KR20190082229A - 스타필로코커스 감염에 대한 백신 구성체 및 이의 용도 - Google Patents

스타필로코커스 감염에 대한 백신 구성체 및 이의 용도 Download PDF

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프랑수아 말루앵
셀린 스떼르
줄리 코떼-그레이블
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소크프라 시앙스 에 제니 에스.에.쎄.
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Abstract

다음의 식 (I)의 융합체 구성체를 제공한다: X-A-링커-B-Z (I); 여기서 (1) A 및 B는 동일하거나 또는 상이하고, 독립적으로 (a) NCBI 기준 서열 NC_002951.2에 기재된 스타필로코커스 아우레우스 COL (SACOL) 게놈 유래의 유전자 명명법을 기반으로, 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131), SACOL0264 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 185), 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92), SACOL0718 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 186), 도 23I-J에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120), SACOL1353 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 187), SACOL1416 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 188), SACOL1611 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 189), 도 25D에 도시된 바와 같은 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164), SACOL1912 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 43), SACOL1944 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 190), SACOL2144 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 191), SACOL2365 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 192), SACOL2385 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 50) 또는 SACOL2599 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 193)를 포함하는 폴리펩티드; (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드이고; (2) 링커는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열이거나 또는 부재하고; (3) X는 부재하거나 또는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열이고; (4) Z는 부재하거나 또는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열이다. 또한 융합체를 포함하는 조성물 및 키트, 및 이들 융합체, 조성물 및 키트의 용도를 제공한다.

Description

스타필로코커스 감염에 대한 백신 구성체 및 이의 용도
본 발명은 스타필로코커스 (Staphylococcus) 감염에 대한 백신 구성체 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 스타필로코커스 감염 예컨대 소 유선내 감염 (bovine intramammary infection) (IMI)에 대한 항원을 조합한 백신 구성체 및 그들의 용도에 관한 것이다.
서열목록에 대한 참조
37 C.F.R. 1.821(c)에 따라서, 서열 목록은 2017년 10월 5일에 생성되고 크기가 278 킬로바이트인, SEQUENCE LISTING USP62411120_ST25의 파일명으로 ASCII에 부응하는 텍스트 파일로서 본 명세서와 함께 제출되었다. 상기 언급된 파일의 내용은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
소 유선염은 유제품 생산자에게 가장 빈번하고 비용이 많이 드는 질환이며 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)가 이 질환의 발생에서 가장 흔한 원인이되는 전염성 박테리아로 여겨진다 (Sears et al., 2003). 유선염을 초래할 수 있는 스타필로코커스 IMI는 치료하는 것이 어렵고 잦은 재발이 일반적이다 (Sandholm et al., 1990).
에스. 아우레우스 (S. aureus) IMI의 예방 및 방제를 위한 백신의 개발이 광범위하게 연구되고 있지만 지금까지 어떠한 제제도 보호 효능을 입증하지 못하고 있다. 이것은 아마도 부적당한 백신 표적 (Middleton, 2008; Middleton 2009), 유선염을 유발할 수 있는 균주 간 높은 다양성 (Buzzola, 2007; Kerro-Dego, 2006; Middleton, 2008) 또는 적절한 면역 반응의 유도 실패 (Bharathan, 2011; Ferens, 2000; Fowler, 2014; Proctor, 2012) 때문인 듯 하다. 오로지 백신-유도 항체만을 기반으로 하는 면역성이 중요할 수 있지만 에스. 아우레우스에 대하여 보호성을 유도하는데는 불충분하다는 것이 점점 더 이해되고 있다 (Middleton 2008; Middleton 2009). Th1 및 Th17 유형 반응을 기반으로 하는 세포 매개 면역성 (CMI)이 보호성을 완성하는데 필수적일 수 있는 것으로 보인다 (Fowler, 2014; Lin, 2009; Proctor, 2012; Spellberg, 2012).
시험관 내에서 항생제에 대한 박테리아 감수성은 만성적으로 감염되는 소의 치료적 효능에 대해서는 불충분한 예측자이다 (Owens et al., 1997). 유선염의 치료 이후에 뒤따르는 감염이 새롭게 획득된 균주에 기인하는 것일 수 있지만, 그들은 종종 본래 감염 유기체의 잔존에 의한 결과이다 (Sandholm et al., 1990; Myllys et al., 1997). 따라서 현존하는 요법은 대개는 감염을 제거하는데 실패하여 스타필로코커스 IMI를 예방하거나 또는 치료하기 위한 신규한 접근법을 발견하는 것이 매우 바람직할 것이다.
백신 효능 및 보호능의 결여가 상업적으로 입수할 수 있는 에스. 아우레우스 백신에서 지적되었다 (Middleton, 2008). 따라서, IMI 및 유선염에 대한 보호성을 위한 백신 성분으로서 IMI 동안 발현되는 것으로 알려진 고도로 효율적인 에스. 아우레우스 항원을 사용하는 것이 매우 바람직할 것이다.
본 발명은 이들 및 다른 요구를 충족하고자 한다.
본 발명의 설명은 다수의 문헌을 참조하고, 그 내용은 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
제1 양상에서, 본 발명은 증가된 면역원성을 나타내는 융합체 폴리펩티드 및 스타필로코커스 IMI에 대한 백신으로서 그들의 용도를 제공한다.
스타필로코커스 예컨대 에스. 아우레우스 IMI의 특징은 숙주 세포 내에서 존속하는 에스. 아우레우스의 능력이다. 특히, 에스. 아우레우스 소형 콜로니 변이체 (SCV)는 일반적으로 침습성 감염을 발생시키지 않고 숙주 세포 내에 내재화될 수 있다. 그러므로 추가의 양상에서, 본 발명은 이러한 균주에 대한 면역 반응을 제공하고 백신의 보호 효능을 증가시키기 위해서 SCV의 표현형적 측면을 기반으로 하는 백신 목적을 위한 생-약독화 에스. 아우레우스 균주를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 다음의 항목들을 제공한다:
항목 1: 다음의 식 (I)의 융합체 구성체: X-A-링커-B-Z (I); 여기서 (1) A 및 B는 동일하거나 또는 상이하고, 독립적으로 (a) NCBI 기준 서열 NC_002951.2에 기재된 스타필로코커스 아우레우스 COL (SACOL) 게놈 유래의 유전자 명명법을 기반으로, 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131), SACOL0264 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 185), 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92), SACOL0718 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 186), 도 23I-K에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120), SACOL1353 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 187), SACOL1416 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 188), SACOL1611 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 189), 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164), SACOL1912 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 43), SACOL1944 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 190), SACOL2144 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 191), SACOL2365 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 192), SACOL2385 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 50) 또는 SACOL2599 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 193)를 포함하는 폴리펩티드; (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드이고; (2) 링커는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열이거나 또는 부재하고; (3) X는 부재하거나 또는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열이고; (4) Z는 부재하거나 또는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열임.
항목 2: 항목 1에 있어서, (1) (a)는 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131), 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92), 도 23I-K에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120), 또는 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164)를 포함하는 폴리펩티드인 구성체.
항목 3: 항목 2에 있어서, A 및 B 중 적어도 하나는 (a) 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131)를 포함하는 폴리펩티드; (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드이고; A 및 B 중 나머지 하나는 (a') 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 SACOL1867 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164); (b') (a')의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c') (a') 또는 (b')의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d') (a') 내지 (c') 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e') (a') 내지 (d') 중 어느 하나의 적어도 12개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드인 구성체.
항목 4: 항목 2에 있어서, A 및 B 중 어느 하나는 (a) 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92); (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드이고; A 및 B 중 나머지 하나는 (a') 도 23I-K에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120); (b') (a')의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 유전자 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c') (a') 또는 (b')의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d') (a') 내지 (c') 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e') (a') 내지 (d') 중 적어도 12개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드인 구성체.
항목 5: 항목 2에 있어서, A 및 B는 동일하거나 또는 상이하고 (a) 도 23I-K에 도시된 바와 같은 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120); (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드인 구성체.
항목 6: 항목 1-2 및 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 구성체: KDTINGKSNKSRNW (SEQ ID NO: 34); 및 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1).
항목 7: 항목 6에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 구성체:
Figure pct00001
항목 8: 항목 1-2 및 4-5 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 구성체: QFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO: 21); TIKDQQKANQLAS (SEQ ID NO: 22); KDINKIYFMTDVDL (SEQ ID NO: 23); 및 DVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 24).
항목 9: 항목 8에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 구성체:
Figure pct00002
항목 10: 항목 1-3 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역원성 단편 (c')은 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 구성체: PYNGVVSFKDATGF (SEQ ID NO: 165); AHPNGDKGNGGIYK (SEQ ID NO: 167); SISDYPGDEDISVM (SEQ ID NO: 169); RGPKGFNFNENVQA (SEQ ID NO: 172); QFESTGTIKRIKDN (SEQ ID NO: 175); 및 GNSGSPVLNSNNEV (SEQ ID NO: 178).
항목 11: 항목 10에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 구성체:
Figure pct00003
항목 12: 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 아스파테이트, 글루타메이트 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 4종의 동일하거나 또는 상이한 아미노산을 포함하는 것인 구성체.
항목 13: 항목 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 링커는 (GGGGS)n (SEQ ID NO: 67), (ERKYK)n (SEQ ID NO: 61); 또는 (EAAAK)n (SEQ ID NO: 63)를 포함하고, 여기서 n = 1 내지 5인 구성체.
항목 14: 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 X는 6 내지 10개 아미노산의 폴리히스티딘을 포함하는 것인 구성체.
항목 15: 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 X는 부재하는 것인 구성체.
항목 16: 항목 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 Z는 부재하는 것인 구성체.
항목 17: 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 정의된 구성체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
항목 18: 항목 17에 정의된 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
항목 19: 항목 18에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
항목 20: 항목 19에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태인 세포.
항목 21: 항목 20에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태는 안정화된 소형 콜로니 변이체 (SCV) 표현형을 갖는 것인 세포.
항목 22: 항목 21에 있어서, 안정화된 SCV 표현형을 갖는 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태는 ΔhemBΔ720 에스. 아우레우스인 세포.
항목 23: (A) 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 정의된 구성체 중 적어도 하나; 항목 17에 정의된 핵산 분자 중 적어도 하나; 항목 18에 정의된 벡터 중 적어도 하나; 또는 항목 19 내지 22 중 어느 하나에 정의된 세포 중 적어도 하나; 및 (B) (i) 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 정의된 폴리펩티드; (ii) 생 약독화 스타필로코커스 아우레우스; (iii) 약학적으로 허용가능한 부형제; (iv) 보강제; 또는 (v) (i) 내지 (iv) 중 적어도 둘의 조합을 포함하는 조성물.
항목 24: 항목 23에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태는 (a) NCBI 기준 서열 NC_002951.2에 기재된 스타필로코커스 아우레우스 COL (SACOL) 게놈 유래의 유전자 명명법을 기반으로, 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131), SACOL0264 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 185), 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92), SACOL0718 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 186), 도 23I-K에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120), SACOL1353 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 187), SACOL1416 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 188), SACOL1611 (SEQ ID NO: 189), 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164), SACOL1912 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 43), SACOL1944 (SEQ ID NO: 190), SACOL2144 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 191), SACOL2365 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 192), SACOL2385 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 50) 또는 SACOL2599 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 193)를 포함하는 폴리펩티드; (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 것인 조성물.
항목 25: 항목 23 또는 24에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태는 안정화된 소형 콜로니 변이체 (SCV) 표현형을 갖는 것인 조성물.
항목 26: 항목 23 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 보강제는 명반, 오일 (예를 들어, 유화유, 미네랄유), 사포닌 (예를 들어, Quil-A™), 환형-디구아노신-5'-모노포스페이트 (c-di-GMP), 폴리포스파신, 인돌리시딘, 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP) 또는 이의 적어도 2종의 조합을 포함하는 것인 조성물.
항목 27: 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 포유동물에게 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 구성체; 항목 17에 정의된 핵산 분자; 항목 18에 정의된 벡터; 항목 19 내지 22 중 어느 하나에 정의된 세포; 또는 항목 23 내지 26 중 어느 하나에 정의된 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
항목 28: 항목 27에 있어서, 상기 스타필로코커스 IMI는 하나 이상의 스타필로코커스 아우레우스 균주에 의해 야기되는 것인 방법.
항목 29: 항목 27 또는 28에 있어서, 상기 포유동물은 소인 방법.
항목 30: 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)을 예방 및/또는 치료하기 위한, (i) 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 정의된 구성체; (ii) 항목 17에 정의된 핵산 분자; (iii) 항목 18에 정의된 벡터; 항목 19 내지 22 중 어느 하나에 정의된 세포; (iv) 항목 23 내지 26 중 어느 하나에 정의된 조성물; 또는 (v) (i) 내지 (iv) 중 적어도 2종의 조합의 유효량의 용도.
항목 31: 항목 30에 있어서, 상기 스타필로코커스 IMI는 하나 이상의 스타필로코커스 아우레우스 균주에 의해 야기되는 것인 용도.
항목 32: 항목 30 또는 31에 있어서, 상기 포유동물은 소인 용도.
항목 33: 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한, 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 정의된 구성체; 항목 17에 정의된 핵산 분자; 항목 18에 정의된 벡터; 항목 19 내지 22 중 어느 하나에 정의된 세포; 항목 23 내지 26 중 어느 하나에 정의된 조성물 또는 이의 적어도 2종의 조합.
항목 34: 항목 33에 있어서, 상기 스타필로코커스 IMI는 하나 이상의 스타필로코커스 아우레우스 균주에 의해 야기되는 것인 구성체, 핵산 분자, 벡터, 세포, 조성물 또는 조합.
항목 35: 항목 33 또는 34에 있어서, 상기 포유동물은 소인 구성체, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 조성물.
항목 36: 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)을 예방 및/또는 치료하기 위한 키트로서, (A) (i) 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 정의된 구성체 중 적어도 하나; (ii) 항목 17에 정의된 핵산 분자 중 적어도 하나; (iii) 항목 18에 정의된 벡터 중 적어도 하나; (iv) 항목 19 내지 22 중 어느 하나에 정의된 세포 중 적어도 하나; 또는 (v) (i) 내지 (iv) 중 적어도 2종의 조합, 및 (B) (i) 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 정의된 폴리펩티드; (ii) 생 약독화 스타필로코커스 아우레우스; (iii) 약학적으로 허용가능한 부형제; (iv) 보강제; (v) 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)을 예방 및/또는 치료하기 위해 키트를 사용하기 위한 지시서; 또는 (vi) (i) 내지 (v) 중 적어도 2종의 조합을 포함하는 것인 키트.
첨부된 도면에서,
도 1A-D. 2차 면역화 이후 4주 (실험 감염 직전)에, 백신의 각 항원, 즉 SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, SACOL1867, SACOL1912 및 SACOL2385에 대한 백신접종 (9) 및 위약 (10) 소에서의 혈청 총 IgG (도 1A), IgG1 (도 1B), 및 IgG2 (도 1C) 역가를 도시한다. 도 1D에서, IgG2/IgG1 비율은 백신접종된 소에 대해 표시된다. 도 1A, B 및 C에서, 개방 원형 (○)은 백신접종된 소에 대한 데이타를 나타내고, 검은색 사각형 (■)은 위약 소에 대한 데이타를 나타낸다. 각각의 기호는 1마리 소에 대한 역가를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타낸다: 파선은 백신접종된 소에 대한 중앙값을 나타내는 반면 연속선은 위약 소에 대한 중앙값을 나타낸다. 도 1A, B 및 C에서, 백신접종된 소에 대한 역가는 위약 소의 역가보다 더 높다 (P< 0.0001). 도 1D에서, 기호는 각 소에 대한 비율 IgG2/IgG1을 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타낸다. 상이한 문자는 통계적 편차를 나타낸다. ***, P<0.001.
도 2. 각각의 항원에 대한 2차 면역화 이후 4주에 백신접종된 소 (9) 및 위약 소 (10) 유래의 혈액 CD4+ 세포의 항원 의존적 증식을 보여준다. 각각의 기호는 양성 대조군 (ConA) 또는 각각의 항원, 즉 SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, SACOL1867, SACOL1912 및 SACOL2385와 인큐베이션 1주 후에 각 소에 대한 증식된 CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다. 개방 원형 (○)은 백신접종된 소에 대한 데이타를 나타내고, 검은색 사각형 (■)은 위약 소에 대한 데이타를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타낸다: 파선은 백신접종된 소에 대한 중앙값을 나타내는 한편 연속선은 위약 소에 대한 중앙값을 나타낸다. 통계 분석: SAS의 혼합 절차. 기호 *는 항원 SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720 및 SACOL1912에 대한 백신접종 그룹 및 위약 그룹 간 통계적 편차를 보여준다 (*, P<0.05). 또한, CD8+ 세포의 증식은 모든 항원에 대해서 백신접종 소 및 위약 소의 경우에 유사하였고 항원 SACOL0720은 예외적으로 백신접종 소에 대해서 CD8+ 세포의 더 높은 증식이 관찰되었다 (데이타는 도시하지 않음).
