所描绘)中的相应片段)；及如图21 中所示的SACOL1867(及SACOL1867直是同源物(例如图25中所描绘)中的相应片段)。在另一个实施例中，本发明所涵盖的片段包括含本发明的抗原蛋白质/多肽(如以上所定义的多肽(a))的至少一个表位的免疫原性片段。在另一个实施例中，本发明所涵盖的片段包括含至少一个如图 21至25中的任一个中所描绘的抗原蛋白质/多肽中的任一种中描绘(加阴影)的表位的免疫原性片段。不受此限制，一个序列中的表位可以用软件，诸如BCPredTM、AAPTM、FBCPredTM及ABCPredTM预测。
在一个实施例中，以上提及的免疫原性片段包含在至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株中保守(亦即，一致)的序列。在其他实施例中，以上提及的免疫原性片段包含在至少3、4、5、6、7、8、9或10种不同金黄色葡萄球菌菌株中保守(亦即，一致)的序列。在另一个实施例中，以上提及的金黄色葡萄球菌菌株是COL、RF122、NCTC 8325、JH1、 JH9、Newman、Mu3、Mu50、USA300-FPR3757、N315、MW2或 MSSA476。在一个实施例中，以上提及的金黄色葡萄球菌菌株与牛乳腺炎有关(例如RF122)。
变体
在另一个实施例中，以上提及的多肽或与该多肽大体上同一性的多肽是在至少两种不同金黄色葡萄球菌菌株中表达。如本文所使用，大体上一致是指多肽的氨基酸序列具有至少60％同一性，在实施例中具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％同一性。在其他实施例中，多肽的氨基酸序列与其所比较的其他多肽具有至少60％、65％、70％,71％、 72％、73％、74％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性。
在另一个实施例中，A及/或B是(d)包含与如以上所定义的(a)至(c) 中的任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽。在其他实施例中，该氨基酸与(a)(例如在其全长内)至少65％、70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％一致。在其他实施例中，该氨基酸与(a)至少60％、 65％、70％,71％、72％、73％、74％、75％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。举例而言，图21至 25的比对中呈现的抗原直是同源物与其所比较的抗原或片段不一致，但存在一定同一性。这些图中呈现的共有序列体现此类同一性百分比。
在另一个实施例中，A及/或B是(e)包括含(a)至(d)中任一个的至少 13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。蛋白质/多肽的免疫原性变体定义为蛋白质/多肽中能够在宿主体内诱导/引发免疫反应的部分。一般技术者应了解，具有非天然存在的修饰(例如免疫原性变体)且能够诱导对未修饰试剂具有特异性的免疫反应(例如能够诱导产生能够识别该未修饰的试剂的抗体)的试剂(蛋白质/多肽、其片段)亦在术语「疫苗组分」的范围内。举例而言，本发明的疫苗组分可以经修饰以增强其活性、稳定性及/或生物利用率，及/或减小其毒性。可以例如藉由用包含酸性侧链的另一氨基酸替代包含酸性侧链的氨基酸、用另一大体积氨基酸替代大体积氨基酸、用包含碱性侧链的另一氨基酸替代包含碱性侧链的氨基酸及类似方式进行保守氨基酸取代。熟习此项技术者完全能够产生蛋白质/多肽的变体。此是例如经由筛选肽文库或藉由肽改变程序进行。根据本发明的免疫原性变体具有与该蛋白质种类基本上相同但量未必相同的免疫原性特性。本发明的蛋白质/多肽的免疫原性变体可以例如包含融合蛋白及/或嵌合蛋白。举例而言，预测作为外毒素、肠毒素或超抗原的本文中所鉴别的蛋白质(例如SACOL0442)的生物功能可以潜在地干扰哺乳动物免疫系统及抗体产生，及/或在宿主中显示某种毒性。尽管在免疫接种期间，将SACOL0442多肽与例如SACOL0720组合使用时未观察到此类干扰，但其可用于改变用于疫苗接种的蛋白质或多肽，由此降低外毒素的生物活性。为此目的，可用化学试剂(例如甲醛) 使外毒素失活。亦可使用分子生物学技术使外毒素活性所涉及的推定区域缺失或突变，同时不丧失免疫原性(Chang等人,2008)。另一实施例是将基于氨基酸的组分与核酸(例如分开添加或以相邻序列形式添加的基因或基因部分)碳水化合物，诸如在微生物多醣胶囊或生物膜中所发现的碳水化合物偶联或混合。变体的其他实施例包括在N或C末端包含或在抗原序列内插入可用于纯化(例如亲和纯化)或用作间隔子或接头的寡肽的本文所描述的抗原或其片段。可用于亲和纯化的寡肽的实施例包括聚组氨酸标签(例如包括或不包括RGS标签的6至10个组氨酸残基(例如 HHHHHH、RGSHHHHHH或RGSHHHHHGS)。该his标签之后亦可为适合于促进使用内肽酶移除聚组氨酸标签的氨基酸序列。如式(I)中所述的「X」及/或「Z」区段亦可以包含此类可用于纯化的寡肽及/或适合于促进移除此类可用于纯化的寡肽的序列。
在具体实施例中，免疫原性片段包含多肽(a)的至少一个表位。不受此限制，在某些实施例中，免疫原性片段包含如图21至25中呈现的序列中所描绘(加阴影)的多肽(a)的至少一个表位。在其他具体实施例中，变体是如图21至25中所揭示。
接头
在融合蛋白结构域的间插入接头可以藉由增大结构域的间的距离，缓解构建体不同区段(例如抗原片段)的间的潜在排斥力，使蛋白质折迭改善及/或恢复来增加生物活性。可以使用不同的多肽接头序列且已知其具有独特的特性，诸如可挠性、刚性或可裂解接头。本发明涵盖使用任何此类接头，包括例如Chen等人,Adv Drug Deliv Rev.(2013), 65(10):1357-69中所列接头中的任一种。本文中的实施例提供有关所用特定接头的说明(亦即，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)、 ERKYK(SEQ ID NO:61)或/及EAAAKEAAAK(SEQ IDNO:62))，亦即富含维持两个连接的结构域的间的距离且改善其折迭的小亲水性氨基酸的可挠性接头结构。
在另一个具体实施例中，Fc包含CH2结构域、CH3结构域及铰链区。在另一个具体实施例中，Fc是选自由以下组成的群的免疫球蛋白的恒定结构域：IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3及IgG-4。在另一个具体实施例中，Fc是免疫球蛋白IgG-1的恒定结构域。
可以在融合物的相邻抗原的间包括接头(例如，在包含两个抗原的融合物中有1个接头、在包含三个抗原的融合物中有2个接头、在包含四个抗原的融合物中有三个接头等)。在使用较大蛋白质结构域的融合物中，接头可能较大且可包含片段可结晶区域(Fc)。
在一具体实施例中，接头是含至少一个氨基酸的氨基酸序列或不存在。在一具体实施例中，接头包含至少三个(至少4、5、6、7、8、9或 10个)选自由以下组成的群的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及赖氨酸。在一具体实施例中，接头是(EAAAK)n(SEQ ID NO:63)；(GGGGS)n(SEQ ID NO:67)；或(XPXPXP)n(SEQ ID NO:69)，其中x是任何氨基酸；其中n是1至5中的任一个，更具体言的为1、2、3、4或5；EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)；EAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:64)；GGGGS(SEQ ID NO:67)； GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:68)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)；XPXPXP(SEQ ID NO:69)，其中x是任何氨基酸；XPXPXPXPXPXP(SEQ ID NO:70)，其中x是任何氨基酸； ERKYK(SEQ ID NO:61)；ERKYKERKYK(SEQ ID NO:65)； ERKYKERKYKERKYK(SEQ ID NO:66)。在一更具体的实施例中，接头是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)、ERKYK(SEQ ID NO:61)或EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)。
构建体的N及C末端
X及Z各自独立地不存在或为含至少一个氨基酸的氨基酸序列。不受此限制，其可为由选殖策略产生的一或多个氨基酸、用于便利构建体纯化的氨基酸(例如聚组氨酸)、适合于促进使用内肽酶移除纯化标签的氨基酸。在融合构建体包含三个或三个以上抗原多肽的具体实施例中，X及/或Z中的任一个亦可包括另一抗原(抗原C、抗原D等)的序列及视情况至少一个其他接头的序列。X及/或Z包含一或多个其他抗原且视情况包含接头的此等具体实施例可以更特定地例如以式(II)或(III)说明，如在融合物包含至少3个抗原时，遵循X'-C-接头1-A-接头2-B-Z'(II)；或在融合物包含至少4个抗原时，遵循X'-C-接头1-A-接头2-B-接头3-D- Z'(III)。在式(II)及(III)中，X'、Z'、接头1、接头2及带有接头3的情形是相同或不同的且独立地如本文所定义的式(I)中的X、Z及接头所定义。
因此，在具体实施例中，融合构建体包含2、3、4或更多个抗原多肽(及具有其他接头的情形)。在一更具体的实施例中且不受此限制，融合构建体可以为SACOL0029_SACOL0442；SACOL0029_ SACOL0720；SACOL0029_SACOL1867；SACOL0029_ SACOL0720_SACOL1867；SACOL0029_SACOL1867_SACOL0442； SACOL0029_SACOL0720_SACOL0442；SACOL0442_SACOL0029_ SACOL0720；SACOL0442_SACOL0029_SACOL1867； SACOL0442_SACOL1867_SACOL0720；SACOL0720_SACOL0442_ SACOL1867；或SACOL0029_SACOL1867_SACOL0720_ SACOL0442，或抗原多肽呈任何其他次序的前述构建体中的任一种。
组合
本发明的构建体可以作为本发明的组合物(例如疫苗)的唯一免疫原性组分使用，或与一或多种其他融合构建体、免疫原性多肽、其片段或变体及/或减毒活细菌(例如金黄色葡萄球菌)(表达或不表达融合构建体及/或多肽、其片段或变体)组合使用。
该一或多种融合构建体可为包括如上文所定义的另一融合构建体的任何免疫原性融合构建体(参见例如实施例14)。
用于本发明的组合物中的一或多个免疫原性多肽、其片段或变体可为造成如本文所定义的本发明的组合物的免疫原性的任何多肽、片段或变体。不受此限制，此类多肽、片段或变体包括(a)包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的 SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442 多肽、SACOL0718多肽(SEQ IDNO:186)、如图23I-K中所描绘的序列 (SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列 (SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽、 SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽 (SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包括含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽，如上文所定义。不受此限制，任何此类多肽、片段或变体均涵盖实施例1至14及21至26中所例示的组合物(例如疫苗#1至#8)中所包的多肽、片段或变体。
减毒活细菌
用于本发明的组合物中的减毒活细菌(例如金黄色葡萄球菌)可以独立于本发明的融合构建体及/或多肽、其片段变体，或作为(亦即，可以表达)此类本发明的融合构建体及/或多肽、其片段或变体的容器。
不受此限制，如本文中所说明，在本发明的组合情形中有用的减毒活细菌包括具有至少一个引起毒力(例如Δ720)或促成宿主健康(例如代谢基因)的基因突变或缺失的葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)。不受此限制，此类基因可为Novick 2003、Novick 2008或Maresso及Schneewind 2008中所鉴别的基因中的任一个。
在另一实施例中，可以藉由具有稳定的SCV表型使减毒活细菌进一步减毒。如本文所使用，术语「SCV表型」是指具有引起生长减慢、毒力因子表达改变及内化至宿主细胞中的能力的功能异常的氧化代谢的细菌。如本文所使用，术语《稳定SCV表型》用于表示保持SCV表型，亦即无法产生侵袭性反突变体(亦即，反突变成正常生长表型)的SCV菌株。此类稳定SCV金黄色葡萄球菌可以藉由使下表III中所列基因中的任一个突变或缺失(例如ΔhemB)来产生。不受限制，本发明涵盖使用实施例 15至25中所例示的稳定SCV金黄色葡萄球菌。如本文所使用，突变包括一或多个核苷酸的取代、缺失及/或插入，以防止由本发明的基因编码的多肽的表达或防止功能性多肽的表达。在一个较佳实施例中，突变防止多肽的表达。在另一个具体实施例中，在相同金黄色葡萄球菌的减毒活菌株或灭活菌株中的两个突变是缺失或插入。预期在本发明基因的一的任何位置具有防止多肽表达的突变的金黄色葡萄球菌突变菌株可以用作根据本发明的减毒活疫苗。减毒活疫苗，亦即包含呈减毒存活形式的根据本发明的细菌的疫苗，相较于灭活疫苗的优势在于，其最佳地模拟天然感染方式。此外，其复制能力允许以较低细菌量进行疫苗接种；其数量将自动增加，直至其达到免疫系统的触发量。自该时刻起，免疫系统将被触发且最终将除去细菌。然而，使用减毒活细菌的微小不足的处可在于，固有地存留一定程度的毒力。此未必为实际不足的处，只要毒力程度是可接受的，亦即只要该疫苗至少减少细菌感染(例如IMI)症状即可。当然，减毒活疫苗残留的毒力越低，则在疫苗接种期间/之后，疫苗接种对体重增加的影响越小。
表III：与SCV表型有关的金黄色葡萄球菌基因的Genbank登录编号(Kahl,2014)
核酸
本发明的核酸较佳包含可操作地连接至基因表达所需的调控组件，诸如启动子、起始密码子、终止密码子、强化子及聚腺苷酸化信号的编码一或多种上述蛋白质/多肽(或其片段)的核苷酸序列。较佳选择的调控组件在欲投与其的物种中是可操作的。在具体实施例中，核酸是如图21 至25中所描绘。
在本发明的内容内有向哺乳动物活体内投与本发明的核酸(例如核酸疫苗、DNA或RNA疫苗)以使得在该哺乳动物中表达一或多种所关注的蛋白质/多肽(或其片段)。
递送系统
本发明疫苗的核酸可以为「裸」DNA或可以可操作地并入载体中。可以使用此项技术中熟知的方法，诸如直接注射DNA、受体介导的DNA吸收、病毒介导的转染或非病毒转染及基于脂质的转染在活体内将核酸递送至细胞中，所有这些方法皆可涉及使用载体。已使用直接注射在活体内将裸DNA引入至细胞中(参见例如，Acsadi等人(1991) Nature 332:815-818；Wolff等人(1990)Science 247:1465-1468)。可以使用用于在活体内将DNA注射至细胞中的递送装置(例如「基因枪」)。此类装置可以为可商购的(例如购自BioRad)。亦可藉由使裸DNA与偶合至细胞表面受体的配体的阳离子，诸如聚赖氨酸形成复合物，将该DNA 引入细胞中(参见例如，Wu,G.及Wu,C.H.(1988)J.Biol.Chem.263: 14621；Wilson等人(1992)J.Biol.Chem.267:963-967；及美国专利第 5,166,320号)。DNA-配体复合物与受体的结合可以促进受体介导的内吞作用引起的DNA吸收。DNA-配体复合物连接至破坏内体的腺病毒衣壳，由此释放细胞质中的物质，可以用于避免该复合物经细胞内溶酶体降解(参见例如，Curiel等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 8850；Cristiano等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2122-2126)。
有用递送载体包括可生物降解微胶囊、免疫刺激性复合物(ISCOM) 或脂质粒，及经遗传工程改造的减毒活载体，诸如细胞、病毒或细菌。
脂质粒载体是单层或多层囊泡，具有由亲脂性物质形成的膜部分及内部含水部分。含水部分在本发明中用于容纳欲递送至靶细胞中的聚核苷酸材料。脂质粒形成材料较佳一般具有阳离子基团，诸如四级铵基团；及一或多个亲脂性基团，诸如具有约6至约30个碳原子的饱和或不饱和烷基。一组适合材料描述于欧洲专利公开案第0187702号中且亦论述于Wolff等人的美国专利第6,228,844号中，其相关揭示内容以引用的方式并入。许多其他适合的脂质粒形成阳离子脂质化合物描述于文献中。参见例如，L.Stamatatos等人,Biochemistry 27:3917 3925 (1988)；及H.Eibl等人,Biophysical Chemistry 10:261271(1979)。或者，可以利用微球体，诸如聚丙交酯-共乙交酯可生物降解微球体。如此项技术中所知，核酸构建体是用脂质粒或微球体封装或以其他方式形成复合物以将核酸递送至组织。
较佳病毒载体包括噬菌体、疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒、缺陷性反转录病毒、腺相关病毒(AAV)及禽痘。转型带有外源DNA构建体的病毒载体的方法在此项技术中亦有充分描述。参见以上Sambrook及Russell。
如上所指出，可以藉由转染或转型将核酸(例如DNA或RNA)并入宿主，诸如活体外或离体宿主细胞(例如免疫细胞，诸如树突状细胞)，或如上所指出的减毒微生物宿主(例如减毒金黄色葡萄球菌、SCV等，参见例如实施例25至26)中，且可以将表达所关注多肽(例如多个抗原或其对应片段的融合物及/或单一抗原或其片段)的经转染或经转型的细胞或微生物投与个体。在投与后，细胞将在个体中表达所关注蛋白质或多肽 (或其变体或片段)，该蛋白质或多肽继而将诱导针对该蛋白质、多肽或其片段的免疫反应。
使用减毒活细菌免疫接种及/或递送本发明的特定构建体或抗原混合物代表一种改善免疫反应的值得关注的方法(Griffiths及Khader, 2014)。仿真天然感染的减毒活生物体以一种有效的方式刺激免疫系统，引发广泛且稳定的免疫反应，由此产生血清及黏膜抗体，以及协同作用以防止疾病的效应及记忆T细胞(Detmer及Glenting,2006；Kollaritsch等人,2000；Pasetti等人,2011)。如此项技术中所知，适合减毒活细菌载体的实施例包括金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门杆菌 (Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、志贺杆菌属(Shigella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、卡介苗 (Bacille Calmette-Guerin，BCG)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)或任何其他适合的细菌载体。转型带有外源DNA构建体的活细菌载体的方法在此项技术中有充分描述。参见例如，Joseph Sambrook及David W.Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)。本发明涵盖使用包含减毒活细菌(例如表达本发明的构建体的ΔhemBΔ720金黄色葡萄球菌)作为唯一免疫原性组分或其与各自表达本发明的另一多肽、片段或变体(例如 SACOL0442、SACOL0720或其片段或变体)的其他减毒活细菌的组合的组合物。
组合物
本文所描述的多肽、核酸及递送系统(例如包含核酸或载体的宿主细胞)可以调配成组合物。如本文所使用，术语「可药用」是指疫苗组分(例如赋形剂、载剂、佐剂)及组合物是生理上可耐受的且当投与个体时通常不会产生过敏性或类似不良反应，诸如反胃、眩晕及类似不良反应。较佳地，如本文所使用，术语「可药用」意谓经联邦政府或洲政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出适用于动物及人类。术语「赋形剂」是指可以与本发明的疫苗组分一起投与的稀释剂、载剂或媒剂。可采用无菌水或生理食盐水溶液以及右旋糖水溶液及甘油溶液作为载剂，特别是对于可注射溶液而言。
在一个实施例中，本发明的药剂是与佐剂或免疫刺激剂组合投与。可以改善各组分的功效以产生免疫反应的适合佐剂或免疫刺激剂包括 (但不限于)油(例如矿物油、乳化油，诸如MONTANIDETM或 EMULSIGENTM-D)、金属盐(例如矾、氢氧化铝或磷酸铝)、阳离子肽(Bowdish等人,2005；Hancock等人,2000)，诸如吲哚力西丁(吲哚力西丁)、由母牛的免疫细胞产生的阳离子肽(Falla等人,1996))、天然及人造微生物组分(例如细菌脂醣、弗氏佐剂(Freund's adjuvants)、胞壁酰二肽(MDP)、环状二鸟苷-5'-单磷酸(c-di-GMP))、病原体相关分子模式 (PAMPS)(诸如表面多醣、脂多醣、聚糖、肽聚糖或微生物DNA(例如 CpG))、植物组分(诸如皂苷(例如Quil-ATM))，及/或一或多种具有载剂作用的物质(例如膨润土、乳胶粒子、脂质粒、ISCOMTM、DNA及聚磷腈(PCPP)共聚物)。亦可免疫接种含有经由TLR信号传导以刺激促炎性细胞介素的抗原加配体的合成奈米粒子(诸如由可生物降解合成聚合物，如聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)制造的奈米粒子)(Kasturi等人,2011)。
本发明的疫苗组分可以医药组合物形式投与。医药组合物可以单位剂型投与。可以采用任何适当的投与途径，例如非经肠、皮下、肌肉内、乳房内、颅内、眶内、眼、室内、囊内、关节内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂或经口投与。具体投药途径的实施例包括非经肠，例如静脉内、皮内、皮下、乳房内；口(例如吸入)；经皮(表面)；经黏膜及直肠投与。
可以采用习知医药实践提供适合调配物或组合物以在存在或不存在佐剂情况下将此类疫苗组分投与个体。此项技术中熟知的用于制备医药组合物及调配物的方法见于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,(第20版)A.R.Gennaro A R.编,2000,Lippincott: Philadelphia中。用于非经肠投与的调配物可例如含有赋形剂、无菌水或生理食盐水、聚伸烷基二醇(诸如聚乙二醇)、miglyol、植物来源的油或氢化萘。可使用生物可兼容、可生物降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物控制化合物的释放。其他可能用于本发明化合物的非经肠递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物粒子、渗透泵、可植入输注系统及脂质粒。用于吸入或乳房内注射的调配物可以含有赋形剂，例如乳糖，或可以为含有例如聚氧化乙烯-9-月桂基醚、miglyol、甘胆酸酯及脱氧胆酸酯的水溶液，或可以为油性溶液(例如石蜡油)以鼻滴剂形式或以凝胶形式投与。
治疗性调配物可以呈液体溶液或悬浮液形式；对于经口投与，调配物可以呈锭剂或胶囊形式；且对于鼻内调配物，呈粉末、鼻滴剂或气雾剂形式。用于非经肠、皮内、乳房内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、生理食盐水溶液、不挥发性油(例如石蜡油)、聚乙二醇、甘油、丙二醇、miglyol或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；还原剂，诸如二硫苏糖醇；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；及用于调整张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调节pH值。非经肠制剂可封装于由玻璃或塑料制成的安瓿、抛弃式注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射使用的医药组合物包括无菌水溶液(在水溶性情况下)或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内或乳房内投与，适合载剂包括生理食盐水、抑菌水、CremophorTM ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载剂。其可以封装于明胶胶囊中或压缩成锭剂或饲料形式。出于经口投与疫苗的目的，活性组分可并有赋形剂且以锭剂、糖衣锭或胶囊或以饲料形式使用。可包括医药学上兼容的黏合剂及/或佐剂物质作为组合物的一部分。锭剂、丸剂、胶囊、糖衣锭及类似物可含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：黏合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、PrimogelTM或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，诸如胶状二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于藉由吸入投药，疫苗组分是以气雾剂喷雾形式自含有适合推进剂(例如气体，诸如二氧化碳)的加压容器，或喷雾器递送。
亦可藉由经黏膜或经皮方式全身性投药。对于经黏膜或经皮投药，在调配物中使用适于渗透障壁的渗透剂。此类渗透剂一般为此项技术中已知的，且对于经黏膜投药，包括例如清洁剂、胆汁盐及梭链孢酸衍生物。经黏膜投药可经由使用经鼻喷雾或栓剂实现。对于经皮投药，如此项技术中一般所知，将活性化合物调配成软膏、油膏、凝胶或乳膏形式。
亦可使用脂质粒悬浮液(包括靶向特定细胞类型的脂质粒)作为可药用的载剂。
医药组合物亦可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、气味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、包覆剂或抗氧化剂。其亦可含有其他有治疗价值的试剂。
静脉内、肌肉内、皮下、乳房内或经口投与是较佳的使用形式。以有效量投与本发明的组分的剂量取决于特定活性成分的性质、宿主及个体的要求以及施用模式。
微生物靶
本发明的多肽、核酸及递送系统可以用作针对葡萄球菌感染，包括引起乳房内感染(IMI)的葡萄球菌感染的抗微生物剂。在一个较佳实施例中，葡萄球菌感染是由金黄色葡萄球菌引起。
免疫接种多肽、核酸、载体、细胞、组合物及递送系统的方法
本发明的方法、用途、医药组合物及试剂盒涵盖被动及主动免疫接种。
被动免疫接种是注射先前针对病原体(或本文所描述的抗原)产生的抗体或抗血清，以便保护或治愈感染或将来感染的接受体动物。保护作用在数周过程内衰退，在此期间用多肽、核酸或递送系统(例如如上文所描述)主动免疫接种将有时间产生持续保护性反应。用于被动免疫接种的血清可以藉由使用如本文中所描述的多肽、核酸或递送系统免疫接种供体动物来产生。该含有针对抗原的抗体的血清可以直接使用或在适当条件下储存。其可以用于对抗急性感染(例如IMI)或作为预防 (Tuchscherr等人,2008)。在被动免疫接种中使用抗体或血清可以与其他药剂，诸如抗生素组合以增加当前正在进展的感染的治愈率或增加对抗即将发生的感染的保护。
主动免疫接种是向个体投与如本文中所描述的多肽、核酸或递送系统。
根据本发明的教示鉴别的组分具有预防及/或治疗价值，诸如其可以用于产生免疫反应以预防及/或对抗疾病或病状，且更特定而言的，与微生物感染有关的疾病或病状。
如本文所使用，术语「预防(prevent/preventing/prevention)」或「治疗(treat/treating/treatment)」是指在个体中引发所需生物反应，亦即，预防及治疗作用。根据本发明，治疗作用包含在投与本发明的多肽、核酸或递送系统(本发明的药剂/组合物)后微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的严重程度、强度及/或持续时间相较于在治疗之前其在个体中的严重程度、强度及/或持续时间或相较于具有该感染或其任何症状的未经处理的对照个体中的严重程度、强度及/或持续时间降低/减少中的一或多种。根据本发明，预防作用可以包含当与未经处理的对照个体(亦即，有经历微生物(例如细菌)感染(例如葡萄球菌感染) 或其任何症状的风险的无症状个体)中的发作时间或其严重程度、强度及/或持续时间相比较时，在将来时间有经历微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的风险的无症状个体中该微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的发作延迟；或在本发明的药剂/组合物投与后发生的微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的严重程度、强度及/或持续时间降低/减少；及/或当与具有此类预先存在的微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的未经处理的对照个体中微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的进展相比较时，在投与本发明的药剂/组合物后个体中任何预先存在的微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的进展减少/减轻。如本文所使用，在治疗性治疗中，本发明的药剂/ 组合物是在微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状发作之后投与。如本文所使用，在预防性治疗中，本发明的药剂/组合物是在微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状发作之前或在其发作之后但在其进展之前投与。
如本文所使用，「减少」或「减轻」微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状是指症状相较于对照个体(未用本发明的药剂/组合物治疗的个体)减轻至少10％，在一个实施例中减轻至少20％，在另一实施例中减轻至少30％，在另一实施例中减轻至少40％，在另一实施例中减轻至少50％，在另一实施例中减轻至少60％，在另一实施例中减轻至少70％，在另一实施例中减轻至少80％，在另一实施例中减轻至少90％，在另一实施例中减轻100％(完全抑制)。
如本文关于葡萄球菌感染使用的术语「症状」是指任何葡萄球菌感染症状，诸如疼痛、炎症、发热、呕吐、腹泻、疲劳、肌肉疼痛、食欲不振、脱水、低血压、蜂窝组织炎、脓疱、疖子及烫伤样皮肤症候群。更确切地说，就葡萄球菌IMI而言，葡萄球菌IMI症状是指例如目测乳汁异常(例如水样外观、片状、结块、异味、存在血液)、乳房发红、乳房肿胀、乳房压痛、直肠温度升高(>39.0℃)、食欲不振、瘤胃活动性降低及疲劳。乳汁体细胞计数(SCC)增加是另一种葡萄球菌IMI。乳汁体细胞包括白血球，诸如白细胞或嗜中性球，以及上皮细胞。一般认为 SCC>200,000个/mL可表示葡萄球菌IMI症状或指示葡萄球菌IMI。
剂量
疫苗组分引起免疫反应的毒性或功效可以藉由细胞培养或实验动物的标准程序测定。可量测有毒作用与免疫刺激作用的间的剂量比率。展现较大比率的组分较佳。尽管可以使用展现有毒副作用的组分，但应当小心地设计递送系统以便使可能的细胞损伤减到最少并由此减小副作用。
自细胞培养分析法及实验室动物研究获得的资料可用于调配用于大型动物及人类的剂量范围。此类组分的剂量较佳处于包括具有很小毒性或无毒性的投与浓度的范围内。剂量可取决于所用剂型及所用投药途径而在此范围内变化。
可以向个体投与任何适合量的医药组合物。剂量将取决于许多因素。通常，在单次剂量内所包含的活性成分的量将为有效地预防或治疗 IMI，且不诱导显著毒性的量。熟练技术人员应了解，某些因素可能影响在个体中有效地产生免疫反应所需的剂量。另外，本发明的抗原(例如融合构建体)的治疗有效量可能需要一是列剂量。一般而言，可考虑每剂约0.01mg至500mg量的包括融合构建体的抗原。在一具体实施例中，可考虑每剂约0.1mg至1mg量的包括融合构建体的抗原。一般而言，一剂、两剂或三剂疫苗可以促进最佳免疫的发展。两次剂量的间的时间可以短至三或四周，但使初始剂量(第一剂)与加强剂量(第二剂)间隔五、六、七、八、九或十周，随后用加强注射刺激免疫系统可能为较佳的。后续加强注射(强化注射(recall shot))亦可最佳提供可持续的免疫。该强化注射可以例如每半年(6个月)、每年、每两年、每三年或每五年进行。
「样品」或「生物样品」是指自活体分离的任何固体或液体样品。在一个特定实施例中，其是指自哺乳动物分离的任何固体(例如组织样品)或液体样品，诸如乳汁、活检材料(例如固体组织样品)、血液(例如血浆、血清或全血)、唾液、滑液、尿液、羊膜液及脑脊髓液。此类样品在分析感染原的表达量之前可以例如为新鲜的、经固定(例如福尔马林、醇或丙酮固定)、经石蜡包埋或经冷冻。
患者
如本文所使用，术语「个体」或「患者」是指作为治疗、观察或实验的对象的动物，较佳为哺乳动物，诸如(但不限于)人类、母牛(例如雌牛犊、经产母牛、初产母牛、小牛)、山羊、绵羊、母羊、驴、马、猪、鸡、猫、狗等。在一具体实施例中，其是母牛(例如有经历葡萄球菌(例如IMI)感染的风险)。
如本文所使用，术语「在将来时间有经历葡萄球菌感染(例如葡萄球菌感染(例如IMI)或其任何症状的风险的个体」是指用于产奶或产肉的哺乳动物(例如母牛(例如雌牛犊、经产母牛、初产母牛、小牛)、山羊、绵羊)。
在一个实施例中，以上提及的哺乳动物是母牛。
检测方法
量测所选蛋白质/多肽的量/含量的方法的实施例包括(但不限于)：西方墨点法(Western blot)、免疫墨点法、酶联结免疫吸附分析法 (ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫沈淀法、表面电浆子共振法、化学发光、荧光偏光、磷光、免疫组织化学分析、基质辅助雷射脱附/ 电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法、显微细胞测量术 (microcytometry)、微数组、显微镜检查、流式细胞测量术，及基于蛋白质的特性，包括(但不限于)DNA结合、配体结合、与其他蛋白质搭配物的相互作用或酶活性的分析法。