도 3. 젖소에서 실험적 에스. 아우레우스 유선내 감염을 보여준다. 2차 면역화 이후 4주 4일 후에, 63 CFU (Colony Forming Unit)의 에스. 아우레우스를 저녁 착유 시 백신접종 (9) 및 위약 소 (10)의 4 쿼터 중 3 쿼터에게 주입하였다 (1일, 도 3에서 화살표). 무균 우유 샘플을 아침 착유 시에 수집하였고 체세포 계측치 (SCC)를 Valacta (Ste-Anne-de-Bellevue, QC)를 통해서 결정하였다. 개방 원형 (○) 및 파선은 백신접종된 소에 대한 데이타를 나타내는 한편, 검은색 사각형 (■) 및 연속선은 위약 소에 대한 데이타를 나타낸다. 각각의 개방 원형은 백신접종된 소 (27)의 모든 감염된 쿼터에 대한 SCC의 평균을 나타내는 반면 각각의 사각형은 위약 소의 모든 감염원 쿼터 (30 쿼터)에 대한 SCC의 평균을 나타낸다. 챌린지 기간 동안, 우유 중 체세포 계측치는 위약 소의 경우보다 백신접종된 소의 경우에 유의하게 더 낮은 것으로 확인되었다 (***; P<0.001).
도 4A-C. 도 4A는 각 소에 대한 CFU 및 SCC 간 상관성을 보여주고, 도 4B는 각 소에 대한 SCC 및 SACOL0442에 대한 혈청 IgG1 역가 간 상관성을 보여준다. 도 4A에서는, 감염의 시작부터 종료까지 감염된 3 쿼터에 대한 SCC 및 CUF의 평균을 나타낸다. 도 4B에서는, 감염의 시작부터 종료까지 감염된 3 쿼터에 대한 SCC의 평균, 및 2차 면역화 후 4주 및 실험 감염 직전 SACOL0442에 대한 혈청 IgG1 역가를 나타낸다. 개방 원형은 백신접종된 소에 대한 데이타를 나타내고 검은색 사각형은 위약 소에 대한 데이타를 나타낸다. SCC/mL 및 CFU/mL 간에 강력한 상관성이 존재하고 SACOL0442에 대한 IgG1 역가 및 SCC 간에는 음의 상관성이 존재한다. 도 4C에서, SACOL0029에 대한 우유 IgG2 역가에 대한 SCC 또는 CFU 간 상관성이 실험 감염 후 10일 (2차 면역화 후 6주)에 각 소에 대해서 확인된다. 각각의 기호는 실험 감염 후 10일에 1마리 소에 대한 데이타를 나타낸다. 무균 우유 샘플은 오전 착유 시에 수집하였고 에스. 아우레우스의 생균 계측치는 10배 희석 및 TSA (tryptic soy agar) 플레이트 상에 플레이팅하여 결정하였고 한편 SCC는 Valacta (Ste-Anne-de-Bellevue, QC)를 통해서 결정하였다. 각각의 소에 대한 SCC 및 CFU 데이타는 실험 감염 후 10일에 감염된 3 쿼터에 대한 데이타의 평균이다. 우유 IgG2 역가의 결정을 위한 우유 샘플은 실험 감염 후 10일 (2차 면역화 후 6주)에 각각의 소의 4 쿼터 유래 우유의 균등한 부피의 혼합물이다. 검은색 사각형 (■)은 위약 소에 대한 데이타를 나타내고, 개방 원형 (○)은 백신접종된 소에 대한 데이타를 나타낸다.
도 5. 융합된 항원 SACOL0029 및 SACOL1867 (SACOL0029-1867로서 표시됨) 및 항원 SACOL0442 및 SACOL0720을 포함하는 백신의 각 항원에 대한 백신접종된 소의 혈청 총 IgG 역가를 도시한다. ELISA에서, 표적화 항원은 SACOL0029-1867, SACOL0029, SACOL1867, SACOL0442 및 SACOL0720이었다. 각각의 개방 원형은 11마리 소 각각에 대한 2차 면역화 후 4주에 역가를 나타내는 한편 각각의 검은색 다이아몬드는 면역전 역가를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타낸다: 실선은 면역전 혈청의 경우이고, 점선은 면역화 후 4주에 채취된 샘플의 경우이다. 면역접종된 소에 대한 역가는 면역전 혈청의 역가보다 더 높다 (**, P < 0.01; 시험된 다른 항원의 경우 ***, P < 0.001).
도 6. 융합체 단백질 (SACOL0029-1867; 융합체), 개별 단백질의 조합 (SACOL0029 + SACOL1867; 조합), SACOL0029 단백질 단독 (0029) 또는 SACOL1867 단백질 단독 (1867)을, 등가 몰량으로 면역화시킨 마우스의 SACOL1867 항원에 대한 혈청 총 IgG 역가를 도시한다. 개방 원형 (○)은 면역전 역가에 대한 데이타를 나타내고, 검은색 사각형 (■)은 면역 역가의 데이타를 나타낸다. 면역전 역가의 경우에, 면역전 혈청은 그룹 당 하나의 개방 원형으로 표시된, 면역전 풀 역가를 수득하기 위해 각 면역화 그룹의 5마리 간에 균등하게 혼합하였다. 면역 역가의 경우, 각각의 사각형 기호는 1마리 마우스에 대한 역가를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타낸다: 검은색 선은 면역 혈청에 대한 중앙값을 나타내는 한편 파선 (및 개방 원형)은 면역전 혈청 풀에 대한 중앙값을 나타낸다. 융합체, 조합 및 1867 그룹에서 백신접종된 마우스에 대한 역가는 면역전 마우스에 대한 역가보다 높고 (P< 0.001), SACOL0029 1가 항원을 단독으로 수용한 마우스의 역가는 SACOL1867에 대한 면역전 풀의 역가와 유의하게 상이한 것으로 확인되지 않았다. 조합 및 2종의 1가 백신 그룹 대비 융합체 그룹의 면역 역가 간 통계적 유의성을 표시하였다 (***: P< 0.001).
도 7. SACOL0442의 아미노산 서열의 단편 (GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD, SEQ ID NO: 2)에 함유되고, SACOL0442 및 SACOL0720로부터 코딩된 펩티드의 융합체 KDGGKYTLESHKELQ EAAAKEAAAK KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 3) (그룹 1) 또는 SACOL0442로부터 코딩된 펩티드 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1) (그룹 2)로 면역화된 마우스로부터 수득된 B-세포 에피토프 서열 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1)에 대해 유도된 혈청 총 IgG (ELISA 어세이로 OD 450 nm에서 측정함). 각각의 그룹은 2-주 간격으로 등몰량의 서열 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1) (그룹 1의 경우 100 ㎍의 KDGGKYTLESHKELQ EAAAKEAAAK KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 3) 및 그룹 2의 경우 31.25 ㎍의 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1))이 2회 주사된 4마리 동물 (n = 4)로 구성되었고, 혈청은 마지막 주사 후 1주에 채혈된 혈액으로부터 제조되었다. ELISA 어세이는 100 000배 희석된 혈청 샘플에서 수행되었고 SACOL0442 (GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD, (SEQ ID NO: 2)) 유래의 단편이 펩티드 에피토프 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1)를 함유하는 표적 항원으로서 사용되었다. 개별 데이타는 그래프 상에 원형으로서 표시되어 있고 중앙값은 막대로 표시되어 있다. 그룹 간 편차는 통계적으로 유의한 것으로 확인되었다 (P < 0.0286, 쿠스칼-왈리스 (Kuskal-Wallis) 검정법, GraphPad Prism™ 7.00).
도 8A-B. 스타필로코커스 아우레우스의 ATCC29213 및 Δ720 균주에서 hemB 의 결실. (도 8A) 야생형 (WT) 균주 ATCC29213 및 이의 동계 돌연변이체 Δ720의 hemB 유전자를 상동성 재조합으로 결실시키고 ermA 카세트로 치환시켜서 각각 돌연변이체 균주 hemB 및 Δ720ΔhemB 를 생성시켰다. 굵은선 및 번호는 부모 (1) 및 hemB 결실 (2) 균주에 대해 B에 도시되어 있는 PCR-증폭 영역을 표시한다. (도 8B) WT 균주 및 이의 동계 ΔhemB 돌연변이체의 PCR 생성물 (유사한 결과가 Δ720 및 Δ720ΔhemB 균주에서 얻어짐).
도 9A-C. MAC-T 세포 감염성에 대한 에스. 아우레우스 ΔhemB, Δ720, 및 ΔhemBΔ720 돌연변이의 영향을 도시한다. MAC-T 세포는 3시간 동안 4종의 균주 각각으로 감염되었고, 그 이후에 리소스타핀과 추가 30분 (t=3h), 12시간 또는 24시간 동안 인큐베이션시켰고 생존 세포내 박테리아의 측정 (CFU)을 위해 용해시켰다. (도 9A) Δ720, 및 (도 9B) ΔhemBΔ720 돌연변이체에 대한 t=3h에 세포내에서 발견된 초기 접종원의 상대적 회수율. 결과는 각각 ATCC 29213 (WT) 또는 ΔhemB 에 대해 수득된 것에 따라서 정규화하고, 평균과 SD로서 표시한다 (**, P ≤ 0.01; ***, P ≤ 0.001; 단측 t 검정). (도 9C) 12h (좌) 및 24h (우)에 WT 및 돌연변이체에 대한 세포내 CFU의 평균 및 SD. 이원 ANOVA 및 터키 (Tukey) 다중 비교 검정을 사용하였다 (*: P ≤ 0.05; ***: P ≤ 0.001). 모든 값은 각각 삼중으로 수행된, 3회 독립 실험의 평균을 나타낸다.
도 10. 시간 경과에 따른 MAC-T 세포 내에서 에스. 아우레우스 ATCC 29213 (WT) 및 동계 돌연변이체의 잔존성을 도시한다. MAC-T 세포는 3시간 동안 4종 균주 각각으로 감염되었고, 이후에 리소스타핀과 추가 30분, 12시간 또는 24시간 동안 인큐베이션되었으며 세포내 박테리아의 측정 (CFU)을 위해 용해되었다. 세포내 박테리아 CFU는 밑수가 10인 로그값으로 전환시킨 후 초기 접종원의 백분율로서 표시된다 (Log10 CFU/mL). 값은 3회 독립 삼중 실험의 평균과 표준 편차로 표시된다.
도 11A-B. 에스. 아우레우스 ATCC 29213 (WT) 및 동계 돌연변이체가 감염된 MAC-T 세포의 생존율을 도시한다. MAC-T 세포는 3시간 동안 4종 균주 각각으로 감염되었고, 이후에 리소스타핀과 12시간 (A) 또는 24시간 (B) 동안 인큐베이션되었다. 다음으로 MTT 생존율 어세이는 문헌 [Kubica et al., 2008]에 기술된 방법으로 수행되었다. 결과는 비감염 세포에 대한 생존율 백분율로서 기록되어 있으며 삼중으로 수행된 3회 독립 실험의 평균과 SD로서 표시되어 있다. (Φ) 기호의 통계적 유의성은 WT와 비교된다 (이원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정: * 또는 Φ: P ≤ 0.05; **: P ≤ 0.01; ***: P ≤ 0.001; ΦΦΦΦ: P ≤ 0.0001).
도 12. 부모 (WT) 및 ΔhemBΔ720 (ΔΔ) 균주에 의한 마우스 IMI를 도시한다. 마우스는 이전에 기술된 대로 감염시켰으며 감염 후 표시된 시간 (h) 또는 일수 (D)에 유선을 채취하였다. 각 컬럼은 그룹에 대한 유선의 박테리아 CFU 계측치의 중앙값을 나타내고, 범위는 막대로 표시되어 있다. D7일에 WT 균주를 제외하고 (2 유선: 1마리 마우스만 생존) 그룹 당 최소 6 유선이 사용되었다. 특정 시점에 마우스의 폐사율은 화살표로 표시되어 있다. 별표는 유선으로부터 ΔhemBΔ720의 청소를 위미한다 (10 CFU/유선의 검출 한계치 미만).
도 13. 이중 돌연변이체 (Δ720ΔhemB)는 감염 후 처음 24시간 동안 WT과 비슷한 수준으로 유선 내 호중구 유입을 자극한다. 마우스는 재료 및 방법에 기술된 대로 감염시켰고, 대조군 (PBS)의 마우스는 멸균된 PBS 주사를 받았다. 재료 및 방법에 기술된 대로 표시된 시간에 유선을 채취하였고, 균질화시켰으며 MPO 활성에 대해 동역학적으로 어세이하였다. 각각의 점은 유선의 그램으로 조정된 미가공값으로서 표시된, 하나의 유선에 대한 MPO 유닛을 나타낸다. 평균은 굵은선으로 표시되어 있다.
도 14. 에스. 아우레우스 ATCC 29213 (WT) 및 이중 돌연변이체 Δ720ΔhemB (ΔΔ)에 의한 마우스 IMI 이후 24시간에 거대 R4 및 L4 유선의 시각적 염증. 마우스는 재료 및 방법에 기술된 대로 감염시켰고, 대조군 (PBS) 마우스는 멸균된 PBS 주사를 받았다. 사진은 24시간 후 채취된 유선을 도시한다. 각 패널에서, R4 (좌) 및 L4 (우) 유선이 도시되어 있다.
도 15A. 호중구 침윤도가 이중 돌연변이체 Δ720ΔhemB의 제거 이후에 정상 수준으로 되돌아 온다. 마우스는 재료 및 방법에 기술된 대로 감염시켰고, 대조군 (PBS)의 마우스는 멸균된 PBS 주사를 받았다. 재료 및 방법에 기재된 대로 유선을 표시된 시간에 채취하였고, 균질화시켰으며 MPO 활성에 대해서 동역학적으로 어세이하였다. 컬럼은 유선의 그램으로 조정된 6 유선의 그룹 (PBS 대조군의 경우 4)의 MPO 유닛의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 예시한다. 감염후 4일 및 12일 그룹 간 통계적 유의성은 (Φ) 기호로 표시되어 있다. 일원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하였다 (ΦΦ: P ≤ 0.01; NS: 그룹 간 유의한 편차없음).
도 15B-C. 생-약독화 이중 돌연변이체 (Δ720ΔhemB)로 마우스의 면역화는 통상적으로 발견되는 spa 유형의 에스. 아우레우스 소 유선염 단리주에 대하여 강력한 체액성 반응을 자극시킨다. 마우스는 이전에 기술된 대로 면역화시켰다: 혈청은 프라이밍 면역화 전 (면역전) 및 부스트 면역화 이후 10일 (면역)에 채혈되었다. 도 15B. IgG 역가는 생-약독화 균주 Δ720GΔhemB 의 용량 증가에 따라서 상승된다: 각각의 점은 Δ720GΔhemB 전체 세포 추출물에 대한 1마리 마우스의 총 IgG 역가를 나타낸다. 중앙값은 면역 역가의 경우에 굵은선으로 나타내었고 면역전 역가는 파선으로 나타내었다. 역가는 그들의 상응하는 면역전 역가와 비교되었다 (이원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정: ****: P ≤ 0.0001). 도 15C. 생-약독화 돌연변이체 Δ720GΔhemB 에 의한 면역화는 통상적으로 발견되는 spa 유형의 유선염 균주들이 공유하는 성분에 대해 IgG 역가를 부여한다. 각각의 점은 표시된 균주의 전체 세포 추출물에 대한 1마리 마우스의 총 IgG 역가를 나타낸다. 중앙값은 면역 역가의 경우에 굵은선으로 나타내고 면역전 역가는 파선으로 나타내었다. 모든 면역 역가는 그들의 상응하는 면역전 역가 (P ≤ 0.0001) 및 임상 균주 간에 비교되었다 (이원 ANOVA 및 시닥 (Sidak) 다중 비교 검정: NS: 유의한 편차없음).
도 16. 단백질 믹스 (5 ㎍의 항원 SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, 및 SACOL0029-1867 융합체로 구성), 105 CFU의 약독화된 생균주 Δ720ΔhemB 단독 또는 단백질 믹스와 Δ720ΔhemB 균주의 조합으로 면역화된 마우스의 SACOL0029-1867 융합체 단백질에 대한 총 혈청 IgG 역가를 도시한다. 개방 원형 (○)은 면역전 역가의 데이타를 나타내고, 검은색 사각형 (■)은 면역 역가의 데이타를 나타낸다. 각각의 기호는 1마리 마우스에 대한 역가를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타낸다: 검은색 선은 면역 혈청에 대한 중앙값을 나타내는 반면 파선은 면역전 혈청에 대한 중앙값을 나타낸다. 단백질 믹스 그룹 및 조합 그룹에서 백신접종된 마우스에 대한 역가는 면역전 마우스의 역가보다 더 높다 (P< 0.001). 2개의 백신접종 마우스 그룹 대비 조합의 면역 역가 간 통계적 유의성이 확인되었다 (**: P< 0.01).
도 17. 단백질 믹스 (5 ㎍의 항원 SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, 및 SACOL0029-1867 융합체로 구성됨), 105 CFU의 약독화된 생균주 Δ720ΔhemB 단독 또는 단백질 믹스와 Δ720ΔhemB 균주의 조합으로 면역화된 마우스의 SACOL0029에 대한 총 혈청 IgG 역가를 도시한다. 개방 원형 (○)은 면역전 역가의 데이타를 나타내고, 검은색 사각형 (■)은 면역 역가의 데이타를 나타낸다. 각각의 기호는 1마리 마우스에 대한 총 IgG 역가를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타낸다: 검은색 선은 면역 혈청에 대한 중앙값을 나타내는 한편 파선은 면역전 혈청에 대한 중앙값을 나타낸다. 3개 마우스 그룹의 면역 역가 및 면역전 역가 간 통계적 유의성이 확인되었다 (**: P< 0.01).
도 18. SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, 및 SACOL0029-1867 단백질 믹스, 105 CFU의 약독화된 생균주 Δ720ΔhemB 단독 또는 단백질 믹스 및 Δ720ΔhemB 의 조합으로 면역화된 마우스에 대한 스타필로코커스 표면 단백질 ClfA에 대한 총 혈청 IgG 역가를 도시한다. 개방 원형 (○)은 면역전 역가의 데이타를 나타내고, 검은색 사각형 (■)은 면역 역가의 데이타를 나타낸다. 각 기호는 1마리 마우스에 대한 역가를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타낸다: 검은색 선은 면역 혈청에 대한 중앙값을 나타내는 반면 파선은 면역전 혈청에 대한 중앙값을 나타낸다. 면역전 역가 및 면역 역가 간 통계적 유의성이 확인되었다 (*: P< 0.05).
도 19. 단백질 믹스, 또는 단백질 믹스 및 약독화 Δ720ΔhemB 생균주의 조합으로 면역화된 마우스의 SACOL0029-1867 융합체 폴리펩티드에 대한 IgG2a/IgG1 역가의 혈청 비율을 아래에 도시한다.
도 20. SACOL0029 항원에 대한 혈청 비율을 도시한다. 개방 사각형 (□)은 면역전 역가의 데이타를 나타내고, 검은색 사각형 (■)은 면역 역가의 데이타를 나타낸다. 각각의 기호는 1마리 마우스에 대한 역가를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타낸다. 조합 그룹 비율 대비 단백질 믹스 그룹 비율 간 통계적 유의성이 확인되었다 (*: P< 0.05; **: P< 0.01).
도 21A-J. I. SACOL0029 폴리뉴클레오티드 (전체 길이 서열 SEQ ID NO: 4) 및 폴리펩티드 (전체 길이, 단편(들) 및 변이체(들) 서열 SEQ ID NO: 5 내지 9). 선택된 에피토프는 음영 및/또는 굵은체로 표시되어 있다; II. SACOL0720 폴리뉴클레오티드 (전체 길이 서열 SEQ ID NO: 10) 및 폴리펩티드 (전체 길이, 단편 및 변이체(들) 서열 SEQ ID NO: 11 내지 27). 선택된 에피토프는 음영 표시되어 있다; III. SACOL0442 폴리뉴클레오티드 (전체 길이 서열 SEQ ID NO: 28) 및 폴리펩티드 (전체 길이, 단편 및 변이체(들) 서열 SEQ ID NO: 29 내지 36 및 1). 선택된 에피토프는 음영 표시되어 있다; IV. SACOL1867 폴리뉴클레오티드 (전체 길이 서열 SEQ ID NO: 37) 및 폴리펩티드 (전체 길이, 단편(들) 및 변이체(들) 서열 SEQ ID NO: 38 내지 41). 선택된 에피토프는 음영 표시되어 있다. 예측되는 경막 (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html) 도메인은 굵은체로 표시되어 있다; V. SACOL1912 폴리뉴클레오티드 (전체 길이 서열 SEQ ID NO: 42) 및 폴리펩티드 (전체 길이 및 변이체(들) 서열 SEQ ID NO: 43 내지 44). 선택된 에피토프는 음영 표시되어 있다 (예를 들어, SEQ ID NO: 45-48 참조); VI. SACOL2385 폴리뉴클레오티드 (전체 길이 SEQ ID NO: 49) 및 폴리펩티드 (전체 길이 및 변이체(들) 서열 SEQ ID NO: 50 내지 51). 선택된 에피토프는 음영 표시되어 있다 (예를 들어, SEQ ID NO: 52-53 참조); VII. 융합체: (i) SACOL0029-1867 융합체 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 54 및 56) 및 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO: 55, 57-58). 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열에서, 존재하는 경우에, 이중 밑줄 서열은 폴리히스티딘의 서열이고, 이탤릭체 서열은 SACOL0029 단편의 서열이고, 단일 밑줄 서열은 링커의 서열이며, 굵은체 서열은 SACOL1867 단편의 서열이다; (ii) SACOL0720-720 융합체 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO: 27). 폴리펩티드 서열에서, 존재하는 경우에, 이중 밑줄 서열은 폴리히스티딘의 서열이고, 이탤릭체 서열은 SACOL0720 단편의 서열이고 단일 밑줄 서열은 링커의 서열이다; (iii) SACOL0442-720 융합체 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO: 3). 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열에서, 존재하는 경우에, 이중 밑줄 서열은 폴리히스티딘의 서열이고, 이탤릭체 서열은 SACOL0442 단편의 서열이고, 단일 밑줄 서열은 링커의 서열이며 굵은체 서열은 SACOL0720 단편의 서열이다; VIII. 링커의 서열 (SEQ ID NO: 59 내지 70).
도 22A-D I. 전체 길이 SACOL0442 및 오르쏘로그에 대한 다수 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 71-72, 28, 73 내지 81)의 정렬; II. 전체 길이 SACOL0442, 오르쏘로그에 대한 다수 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92)의 정렬, 및 그로부터 유래된 공통 (consensus) 서열을 나타낸다. 이들 서열에서, "*"는 그 컬럼의 잔기가 모든 정렬 서열에서 동일하다는 것을 의미하고, ":"은 보존성 치환이 관찰된 것을 의미하고, "."은 반보존성 치환이 관찰된 것을 나타낸다. 이들 정렬로부터 유래된 공통 서열이 또한 표시되어 있으며 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 폴리펩티드 서열에서, 선택된 에피토프는 음영 표시되어 있다 (예를 들어, SEQ ID NO: 1, 34, 93-97 참조).
도 23A-K I. 전체 길이 SACOL0720 및 오르쏘로그에 대한 다수 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 98 내지 104, 10, 및 105 내지 108)의 정렬; II. 전체 길이 SACOL0720, 오르쏘로그에 대한 다수 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120)의 정렬, 및 그로부터 유래된 공통 서열을 나타낸다. 이들 서열에서, "*"는 그 컬럼의 잔기가 모든 정렬 서열에서 동일하다는 것을 의미하고, ":"은 보존성 치환이 관찰된 것을 나타내며, "."은 반보존성 치환이 관찰된 것을 나타낸다. 이들 정렬로부터 유래된 공통 서열이 또한 표시되어 있고 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 폴리펩티드 서열에서, 선택된 에피토프는 음영 표시되어 있다 (예를 들어, SEQ ID NO: 22, 19 및 21 참조).
도 24. 전체 길이 SACOL0029, 오르쏘로그에 대한 다수 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131)의 정렬, 및 그로부터 유래된 공통 서열을 나타낸다. 이들 서열에서, "*"는 그 컬럼의 잔기가 모든 정렬 서열에서 동일하다는 것을 의미하고, ":"은 보존성 치환이 관찰된 것을 의미하며, "."은 반보존성 치환이 관찰된 것을 의미한다. 이들 정렬로부터 유래된 공통 서열이 또한 표시되어 있고 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 폴리펩티드 서열에서, 선택된 에피토프는 음영 표시되어 있다 (예를 들어, SEQ ID NO: 132-139 참조). 굵은체 에피토프는 BCPred™으로 동정되었다. 음영 표시된 에피토프는 AAp 예측으로 동정되었다.
도 25A-D. I - 전체 길이 SACOL1867 및 오르쏘로그에 대한 다수 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 140 내지 151)의 정렬; II - 전체 길이 SACOL1867, 오르쏘로그에 대한 다수 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO: 152 내지 164)의 정렬, 및 그로부터 유래된 공통 서열을 나타낸다. 이들 서열에서, "*"는 그 컬럼의 잔기가 모든 정렬 서열에서 동일하다는 것을 의미하고, ":"은 보존성 치환이 관찰된 것을 나타내고, "."은 반보존성 치환이 관찰된 것을 나타낸다. 이들 정렬로부터 유래된 공통 서열이 또한 표시되어 있고 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 폴리펩티드 서열에서, 선택된 에피토프는 음영 표시되어 있고 (예를 들어, SEQ ID NO: 165-180 참조), 신호 펩티드 도메인 및/또는 경막 도메인의 말단은 선으로 표시되어 있다 (신호 펩티드 및/또는 경막 도메인을 분비형과 분리시킴).
도 26. I - 전체 길이 SACOL1715 (hemB)의 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 181); 및 II - 전체 길이 SACOL1715 (hemB)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 182).
도 27. I - 전체 길이 ClfA (NWMN_0756, newman)의 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 183); 및 II - 전체 길이 ClfA의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 184).
본 발명은 2종의 항원의 융합체가 면역 반응에서 예상치 못한 상승작용을 생성시켰음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 또한 백신 전달 시스템으로서 이의 사용을 가능하게 하는 hemB 를 통해 스타필로코커스의 SCV 표현형 (완전 결실이므로 침윤성 표현형으로 복귀 가능성 상실 (Tuchscherr, 2011))을 안정화시켰다. HemB는 조합되어 포르포빌리노겐 신타제 또는 아미노레불리네이트 디히드로게나제 효소 [EC 4.2.1.24]를 생성하는 HemB 단백질/단량체를 코딩한다. 또한, 양이온성 펩티드 내성에서 (Falord, 2012; Kawada-Matsuo, 2011; Meehl, 2007) 그리고 IMI 동안 생체 내에서 (Allard, 2013) 에스. 아우레우스에게 중요한 것으로 이전에 확인된, 본 발명의 항원, 즉 유전자 SACOL0720의 불활성화를 통해서 추가의 약독화를 야기시켰다. 이러한 이유로, 본 발명의 구성체를 발현하는 이러한 약독화 이중 돌연변이체 균주가 IMI에 대한 면역화 및 보호화에 사용가능하다.
일반 정의
제목, 및 다른 식별자, 예를 들어 (a), (b), (i), (ii) 등은 단지 명세서 및 청구항을 읽는데 용이하도록 제시된다. 명세서 또는 청구항에서 제목 또는 다른 식별자의 사용은 단계 또는 구성요소가 알파벳 또는 번호 순서로 또는 그들이 표시된 순서로 수행되는 것을 반드시 요구하는 것이 아니다.
본 설명에서, 다수의 용어가 광범위하게 이용된다. 이러한 용어가 제공되는 범위를 포함하여, 명세서 및 청구항의 분명하고 일관된 이해를 제공하기 위해서, 하기 정의들이 제공된다.
청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 때, 단어 "한" 또는 "하나"의 사용은 "일 (one)"을 의미할 수 있지만 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일치된다.
본 출원 전반에서, 용어 "약"은 값이 그 값을 결정하는데 적용되는 장치 또는 방법에 대한 오류의 표준 편차를 포함한다는 것을 의미하는데 사용된다. 일반적으로, 용어 "약"은 최대 10%의 가능한 변동을 표시하려는 의미이다. 그러므로, 값의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10%의 변동이 용어 "약"에 포함된다. 달리 표시하지 않으면, 범위 앞에서 용어 "약"의 사용은 그 범위의 양쪽 끝값에 적용된다.
본 명세서 및 청구항(들)에서 사용시, 단어 "포함하는" (및 '포함하는'의 임의 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함한다"), "가지는" (및 '가지는'의 임의 형태, 예컨대 "가지다" 및 "갖다"), "포괄하는" (및 '포괄하는'의 임의 형태, 예컨대 "포괄한다" 및 "포괄하다") 또는 "함유하는" (및 '함유하는'의 임의 형태, 예컨대 "함유한다" 및 "함유하다")는 내포적이거나 또는 제한이 없으며 추가의, 언급되지 않은 구성요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이루어지다" 또는 "이루어진"은 특정한 청구된 구체예 또는 청구항에서 특별히 언급된 구성요소, 단계 또는 성분만을 포함하는 것을 의미한다.
폴리펩티드, 핵산 및 전달 시스템
본 명세서에서 사용되는 용어 "백신"은 숙주에서 면역 반응을 유도/유발시킬 수 있고 감염 및/또는 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있게 하는 임의의 화합물/작용제 ("백신 성분") 또는 이의 조합을 의미한다. 그러므로, 이러한 작용제의 비제한적인 예는 단백질, 폴리펩티드, 단백질/폴리펩티드 단편, 면역원, 항원, 펩티드 에피토프, 에피토프, 단백질, 펩티드 또는 에피토프의 혼합물을 비롯하여, 개별적으로 또는 연속되는 서열로 첨가되는 핵산, 유전자 또는 유전자의 일부분 (관심 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 단편을 코딩함) 예컨대 핵산 백신 등을 포함한다.
본 발명의 일 양상에서, 하기 식 I의 융합체 구성체가 제공된다:
X-A-링커-B-Z 식 (I)
여기서 A 및 B는 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 본 발명의 항원성 폴리펩티드 (즉, 이의 천연, 단편 또는 변이체)이다.
특정 구체예에서, A 및/또는 B는 (a) 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131), SACOL0264 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 185), 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92), SACOL0718 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 186), 도 23I-J에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120), SACOL1353 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 187), SACOL1416 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 188), SACOL1611 (SEQ ID NO: 189), 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164), 도 21G-V에 기재된 바와 같은 SACOL1912 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 43), SACOL1944 (SEQ ID NO: 190), SACOL2144 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 191), SACOL2365 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 192), 도 21H 상에 VI로 기재된 바와 같은 SACOL2385 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 50) 또는 SACOL2599 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 193)를 포함하는 폴리펩티드이다. 특정한 구체예에서, 상기 폴리펩티드 (a)는 상기 정의된 폴리펩티드의 분비형 또는 세포외 단편이다. 경막 도메인은 예를 들어, 소프트웨어 TMpred™ (ExPASy) http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html, http://www.psort.org/psortb/index.html, http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html 및/또는 SignlP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)를 사용하여 예측할 수 있다. TMpred™ 및 SignalIP 4.1 은 SACOL0720: AA 310-508; SACOL0442 AA 36 내지 203에 대해 세포외 도메인을 예측하였다. Enzim이 경막 도메인 SACOL1867 (1-40)을 예측하여 세포외 도메인이 AA 41-239인 한편, http://www.psort.org/psortb/index.html 은 SACOL1867이 세포외 도메인이라는 것을 예측하였다. 상기 언급된 경막 및/또는 신포 펩티드 도메인은 추정상이므로, 본 발명은 본 명세서에서 제시하는 항원 (예를 들어, SACOL1867)이 신호 펩티드 및/또는 경막 도메인을 갖거나 또는 갖지 않는 경우를 포괄하고 상응하는 세포외 단편을 포괄한다. 일 구체예에서, 상기 언급된 폴리펩티드는 박테리아 (예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스)의 표면 상에서 정상적으로 분비되거나 또는 발현되는 폴리펩티드이다.