在一个实施例中，使用特异性针对多肽/蛋白质的抗体在本发明的方法内检测多肽/蛋白质的量。如本文所使用，术语「抗体」涵盖单株抗体、多株抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，只要其展现所需生物活性或特异性即可。「抗体片段」包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体与靶多肽的间的相互作用是藉由辐射量测、色度或荧光方式检测。可以藉由添加偶合至可检测标签，诸如酶、荧光团或发色团的二次抗体检测抗原-抗体复合物。
用于制备抗体的方法是此项技术中熟知的。可以藉由用所关注多肽 /蛋白质或其片段作为免疫原对适合个体(例如兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)免疫接种来制备多株抗体。多肽/蛋白质「片段」、「部分」或「区段」是具有上述多肽中的至少约5、7、10、14、15、20、21个或更多个氨基酸的氨基酸残基链段。可以藉由标准技术，诸如使用固定的外吐小体标记物多肽或其片段的酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)，随时间监测经免疫接种的个体中的抗体效价。在免疫接种之后的适当时间，例如当抗体效价最高时，可以自动物，通常小鼠获得产抗体细胞，且可以使用产抗体细胞，藉由标准技术，诸如最初由Kohler及 Milstein(1975)Nature 256:495-497描述的融合瘤技术、人类B细胞融合瘤技术(Kozbor等人(1983)Immunol.Today 4:72)、EBV-融合瘤技术 (Cole等人(1985)Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Reisfeld 及Sell编(Alan R.Liss,Inc.,New York,NY),第77-96页)或三源融合瘤技术制备单株抗体。用于产生融合瘤的技术是熟知的(一般参见Coligan等人编(1994)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc., New York,NY)。
或者，为了制备单株抗体分泌性融合瘤，可以藉由用多肽或其片段筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)，由此分离出结合该多肽的免疫球蛋白文库成员来鉴别并分离单株抗体。用于产生及筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如Pharmacia Recombinant Phage Antibody SystemTM，目录号27-9400-01；及StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。
另外，针对一或多种本文所描述的多肽/蛋白质的抗体亦可自商业来源获得。
本发明亦涵盖使用对多肽/蛋白质具有特异性的固定抗体且其是一般熟习此项技术者熟知的。抗体可固定至多种固体支撑物上，诸如磁性或层析基质粒子、分析位置(诸如微量滴定孔)的表面、固体基质材料(诸如塑料、耐纶、纸)片及类似物。可以藉由在固体支撑物上以数组方式涂布该抗体或复数种抗体来制备分析条带。此条带接着可浸渍于测试样品中，且接着藉由洗涤及检测步骤快速处理，产生可量测信号，诸如彩色点。
复数种(2种或2种以上)多肽/蛋白质的分析可以用一份测试样品分别或同时进行。若干多肽/蛋白质可以组合于一项测试中以高效处理多份样品。
多肽/蛋白质的分析亦可以多种物理形式进行。举例而言，可使用微量滴定板或自动化以便利大量测试样品的处理。或者，可以开发单一样品形式以便利以及时方式实时治疗及诊断。特别有用的物理形式包含具有复数个不连续、可寻址位置用于检测复数种不同分析物的表面。此类形式包括蛋白质微数组或「蛋白质芯片」(参见例如，Ng及Ilag, J.CellMol.Med.6:329-340,2002)及毛细管装置。
在一个实施例中，以上提及的表达量是藉由量测自该一或多个基因转录的mRNA的表达量测定。
测定核酸(mRNA)含量的方法是此项技术中已知的，且包括例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶-PCR(RT-PCR)、SAGE、定量PCR(q- PCR)、南方墨点法(Southern blot)、北方墨点法(Northern blot)、序列分析、微数组分析、报导基因检测或其他DNA/RNA杂交平台。对于 RNA表达，较佳方法包括(但不限于)：提取细胞mRNA及使用与编码一或多种本发明的蛋白质/多肽的编码核酸的全部或一部分的转录物杂交的经标记探针进行北方墨点法；使用特异性引子、聚合酶链反应 (PCR)、定量PCR(q-PCR)及逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增由一或多种编码本发明的蛋白质/多肽的核酸表达的mRNA，随后藉由多种方式中的任一种定量检测产物；自生物样品提取总RNA，接着标记并用于探测排列在多种表面中的任一种上的编码本发明的蛋白质/多肽编码核酸的全部或一部分的cDNA或寡核苷酸。
试剂盒
本发明亦涵盖包含本发明的组分的试剂盒。举例而言，该试剂盒可以包含一或多种组分。这些组分可以包装于适合投与的容器及装置中。该试剂盒可以进一步包含有关使用该试剂盒的说明书。
本发明亦提供一种用于治疗及/或预防葡萄球菌IMI的试剂盒或包装，其包含可用于向有需要的个体投与一或多种本发明的构建体、多肽、核酸、载体、宿主、组合物或其中至少两种的组合的试剂。此类试剂盒可以进一步包含例如有关预防及/或治疗葡萄球菌IMI的说明书、容器、可用于执行这些方法的试剂。必要时，该试剂盒进一步包括用于降低测试中的背景干扰的试剂、用于增加信号的试剂、用于组合及内插标记物值以产生对所关注临床结果的预测的软件及算法、用于进行测试的设备、校准曲线及图表、标准化曲线及图表，及类似物。
用于进行本发明的模式
本发明藉由以下非限制性实施例进一步详细说明。
实施例1：有关包括SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720、 SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385的疫苗(疫苗#1)的材料及方法
制备抗原.选择在金黄色葡萄球菌牛乳房内感染期间大量表达的六种抗原纳入第一种牛疫苗(疫苗#1)中。这些抗原是： SACOL0029(GenBank登录编号:YP_184940.1)(SEQID NO:5)、 SACOL0442(YP_185332.1)(SEQ ID NO:29)、 SACOL0720(YP_185601.1)(SEQ IDNO:11)、SACOL1867(GenBank登录编号：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、SACOL1912(GenBank登录编号：YP_186737.1)(SEQ ID NO:43)及SACOL2385(GenBank登录编号： YP_187189.1)(SEQ ID NO:50)。由GenScript,Inc.(Piscataway,NJ)对 His标记的SACOL0029、SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385的重组蛋白质进行工程改造及制造。根据制造商的推荐，使用来自Qiagen Inc.(Mississauga,ON,Canada)的QIA表达技术(pQE30质粒)工程改造及制造His标记的SACOL0442及SACOL0720的重组蛋白质。有关his标记的抗原序列，参见图21I至VI。实施例2至5及图1至4是关于该疫苗#1。
对奶牛免疫接种.将十九头处于泌乳中期的健康经产荷斯坦母牛 (Holsteincow)圈养于加拿大农业与农产品部奶牛及猪研究与开发中心 (Dairy and SwineResearch and Development Centre of Agriculture and Agri-Food Canada；Sherbrooke,QC)的II级生物安全畜棚中。将母牛随机分成2组：一组(10头母牛)接受生理食盐水(安慰剂组)；另一组(9头母牛)接受疫苗#1(疫苗接种组)。该疫苗是由六种抗原(SACOL0029、 SACOL0720、SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385)各300μg组合EmulsigenTM-D(MVP Technologies,Omaha,NE)、CpG ODN 2007(TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:194)，一种病原体相关分子模式(PAMP)，VIDO,Saskatoon,SW)及阳离子肽吲哚力西丁(ILPWKWPWWPWRR(SEQ ID NO:195)，用于诱导母牛的免疫反应(Chemprep Inc.,Miami,FL)构成。间隔10周在颈部中经皮下进行两次免疫接种。未观察到不良副作用。在第一次免疫接种之前(免疫前血清)并且接着每两周取得尾静脉血液及牛奶样品以检测总IgG、IgG1及IgG2。在第一次免疫接种之前及第一次免疫接种之后14周(亦即，在第二次免疫接种之后4周)自颈静脉取得较大体积的血液(150mL)进行外周血液单核细胞(PBMC)分离并分析细胞免疫反应。
藉由ELISA检测总IgG、IgG1及IgG2.如先前所描述且稍加修改(Ster等人,Vet.Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对血清及牛奶中的每一抗原的总IgG、IgG1及IgG2。用测试抗原(5 μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，SigmaAldrich,Oakville,ON) 涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)并在37℃下培育隔夜。接着，在37℃下，用含有0.5％明胶的PBS(BD，Franklin Lakes,NJ)使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有0.5％明胶及0.1％TweenTM 20的PBS中的血清的两倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有0.1％TweenTM 20的PBS 洗涤这些盘三次。将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。使用的二次抗体是分别在含有0.5％明胶及0.1％TweenTM 20 的PBS中以1/50,000、1/20,000及1/20,000稀释的山羊抗牛IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories Inc.,West Grove,PA)、绵羊抗牛 IgG1(AbD Serotec,Raleigh,NC)或绵羊抗牛IgG2(AbD Serotec)。在 37℃下培育1小时随后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
使用相同程序且略加修改，检测牛奶中的总IgG、IgG1及IgG2。将牛奶样品稀释于含有0.5％明胶的PBS中。将绵羊抗牛IgG2是以1/10,000 稀释于含有0.5％明胶及0.1％TweenTM 20的PBS中。
评价细胞免疫反应.如先前所描述(Loiselle等人,J.Dairy.Sci.(2009), 92:1900-1912)，自颈静脉血液分离出PBMC并用二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE；Molecular Probes Inc.,Eugene,OR)标记。在 CFDA-SE标记程序结束时，使这些PBMC悬浮于含有5％FBS及1X抗生素/抗霉菌素(A5955,Sigma Chemical Aldrich)的RPMI培养基中。用最终浓度为1μg/mL的有丝分裂原伴刀豆球蛋白A(ConA；阳性对照； Sigma Aldrich)，或各抗原(每孔5μg)刺激这些PBMC(5×106个细胞/孔) 并在37℃下培育7天。在无任何有丝分裂原下培育这些PBMC作为阴性对照。刺激是一式两份进行(Ster等人,2010)。
在与不同有丝分裂原一起培育后，评价CD4+及CD8+细胞的增殖情况。以300×g离心细胞5分钟，使其悬浮于含有0.5％BSA的PBS中。接着添加与Alexa FluorTM 647偶合的小鼠抗牛CD8(以1/20稀释，AbD serotec)及与rPE偶合的小鼠抗牛CD4(以1/20稀释，AbDserotec)。在冰上培育20分钟之后，用含有0.5％BSA的PBS洗涤细胞三次。接着使细胞悬浮于含0.5％甲醛的PBS中。在BD FACS Canto II流式细胞仪上，使用BD FACS Diva软件藉由流式细胞测量术测定增殖群的百分比。
奶牛中的实验性金黄色葡萄球菌IMI.在使用细菌培养物进行实验性IMI之前，确定细菌培养物的吸光度(A600nm)与CFU的间的关系。在激发当天，将含一定体积金黄色葡萄球菌隔夜培养物的米勒辛顿培养液(Mueller Hinton broth，MHB；BD)转移至200mL新鲜MHB中以获得0.1的A600nm，且随后使其在35℃下生长，直至A600nm在指数生长期达到对应于108CFU/mL的值。用于该实验性感染的菌株(CLJ08-3)已预先在共同发明者的实验室中表征(Allard等人,Vet.Microbiol.(2013) 162:761-770)。对于乳房内输注，常规地在无菌PBS(Sigma Aldrich)中稀释细菌以在3mL中达到约50CFU。在本实验中，将接种物涂铺于 TSA上并发现其在3mL中含有63cfu。
在实验性IMI之前，进行体细胞计数(SCC)测定及无菌乳区牛奶样品的细菌分析以确保所有母牛均无IMI。根据先前所描述的程序 (Petitclerc等人,J.Dairy.Sci.(2007),90:2778-2787)且略加修改，在晚间挤奶之后，在每头母牛四个乳区中的三个(随机选择)中进行乳区的实验性细菌输注。简言之，在接种之前，用浸泡于70％乙醇中的纱布擦洗乳头。使乳头空气干燥，随后将3mL细菌悬浮液(含有63CFU)经乳房内输注至四个乳区中的三个中。在输注之后，立即充分按摩所有乳区并将乳头浸入基于碘伏的乳头消毒剂中。在整个程序中穿戴抛弃式分指手套并在进行至下一动物之前消毒。输注金黄色葡萄球菌的所有乳区变得感染且所有母牛在输注金黄色葡萄球菌之后前几天期间的某一时间显示乳腺炎的临床症状(炎症及/或较差牛奶外观)。
评价在实验性感染之后金黄色葡萄球菌活菌计数.实验性感染之后的前3周期间一周三次并且接着在其余2周一周两次在早晨挤奶之前取得无菌牛奶样品。在丢弃前奶且用70％乙醇对乳头消毒之后，对于每一个别乳区，将10 mL牛奶样品无菌收集于50 mL无菌小瓶中。连续稀释牛奶样品且将100μL各稀释液涂铺于胰蛋白酶大豆琼脂(BectonDickinson)及甘露糖醇盐琼脂盘(Becton Dickinson)上以测定CFU并鉴别金黄色葡萄球菌。接着在35℃下培育盘24小时，随后对菌落计数。使用显示菌落数在30个与300个的间的稀释液计算细菌浓度。每一稀释液是一式两份涂铺。
评价体细胞计数.以与无菌牛奶样品相同的频率，在早晨挤奶时使用个别乳区挤奶单元收集牛奶并称重以测定乳区牛奶产量。亦自各乳区挤奶单元获得非无菌50 mL样品以藉由商业实验室(Valacta Inc.,Ste- Anne-de-Bellevue,QC,Canada)测定SCC。每头母牛上的挤奶单元在其使用的间用基于碘的杀菌剂清洁剂(K.O.GEA FarmTechnologies,Westmoreland,NY)充分洗涤并消毒。接触牛奶的所有其他材料均用70％乙醇消毒。
统计分析.使用SAS(SAS Institute Inc.,Cary,NC)的MIXED程序作为重复量测方式进行实验性感染数据的统计分析。为分析SCC及CFU，在分析之前对数据进行log10转换。使用GraphPad PrismTM v6.05进行抗体效价及CFU与SCC之间相关性的统计分析。
伦理学声明.所有动物实验均得到加拿大农业与农产品部地方机构动物护理委员会(Agriculture and Agri-Food Canada local institutional animal carecommittee)的批准并根据加拿大动物护理委员会(Canadian Council on Animal Care)的指导原则进行。
实施例2：在疫苗接种之后的血清总IgG1效价-疫苗#1
如实施例1(制备抗原及对奶牛免疫接种)中所描述，制备有关SACOL0029(Genbank登录编号：YP_184940.1)(SEQ ID NO:5)、 SACOL0442(SEQ ID NO:29)、SACOL0720(SEQ IDNO:11)、 SACOL1867(Genbank登录编号：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、 SACOL1912(Genbank登录编号：YP_186737.1)(SEQ ID NO:43)及 SACOL2385(Genbank登录编号：YP_187189.1)(SEQ ID NO:50)的重组 His标记的抗原并投与健康母牛。有九头奶牛接受疫苗且10头母牛接受生理食盐水(安慰剂)。如实施例1(藉由ELISA检测总IgG、IgG1及IgG2) 中所描述，检测总血清IgG、IgG1及IgG2效价。
正如预期，且如图1B-C中所示，相较于安慰剂组，在疫苗接种组中免疫接种诱导抗原特异性血清IgG1及IgG2的产生增加。有趣的是，对于SACOL0442，IgG2/IgG1比率是1(参见图1D)，指示针对该抗原的平衡Th1/Th2免疫反应。对于抗原SACOL0029、SACOL0720、SACOL1912及SACOL2385，IgG2/IgG1比率明显低于SACOL0442的比率，指示这些抗原主要经由Th2路径诱导IgG1抗体反应。
实施例3：在疫苗接种之后的抗原依赖性血液CD4+及CD8+细胞增殖-疫苗#1
对于各抗原，在第二次免疫接种(即将实验性感染之前)之后四周，如实施例1(评价细胞免疫反应)中所描述，评价来自经疫苗接种的母牛 (9)及安慰剂母牛(10)的血液CD4+及CD8+细胞的抗原依赖性增殖情况。有关CD4+细胞的结果显示于图2中，其中每个符号表示在与阳性对照 (ConA)或各抗原一起培育一周之后每头母牛中增殖的CD4+细胞的百分含量。空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料，黑色正方形(■)表示安慰剂母牛的资料。水平线表示中值：虚线表示经疫苗接种的母牛的中值，而连续线表示安慰剂母牛的中值。
符号＊显示针对抗原SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及 SACOL1912，疫苗接种组与安慰剂组的间的统计差异(＊，P<0.05)。
此外，对于除抗原SACOL0720的外的所有抗原，经疫苗接种的母牛及安慰剂母牛的CD8+细胞增殖类似，对于抗原SACOL0720，在经疫苗接种的母牛中观察到较高CD8+细胞增殖(数据未显示)。CD8+细胞的诱导看来对于感染的消退亦很重要(Riollet等人,2001；Burton及 Erskine,2003)。疫苗能够刺激细胞(CD8+)及体液(CD4+)两种免疫反应。利用不同抗原的疫苗#1引起平衡的免疫反应。
实施例4：如藉由跟踪体细胞计数(SCC)的变化评价的疫苗的保护作用-疫苗#1
如实施例1(奶牛中的实验性金黄色葡萄球菌IMI、在实验性感染之后评价金黄色葡萄球菌活菌计数、评价体细胞计数及统计分析)中所描述，对奶牛进行实验性金黄色葡萄球菌感染并加以评价。在第二次免疫接种之后四周及4天，在晚间挤奶时，将63CFU的金黄色葡萄球菌输注至经疫苗接种母牛(9)及安慰剂母牛(10)的4个乳区中的3个中(第1天，图 3中的箭头)。在早晨挤奶时取得无菌牛奶样品并由Valacta(Ste-Anne-de- Bellevue,QC)测定SCC。结果显示于图3中，其中空心圆(○)及虚线表示经疫苗接种母牛的资料，而黑色正方形(■)及连续线表示安慰剂母牛的资料。每个空心圆表示经疫苗接种母牛的所有经感染乳区(27个)的平均 SCC，而每个正方形表示安慰剂母牛所有经感染乳区(30个乳区)的平均SCC。
在激发期间，发现经疫苗接种母牛的牛奶中的SCC明显低于安慰剂母牛(＊＊＊；P<0.001)，指示在经疫苗接种母牛中炎症较少及对感染的较佳控制。
实施例5：金黄色葡萄球菌(CFU)的SCC或活菌计数相对于针对特异性抗原的血清或牛奶IgG效价的间的相关性-疫苗#1
如图4A-B中所示，SCC与激发期的金黄色葡萄球菌CFU呈正相关 (图4A，r＝0.82，P<0.0001)且与在感染之前测量的针对SACOL0442的血清IgG1效价呈负相关(图4B，r＝-0.49，P<0.05)。因此，疫苗接种使此由激发诱导的炎症标准减小。利用在第10天收集的样品进行类似分析。观察到与先前所获得相同的相关性，但在此特定时间点，SCC及金黄色葡萄球菌CFU亦与针对SACOL0029的牛奶IgG2效价相关(图4C，分别为r＝-0.48，P<0.05及r＝-0.58，P<0.05)。这些结果显示，在针对感染的免疫反应中涉及超过一种抗原。
实施例6：有关包括SACOL0442、SACOL0720以及SACOL1867与 SACOL0029的融合物的疫苗的材料及方法-疫苗#2
制备抗原.选择在金黄色葡萄球菌牛乳房内感染期间大量表达的四种抗原纳入疫苗#2中。这些抗原是由以下编码的多肽：
SACOL0029(Genbank登录编号：YP_184940.1)(SEQ ID NO:5)、 SACOL1867(Genbank登录编号：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、 SACOL0442(SEQ ID NO:29)及SACOL0720(SEQ ID NO:11)。包括呈融合物形式的SACOL0029及SACOL1867抗原。由GenScript, Inc.(Piscataway,NJ)对His标记的SACOL0720及SACOL0029-1867的重组蛋白质进行工程改造及制造。根据制造商的推荐，使用来自Qiagen Inc.(Mississauga,ON,Canada)的QIA表达技术(pQE30质粒)工程改造及制造His标记的SACOL0442的重组蛋白质。(有关SACOL0720、 SACOL0442及SACOL0029-1867his标记序列，参见图21D-E及I，以及第II、III及VII项)。另外，亦藉由使用该QIA表达载体，藉由自金黄色葡萄球菌ATCC 25904选殖clfA基因制造表面蛋白质ClfA(SEQ ID NO:184)。该后一重组蛋白并非疫苗组合物的一部分，但用于ELISA分析中以测定针对其他金黄色葡萄球菌蛋白质，诸如ClfA的血清IgG效价。
该疫苗是由3种抗原(如实施例1中所定义的SACOL0442及 SACOL0720，及融合物SACOL0029-1867)各300μg及EmulsigenTM- D(MVP Technologies,Omaha,NE)、CpG ODN 2007(亦即， TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:194)(IDT,Coralville, IA))及吲哚力西丁(ILPWKWPWWPWRR(SEQ ID NO:195,GenScript, Piscataway,NJ,Chemprep Inc.,Miami,FL)构成(疫苗#2)。
对奶牛免疫接种.将十一头处于泌乳中期的健康经产荷斯坦母牛圈养于加拿大农业与农产品部奶牛及猪研究与开发中心(Sherbrooke,QC) 的II级生物安全畜棚中。母牛接受疫苗#2(经疫苗接种组)。间隔10周在颈部中经皮下进行两次免疫接种。未观察到不良副作用。在第一次免疫接种之前(免疫前血清)，并且接着每周取得尾静脉血液及牛奶样品以检测总IgG。
藉由ELISA检测总IgG.如先前所描述且稍加修改(Ster等人,Vet.Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对血清中的每一抗原的总IgG。用测试抗原(5μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释， Sigma Aldrich,Oakville,ON)涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)并在37℃下培育隔夜。接着，在37℃下，用含有0.5％明胶的PBS(BD，Franklin Lakes,NJ)使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有0.5％明胶及0.1％TweenTM 20的 PBS中的血清的两倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有0.1％TweenTM 20的PBS洗涤这些盘三次。将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。使用的二次抗体是在含有0.5％明胶及0.1％TweenTM 20的PBS中1/1000,000稀释的山羊抗牛 IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在 37℃下培育1小时随后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
实施例7：抗原融合物诱导高抗体效价-疫苗#2
图5显示经疫苗接种的母牛针对该疫苗(包括融合抗原SACOL0029 及SACOL1867(在图5上标为SACOL0029-1867)各抗原的血清总IgG效价。每个空心圆表示在第二次免疫接种之后四周每头母牛的效价(在即将实验性感染之前)，而每个黑色菱形表示免疫前效价。水平线表示中值：实线表示免疫前血清，点线表示在免疫接种之后四周取得的样品。经疫苗接种的母牛的效价高于免疫前血清的效价(＊＊，P<0.01；对于测试的其他抗原，＊＊＊，P<0.001)。
因此，图5显示，由包括融合肽在内的三种独立抗原构成的疫苗在母牛中诱导较强免疫反应。另外，图5意外地显示，融合抗原 SACOL0029及SACOL1867(融合物SACOL0029-SACOL1867)引起的抗体效价高于由各单独抗原引起的抗体效价(比较图1A与图5)且这些融合抗原使疫苗具有另外的益处。
更确切地说，当在疫苗中个别地投与时，免疫母牛针对 SACOL0029及SACOL1867的效价分别达到3200及51200(图1A)，而当这些抗原是以融合物形式投与时，免疫母牛的效价分别达到12800及 409600(图5)，显示该融合物在免疫反应中产生出人意料的协同作用。
实施例8：有关包含SACOL0029、SACOL1867以及SACOL1867与 SACOL0029的融合物的疫苗的材料及方法-疫苗#3
制备抗原.选择由在金黄色葡萄球菌牛乳房内感染期间大量表达的两个基因得到的三种抗原纳入疫苗中。这些抗原是：SACOL0029(Genbank登录编号：YP_184940.1)(SEQ IDNO:5)、 SACOL1867Genbank登录编号：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)及 SACOL1867与SACOL0029的间的融合物(Genbank登录编号： YP_184940.1)(SEQ ID NO:5)。由GenScript,Inc.(Piscataway,NJ)对 His标记的SACOL0029、SACOL1867及SACOL0029-1867的重组蛋白质进行工程改造及制造。(有关SACOL0029、SACOL1867及 SACOL0029-1867的his标记序列，参见图21A、F及I，第I、IV及VII 项)。
对小鼠免疫接种.在小鼠中评价由SACOL0029、SACOL1867基因及SACOL0029与SACOL1867的融合物编码的重组金黄色葡萄球菌蛋白质的免疫原性特性。四组小鼠接受呈单价形式(SACOL0029或 SACOL1867)或呈多价形式(融合物SACOL0029-1867或SACOL0029与SACOL1867的组合)的精确等摩尔量的蛋白质，并比较。
简言之，使用ExPASyTM生物信息学资源门户 (http://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)计算对应于整个融合物或该融合物的SACOL0029或SACOL1867部分的各氨基酸序列的理论分子量。
向一组小鼠投与五微克融合物。根据理论分子量，测定5μg的 SACOL0029-1867融合物的相应摩尔量是168.55pmol。向其他两组小鼠分别投与1.15μg及3.69μg量的SACOL0029及SACOL1867以便分别提供168.55pmol各抗原。最后一组小鼠接受两种个别抗原(各168.55 pmol)的组合。
为制备免疫接种剂量，个别地混合SACOL0029、SACOL1867及 SACOL0029-1867融合多肽并使其悬浮于PBS中以在100μl体积中获得最终等摩尔量的各抗原。将二十只CD-1雌性小鼠随机分成4组：A组(5 只小鼠)接受5μg SACOL0029-1867融合蛋白(融合物)；B组(5只小鼠)接受1.15μg SACOL0029及3.69μg SACOL1867(组合)；C组(5只小鼠)接受1.15μgSACOL0029(0029)；且D组接受3.69μg SACOL1867(1867)。在颈部以间隔两周方式两次皮下注射对CD-1小鼠进行免疫接种。在整个实验性免疫接种期间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，在4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃，以待后续分析。
藉由ELISA检测总IgG.如先前所描述且稍加修改(Ster等人,Vet.Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对SACOL0029 及SACOL1867重组蛋白质的血清总IgG。用75μl各测试抗原(6.67 μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，Sigma Aldrich,Oakville,ON) 涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher ScientificInc.,Rochester, NY)并在室温下培育隔夜。接着在37℃下，用含有5％脱脂奶粉的PBS 使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有3％牛奶及0.025％ TweenTM 20的PBS中的血清的四倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有0.05％TweenTM 20的PBS洗涤这些盘三次。接着将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。所用二次抗体是在含有3％牛奶及0.025％TweenTM 20的PBS中1/5000稀释的商购山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove, PA)。在37℃下培育1小时随后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，藉由添加一百微升3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc., Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
统计分析抗体效价及相关性的统计分析是使用GraphPad PrismTM v6.05进行。
实施例9：相较于单价抗原或抗原组合，抗原融合物诱导明显较高的抗体效价-疫苗#3
图6显示融合多肽(亦即，SACOL0029-1867融合蛋白)中所包括的抗原(SACOL1867)可以诱导针对特异性抗原(SACOL1867)的较强特异性抗体免疫反应，且更重要的是，该反应可以显著高于利用该抗原的单价形式(单独投与的SACOL1867)或作为融合物的一部分的个别多肽的多价组合(SACOL1867加SACOL0029的组合)获得的反应。因此，除产生针对多个多肽靶的免疫反应的优势外，此类融合抗原亦提供大幅提高针对这些靶的抗体效价的额外益处。
实施例10：有关包括SACOL0720片段及/或SACOL442片段的疫苗的材料及方法-疫苗#4至6
制备抗原.基于B细胞表位的存在，选择长度为15至50个氨基酸且源自于序列SACOL0442及/或SACOL0720的肽及氨基酸片段。亦设计出肽表位的融合物，其中用氨基酸接头(例如EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)，或ERKYK(SEQ ID NO:61)，或KDYERKYKKHIVS(SEQ IDNO:196))接合各种表位。肽及氨基酸片段是由Biomatik, Inc.(Cambridge,ON)合成。在收到后，将冻干的肽及氨基酸片段以5 mg/mL浓度悬浮于无菌水中并在-80℃储存待用。
对小鼠免疫接种.使用肽及氨基酸片段作为抗原对小鼠免疫接种。对于制备免疫接种剂量，除非另外说明，否则将各肽及氨基酸片段或其组合混合并悬浮于含有20％-D水包油乳液佐剂的PBS 中，以获得每剂100μg多肽的最终剂量。将CD-1雌性小鼠随机分成具有3至4只动物的不同组别。以间隔两周方式两次皮下注射小鼠颈部进行免疫接种。在整个实验期间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持1小时，并且接着在4℃下以 10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃，以待后续分析。