본 명세서에 열거된 에스. 아우레우스 유전자에 대한 GenbankTM 등록 번호 및 본 명세서에서 포괄되는 그들이 코딩하는 폴리펩티드가 하기 표 1에 표시되어 있다:
표 I: 본 명세서에 기술된 IMI-연관 에스. 아우레우스 유전자 및 코딩된 폴리펩티드의 GenbankTM 등록 번호
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
일정한 상기 열거된 폴리펩티드의 정렬로부터 유래된 공통 서열이 도 21-25에 제시되어 있다. 이들 공통 서열의 특정한 구체예에서, 공통 서열 (예를 들어, 도 21-25의 공통 서열)에서 각각의 X는 임의의 아미노산으로 정의되거나, 또는 정렬에서 제시된 오르쏘로그 중 하나 이상에서 이 위치가 부재할 경우에 부재한다. 이들 공통 서열의 특정 구체예에서, 공통 서열에서 각각의 X는 정렬에서 제시된 오르쏘로그의 상응하는 위치에서 임의의 아미노산의 보존성 또는 반보존성 치환을 구성하는 임의의 아미노산으로서 정의되거나, 또는 정렬에서 제시된 오르쏘로그 중 하나 이상에서 이 위치가 부재하는 경우에 부재한다. 도 21-25에서, 보존성 치환은 기호 ":"로 표시되고 반보존성 치환은 기호 "."으로 표시된다. 다른 구체예에서, 각각의 X는 정렬에서 제시된 오르쏘로그의 상응하는 위치의 임의의 아미노산 잔기와 동일한 클래스에 속하는 임의의 아미노산을 의미하거나, 또는 정렬에서 제시된 오르쏘로그 중 하나 이상에서 이 위치가 부재하는 경우에 부재한다. 다른 구체예에서, 각각의 X는 정렬에서 제시된 오르쏘로그의 상응하는 위치의 임의의 아미노산을 의미하거나, 또는 정렬에서 제시된 오르쏘로그 중 하나 이상에서 이 위치가 부재하는 경우에 부재한다. 특정 구체예에서, A 및/또는 B는 이들 공통 서열 중 어느 하나를 충족하는 폴리펩티드 또는 이의 단편이다.
보존성 아미노산 돌연변이는 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있고; 보존성 아미노산 치환은 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 크기, 전하 또는 극성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 잔기의 치환으로서 본 명세서에서 정의된다. 이러한 보존성 아미노산 치환은 염기성, 중성, 소수성 또는 산성 아미노산의 동일 그룹의 다른 것에 대한 것일 수 있다 (예를 들어, 하기 표 II 참조). 용어 "염기성 아미노산"이란, 생리적 pH에서 전형적으로 양으로 하전된, 7보다 큰 측쇄 pK 값을 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 염기성 아미노산은 히스티딘 (His 또는 H), 아르기닌 (Arg 또는 R), 및 리신 (Lys 또는 K)을 포함한다. 용어 "중성 아미노산" (또한 "극성 아미노산")이란, 생리적 pH에서 전하를 띄지 않지만, 2개 원자가 공동으로 공유하는 전자쌍이 그 원자 중 하나에 의해 더 밀접하게 보유되는 적어도 하나의 결합을 갖는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 극성 아미노산은 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 시스테인 (Cys 또는 C), 티로신 (Tyr 또는 Y), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 및 글루타민 (Gln 또는 Q)을 포함한다. 용어 "소수성 아미노산" (또한 "비극성 아미노산")은 [Eisenberg (1984)]의 정규화된 공통 소수성 척도에 따라서 0보다 큰 소수성을 나타내는 아미노산을 포함하는 것을 의미한다. 소수성 아미노산은 프롤린 (Pro 또는 P), 이소류신 (He 또는 I), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 발린 (Val 또는 V), 류신 (Leu 또는 L), 트립토판 (Trp 또는 W), 메티오닌 (Met 또는 M), 알라닌 (Ala 또는 A), 및 글리신 (Gly 또는 G)을 포함한다. "산성 아미노산"은 생리적 pH에서 전형적으로 음으로 하전된, 7 미만의 측쇄 pK 값을 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 산성 아미노산은 글루타메이트 (Glu 또는 E), 및 아스파테이트 (Asp 또는 D)를 포함한다.
반보존성 아미노산은 한 잔기를, 유사한 입체 구조를 갖지만 화학적 특성은 공유하지 않는 다른 것으로 치환한다. 반보존성 치환의 예는 시스테인의 알라닌 또는 류신으로의 치환; 세린의 아스파라긴으로의 치환; 발린의 트레오닌으로의 치환; 또는 프롤린의 알라닌으로의 치환을 포함할 수 있다.
하기 표 II는 어떠한 아미노산이 각 아미노산 클래스에 속하는지를 표시한다.
표 II
Figure pct00008
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 간 유사성 및 동일성은 정렬된 서열에서 각 위치를 비교하여 결정될 수 있다. 유사성 및/또는 동일성의 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 다양한 알고리즘을 사용하여, 예를 들어 당분야에 충분히 공지된 다중 서열 정렬 프로그램/소프트웨어 예컨대 ClustalW™, SAGA™, UGENE™ 또는 T-coffee™을 사용하여 수행될 수 있다. 다중 서열 정렬의 예는 하기 실시예에 기 기술되고 도 21A 내지 25에 도시되어 있다.
유전자 오페론
다른 구체예에서, A 및/또는 B는 (b) 상기 정의된 바와 같은 (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다. 예를 들어, SACOL0718은 SACOL0720과 동일한 오페론 유래의 유전자이다.
단편
다른 구체예에서, A 및/또는 B는 (c) 상기 정의된 바와 같은 (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드이다.
단백질/폴리펩티드의 면역원성 단편은 숙주에서 면역 반응을 유도/유발시킬 수 있는 단백질/폴리펩티드의 일부분으로서 정의된다. 일 구체예에서, 면역원성 단편은 비록 반드시 양이 아니더라도, 종류가 단백질/폴리펩티드와 같은 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 단백질/폴리펩티드의 면역원성 단편은 바람직하게 상기 단백질/폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 단백질/폴리펩티드의 에피토프는 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 보유하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 B 세포) 및/또는 특이적 항체를 유발시킬 수 있는, 길이가 적어도 약 4 또는 5개 아미노산인 상기 단백질/폴리펩티드의 단편으로서 정의된다. 2가지 상이한 종류의 에피토프가 존재한다: 선형 에피토프 및 입체형태 에피토프. 선형 에피토프는 연속되는 아미노산의 스트레치를 포함한다. 입체형태 에피토프는 전형적으로 위치에서 폴딩되고 적절하게 폴딩된 단백질에서 함께 에피토프를 형성하는 연속되는 아미노산의 몇몇 스트레치에 의해 형성된다. 본 명세서에서 사용되는 면역원성 단편은 상기 유형의 에피토프 중 하나 또는 둘 모두를 의미한다. 면역원성 단편이 단독으로 사용되는 일 구체예 (즉, 더 큰 폴리펩티드 구성체 (예를 들어, 다른 항원성 단편과의 융합체)로 융합되지 않음)에서, 단백질/폴리펩티드의 면역원성 단편은 적어도 16개의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가 구체예에서, 면역원성 단편은 천연 단백질/폴리펩티드의 적어도 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 또는 160개의 연속되는 아미노산을 포함한다. 특정한 구체예에서, 단편은 천연 단백질/폴리펩티드의 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ,47, 48, 49, 50, 또는 50개 이상의 연속되는 아미노산을 갖는다. 적어도 하나의 면역원성 단편이 더 큰 폴리펩티드 구성체 (예를 들어, 다른 항원성 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체와의 융합체)의 일부분을 형성하는 일 구체예에서, 면역원성 단편은 폴리펩티드의 적어도 13개의 연속되는 아미노산 잔기를 포함한다. 그렇게 제한하려는 것은 아니나, 본 발명에서 포괄하는 단편은 도 21에 도시된 바와 같은 SACOL029 (및 SACOL029 오르쏘로그의 상응하는 단편 (예를 들어, 도 24에 도시됨)); 도 21에 도시된 바와 같은 SACOL0442 (및 SACOL0442 오르쏘로그의 상응하는 단편 (예를 들어, 도 22에 도시됨); 도 21에 도시된 바와 같은 SACOL0720 (및 SACOL0720 오르쏘로그의 상응하는 단편 (예를 들어, 도 23에 도시됨); 및 도 21에 도시된 바와 같은 SACOL1867 (및 SACOL1867 오르쏘로그의 상응하는 단편 (예를 들어, 도 25에 도시됨))의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명이 포괄하는 단편은 본 발명의 항원성 단백질/폴리펩티드 (상기 정의된 폴리펩티드 (a))의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 면역원성 단편을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명이 포괄하는 단편은 도 21 내지 25 중 어느 하나에 도시된 항원성 단백질/폴리펩티드 중 어느 하나에서 도시 (음영표시)된 바와 같은 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 면역원성 단편을 포함한다. 그렇게 제한하려는 것은 아니나, 서열에서 에피토프는 소프트웨어 예컨대 BCPred™, AAP™, FBCPred™ 및 ABCPred™으로 예측할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 언급된 면역원성 단편은 스타필로코커스 아우레우스의 적어도 2종의 상이한 균주에서 보존된 (즉, 동일한) 서열을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 면역원성 단편은 스타필로코커스 아우레우스의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종의 상이한 균주에서 보존된 (즉, 동일한) 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 언급된 스타필로코커스 아우레우스의 균주는 COL, RF122, NCTC 8325, JH1, JH9, Newman, Mu3, Mu50, USA300-FPR3757, N315, MW2 또는 MSSA476이다. 일 구체예에서, 상기 언급된 스타필로코커스 아우레우스의 균주는 소 유선염과 연관된다 (예를 들어, RF122).
변이체
다른 구체예에서, 상기 언급된 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드는 스타필로코커스 아우레우스의 적어도 2종의 상이한 균주에서 발현된다. 본 명세서에서 사용시 '실질적으로 동일한'은 그들 아미노산 서열에서 적어도 60%의 동일성, 구체예에서, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 추가 구체예에서, 폴리펩티드는 그들과 비교되는 다른 폴리펩티드와 그들 아미노산 서열에서 적어도 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는다.
다른 구체예에서, A 및/또는 B는 (d) 상기 정의된 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 아미노산은 (예를 들어, 그들의 전체 길이에 걸쳐) (a)와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일하다. 추가 구체예에서, 아미노산은 (a)에 대해 적어도 60%, 65%, 70%,71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 예를 들어, 도 21-25의 정렬에서 제시된 항원 오르쏘로그는 동일하지는 않지만, 그들과 비교된 항원 또는 단편과 일정한 동일성이 존재한다. 이들 도면에 제시된 공통 서열은 이러한 동일성 백분율을 구체화한 것이다.
다른 구체예에서, A 및/또는 B는 (e) (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드이다. 단백질/폴리펩티드의 면역원성 변이체는 숙주에서 면역 반응을 유도/유발시킬 수 있는 단백질/폴리펩티드의 일부분으로서 정의된다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 비천연 발생 변형 (예를 들어, 면역원성 변이체)을 갖고 비변형된 작용제에 대해 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 (예를 들어, 비변형된 작용제를 인식할 수 있는 항체의 생산을 유도할 수 있는) 작용제 (단백질/폴리펩티드, 이의 단편)가 또한 용어 "백신 성분"의 범주에 속한다. 예를 들어, 본 발명의 백신 성분은 그들의 활성, 안정성 및/또는 생체이용률을 증강시키고/시키거나, 그들의 독성을 감소시키기 위해서 변형될 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 산성 측쇄를 포함하는 아미노산의 산성 측쇄를 포함하는 다른 아미노산으로의 치환, 부피 큰 아미노산의 부피 큰 다른 아미노산으로의 치환, 염기성 측쇄를 포함하는 아미노산의 염기성 측쇄를 포함하는 다른 아미노산으로의 치환 등과 같이 만들 수 있다. 당업자는 단백질/폴리펩티드의 변이체를 충분히 생성시킬 수 있다. 이것은 예를 들어 펩티드 라이브러리의 스크리닝을 통해서 또는 펩티드 변화 프로그램에 의해 수행된다. 본 발명에 따른 면역원성 변이체는 반드시 양은 아니지만, 종류에 있어서 상기 단백질의 동일한 면역원성 특성을 본질적으로 갖는다. 본 발명의 단백질/폴리펩티드의 면역원성 변이체는 예를 들어 융합체 단백질 및/또는 키메라 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 외독소, 장독소 또는 초항원인 것으로 예측된 본 명세서에서 동정된 단백질 (예를 들어, SACOL0442)의 생물학적 기능은 잠재적으로 포유동물 면역계 및 항원 생산을 방해할 수 있고/있거나, 숙주에서 일부 독성을 보일 수 있다. SACOL0442 폴리펩티드가 면역화 동안 예를 들어 SACOL0720과 조합하여 사용되었을 때 이러한 방해가 관찰되지 않았지만, 외독소의 생물학적 활성이 감소되도록 백신접종에 사용되는 단백질 또는 폴리펩티드를 변형시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 외독소를 화학물 (예를 들어, 포름알데히드)을 사용해 불활성화시키는 것이 가능하다. 또한, 면역원성을 상실하지 않고 외독소에 관여되는 추정 영역(들)을 결실시키거나 또는 돌연변이시키는 분자 생물학 기술을 사용하는 것도 가능하다 (Chang et al., 2008). 다른 예는 핵산 (예를 들어, 개별적으로 또는 연속되는 서열로 첨가된 유전자 또는 유전자의 일부분) 탄수화물 예컨대 미생물 다당류 캡슐 또는 생물막에서 발견되는 것들과 아미노산-기반 성분의 혼합물 또는 접합체이다. 변이체의 다른 예는 스페이서 또는 링커로서 유용하거나 또는 정제 (예를 들어, 친화성 정제)에 유용한 올리고펩티드를 그들 항원 서열 내에 삽입하거나 또는 그들 N 또는 C 말단에 포함하는 본 명세서에 기술된 항원 또는 이의 단편을 포함한다. 친화성 정제에 유용한 올리고펩티드의 예는 폴리히스티딘 태그 (예를 들어, RGS 태그를 포함하거나 또는 포함하지 않는 6-10개 히스티딘 잔기 (예를 들어, HHHHHH, RGSHHHHHH, 또는 RGSHHHHHGS)를 포함한다. his-태그는 또한 엔도펩티다제를 사용한 폴리히스티딘-태그의 제거를 용이하게 하는데 적합한 아미노산 서열이 후속될 수도 있다. 식 (I)에서 나열된 "X" 및/또는 "Z" 절편은 또한 정제에 유용한 이러한 올리고펩티드 및/또는 정제에 유용한 이러한 올리고펩티드의 제거를 용이하게 하는데 적합한 서열을 포함할 수 있다.
특정한 구체예에서, 면역원성 단편은 폴리펩티드 (a)의 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 이렇게 제한하려는 것은 아니나, 일정 구체예에서, 면역원성 단편은 도 21-25에 제시된 서열에서 도시 (음영 표시)된 바와 같은 폴리펩티드 (a)의 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 다른 특정한 구체예에서, 변이체는 도 21-25에 개시된 바와 같다.
링커
융합체 단백질 도메인 사이에 링커의 삽입은 도메인 간 거리를 증가시킴으로써 구성체의 상이한 절편 (예를 들어, 항원성 단편) 사이의 잠재적인 반발력을 경감시켜서 그 결과로 개선되고/되거나 복원된 단백질 폴딩을 일으켜서 생활성을 증가시킬 수 있다. 폴리펩티드 링커의 상이한 서열을 사용할 수 있고 별개의 특성, 예컨대 탄성, 강성 또는 절단성 링커를 갖는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 예를 들어 문헌 [Chen et. al, Adv Drug Deliv Rev. (2013), 65(10):1357-69]에 열거된 것 중 어느 하나를 포함하는 임의의 이러한 링커의 사용을 포괄한다. 본 명세서에서의 예는 사용된 특정한 링커의 예시 (즉, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 60), ERKYK (SEQ ID NO: 61), 또는 및 EAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 62)), 즉 2개의 연결된 도메인 간 거리를 유지시키고 그들 폴딩을 개선시키는 소형 친수성 아미노산이 풍부한, 탄성 링커 구조를 제공한다.
다른 특정한 구체예에서, Fc는 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 영역을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, Fc는 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-3 및 IgG-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린의 불변 도메인이다. 다른 특정한 구체예에서, Fc는 면역글로불린 IgG-1의 불변 도메인이다.
링커는 융합체의 인접하는 항원 사이에 포함될 수 있다 (예를 들어, 2개 항원을 포함하는 융합체에서 1개 링커, 3개 항원을 포함하는 융합체에서 2개 링커, 4개 항원을 포함하는 융합체에서 3개 링커 등). 대형 단백질 도메인이 사용되는 융합체에서, 링커는 더 커질 수 있고 단편 결정화가능한 영역 (Fc)을 포함할 수 있다.
특정한 구체예에서, 링커는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열이거나 또는 부재한다. 특정한 구체예에서, 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 아스파테이트, 글루타메이트 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개 (적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산을 포함한다. 특정한 구체예에서, 링커는 (EAAAK)n (SEQ ID NO: 63); (GGGGS)n (SEQ ID NO: 67); 또는 (XPXPXP)n (SEQ ID NO: 69) [여기서 x는 임의의 아미노산이고, n은 1 내지 5 중 어느 하나, 보다 특히 1, 2, 3, 4 또는 5임]; EAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 62); EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 64); GGGGS (SEQ ID NO: 67); GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 68); GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 60); XPXPXP (SEQ ID NO: 69) [여기서 x는 임의의 아미노산임]; XPXPXPXPXPXP (SEQ ID NO: 70) [여기서 x는 임의의 아미노산임]; ERKYK (SEQ ID NO: 61); ERKYKERKYK (SEQ ID NO: 65); ERKYKERKYKERKYK (SEQ ID NO: 66)이다. 보다 특정한 구체예에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 60), ERKYK (SEQ ID NO: 61), 또는 EAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 62)이다.
구성체의 N 및 C 말단
X 및 Z는 각각 독립적으로 부재하거나 또는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열이다. 그렇게 제한하려는 것은 아니나, 그들은 클로닝 전략에 의해 생성된 아미노산, 구성체의 정제를 용이하게 하는데 사용되는 아미노산 (예를 들어, 폴리히스티딘), 엔도펩티다제를 사용한 정제-태그의 제거를 용이하게 하는데 적합한 아미노산 중 하나 이상일 수 있다. 특정한 구체예에서, 융합체 구성체가 셋 이상의 항원 폴리펩티드를 포함하는 경우에, X 및/또는 Z 중 어느 하나는 또한 추가 항원 (항원 C, 항원 D 등)의 서열, 및 임의로 적어도 하나의 추가 링커의 서열을 포함할 수도 있다. X 및/또는 Z가 하나 이상의 추가 항원(들) 및 임의로 링커(들)를 포함하는 이러한 구체예는 예를 들어 하기와 같은 식 (II) 또는 (III)으로서 더욱 특별히 예시될 수 있다: 융합체가 적어도 3개 항원을 포함할 때 X'-C-링커1-A-링커2-B-Z' (II); 또는 융합체가 적어도 4개 항원을 포함할 때 X'-C-링커1-A-링커2-B-링커3-D-Z' (III). 양쪽 식 (II) 및 (III)에서, X', Z', 링커1, 링커2, 및 링커3이 되는 경우는 동일하거나 또는 상이하고 독립적으로 본 명세서에서 정의된 식 (I)의 X, Z 및 링커와 같이 정의된다.
그러한 이유로, 특정한 구체예에서, 융합체 구성체는 2, 3, 4개 또는 그 이상의 항원 폴리펩티드 (및, 이 경우에 추가 링커)를 포함한다. 보다 특정한 구체예에서, 그렇게 제한하려는 것은 아니나 융합체 구성체는 SACOL0029_SACOL0442; SACOL0029_SACOL0720; SACOL0029_SACOL1867; SACOL0029_SACOL0720_SACOL1867; SACOL0029_SACOL1867_SACOL0442; SACOL0029_SACOL0720_SACOL0442; SACOL0442_SACOL0029_SACOL0720; SACOL0442_SACOL0029_SACOL1867; SACOL0442_SACOL1867_SACOL0720; SACOL0720_SACOL0442_SACOL1867; 또는 SACOL0029_SACOL1867_SACOL0720_SACOL0442, 또는 항원 폴리펩티드가 임의의 다른 순서인 임의의 전술한 구성체일 수 있다.
조합
본 발명의 구성체는 본 발명의 조성물 (예를 들어, 백신)의 단독 면역원성 성분으로서, 또는 하나 이상의 추가 융합체 구성체(들), 면역원성 폴리펩티드(들), 이의 단편(들) 또는 변이체(들) 및/또는 생 약독화 박테리아 (예를 들어, 에스. 아우레우스) (융합체 구성체 및/또는 폴리펩티드(들), 이의 단편(들) 또는 변이체(들)를 발현하거나 또는 발현하지 않음)와 조합으로서 사용될 수 있다.
하나 이상의 융합체 구성체는 상기 정의된 바와 같이 추가 융합체 구성체를 포함하는 임의의 면역원성 융합체 구성체일 수 있다 (예를 들어, 실시예 14 참조).
본 발명의 조성물에서 사용을 위한 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드(들), 이의 단편(들) 또는 변이체(들)는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물의 면역원성에 기여하는 임의의 폴리펩티드(들), 단편(들) 또는 변이체(들)일 수 있다. 그렇게 제한하려는 것은 아니나, 이러한 폴리펩티드(들), 단편(들) 또는 변이체(들)는 (a) 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131), SACOL0264 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 185), 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92), SACOL0718 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 186), 도 23I-K에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120), SACOL1353 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 187), SACOL1416 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 188), SACOL1611 (SEQ ID NO: 189), 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164), SACOL1912 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 43), SACOL1944 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 190), SACOL2144 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 191), SACOL2365 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 192), SACOL2385 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 50) 또는 SACOL2599 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 193)를 포함하는 폴리펩티드; (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) 상기 정의된 바와 같은 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 그렇게 제한하려는 것은 아니나, 임의의 이러한 폴리펩티드(들), 단편(들) 또는 변이체(들)는 실시예 1 내지 14 및 21-26에 예시된 조성물 (예를 들어, 백신 #1 내지 #8)에 포함된 것들을 포괄한다.
생 약독화 박테리아
본 발명의 조성물에서 사용을 위한 생 약독화 박테리아 (예를 들어, 에스. 아우레우스)는 본 발명의 융합체 구성체 및/또는 폴리펩티드(들), 이의 단편(들) 또는 변이체(들)와 독립적일 수 있거나, 또는 본 발명의 이러한 융합체 구성체 및/또는 폴리펩티드(들), 이의 단편(들) 또는 변이체(들)를 위한 용기일 수 있다 (즉, 발현할 수 있다).
그렇게 제한하려는 것은 아니나, 본 명세서에서 예시된 바와 같이, 본 발명의 조합의 경우에 유용한 생 약독화 박테리아는 병독성에 기여하거나 (예를 들어 Δ720) 또는 숙주의 건강함에 기여하는 (예를 들어, 물질대사 유전자) 적어도 하나의 유전자가 돌연변이되거나 또는 결실된 스타필로코커스 (예를 들어, 이우레우스) 박테리아를 포함한다. 그렇게 제한하려는 것은 아니나, 이러한 유전자는 Novick 2003, Novick 2008, 또는 Maresso 및 Schneewind 2008에서 동정된 유전자 중 어느 하나일 수 있다.
추가 구체예에서, 생 약독화 박테리아는 안정화된 SCV 표현형을 갖게 하여 더욱 약독화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "SCV 표현형"은 느린 성장을 초래하는 기능장애성 산화적 대사, 병독성 인자의 발현 변경, 및 숙주 세포에 내재화되는 능력을 갖는 박테리아를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 ≪안정화된 SCV 표현형≫은 SCV 표현형을 보유하는, 즉 침습성 복귀돌연변이체 (즉, 정상 성장 표현형으로 복귀)를 생산할 수 없는 SCV 균주를 의미하고자 사용된다. 이러한 안정화된 SCV 에스. 아우레우스는 하기 표 III에 열거된 유전자 중 어느 하나를 돌연변이시키거나 또는 결실시켜서 생성될 수 있다 (예를 들어, ΔhemB). 제한하려는 것은 아니나, 본 발명은 실시예 15 내지 25에서 예시되는 안정화된 SCV 에스. 아우레우스의 용도를 포괄한다. 본 명세서에서 사용되는 돌연변이는 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 방지하거나 또는 기능성 폴리펩티드의 발현을 방지하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 돌연변이는 폴리펩티드의 발현을 방지한다. 다른 특정한 구체예에서, 에스. 아우레우스의 동일한 약독화 생 또는 불활성화 균주에서 2종의 돌연변이는 결실 또는 삽입이다. 폴리펩티드의 발현을 방지하는 본 발명의 유전자 중 하나의 임의 위치에 돌연변이를 갖는 에스. 아우레우스의 돌연변이된 균주는 본 발명에 따라서 약독화 생 백신으로서 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 약독화 생 백신, 즉 생 약독화된 형태의 본 발명에 따른 박테리아를 포함하는 백신은 그들이 자연적인 감염 방식을 최고로 모방한다는 점에서 불활성화 백신보다 장점을 갖는다. 또한, 그들의 복제 능력은 소량의 박테리아를 사용한 백신접종을 가능하게 하여; 그들 수가 면역계 발동 수준에 도달할 때까지 자동적으로 증가하게 될 것이다. 그 순간부터, 면역계가 발동될 것이고 결국 박테리아를 제거하게 될 것이다. 그러나 생 약독화 박테리아 사용의 사소한 단점은 선천적으로 일정 수준의 병독성이 남아있다는 것일 수 있다. 이것은 병독성 수준이 허용가능한 수준이라면, 즉 백신이 적어도 박테리아 감염 (예를 들어, IMI) 증상을 감소시키는 한 진정한 단점일 필요가 없다. 물론, 생 약독화 백신의 잔존 병독성이 낮을수록, 백신접종이 백신접종 동안/그 이후에 가중되는 영향이 낮아진다.
표 III: SCV 표현형과 연관된 에스. 아우레우스 유전자의 GenbankTM 등록 번호 (Kahl, 2014)
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핵산
본 발명의 핵산은 바람직하게 유전자 발현에 필요한 조절 성분 예컨대 프로모터, 개시 코돈, 중지 코돈, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호에 작동적으로 연결된 상기 언급된 하나 이상의 단백질/폴리펩티드 (또는 이의 단편)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 조절 성분은 바람직하게 그들이 투여되는 종에서 작동가능한 것이 선택된다. 특정한 구체예에서, 핵산은 도 21 내지 25에 도시되어 있는 바와 같다.
본 발명의 상황에서는 하나 이상의 관심 단백질/폴리펩티드 (또는 이의 단편)이 포유동물에서 발현되도록 포유동물에게 본 발명의 핵산 (예를 들어, 핵산 백신, DNA 또는 RNA 백신)의 생체 내 투여이다.
전달 시스템
본 발명의 백신의 핵산은 "나형 (naked)" DNA일 수 있거나 또는 벡터에 작동적으로 도입될 수 있다. 핵산은 당분야에 충분히 공지된 방법 예컨대 모두가 벡터의 사용이 관여될 수 있는, DNA의 직접 주사, 수용체-매개 DNA 흡수, 바이러스-매개 형질감염 또는 비바이러스 형질감염 및 지질-기반 형질감염을 사용해 생체 내 세포에게 전달될 수 있다. 직접 주사가 생체 내 세포에게 나형 DNA를 도입시키는데 사용되었다 (예를 들어, [Acsadi et al. (1991) Nature 332:815-818]; [Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468] 참조). 생체 내 세포에 DNA를 주사하기 위한 전달 장비 (예를 들어, "유전자 총")가 사용될 수 있다. 이러한 장비는 상업적으로 입수할 수 있다 (예를 들어, BioRad로부터 입수). 나형 DNA는 또한 세포-표면 수용체에 대한 리간드에 결합되는, 양이온, 예컨대 폴리리신과 DNA를 착화시킴으로써 세포에 도입될 수 있다 (예를 들어, [Wu, G. and Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621]; [Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967]; 및 미국 특허 제5,166,320호 참조). 수용체와 DNA-리간드 복합체의 결합은 수용체-매개 세포내이입을 통한 DNA의 흡수를 촉진시킬 수 있다. 엔도솜을 파괴하여, 물질을 세포질로 방출시키는 아데노바이러스 캡시드에 연결된 DNA-리간드 복합체가 세포내 리소솜에 의한 복합체의 분해를 피하도록 사용될 수 있다 (예를 들어, [Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850]; [Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126] 참조).
유용한 전달 벡터는 생분해성 미세캡슐, 면역-자극성 복합체 (ISCOM) 또는 리포솜, 및 유전자 조작된 약독화 생 벡터 예컨대 세포, 바이러스 또는 박테리아를 포함한다.
리포솜 벡터는 친지성 물질로 형성된 막 부분 및 내부 수성 부분을 갖는 단층 또는 다층 소포체이다. 수성 부분은 표적 세포로 전달하려는 폴리뉴클레오티드 물질을 함유하도록 본 발명에서 사용된다. 리포솜 형성 물질이 양이온성 기, 예컨대 4차 암모늄 기, 및 하나 이상의 친지성 기, 예컨대 약 6 내지 약 30개 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 알킬 기를 갖는 것이 일반적으로 바람직하다. 적합한 물질 중 한 그룹은 유럽 특허 제0187702호에 기술되어 있고, Wolff 등의 미국 특허 제6,228,844호에 더욱 기술되어 있으며, 이들의 관련 개시 내용을 참조로 편입시킨다. 많은 다른 적합한 리포솜-형성 양이온성 지질 화합물이 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 [L. Stamatatos, et al., Biochemistry 27:3917 3925 (1988)]; 및 [H. Eibl, et al., Biophysical Chemistry 10:261 271 (1979)]을 참조한다. 대안적으로, 미세구 예컨대 폴리락티드-코글리콜리드 생분해성 미세구가 이용될 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 핵산 구성체가 캡슐화되거나 또는 아니면 조직으로 핵산의 전달을 위해 리포솜 또는 미세구와 복합체화된다.
바람직한 바이러스 벡터는 박테리아 파지, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 폴리오 바이러스, 백시니아 바이러스, 결함성 레트로바이러스, 아데노-연합 바이러스 (AAV) 및 조류폭스 바이러스를 포함한다. 외생성 DNA 구성체로 바이러스 벡터를 형질전환시키는 방법은 또한 당분야에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 상기 Sambrook 및 Russell 을 참조한다.
상기에 표시된 바와 같이, 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)은 숙주 예컨대 시험관 내 또는 생체 외 숙주 세포 (예를 들어, 면역 세포 예컨대 수지상 세포)에, 또는 상기 기술된 바와 같이, 약독화된 미생물 숙주 (예를 들어, 약독화된 에스. 아우레우스, SCV 등 예를 들어, 실시예 25-26 참조)에 형질감염 또는 형질전환에 의해 도입될 수 있고, 관심 폴리펩티드 (예를 들어, 다수 항원 또는 이의 단편 및/또는 단일 항원 또는 이의 단편의 융합체)를 발현하는 형질감염 또는 형질전환된 세포 또는 미생물이 대상체에게 투여될 수 있다. 투여 후에, 세포는 대상체에서 관심 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 이의 변이체 또는 단편)를 발현하게 될 것이고, 이후에 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대하여 유도된 면역 반응의 유도를 일으키게 될 것이다.
본 발명의 특이적 구성체 또는 항원 혼합물을 면역화 및/또는 전달하기 위해 약독화된 생 박테리아를 사용하는 것은 면역 반응을 개선시키기 위한 흥미로운 접근법을 의미한다 (Griffiths and Khader, 2014). 천연 감염을 모방하는 생 약독화 유기체는 강력한 방식으로 면역계를 자극시켜서, 질환에 대해 상승적으로 보호하도록 작용하는 혈청 및 점액 항체, 및 이펙터 및 기억 T 세포를 생산하는 광범위하고 강건한 면역 반응을 유발한다 (Detmer and Glenting, 2006; Kollaritsch et al, 2000; Pasetti et al., 2011). 적합한 약독화 생 박테리아 벡터의 예는 당분야에 공지된 바와 같이, 에스. 아우레우스 (S. aureus), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 시겔라 (Shigella), 바실러스 (Bacillus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 바실 카메트-게렝 (Bacille Calmette-Guerin) (BCG), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 캄필로박터 (Campylobacter), 또는 임의의 다른 적합한 박테리아 벡터를 포함한다. 외생성 DNA에 의한 생 박테리아 벡터의 형질전환 방법은 당분야에 충분히 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Joseph Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)]을 참조한다. 본 발명은 단독 면역원성 성분으로서 또는 각각 본 발명의 다른 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체 (예를 들어, SACOL0442, SACOL0720 또는 이의 단편 또는 변이체)를 발현하는 다른 약독화 생 박테리아와 조합하여 본 발명의 구성체를 발현하는 약독화 생 박테리아 (예를 들어, ΔhemBΔ720 에스. 아우레우스를 포함하는 조성물의 용도를 포함한다.