藉由ELISA检测总IgG.如先前所描述及稍加修改(Ster等人,Vet.Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对用于免疫接种小鼠的抗原中所发现的特定氨基酸序列的血清总IgG。用100μl在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma Aldrich,Oakville,ON)中稀释的最终浓度为5 μg/mL的各靶氨基酸序列涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)并在室温下培育隔夜。接着在37℃下，用含有5％脱脂奶粉的PBS使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有 1％牛奶及0.025％TweenTM 20的PBS中的血清的四倍或两倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。接着用含有0.05％TweenTM 20的 PBS洗涤这些盘三次。接着将一百微升辣根过氧化酶(horseradish peroxidase；HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。所用二次抗体是在含有1％牛奶及0.025％TweenTM 20的PBS中1/5000稀释的山羊抗小鼠 IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在 37℃下培育1小时随后用PBSTweenTM 20洗涤3次且最后用PBS洗涤一次之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
统计分析.抗体效价及光学密度的统计分析是使用GraphPad PrismTM v6.05进行。
实施例11：针对包括由序列SACOL0442及SACOL0720编码的表位的肽的融合物的免疫反应-疫苗#4
使用由SACOL0442及SACOL0720编码的肽表位的融合物对小鼠接种疫苗(n＝4)。肽融合物的序列是KDGGKYTLESHKELQ EAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:3)(疫苗#4)，其中接头呈斜体且不同表位是以粗体字符标识。表位是由 SACOL0442编码的KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)、由 SACOL0720编码的KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)及亦由 SACOL0720编码的DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。在ELISA分析中，自动物收集的血清中的IgG抗体能够结合包含来自 SACOL0442(亦即KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1))及/或 SACOL0720(亦即，QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)； KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)、DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24))的B细胞表位的氨基酸片段且抗体效价为1/6400或更高。用于免疫接种的肽的融合物及在ELISA分析中用作抗体靶的氨基酸片段或多肽显示于下表III中。在该表中，表位是呈粗体且接头序列是呈斜体。
表III-多肽疫苗及抗体反应靶
用于疫苗接种的肽的融合物
在ELISA分析中，由来自疫苗接种以上融合抗原的小鼠的IgG结合以上显示的所有抗体靶。
由此证实，可以使用由SACOL0442及SACOL0720编码的肽表位的融合物免疫接种哺乳动物并引起免疫反应。获得的免疫反应包括产生识别SACOL0442或SACOL0720、由SACOL0442或SACOL0720编码的氨基酸片段或变体的抗体。
实施例12：在免疫接种中用作抗原的多个表位的融合物显著增强针对单一表位的免疫反应-疫苗#4
使用由SACOL0442及SACOL0720编码的肽表位的融合物对小鼠接种疫苗(n＝4)。肽融合物的序列是KDGGKYTLESHK ELQEAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:3)，其中接头呈斜体且不同表位以粗体字符标识。表位是由 SACOL0442编码的KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)、由 SACOL0720编码的KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)及亦由 SACOL0720编码的DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。用由 SACOL0442编码的单一肽表位KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)对另一组小鼠(n＝4)免疫接种。
自动物收集血清并测试针对由SACOL0442编码的氨基酸片段 (GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD)(SEQ ID NO:2)的IgG抗体的存在，该氨基酸片段含有肽表位KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)。
如图7上所示，相较于当仅使用肽表位KDGGKYTLESHK ELQ(SEQ ID NO:1)作为抗原进行免疫接种时获得的抗体含量，用三个肽表位(一个由SACOL0442编码及两个由SACOL0720编码)的融合物免疫接种显著增加针对由SACOL0442编码的氨基酸片段 (GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD)(SEQ ID NO:2)的抗体产生，该氨基酸片段含有肽表位KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)。
实施例13：针对SACOL0720变体编码的50个氨基酸的多肽片段的免疫反应-疫苗#5
用由序列SACOL0720编码的含有B细胞表位(粗体字符)，更具体言的，含有表位KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)、 DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)及QFGFDLKHKKDALA(SEQID NO:21)的50个氨基酸的肽片段(KDINKIYFMTDVDLGGP TFVLNDKDYERKYKKHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO: 27))(疫苗#5)对一组小鼠(n＝3)进行疫苗接种。KDINKIYFMTDVDL GGPTFVLNDKDYERKYKKHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:27)的总体序列与SACOL0720的天然序列在连接表位 DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)与QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)的区域中有四个氨基酸的差异。因此，可以认为疫苗#5是 SACOL0720的变体片段或藉由接头ERKYK(SEQ ID NO:61)隔开的来自SACOL0720的表位的融合物。
测试血清中针对由SACOL0720(SEQ ID NO:25)(亦即，图21D中第 II项显示的聚组氨酸形式)编码的天然蛋白质的片段的IgG抗体的存在。在ELISA分析中，用对应于氨基酸的变异序列(或融合物SACOL0720- 720)的肽片段疫苗接种的小鼠均产生识别原始氨基酸序列中的表位的抗体，且效价为1/6400或更高。
由此证实，包含由序列SACOL0720编码的表位的氨基酸片段可以在哺乳动物中引起免疫反应。此亦进一步证实，天然序列变体能够刺激针对含有B细胞表位的原始片段序列的免疫系统。
实施例14：针对融合物组合(肽融合物0442-0720及多肽融合物0029- 1867)的免疫反应-疫苗#6
将由SACOL0442及SACOL0720编码的肽表位的融合物(参见图21I 中第VII项的序列-融合物)与含有SACOL0029及SACOL1867序列的多肽融合物(参见图21I中第VII项融合物的序列)组合并用于对小鼠进行疫苗接种(疫苗#6)。
为制备免疫接种剂量，将肽融合物0442-0720及多肽融合物1867- 0029混合并悬浮于含有20％-D水包油乳液佐剂的PBS 中，分别获得每剂100μg及5μg最终剂量的肽融合物(0442-0720)及多肽融合物(0029-1867)。藉由在颈部中三次皮下注射对CD-1雌性小鼠(n＝3) 进行免疫接种。前两次注射是间隔一周进行且第三次注射是在第二次注射之后3周进行。在整个实验期间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十四天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，并且接着在 4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃，以待后续分析。
在ELISA分析中，自动物收集的血清中的IgG抗体能够结合包含来自SACOL0442或SACOL0720的表位的氨基酸片段或多肽SACOL0029 或SACOL1867，且抗体效价为1/6400或更高。用于免疫接种的肽及多肽的融合物以及在ELISA分析中用作抗体靶的多肽或氨基酸片段显示于下表IV中。
表IV-混合多肽融合物疫苗及抗体反应靶
使用肽0442-0720的融合物与多肽融合物0029-1867的混合物进行疫苗接种(疫苗#6)
表位是呈粗体且接头序列是呈斜体
由此证实，可以使用融合物组合(例如肽融合物0442-0720与多肽融合物0029-1867的混合物)对哺乳动物免疫接种并引起免疫反应。获得的免疫反应包括产生识别由SACOL0442或SACOL0720或SACOL0029或 SACOL1867编码的氨基酸序列的抗体。
实施例15：有关减毒活突变株的材料及方法
细菌菌株及生长条件.实施例15至25中使用的菌株列于表V中。金黄色葡萄球菌ATCC 29213及其同基因突变株Δ720如先前所描述(Allard 等人,2013)。除非另外规定，否则金黄色葡萄球菌菌株是在胰酶大豆培养液(TSB)及琼脂(TSA)(BD,ON,Canada)中生长，且大肠杆菌DH5α是在LB及LBA培养基(BD)中生长。必要时，将安比西林(ampicillin) (100μg/ml)(Sigma,Oakville,Ontario,Canada)、氯霉素 (chloramphenicol)(20μg/ml)(ICNBiomedicals,Irvine,CA)及红霉素 (erythromycin)(10μg/ml)(Sigma)添加至琼脂盘中。对于免疫测试，选择对应于在加拿大奶牛群及世界其他地方所发现的主要金黄色葡萄球菌spa类型中的一部分的四种不同的牛乳腺炎分离株(Veh等人,2015； Mitra等人,2013)。菌株SHY97-3906(spa t529)是自在泌乳期间发生的临床牛乳腺炎病例分离，且CLJ08-3(spat359)最初是在干奶期自患有持久乳腺炎的母牛分离(Allard等人,2013)。菌株Sa3151(spat13401)及 Sa3181(spa t267)是自加拿大牛乳腺炎及牛奶质量研究网(Canadian BovineMastitis and Milk Quality Research Network，CBMMQRN)乳腺炎病原体培养物保藏中心(Mastitis Pathogen Culture Collection)(Universitéde Montréal,Facultéde médecine vétérinaire,St- Hyacinthe,QC,Canada)获得，且自亚临床乳房内感染病例分离。
表V-实施例15至25中使用的菌株及质粒
细胞培养条件.使用确定的牛乳房上皮细胞(BMEC)株MAC- T(Huynh等人,1991)作为感染的细胞培养模型。在含有10％热灭活胎牛血清(FBS)且补充有5μg/ml胰岛素(RocheDiagnostics Inc.,Laval, Canada)及1μg/ml羟皮质酮(hydrocortisone)(Sigma)的达尔伯克改良型伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中常规地培养并维持MAC-T细胞，且在37℃及5％CO2下于含湿气培育箱中培育。细胞培养试剂是购自Wisent(St-Bruno,QC,Canada)。
DNA操作.遵循制造商推荐的试剂盒进行基因组DNA分离 (Sigma)、质粒DNA分离(Qiagen,ON,Canada)、自琼脂糖凝胶提取 DNA片段(Qiagen)以及PCR产物及消化的DNA片段的纯化(Qiagen)。在分离基因组及质粒DNA时，再使用200μg/ml溶葡球菌酶(Sigma)处理1小时以实现金黄色葡萄球菌细胞的有效溶解。引子( Integrated DNATechnologies；Coraville,Iowa,USA)经设计以在扩增产物的上游及下游添加限制性位点。对于常规PCR，使用Taq DNA聚合酶(NEB, Pickering,ON,Canada)进行PCR，或对于选殖，使用Q5高保真度DNA 聚合酶(NEB)，且循环时间及温度针对各引物对进行优化。使用大肠杆菌DH5α(Invitrogen,Burlington,ON,Canada)、限制酶(NEB)及T4 DNA连接酶(NEB)产生质粒构建体。在电穿孔放入金黄色葡萄球菌 RN4220中(Kreiswirth等人,1983)及最终宿主菌株中之前，藉由限制性消化模式及DNA测序验证质粒构建体。实施例15至25中使用的质粒列于上表V中。
产生减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720及ΔhemB.构筑ATCC 29213 菌株的同基因hemB突变株，其中hemB基因缺失且藉由同源重组插入 emrA卡匣替代。使用TargeTronTM基因敲除系统(Gene Knockout System)(利用TargeTronTM载体pNL9164(Sigma-Aldrich CanadaLtd.)(Chen等人,2007)破坏细菌基因，藉由在金黄色葡萄球菌 ATCC29213中的核苷酸803与804的间插入第II组内含子(如先前所描述 (Allard等人,2013)，片段大小为约2Kb)来产生针对基因 SACOL0720(Δ720)的金黄色葡萄球菌ATCC 29213突变株。遵循制造商的方案及推荐。
产生ΔhemBΔ720.为了在基因hemB中实现第二突变以便在Δ720突变基因背景下获得SCV表型，使用另一策略：在先前所描述的策略 (Mitchell等人,2008)中，稍加修改，使用温度敏感性pBT2- hemB:emrA(pBT-E:hemB)。简言之，藉由在温度敏感性穿梭载体pBT2的XbaI与SalI位点的间插入ermA卡匣来构筑pBT-E质粒(Brückner, 1997)。自金黄色葡萄球菌ATCC 29213扩增基因hemB(SACOL1715)DNA片段的侧接区且选殖于质粒pBT-E中的ermA卡匣的两侧上。接着将质粒转移至金黄色葡萄球菌RN4220(res-)中进行繁殖。在用溶葡球菌酶(200μg/ml，在室温下保持1小时)细菌溶解之后，分离质粒DNA并藉由电穿孔而用于转型ATCC 29213及Δ720。对于质粒整合及突变株产生，先使细菌在30℃下在10μg/ml红霉素及1μg/ml氯化血红素补充物(Sigma-Aldrich,ON,Canada)存在下生长隔夜。接着以 1:1000稀释细菌并使其在42℃下在2.5μg/ml红霉素及1μg/ml氯化血红素存在下生长隔夜。该步骤重复两次。最后，以1:1000稀释细菌并在无抗生素存在下，使其在42℃下生长隔夜。选择的带有失活的hemB基因的突变株对红霉素具有抗性且对氯霉素敏感，且带有可以藉由在琼脂盘上补充5μg/ml氯化血红素补充的SCV表型(亦即，反突变成正常生长表型)。藉由PCR确定ATCC 29213(亦即ΔhemB)及Δ720(亦即ΔhemBΔ720) 菌株中hemB的缺失(参见图8A及B)。
在培养液培养中的氯化血红素补充.为了评价氯化血红素使金黄色葡萄球菌ΔhemB及双重突变株Δ720ΔhemB恢复最佳生长动力学的能力，在包含补充有各种浓度氯化血红素(Sigma)的新鲜BHI的培养管中，将隔夜细菌培养物稀释至A600nm为约0.1。在35℃(225rpm)下培育期间的不同时间点监测培养物的A600nm。
金黄色葡萄球菌感染牛乳房上皮细胞(BMEC).使用MAC-T BMEC 表征ATCC 29213(WT)及其同基因突变株的细胞内感染性及存留性。在感染之前四十八小时，将1×105个/毫升MAC-T细胞接种于经处理的24孔盘(Corning)上以获得30％汇合。在37℃及10％CO2下，使单细胞层生长至汇合。在感染之前六小时，用DMEM洗涤单细胞层并与侵袭性培养基(invasion medium，IM)(不含抗生素且含有1％热灭活FBS的生长培养基)一起培育。将隔夜细菌培养物以1:20稀释于新鲜TSB中并使其生长至对数生长中期，接着用PBS洗涤并稀释于IM中达到感染倍率10。藉由将单细胞层与细菌一起培育3小时来实现侵袭。接着用DMEM洗涤单细胞层并用含有20μg/ml溶葡球菌酶的IM培育以杀灭细胞外细菌。先前在细胞侵袭分析中已验证溶葡球菌酶在杀灭细胞外正常及SCV金黄色葡萄球菌方面的用途(Moisan等人,2006及Tuchscherr等人,2011)。处理30 分钟以测定感染3小时的CFU，或再处理12或24小时。接着，在用达尔伯克氏磷酸盐缓冲生理食盐水(Dulbecco's Phosphate-BufferedSaline， DPBS)充分洗涤之后，藉由胰蛋白酶消化剥离单细胞层并用0.05％ TritonX-100溶解，且添加PBS以获得最终1×浓度。连续稀释溶解产物并将其涂铺于TSA上进行CFU测定。
BMEC活力及代谢活性分析.为了测定MAC-T细胞上由金黄色葡萄球菌ATCC 29213(WT)及其同基因突变株造成的细胞毒性损伤，进行 MTT细胞代谢活性分析，该分析量测活细胞中3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]- 2,5二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原成不溶性甲产物的情况。该分析遵循Kubica等人(Kubica等人,2008)的方法且稍加修改。简言之，如存留性分析中所描述实现细胞的金黄色葡萄球菌感染，但在12小时或24小时之后不溶解，而是在37℃下，用含100μl MTT试剂(5mg/ml)(Sigma) 的DPBS培育细胞2小时。在此之后，添加具有16％SDS及40％PMF的 pH 4.7酸性溶剂溶液以溶解细胞并溶解甲晶体隔夜。在570nm波长下，使用Epoch微量盘读取器(Biotek Instruments Inc.)读取样品。所有分析均一式三份进行，且在每个盘中均包括含未感染细胞(高活力对照) 或溶解的WT感染的细胞(细菌背景对照；在添加MTT之前，用0.05％ tritonX-100处理10分钟)的对照孔。使用下式计算代谢活性水平：
(样品吸光度-背景对照)/高对照)×100.
小鼠乳腺炎模型中的毒力.感染的小鼠乳腺炎模型是基于先前的描述(Brouillette,2005；Brouillette,2004)。用小鼠进行的所有实验均得到伦理学委员会有关舍布鲁克大学科学是(Facultédes sciences of theUniversitéde Sherbrooke)动物实验的批准且根据加拿大动物护理委员会(Canadian Council on Animal Care)的指导原则进行。简言之，在取出12至14天大的后代之后一小时，分别每用公斤体重87mg及13mg 的氯胺酮及甲苯噻嗪使哺乳期CD-1小鼠(Charles River Laboratories)麻醉并在双眼显微镜下对乳腺接种。藉由在乳头近端的小切口暴露出乳管并使用32号钝针经乳头导管注射在无内毒素的磷酸盐缓冲生理食盐水 (PBS，Sigma)中含有102CFU的100μl细菌悬浮液。对于每只动物，接种两个腺体(自头至尾，右侧第四个[R4]及左侧第四个[L4])。在指定时间时以无菌方式收集乳腺，称重并目测评价炎症。在PBS中进行机械组织均质化，连续稀释并涂铺于琼脂上测定CFU之后，评价细菌负荷。在第二实验中，保留均质化腺体进行蛋白质提取用于髓过氧化酶(MPO)活性酶分析。
乳腺蛋白质提取.利用先前所描述的优化方法(Pulli等人,2013)且稍加修改，自乳腺提取总蛋白质。在含有最终浓度50mM磷酸钾(pH 6.0) 及50mM溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)(Sigma)的缓冲液中将乳房组织均质化。接着超音处理样品，在液氮中冷冻-解冻，并在4℃下以2000g 离心15分钟。最后，藉由抽吸移除脂肪层，并保留上清液，以15000g 最终离心15分钟，以丢弃每个细胞残渣。将上清液分配成数等分并保持在-80℃，直至用于酶分析或如藉由双金鸡纳酸法(BCA)蛋白质分析试剂盒(Thermo-Scientific)所量测的蛋白质浓度测定。
MPO活性分析.藉由改良用于微孔盘的邻二甲氧苯胺-H2O2方法 (Bradley,RD.及Rothstein,GPPC.,1982)定量MPO酶活性来量测乳房组织中的嗜中性球募集。在96孔微量盘中，将10μl组织提取上清液与邻二甲氧苯胺盐酸盐(0.167mg/mL)(Sigma)及0.0005％H2O2(Sigma)于50 mM CTAB磷酸盐缓冲液50mM(pH 6.0)中的溶液一起培育。在Epoch微量盘读取器中，在460nm下，经5分钟的时间，间隔15秒动力学量测 MPO活性。MPO单位视为在25℃下每分钟降解1μmol H2O2的酶量，假设在460nm下邻二甲氧苯胺的吸收是数为11.3mM-1cm-1(Zhang等人, 2004)。结果表示为每公克腺体的MPO单位数。
用减毒活突变株Δ720ΔhemB免疫接种小鼠.在小鼠中评价以活毒疫苗形式投与的减毒菌株Δ720ΔhemB的免疫原性特性。在初步研究中，小鼠对肌肉内及皮下(SC)注射减毒菌株具有良好耐受性。选择106、107及108CFU剂量及SC途径用于后续实验。对于制备细菌接种物，在冰冷的PBS中洗涤预先在BHIA盘上生长的金黄色葡萄球菌Δ720ΔhemB菌落两次并将其悬浮于含有15％甘油的PBS中，接着等分并保持在-80℃待用。藉由在BHIA涂铺连续稀释液来验证接种物制剂中活细菌计数。将 CD-1随机分成3组：第1组(n＝3)接受106CFU剂量；第2组(n＝3)，107 CFU；及第3组(n＝3)，108CFU。在颈部以间隔两周方式两次皮下注射于PBS(100μl)中的细菌来对小鼠免疫接种。在即将初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，并且接着在4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃以待后续分析。
制备金黄色葡萄球菌细胞提取物.如先前所描述且稍加修改(Asli等人,2016)，制备金黄色葡萄球菌全细胞提取物。简言之，将隔夜细菌培养物以1/1000稀释于新鲜BHI培养液中，并且接着在35℃(225rpm)下培育，直至A600nm达到约0.8。对细菌细胞离心并在冰冷的PBS中洗涤细胞集结粒两次并藉由添加每毫升集结粒5ml PBS使其悬浮。首先在37℃下用溶葡球菌酶(Sigma)(100μg/ml集结粒)处理细菌悬浮液1小时，并且接着将每毫升集结粒3μg蛋白酶抑制剂混合液(Sigma)、8μgRNA酶 A(Sigma)及8μgDNA酶(Qiagen)添加至该悬浮液中。在室温下30分钟之后，藉由3至4次通过SLMAmincoTM French加压细胞破碎仪(Pressurecell disrupter)以机械方式破坏细胞，并且接着在4℃下以12,000g离心 10分钟以移除未破坏的细胞。收集上清液并如先前所描述，利用BCA 蛋白质分析试剂盒测定总蛋白质浓度。
藉由ELISA检测小鼠总IgG.检测针对Δ720ΔhemB疫苗接种菌株及各牛IMI分离株的血清总IgG以展示并量测由小鼠免疫接种产生的全身体液反应。对于靶抗原，用100μl各完整金黄色葡萄球菌细胞提取物(10 μg/ml于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，Sigma)涂布NuncMaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)，并在室温下培育隔夜。接着，在37℃下用含有5％脱脂奶粉的PBS使这些盘饱和，保持1 小时，随后藉由添加5％猪血清以防止非特异性金黄色葡萄球菌蛋白质 A相互作用进行第二个阻断步骤。将一百微升于稀释缓冲液(含2％牛奶、5％猪血清及0.025％TweenTM 20的PBS)中的血清的两倍连续稀释液装载至这些盘中并在37℃下培育1小时。接着用含有0.05％ TweenTM20的PBS洗涤盘三次，且装载在稀释缓冲液中以1/5000稀释的 100μl辣根过氧化酶(HRP)偶联山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在37℃下培育1 小时随后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
统计分析.用GraphPadPrismTM软件(6.02版)进行统计分析。在用于统计分析之前，将细胞内细菌CFU及细菌CFU/g腺体(小鼠中的IMI)转换成以10为底的对数值。用于分析各实验的统计检定及显著性在图例中说明。
实施例16：构筑金黄色葡萄球菌ATCC 29213Δ720、ΔhemB及Δ720ΔhemB菌株
仿真天然感染的减毒活生物体以一种有效的方式刺激免疫系统，引起广泛且稳定的免疫反应，由此产生血清及黏膜抗体，以及协同作用以防止疾病的效应及记忆T细胞(Detmer,2006；Kollaritsch,2000； Pasetti,2011)。
在母牛实验性IMI感染中，经显示基因SACOL0720的突变可改变金黄色葡萄球菌的毒力(Allard等人,2013)。
基于金黄色葡萄球菌SCV的表型特征，制备其他减毒活菌株用于疫苗目的。SCV一般不产生侵袭性感染(亦即，额外减毒)且可以内化于宿主细胞中并因此除体液免疫反应外，还将刺激细胞介导的免疫反应。
先经由hemB基因缺失(ΔhemB)产生稳定金黄色葡萄球菌SCV(参见实施例15，产生减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720及ΔhemB)。接着藉由使基因SACOL0720失活(Δ720)达成该SCV的进一步减毒(参见实施例 15，产生ΔhemBΔ720)。
在感染MAC-T牛乳房上皮细胞之后，相较于分别用ΔhemB及Δ720 所观察到的情形，双重突变株(Δ720ΔhemB)明显地显示较少的内化及细胞破坏。
实施例17：金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株在MAC-T细胞中减毒
接着，在细胞内存留分析中使用MAC-T细胞比较ATCC 29213(WT)、Δ720、ΔhemB及ΔhemBΔ720菌株的感染性。藉由将该三个突变菌株与其同基因WT亲株相比较，观察基因hemB及SACOL0720 突变的不同影响。基于活细胞内细菌的回收率(CFU)，将细菌与细胞单层培育3小时的较短时间，随后添加溶葡球菌酶除去细胞外细菌WT及ΔhemB菌株在MAC-T细胞中的较高内化程度(图9A及B)。然而，相较于其亲本WT菌株，单Δ720突变株显示明显较低(P≤0.01)的内化(图9A)。当比较双重突变株ΔhemBΔ720与ΔhemB时，在Δ720中见到甚至更明显的内化减少，且在该3小时内化分析中接种物回收率减小10倍 (P≤0.001，图9B)。如在侵袭(PI)后12及24小时相较于关于ΔhemB所观察的结果CFU/ml有1-log10减小所说明，对于双重突变株ΔhemBΔ720(图9C)，该内化细菌负载的初始降低在该两个时间点仍显而易见(P≤0.001)。单Δ720突变株与WT菌株的间的初始细胞内细菌负载量差异 (图9A)随着培育时间延长而逐渐消失(图9C)，因为该两种菌株无法良好地存留于MAC-T细胞中(图10)。相反，在24小时PI时，所回收的单ΔhemB菌株的细胞内CFU显著高于所回收的该三种其他菌株的细胞内 CFU(图9C，针对全部，P≤0.001)。总体而言且正如关于SCV表型所预期的，相较于任何其他菌株，ΔhemB菌株随时间显示较高的细胞内存留量(图10)。这些结果表明，Δ720突变主要降低MAC-T细胞中的内化过程。结果进一步证实，ΔhemBΔ720突变株仍能够内化且存留于BMEC 中，但程度要比用单ΔhemB突变株所观察到的程度低得多。
ΔhemBΔ720及ΔhemB SCV引起较少BMEC破坏。如以上所报导，如由ΔhemB及ΔhemBΔ720SCV菌株在12及24小时PI时具有持久活力所说明，这些菌株在MAC-T细胞中随时间显示比WT及Δ720菌株高的存留量(图9C及10)。对于双重突变株及单hemB突变株，在溶葡球菌酶添加之后0至24小时，自细胞回收的接种物的百分含量保持大致相同，其中在12小时略有增加，指示细胞内生长(图10)。在该感染时间后，两种菌株开始以较慢速率减少。然而，在WT及Δ720菌株的细胞内CFU的明显降低的同时，目测观察到细胞单层随时间而损伤的增加，与利用具有 SCV表型的菌株所观察到的情形形成比较。
在感染之后亦藉由该四种研究菌株中的每一种评价MAC-T细胞活力。藉由MTT方法(Kubica等人,2008)评价MAC-T细胞活力。结果显示，两种SCV菌株(ΔhemB及ΔhemBΔ720)在该分析中引起明显不如WT 及Δ720菌株的MAC-T杀灭作用。当与ΔhemB相比较时，在12小时， WT菌株使细胞活力降低接近一半(图11A：WT：25.4％；ΔhemB： 48.4％)。该差异在24小时仍显而易见(图11B：分别为16.3％相对于 34.5％)，即使ΔhemB突变株的细菌负载量高出10倍(图9C)。ΔhemB对 MAC-T细胞的破坏明显超过双重突变株Δ720ΔhemB，但仅在24小时存在显著差异(P≤0.01)。当直接与WT菌株相比较时，双重突变株Δ720ΔhemB在12小时保持的上皮细胞活力高出2.3倍(图11A)且在24小时要高出2.7倍(图11B)(12小时与24小时：P≤0.0001)。因此，两种SCV菌株随时间的细胞内存留量高于WT及Δ720菌株(图10)可能归于SCV对MAC-T细胞的毒性较低(图11)。综合而言，自BMEC感染分析得到的结果证实ΔhemB及Δ720两种突变对于WT菌株减毒呈现相加效应。
实施例18：金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株在小鼠IMI模型中减毒
为了证明在活体内感染模型中ΔhemBΔ720减毒，在鼠类IMI模型中评价双重突变株的毒力且与WT菌株相比较(Brouillette及Malouin, 2005)。用于两种菌株，感染的指数期主要在感染后前12小时内发生，而最大细菌负荷对于双重突变株是在24小时且对于WT菌株是在48小时 (第2天[D2])达到(图12)。在24小时的时候，双重突变株显示平均CFU/g 腺体相较于WT有1.9log10的减小(P≤0.05)。另外，在24小时之后，该突变株细菌负荷显示持续减小直至在第12天细菌完全清除(在图12上以星号显示)。相比的下，相较于该突变株，亲本WT菌株引起严重侵袭性感染，在第2天杀灭剩余9只小鼠中的3只且在第7天杀灭3只小鼠中的2只 (图12；箭头)，随后可以收集这些组的腺体。在WT感染中存活的小鼠在第7天维持较高的活菌计数(9log10CFU/g腺体)，细菌负荷相较于双重突变株有近似5log10的差异。这些结果清楚地展示菌株ΔhemBΔ720在乳腺中倍增及存活的能力明显降低。因此，ΔhemBΔ720双重突变株在小鼠乳房内感染(IMI)模型中明显减毒且自乳腺高效地清除。
减毒菌株ΔhemBΔ720看来理想地用于疫苗接种目的及细胞内抗原递送。实际上，ΔhemBΔ720较少且暂时性内化应有助于刺激细胞介导的免疫，该免疫是对于防御金黄色葡萄球菌极为重要的免疫反应的组成部分(Fowler及Proctor,2014)。
实施例19：在IMI之后针对Δ720ΔhemB及WT菌株的炎症反应
为了监测小鼠对WT及突变菌株感染的炎症反应(免疫反应)，藉由腺体匀浆总蛋白质提取物的MPO酶活性评价腺体中的嗜中性球浸润。如先前所述，生物样品的MPO活性与嗜中性球绝对数存在较强相关性 (Xia,1997)，且因此为适当标记物。在感染之后前几小时期间，双重突变株及WT感染的腺体中嗜中性球募集遵循类似型态(图13)，且在感染后12小时至24小时，明显嗜中性球浸润呈指数加强，与细菌生长一致，尽管存在一定延迟。先前已显示与乳腺中细菌负载量有关的多形核细胞的绝对数目未必总是在相同时间达到峰值(Brouillette,2005)。在6小时、12小时及24小时，在感染突变株与感染WT菌株的腺体的间未观察到MPO活性的显著差异(图13)。不过，该同等的明显嗜中性球浸润与在 24小时目测观察到的炎症不相关，在24小时的时候，相较于双重突变株，WT感染引起经感染腺体的大面积发红(图14的照片)。相反地，相较于PBS对照组，感染突变株的腺体在宏观层面上目测无变化。目测炎症评估与嗜中性球浸润结果的间的不一致可以归于细菌负载量的差异 (图9A-C)及WT菌株的细胞毒性活性(图11)，且可经由毒素及酶表达与该菌株的高侵袭性及传播能力相关联。因此，这些结果指示，感染突变株的腺体中的嗜中性球募集与用WT菌株所见到的情形相当且此足以引起突变株负载量的后续降低及清除。
最后，为了证明菌株的安全性，及评估该炎症反应并非不可接受的反应原性菌株所致，监测在感染之后4天及12天感染Δ720ΔhemB的腺体的MPO活性。接着，将活性水平与用注射PBS的小鼠获得的水平相比较。如图15中所示，感染突变株的腺体中的明显存在的嗜中性球在感染之后4天仍大量存在，且活性范围为8至21个单位/公克腺体。此外，腺体退化(使哺乳期腺体恢复成接近孕前状态的形态的过程)通常与嗜中性球募集以允许在组织重塑期间吞噬凋亡细胞有关(Stein,2007)。在此模型中感染后数天，如由小鼠腺体迅速收缩所指示，这些腺体已经处于改良的正常状态。然而，感染突变株的腺体中的MPO含量在第4天与第12 天的间大幅降低(P≤0.01)。接着，认为MPO含量在第12天恢复到正常水平，显示与用注射PBS的小鼠所达到的含量无显著差异。感染Δ720ΔhemB的腺体的炎症反应随着细菌清除而恢复正常水平(图15。
实施例20：免疫接种Δ720GΔhemB产生针对若干金黄色葡萄球菌牛乳房内感染分离株的较强体液反应.