조성물
본 명세서에 기술된 폴리펩티드, 핵산 및 전달 시스템 (예를 들어, 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포)은 조성물로 제제화될 수 있다. 본 명세서에서 사용시 용어 "약학적으로 허용가능한"은 대상체에게 투여시 전형적으로 알레르기 또는 유사한 부작용, 예컨대 위장 전복, 현기증 등을 일으키지 않고 생리적으로 내성인 백신 성분 (예를 들어, 부형제, 담체, 보강제) 및 조성물을 의미한다. 바람직하게, 본 명세서에서 사용시, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관이 승인하였거나 또는 미국 약전 또는 동물 및 인간에서 사용을 위한 다른 일반적으로 승인된 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "부형제"는 본 발명의 백신 성분이 투여될 수 있는 희석제, 담체 또는 비히클을 의미한다. 멸균수 또는 수성 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 특히 주사용 용액을 위한 담체로서 적용될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 작용제는 보강제 또는 면역자극제와 조합하여 투여된다. 면역 반응을 상승시키기 위해 성분의 효능을 개선시킬 수 있는 적합한 보강제 또는 면역자극제는 제한없이 오일 (예를 들어, 미네랄유, 유화유 예컨대 MONTANIDE™ 또는 EMULSIGEN™-D), 금속염 (예를 들어, 명반, 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄), 양이온성 펩티드 (Bowdish et al., 2005; Hancock, et al., 2000) 예컨대 인돌리시딘, 소의 면역 세포에 의해 생성된 양이온성 펩티드 (Falla et al., 1996), 천연 및 인공 미생물 성분 (예를 들어, 박테리아 리포사카라이드, 프로인트 보강제, 뮤라밀 디펩티드 (MDP), 환형-디구아노신-5'-모노포스페이트 (c-di-GMP), 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP) 예컨대 표면 다당류, 지질다당류, 표면 다당류, 지질다당류, 글리칸, 펩티도글리칸 또는 미생물 DNA (예를 들어, CpG), 식물 성분 예컨대 사포닌 (예를 들어, Quil-A™), 및/또는 담체 효과를 갖는 하나 이상의 물질 (예를 들어, 벤토나이트, 라텍스 입자, 리포솜, ISCOM™, DNA 및 폴리포스파진 (PCPP) 공중합체)을 포함한다. 프로염증성 사이토카인을 자극시키기 위해서 TLR을 통해서 신호전달하는 리간드와 함께 항원을 함유하는 합성 나노입자 (예컨대 생분해성 합성 중합체 예컨대 폴리(D,L-락틱코-글리콜산)으로 제조된 것)에 의한 면역화가 또한 가능하다 (Kasturi et al, 2011).
본 발명의 백신 성분은 약학 조성물로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 단위 제형으로 투여될 수 있다. 임의의 적합한 투여 경로는 예를 들어, 비경구, 피하, 근육내, 유선내, 두개내, 안와내, 눈, 심실내, 피막내, 관절내, 척수내, 낭내, 복강내, 비내, 에어로졸, 또는 경구 투여로 적용될 수 있다. 특별한 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 유선내; 경구 (예를 들어, 흡입); 경피 (국소); 경점막, 및 직장 투여를 포함한다.
통상적인 약학적 관행을 적용하여 피험체에게 보강제와 함께 또는 없이 이러한 백신 성분을 투여하기 위한 적합한 제제 또는 조성물을 제공할 수 있다. 약학 조성물 및 제제를 제조하기 위한 당분야에 충분히 공지된 방법은 예를 들어, [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20th ed.) ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott: Philadelphia]에서 확인한다. 비경구 투여용 제제는 예를 들어 부형제, 멸균수, 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 미글리올, 식물 기원 오일, 또는 수첨 나프탈렌을 함유할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체는 화합물의 방출을 제어하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 위한 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식가능한 주입 시스템 및 리포솜을 포함한다. 흡입 또는 유선내 주사용 제제는 부형제, 예를 들어 락토스를 함유할 수 있거나, 또는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 미글리올, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액일 수 있거나, 또는 점비액의 형태, 또는 겔로서 투여를 위한 유성 용액 (예를 들어, 파라핀 오일)일 수 있다.
치료 제제는 액상 용액이거나 또는 현탁액의 형태일 수 있고; 경구 투여를 위한 제제는 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있고; 비내 제제를 위해서는 분말, 점비액 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 비경구, 피내, 유선내 또는 피하 도포에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용 물, 염수 용액, 고정유 (예를 들어, 파라핀 오일), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 미글리올 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 비술파이트; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 환원제 예컨대 디티오트레이톨, 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조정을 위한 작용제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 시린지 또는 다수 용량 바이알에 내포될 수 있다.
주사 용도에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산물 및 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 또는 유선내 투여를 위해서, 적합한 담체는 생리적 염수, 정균수, Cremophor™ ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산 완충 염수 (PBS)를 포함한다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 그들은 젤라틴 캡슐에 내포될 수 있거나 또는 정제 또는 사료로 압착될 수 있다. 경구 백신 투여의 목적을 위해서, 활성 성분은 부형제와 도입될 수 있고 정제, 트로키, 캡슐 또는 사료의 형태로 사용될 수 있다. 약학적으로 적합한 결합제 및/또는 보강제 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 임의의 하기 성분, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제 예컨대 알긴산, Primogel™, 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스; 활택제 예컨대 콜로이드 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향.
흡입에 의한 투여를 위해서, 백신 성분은 네뷸라이저, 또는 안정한 추진제, 예를 들어 가스 예컨대 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단을 통할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우에, 투과하려는 장벽에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여의 경우에, 세제, 담즙산염, 및 후시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 코 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해서 수행될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 일반적으로 당분야에 공지된 바와 같은 연고, 샐브, 겔 또는 크림으로 제제화된다.
리포솜 현탁물 (특별한 세포 유형을 표적화하는 리포솜 포함)이 또한 약학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다.
약학 조성물은 또한 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 취기제, 삼투압 변동용 염, 완충제, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 그들은 또한 다른 치료적으로 가치있는 작용제를 함유할 수 있다.
전맥내, 근육내, 피하, 유선내 또는 경구 투여가 바람직한 사용 형태이다. 본 발명의 성분이 유효량으로 투여되는 용량은 특별한 활성 성분의 성질, 숙주 및 대상체의 요건 및 적용 방식에 의존한다.
미생물 표적
폴리펩티드, 본 발명의 핵산 및 전달 시스템은 유선내 감염 (IMI)을 야기시키는 것들을 포함하여 스타필로코커스 감염에 대한 항미생물제로서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 스타필로코커스 감염은 스타필로코커스 아우레우스에 의해서 야기된다.
폴리펩티드, 핵산, 벡터, 세포, 조성물 및 전달 시스템에 의한 면역화 방법
본 발명의 방법, 용도, 약학 조성물 및 키트는 수동 및 능동 면역화를 포괄한다.
수동 면역화는 감염 또는 향후 감염의 수용 동물을 보호하거나 또는 치유하기 위해서, 병원체 (또는 본 명세서에 기술된 항원)에 대하여 이전에 생성된 항체 또는 항혈청의 주사이다. 보호성은 수 주 동안 서서히 사라지는데 그 시간 동안 폴리펩티드, 핵산 또는 전달 시스템 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음)에 의한 능동 면역화가 지속성 보호 반응을 생성시키는 시간을 가지게 될 것이다. 수동 면역화를 위한 혈청은 본 명세서에 기술된 바와 같은, 폴리펩티드, 핵산 또는 전달 시스템을 사용하여 도너 동물의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 항원에 대한 항체를 함유하는 이러한 혈청은 즉시 사용될 수 있거나 또는 적절한 조건 하에서 저장될 수 있다. 이것은 급성 감염 (예를 들어, IMI)을 방지하기 위해서 또는 예방적으로 사용될 수 있다 (Tuchscherr et al., 2008). 수동 면역화에서 혈청 또는 항체의 용도는 현재 진행중인 감염의 치유 속도를 증가시키거나 또는 절박한 감염에 대한 보호성을 증가시키기 위해 다른 작용제 예컨대 항생제와 조합될 수 있다.
능동 면역화는 대상체에게 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 또는 전달 시스템의 투여이다.
본 발명의 교시에 따라서 동정된 성분은 그들이 질환 또는 병태, 및 보다 특히 미생물 감염과 관련된 질환 또는 병태를 예방하고/하거나 방지하기 위해서 면역 반응을 상승시키는데 사용될 수 있는 것과 같은 예방적 및/또는 치료적 가치를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방하다/예방하는/예방" 또는 "치료하다/치료하는/치료"는 대상체에서 바람직한 생물학적 반응, 즉 개별적으로 예방적 및 치료적 효과를 유발시키는 것을 의미한다. 본 발명에 따라서, 치료적 효과는 감염 또는 이의 임의 증상을 갖는 비치료 대조군 대상체의 것과 비교하거나 또는 치료 전 대상체에서 이의 중증도, 강도 및/또는 지속기간과 비교했을 때 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 또는 전달 시스템 (본 발명의 작용제/조성물)의 투여 후에 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의의 증상의 중증도, 강도 및/또는 지속기간의 저하/감소 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명에 따라서, 예방적 효과는 향후 시점에 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의 증상을 경험할 위험성이 있는 무증상성 대상체에서 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의 증상의 개시의 지연; 또는 비치료 대조군 대상체 (즉, 미생물 (예를 들어, 박테리아) 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의 증상을 경험할 위험성이 있는 무증상 대상체)에서 그들의 개시 시점 또는 그들 중증도, 강도 및/또는 지속기간과 비교하였을 때, 본 발명의 작용제/조성물의 투여 후에 발생되는 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의의 증상의 중증도, 강도 및/또는 지속기간의 저하/감소; 및/또는 이러한 사전 존재하는 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의 증상을 갖는 비치료 대조군 대상체에서 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염)의 진행과 비교했을 때 본 발명의 작용제/조성물의 투여 후에 대상체에서 임의의 사전 존재하는 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의 증상의 진행의 저하/감소를 포함한다. 본 명세서에서 사용시, 치료적 처치에서, 본 발명의 작용제/조성물은 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의 증상의 개시 이후에 투여된다. 본 명세서에서 사용시, 예방적 처치에서, 본 발명의 작용제/조성물은 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의 증상의 개시 이전에 또는 이의 개시 이후지만 이의 진행 이전에 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 미생물 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염) 또는 이의 임의 증상의 "저하" 또는 "감소"는 대조군 대상체 (본 발명의 작용제/조성물로 치료하지 않은 대상체)와 비교하여 적어도 10%의 증상의 감소, 일 구체예에서 적어도 20% 저하, 추가 구체예에서 적어도 30% 저하, 추가 구체예에서 적어도 40% 저하, 추가 구체예에서 적어도 50% 저하, 추가 구체예에서 적어도 60% 저하, 추가 구체예에서 적어도 70% 저하, 추가 구체예에서 적어도 80% 저하, 추가 구체예에서 적어도 90% 저하, 추가 구체예에서 100% (완전한 억제) 저하를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 스타필로코커스 감염과 관련하여 용어 "증상"은 임의의 스타필로코커스 감염 증상 예컨대 통증, 염증, 발열, 구토, 설사, 피로 근육통, 식욕부진, 탈수, 저혈압, 봉소염, 농가진, 화상 및 열상 피부 증후군을 의미한다. 보다 특히, 스타필로코커스 IMI와 관련하여, 스타필로코커스 IMI 증상은 예를 들어 우유의 육안적 이상성 (예를 들어, 예컨대 물기 많은 외관, 플레이크, 응괴, 악취, 혈액 존재), 유방의 발적, 유방의 부기, 유방의 압통, 높은 직장 온도 (>39.0℃), 식욕부진, 감소된 반추위 운동성 및 피로감을 의미한다. 우유 체세포 계측치 (SCC)의 증가는 다른 스타필로코커스 IMI이다. 우유 체세포는 백혈 세포 예컨대 백혈구 또는 호중구를 비롯하여 상피 세포를 포함한다. > 200,000/mL의 SCC가 스타필로코커스 IMI 증상을 대표할 수 있거나 또는 스타필로코커스 IMI의 지표라는 것이 일반적으로 인정된다.
용량
면역 반응을 유발시키는 백신 성분의 독성 또는 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 절차를 통해 결정될 수 있다. 독성 및 면역 자극 효과 간 용량 비율을 측정할 수 있다. 큰 비율을 나타내는 성분이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 성분이 사용될 수 있지만, 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여서, 부작용을 감소시키기 위해서, 전달 시스템을 디자인하는데 주의를 기울여야만 한다.
세포 배양 어세이 및 실험실 동물 실험으로 수득된 데이타가 대형 동물 및 인간에서 사용을 위한 용량의 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 이러한 성분의 용량은 바람직하게 독성이 거의 없거나 또는 전혀없이 효능을 포함하는, 투여되는 농도의 범위 내인 것이다. 용량은 적용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 의존적으로 이 범위 내에서 다양할 수 있다.
약학 조성물의 임의의 적합한 양이 대상체에게 투여될 수 있다. 용량은 많은 인자들에 의존적이게 된다. 전형적으로, 단일 용량 내에 함유된 활성 성분의 양은 유의한 독성을 유도하지 않고 IMI를 효과적으로 예방하거나, 또는 치료하는 양일 수 있다. 당업자는 일정한 인자들이 대상체에서 면역 반응을 효과적으로 상승시키는데 요구되는 용량에 영향을 미칠 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 게다가, 본 발명의 항원 (예를 들어, 융합체 구성체)의 치료적 유효량은 일련의 용량을 요구할 수 있다. 일반적으로, 용량 당 융합체 구성체를 포함하는 항원의 약 0.01 mg - 500 mg의 양이 고려된다. 특정한 구체예에서, 용량 당 융합체 구성체를 포함하는 항원의 약 0.1 mg - 1 mg의 양이 고려된다. 일반적으로, 백신의 1회, 2회, 또는 3회 용량이 면역성의 최적 발생을 촉진할 수 있다. 2회 용량 간 시간은 3주 또는 4주 정도로 짧을 수 있지만 부스터 주사로 면역계를 자극하기 전에 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 만큼 프라이밍 용량 (제1 용량) 및 부스터 용량 (제2 용량)을 분리시키는 것이 바람직할 수 있다. 후속 부스터 주사 (리콜 주사)가 또한 지속가능한 면역성을 제공하는데 최적일 수 있다. 이러한 리콜은 예를 들어 반년 (6개월)마다, 1년 마다, 2년 마다, 3년 마다 또는 5년 마다 일어날 수 있다.
"샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 생물체로부터 단리된 임의의 고체 또는 액체 샘플을 의미한다. 특정 구체예에서, 이것은 포유동물로부터 단리된 임의의 고체 (예를 들어, 조직 샘플) 또는 액체 샘플, 예컨대 우유, 생검 물질 (예를 들어, 고형 조직 샘플), 혈액 (예를 들어, 혈장, 혈청 또는 전혈), 타액, 활액, 소변, 양수 및 뇌척수액을 의미한다. 이러한 샘플은 예를 들어 감염성 작용제의 발현 수준의 분석 이전에 신선하거나, 고정 (예를 들어, 포르말린-, 알콜- 또는 아세톤-고정)되거나, 파라핀-포매되거나 또는 냉동될 수 있다.
환자
본 명세서에서 사용시 용어 "대상체" 또는 "환자"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물, 바람직하게 포유동물 예컨대 제한없이 인간, 소 (예를 들어, 어린 암소, 다산, 초산, 송아지), 염소, 양, 암양, 당나귀, 말, 돼지, 닭, 고양이, 개 등을 의미한다. 특정한 구체예에서, 이는 (예를 들어, 스타필로코커스 (예를 들어, IMI) 감염을 경험할 위험성이 있는) 소이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "향후 시점에 스타필로코커스 감염 (예를 들어, 스타필로코커스 감염 (예를 들어, IMI)) 또는 이의 임의 증상을 경험할 위험성이 있는 대상체"는 우유 또는 고기 생산에 사용되는 포유동물 (예를 들어, 소 (예를 들어, 어린 암소, 다산, 초산, 송아지), 염소, 양)을 의미한다.
일 구체예에서, 상기 언급된 포유동물은 소이다.
검출 방법
선택된 단백질/폴리펩티드의 양/수준을 측정하기 위한 방법의 예는 제한없이 웨스턴 블롯, 면역블롯, 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA), 방사성면역어세이 (RIA), 면역침강법, 표면 플라스몬 공명법, 화학발광법, 형광 편광법, 인광법, 면역조직화학 분석법, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 (MALDI-TOF) 질량 분광법, 미세세포측정법, 마이크로어레이법, 현미경법, 유세포측정법, 및 제한없이 DNA 결합, 리간드 결합, 다른 단백질 파트너와 상호작용 또는 효소 활성을 포함하는 단백질의 특성을 기반으로 하는 어세이를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법 내에서 폴리펩티드/단백질의 양은 폴리펩티드/단백질에 대하여 특이적으로 유도된 항체를 사용하여 검출된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그들이 바람직한 생물학적 활성 또는 특이성을 나타내는 한 항체 단편을 포괄한다. "항체 단편"은 전체 길이 항체의 일부분, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 및 표적 폴리펩티드 간 상호작용은 방사측정, 비색계, 또는 형광계측 수단에 의해 검출된다. 항원-항체 복합체의 검출은 검출가능한 태그, 예컨대 예를 들어 효소, 형광단 또는 발색단과 커플링된 2차 항체의 첨가를 통해 수행될 수 있다.
항체를 제조하는 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 다클론 항체는 적합한 대상체 (예를 들어, 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유동물)를 면역원으로서 관심 폴리펩티드/단백질 또는 이의 단편으로 면역화하여 제조될 수 있다. 폴리펩티드/단백질 "단편", "일부분" 또는 "절편"은 상기 언급된 폴리펩티드의 적어도 약 5, 7, 10, 14, 15, 20, 21개 또는 그 이상의 아미노산의 아미노산 잔기의 스트레치이다. 면역화된 대상체에서 항체 역가는 표준 기술에 의해서, 예컨대 고정된 엑소솜 마커 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용하는 효소 연결 면역흡착 어세이 (ELISA)를 사용하여 시간 경과에 따라 모니터링될 수 있다. 면역화 이후에 적절한 시간에, 예를 들어, 항체 역가가 최고인 경우에, 항체-생산 세포는 동물, 일반적으로 마우스로부터 수득될 수 있고, 표준 기술, 예컨대 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497]에 최초로 기술된 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4: 72), EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld and Sell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), pp. 77-96) 또는 트리오마 기술을 통해 단일클론 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 하이브리도마를 생산하기 위한 기술은 충분히 공지되어 있다 (일반적으로 [Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY] 참조).
대안적으로, 단일클론 항체-분비 하이브리도마를 제조하기 위해서, 단일클론 항체는 재조합 조합성 면역글로불린 라이브러리 (예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용해 스크리닝하여서 폴리펩티드에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 단리함으로써 동정되고 단리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System™, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP™ 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612 참조).
뿐만 아니라, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드/단백질 중 하나 이상에 대하여 유도된 항체는 상업적 공급처로부터 수득될 수 있다.
폴리펩티드/단백질에 특이적인 고정된 항체의 사용이 또한 본 발명에서 고려되고 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 항체는 다양한 고형 지지체, 예컨대 자성 또는 크로마토그래피 매트릭스 입자, 어세이 위치의 표면 (예컨대 마이크로타이터 웰), 고형 기재 재료 (예컨대 플라스틱, 나일론, 종이)의 조각 등의 위에 고정될 수 있다. 어세이 스트립은 고형 지지체 상에 어레이로 다수의 항체들 또는 항체를 코팅하여 제조될 수 있다. 이어서, 이러한 스트립을 검사 샘플에 침지시킨 후에 신속하게 세척 및 검출 단계를 통해서 처리하여 발색점과 같은 측정가능한 신호를 생성할 수 있다.
다수 (2 이상)의 폴리펩티드/단백질의 분석은 하나의 검사 샘플과 별개로 또는 동시에 수행될 수 있다. 몇몇 폴리펩티드/단백질은 다수의 샘플의 효율적인 처리를 위해서 한 검사로 조합될 수 있다.
폴리펩티드/단백질의 분석은 다양한 물리적 형식으로 수행될 수도 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 사용 또는 자동화를 사용하여 대량의 검사 샘플의 처리를 용이하게 할 수 있다. 대안적으로, 단일 샘플 형식이 시기적절한 방식으로 즉시 치료 및 진단을 촉진하기 위해 개발될 수 있다. 특히 유용한 물리적 형식은 다수의 상이한 피분석물의 검출을 위해서 다수의 개별, 주소지정가능한 위치를 갖는 표면을 포함한다. 이러한 형식은 단백질 마이크로어레이, 또는 "단백질 칩" (예를 들어, [Ng and Ilag, J. Cell Mol. Med. 6: 329-340, 2002] 참조) 및 모세관 장치를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 언급된 발현 수준은 상기 하나 이상의 유전자로부터 전사된 mRNA의 발현 수준을 측정하여 결정된다.
핵산 (mRNA) 수준을 결정하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소-PCR (RT-PCR), SAGE, 정량적 PCR (q-PCR), 서던 블롯, 노던 블롯, 서열 분석, 마이크로어레이 분석, 리포터 유전자의 검출, 또는 다른 DNA/RNA 하이브리드화 플랫폼을 포함한다. RNA 발현을 위해서, 바람직한 방법은 제한없이, 세포 mRNA의 추출 및 본 발명의 단백질/폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나 이상의 전부 또는 일부분을 코딩하는 전사물과 하이브리드화하는 표지된 프로브를 사용한 노던 블롯; 특이적 프라이머, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR (q-PCR), 및 역전사효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용한 본 발명의 단백질/폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나 이상으로부터 발현된 mRNA의 증폭 후, 임의의 다양한 수단에 의한 생성물의 정량적 검출; 이후에 표지되어 임의의 다양한 표면 상에 어레이된 본 발명의 단백질/폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 전부 또는 일부를 코딩하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 탐침하는데 사용되는, 생물학적 샘플로부터 총 RNA의 추출을 포함한다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 성분을 포함하는 키트를 포괄한다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 성분을 포함한다. 성분은 투여를 위한 적합한 용기 및 장치에 포장될 수 있다. 키트는 키트를 사용하기 위한 지시서를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 구성체, 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주, 조성물, 또는 이의 적어도 2종의 조합을 스타필로코커스 IMI의 치료 및/또는 예방을 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는데 유용한 시약을 포함하는 키트 또는 패키지를 제공한다. 이러한 키트는 예를 들어, 스타필로코커스 IMI의 예방 및/또는 치료를 위한 지시서, 용기, 방법을 수행하는데 유용한 시약을 더 포함할 수 있다. 키트는 검사 시 배경 간섭을 감소시키기 위한 작용제가 필요한 경우에, 신호 증가를 위한 작용제, 관심 임상 결과의 예측을 생성하도록 마커 값을 조합하고 내삽하기 위한 소프트웨어 및 알고리즘, 검사를 수행하기 위한 장비, 보정 그래프 및 도표, 표준화 그래프 및 도표 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명을 실시하기 위한 방식(들)
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 통해서 더욱 상세하게 예시된다.
실시예 1: SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, SACOL1867, SACOL1912 및 SACOL2385를 포함하는 백신에 대한 재료 및 방법 (백신 #1)
항원의 생산. 에스. 아우레우스 소 유선내 감염 동안 고도로 발현되는 6종의 항원이 제1 소 백신 (백신 #1)에 포함을 위해 선택되었다. 이들 항원은 SACOL0029 (GenBank 등록 번호: YP_184940.1) (SEQ ID NO: 5), SACOL0442 (YP_185332.1) (SEQ ID NO: 29), SACOL0720 (YP_185601.1) (SEQ ID NO: 11), SACOL1867 (GenBank 등록 번호: YP_186695.1) (SEQ ID NO: 38), SACOL1912 (GenBank 등록 번호: YP_186737.1) (SEQ ID NO: 43), 및 SACOL2385 (GenBank 등록 번호: YP_187189.1) (SEQ ID NO: 50)이다. SACOL0029, SACOL1867, SACOL1912, 및 SACOL2385의 His-태그화 재조합 단백질은 GenScript, Inc. (Piscataway, NJ)가 조작하여 생산하였다. SACOL0442 및 SACOL0720의 His-태그화 재조합 단백질은 제조사의 추천에 따라서, Qiagen Inc. (Mississauga, ON, Canada)의 QIA 발현 기술 (pQE30 플라스미드)을 사용하여 조작하여 생산하였다. 항원의 his-태그화 서열의 경우 도 21 I 내지 VI을 참조한다. 실시예 2-5 및 도 1-4는 이 백신 #1과 관련된다.
젖소의 면역화. 수유 중인 19마리의 건강한 다산 홀슈타인 젖소를 캐나다 농업 및 농식품부의 낙농 및 돼지 연구 및 개발 센터 (Dairy and Swine Research and Development Centre of Agriculture and Agri-Food Canada) (Sherbrooke, QC)에서 II 단계 생물안전 외양간에서 사육하였다. 소들을 2개 그룹으로 무작위로 분류하였는데, 한 그룹 (10마리 소)은 염수 (위약 그룹)를 투여받았고, 나머지 그룹 (9마리 소)은 백신 #1을 투여받았다 (백신접종 그룹). 백신은 소의 면역 반응을 유도시키는데 사용된, Emulsigen™-D (MVP Technologies, Omaha, NE), CpG ODN 2007 (TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 194), 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP), VIDO, Saskatoon, SW) 및 소의 면역 반응을 유도시키는데 사용된, 양이온성 펩티드 인돌리시딘 (ILPWKWPWWPWRR (SEQ ID NO: 195) (Chemprep Inc., Miami, FL)과 조합된, 300 ㎍의 각각의 6종의 항원 (SACOL0029, SACOL0720, SACOL1867, SACOL1912, 및 SACOL2385)으로 구성되었다. 2회 면역화는 목에 피하로, 10주 간격으로 수행하였다. 부작용이 관찰되지 않았다. 미정맥 유래 혈액 및 우유 샘플은 제1 면역화 이전 (면역전 혈청)에 채취하였고 그 이후에 총 IgG, IgG1 및 IgG2의 검출을 위해 2주마다 채취하였다. 경정맥으로부터 더 많은 부피의 혈액 (150 mL)을 제1 면역화 이전 및 제1 면역화 이후 14주 (즉, 제2 면역화 후 4주)에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 단리 및 세포 면역 반응의 분석을 위해 채혈하였다.
ELISA에 의한 총 IgG, IgG1 및 IgG2의 검출. 혈청 및 우유에서 항원 각각에 대한 총 IgG, IgG1 및 IgG2의 검출은 일부 변형을 가하여 이전에 기술된 대로 수행하였다 (Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318). Nunc MaxiSorp™ 96-웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)를 시험 항원 (카보네이트/바이카보네이트 완충액에 희석된 5 ㎍/mL, Sigma Aldrich, Oakville, ON)으로 코팅하였고 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로 플레이트를 0.5% 젤라틴을 함유하는 PBS (BD, Franklin Lakes, NJ)로 1시간 동안 37℃에서 포화시켰다. 0.5% 젤라틴 및 0.1% Tween™ 20을 함유하는 PBS 중 혈청의 2배 연속 희석물 중 100 마이크로리터를 플레이트에 적재하였고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 0.1% Tween™ 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 100 마이크로리터의 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 2차 항체를 플레이트에 첨가하였다. 사용된 2차 항체는 염소 항-소 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA), 양 항-소 IgG1 (AbD Serotec, Raleigh, NC) 또는 양 항-소 IgG2 (AbD Serotec)였고, 각각은 0.5% 젤라틴 및 0.1% Tween™ 20을 함유하는 PBS에 1/50,000 1/20,000 및 1/20,000로 희석되었다. 37℃에서 1시간의 인큐베이션 후에 3회 세척을 후속하고 나서, 퍼옥시다제 활성은 제조사의 추천에 따라서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 시약 (KPL Inc., Gaithersburg, MD)으로 검출하였다.
우유 중 총 IgG, IgG1 및 IgG2의 검출은 약간의 변형을 가하여 동일한 절차를 사용해 수행하였다. 우유 샘플은 0.5% 젤라틴을 함유하는 PBS에 희석하였다. 양 항-소 IgG2는 0.5% 젤라틴 및 0.1% Tween™ 20을 함유하는 PBS에 1/10,000로 희석되었다.
세포 면역 반응의 평가. PBMC는 경정맥 혈액으로부터 단리하였고 이전에 기술된 대로 카복시플루오레세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르 (CFDA-SE; Molecular Probes Inc., Eugene, OR)로 표지하였다 (Loiselle et al., J. Dairy. Sci. (2009), 92:1900-1912). CFDA-SE 표지화 절차 종료시에, PBMC를 5% FBS 및 1X 항생제/항진균제를 함유하는 RPMI 배지 (A5955, Sigma Chemical Aldrich)에 현탁시켰다. PBMC (웰 당 5x106 세포)는 1 ㎍/mL의 최종 농도의 미토겐 콘카나발린 A (ConA; 양성 대조군; Sigma Aldrich), 또는 각각의 항원 (웰 당 5 ㎍)으로 자극시켰고 7일 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 음성 대조군으로서, PBMC는 임의의 미토겐 없이 인큐베이션시켰다. 자극은 이중으로 수행하였다 (Ster et al., 2010).
CD4+ 및 CD8+ 세포의 증식은 상이한 미토겐과 인큐베이션 후 평가하였다. 세포는 300 x g에서 5분 동안 원심분리시켰고, 0.5% BSA를 함유하는 PBS에 현탁시켰다. 그리고 나서 Alexa Fluor™ 647이 커플링된 마우스 항-소 CD8 (1/20로 희석, AbD serotec) 및 rPE가 커플링된 마우스 항-소 CD4 (1/20로 희석, AbD serotec)를 첨가하였다. 얼음 상에서 30분간 인큐베이션 후, 세포는 0.5% BSA를 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 세포를 0.5% 포름알데히드가 있는 PBS에 현탁시켰다. 증식된 개체군의 백분율은 BD FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 BD FACS Canto II 유세포측정계 상에서 유세포측정을 통해 결정하였다.
젖소의 IMI에서 실험적 에스. 아우레우스. 실험적 IMI에서 그들을 사용하기 전에, 박테리아 배양물의 흡광도 (A600 nm) 및 CFU 간 상관성을 결정하였다. 챌린지 당일에, MHB (Mueller Hinton broth; BD) 중 에스. 아우레우스의 밤샘 배양물의 부피를 200 mL의 신선한 MHB로 옮겨서 0.1의 A600 nm을 수득하였고 이후에 A600 nm이 성장 대수기의 108 CFU/mL에 상응하는 값에 도달할 때까지 35℃에서 성장시켰다. 이러한 실험적 감염에서 사용하려는 균주 (CLJ08-3)는 공동 발명자의 실험실에서 이전에 특징규명하였다 (Allard et al., Vet. Microbiol. (2013) 162: 761-770). 유선내 주입을 위해서, 박테리아는 통상적으로 멸균 PBS (Sigma Aldrich)에 희석하여 3 mL 중 대략 50 CFU를 수득하였다. 이 실험에서, 접종원을 TSA 상에 플레이팅하였고 3 mL 중 63 cfu를 함유한다는 것을 확인하였다.
무균 쿼터 우유 샘플의 체세포 계측치 (SCC) 결정 및 박테리아 분석은 모든 소가 IMI가 없었다는 것을 보장하기 위해서 실험적 IMI 이전에 수행되었다. 박테리아로 유선 쿼터의 실험적 주입은 약간의 변형을 가하여 이전에 기술된 절차에 따라서 저녁 착유 이후에 각각의 소의 4 쿼터 중 3개 (임의 선택)에서 수행하였다 (Petitclerc et al., J. Dairy. Sci. (2007), 90: 2778-2787). 간략하게, 접종 이전에, 젖꼭지를 70% 에탄올에 침지시킨 거즈로 문질러주었다. 젖꼭지는 4 쿼터 중 3 쿼터에 3 mL의 박테리아 현탁액 (63 CFU 함유)의 유선내 주입 이전에 공기 건조될 수 있게 하였다. 주입 후 즉시, 모든 쿼터를 완전하게 마사지해주었고 젖꼭지는 요오드포어-기반 젖꼭지 살균제에 담가주었다. 절차 전반에서 일회용 글로브를 사용하였고 다음 동물을 진행하기 전에 소독하였다. 에스. 아우레우스가 주입된 모든 쿼터는 감염되었고 모든 소가 에스. 아우레우스의 주입 후 최초 수 일 동안 일부 시기에 유선염의 임상적 징후 (염증 및/또는 불량한 우유 외관)를 보였다.