为了证实免疫接种活Δ720ΔhemB实际上可以产生使其适合用作针对金黄色葡萄球菌乳房内感染的推定的活毒疫苗的较强免疫反应，用不同剂量的活毒疫苗对小鼠免疫接种并分析结合至多种金黄色葡萄球菌牛分离株的全细胞提取物的血清总IgG。首先，在颈部中皮下投与106、 107及108CFU剂量，未在整个免疫接种时间段内引起不良作用，诸如小鼠行为改变或在免疫接种部位的炎症或坏死迹象。另外，使用递增量的活双重突变株ATCC29213Δ720ΔhemB免疫接种使针对其自身抗原的全细胞提取物的全身IgG抗体的效价增加(图15B)。免疫血清效价明显高于免疫前血清的效价，展示产生针对活毒疫苗中存在的金黄色葡萄球菌抗原的特异性抗体。最重要的是，使用递增量的Δ720ΔhemB免疫接种亦引起针对自牛乳腺炎分离的变种金黄色葡萄球菌菌株，包括在加拿大及世界其他地方发现的主要spa类型菌株的抗体效价随的升高(图15C)。这些结果清楚地显示，免疫接种双重突变株可以产生免疫反应，及(ii)菌株背景(ATCC 29213)与牛乳腺炎菌株共有足够的共同特征，使得该抗体反应亦很大程度上识别主要spa类型的菌株。
如根据所量测的针对完整细菌细胞提取物的总IgG效价较高判断，使用皮下注射存活Δ720ΔhemB免疫接种小鼠引起较强体液反应。另外，疫苗菌株Δ720ΔhemB与牛乳腺炎菌株具有足够的共同特征，使得该抗体反应亦很大程度上识别来自多种常见乳腺炎相关spa类型的菌株。
尽管此证实双重突变株背景(ATCC 29213)与牛乳腺炎菌株共有许多共同的特征，但若希望，则此类双重突变株可以在任何所希望的遗传背景下产生，特别是自牛乳腺炎分离的任何菌株，诸如(但不限于)金黄色葡萄球菌菌株RF122。
这些结果显示，具有某些残留细胞内能力的SCV菌株可以允许免疫细胞募集，但不产生严重感染。此类SCV菌株可以用作减毒活疫苗，充分地刺激免疫反应以对抗有细胞内能力的病原体。
实施例21：材料及方法-SACOL0442、SACOL0720、SACOL0029 以及SACOL1867与SACOL0029的间的融合物+减毒活细菌(疫苗#7)
制备抗原.如实施例6制备抗原一节中所描述来制备抗原，不过另外存在抗原SACOL0029。由GenScript,Inc.(Piscataway,NJ)对His标记的 SACOL0029的重组蛋白质进行工程改造及制造。(参见图21A第I项， his标记的序列)。
产生减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB.如实施例15(产生ΔhemBΔ720)中所描述来产生减毒活金黄色葡萄球菌菌株。
对小鼠免疫接种.在小鼠中评价由SACOL0442、SACOL0720、 SACOL0029基因以及SACOL0029及SACOL1867基因的融合物编码的重组金黄色葡萄球菌蛋白质与或不与减毒活细菌菌株金黄色葡萄球菌Δ720ΔhemB组合的免疫原性特性。在小鼠颈部皮下注射及大腿肌肉内注射的103、105、106、107及108CFU剂量具有良好耐受性。选择105剂量及皮下途径用于后续实验。
对于制备细菌接种物，在冰冷的PBS中洗涤预先在BHIA盘上生长的金黄色葡萄球菌Δ720ΔhemB菌落两次并将其再悬浮于含有15％甘油的PBS中，接着等分并保持在-80℃待用。为了获得对应于105CFU减毒细菌的最终小鼠免疫接种剂量，藉由将连续稀释液涂铺于BHIA上来评价冷冻接种物细菌浓度，并且接着在免疫接种当天，在PBS中将其稀释至105CFU/ml的最终浓度。
对于制备蛋白质剂量，将SACOL0029、SACOL0442、 SACOL0720及SACOL0029-1867融合多肽混合并悬浮于PBS中，各自获得5μg最终剂量。将CD-1雌性小鼠随机分成3组：第1组(5只小鼠)接受混合蛋白质剂量(蛋白质混合物)；第2组(5只小鼠)接受减毒细菌 (Δ720ΔhemB)剂量(Δ720ΔhemB)；第3组(6只小鼠)接受混合蛋白质与减毒细菌的组合(组合)。在颈部以间隔两周方式两次皮下注射对CD-1雌性小鼠进行免疫接种。如先前所描述，在PBS中稀释蛋白质及细菌菌株剂量并以100μl最终体积投与每组小鼠。在整个实验性免疫接种期间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，在4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在- 20℃，以待后续分析。
藉由ELISA检测总IgG、IgG1及IgG2.如先前所描述且稍加修改 (Ster等人,Vet.Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对先前用于免疫接种的各抗原的血清总IgG、IgG1及IgG2。此外，亦检测针对葡萄球菌表面蛋白质ClfA的IgG以展示使用活菌株增强及平衡针对金黄色葡萄球菌的免疫反应的补充优势。用75μl各测试抗原(6.67 μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，Sigma Aldrich,Oakville,ON) 涂布NuncMaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester, NY)并在室温下培育隔夜。接着在37℃下，用含有5％脱脂奶粉的PBS 使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有3％牛奶及0.025％ TweenTM 20的PBS中的血清的四倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有0.05％TweenTM 20的PBS洗涤这些盘三次。接着将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。使用的二次抗体是在含有3％牛奶及0.025％TweenTM20的PBS分别以1/5000稀释的山羊抗小鼠IgG、IgG2a及IgG1(Jackson ImmunoResearchLaboratories Inc.,West Grove,PA)。在37℃下培育1小时随后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
统计分析.抗体效价及相关性的统计分析是使用GraphPad PrismTM v6.05进行。
实施例22：抗原融合物及与减毒活金黄色葡萄球菌菌株的组合在小鼠中诱导高抗体效价-疫苗#7
如实施例21中所描述，制备抗原及减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。如实施例21中所描述，对小鼠免疫接种并检测IgG。
图16中的结果显示，用SACOL0029-1867融合物免疫接种(当与其他抗原或与减毒活菌株共投与时)在小鼠中诱导较高特异性抗体反应。
实施例23：减毒活金黄色葡萄球菌菌株明显改善针对一些特异性抗原的抗体免疫反应-疫苗#7
如实施例21中所描述，制备抗原及减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。如实施例21中所描述，对小鼠免疫接种并检测IgG。
图17中的结果显示，相较于自仅用蛋白质混合物免疫接种的小鼠获得的IgG抗体，用减毒活菌株Δ720ΔhemB免疫接种使针对 SACOL0029抗原的特异性IgG抗体的产生明显增加。
实施例24：减毒活金黄色葡萄球菌菌株明显诱导另外针对金黄色葡萄球菌表面蛋白质的抗体效价-疫苗#7
如实施例21中所描述，制备抗原及减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。如实施例21中所描述，对小鼠免疫接种并检测IgG。
图18中的结果显示，相较于用仅由SACOL0029、SACOL0442、 SACOL0720及SACOL0029-1867构成的蛋白质混合物所实现的抗体产生，用减毒活菌株Δ720ΔhemB免疫接种(单独或当与多肽抗原共投与时) 使针对葡萄球菌表面蛋白质ClfA的特异性抗体的产生显著增加。
实施例25：减毒活金黄色葡萄球菌菌株明显平衡Th1Th2免疫反应- 疫苗#7
如实施例21中所描述，制备抗原及减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。
如先前所描述，在经疫苗接种小鼠的血清中检测针对SACOL0029- 1867融合蛋白的血清IgG2a及IgG1同型，并测定各小鼠的IgG2a比IgG1 效价比率。IgG2a同型与小鼠体内的Th1免疫反应相关，而IgG1是Th2 反应的标记物。如实施例5中所描述，如根据母牛的牛奶中相应体细胞 (SCC)含量或细菌计数(CFU)判断(图4C)，在母牛中诱导产生IgG2及牛奶中IgG2效价的程度与保护母牛免受金黄色葡萄球菌激发影响明显相关。
图19及20中所示的结果证实，在组合免疫接种疫苗(Δ720ΔhemB金黄色葡萄球菌与SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及 SACOL0029-1867一起投与)中包括减毒活菌株Δ720ΔhemB诱导的针对 SACOL0029-1867融合物及SACOL0029蛋白质的IgG2a/IgG1抗体比率明显高于用蛋白质混合物免疫接种(SACOL0029、SACOL0442、 SACOL0720及SACOL0029-1867)所见到的比率，引起明显更平衡的 Th1/Th2反应。
以上实施例21至25显示，即使藉由免疫接种呈蛋白质混合物组合物形式的不同抗原(包括例如SACOL0029-1867融合物)获得较强抗体反应，对小鼠免疫接种这些抗原与减毒活菌株的组合藉由诱导针对某些特定抗原(例如SACOL0029)的较高抗体效价、藉由产生针对其他葡萄球菌蛋白质(例如ClfA)的抗体及藉由达到针对与活菌株共投与的抗原更平衡的IgG2a/IgG1比率(较强Th1型反应的较佳标记物)，仍显著提高针对金黄色葡萄球菌的免疫反应。
实施例26：在金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中重组蛋白质的表达-疫苗#8、9、10等
将基因SACOL0442、SACOL0720、SACOL0029及/或 SACOL1867以及基因SACOL0029及SACOL1867(或其片段)的融合物 (例如大小为50AA或更多AA)(SACOL0029-SACOL1867)、SACOL720 及/或SACOL0442的片段(例如表位)的融合物(融合物720-720)(融合物 442-720)或基因或其片段的任何其他融合物，例如SACOL0029- SACOL0442、SACOL0029-SACOL0720、SACOL0029-SACOL0720- SACOL0442、SACOL0029-SACOL0720-SACOL1867、SACOL0029- SACOL1867-SACOL0442、SACOL0442-SACOL0029-SACOL0720、 SACOL0442-SACOL0029-SACOL0720、SACOL0442-SACOL1867- SACOL0720、SACOL0720-SACOL0442-SACOL1867、SACOL04029- SACOL1867-SACOL0720-SACOL0442，选殖至质粒 pCN36(Charpentier等人,2004)中，处于组成性启动子(来自质粒pCN40 的PblaZ)(Charpentier等人,2004)控制下并在金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中表达。预测本文中提出的某些蛋白质抗原是外毒素、肠毒素或超抗原(例如SACOL0442)或可用于针对宿主防御进行保护的蛋白质(例如SACOL0720)且可能干扰哺乳动物免疫系统及抗体产生，及/或在宿主体内显示一定毒性。尽管用本文所描述的疫苗组合物及调配物未观察到此类干扰，但对金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中表达的蛋白质或多肽进行修饰以使选殖的基因不补充其毒力可能是有用的。出于此类目的，可使用分子生物学技术使此类蛋白质活性所涉及的推定区域缺失或突变，同时不丧失免疫原性(Chang等人,2008)。该是申请人用于制备本发明的疫苗组合物的抗原的方法。
藉由LC-MS/MS分析验证带有这些构筑表达载体的一的金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中每一种的个别重组蛋白产物的表达。简言之，对在含15μg/ml四环素的BHI中生长至对数中期的菌株离心且用乙醇使集结粒失活。样品保持在-20℃，直至进行细胞溶解及胰蛋白酶消化程序。在37℃下，将样品与溶葡球菌酶及胰蛋白酶一起培育，随后藉由使用玻璃珠及珠磨器以机械方式均质化来破坏细胞。接着在4℃下以13 000rpm将溶解产物离心25分钟以便移除细胞碎片，随后用胰蛋白酶消化蛋白质，藉由标准程序进行还原及烷基化，接着注射样品以使用LC- MS/MS的MRM方法检测蛋白质。
或者，亦藉由细菌溶解产物西方墨点确定重组蛋白的表达。
实施例27：用表达抗原的减毒菌株免疫接种小鼠-疫苗#8等
以间隔两周方式两次皮下注射对CD-1雌性小鼠疫苗进行接种。在生理食盐水中稀释带有或未带有这些构筑表达载体的一的金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中的每一种并以每剂100μl最终体积投与。第1组仅接受双重突变株；第2组接受表达融合物SACOL0029-1867的双重突变株；第3组接受表达融合物SACOL0029-0442的双重突变株；第4组接受表达融合物SACOL0029-0720的双重突变株；第5组接受双重突变株的混合物，一种表达融合物SACOL0029-1867且另一种表达融合物 SACOL0029-0442；第6组接受双重突变株的混合物，一种表达融合物 SACOL0029-1867且另一种表达融合物SACOL0029-0720；及第7组接受双重突变株的混合物。在即将第一次注射之前及在第二次注射之后十二天取得血液样品。使样品在室温下凝结一小时，接着在4℃下以2000 g离心10分钟。收集上清液(血清)并保持在-20℃，以待后续分析。在第 27天对小鼠实施安乐死并藉由心脏穿刺收集血液。回收免疫血清，等分并储存作为免疫前血清。
藉由酶联结免疫吸附分析法(ELISA)关于针对金黄色葡萄球菌完整细胞(Wood株)或特定重组蛋白质的血清多株IgG抗体的存在评价针对疫苗接种的免疫反应。使用抗小鼠IgG-HRP(HRP：辣根过氧化酶)作为二次抗体，使用分光亮度计检测由过氧化酶活性氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)受质产生的色度。
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<141> 2017-10-20
<150> 62/411,120
<151> 2016-10-21
<160> 196
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 1
Lys Asp Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln
1 5 10 15
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 2
Gly Glu His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile Asn Thr Lys Asp Gly
1 5 10 15
Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Lys Asp Arg Glu
20 25 30
Asn Val Lys Ile Asn Thr Ala Asp
35 40
<210> 3
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
Lys Asp Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr
20 25 30
Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp
35 40 45
<210> 4
<211> 168
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 4
atgctagaat ctagagagca attatcagtc gaagaatacg aaacattctt taacagattt 60
gataatcaag aatttgattt cgaacgtgaa ttgacacaag atccatattc aaaagtatac 120
ttatacagta tagaagacca tatcagaaca tataagatag agaaataa 168
<210> 5
<211> 55
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 5
Met Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr Phe
1 5 10 15
Phe Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu Thr
20 25 30
Gln Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His Ile
35 40 45
Arg Thr Tyr Lys Ile Glu Lys
50 55
<210> 6
<211> 165
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 6
ctagaatcta gagagcaatt atcagtcgaa gaatacgaaa cattctttaa cagatttgat 60
aatcaagaat ttgatttcga acgtgaattg acacaagatc catattcaaa agtatactta 120
tacagtatag aagaccatat cagaacatat aagatagaga aataa 165
<210> 7
<211> 54
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 7
Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr Phe Phe
1 5 10 15
Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu Thr Gln
20 25 30
Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His Ile Arg
35 40 45
Thr Tyr Lys Ile Glu Lys
50
<210> 8
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 8
Met His His His His His His Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Glu Thr Phe Phe Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp
20 25 30
Phe Glu Arg Glu Leu Thr Gln Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr
35 40 45
Ser Ile Glu Asp His Ile Arg Thr Tyr Lys Ile Glu Lys
50 55 60
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 9
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Leu Glu Ser Arg
1 5 10 15
Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr Phe Phe Asn Arg Phe Asp
20 25 30
Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu Thr Gln Asp Pro Tyr Ser
35 40 45
Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His Ile Arg Thr Tyr Lys Ile
50 55 60
Glu Lys
65
<210> 10
<211> 1889
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 10
atgaccttta acgagataat atttaaaaat ttccgtcaaa atttatcaca ttatgccatc 60
tatctttttt cgttaattac gagtgtagta ttgtatttta gctttgtagc attaaaatac 120
gctcataaac taaacatgac agagtcatat ccaattataa aggaaggctc acaagtcgga 180
agctactttc tatttttcat cataattgca tttttgttat atgccaatgt gttatttatt 240
aaacgacgaa gttatgagct tgcattatat caaacattag gtttatctaa attcaacatt 300
atttatatac taatgctcga acaattacta atatttataa ttacggcaat attaggtatt 360
attattggta tttttggttc gaaactgtta ttaatgattg tctttacatt attaggaatt 420
aaagaaaagg ttccaattat ttttagtttg agggcggtat ttgaaacatt aatgttaatc 480
ggtgtcgctt attttttaac atctgctcaa aattttatat tagtgttcaa acaatctatt 540
tcacagatgt caaagaataa ccaggttaaa gaaacaaatc ataataaaat tacatttgaa 600
gaggttgttt taggcatctt aggtatagta ttgattacca caggatacta tctatctttg 660
aacattgttc aatattatga ttctatcggt acacttatgt ttattttatt gtcaactgtg 720
attggggcat acttattttt taaaagctct gtttctctag tttttaaaat ggtgaagaag 780
tttagaaaag gtgttataag tgtaaatgat gtcatgttct catcatctat tatgtatcgt 840
attaagaaaa atgctttttc acttacggtc atggcaatca tttcagcgat tactgtttca 900
gttctttgct ttgctgctat aagtagagcg tccttatcaa gtgaaataaa atatactgca 960
ccacacgacg ttacaattaa agaccaacaa aaagctaatc aattagcaag tgaattaaac 1020
aatcaaaaaa ttcctcattt ttataattat aaagaagtaa ttcatacgaa attgtataaa 1080
gataatttat ttgatgtaaa agcgaaagaa ccatacaatg taacaattac tagtgataaa 1140
tacatcccta atactgattt gaaacgtggg caagctgatt tatttgtagc ggaaggttct 1200
atcaaagatt tagtgaaaca taagaagcat ggtaaggcaa ttataggaac gaaaaaacat 1260
catgttaata ttaagttacg taaagatatt aataaaatct attttatgac agatgttgat 1320
ttaggtggac caacgtttgt cttaaatgac aaagactatc aagaaataag aaagtataca 1380
aaggcaaagc atatcgtctc tcaatttgga ttcgatttga aacataaaaa agatgcttta 1440
gcattagaaa aagcgaaaaa taaagttgat aaatctattg aaacaagaag tgaagcgata 1500
agctcaatat caagtttaac cggaatatta ttatttgtaa catcattttt aggtattaca 1560
ttcttgattg ctgtatgttg cattatatac ataaagcaaa tagatgaaac cgaagatgag 1620
ttagagaatt atagtatttt gagaaagctt ggatttacac aaaaagatat ggcaagggga 1680
ctaaagttta aaattatgtt taattttggg ttacctttag ttattgcact atcacatgca 1740
tattttacat cattagcata tatgaaatta atgggtacaa cgaatcaaat accggttttc 1800
atagtaatgg gattatacat ttgtatgtat gctgtttttg cagtgacggc ttataatcat 1860
tccaagcgaa cattagacat tccatataa 1889
<210> 11
<211> 629
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 11
Met Thr Phe Asn Glu Ile Ile Phe Lys Asn Phe Arg Gln Asn Leu Ser
1 5 10 15
His Tyr Ala Ile Tyr Leu Phe Ser Leu Ile Thr Ser Val Val Leu Tyr
20 25 30
Phe Ser Phe Val Ala Leu Lys Tyr Ala His Lys Leu Asn Met Thr Glu
35 40 45
Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser Tyr Phe Leu
50 55 60
Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val Leu Phe Ile
65 70 75 80
Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ser
85 90 95
Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu Leu Ile Phe
100 105 110
Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe Gly Ser Lys
115 120 125
Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys Glu Lys Val
130 135 140
Pro Ile Ile Phe Ser Leu Arg Ala Val Phe Glu Thr Leu Met Leu Ile
145 150 155 160
Gly Val Ala Tyr Phe Leu Thr Ser Ala Gln Asn Phe Ile Leu Val Phe
165 170 175
Lys Gln Ser Ile Ser Gln Met Ser Lys Asn Asn Gln Val Lys Glu Thr
180 185 190
Asn His Asn Lys Ile Thr Phe Glu Glu Val Val Leu Gly Ile Leu Gly
195 200 205
Ile Val Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Ile Val Gln
210 215 220
Tyr Tyr Asp Ser Ile Gly Thr Leu Met Phe Ile Leu Leu Ser Thr Val
225 230 235 240
Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Phe Lys Ser Ser Val Ser Leu Val Phe Lys
245 250 255
Met Val Lys Lys Phe Arg Lys Gly Val Ile Ser Val Asn Asp Val Met
260 265 270
Phe Ser Ser Ser Ile Met Tyr Arg Ile Lys Lys Asn Ala Phe Ser Leu
275 280 285
Thr Val Met Ala Ile Ile Ser Ala Ile Thr Val Ser Val Leu Cys Phe
290 295 300
Ala Ala Ile Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys Tyr Thr Ala
305 310 315 320
Pro His Asp Val Thr Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn Gln Leu Ala
325 330 335
Ser Glu Leu Asn Asn Gln Lys Ile Pro His Phe Tyr Asn Tyr Lys Glu
340 345 350
Val Ile His Thr Lys Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp Val Lys Ala
355 360 365
Lys Glu Pro Tyr Asn Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Tyr Ile Pro Asn
370 375 380
Thr Asp Leu Lys Arg Gly Gln Ala Asp Leu Phe Val Ala Glu Gly Ser
385 390 395 400
Ile Lys Asp Leu Val Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala Ile Ile Gly
405 410 415
Thr Lys Lys His His Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp Ile Asn Lys
420 425 430
Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu
435 440 445
Asn Asp Lys Asp Tyr Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Thr Lys Ala Lys His
450 455 460
Ile Val Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp Ala Leu
465 470 475 480
Ala Leu Glu Lys Ala Lys Asn Lys Val Asp Lys Ser Ile Glu Thr Arg
485 490 495
Ser Glu Ala Ile Ser Ser Ile Ser Ser Leu Thr Gly Ile Leu Leu Phe
500 505 510
Val Thr Ser Phe Leu Gly Ile Thr Phe Leu Ile Ala Val Cys Cys Ile
515 520 525
Ile Tyr Ile Lys Gln Ile Asp Glu Thr Glu Asp Glu Leu Glu Asn Tyr
530 535 540
Ser Ile Leu Arg Lys Leu Gly Phe Thr Gln Lys Asp Met Ala Arg Gly
545 550 555 560
Leu Lys Phe Lys Ile Met Phe Asn Phe Gly Leu Pro Leu Val Ile Ala
565 570 575
Leu Ser His Ala Tyr Phe Thr Ser Leu Ala Tyr Met Lys Leu Met Gly
580 585 590
Thr Thr Asn Gln Ile Pro Val Phe Ile Val Met Gly Leu Tyr Ile Cys
595 600 605
Met Tyr Ala Val Phe Ala Val Thr Ala Tyr Asn His Ser Lys Arg Thr
610 615 620
Ile Arg His Ser Ile
625
<210> 12
<211> 200
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 12
Arg Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys Tyr Thr Ala Pro His Asp Val
1 5 10 15
Thr Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn Gln Leu Ala Ser Glu Leu Asn
20 25 30
Asn Gln Lys Ile Pro His Phe Tyr Asn Tyr Lys Glu Val Ile His Thr
35 40 45
Lys Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp Val Lys Ala Lys Glu Pro Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Tyr Ile Pro Asn Thr Asp Leu Lys
65 70 75 80
Arg Gly Gln Ala Asp Leu Phe Val Ala Glu Gly Ser Ile Lys Asp Leu
85 90 95
Val Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala Ile Ile Gly Thr Lys Lys His
100 105 110
His Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met
115 120 125
Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp
130 135 140
Tyr Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Thr Lys Ala Lys His Ile Val Ser Gln
145 150 155 160
Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp Ala Leu Ala Leu Glu Lys
165 170 175
Ala Lys Asn Lys Val Asp Lys Ser Ile Glu Thr Arg Ser Glu Ala Ile
180 185 190
Ser Ser Ile Ser Ser Leu Thr Gly
195 200
<210> 13
<211> 199
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 13
Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys Tyr Thr Ala Pro His Asp Val Thr
1 5 10 15
Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn Gln Leu Ala Ser Glu Leu Asn Asn
20 25 30
Gln Lys Ile Pro His Phe Tyr Asn Tyr Lys Glu Val Ile His Thr Lys
35 40 45
Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp Val Lys Ala Lys Glu Pro Tyr Asn
50 55 60
Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Tyr Ile Pro Asn Thr Asp Leu Lys Arg
65 70 75 80
Gly Gln Ala Asp Leu Phe Val Ala Glu Gly Ser Ile Lys Asp Leu Val
85 90 95
Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala Ile Ile Gly Thr Lys Lys His His
100 105 110
Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr
115 120 125
Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr
130 135 140
Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Thr Lys Ala Lys His Ile Val Ser Gln Phe
145 150 155 160
Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp Ala Leu Ala Leu Glu Lys Ala
165 170 175
Lys Asn Lys Val Asp Lys Ser Ile Glu Thr Arg Ser Glu Ala Ile Ser
180 185 190
Ser Ile Ser Ser Leu Thr Gly
195
<210> 14
<211> 146
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 14
Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys Tyr Thr Ala Pro His Asp Val Thr
1 5 10 15
Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn Gln Leu Ala Ser Glu Leu Asn Asn
20 25 30
Gln Lys Ile Pro His Phe Tyr Asn Tyr Lys Glu Val Ile His Thr Lys
35 40 45
Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp Val Lys Ala Lys Glu Pro Tyr Asn
50 55 60
Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Tyr Ile Pro Asn Thr Asp Leu Lys Arg
65 70 75 80
Gly Gln Ala Asp Leu Phe Val Ala Glu Gly Ser Ile Lys Asp Leu Val
85 90 95
Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala Ile Ile Gly Thr Lys Lys His His
100 105 110
Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr
115 120 125
Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr
130 135 140
Gln Glu
145
<210> 15
<211> 54
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 15
Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr Gln Glu Ile Arg Lys Tyr
20 25 30
Thr Lys Ala Lys His Ile Val Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His
35 40 45
Lys Lys Asp Ala Leu Ala
50
<210> 16
<211> 25
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 16
Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp
20 25
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 17
Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr
20 25
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 18
Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 19
Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp
20
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 20
Lys His Ile Val Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp
1 5 10 15
Ala Leu Ala
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 21
Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 22
Thr Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn Gln Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 23
Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 24
Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp
1 5 10
<210> 25
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 25
Met His His His His His His Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys Tyr
1 5 10 15
Thr Ala Pro His Asp Val Thr Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn Gln
20 25 30
Leu Ala Ser Glu Leu Asn Asn Gln Lys Ile Pro His Phe Tyr Asn Tyr
35 40 45
Lys Glu Val Ile His Thr Lys Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp Val
50 55 60
Lys Ala Lys Glu Pro Tyr Asn Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Tyr Ile
65 70 75 80
Pro Asn Thr Asp Leu Lys Arg Gly Gln Ala Asp Leu Phe Val Ala Glu
85 90 95
Gly Ser Ile Lys Asp Leu Val Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala Ile
100 105 110
Ile Gly Thr Lys Lys His His Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp Ile
115 120 125
Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe
130 135 140
Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr Gln Glu
145 150
<210> 26
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Ser Leu Ser
1 5 10 15
Ser Glu Ile Lys Tyr Thr Ala Pro His Asp Val Thr Ile Lys Asp Gln
20 25 30
Gln Lys Ala Asn Gln Leu Ala Ser Glu Leu Asn Asn Gln Lys Ile Pro
35 40 45
His Phe Tyr Asn Tyr Lys Glu Val Ile His Thr Lys Leu Tyr Lys Asp
50 55 60
Asn Leu Phe Asp Val Lys Ala Lys Glu Pro Tyr Asn Val Thr Ile Thr
65 70 75 80
Ser Asp Lys Tyr Ile Pro Asn Thr Asp Leu Lys Arg Gly Gln Ala Asp
85 90 95
Leu Phe Val Ala Glu Gly Ser Ile Lys Asp Leu Val Lys His Lys Lys
100 105 110
His Gly Lys Ala Ile Ile Gly Thr Lys Lys His His Val Asn Ile Lys
115 120 125
Leu Arg Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu
130 135 140
Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr Gln Glu
145 150 155
<210> 27
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr Glu Arg Lys Tyr Lys Lys
20 25 30
His Ile Val Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp Ala
35 40 45
Leu Ala
50
<210> 28
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 28
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attacaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agcaaggata caataaatgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtatacat 300
ttagaaggaa catacacagt tgctggcaga gtgtatacac ctaagaggaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaagaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttcc 420
tatggcttgt atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggtggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 29
<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 29
Met Phe Lys Lys Tyr Asp Ser Lys Asn Ser Ile Val Leu Lys Ser Ile
1 5 10 15
Leu Ser Leu Gly Ile Ile Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Pro Lys
20 25 30
Ala Asp Ala Ser Thr Gln Asn Ser Ser Ser Val Gln Asp Lys Gln Leu
35 40 45
Gln Lys Val Glu Glu Val Pro Asn Asn Ser Glu Lys Ala Leu Val Lys
50 55 60
Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Ser Lys Asp Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn
65 70 75 80
Lys Ser Arg Asn Trp Val Tyr Ser Glu Arg Pro Leu Asn Glu Asn Gln
85 90 95
Val Arg Ile His Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Val Ala Gly Arg Val Tyr
100 105 110
Thr Pro Lys Arg Asn Ile Thr Leu Asn Lys Glu Val Val Thr Leu Lys
115 120 125
Glu Leu Asp His Ile Ile Arg Phe Ala His Ile Ser Tyr Gly Leu Tyr
130 135 140
Met Gly Glu His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile Asn Thr Lys Asp
145 150 155 160
Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Lys Asp Arg
165 170 175
Glu Asn Val Lys Ile Asn Thr Ala Asp Ile Lys Asn Val Thr Phe Lys
180 185 190
Leu Val Lys Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
195 200
<210> 30
<211> 168
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 30
Ser Thr Gln Asn Ser Ser Ser Val Gln Asp Lys Gln Leu Gln Lys Val
1 5 10 15
Glu Glu Val Pro Asn Asn Ser Glu Lys Ala Leu Val Lys Lys Leu Tyr
20 25 30
Asp Arg Tyr Ser Lys Asp Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn Lys Ser Arg
35 40 45
Asn Trp Val Tyr Ser Glu Arg Pro Leu Asn Glu Asn Gln Val Arg Ile
50 55 60
His Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Val Ala Gly Arg Val Tyr Thr Pro Lys
65 70 75 80
Arg Asn Ile Thr Leu Asn Lys Glu Val Val Thr Leu Lys Glu Leu Asp
85 90 95
His Ile Ile Arg Phe Ala His Ile Ser Tyr Gly Leu Tyr Met Gly Glu
100 105 110
His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile Asn Thr Lys Asp Gly Gly Lys
115 120 125
Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Lys Asp Arg Glu Asn Val
130 135 140
Lys Ile Asn Thr Ala Asp Ile Lys Asn Val Thr Phe Lys Leu Val Lys
145 150 155 160
Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
165
<210> 31
<211> 116
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 31
Gln Asp Lys Gln Leu Gln Lys Val Glu Glu Val Pro Asn Asn Ser Glu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Val Lys Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Ser Lys Asp Thr Ile
20 25 30
Asn Gly Lys Ser Asn Lys Ser Arg Asn Trp Val Tyr Ser Glu Arg Pro
35 40 45
Leu Asn Glu Asn Gln Val Arg Ile His Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Val
50 55 60
Ala Gly Arg Val Tyr Thr Pro Lys Arg Asn Ile Thr Leu Asn Lys Glu
65 70 75 80
Val Val Thr Leu Lys Glu Leu Asp His Ile Ile Arg Phe Ala His Ile
85 90 95
Ser Tyr Gly Leu Tyr Met Gly Glu His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val
100 105 110
Ile Asn Thr Lys
115
<210> 32
<211> 115
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 32
Asp Lys Gln Leu Gln Lys Val Glu Glu Val Pro Asn Asn Ser Glu Lys
1 5 10 15
Ala Leu Val Lys Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Ser Lys Asp Thr Ile Asn
20 25 30
Gly Lys Ser Asn Lys Ser Arg Asn Trp Val Tyr Ser Glu Arg Pro Leu
35 40 45
Asn Glu Asn Gln Val Arg Ile His Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Val Ala
50 55 60
Gly Arg Val Tyr Thr Pro Lys Arg Asn Ile Thr Leu Asn Lys Glu Val
65 70 75 80
Val Thr Leu Lys Glu Leu Asp His Ile Ile Arg Phe Ala His Ile Ser
85 90 95
Tyr Gly Leu Tyr Met Gly Glu His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile
100 105 110
Asn Thr Lys
115
<210> 33
<211> 159
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 33
Asp Lys Gln Leu Gln Lys Val Glu Glu Val Pro Asn Asn Ser Glu Lys
1 5 10 15
Ala Leu Val Lys Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Ser Lys Asp Thr Ile Asn
20 25 30
Gly Lys Ser Asn Lys Ser Arg Asn Trp Val Tyr Ser Glu Arg Pro Leu
35 40 45
Asn Glu Asn Gln Val Arg Ile His Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Val Ala
50 55 60
Gly Arg Val Tyr Thr Pro Lys Arg Asn Ile Thr Leu Asn Lys Glu Val
65 70 75 80
Val Thr Leu Lys Glu Leu Asp His Ile Ile Arg Phe Ala His Ile Ser
85 90 95
Tyr Gly Leu Tyr Met Gly Glu His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile
100 105 110
Asn Thr Lys Asp Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu
115 120 125
Gln Lys Asp Arg Glu Asn Val Lys Ile Asn Thr Ala Asp Ile Lys Asn
130 135 140
Val Thr Phe Lys Leu Val Lys Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
145 150 155
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 34
Lys Asp Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn Lys Ser Arg Asn Trp
1 5 10
<210> 35
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 35
Met His His His His His His Asp Lys Gln Leu Gln Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Val Pro Asn Asn Ser Glu Lys Ala Leu Val Lys Lys Leu Tyr Asp Arg
20 25 30
Tyr Ser Lys Asp Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn Lys Ser Arg Asn Trp
35 40 45
Val Tyr Ser Glu Arg Pro Leu Asn Glu Asn Gln Val Arg Ile His Leu
50 55 60
Glu Gly Thr Tyr Thr Val Ala Gly Arg Val Tyr Thr Pro Lys Arg Asn
65 70 75 80
Ile Thr Leu Asn Lys Glu Val Val Thr Leu Lys Glu Leu Asp His Ile
85 90 95
Ile Arg Phe Ala His Ile Ser Tyr Gly Leu Tyr Met Gly Glu His Leu
100 105 110
Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile Asn Thr Lys Asp Gly Gly Lys Tyr Thr
115 120 125
Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Lys Asp Arg Glu Asn Val Lys Ile
130 135 140
Asn Thr Ala Asp Ile Lys Asn Val Thr Phe Lys Leu Val Lys Ser Val
145 150 155 160
Asn Asp Ile Glu Gln Val
165
<210> 36
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 36
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Lys Gln Leu
1 5 10 15
Gln Lys Val Glu Glu Val Pro Asn Asn Ser Glu Lys Ala Leu Val Lys
20 25 30
Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Ser Lys Asp Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn
35 40 45
Lys Ser Arg Asn Trp Val Tyr Ser Glu Arg Pro Leu Asn Glu Asn Gln
50 55 60
Val Arg Ile His Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Val Ala Gly Arg Val Tyr
65 70 75 80
Thr Pro Lys Arg Asn Ile Thr Leu Asn Lys Glu Val Val Thr Leu Lys
85 90 95
Glu Leu Asp His Ile Ile Arg Phe Ala His Ile Ser Tyr Gly Leu Tyr
100 105 110
Met Gly Glu His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile Asn Thr Lys Asp
115 120 125
Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Lys Asp Arg
130 135 140
Glu Asn Val Lys Ile Asn Thr Ala Asp Ile Lys Asn Val Thr Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Lys Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
165 170
<210> 37
<211> 720
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 37
atgaataaaa atatagtcat taaaagcatg gcagcattag ccattctaac ctcagtaact 60
ggaataaatg ctgcagtcgt tgaagagaca caacaaatag caaatgcaga gaagaatgtt 120
acgcaagtta aagatacaaa tatttttcca tataatggcg tcgtttcatt taaagatgcg 180
acaggttttg taattggaaa aaatacaatt atcaccaata aacatgtatc aaaagattat 240
aaagttggcg atagaattac tgcccatcca aacggtgaca aaggaaatgg tggtatatat 300
aaaattaaaa gcatttctga ttatccgggt gatgaagaca tctctgtcat gaatattgaa 360
gaacaagcag tcgaacgtgg accaaaaggc tttaatttta atgaaaatgt ccaagcattc 420
aattttgcga aagatgctaa agttgatgac aaaattaaag ttattggtta cccattacct 480
gctcaaaata gttttaaaca gtttgaatct acaggaacta taaaaagaat caaagacaat 540
attttaaatt ttgatgcata cattgaaccc gggaattcag gatcaccagt tctaaattct 600
aacaatgagg tcataggtgt ggtgtatggc ggtattggaa aaattggttc tgaatataat 660
ggtgccgtat actttacgcc tcaaatcaaa gattttattc aaaagcacat tgaacaataa 720
<210> 38
<211> 239
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 38
Met Asn Lys Asn Ile Val Ile Lys Ser Met Ala Ala Leu Ala Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ser Val Thr Gly Ile Asn Ala Ala Val Val Glu Glu Thr Gln Gln
20 25 30
Ile Ala Asn Ala Glu Lys Asn Val Thr Gln Val Lys Asp Thr Asn Ile
35 40 45
Phe Pro Tyr Asn Gly Val Val Ser Phe Lys Asp Ala Thr Gly Phe Val
50 55 60
Ile Gly Lys Asn Thr Ile Ile Thr Asn Lys His Val Ser Lys Asp Tyr
65 70 75 80
Lys Val Gly Asp Arg Ile Thr Ala His Pro Asn Gly Asp Lys Gly Asn
85 90 95
Gly Gly Ile Tyr Lys Ile Lys Ser Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Asp Glu
100 105 110
Asp Ile Ser Val Met Asn Ile Glu Glu Gln Ala Val Glu Arg Gly Pro
115 120 125
Lys Gly Phe Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala Phe Asn Phe Ala Lys
130 135 140
Asp Ala Lys Val Asp Asp Lys Ile Lys Val Ile Gly Tyr Pro Leu Pro
145 150 155 160
Ala Gln Asn Ser Phe Lys Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Ile Lys Arg
165 170 175
Ile Lys Asp Asn Ile Leu Asn Phe Asp Ala Tyr Ile Glu Pro Gly Asn
180 185 190
Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Ser Asn Asn Glu Val Ile Gly Val Val
195 200 205
Tyr Gly Gly Ile Gly Lys Ile Gly Ser Glu Tyr Asn Gly Ala Val Tyr
210 215 220
Phe Thr Pro Gln Ile Lys Asp Phe Ile Gln Lys His Ile Glu Gln
225 230 235
<210> 39
<211> 199
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 39
Thr Gln Val Lys Asp Thr Asn Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Val Val Ser
1 5 10 15
Phe Lys Asp Ala Thr Gly Phe Val Ile Gly Lys Asn Thr Ile Ile Thr
20 25 30
Asn Lys His Val Ser Lys Asp Tyr Lys Val Gly Asp Arg Ile Thr Ala
35 40 45
His Pro Asn Gly Asp Lys Gly Asn Gly Gly Ile Tyr Lys Ile Lys Ser
50 55 60
Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Ile Ser Val Met Asn Ile Glu
65 70 75 80
Glu Gln Ala Val Glu Arg Gly Pro Lys Gly Phe Asn Phe Asn Glu Asn
85 90 95
Val Gln Ala Phe Asn Phe Ala Lys Asp Ala Lys Val Asp Asp Lys Ile
100 105 110
Lys Val Ile Gly Tyr Pro Leu Pro Ala Gln Asn Ser Phe Lys Gln Phe
115 120 125
Glu Ser Thr Gly Thr Ile Lys Arg Ile Lys Asp Asn Ile Leu Asn Phe
130 135 140
Asp Ala Tyr Ile Glu Pro Gly Asn Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Ser
145 150 155 160
Asn Asn Glu Val Ile Gly Val Val Tyr Gly Gly Ile Gly Lys Ile Gly
165 170 175
Ser Glu Tyr Asn Gly Ala Val Tyr Phe Thr Pro Gln Ile Lys Asp Phe
180 185 190
Ile Gln Lys His Ile Glu Gln
195
<210> 40
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
Met His His His His His His Thr Gln Val Lys Asp Thr Asn Ile Phe
1 5 10 15
Pro Tyr Asn Gly Val Val Ser Phe Lys Asp Ala Thr Gly Phe Val Ile
20 25 30
Gly Lys Asn Thr Ile Ile Thr Asn Lys His Val Ser Lys Asp Tyr Lys
35 40 45
Val Gly Asp Arg Ile Thr Ala His Pro Asn Gly Asp Lys Gly Asn Gly
50 55 60
Gly Ile Tyr Lys Ile Lys Ser Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Asp Glu Asp
65 70 75 80
Ile Ser Val Met Asn Ile Glu Glu Gln Ala Val Glu Arg Gly Pro Lys
85 90 95
Gly Phe Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala Phe Asn Phe Ala Lys Asp
100 105 110
Ala Lys Val Asp Asp Lys Ile Lys Val Ile Gly Tyr Pro Leu Pro Ala
115 120 125
Gln Asn Ser Phe Lys Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Ile Lys Arg Ile
130 135 140
Lys Asp Asn Ile Leu Asn Phe Asp Ala Tyr Ile Glu Pro Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Pro Val Leu Asn Ser Asn Asn Glu Val Ile Gly Val Val Tyr
165 170 175
Gly Gly Ile Gly Lys Ile Gly Ser Glu Tyr Asn Gly Ala Val Tyr Phe
180 185 190
Thr Pro Gln Ile Lys Asp Phe Ile Gln Lys His Ile Glu Gln
195 200 205
<210> 41
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 41
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Thr Gln Val Lys
1 5 10 15
Asp Thr Asn Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Val Val Ser Phe Lys Asp Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Val Ile Gly Lys Asn Thr Ile Ile Thr Asn Lys His Val
35 40 45
Ser Lys Asp Tyr Lys Val Gly Asp Arg Ile Thr Ala His Pro Asn Gly
50 55 60
Asp Lys Gly Asn Gly Gly Ile Tyr Lys Ile Lys Ser Ile Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Pro Gly Asp Glu Asp Ile Ser Val Met Asn Ile Glu Glu Gln Ala Val
85 90 95
Glu Arg Gly Pro Lys Gly Phe Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala Phe
100 105 110
Asn Phe Ala Lys Asp Ala Lys Val Asp Asp Lys Ile Lys Val Ile Gly
115 120 125
Tyr Pro Leu Pro Ala Gln Asn Ser Phe Lys Gln Phe Glu Ser Thr Gly
130 135 140
Thr Ile Lys Arg Ile Lys Asp Asn Ile Leu Asn Phe Asp Ala Tyr Ile
145 150 155 160
Glu Pro Gly Asn Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Ser Asn Asn Glu Val
165 170 175
Ile Gly Val Val Tyr Gly Gly Ile Gly Lys Ile Gly Ser Glu Tyr Asn
180 185 190
Gly Ala Val Tyr Phe Thr Pro Gln Ile Lys Asp Phe Ile Gln Lys His
195 200 205
Ile Glu Gln
210
<210> 42
<211> 600
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 42
atggcaatga actttaaagt ctttgacaat agtcaacttg tagcagaata tgctgctgat 60
attattagaa agcaatttaa caataatcct actacaattg caggttttca tttagataca 120
gatcaagcgc cagttctaga tgaattaaag aaaaatgttg aaaaacatgc tgttgatttt 180
agccaaataa atattttaga ttatgacgat aaaaaatcat atttcgaagc gttaggtgta 240
ccagcaggtc aagtttatcc aattgcttat gaaaaagatg caatcgaatt aatcgctgat 300
aagattaaaa ctaaagaaaa taaagggaaa ttaacattac aagttgtttc tatcgatgag 360
caaggtaagt taaatgttag tattcgtcaa ggactaatgg aagcaagaga aattttctta 420
gtagtgacag gtgctaataa acgagatgta gttgaaaaat tatatcaaga aaatggtaaa 480
acaagcttcg aaccagccga tttaaaagca catagaatgg taaatgttat tcttgataaa 540
gaagcggctg caggtttacc tgaagatgtt aaagcttact ttacgtcacg ctttgcttaa 600
<210> 43
<211> 199
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 43
Met Ala Met Asn Phe Lys Val Phe Asp Asn Ser Gln Leu Val Ala Glu
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Asp Ile Ile Arg Lys Gln Phe Asn Asn Asn Pro Thr Thr
20 25 30
Ile Ala Gly Phe His Leu Asp Thr Asp Gln Ala Pro Val Leu Asp Glu
35 40 45
Leu Lys Lys Asn Val Glu Lys His Ala Val Asp Phe Ser Gln Ile Asn
50 55 60
Ile Leu Asp Tyr Asp Asp Lys Lys Ser Tyr Phe Glu Ala Leu Gly Val
65 70 75 80
Pro Ala Gly Gln Val Tyr Pro Ile Ala Tyr Glu Lys Asp Ala Ile Glu
85 90 95
Leu Ile Ala Asp Lys Ile Lys Thr Lys Glu Asn Lys Gly Lys Leu Thr
100 105 110
Leu Gln Val Val Ser Ile Asp Glu Gln Gly Lys Leu Asn Val Ser Ile
115 120 125
Arg Gln Gly Leu Met Glu Ala Arg Glu Ile Phe Leu Val Val Thr Gly
130 135 140
Ala Asn Lys Arg Asp Val Val Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Asn Gly Lys
145 150 155 160
Thr Ser Phe Glu Pro Ala Asp Leu Lys Ala His Arg Met Val Asn Val
165 170 175
Ile Leu Asp Lys Glu Ala Ala Ala Gly Leu Pro Glu Asp Val Lys Ala
180 185 190
Tyr Phe Thr Ser Arg Phe Ala
195
<210> 44
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
Met His His His His His His Met Ala Met Asn Phe Lys Val Phe Asp
1 5 10 15
Asn Ser Gln Leu Val Ala Glu Tyr Ala Ala Asp Ile Ile Arg Lys Gln
20 25 30
Phe Asn Asn Asn Pro Thr Thr Ile Ala Gly Phe His Leu Asp Thr Asp
35 40 45
Gln Ala Pro Val Leu Asp Glu Leu Lys Lys Asn Val Glu Lys His Ala
50 55 60
Val Asp Phe Ser Gln Ile Asn Ile Leu Asp Tyr Asp Asp Lys Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Phe Glu Ala Leu Gly Val Pro Ala Gly Gln Val Tyr Pro Ile Ala
85 90 95
Tyr Glu Lys Asp Ala Ile Glu Leu Ile Ala Asp Lys Ile Lys Thr Lys
100 105 110
Glu Asn Lys Gly Lys Leu Thr Leu Gln Val Val Ser Ile Asp Glu Gln
115 120 125
Gly Lys Leu Asn Val Ser Ile Arg Gln Gly Leu Met Glu Ala Arg Glu
130 135 140
Ile Phe Leu Val Val Thr Gly Ala Asn Lys Arg Asp Val Val Glu Lys
145 150 155 160
Leu Tyr Gln Glu Asn Gly Lys Thr Ser Phe Glu Pro Ala Asp Leu Lys
165 170 175
Ala His Arg Met Val Asn Val Ile Leu Asp Lys Glu Ala Ala Ala Gly
180 185 190
Leu Pro Glu Asp Val Lys Ala Tyr Phe Thr Ser Arg Phe Ala
195 200 205
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 45
Asp Ile Ile Arg Lys Gln Phe Asn Asn Asn Pro Thr Thr Ile
1 5 10
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 46
Tyr Phe Glu Ala Leu Gly Val Pro Ala Gly Gln Val Tyr Pro
1 5 10
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 47
Ala Asp Lys Ile Lys Thr Lys Glu Asn Lys Gly Lys Leu Thr
1 5 10
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 48
Gln Glu Asn Gly Lys Thr Ser Phe Glu Pro Ala Asp Leu Lys
1 5 10
<210> 49
<211> 429
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 49
atgatattga acttcaatca attcgagaat caaaactttt ttaacggtaa tccaagtgat 60
acatttaaag atttaggtaa acaagtattt aattactttt caacaccttc atttgtaacg 120
aatatatatg aaacagacga attatattac ttagaagctg aactagcagg tgtaaataaa 180
gaagatatta gtatcgattt caataataat acgctcacta ttcaagctac tagaagcgca 240
aaatacaaat ctgaacaact cattttagat gagcgtaact tcgaatcatt aatgcgtcaa 300
tttgattttg aagctgttga taagcaacat attactgcta gttttgaaaa tgggttatta 360
accattacct tgcctaaaat caaaccaagc aatgaaacta cttcatcaac atctattcca 420
atttcatag 429
<210> 50
<211> 93
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 50
Met Ile Leu Asn Phe Asn Gln Phe Glu Asn Gln Asn Phe Phe Asn Gly
1 5 10 15
Asn Pro Ser Asp Thr Phe Lys Asp Leu Gly Lys Gln Val Phe Asn Tyr
20 25 30
Phe Ser Thr Pro Ser Phe Val Thr Asn Ile Tyr Glu Thr Asp Glu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Leu Glu Ala Glu Leu Ala Gly Val Asn Lys Glu Asp Ile Ser
50 55 60
Ile Asp Phe Asn Asn Asn Thr Leu Thr Ile Gln Ala Thr Arg Ser Ala
65 70 75 80
Lys Tyr Lys Ser Glu Gln Leu Ile Leu Asp Glu Arg Asn
85 90
<210> 51
<211> 100
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 51
Met His His His His His His Met Ile Leu Asn Phe Asn Gln Phe Glu
1 5 10 15
Asn Gln Asn Phe Phe Asn Gly Asn Pro Ser Asp Thr Phe Lys Asp Leu
20 25 30
Gly Lys Gln Val Phe Asn Tyr Phe Ser Thr Pro Ser Phe Val Thr Asn
35 40 45
Ile Tyr Glu Thr Asp Glu Leu Tyr Tyr Leu Glu Ala Glu Leu Ala Gly
50 55 60
Val Asn Lys Glu Asp Ile Ser Ile Asp Phe Asn Asn Asn Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Ala Thr Arg Ser Ala Lys Tyr Lys Ser Glu Gln Leu Ile Leu
85 90 95
Asp Glu Arg Asn
100
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 52
Asn Gly Asn Pro Ser Asp Thr Phe Lys Asp Leu Gly Lys Gln
1 5 10
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 53
Glu Asp Ile Ser Ile Asp Phe Asn Asn Asn Thr Leu Thr Ile
1 5 10
<210> 54
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 54
ctagaatcta gagagcaatt atcagtcgaa gaatacgaaa cattctttaa cagatttgat 60
aatcaagaat ttgatttcga acgtgaattg acacaagatc catattcaaa agtatactta 120
tacagtatag aagaccatat cagaacatat aagatagaga aaggaggtgg cggttcagga 180
ggtggaggat ctggaggcgg tggatcaacg caagttaaag atacaaatat ttttccatat 240
aatggcgtcg tttcatttaa agatgcgaca ggttttgtaa ttggaaaaaa tacaattatc 300
accaataaac atgtatcaaa agattataaa gttggcgata gaattactgc ccatccaaac 360
ggtgacaaag gaaatggtgg tatatataaa attaaaagca tttctgatta tccgggtgat 420
gaagacatct ctgtcatgaa tattgaagaa caagcagtcg aacgtggacc aaaaggcttt 480
aattttaatg aaaatgtcca agcattcaat tttgcgaaag atgctaaagt tgatgacaaa 540
attaaagtta ttggttaccc attacctgct caaaatagtt ttaaacagtt tgaatctaca 600
ggaactataa aaagaatcaa agacaatatt ttaaattttg atgcatacat tgaacccggg 660
aattcaggat caccagttct aaattctaac aatgaggtca taggtgtggt gtatggcggt 720
attggaaaaa ttggttctga atataatggt gccgtatact ttacgcctca aatcaaagat 780
tttattcaaa agcacattga acaataa 807
<210> 55
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 55
Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr Phe Phe
1 5 10 15
Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu Thr Gln
20 25 30
Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His Ile Arg
35 40 45
Thr Tyr Lys Ile Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gln Val Lys Asp Thr Asn Ile Phe Pro Tyr
65 70 75 80
Asn Gly Val Val Ser Phe Lys Asp Ala Thr Gly Phe Val Ile Gly Lys
85 90 95
Asn Thr Ile Ile Thr Asn Lys His Val Ser Lys Asp Tyr Lys Val Gly
100 105 110
Asp Arg Ile Thr Ala His Pro Asn Gly Asp Lys Gly Asn Gly Gly Ile
115 120 125
Tyr Lys Ile Lys Ser Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Ile Ser
130 135 140
Val Met Asn Ile Glu Glu Gln Ala Val Glu Arg Gly Pro Lys Gly Phe
145 150 155 160
Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala Phe Asn Phe Ala Lys Asp Ala Lys
165 170 175
Val Asp Asp Lys Ile Lys Val Ile Gly Tyr Pro Leu Pro Ala Gln Asn
180 185 190
Ser Phe Lys Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Ile Lys Arg Ile Lys Asp
195 200 205
Asn Ile Leu Asn Phe Asp Ala Tyr Ile Glu Pro Gly Asn Ser Gly Ser
210 215 220
Pro Val Leu Asn Ser Asn Asn Glu Val Ile Gly Val Val Tyr Gly Gly
225 230 235 240
Ile Gly Lys Ile Gly Ser Glu Tyr Asn Gly Ala Val Tyr Phe Thr Pro
245 250 255
Gln Ile Lys Asp Phe Ile Gln Lys His Ile Glu Gln
260 265
<210> 56
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 56
atgcaccacc accaccacca cctggaatcc cgtgaacaac tgtccgtcga agaatacgaa 60
accttcttta accgctttga taaccaagaa tttgatttcg aacgtgaact gacccaggat 120
ccgtattcta aagtgtatct gtacagtatc gaagatcata ttcgcacgta caaaatcgaa 180
aaaggcggtg gcggttctgg cggtggcggt agtggcggtg gcggtagcac ccaggtgaaa 240
gatacgaata tctttccgta taacggcgtg gtttctttta aagatgcgac cggcttcgtt 300
atcggtaaaa acaccatcat cacgaacaaa catgtgagca aagattacaa agttggcgat 360
cgtattaccg cccacccgaa tggcgataag ggtaacggcg gtatctacaa aatcaaaagc 420
atctctgatt acccgggtga tgaagatatc agcgtgatga atattgaaga acaggcagtt 480
gaacgcggcc cgaaaggttt taacttcaat gaaaacgttc aggcgtttaa tttcgcgaaa 540
gatgccaaag tggatgataa aatcaaagtt attggctatc cgctgccggc ccagaacagc 600
tttaaacagt tcgaatctac cggtacgatc aaacgtatca aagataacat cctgaacttc 660
gatgcatata ttgaaccggg caatagtggt agcccggtgc tgaacagtaa caatgaagtt 720
attggtgtgg tttatggcgg tatcggcaaa attggtagcg aatacaacgg tgctgtgtat 780
tttacgccgc agatcaaaga cttcatccag aaacatatcg aacaa 825
<210> 57
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 57
Met His His His His His His Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Glu Thr Phe Phe Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp
20 25 30
Phe Glu Arg Glu Leu Thr Gln Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr
35 40 45
Ser Ile Glu Asp His Ile Arg Thr Tyr Lys Ile Glu Lys Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gln Val Lys
65 70 75 80
Asp Thr Asn Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Val Val Ser Phe Lys Asp Ala
85 90 95
Thr Gly Phe Val Ile Gly Lys Asn Thr Ile Ile Thr Asn Lys His Val
100 105 110
Ser Lys Asp Tyr Lys Val Gly Asp Arg Ile Thr Ala His Pro Asn Gly
115 120 125
Asp Lys Gly Asn Gly Gly Ile Tyr Lys Ile Lys Ser Ile Ser Asp Tyr
130 135 140
Pro Gly Asp Glu Asp Ile Ser Val Met Asn Ile Glu Glu Gln Ala Val
145 150 155 160
Glu Arg Gly Pro Lys Gly Phe Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala Phe
165 170 175
Asn Phe Ala Lys Asp Ala Lys Val Asp Asp Lys Ile Lys Val Ile Gly
180 185 190
Tyr Pro Leu Pro Ala Gln Asn Ser Phe Lys Gln Phe Glu Ser Thr Gly
195 200 205
Thr Ile Lys Arg Ile Lys Asp Asn Ile Leu Asn Phe Asp Ala Tyr Ile
210 215 220
Glu Pro Gly Asn Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Ser Asn Asn Glu Val
225 230 235 240
Ile Gly Val Val Tyr Gly Gly Ile Gly Lys Ile Gly Ser Glu Tyr Asn
245 250 255
Gly Ala Val Tyr Phe Thr Pro Gln Ile Lys Asp Phe Ile Gln Lys His
260 265 270
Ile Glu Gln
275
<210> 58
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 58
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Leu Glu Ser Arg
1 5 10 15
Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr Phe Phe Asn Arg Phe Asp
20 25 30
Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu Thr Gln Asp Pro Tyr Ser
35 40 45
Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His Ile Arg Thr Tyr Lys Ile
50 55 60
Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Thr Gln Val Lys Asp Thr Asn Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Val Val
85 90 95
Ser Phe Lys Asp Ala Thr Gly Phe Val Ile Gly Lys Asn Thr Ile Ile
100 105 110
Thr Asn Lys His Val Ser Lys Asp Tyr Lys Val Gly Asp Arg Ile Thr
115 120 125
Ala His Pro Asn Gly Asp Lys Gly Asn Gly Gly Ile Tyr Lys Ile Lys
130 135 140
Ser Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Ile Ser Val Met Asn Ile
145 150 155 160
Glu Glu Gln Ala Val Glu Arg Gly Pro Lys Gly Phe Asn Phe Asn Glu
165 170 175
Asn Val Gln Ala Phe Asn Phe Ala Lys Asp Ala Lys Val Asp Asp Lys
180 185 190
Ile Lys Val Ile Gly Tyr Pro Leu Pro Ala Gln Asn Ser Phe Lys Gln
195 200 205
Phe Glu Ser Thr Gly Thr Ile Lys Arg Ile Lys Asp Asn Ile Leu Asn
210 215 220
Phe Asp Ala Tyr Ile Glu Pro Gly Asn Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn
225 230 235 240
Ser Asn Asn Glu Val Ile Gly Val Val Tyr Gly Gly Ile Gly Lys Ile
245 250 255
Gly Ser Glu Tyr Asn Gly Ala Val Tyr Phe Thr Pro Gln Ile Lys Asp
260 265 270
Phe Ile Gln Lys His Ile Glu Gln
275 280
<210> 59
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 59
ggaggtggcg gttcaggagg tggaggatct ggaggcggtg gatca 45
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 61
Glu Arg Lys Tyr Lys
1 5
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 62
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 63
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 64
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 65
Glu Arg Lys Tyr Lys Glu Arg Lys Tyr Lys
1 5 10
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 66
Glu Arg Lys Tyr Lys Glu Arg Lys Tyr Lys Glu Arg Lys Tyr Lys
1 5 10 15
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 68
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 69
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
1 5
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 70
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
1 5 10
<210> 71
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 71
atgttcaaaa aaaatgactc gaaaaattca attctattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
ccaagtgtac aagataaaca attccaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agccaaaata caataaacgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtataaat 300
ttagaaggaa catacagagt tgctgataga gtatatacac ctaagagaaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaggaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttct 420
tatggcttat atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggcggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 72
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 72
atgttcaaaa aaaatgactc gaaaaattca attctattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
ccaagtgtac aagataaaca attccaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agccaaaata caataaacgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtataaat 300
ttagaaggaa catacagagt tgctgataga gtatatacac ctaagagaaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaggaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttct 420
tatggcttat atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggcggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 73
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 73
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attacaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agcaaggata caataaatgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtatacat 300
ttagaaggaa catacacagt tgctggcaga gtgtatacac ctaagaggaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaagaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttcc 420
tatggcttgt atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggtggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 74
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 74
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attacaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agcaaggata caataaatgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtatacat 300
ttagaaggaa catacacagt tgctggcaga gtgtatacac ctaagaggaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaagaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttcc 420
tatggcttgt atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggtggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 75
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 75
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attacaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agcaaggata caataaatgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtatacat 300
ttagaaggaa catacacagt tgctggcaga gtgtatacac ctaagaggaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaagaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttcc 420
tatggcttgt atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggtggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 76
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 76
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attacaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agcaaggata caataaatgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtatacat 300
ttagaaggaa catacacagt tgctgataga gtatatacac ctaagagaaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaggaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttct 420
tatggcttat atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggcggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 77
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 77
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attacaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agcaaggata caataaatgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtatacat 300
ttagaaggaa catacacagt tgctgataga gtatatacac ctaagagaaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaggaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttct 420
tatggcttat atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggcggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 78
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 78
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attacaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agcaaggata caataaatgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtatacat 300
ttagaaggaa catacacagt tgctgataga gtatatacac ctaagagaaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaggaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttct 420
tatggcttat atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggcggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 79
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 79
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attacaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agcaaggata caataaatgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtatacat 300
ttagaaggaa catacacagt tgctgataga gtatatacac ctaagagaaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaggaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttct 420
tatggcttat atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggcggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 80
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 80
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attacaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaacttta cgatagatac agcaaggata caataaatgg aaaatctaat 240
aaatctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaaccaagt tcgtatacat 300
ttagaaggaa catacacagt tgctgataga gtatatacac ctaagagaaa tattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaggaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttct 420
tatggcttat atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaaagat 480
ggcggtaaat atacattaga gtcgcataaa gagctacaaa aagataggga aaatgtaaaa 540
attaatacag ccgatataaa aaatgtaact ttcaaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 81
<211> 612
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 81
atgttcaaaa aatatgactc aaaaaattca atcgtattaa aatctattct atcgctaggt 60
atcatctatg ggggaacatt tggaatatat ccaaaagcag acgcgtcaac acaaaattcc 120
tcaagtgtac aagataaaca attccaaaaa gttgaagaag taccaaataa ttcagaaaaa 180
gctttggtta aaaaactgta cgatagatac agccaaaata caataaacgg aaaatctaat 240
aaagctagga attgggttta ttcagagaga cctttaaatg aaaatcaagt tcgcatacat 300
ttagaaggta catacagagt tgctgataga gtgtatacac ctaagaggaa cattactctt 360
aataaagaag ttgtcacttt aaaagaattg gatcatatca taagatttgc tcatatttct 420
tatggcttat atatgggaga acatttgcct aaaggtaaca tcgtcataaa tacaaagaat 480
ggcggtaaat atacattaga gtcgcacaaa gagttacaaa agaataggga aaatgtagaa 540
attaatactg atgatataaa aaatgtaact ttcgaacttg tgaaaagtgt taatgacatt 600
gaacaagttt ga 612
<210> 82
<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 82
Met Phe Lys Lys Tyr Asp Ser Lys Asn Ser Ile Val Leu Lys Ser Ile
1 5 10 15
Leu Ser Leu Gly Ile Ile Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Pro Lys
20 25 30
Ala Asp Ala Ser Thr Gln Asn Ser Ser Ser Val Gln Asp Lys Gln Leu
35 40 45
Gln Lys Val Glu Glu Val Pro Asn Asn Ser Glu Lys Ala Leu Val Lys
50 55 60
Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Ser Lys Asp Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn
65 70 75 80
Lys Ser Arg Asn Trp Val Tyr Ser Glu Arg Pro Leu Asn Glu Asn Gln
85 90 95
Val Arg Ile His Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Val Ala Gly Arg Val Tyr
100 105 110
Thr Pro Lys Arg Asn Ile Thr Leu Asn Lys Glu Val Val Thr Leu Lys
115 120 125
Glu Leu Asp His Ile Ile Arg Phe Ala His Ile Ser Tyr Gly Leu Tyr
130 135 140
Met Gly Glu His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile Asn Thr Lys Asp
145 150 155 160
Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Lys Asp Arg
165 170 175
Glu Asn Val Lys Ile Asn Thr Ala Asp Ile Lys Asn Val Thr Phe Lys
180 185 190
Leu Val Lys Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
195 200
<210> 83
<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 83
Met Phe Lys Lys Tyr Asp Ser Lys Asn Ser Ile Val Leu Lys Ser Ile
1 5 10 15
Leu Ser Leu Gly Ile Ile Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Pro Lys
20 25 30
Ala Asp Ala Ser Thr Gln Asn Ser Ser Ser Val Gln Asp Lys Gln Leu
35 40 45
Gln Lys Val Glu Glu Val Pro Asn Asn Ser Glu Lys Ala Leu Val Lys
50 55 60
Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Ser Lys Asp Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn
65 70 75 80
Lys Ser Arg Asn Trp Val Tyr Ser Glu Arg Pro Leu Asn Glu Asn Gln
85 90 95
Val Arg Ile His Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Val Ala Gly Arg Val Tyr
100 105 110
Thr Pro Lys Arg Asn Ile Thr Leu Asn Lys Glu Val Val Thr Leu Lys
115 120 125
Glu Leu Asp His Ile Ile Arg Phe Ala His Ile Ser Tyr Gly Leu Tyr
130 135 140
Met Gly Glu His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile Asn Thr Lys Asp
145 150 155 160
Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Lys Asp Arg
165 170 175
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180 185 190
Leu Val Lys Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
195 200
<210> 84
<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 84
Met Phe Lys Lys Tyr Asp Ser Lys Asn Ser Ile Val Leu Lys Ser Ile
1 5 10 15
Leu Ser Leu Gly Ile Ile Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Pro Lys
20 25 30
Ala Asp Ala Ser Thr Gln Asn Ser Ser Ser Val Gln Asp Lys Gln Leu
35 40 45
Gln Lys Val Glu Glu Val Pro Asn Asn Ser Glu Lys Ala Leu Val Lys
50 55 60
Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Ser Lys Asp Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn
65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200
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<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 85
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20 25 30
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50 55 60
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<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 86
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Leu Val Lys Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
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<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 87
Met Phe Lys Lys Tyr Asp Ser Lys Asn Ser Ile Val Leu Lys Ser Ile
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Leu Ser Leu Gly Ile Ile Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Pro Lys
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<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 88
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Leu Ser Leu Gly Ile Ile Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Pro Lys
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100 105 110
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115 120 125
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<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 89
Met Phe Lys Lys Tyr Asp Ser Lys Asn Ser Ile Val Leu Lys Ser Ile
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Leu Ser Leu Gly Ile Ile Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Pro Lys
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50 55 60
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115 120 125
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Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Lys Asp Arg
165 170 175
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180 185 190
Leu Val Lys Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
195 200
<210> 90
<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 90
Met Phe Lys Lys Asn Asp Ser Lys Asn Ser Ile Leu Leu Lys Ser Ile
1 5 10 15
Leu Ser Leu Gly Ile Ile Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Pro Lys
20 25 30
Ala Asp Ala Ser Thr Gln Asn Ser Pro Ser Val Gln Asp Lys Gln Phe
35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Leu Val Lys Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
195 200
<210> 91
<211> 203
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 91
Met Phe Lys Lys Tyr Asp Ser Lys Asn Ser Ile Val Leu Lys Ser Ile
1 5 10 15
Leu Ser Leu Gly Ile Ile Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ile Tyr Pro Lys
20 25 30
Ala Asp Ala Ser Thr Gln Asn Ser Ser Ser Val Gln Asp Lys Gln Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Leu Val Lys Ser Val Asn Asp Ile Glu Gln Val
195 200
<210> 92
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(73)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(100)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(106)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(109)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (160)..(160)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (175)..(175)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (180)..(180)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (184)..(184)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (192)..(192)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (201)..(203)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 92
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65 70 75 80
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115 120 125
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180 185 190
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195 200
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 93
Gln Asn Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn Lys Ser Arg Asn Trp
1 5 10
<210> 94
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 94
Gln Asn Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn Lys Ala Arg Asn Trp
1 5 10
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 95
Lys Asn Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln
1 5 10 15
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 96
Xaa Xaa Thr Ile Asn Gly Lys Ser Asn Lys Xaa Arg Asn Trp
1 5 10
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 97
Lys Xaa Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln
1 5 10 15
<210> 98
<211> 1755
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 98
atgacagagt catatccaat tattaaggaa ggctcacaag tcggaagcta ctttctattt 60
ttcatcataa ttgcattttt gttatatgcc aatgtgttat ttattaaacg acgaagttat 120
gagcttgcat tatatcaaac attaggttta tctaaattca acattattta tatactaatg 180
ctcgaacaat tactaatatt tataattacg gcaatattag gtattattat tggtattttt 240
ggttcaaaac tgttattaat gattgtcttt acattattag gaattaaaga aaaggttcca 300
attattttta gtttgagggc ggtatttgaa acattaatgt taatcggtgt cgcttatttt 360
ttaacctctg ctcaaaattt tatattagtg ttcaaacaat ctatttcaca gatgtcaaag 420
aataaccagg ttaaagaaac aaatcataat aaaattacat ttgaagaggt tgttttaggc 480
atcttaggta tagtattgat tatcacagga tactatctat ctttgaacat tgttcaatat 540
tatgattcta tcggtatact tatgtttatt ttattgtcaa ctgtgattgg ggcatactta 600
ttttttaaaa gctctgtttc tctagttttt aaaatggtga agaagtttag aaaaggtgtt 660
ataagtgtaa atgatgtcat gttctcatca tctattatgt atcgtattaa gaaaaatgct 720
ttttcactta cggtcatggc aatcatttca gcgattactg tttcagttct ttgctttgct 780
gctataagta gagcgtcctt atcaagtgaa ataaaatata ctgcaccaca cgacgttaca 840
attaaagacc aacaaaaagc taatcaatta gcaagtgaat taaacaatca aaaaattcct 900
catttttata attataaaga agtaattcat acgaaattgt ataaagataa tttatttgat 960
gtaaaagcga aagaaccata caatgtaaca attactagtg ataaatatat ccctaatact 1020
gatttgaaac gtggacaagc tgatttgttt gtagcggaag gttctatcaa agatttagtg 1080
aaacataaga agcatggtaa ggcaattata ggaacgaaaa aacatcatgt taatattaag 1140
ttacggaaag atattaataa aatctatttt atgacagatg ttgatttagg tggaccaacg 1200
tttgtcttaa atgacaaaga ctatcaagaa ataagaaagt atacaaaagc aaagcatatc 1260
gtctctcaat ttggattcga tttgaaacat aaaaaagatg ctttagcatt agaaaaagtg 1320
aaaaataaag ttgataaatc tattaaaaca agaagtgaag cgataagctc aatatcaagt 1380
ttaaccggaa tattattatt tgtaacatca tttttaggta ttacattctt gattgctgta 1440
tgttgcatta tatacattaa gcaaatagat gaaaccgaag atgagttaga gaattatagt 1500
atattgagaa agcttggatt tacacaaaaa gatatggcaa ggggactaaa gtttaaaatt 1560
atgtttaatt ttgggttacc tttagttatt gcactatcac atgcatattt tacatcatta 1620
gcatatatga aattaatggg tacaacgaat caaataccgg ttttcatagt aatgggatta 1680
tacatttgta tgtatgctgt ttttgcagtg acggcttata atcattccaa gcgaacaatt 1740
agacattcca tataa 1755
<210> 99
<211> 1755
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 99
atgacagagt catatccaat tattaaggaa ggctcacaag tcggaagcta ctttctattt 60
ttcatcataa ttgcattttt gttatatgcc aatgtgttat ttattaaacg acgaagttat 120
gagcttgcat tatatcaaac attaggttta tctaaattca acattattta tatactaatg 180
ctcgaacaat tactaatatt tataattacg gcaatattag gtattattat tggtattttt 240
ggttcaaaac tgttattaat gattgtcttt acattattag gaattaaaga aaaggttcca 300
attattttta gtttgagggc ggtatttgaa acattaatgt taatcggtgt cgcttatttt 360
ttaacctctg ctcaaaattt tatattagtg ttcaaacaat ctatttcaca gatgtcaaag 420
aataaccagg ttaaagaaac aaatcataat aaaattacat ttgaagaggt tgttttaggc 480
atcttaggta tagtattgat tatcacagga tactatctat ctttgaacat tgttcaatat 540
tatgattcta tcggtatact tatgtttatt ttattgtcaa ctgtgattgg ggcatactta 600
ttttttaaaa gctctgtttc tctagttttt aaaatggtga agaagtttag aaaaggtgtt 660
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gctataagta gagcgtcctt atcaagtgaa ataaaatata ctgcaccaca cgacgttaca 840
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<210> 100
<211> 1755
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 100
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<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
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<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
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gagcttgcat tatatcaaac attaggttta tctaaattca acattattta tatactaatg 180
ctcgaacaat tactaatatt tataattacg gcaatattag gtattattat tggtattttt 240
ggttcgaaac tgttattaat gattgtcttt acattattag gaattaaaga aaaggttcca 300
attattttta gtttgagggc ggtatttgaa acattaatgt taatcggtgt cgcttatttt 360
ttaacatctg ctcaaaattt tatattagtg ttcaaacaat ctatttcaca gatgtcaaag 420
aataaccagg ttaaagaaac aaatcataat aaaattacat ttgaagaggt tgttttaggc 480
atcttaggta tagtattgat taccacagga tactatctat ctttgaacat tgttcaatat 540
tatgattcta tcggtacact tatgtttatt ttattgtcaa ctgtgattgg ggcatactta 600
ttttttaaaa gctctgtttc tctagttttt aaaatggtga agaagtttag aaaaggtgtt 660
ataagtgtaa atgatgtcat gttctcatca tctattatgt atcgtattaa gaaaaatgct 720
ttttcactta cggtcatggc aatcatttca gcgattactg tttcagttct ttgctttgct 780
gctataagta gagcgtcctt atcaagtgaa ataaaatata ctgcaccaca cgacgttaca 840
attaaagacc aacaaaaagc taatcaatta gcaagtgaat taaacaatca aaaaattcct 900
catttttata attataaaga agtaattcat acgaaattgt ataaagataa tttatttgat 960
gtaaaagcga aagaaccata caatgtaaca attactagtg ataaatacat ccctaatact 1020
gatttgaaac gtgggcaagc tgatttattt gtagcggaag gttctatcaa agatttagtg 1080
aaacataaga agcatggtaa ggcaattata ggaacgaaaa aacatcatgt taatattaag 1140
ttacgtaaag atattaataa aatctatttt atgacagatg ttgatttagg tggaccaacg 1200
tttgtcttaa atgacaaaga ctatcaagaa ataagaaagt atacaaaggc aaagcatatc 1260
gtctctcaat ttggattcga tttgaaacat aaaaaagatg ctttagcatt agaaaaagcg 1320
aaaaataaag ttgataaatc tattgaaaca agaagtgaag cgataagctc aatatcaagt 1380
ttaaccggaa tattattatt tgtaacatca tttttaggta ttacattctt gattgctgta 1440
tgttgcatta tatacataaa gcaaatagat gaaaccgaag atgagttaga gaattatagt 1500
attttgagaa agcttggatt tacacaaaaa gatatggcaa ggggactaaa gtttaaaatt 1560
atgtttaatt ttgggttacc tttagttatt gcactatcac atgcatattt tacatcatta 1620
gcatatatga aattaatggg tacaacgaat caaataccgg ttttcatagt aatgggatta 1680
tacatttgta tgtatgctgt ttttgcagtg acggcttata atcattccaa gcgaacaatt 1740
agacattcca tataa 1755
<210> 108
<211> 1890
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 108
atgaccttta acgagataat atttaaaaat ttccgtcaaa atttatcaca ttatgccatc 60
tatctttttt cattaattac gagtgtagta ttgtatttta gctttgtagc attaaaatac 120
gctcataaac taaacatgac agagtcatat ccaattataa aggaaggctc acaagtcgga 180
agctactttc tatttttcat cataattgca tttttgttat atgccaatgt gttatttatt 240
aaacgacgaa gttatgagct tgcattatat caaacattag gtttatctaa attcaacatt 300
atttatatac taatgctcga acaattacta atatttataa ttacggcaat attaggtatt 360
attattggta tttttggttc gaaactgtta ttaatgattg tctttacatt attaggaatt 420
aaagaaaagg ttccaattat ttttagtttg agggcggtat ttgaaacatt aatgttaatc 480
ggtgtcgctt attttttaac atctgctcaa aattttatat tagtgttcaa acaatctatt 540
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gaggttgttt taggcatctt aggtatagta ttgattacca caggatacta tctatctttg 660
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tttagaaaag gtgttataag tgtaaatgat gtcatgttct catcatctat tatgtatcgt 840
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ctaaagttta aaattatgtt taattttggg ttacctttag ttattgcact atcacatgca 1740
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atagtaatgg gattatacat ttgtatgtat gctgtttttg cagtgacggc ttataatcat 1860
tccaagcgaa caattagaca ttccatataa 1890
<210> 109
<211> 629
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 109
Met Thr Phe Asn Glu Ile Ile Phe Lys Asn Phe Arg Gln Asn Leu Ser
1 5 10 15
His Tyr Ala Ile Tyr Leu Phe Ser Leu Ile Thr Ser Val Val Leu Tyr
20 25 30
Phe Ser Phe Val Ala Leu Lys Tyr Ala His Lys Leu Asn Met Thr Glu
35 40 45
Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser Tyr Phe Leu
50 55 60
Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val Leu Phe Ile
65 70 75 80
Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ser
85 90 95
Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu Leu Ile Phe
100 105 110
Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe Gly Ser Lys
115 120 125
Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys Glu Lys Val
130 135 140
Pro Ile Ile Phe Ser Leu Arg Ala Val Phe Glu Thr Leu Met Leu Ile
145 150 155 160
Gly Val Ala Tyr Phe Leu Thr Ser Ala Gln Asn Phe Ile Leu Val Phe
165 170 175
Lys Gln Ser Ile Ser Gln Met Ser Lys Asn Asn Gln Val Lys Glu Thr
180 185 190
Asn His Asn Lys Ile Thr Phe Glu Glu Val Val Leu Gly Ile Leu Gly
195 200 205
Ile Val Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Ile Val Gln
210 215 220
Tyr Tyr Asp Ser Ile Gly Thr Leu Met Phe Ile Leu Leu Ser Thr Val
225 230 235 240
Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Phe Lys Ser Ser Val Ser Leu Val Phe Lys
245 250 255
Met Val Lys Lys Phe Arg Lys Gly Val Ile Ser Val Asn Asp Val Met
260 265 270
Phe Ser Ser Ser Ile Met Tyr Arg Ile Lys Lys Asn Ala Phe Ser Leu
275 280 285
Thr Val Met Ala Ile Ile Ser Ala Ile Thr Val Ser Val Leu Cys Phe
290 295 300
Ala Ala Ile Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys Tyr Thr Ala
305 310 315 320
Pro His Asp Val Thr Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn Gln Leu Ala
325 330 335
Ser Glu Leu Asn Asn Gln Lys Ile Pro His Phe Tyr Asn Tyr Lys Glu
340 345 350
Val Ile His Thr Lys Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp Val Lys Ala
355 360 365
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370 375 380
Thr Asp Leu Lys Arg Gly Gln Ala Asp Leu Phe Val Ala Glu Gly Ser
385 390 395 400
Ile Lys Asp Leu Val Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala Ile Ile Gly
405 410 415
Thr Lys Lys His His Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp Ile Asn Lys
420 425 430
Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu
435 440 445
Asn Asp Lys Asp Tyr Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Thr Lys Ala Lys His
450 455 460
Ile Val Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp Ala Leu
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Ala Leu Glu Lys Ala Lys Asn Lys Val Asp Lys Ser Ile Glu Thr Arg
485 490 495
Ser Glu Ala Ile Ser Ser Ile Ser Ser Leu Thr Gly Ile Leu Leu Phe
500 505 510
Val Thr Ser Phe Leu Gly Ile Thr Phe Leu Ile Ala Val Cys Cys Ile
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Leu Lys Phe Lys Ile Met Phe Asn Phe Gly Leu Pro Leu Val Ile Ala
565 570 575
Leu Ser His Ala Tyr Phe Thr Ser Leu Ala Tyr Met Lys Leu Met Gly
580 585 590
Thr Thr Asn Gln Ile Pro Val Phe Ile Val Met Gly Leu Tyr Ile Cys
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Met Tyr Ala Val Phe Ala Val Thr Ala Tyr Asn His Ser Lys Arg Thr
610 615 620
Ile Arg His Ser Ile
625
<210> 110
<211> 599
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 110
Met Tyr Phe Ser Phe Val Ala Leu Lys Tyr Ala His Lys Leu Asn Met
1 5 10 15
Thr Glu Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Phe Leu Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val Leu
35 40 45
Phe Ile Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu Gly
50 55 60
Leu Ser Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu Leu
65 70 75 80
Ile Phe Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe Gly
85 90 95
Ser Lys Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys Glu
100 105 110
Lys Val Pro Ile Ile Phe Ser Leu Arg Ala Val Phe Glu Thr Leu Met
115 120 125
Leu Ile Gly Val Ala Tyr Phe Leu Thr Ser Ala Gln Asn Phe Ile Leu
130 135 140
Val Phe Lys Gln Ser Ile Ser Gln Met Ser Lys Asn Asn Gln Val Lys
145 150 155 160
Glu Thr Asn His Asn Lys Ile Thr Phe Glu Glu Val Val Leu Gly Ile
165 170 175
Leu Gly Ile Val Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Ile
180 185 190
Val Gln Tyr Tyr Asp Ser Ile Gly Thr Leu Met Phe Ile Leu Leu Ser
195 200 205
Thr Val Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Phe Lys Ser Ser Val Ser Leu Val
210 215 220
Phe Lys Met Val Lys Lys Phe Arg Lys Gly Val Ile Ser Val Asn Asp
225 230 235 240
Val Met Phe Ser Ser Ser Ile Met Tyr Arg Ile Lys Lys Asn Ala Phe
245 250 255
Ser Leu Thr Val Met Ala Ile Ile Ser Ala Ile Thr Val Ser Val Leu
260 265 270
Cys Phe Ala Ala Ile Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys Tyr
275 280 285
Thr Ala Pro His Asp Val Thr Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn Gln
290 295 300
Leu Ala Ser Glu Leu Asn Asn Gln Lys Ile Pro His Phe Tyr Asn Tyr
305 310 315 320
Lys Glu Val Ile His Thr Lys Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp Val
325 330 335
Lys Ala Lys Glu Pro Tyr Asn Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Tyr Ile
340 345 350
Pro Asn Thr Asp Leu Lys Arg Gly Gln Ala Asp Leu Phe Val Ala Glu
355 360 365
Gly Ser Ile Lys Asp Leu Val Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala Ile
370 375 380
Ile Gly Thr Lys Lys His His Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp Ile
385 390 395 400
Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe
405 410 415
Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Thr Lys Ala
420 425 430
Lys His Ile Val Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp
435 440 445
Ala Leu Ala Leu Glu Lys Ala Lys Asn Lys Val Asp Lys Ser Ile Glu
450 455 460
Thr Arg Ser Glu Ala Ile Ser Ser Ile Ser Ser Leu Thr Gly Ile Leu
465 470 475 480
Leu Phe Val Thr Ser Phe Leu Gly Ile Thr Phe Leu Ile Ala Val Cys
485 490 495
Cys Ile Ile Tyr Ile Lys Gln Ile Asp Glu Thr Glu Asp Glu Leu Glu
500 505 510
Asn Tyr Ser Ile Leu Arg Lys Leu Gly Phe Thr Gln Lys Asp Met Ala
515 520 525
Arg Gly Leu Lys Phe Lys Ile Met Phe Asn Phe Gly Leu Pro Leu Val
530 535 540
Ile Ala Leu Ser His Ala Tyr Phe Thr Ser Leu Ala Tyr Met Lys Leu
545 550 555 560
Met Gly Thr Thr Asn Gln Ile Pro Val Phe Ile Val Met Gly Leu Tyr
565 570 575
Ile Cys Met Tyr Ala Val Phe Ala Val Thr Ala Tyr Asn His Ser Lys
580 585 590
Arg Thr Ile Arg His Ser Ile
595
<210> 111
<211> 584
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 111
Met Thr Glu Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser
1 5 10 15
Tyr Phe Leu Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val
20 25 30
Leu Phe Ile Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu
35 40 45
Gly Leu Ser Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu
50 55 60
Leu Ile Phe Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe
65 70 75 80
Gly Ser Lys Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys
85 90 95
Glu Lys Val Pro Ile Ile Phe Ser Leu Arg Ala Val Phe Glu Thr Leu
100 105 110
Met Leu Ile Gly Val Ala Tyr Phe Leu Thr Ser Ala Gln Asn Phe Ile
115 120 125
Leu Val Phe Lys Gln Ser Ile Ser Gln Met Ser Lys Asn Asn Gln Val
130 135 140
Lys Glu Thr Asn His Asn Lys Ile Thr Phe Glu Glu Val Val Leu Gly
145 150 155 160
Ile Leu Gly Ile Val Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn
165 170 175
Ile Val Gln Tyr Tyr Asp Ser Ile Gly Thr Leu Met Phe Ile Leu Leu
180 185 190
Ser Thr Val Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Phe Lys Ser Ser Val Ser Leu
195 200 205
Val Phe Lys Met Val Lys Lys Phe Arg Lys Gly Val Ile Ser Val Asn
210 215 220
Asp Val Met Phe Ser Ser Ser Ile Met Tyr Arg Ile Lys Lys Asn Ala
225 230 235 240
Phe Ser Leu Thr Val Met Ala Ile Ile Ser Ala Ile Thr Val Ser Val
245 250 255
Leu Cys Phe Ala Ala Ile Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys
260 265 270
Tyr Thr Ala Pro His Asp Val Thr Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn
275 280 285
Gln Leu Ala Ser Glu Leu Asn Asn Gln Lys Ile Pro His Phe Tyr Asn
290 295 300
Tyr Lys Glu Val Ile His Thr Lys Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp
305 310 315 320
Val Lys Ala Lys Glu Pro Tyr Asn Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Tyr
325 330 335
Ile Pro Asn Thr Asp Leu Lys Arg Gly Gln Ala Asp Leu Phe Val Ala
340 345 350
Glu Gly Ser Ile Lys Asp Leu Val Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala
355 360 365
Ile Ile Gly Thr Lys Lys His His Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp
370 375 380
Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr
385 390 395 400
Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Thr Lys
405 410 415
Ala Lys His Ile Val Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys
420 425 430
Asp Ala Leu Ala Leu Glu Lys Ala Lys Asn Lys Val Asp Lys Ser Ile
435 440 445
Glu Thr Arg Ser Glu Ala Ile Ser Ser Ile Ser Ser Leu Thr Gly Ile
450 455 460
Leu Leu Phe Val Thr Ser Phe Leu Gly Ile Thr Phe Leu Ile Ala Val
465 470 475 480
Cys Cys Ile Ile Tyr Ile Lys Gln Ile Asp Glu Thr Glu Asp Glu Leu
485 490 495
Glu Asn Tyr Ser Ile Leu Arg Lys Leu Gly Phe Thr Gln Lys Asp Met
500 505 510
Ala Arg Gly Leu Lys Phe Lys Ile Met Phe Asn Phe Gly Leu Pro Leu
515 520 525
Val Ile Ala Leu Ser His Ala Tyr Phe Thr Ser Leu Ala Tyr Met Lys
530 535 540
Leu Met Gly Thr Thr Asn Gln Ile Pro Val Phe Ile Val Met Gly Leu
545 550 555 560
Tyr Ile Cys Met Tyr Ala Val Phe Ala Val Thr Ala Tyr Asn His Ser
565 570 575
Lys Arg Thr Ile Arg His Ser Ile
580
<210> 112
<211> 584
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 112
Met Thr Glu Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser
1 5 10 15
Tyr Phe Leu Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val
20 25 30
Leu Phe Ile Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu
35 40 45
Gly Leu Ser Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu
50 55 60
Leu Ile Phe Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe
65 70 75 80
Gly Ser Lys Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys
85 90 95
Glu Lys Val Pro Ile Ile Phe Ser Leu Arg Ala Val Phe Glu Thr Leu
100 105 110
Met Leu Ile Gly Val Ala Tyr Phe Leu Thr Ser Ala Gln Asn Phe Ile
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Leu Val Phe Lys Gln Ser Ile Ser Gln Met Ser Lys Asn Asn Gln Val
130 135 140
Lys Glu Thr Asn His Asn Lys Ile Thr Phe Glu Glu Val Val Leu Gly
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Ile Leu Gly Ile Val Leu Ile Ile Thr Gly Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn
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Ile Val Gln Tyr Tyr Asp Ser Ile Gly Ile Leu Met Phe Ile Leu Leu
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Ser Thr Val Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Phe Lys Ser Ser Val Ser Leu
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Val Phe Lys Met Val Lys Lys Phe Arg Lys Gly Val Ile Ser Val Asn
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Asp Val Met Phe Ser Ser Ser Ile Met Tyr Arg Ile Lys Lys Asn Ala
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Phe Ser Leu Thr Val Met Ala Ile Ile Ser Ala Ile Thr Val Ser Val
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Leu Cys Phe Ala Ala Ile Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys
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Tyr Thr Ala Pro His Asp Val Thr Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn
275 280 285
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Tyr Lys Glu Val Ile His Thr Lys Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp
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Glu Gly Ser Ile Lys Asp Leu Val Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala
355 360 365
Ile Ile Gly Thr Lys Lys His His Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp
370 375 380
Ile Asn Lys Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr
385 390 395 400
Phe Val Leu Asn Asp Lys Asp Tyr Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Thr Lys
405 410 415
Ala Lys His Ile Val Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys
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Asp Ala Leu Ala Leu Glu Lys Val Lys Asn Lys Val Asp Lys Ser Ile
435 440 445
Lys Thr Arg Ser Glu Ala Ile Ser Ser Ile Ser Ser Leu Thr Gly Ile
450 455 460
Leu Leu Phe Val Thr Ser Phe Leu Gly Ile Thr Phe Leu Ile Ala Val
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Cys Cys Ile Ile Tyr Ile Lys Gln Ile Asp Glu Thr Glu Asp Glu Leu
485 490 495
Glu Asn Tyr Ser Ile Leu Arg Lys Leu Gly Phe Thr Gln Lys Asp Met
500 505 510
Ala Arg Gly Leu Lys Phe Lys Ile Met Phe Asn Phe Gly Leu Pro Leu
515 520 525
Val Ile Ala Leu Ser His Ala Tyr Phe Thr Ser Leu Ala Tyr Met Lys
530 535 540
Leu Met Gly Thr Thr Asn Gln Ile Pro Val Phe Ile Val Met Gly Leu
545 550 555 560
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565 570 575
Lys Arg Thr Ile Arg His Ser Ile
580
<210> 113
<211> 584
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 113
Met Thr Glu Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser
1 5 10 15
Tyr Phe Leu Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val
20 25 30
Leu Phe Ile Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu
35 40 45
Gly Leu Ser Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu
50 55 60
Leu Ile Phe Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe
65 70 75 80
Gly Ser Lys Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys
85 90 95
Glu Lys Val Pro Ile Ile Phe Ser Leu Arg Ala Val Phe Glu Thr Leu
100 105 110
Met Leu Ile Gly Val Ala Tyr Phe Leu Thr Ser Ala Gln Asn Phe Ile
115 120 125
Leu Val Phe Lys Gln Ser Ile Ser Gln Met Ser Lys Asn Asn Gln Val
130 135 140
Lys Glu Thr Asn His Asn Lys Ile Thr Phe Glu Glu Val Val Leu Gly
145 150 155 160
Ile Leu Gly Ile Val Leu Ile Ile Thr Gly Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn
165 170 175
Ile Val Gln Tyr Tyr Asp Ser Ile Gly Ile Leu Met Phe Ile Leu Leu
180 185 190
Ser Thr Val Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Phe Lys Ser Ser Val Ser Leu
195 200 205
Val Phe Lys Met Val Lys Lys Phe Arg Lys Gly Val Ile Ser Val Asn
210 215 220
Asp Val Met Phe Ser Ser Ser Ile Met Tyr Arg Ile Lys Lys Asn Ala
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245 250 255
Leu Cys Phe Ala Ala Ile Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys
260 265 270
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275 280 285
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530 535 540
Leu Met Gly Thr Thr Asn Gln Ile Pro Val Phe Ile Val Met Gly Leu
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Tyr Ile Cys Met Tyr Ala Val Phe Ala Val Thr Ala Tyr Asn His Ser
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580
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<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 114
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<400> 118
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<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 119
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<210> 120
<211> 629
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(45)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (213)..(213)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (231)..(231)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (368)..(368)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (370)..(370)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (384)..(384)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (414)..(414)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (486)..(486)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (494)..(494)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (576)..(576)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 120
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Met Thr Glu
35 40 45
Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser Tyr Phe Leu
50 55 60
Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val Leu Phe Ile
65 70 75 80
Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ser
85 90 95
Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu Leu Ile Phe
100 105 110
Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe Gly Ser Lys
115 120 125
Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys Glu Lys Val
130 135 140
Pro Ile Ile Phe Ser Leu Arg Ala Val Phe Glu Thr Leu Met Leu Ile
145 150 155 160
Gly Val Ala Tyr Phe Leu Thr Ser Ala Gln Asn Phe Ile Leu Val Phe
165 170 175
Lys Gln Ser Ile Ser Gln Met Ser Lys Asn Asn Gln Val Lys Glu Thr
180 185 190
Asn His Asn Lys Ile Thr Phe Glu Glu Val Val Leu Gly Ile Leu Gly
195 200 205
Ile Val Leu Ile Xaa Thr Gly Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Ile Val Gln
210 215 220
Tyr Tyr Asp Ser Ile Gly Xaa Leu Met Phe Ile Leu Leu Ser Thr Val
225 230 235 240
Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Phe Lys Ser Ser Val Ser Leu Val Phe Lys
245 250 255
Met Val Lys Lys Phe Arg Lys Gly Val Ile Ser Val Asn Asp Val Met
260 265 270
Phe Ser Ser Ser Ile Met Tyr Arg Ile Lys Lys Asn Ala Phe Ser Leu
275 280 285
Thr Val Met Ala Ile Ile Ser Ala Ile Thr Val Ser Val Leu Cys Phe
290 295 300
Ala Ala Ile Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ser Glu Ile Lys Tyr Thr Ala
305 310 315 320
Pro His Asp Val Thr Ile Lys Asp Gln Gln Lys Ala Asn Gln Leu Ala
325 330 335
Ser Glu Leu Asn Asn Gln Lys Ile Pro His Phe Tyr Asn Tyr Lys Glu
340 345 350
Val Ile His Thr Lys Leu Tyr Lys Asp Asn Leu Phe Asp Val Lys Xaa
355 360 365
Lys Xaa Pro Tyr Asn Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Tyr Ile Pro Xaa
370 375 380
Thr Asp Leu Lys Arg Gly Gln Ala Asp Leu Phe Val Ala Glu Gly Ser
385 390 395 400
Ile Lys Asp Leu Val Lys His Lys Lys His Gly Lys Ala Xaa Ile Gly
405 410 415
Thr Lys Lys His His Val Asn Ile Lys Leu Arg Lys Asp Ile Asn Lys
420 425 430
Ile Tyr Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu
435 440 445
Asn Asp Lys Asp Tyr Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Thr Lys Ala Lys His
450 455 460
Ile Val Ser Gln Phe Gly Phe Asp Leu Lys His Lys Lys Asp Ala Leu
465 470 475 480
Ala Leu Glu Lys Ala Xaa Asn Lys Val Asp Lys Ser Ile Xaa Thr Arg
485 490 495
Ser Glu Ala Ile Ser Ser Ile Ser Ser Leu Thr Gly Ile Leu Leu Phe
500 505 510
Val Thr Ser Phe Leu Gly Ile Thr Phe Leu Ile Ala Val Cys Cys Ile
515 520 525
Ile Tyr Ile Lys Gln Ile Asp Glu Thr Glu Asp Glu Leu Glu Asn Tyr
530 535 540
Ser Ile Leu Arg Lys Leu Gly Phe Thr Gln Lys Asp Met Ala Arg Gly
545 550 555 560
Leu Lys Phe Lys Ile Met Phe Asn Phe Gly Leu Pro Leu Val Ile Xaa
565 570 575
Leu Ser His Ala Tyr Phe Thr Ser Leu Ala Tyr Met Lys Leu Met Gly
580 585 590
Thr Thr Asn Gln Ile Pro Val Phe Ile Val Met Gly Leu Tyr Ile Cys
595 600 605
Met Tyr Ala Val Phe Ala Val Thr Ala Tyr Asn His Ser Lys Arg Thr
610 615 620
Ile Arg His Ser Ile
625
<210> 121
<211> 55
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 121
Met Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr Phe
1 5 10 15
Phe Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu Thr
20 25 30
Gln Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His Ile
35 40 45
Arg Thr Tyr Lys Ile Glu Lys
50 55
<210> 122
<211> 55
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 122
Met Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr Phe
1 5 10 15
Phe Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu Thr
20 25 30
Gln Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His Ile
35 40 45
Arg Thr Tyr Lys Ile Glu Lys
50 55
<210> 123
<211> 88
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 123
Cys Leu Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Ala Val Gly Glu Ile Phe Ser Gly
1 5 10 15
Ser Ile Val Lys Gly Tyr Asp Lys Ala Leu Asp Lys Glu Lys His Leu
20 25 30
Asn Met Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr
35 40 45
Phe Phe Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu
50 55 60
Thr Gln Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His
65 70 75 80
Ile Arg Thr Tyr Lys Ile Glu Lys
85
<210> 124
<211> 88
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 124
Cys Leu Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Ala Val Gly Glu Ile Phe Ser Gly
1 5 10 15
Ser Ile Val Lys Gly Tyr Asp Lys Ala Leu Asp Lys Glu Lys His Leu
20 25 30
Asn Met Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr
35 40 45
Phe Phe Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu
50 55 60
Thr Gln Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His
65 70 75 80
Ile Arg Thr Tyr Lys Ile Glu Lys
85
<210> 125
<211> 88
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 125
Cys Leu Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Ala Val Gly Glu Ile Phe Ser Gly
1 5 10 15
Ser Ile Val Lys Gly Tyr Asp Lys Ala Leu Asp Lys Glu Lys His Leu
20 25 30
Asn Met Leu Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr
35 40 45
Phe Phe Asn Arg Phe Asp Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu
50 55 60
Thr Gln Asp Pro Tyr Ser Lys Val Tyr Leu Tyr Ser Ile Glu Asp His
65 70 75 80
Ile Arg Thr Tyr Lys Ile Glu Lys
85
<210> 126
<211> 78
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 126
Gly Glu Phe Tyr Ser Ala Thr Leu Val Glu Gly Tyr Lys Asp His Leu
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ala His Lys Ala Leu Leu Asn Asn Arg Thr Glu Val Ser
20 25 30
Val Asp Ala Tyr Glu Thr Phe Phe Lys Arg Phe Asp Asp Val Asp Phe
35 40 45
Asp Glu Gln Gln Asp Ala Val His Glu Asp Arg Arg Ile Phe Tyr Leu
50 55 60
Ser Asn Ile Glu Asn Asn Val Arg Glu Tyr His Arg Pro Glu
65 70 75
<210> 127
<211> 88
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 127
Gly Leu Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Val Gly Glu Phe Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Thr Leu Val Glu Gly Tyr Lys Asp His Leu Asp Gln Ala Ala His Lys
20 25 30
Ala Leu Leu Asn Asn Arg Thr Glu Val Ser Val Asp Ala Tyr Glu Thr
35 40 45
Phe Phe Lys Arg Phe Asp Asp Val Asp Phe Asp Glu Gln Gln Asp Ala
50 55 60
Val His Glu Asp Arg Arg Ile Phe Tyr Leu Ser Asn Ile Glu Asn Asn
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr His Arg Pro Glu
85
<210> 128
<211> 78
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 128
Gly Glu Phe Tyr Ser Ala Thr Leu Val Glu Gly Tyr Lys Asp His Leu
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ala His Lys Ala Leu Leu Asn Asn Arg Thr Glu Val Ser
20 25 30
Val Asp Ala Tyr Glu Thr Phe Phe Lys Arg Phe Asp Asp Val Asp Phe
35 40 45
Asp Glu Glu Gln Asp Ala Val His Glu Asp Arg His Ile Phe Tyr Leu
50 55 60
Ser Asn Ile Glu Asn Asn Val Arg Glu Tyr His Arg Pro Glu
65 70 75
<210> 129
<211> 88
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 129
Gly Leu Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Val Gly Glu Phe Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Thr Leu Val Glu Gly Tyr Lys Asp His Leu Asp Gln Ala Ala His Lys
20 25 30
Ala Leu Leu Asn Asn Arg Thr Glu Val Ser Val Asp Ala Tyr Glu Thr
35 40 45
Phe Phe Lys Arg Phe Asp Asp Val Glu Phe Asp Glu Glu Gln Asp Ala
50 55 60
Val His Glu Asp Arg His Ile Phe Tyr Leu Ser Asn Ile Glu Asn Asn
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr His Arg Pro Glu
85
<210> 130
<211> 88
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 130
Gly Leu Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Val Gly Glu Phe Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Thr Leu Val Glu Gly Tyr Lys Asp His Leu Asp Gln Ala Ala His Lys
20 25 30
Ala Leu Leu Asn Asn Arg Thr Glu Val Ser Val Asp Ala Tyr Glu Thr
35 40 45
Phe Phe Lys Arg Phe Asp Asp Val Glu Phe Asp Glu Glu Gln Asp Ala
50 55 60
Val His Glu Asp Arg His Ile Phe Tyr Leu Ser Asn Ile Glu Asn Asn
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr His Arg Pro Glu
85
<210> 131
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(37)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(41)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(45)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(57)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(72)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(76)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(81)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(88)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 131
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Ser Val Xaa Xaa Tyr Glu Thr
35 40 45
Phe Phe Xaa Arg Phe Asp Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Xaa Ile Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Arg Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa
85
<210> 132
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 132
Glu Ser Arg Glu Gln Leu Ser Val Glu Glu Tyr Glu Thr Phe
1 5 10
<210> 133
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 133
Asn Asn Arg Thr Glu Val Ser Val Asp Ala Tyr Glu Thr Phe
1 5 10
<210> 134
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 134
Asn Gln Glu Phe Asp Phe Glu Arg Glu Leu Thr Gln Asp Pro
1 5 10
<210> 135
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 135
Asp Val Asp Phe Asp Glu Gln Gln Asp Ala Val His Glu Asp
1 5 10
<210> 136
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 136
Asp Val Asp Phe Asp Glu Glu Gln Asp Ala Val His Glu Asp
1 5 10
<210> 137
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 137
Asp Val Glu Phe Asp Glu Glu Gln Asp Ala Val His Glu Asp
1 5 10
<210> 138
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 138
Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Ser Val Xaa Xaa Tyr Glu Thr Phe
1 5 10
<210> 139
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(14)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 139
Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 140
<211> 720
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 140
ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60
attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120
agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180
attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240
aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300
taatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcaa ctgcttgttc 360
ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420
atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtc tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480
ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540
cgcatcttta aatgaaacga cgccattata tggaaaaata tttgtatctt taacttgcgt 600
aacattcttc tctgcatttg ctatttgttg tgtctcttca acgactgcag catttattcc 660
agttactgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720
<210> 141
<211> 720
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 141
ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60
attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120
agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180
attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240
aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300
taatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcaa ctgcttgttc 360
ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420
atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtc tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480
ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540
cgcatcttta aatgaaacga cgccattata tggaaaaata tttgtatctt taacttgcgt 600
aacattcttc tctgcatttg ctatttgttg tgtctcttca acgactgcag catttattcc 660
agttgctgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720
<210> 142
<211> 740
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 142
ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60
attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120
agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180
attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240
aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300
gaatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcga ctgcttgttc 360
ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420
atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtt tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480
ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540
cgcatcttta aatgaaacga cgccattata tggaaaaata tttgtatctt taacttgcgt 600
aacattcttc tctgcatttg ctatttgttg tgtctcttca acgactgcag catttattcc 660
agttactgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720
aaaagcacat tgaacaataa 740
<210> 143
<211> 720
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 143
ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60
attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120
agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180
attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240
aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300
gaatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcga ctgcttgttc 360
ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420
atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtt tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480
ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540
cgcatcttta aatgaaacga cgccattata tggaaaaata tttgtatctt taacttgcgt 600
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agttactgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720
<210> 144
<211> 720
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 144
ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60
attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120
agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180
attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240
aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300
taatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcga ctgcttgttc 360
ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420
atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtt tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480
ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540
cgcatcttta aatgaaacga cgccattata tggaaaaata tttgtatctt taacttgcgt 600
aacattcttc tctgcatttg ctatttgttg tgtctcttca acgactgcag catttattcc 660
agttactgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720
<210> 145
<211> 720
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 145
ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60
attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120
agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180
attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240
aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300
gaatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcga ctgcttgttc 360
ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420
atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtt tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480
ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540
cgcatcttta aatgaaacga cgccattata tggaaaaata tttgtatctt taacttgcgt 600
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<210> 146
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<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
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<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 147
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20 25 30
Ile Ala Asn Ala Glu Lys Asn Val Thr Gln Val Lys Asp Thr Asn Asn
35 40 45
Phe Pro Tyr Asn Gly Val Val Ser Phe Lys Asp Ala Thr Gly Phe Val
50 55 60
Ile Gly Lys Asn Thr Ile Ile Thr Asn Lys His Val Ser Lys Asp Tyr
65 70 75 80
Lys Val Gly Asp Arg Ile Thr Ala His Pro Asn Gly Asp Lys Gly Asn
85 90 95
Gly Gly Ile Tyr Lys Ile Lys Ser Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Asp Glu
100 105 110
Asp Ile Ser Val Met Asn Ile Glu Glu Gln Ala Val Glu Arg Gly Pro
115 120 125
Lys Gly Phe Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala Phe Asn Phe Ala Lys
130 135 140
Asp Ala Lys Val Asp Asp Lys Ile Lys Val Ile Gly Tyr Pro Leu Pro
145 150 155 160
Ala Gln Asn Ser Phe Lys Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Ile Lys Arg
165 170 175
Ile Lys Asp Asn Ile Leu Asn Phe Asp Ala Tyr Ile Glu Pro Gly Asn
180 185 190
Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Ser Asn Asn Glu Val Ile Gly Val Val
195 200 205
Tyr Gly Gly Ile Gly Lys Ile Gly Ser Glu Tyr Asn Gly Ala Val Tyr
210 215 220
Phe Thr Pro Gln Ile Lys Asp Phe Ile Gln Lys His Ile Glu Gln
225 230 235
<210> 163
<211> 239
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 163
Met Asn Lys Asn Ile Val Ile Lys Ser Met Ala Ala Leu Ala Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ser Val Thr Gly Ile Asn Ala Ala Val Val Asp Glu Thr Gln Gln
20 25 30
Ile Ala Asn Ala Glu Lys Asn Val Thr Gln Val Lys Asp Thr Asn Val
35 40 45
Phe Pro Tyr Asn Gly Val Val Ser Phe Lys Asp Ala Thr Gly Phe Ala
50 55 60
Ile Glu Lys Asn Thr Ile Ile Thr Asn Lys His Val Ser Lys Asp Tyr
65 70 75 80
Lys Val Gly Asp Arg Ile Thr Ala His Pro Asn Gly Asp Lys Gly Asn
85 90 95
Gly Gly Ile Tyr Lys Ile Lys Asn Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Asn Glu
100 105 110
Asp Ile Ser Val Met Asn Val Glu Glu Asn Ala Val Glu Arg Gly Ala
115 120 125
Asn Gly Tyr Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala Phe Asn Phe Ala Lys
130 135 140
Asp Ala Lys Val Asp Asp Lys Ile Lys Val Ile Gly Tyr Pro Leu Pro
145 150 155 160
Ala Gln Asn Thr Phe Lys Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Val Lys Ser
165 170 175
Ile Lys Asp Asn Asn Leu Asn Phe Asp Ala Tyr Ile Glu Pro Gly Asn
180 185 190
Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Leu Asn Asn Glu Val Val Gly Val Val
195 200 205
Tyr Gly Gly Ile Gly Lys Ile Gly Ser Glu Tyr Asn Gly Ala Val Tyr
210 215 220
Phe Thr Pro Gln Ile Lys Glu Phe Ile Gln Lys His Ile Glu Gln
225 230 235
<210> 164
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(64)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(91)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (104)..(104)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (111)..(111)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (122)..(122)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (131)..(131)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (140)..(140)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (164)..(164)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (174)..(174)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (176)..(176)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (181)..(181)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (200)..(200)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (205)..(205)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (231)..(231)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 164
Met Asn Lys Asn Ile Val Ile Lys Ser Met Ala Ala Leu Ala Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ser Xaa Thr Gly Ile Asn Ala Ala Val Val Xaa Glu Thr Gln Gln
20 25 30
Ile Ala Asn Ala Glu Lys Asn Val Thr Gln Val Lys Asp Thr Asn Xaa
35 40 45
Phe Pro Tyr Asn Gly Val Val Ser Phe Lys Asp Ala Thr Gly Phe Xaa
50 55 60
Ile Xaa Lys Asn Thr Ile Ile Thr Asn Lys His Val Ser Lys Asp Tyr
65 70 75 80
Lys Val Gly Asp Arg Ile Thr Ala His Pro Xaa Gly Asp Lys Gly Asn
85 90 95
Gly Gly Ile Tyr Lys Ile Lys Xaa Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Xaa Glu
100 105 110
Asp Ile Ser Val Met Asn Xaa Glu Glu Xaa Ala Val Glu Arg Gly Xaa
115 120 125
Xaa Gly Xaa Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala Xaa Asn Phe Ala Lys
130 135 140
Asp Ala Lys Val Asp Asp Lys Ile Lys Val Ile Gly Tyr Pro Leu Pro
145 150 155 160
Ala Gln Asn Xaa Phe Lys Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Xaa Lys Xaa
165 170 175
Ile Lys Asp Asn Xaa Leu Asn Phe Asp Ala Tyr Ile Glu Pro Gly Asn
180 185 190
Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Xaa Asn Asn Glu Val Xaa Gly Val Val
195 200 205
Tyr Gly Gly Ile Gly Lys Ile Gly Ser Glu Tyr Asn Gly Ala Val Tyr
210 215 220
Phe Thr Pro Gln Ile Lys Xaa Phe Ile Gln Lys His Ile Glu Gln
225 230 235
<210> 165
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 165
Pro Tyr Asn Gly Val Val Ser Phe Lys Asp Ala Thr Gly Phe
1 5 10
<210> 166
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 166
Ala His Pro Asp Gly Asp Lys Gly Asn Gly Gly Ile Tyr Lys
1 5 10
<210> 167
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 167
Ala His Pro Asn Gly Asp Lys Gly Asn Gly Gly Ile Tyr Lys
1 5 10
<210> 168
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 168
Ala His Pro Xaa Gly Asp Lys Gly Asn Gly Gly Ile Tyr Lys
1 5 10
<210> 169
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 169
Ser Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Ile Ser Val Met
1 5 10
<210> 170
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 170
Asn Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Asn Glu Asp Ile Ser Val Met
1 5 10
<210> 171
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 171
Xaa Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Xaa Glu Asp Ile Ser Val Met
1 5 10
<210> 172
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 172
Arg Gly Pro Lys Gly Phe Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala
1 5 10
<210> 173
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 173
Arg Gly Ala Asn Gly Tyr Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala
1 5 10
<210> 174
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 174
Arg Gly Xaa Xaa Gly Xaa Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala
1 5 10
<210> 175
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 175
Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Ile Lys Arg Ile Lys Asp Asn
1 5 10
<210> 176
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 176
Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Val Lys Ser Ile Lys Asp Asn
1 5 10
<210> 177
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 177
Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Xaa Lys Xaa Ile Lys Asp Asn
1 5 10
<210> 178
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 178
Gly Asn Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Ser Asn Asn Glu Val
1 5 10
<210> 179
<211> 14
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 179
Gly Asn Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Leu Asn Asn Glu Val
1 5 10
<210> 180
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 180
Gly Asn Ser Gly Ser Pro Val Leu Asn Xaa Asn Asn Glu Val
1 5 10
<210> 181
<211> 975
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 181
atgaaatttg atagacatag aagattgaga tcatcagcga caatgagaga tatggttaga 60
gagaatcatg taagaaaaga agatttaata tatccaattt ttgtagttga aaaagacgat 120
gtgaaaaaag aaattaagtc attgccaggt gtataccaaa tcagtttgaa tttacttgaa 180
agtgaattaa aagaagctta tgacttaggc atacgtgcca ttatgttttt cggtgttcca 240
aactcaaaag atgatatagg tactggtgca tacattcacg atggtgttat tcaacaggca 300
acacgtattg ctaaaaaaat gtatgatgac ttattaattg ttgcagacac ttgtttatgt 360
gaatatactg atcatggtca ttgtggcgtg attgatgacc atacacatga cgttgacaat 420
gataaatcat tgccactact tgttaaaaca gcaatttctc aagtggaagc tggtgctgat 480
attattgcgc caagtaatat gatggatggt tttgttgctg aaattcgtcg tggattagat 540
gaagccggct attacaatat tcctataatg agttatggtg tcaagtatgc atcaagtttc 600
tttggacctt ttagagatgc agcagattca gcgccatcat ttggggatag aaaaacgtat 660
cagatggacc ctgctaaccg tttggaagca cttcgtgaat tagaaagtga tcttaaagaa 720
gggtgcgaca tgatgattgt taaacctgct ctaagttatt tagatatagt tcgagatgtt 780
aaaaatcata cgaatgttcc agttgttgca tataatgtga gtggagaata tagtatgact 840
aaagcagcgg cacaaaatgg ttggatagat gaagaacgtg tcgttatgga acaaatggtt 900
tcaatgaaac gtgcaggtgc tgatatgatt attacgtatt ttgcaaagga catttgtcgc 960
tatttagata aataa 975
<210> 182
<211> 324
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 182
Met Lys Phe Asp Arg His Arg Arg Leu Arg Ser Ser Ala Thr Met Arg
1 5 10 15
Asp Met Val Arg Glu Asn His Val Arg Lys Glu Asp Leu Ile Tyr Pro
20 25 30
Ile Phe Val Val Glu Lys Asp Asp Val Lys Lys Glu Ile Lys Ser Leu
35 40 45
Pro Gly Val Tyr Gln Ile Ser Leu Asn Leu Leu Glu Ser Glu Leu Lys
50 55 60
Glu Ala Tyr Asp Leu Gly Ile Arg Ala Ile Met Phe Phe Gly Val Pro
65 70 75 80
Asn Ser Lys Asp Asp Ile Gly Thr Gly Ala Tyr Ile His Asp Gly Val
85 90 95
Ile Gln Gln Ala Thr Arg Ile Ala Lys Lys Met Tyr Asp Asp Leu Leu
100 105 110
Ile Val Ala Asp Thr Cys Leu Cys Glu Tyr Thr Asp His Gly His Cys
115 120 125
Gly Val Ile Asp Asp His Thr His Asp Val Asp Asn Asp Lys Ser Leu
130 135 140
Pro Leu Leu Val Lys Thr Ala Ile Ser Gln Val Glu Ala Gly Ala Asp
145 150 155 160
Ile Ile Ala Pro Ser Asn Met Met Asp Gly Phe Val Ala Glu Ile Arg
165 170 175
Arg Gly Leu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Asn Ile Pro Ile Met Ser Tyr
180 185 190
Gly Val Lys Tyr Ala Ser Ser Phe Phe Gly Pro Phe Arg Asp Ala Ala
195 200 205
Asp Ser Ala Pro Ser Phe Gly Asp Arg Lys Thr Tyr Gln Met Asp Pro
210 215 220
Ala Asn Arg Leu Glu Ala Leu Arg Glu Leu Glu Ser Asp Leu Lys Glu
225 230 235 240
Gly Cys Asp Met Met Ile Val Lys Pro Ala Leu Ser Tyr Leu Asp Ile
245 250 255
Val Arg Asp Val Lys Asn His Thr Asn Val Pro Val Val Ala Tyr Asn
260 265 270
Val Ser Gly Glu Tyr Ser Met Thr Lys Ala Ala Ala Gln Asn Gly Trp
275 280 285
Ile Asp Glu Glu Arg Val Val Met Glu Gln Met Val Ser Met Lys Arg
290 295 300
Ala Gly Ala Asp Met Ile Ile Thr Tyr Phe Ala Lys Asp Ile Cys Arg
305 310 315 320
Tyr Leu Asp Lys
<210> 183
<211> 2802
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 183
atgaatatga agaaaaaaga aaaacacgca attcggaaaa aatcgattgg cgtggcttca 60
gtgcttgtag gtacgttaat cggttttgga ctactcagca gtaaagaagc agatgcaagt 120
gaaaatagtg ttacgcaatc tgatagcgca agtaacgaaa gcaaaagtaa tgattcaagt 180
agcgttagtg ctgcacctaa aacagacgac acaaacgtga gtgatactaa aacatcgtca 240
aacactaata atggcgaaac gagtgtggcg caaaatccag cacaacagga aacgacacaa 300
tcatcatcaa caaatgcaac tacggaagaa acgccggtaa ctggtgaagc tactactacg 360
acaacgaatc aagctaatac accggcaaca actcaatcaa gcaatacaaa tgcggaggaa 420
ttagtgaatc aaacaagtaa tgaaacgact tttaatgata ctaatacagt atcatctgta 480
aattcacctc aaaattctac aaatgcggaa aatgtttcaa caacgcaaga tacttcaact 540
gaagcaacac cttcaaacaa tgaatcagct ccacagagta cagatgcaag taataaagat 600
gtagttaatc aagcggttaa tacaagtgcg cctagaatga gagcatttag tttagcggca 660
gtagctgcag atgcaccggc agctggcaca gatattacga atcagttgac gaatgtgaca 720
gttggtattg actctggtac gactgtgtat ccgcaccaag caggttatgt caaactgaat 780
tatggttttt cagtgcctaa ttctgctgtt aaaggtgaca cattcaaaat aactgtacct 840
aaagaattaa acttaaatgg tgtaacttca actgctaaag tgccaccaat tatggctgga 900
gatcaagtat tggcaaatgg tgtaatcgat agtgatggta atgttattta tacatttaca 960
gactatgtaa atactaaaga tgatgtaaaa gcaactttga ccatgcccgc ttatattgac 1020
cctgaaaatg ttaaaaagac aggtaatgtg acattggcta ctggcatagg tagtacaaca 1080
gcaaacaaaa cagtattagt agattatgaa aaatatggta agttttataa cttatctatt 1140
aaaggtacaa ttgaccaaat cgataaaaca aataatacgt atcgtcagac aatttatgtc 1200
aatccaagtg gagataacgt tattgcgccg gttttaacag gtaatttaaa accaaatacg 1260
gatagtaatg cattaataga tcagcaaaat acaagtatta aagtatataa agtagataat 1320
gcagctgatt tatctgaaag ttactttgtg aatccagaaa actttgagga tgtcactaat 1380
agtgtgaata ttacattccc aaatccaaat caatataaag tagagtttaa tacgcctgat 1440
gatcaaatta caacaccgta tatagtagtt gttaatggtc atattgatcc gaatagcaaa 1500
ggtgatttag ctttacgttc aactttatat gggtataact cgaatataat ttggcgctct 1560
atgtcatggg acaacgaagt agcatttaat aacggatcag gttctggtga cggtatcgat 1620
aaaccagttg ttcctgaaca acctgatgag cctggtgaaa ttgaaccaat tccagaggat 1680
tcagattctg acccaggttc agattctggc agcgattcta attcagatag cggttcagat 1740
tcgggtagtg attctacatc agatagtggt tcagattcag cgagtgattc agattcagca 1800
agtgattcag actcagcgag tgattcagat tcagcaagcg attccgactc agcgagcgat 1860
tccgactcag acaatgactc ggattcagat agcgattctg actcagacag tgactcagat 1920
tccgacagtg actcagattc agatagcgat tctgactcag acagtgactc agattcagat 1980
agcgattcag attcagatag cgattcagat tccgacagtg attccgactc agacagcgat 2040
tctgactccg acagtgattc cgactcagac agcgattcag attccgacag tgattccgac 2100
tcagatagcg attccgactc agatagcgac tcagattcag acagcgattc agattcagac 2160
agcgattcag attcagatag cgattcagat tccgacagtg actcagattc cgacagtgac 2220
tcggattcag atagcgattc agattccgac agtgactcag attccgacag tgactcagac 2280
tcagacagtg attcggattc agcgagtgat tcggattcag atagtgattc cgactccgac 2340
agtgactcgg attcagatag cgactcagac tcggatagcg actcggattc agatagcgat 2400
tcggactcag atagcgattc agaatcagac agcgattcag aatcagacag cgattcagat 2460
tcagacagcg actcagacag tgactcagat tcagatagtg actcggattc agcgagtgat 2520
tcagactcag gtagtgactc cgattcatca agtgattccg actcagaaag tgattcaaat 2580
agcgattccg agtcaggttc taacaataat gtagttccgc ctaattcacc taaaaatggt 2640
actaatgctt ctaataaaaa tgaggctaaa gatagtaaag aaccattacc agatacaggt 2700
tctgaagatg aagcaaatac gtcactaatt tggggattat tagcatcaat aggttcatta 2760
ctacttttca gaagaaaaaa agaaaataaa gataagaaat aa 2802
<210> 184
<211> 933
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 184
Met Asn Met Lys Lys Lys Glu Lys His Ala Ile Arg Lys Lys Ser Ile
1 5 10 15
Gly Val Ala Ser Val Leu Val Gly Thr Leu Ile Gly Phe Gly Leu Leu
20 25 30
Ser Ser Lys Glu Ala Asp Ala Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp
35 40 45
Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala
50 55 60
Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser
65 70 75 80
Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gln Asn Pro Ala Gln Gln
85 90 95
Glu Thr Thr Gln Ser Ser Ser Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr Pro
100 105 110
Val Thr Gly Glu Ala Thr Thr Thr Thr Thr Asn Gln Ala Asn Thr Pro
115 120 125
Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asn Thr Asn Ala Glu Glu Leu Val Asn Gln
130 135 140
Thr Ser Asn Glu Thr Thr Phe Asn Asp Thr Asn Thr Val Ser Ser Val
145 150 155 160
Asn Ser Pro Gln Asn Ser Thr Asn Ala Glu Asn Val Ser Thr Thr Gln
165 170 175
Asp Thr Ser Thr Glu Ala Thr Pro Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gln
180 185 190
Ser Thr Asp Ala Ser Asn Lys Asp Val Val Asn Gln Ala Val Asn Thr
195 200 205
Ser Ala Pro Arg Met Arg Ala Phe Ser Leu Ala Ala Val Ala Ala Asp
210 215 220
Ala Pro Ala Ala Gly Thr Asp Ile Thr Asn Gln Leu Thr Asn Val Thr
225 230 235 240
Val Gly Ile Asp Ser Gly Thr Thr Val Tyr Pro His Gln Ala Gly Tyr
245 250 255
Val Lys Leu Asn Tyr Gly Phe Ser Val Pro Asn Ser Ala Val Lys Gly
260 265 270
Asp Thr Phe Lys Ile Thr Val Pro Lys Glu Leu Asn Leu Asn Gly Val
275 280 285
Thr Ser Thr Ala Lys Val Pro Pro Ile Met Ala Gly Asp Gln Val Leu
290 295 300
Ala Asn Gly Val Ile Asp Ser Asp Gly Asn Val Ile Tyr Thr Phe Thr
305 310 315 320
Asp Tyr Val Asn Thr Lys Asp Asp Val Lys Ala Thr Leu Thr Met Pro
325 330 335
Ala Tyr Ile Asp Pro Glu Asn Val Lys Lys Thr Gly Asn Val Thr Leu
340 345 350
Ala Thr Gly Ile Gly Ser Thr Thr Ala Asn Lys Thr Val Leu Val Asp
355 360 365
Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys Phe Tyr Asn Leu Ser Ile Lys Gly Thr Ile
370 375 380
Asp Gln Ile Asp Lys Thr Asn Asn Thr Tyr Arg Gln Thr Ile Tyr Val
385 390 395 400
Asn Pro Ser Gly Asp Asn Val Ile Ala Pro Val Leu Thr Gly Asn Leu
405 410 415
Lys Pro Asn Thr Asp Ser Asn Ala Leu Ile Asp Gln Gln Asn Thr Ser
420 425 430
Ile Lys Val Tyr Lys Val Asp Asn Ala Ala Asp Leu Ser Glu Ser Tyr
435 440 445
Phe Val Asn Pro Glu Asn Phe Glu Asp Val Thr Asn Ser Val Asn Ile
450 455 460
Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gln Tyr Lys Val Glu Phe Asn Thr Pro Asp
465 470 475 480
Asp Gln Ile Thr Thr Pro Tyr Ile Val Val Val Asn Gly His Ile Asp
485 490 495
Pro Asn Ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg Ser Thr Leu Tyr Gly Tyr
500 505 510
Asn Ser Asn Ile Ile Trp Arg Ser Met Ser Trp Asp Asn Glu Val Ala
515 520 525
Phe Asn Asn Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly Ile Asp Lys Pro Val Val
530 535 540
Pro Glu Gln Pro Asp Glu Pro Gly Glu Ile Glu Pro Ile Pro Glu Asp
545 550 555 560
Ser Asp Ser Asp Pro Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ser Asp
565 570 575
Ser Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Thr Ser Asp Ser Gly Ser Asp
580 585 590
Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp
595 600 605
Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Asp
610 615 620
Asn Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
625 630 635 640
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
645 650 655
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
660 665 670
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
675 680 685
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
690 695 700
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
705 710 715 720
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
725 730 735
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
740 745 750
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Ala
755 760 765
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
770 775 780
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
785 790 795 800
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp
805 810 815
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
820 825 830
Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Asp
835 840 845
Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asp Ser Glu
850 855 860
Ser Gly Ser Asn Asn Asn Val Val Pro Pro Asn Ser Pro Lys Asn Gly
865 870 875 880
Thr Asn Ala Ser Asn Lys Asn Glu Ala Lys Asp Ser Lys Glu Pro Leu
885 890 895
Pro Asp Thr Gly Ser Glu Asp Glu Ala Asn Thr Ser Leu Ile Trp Gly
900 905 910
Leu Leu Ala Ser Ile Gly Ser Leu Leu Leu Phe Arg Arg Lys Lys Glu
915 920 925
Asn Lys Asp Lys Lys
930
<210> 185
<211> 219
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 185
Met Ile Glu Ile Asn Asn Leu Ser Lys Arg Tyr Arg Asn Lys Gln Ile
1 5 10 15
Phe Asn His Leu Thr Met Ser Phe Asp Ser Asn Arg Leu Thr Val Leu
20 25 30
Leu Gly Asp Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Leu Arg Met Ile Ala
35 40 45
Gly Ile Glu Lys Ala Asn Asp Gly Thr Ile Asn Tyr Phe Gly Glu Lys
50 55 60
Trp Asn Gln Arg Gln Ile Gln Asn His Ile Gly Tyr Val Pro Gln Asp
65 70 75 80
Ile Ala Leu Phe Glu His Met Thr Val Ala Glu Asn Ile Lys Phe Phe
85 90 95
Lys Ser Leu Cys Lys Asn Pro Ile Asn Asp Thr Thr Ile Asn Glu Tyr
100 105 110
Leu Gln Gln Leu Asn Phe Asp Asp Thr Ser Ala Lys Val Ser Thr Leu
115 120 125
Ser Gly Gly Asn Lys Arg Lys Ile Asn Ile Leu Val Gly Leu Leu Gly
130 135 140
Gln Pro Arg Ile Leu Ile Leu Asp Glu Pro Thr Val Gly Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Ser Arg His Asp Ile His Gln Leu Leu Asn Ile Met Lys Ser Lys
165 170 175
Cys Leu Ile Ile Leu Thr Thr His His Leu Asp Glu Val Glu Ala Leu
180 185 190
Ala Asp Asp Ile Lys Leu Ile Gly Gln Asp Pro Phe Tyr Gln His Val
195 200 205
Leu Glu Asp Lys Gln Trp Thr Tyr Thr Tyr Tyr
210 215
<210> 186
<211> 253
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 186
Met Ala Ile Leu Glu Val Lys Gln Leu Thr Lys Ile Tyr Gly Thr Lys
1 5 10 15
Lys Met Ala Gln Glu Val Leu Arg Asp Ile Asn Met Ser Ile Glu Glu
20 25 30
Gly Glu Phe Ile Ala Ile Met Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys Thr Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Val Leu Ser Ser Ile Asp Tyr Ile Ser Gln Gly Ser Ile
50 55 60
Thr Leu Lys Gly Lys Lys Leu Glu Lys Leu Ser Asn Lys Glu Leu Ser
65 70 75 80
Asp Ile Arg Lys His Asp Ile Gly Phe Ile Phe Gln Glu Tyr Asn Leu
85 90 95
Leu His Thr Leu Thr Val Lys Glu Asn Ile Met Leu Pro Leu Thr Val
100 105 110
Gln Lys Leu Asp Lys Glu His Met Leu Asn Arg Tyr Glu Lys Val Ala
115 120 125
Glu Ala Leu Asn Ile Leu Asp Ile Ser Asp Lys Tyr Pro Ser Glu Leu
130 135 140
Ser Gly Gly Gln Arg Gln Arg Thr Ser Ala Ala Arg Ala Phe Ile Thr
145 150 155 160
Leu Pro Ser Ile Ile Phe Ala Asp Glu Pro Thr Gly Ala Leu Asp Ser
165 170 175
Lys Ser Thr Gln Asp Leu Leu Lys Arg Leu Thr Arg Met Asn Glu Ala
180 185 190
Phe Lys Ser Thr Ile Ile Met Val Thr His Asp Pro Val Ala Ala Ser
195 200 205
Tyr Ala Asn Arg Val Val Met Leu Lys Asp Gly Gln Ile Phe Thr Glu
210 215 220
Leu Tyr Gln Gly Asp Asp Asp Lys His Thr Phe Phe Lys Glu Ile Ile
225 230 235 240
Arg Val Gln Ser Val Leu Gly Gly Val Asn Tyr Asp Leu
245 250
<210> 187
<211> 243
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 187
Met Ile Leu Ser Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Lys Val Ile Met Arg Lys
1 5 10 15
Lys Thr Thr Leu Ile Leu Ser Ile Leu Phe Pro Val Ile Phe Tyr Ile
20 25 30
Leu Phe Thr Ser Ile Leu Glu Leu Pro Glu Asp Val Lys Pro Lys Phe
35 40 45
Tyr Lys Glu Tyr Met Tyr Ser Met Thr Val Tyr Ser Leu Leu Ser Phe
50 55 60
Ser Leu Leu Thr Phe Pro Leu Asp Ile Ile Asn Glu Lys Gln Asn Glu
65 70 75 80
Trp Arg Gln Arg Leu Met Val Thr Pro Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
85 90 95
Ile Ser Lys Val Val Lys Thr Met Leu Gln Phe Ala Ile Ala Ile Leu
100 105 110
Val Ile Phe Met Val Gly His Phe Tyr Lys Gly Val Ala Met Ser Ala
115 120 125
Val Gln Trp Leu Glu Ser Gly Ile Phe Leu Trp Leu Gly Ala Ser Leu
130 135 140
Leu Ile Thr Phe Gly Ile Leu Phe Ser Leu Leu Asn Asp Ile Gln Lys
145 150 155 160
Thr Ser Ala Leu Ala Asn Ile Val Thr Ile Gly Leu Ala Val Leu Gly
165 170 175
Gly Leu Trp Phe Pro Ile Asn Thr Phe Pro Asn Trp Leu Gln His Val
180 185 190
Ala His Val Leu Pro Ser Tyr His Leu Arg Lys Leu Gly Val Asp Ile
195 200 205
Ala Ser Asn His His Ile Asn Leu Ile Ser Phe Ala Ile Ile Leu Leu
210 215 220
Tyr Ala Leu Gly Ser Ile Ile Ala Val Tyr Cys Ile Ser His Phe Lys
225 230 235 240
Arg Ala Glu
<210> 188
<211> 276
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 188
Met His Lys Ile Phe Ser Lys Asn Asn Leu Ile Phe Phe Val Phe Val
1 5 10 15
Ala Phe Ile Phe Val Val Ile Val Leu Gln Phe Phe Val Ser Ser Glu
20 25 30
Asn Ala Thr Lys Val Asn Leu Ser Gln Thr Phe Glu Pro Ile Ser Trp
35 40 45
Leu His Leu Leu Gly Thr Asp Asp Tyr Gly Arg Asp Leu Phe Thr Arg
50 55 60
Ile Ile Ile Gly Ala Arg Ser Thr Leu Phe Val Thr Val Leu Thr Leu
65 70 75 80
Ile Ala Ile Val Val Ile Gly Val Thr Leu Gly Leu Phe Ala Gly Tyr
85 90 95
Lys Lys Gly Trp Ile Glu Arg Leu Val Leu Arg Phe Ile Asp Val Gly
100 105 110
Leu Ser Ile Pro Glu Phe Ile Ile Met Ile Ala Leu Ala Ser Phe Phe
115 120 125
Gln Pro Ser Leu Trp Asn Leu Val Ile Ser Ile Thr Leu Ile Lys Trp
130 135 140
Met Asn Tyr Thr Arg Leu Thr Arg Ser Ile Val Asn Ser Glu Met Asn
145 150 155 160
Lys Pro Tyr Ile Lys Met Ala Gln Leu Phe His Val Pro Thr Arg Thr
165 170 175
Ile Leu Ile Arg His Leu Thr Pro Lys Ile Ile Pro Ala Ile Ile Val
180 185 190
Leu Met Val Val Asp Phe Gly Lys Ile Ile Leu Tyr Ile Ser Ser Leu
195 200 205
Ser Phe Ile Gly Leu Gly Ala Gln Pro Pro Thr Pro Glu Trp Gly Ala
210 215 220
Met Leu Gln Gln Gly Arg Asp Phe Ile Ser Ser His Pro Ile Met Leu
225 230 235 240
Ile Ala Pro Ala Ser Val Ile Ala Ile Thr Ile Leu Ile Phe Asn Leu
245 250 255
Thr Gly Asp Ala Leu Arg Asp Arg Leu Leu Lys Gln Arg Gly Glu Tyr
260 265 270
Asp Glu Ser His
275
<210> 189
<211> 136
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 189
Met Asn Thr Asn Asp Ala Ile Lys Ile Leu Lys Glu Asn Gly Leu Lys
1 5 10 15
Tyr Thr Asp Lys Arg Lys Asp Met Leu Asp Ile Phe Val Glu Glu Asp
20 25 30
Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Tyr Ile Gln Gln Val Met Asp Glu Asn Tyr
35 40 45
Pro Gly Ile Ser Phe Asp Thr Ile Tyr Arg Asn Leu His Leu Phe Lys
50 55 60
Asp Leu Gly Ile Ile Glu Asn Thr Glu Leu Asp Gly Glu Met Lys Phe
65 70 75 80
Arg Ile Ala Cys Thr Asn His His His His His Phe Ile Cys Glu Lys
85 90 95
Cys Gly Asp Thr Lys Val Ile Asp Tyr Cys Pro Ile Asp Gln Ile Lys
100 105 110
Leu Ser Leu Pro Gly Val Asn Ile His Lys His Lys Leu Glu Val Tyr
115 120 125
Gly Val Cys Glu Ser Cys Gln Asp
130 135
<210> 190
<211> 233
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 190
Met Thr His Lys Tyr Ile Ser Thr Gln Met Leu Ile Ile Phe Thr Ala
1 5 10 15
Leu Met Ile Ile Ala Asn Phe Tyr Tyr Ile Phe Phe Glu Lys Ile Gly
20 25 30
Phe Leu Leu Val Leu Leu Leu Gly Cys Val Leu Val Tyr Val Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Phe His Lys Ile Arg Gly Leu Leu Ala Phe Trp Ile Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Ile Ala Phe Thr Leu Leu Ser Asn Lys Tyr Thr Ile Ile Ile
65 70 75 80
Leu Phe Val Phe Leu Leu Leu Leu Ile Val Arg Tyr Leu Ile His Lys
85 90 95
Phe Lys Pro Lys Lys Val Val Ala Thr Asp Glu Val Met Thr Ser Pro
100 105 110
Ser Phe Ile Lys Gln Lys Trp Phe Gly Glu Gln Arg Thr Pro Val Tyr
115 120 125
Val Tyr Lys Trp Glu Asp Val Gln Ile Gln His Gly Ile Gly Asp Leu
130 135 140
His Ile Asp Leu Thr Lys Ala Ala Asn Ile Lys Glu Asn Asn Thr Ile
145 150 155 160
Val Val Arg His Ile Leu Gly Lys Val Gln Val Ile Leu Pro Val Asn
165 170 175
Tyr Asn Ile Asn Leu His Val Ala Ala Phe Tyr Gly Ser Thr Tyr Val
180 185 190
Asn Glu Lys Ser Tyr Lys Val Glu Asn Asn Asn Ile His Ile Glu Glu
195 200 205
Met Met Lys Pro Asp Asn Tyr Thr Val Asn Ile Tyr Val Ser Thr Phe
210 215 220
Ile Gly Asp Val Glu Val Ile Tyr Arg
225 230
<210> 191
<211> 260
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 191
Met Leu Ile Gln Leu Asp Gln Ile Gly Arg Met Lys Gln Gly Lys Thr
1 5 10 15
Ile Leu Lys Lys Ile Ser Trp Gln Ile Ala Lys Gly Asp Lys Trp Ile
20 25 30
Leu Tyr Gly Leu Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Leu Asn Ile Leu
35 40 45
Asn Ala Tyr Glu Pro Ala Thr Ser Gly Thr Val Asn Leu Phe Gly Lys
50 55 60
Met Pro Gly Lys Val Gly Tyr Ser Ala Glu Thr Val Arg Gln His Ile
65 70 75 80
Gly Phe Val Ser His Ser Leu Leu Glu Lys Phe Gln Glu Gly Glu Arg
85 90 95
Val Ile Asp Val Val Ile Ser Gly Ala Phe Lys Ser Ile Gly Val Tyr
100 105 110
Gln Asp Ile Asp Asp Glu Ile Arg Asn Glu Ala His Gln Leu Leu Lys
115 120 125
Leu Val Gly Met Ser Ala Lys Ala Gln Gln Tyr Ile Gly Tyr Leu Ser
130 135 140
Thr Gly Glu Lys Gln Arg Val Met Ile Ala Arg Ala Leu Met Gly Gln
145 150 155 160
Pro Gln Val Leu Ile Leu Asp Glu Pro Ala Ala Gly Leu Asp Phe Ile
165 170 175
Ala Arg Glu Ser Leu Leu Ser Ile Leu Asp Ser Leu Ser Asp Ser Tyr
180 185 190
Pro Thr Leu Ala Met Ile Tyr Val Thr His Phe Ile Glu Glu Ile Thr
195 200 205
Ala Asn Phe Ser Lys Ile Leu Leu Leu Lys Asp Gly Gln Ser Ile Gln
210 215 220
Gln Gly Ala Val Glu Asp Ile Leu Thr Ser Glu Asn Met Ser Arg Phe
225 230 235 240
Phe Gln Lys Asn Val Ala Val Gln Arg Trp Asn Asn Arg Phe Ser Met
245 250 255
Ala Met Leu Glu
260
<210> 192
<211> 209
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 192
Met Lys Arg Leu Val Thr Gly Leu Leu Ala Leu Ser Leu Phe Leu Ala
1 5 10 15
Ala Cys Gly Gln Asp Ser Asp Gln Gln Lys Asp Gly Asn Lys Glu Lys
20 25 30
Asp Asp Lys Ala Lys Thr Glu Gln Gln Asp Lys Lys Thr Asn Asp Ser
35 40 45
Ser Lys Asp Lys Lys Asp Asn Lys Asp Asp Ser Lys Asp Val Asn Lys
50 55 60
Asp Asn Lys Asp Asn Ser Ala Asn Asp Asn Gln Gln Gln Ser Asn Ser
65 70 75 80
Asn Ala Thr Asn Asn Asp Gln Asn Gln Thr Asn Asn Asn Gln Ser Ser
85 90 95
Asn Asn Gln Ala Asn Asn Asn Gln Lys Ser Ser Tyr Val Ala Pro Tyr
100 105 110
Tyr Gly Gln Asn Ala Ala Pro Val Ala Arg Gln Ile Tyr Pro Phe Asn
115 120 125
Gly Asn Lys Asn Gln Ala Leu Gln Gln Leu Pro Asn Phe Gln Thr Ala
130 135 140
Leu Asn Ala Ala Asn Asn Glu Ala Asn Lys Phe Gly Ser Asn Asn Lys
145 150 155 160
Val Tyr Asn Asp Tyr Ser Ile Glu Glu His Asn Gly Asn Tyr Lys Tyr
165 170 175
Val Phe Ser Phe Lys Asp Pro Asn Ala Asn Gly Lys Tyr Ser Ile Val
180 185 190
Thr Val Asp Tyr Thr Gly Gln Ala Met Val Thr Asp Pro Asn Tyr Gln
195 200 205
Gln
<210> 193
<211> 439
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 193
Met Arg Thr Gly His Tyr Thr Pro Ile Pro Asn Glu Pro His Tyr Leu
1 5 10 15
Val Ile Ser His Ala Asp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Ala Lys Leu
20 25 30
Arg Leu Leu Ile Ile Lys Gln Lys Leu Asp Ile Ser Leu Ala Glu Ser
35 40 45
Val Val Ser Ser Pro Ile Ala Ser Glu His Val Ile Glu Gln Leu Thr
50 55 60
Leu Phe Gln His Glu Arg Arg His Leu Arg Pro Lys Ile Ser Ala Thr
65 70 75 80
Phe Leu Ala Trp Leu Leu Ile Phe Leu Met Phe Ala Leu Pro Ile Gly
85 90 95
Ile Ala Tyr Gln Phe Ser Asp Trp Phe Gln Asn Gln Tyr Val Ser Ala
100 105 110
Trp Ile Glu Tyr Leu Thr Gln Thr Thr Leu Leu Asn His Asp Ile Leu
115 120 125
Gln His Ile Leu Phe Gly Asp Tyr Gly Val Leu Ser Leu Gly Thr Tyr
130 135 140
Ser Leu Val Trp Ala Leu Pro Val Val Ile Leu Ile Ser Leu Ser Thr
145 150 155 160
Ala Ile Ile Asp Gln Thr Gly Leu Lys Ser Trp Met Ile Trp Ala Ile
165 170 175
Glu Pro Ser Met Leu Trp Ile Gly Leu Gln Gly Asn Asp Ile Val Pro
180 185 190
Leu Leu Glu Gly Phe Gly Cys Asn Ala Ala Ala Ile Ser Gln Ala Ala
195 200 205
His Gln Cys His Thr Cys Thr Lys Thr Gln Cys Met Ser Leu Ile Ser
210 215 220
Phe Gly Ser Ser Cys Ser Tyr Gln Ile Gly Ala Thr Leu Ser Ile Phe
225 230 235 240
Ser Val Ala Gly Lys Ser Trp Leu Phe Met Pro Tyr Leu Ile Leu Val
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Ile Leu His Asn Arg Ile Trp Leu Lys Lys Asn Asp
260 265 270
Gln Gln Leu Ser Val Pro Leu Pro Tyr Asp Arg Gln Leu His Met Pro
275 280 285
Asn Ile Arg Gln Met Leu Leu Gln Met Trp Gln Asn Ile Gln Met Phe
290 295 300
Ile Val Gln Ala Leu Pro Ile Phe Ile Thr Ile Cys Leu Ile Val Ser
305 310 315 320
Ile Leu Ser Leu Thr Pro Ile Leu Asn Val Leu Ser Gln Ile Phe Thr
325 330 335
Pro Ile Leu Ser Leu Leu Gly Ile Ser Ser Glu Leu Ser Pro Gly Ile
340 345 350
Leu Phe Ser Met Ile Arg Lys Asp Gly Met Leu Leu Phe Asn Leu His
355 360 365
Gln Gly Ala Leu Leu Gln Gly Met Thr Ala Thr Gln Leu Leu Leu Leu
370 375 380
Val Phe Phe Ser Ser Thr Phe Thr Ala Cys Ser Val Thr Met Thr Met
385 390 395 400
Leu Leu Lys His Leu Gly Gly Gln Ser Ala Leu Lys Leu Ile Gly Lys
405 410 415
Gln Met Val Thr Ser Leu Ser Leu Val Ile Gly Val Gly Ile Ile Val
420 425 430
Lys Ile Val Met Leu Ile Ile
435
<210> 194
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 194
tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22
<210> 195
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 195
Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg
1 5 10
<210> 196
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 196
Lys Asp Tyr Glu Arg Lys Tyr Lys Lys His Ile Val Ser
1 5 10

Claims (36)

1.一种式(I)的融合构建体，
X-A-接头-B-Z(I)
其中：
(1)A与B相同或不同，且独立地为：
(a)基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)COL(SACOL)基因组中的基因命名法，包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611多肽(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ IDNO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；
(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；
(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；
(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或
(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；
(2)该接头是含至少一个氨基酸的氨基酸序列或不存在；
(3)X不存在或是含至少一个氨基酸的氨基酸序列；及
(4)Z不存在或是含至少一个氨基酸的氨基酸序列。
2.权利要求1的构建体，其中(1)(a)是包含如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442多肽、如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽或如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽的多肽。
3.权利要求2的构建体，其中A与B中至少一个是(a)包含如图24中所描绘的序列(SEQID NO:5及121至131)中任一个中所述的SACOL0029多肽的多肽；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包含(a')或(b')的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中的任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(c')中任一个的至少12个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
4.权利要求2的构建体，其中A与B中的至少一个是(a)包含如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442多肽的多肽；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(d)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包含(a')或(b')的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(d')中任一个的至少12个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
5.权利要求2的构建体，其中A与B相同或不同且是(a)包含如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽的多肽；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(d)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
6.权利要求1至2及4中任一项的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一个或多个：KDTINGKSNKSRNW(SEQ ID NO:34)；及KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)。
7.权利要求6的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一个或多个：
STQNSSSVQDKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTADIKNVTFKLVKSVNDIEQV(SEQ ID NO:30)；
DKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVINTK(SEQ ID NO:32)；及DKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTADIKNVTFKLVKSVNDIEQV(SEQ IDNO:33)。
8.权利要求1至2及4至5中任一项的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一个或多个：QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)；TIKDQQKANQLAS(SEQ ID NO:22)；
KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)；及DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。
9.权利要求8的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一个或多个：
RASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASELNNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPNTDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALALEKAKNKVDKSIETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO:12)；
ASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASELNNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPNTDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALALEKAKNKVDKSIETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO:13)；
ASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASELNNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPNTDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQE(SEQ ID NO:14)；
KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:15)；
KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDY(SEQ ID NO:17)；
KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKD(SEQ ID NO:16)；
KDINKIYFM TDVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:19)；
KHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:20)及
SQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:18)。
10.权利要求1至3中任一项的构建体，其中所述免疫原性片段(c')包含以下氨基酸序列中的一个或多个：PYNGVVSFKDATGF(SEQ ID NO:165)；AHPNGDKGNGGIYK(SEQ ID NO:167)；
SISDYPGDEDISVM(SEQ ID NO:169)；RGPKGFNFNENVQA(SEQ ID NO:172)；QFESTGTIKRIKDN(SEQ ID NO:175)；及GNSGSPVLNSNNEV(SEQ ID NO:178)。
11.权利要求10的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列：
TQVKDTNIFPYNGVVSFKDATGFVIGKNTIITNKHVSKDYKVGDRITAHPNGDKGNGGIYKIKSISDYPGDEDISVMNIEEQAVERGPKGFNFNENVQAFNFAKDAKVDDKIKVIGYPLPAQNSFKQFESTGTIKRIKDNILNFDAYIEPGNSGSPVLNSNNEVIGVVYGGIGKIGSEYNGAVYFTPQIKDFIQKHIEQ(SEQ ID NO:39)。
12.权利要求1至11中任一项的构建体，其中所述接头包含至少四个选自以下的相同或不同氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及赖氨酸。
13.权利要求1至12中任一项的构建体，其中所述接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:67)、(ERKYK)n(SEQ ID NO:61)；或(EAAAK)n(SEQ ID NO:63)，其中n＝1至5。
14.权利要求1至13中任一项的构建体，其中所述X包括6至10个氨基酸的聚组氨酸。
15.权利要求1至13中任一项的构建体，其中所述X不存在。
16.权利要求1至15中任一项的构建体，其中所述Z不存在。
17.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至16中任一项的构建体。
18.一种载体，其包含权利要求17的分离的核酸。
19.一种宿主细胞，其包含权利要求18的载体。
20.权利要求19的细胞，其是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的减毒存活形式。
21.权利要求20的细胞，其中所述金黄色葡萄球菌的减毒存活形式具有稳定小菌落变体(small colony variant；SCV)表型。
22.权利要求21的细胞，其中具有稳定SCV表型的该金黄色葡萄球菌的减毒存活形式是ΔhemBΔ720金黄色葡萄球菌。
23.一种组合物，其包含：
(A)至少一种权利要求1至16中任一项定义的构建体；至少一种权利要求17定义的核酸分子；至少一种权利要求18定义的载体；或至少一种权利要求19至22中任一项定义的细胞；及
(B)(i)权利要求1至11中任一项所定义的多肽；
(ii)减毒活金黄色葡萄球菌；
(iii)可药用的赋形剂；
(iv)佐剂；或
(v)(i)至(iv)中至少两种的组合。
24.权利要求23的组合物，其中所述金黄色葡萄球菌的减毒存活形式表达：
(a)基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌COL(SACOL)基因组中的基因命名法，包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ IDNO:186)、如图23I-J中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；
(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；
(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；
(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或
(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
25.权利要求23或24的组合物，其中所述金黄色葡萄球菌的减毒存活形式具有稳定小菌落变体(SCV)表型。
26.权利要求23至25中任一项的组合物，其中所述佐剂包含矾、油、皂素、环状-二鸟苷-5'-单磷酸(c-di-GMP)、聚磷腈、吲哚力西丁(indolicidin)、病原体相关分子模式(PAMPS)、脂质粒或其中至少两种的组合。
27.一种用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的方法，所述方法包括向该哺乳动物给予有效量的权利要求1至16中任一项定义的构建体；权利要求17定义的核酸分子；权利要求18定义的载体；权利要求19至22中任一项定义的细胞；或权利要求23至26中任一项定义的组合物。
28.权利要求27的方法，其中所述葡萄球菌IMI是由一种或多种金黄色葡萄球菌株引起。
29.权利要求27或28的方法，其中该哺乳动物是母牛。
30.有效量的(i)权利要求1至16中任一项定义的构建体；(ii)权利要求17定义的核酸分子；(iii)权利要求18定义的载体；权利要求19至22中任一项定义的细胞；(iv)权利要求23至26中任一项定义的组合物；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的用途。
31.权利要求30的用途，其中所述葡萄球菌IMI是由一种或多种金黄色葡萄球菌株引起。
32.权利要求30或31的用途，其中所述哺乳动物是母牛。
33.权利要求1至16中任一项定义的构建体；权利要求17定义的核酸分子；权利要求18定义的载体；权利要求19至22中任一项定义的细胞；权利要求23至26中任一项定义的组合物或其中至少两种的组合，其用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)。
34.权利要求33的构建体、核酸分子、载体、细胞、组合物或组合，其中该葡萄球菌IMI是由一或多种金黄色葡萄球菌株引起。
35.权利要求33或34的构建体、核酸分子、载体、细胞或组合物，其中该哺乳动物是母牛。
36.一种用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的试剂盒，其包含：
(A)(i)至少一种权利要求1至16中任一项定义的构建体；(ii)至少一种权利要求17定义的核酸分子；(iii)至少一种权利要求18定义的载体；(iv)至少一种权利要求19至22中任一项定义的细胞；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合，及
(B)(i)权利要求1至11中任一项所定义的多肽；
(ii)减毒活金黄色葡萄球菌；
(iii)可药学用的赋形剂；
(iv)佐剂；
(v)有关使用该试剂盒预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的说明书；或
(vi)(i)至(v)中至少两种的组合。
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