실험적 감염 이후 에스. 아우레우스 생존 계측치의 평가. 무균 우유 샘플은 실험적 감염 이후에 처음 3주 동안 주 당 3회씩 아침 착유 이전에 채취하였고 그 이후에 나머지 2주 동안 주 당 2회 채취하였다. 초유를 버리고 젖꼭지를 70% 에탄올로 소독시킨 후, 10-mL 우유 샘플을 각각의 개별 쿼터에 대해서 50-mL 멸균 바이알에 무균적으로 채취하였다. 우유 샘플은 연속 희석하였고, CFU 결정 및 에스. 아우레우스 동정을 위해서 100 ㎕의 각 희석액을 TSA 한천 (Becton Dickinson) 및 만니톨 염 한천 플레이트 (Becton Dickinson) 둘 모두에 플레이팅하였다. 다음으로 플레이트는 콜로니를 계측하기 전에 24시간 동안 35℃에서 인큐베이션시켰다. 30 내지 300 콜로니를 보이는 희석액을 사용하여 박테리아 농도를 계산하였다. 각각의 희석액은 이중으로 플레이팅하였다.
체세포 계측치의 평가. 무균 우유 샘플과 동일한 빈도로, 우유를 아침 착유 시에 개별 쿼터 착유 유닛을 사용해 채취하였고 쿼터 우유 생산을 결정하기 위해 칭량하였다. 비-무균 50-mL 샘플을 또한 상업적 실험실 (Valacta Inc., Ste-Anne-de-Bellevue, QC, Canada)에서의 SCC 결정을 위해서 각 쿼터 착유 유닛으로부터 채취하였다. 착유 유닛은 각각의 소에서 그들 사용 사이 사이에 철저하게 세척하였고 요오드-기반 살균제 세제 (K.O. Dyne®, GEA Farm Technologies, Westmoreland, NY)로 소독하였다. 우유와 접촉되는 모든 다른 재료들은 70% 에탄올로 소독하였다.
통계적 분석. 실험적 감염 데이타의 통계적 분석은 반복된 측정으로서 SAS의 MIXED 절차 (SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용해 수행하였다. SCC 및 CFU의 분석을 위해서, 데이타는 분석 전에 log10으로 전환시켰다. CFU 및 SCC 간 상관성 및 항체 역가의 통계적 분석은 GraphPad Prism™ v6.05를 사용해 수행하였다.
윤리적 진술. 모든 동물 실험은 캐나다 농업 및 농식품부의 동물 보호 지역 위원회에 의해 승인받았고 캐나다 동물 보호 협회의 지침에 따라서 수행되었다.
실시예 2: 백신접종 후 혈청 총 IgG1 역가 - 백신 #1
SACOL0029 (GenBank 등록 번호: YP_184940.1) (SEQ ID NO: 5), SACOL0442 (SEQ ID NO: 29), SACOL0720 (SEQ ID NO: 11), SACOL1867 (GenBank 등록 번호: YP_186695.1) (SEQ ID NO: 38), SACOL1912 (GenBank 등록 번호: YP_186737.1) (SEQ ID NO: 43), 및 SACOL2385 (GenBank 등록 번호: YP_187189.1) (SEQ ID NO: 50)에 대한 재조합 His-태그화 항원은 실시예 1 (항원의 생산 및 젖소의 면역화)에 기술된 바와 같이 제조하여 건강한 소에게 투여하였다. 9마리 젖소가 백신을 투여받았고 10마리 소는 염수 (위약)를 투여받았다. 총 혈청 IgG, IgG1 및 IgG2 역가는 실시예 1 (ELISA에 의한 총 IgG, IgG1 및 IgG2의 검출)에 기술된 대로 검출하였다.
예상한 바와 같이, 도 1B-C에 도시된 대로, 면역화는 위약 그룹과 비교하여 백신접종 그룹에서 항원-특이적 혈청 IgG1 및 IgG2의 증가된 생산을 유도하였다. 흥미롭게, IgG2/IgG1 비율은 SACOL0442의 경우 1이었고 (도 1D 참조), 이것은 이 항원에 대한 균형잡힌 Th1/Th2 면역 반응의 지표이다. 항원 SACOL0029, SACOL0720, SACOL1912 및 SACOL2385의 경우, IgG2/IgG1 비율은 SACOL0442에 대한 비율보다 유의하게 더 낮아서 이들 항원이 주로 Th2 경로를 통해서 IgG1 항체 반응을 유도하였다는 것을 의미한다.
실시예 3: 백신접종 후 혈액 CD4+ 및 CD8+ 세포의 항원 의존적 증식 - 백신 #1
백신접종 소 (9) 및 위약 소 (10) 유래의 혈액 CD4+ 및 CD8+ 세포의 항원 의존적 증식은 각 항원에 대한 2차 면역화 후 4주 (실험적 감염 직전)에 실시예 1 (세포 면역 반응의 평가)에 기술된 대로 평가하였다. CD4+ 세포의 결과는 도 2에 도시되어 있으며, 여기서 각각의 기호는 양성 대조군 (ConA) 또는 각각의 항원과 인큐베이션 1주일 후에 각 소에서 증식된 CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다. 개방 원형 (○)은 백신접종된 소의 데이타를 나타내고, 검은색 사각형 (■)은 위약 소의 데이타를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타내는데, 파선은 백신접종 소의 중앙값을 나타내는 한편 연속선은 위약 소의 중앙값을 나타낸다.
기호 *은 항원 SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720 및 SACOL1912에 대한 백신접종 및 위약 그룹 간 통계적 편차를 나타낸다 (*, P<0.05).
또한, CD8+ 세포의 증식은 모든 항원의 경우 백신접종 및 위약 소에서 유사하였지만 항원 SACOL0720은 예외적으로 백신접종된 소에서 CD8+ 세포의 더 높은 증식이 관찰되었다 (데이타는 도시하지 않음). CD8+ 세포의 유도가 또한 감염의 해결에 중요한 것으로 보였다 (Riollet et al., 2001; Burton and Erskine, 2003). 이 백신은 세포성 (CD8+) 및 체액성 (CD4+) 면역 반응 둘 모두를 자극시킬 수 있었다. 이의 상이한 항원을 갖는 백신 #1은 균형잡힌 면역 반응을 야기시킨다.
실시예 4: 체세포 계측치 ( SCC )의 전개 후 평가된 백신의 보호 효과 - 백신 #1
젖소에서 실험적 에스. 아우레우스 IMI 감염은 실시예 1 (젖소에서 실험적 에스. 아우레우스 IMI, 실험적 감염 후 에스. 아우레우스 생존 계측치의 평가, 체세포 계측치의 평가 및 통계적 분석)에 기술된 대로 수행하고 평가하였다. 2차 면역화 후 4주 및 4일 후에, 에스. 아우레우스의 63 CFU를 저녁 착유 시 (1일, 도 3의 화살표)에 백신접종 (9) 및 위약 소 (10)의 4 쿼터 중 3 쿼터에 주입하였다. 무균 우유는 아침 착유시에 채취하였고 SCC는 Valacta (Ste-Anne-de-Bellevue, QC)에 의해 결정하였다. 결과를 도 3에 도시하였고, 여기서 개방 원형 (○) 및 파선은 백신접종 소의 데이타를 나타내는 한편, 검은색 사각형 (■) 및 연속선은 위약 소의 데이타를 나타낸다. 각각의 개방 원형은 백신접종 소 (27)의 모든 감염된 쿼터에 대한 SCC의 평균을 나타내는 한편 각각의 사각형은 위약 소의 모든 감염된 쿼터 (30 쿼터)에 대한 SCC의 평균을 나타낸다.
챌린지 기간 동안, 우유의 SCC는 위약 소의 경우보다 백신접종 소에서 유의하게 더 낮은 것으로 확인되어 (***; P<0.001), 백신접종 소에서 염증의 더 양호한 방제 및 더 적은 염증을 나타낸다.
실시예 5: 특이적 항원에 대한 혈청 또는 우유 IgG 역가에 대한 SCC 또는 에스. 아우레우스의 생존 계측치 (CFU) 간 상관성 - 백신 #1
도 4A-B에 도시된 바와 같이, SCC는 챌린지 기간 동안 에스. 아우레우스 CFU와 양의 상관관계였고 (도 4A, r=0.82, P<0.0001), 감염 전 측정된 SACOL0442에 대한 혈청 IgG1 역가와 음의 상관관계였다 (도 4B, r=-0.49, P<0.05). 따라서 백신접종은 챌린지에 의해 유도된 염증의 이러한 기준을 감소시켰다. 유사한 분석이 10일에 채취된 샘플을 사용해 수행되었다. 동일한 상관성이 이전에 수득된 바와 같이 관찰되었지만 이러한 특정 시점에서 SCC 및 에스. 아우레우스 CFU는 또한 SACOL0029에 대한 우유 IgG 역가와 상관관계가 있었다 (도4C, 개별적으로 r=-0.48, P<0.05 및 r=-0.58, P<0.05). 이들 결과는 하나를 초과하는 항원이 감염에 대한 면역 반응에 관여된다는 것을 보여준다.
실시예 6: SACOL0442, SACOL0720, 및 SACOL1867과 SACOL0029 간 융합체를 포함하는 백신에 대한 재료 및 방법 - 백신 #2
항원의 생산. 에스. 아우레우스 소 유선내 감염 동안 고도로 발현되는 4종의 항원을 백신 #2에 포함을 위해 선택하였다. 항원은 SACOL0029 (GenBank 등록 번호: YP_184940.1) (SEQ ID NO: 5), SACOL1867 (GenBank 등록 번호: YP_186695.1) (SEQ ID NO: 38), SACOL0442 (SEQ ID NO: 29), 및 SACOL0720 (SEQ ID NO: 11)에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다. SACOL0029 및 SACOL1867 항원은 융합체의 형태로 포함시켰다. SACOL0720 및 SACOL0029-1867의 His-태그화 재조합 단백질은 GenScript, Inc. (Piscataway, NJ)에 의해 조작되어 생산되었다. SACOL0442의 his-태그화 재조합 단백질은 제조사의 추천에 따라서, Qiagen Inc. (Mississauga, ON, Canada)의 QIA 발현 기술 (pQE30 플라스미드)을 사용해 조작하여 생산되었다 (SACOL0720, SACOL0442, 및 SACOL0029-1867 his-태그화 서열에 대해 도 21D-E 및 I, 및 항목 II, III 및 VII 참조). 표면 단백질 ClfA (SEQ ID NO: 184)가 또한 에스. 아우레우스 ATCC 25904로부터 clfA 유전자를 클로닝하여 QIA 발현 벡터를 사용해 추가적으로 생산되었다. 후자의 재조합 단백질은 백신 조성물의 일부가 아니었지만 다른 에스. 아우레우스 단백질 예컨대 ClfA에 대한 혈청의 IgG 역가를 결정하기 위해 ELISA 어세이에서 사용되었다.
백신은 300 ㎍의 각각의 3종 항원 (실시예 1에 정의된 바와 같은 SACOL0442 및 SACOL0720 및 융합체 SACOL0029-1867) 및 Emulsigen™-D (MVP Technologies, Omaha, NE), CpG ODN 2007 (i.e. TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 194) (IDT, Coralville, IA)), 및 인돌리시딘 (ILPWKWPWWPWRR (SEQ ID NO: 195, GenScript, Piscataway, NJ, Chemprep Inc., Miami, FL)으로 구성되었다 (백신 #2).
젖소의 면역화. 수유 중인 11마리의 건강한 다산 홀슈타인 소를 캐나다 농업 및 농식품부의 낙농 및 돼지 연구 및 개발 센터(Sherbrooke, QC)의 II 단계 생물안전 외양간에서 사육하였다. 소들은 백신 #2를 투여받았다 (백신접종 그룹). 2회 면역화가 목의 피하로 10주 간격으로 수행되었다. 부작용이 관찰되지 않았다. 미정맥 유래 혈액 및 우유 샘플은 총 IgG의 검출을 위해서 1차 면역화 이전 (면역전 혈청)에 채취되었고 이후에 매주 채취되었다.
ELISA에 의한 총 IgG의 검출. 혈청 중 각각의 항원에 대한 총 IgG의 검출은 약간의 변형을 가하여 이전에 기술된 대로 수행하였다 (Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318). Nunc MaxiSorp™ 96-웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)는 검사 항원 (카보네이트/바이카보네이트 완충액 중에 희석된 5 ㎍/mL, Sigma Aldrich, Oakville, ON)으로 코팅하였고 밤새 37℃에서 인큐베이션시켰다. 다음으로 플레이트를 0.5% 젤라틴을 함유하는 PBS (BD, Franklin Lakes, NJ)로 1시간 동안 37℃에서 포화시켰다. 0.5% 젤라틴 및 0.1% Tween™ 20을 함유하는 PBS 중 혈청의 2배 연속 희석물 100 마이크로리터를 플레이트에 적재하였고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트는 0.1% Tween™ 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 100 마이크로리터의 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 2차 항체를 플레이트에 첨가하였다. 사용된 2차 항체는 0.5% 젤라틴 및 0.1% Tween™ 20을 함유하는 PBS에 1/1000,000로 희석된 염소 항-소 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후에 3회 세척 후, 퍼옥시다제 활성은 제조사의 추천에 따라서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 시약 (KPL Inc., Gaithersburg, MD)으로 검출하였다.
실시예 7: 항원의 융합체는 높은 항체 역가를 유도한다 - 백신 #2
도 5는 백신의 각 항원 (융합된 항원 SACOL0029 및 SACOL1867 (도 5에서 SACOL0029-1867로 표지)을 포함)에 대한 백신접종 소의 혈청 총 IgG 역가를 도시한다. 각각의 개방 원형은 각 소에 대한 2차 면역화 후 4주 (실험적 감염 직전)의 역가를 나타내는 한편 각각의 검은색 다이아몬드는 면역전 역가를 나타낸다. 수평선은 중앙값을 나타내고, 실선은 면역전 혈청의 경우이고, 점선은 면역화 후 4주에 채취된 샘플의 경우이다. 백신접종된 소의 역가가 면역전 혈청의 역가보다 더 높다 (**, P < 0.01; ***, 검사된 다른 항원의 경우 P < 0.001).
따라서 도 5는 융합체 펩티드를 포함하는, 3종의 개별 항원으로 구성된 백신이 소에서 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 도시한다. 게다가, 도 5는 놀랍게도 융합된 항원 SACOL0029 및 SACOL1867 (융합체 SACOL0029-SACOL1867)이 각각의 항원 단독에 의해 상승된 것 이상으로 항체 역가를 상승시켰고 (도 1A 대 도 5 비교) 이러한 융합된 항원이 백신에 추가적인 이득을 제공한다는 것을 보여준다.
보다 특히, 백신으로 개별적으로 투여되었을 때, SACOL0029 및 SACOL1867에 대한 면역 소의 역가는 개별적으로 3200 및 51200에 도달한데 반해서 (도 1A), 이들 항원이 융합체로서 투여되었을 때, 면역 소의 역가는 개별적으로 12800 및 409600에 도달하여서 (도 5), 융합체가 면역 반응의 예상치 않은 상승작용을 생성시킨다는 것을 보여준다.
실시예 8: SACOL0029, SACOL1867, 및 SACOL1867과 SACOL0029 간 융합체를 포함하는 백신에 대한 재료 및 방법 - 백신 #3
항원의 생산. 에스. 아우레우스 소 유선내 감염 동안 고도로 발현되는 2종의 유전자로부터 유래된 3종의 항원이 백신에 포함을 위해 선택되었다. 이들 항원은 SACOL0029 (GenBank 등록 번호: YP_184940.1) (SEQ ID NO: 5), SACOL1867 (GenBank 등록 번호: YP_186695.1) (SEQ ID NO: 38), 및 SACOL1867 및 SACOL0029 간 융합체 (GenBank 등록 번호: YP_184940.1) (SEQ ID NO: 5)이다. SACOL0029, SACOL1867 및 SACOL0029-1867의 His-태그화 재조합 단백질은 GenScript, Inc. (Piscataway, NJ)가 조작하여 생산하였다. (SACOL0029, SACOL1867, 및 SACOL0029-1867 his-태그화 서열에 대해서 도 21A, F 및 I, 항목 I, IV 및 VII 참조).
마우스의 면역화. SACOL0029, SACOL1867 유전자 및 SACOL0029와 SACOL1867의 융합체에 의해 코딩되는 재조합 에스. 아우레우스 단백질의 면역원성 특성을 마우스에서 평가하였다. 1가 형태 (SACOL0029 또는 SACOL1867) 또는 다가 형태 (융합체 SACOL0029-1867 또는 SACOL0029와 함께 SACOL1867의 조합)로, 정확한 등몰량의 단백질을 투여받은 4개 그룹의 마우스를 비교하였다.
간략하게, 전체 융합체 또는 융합체의 SACOL0029 또는 SACOL1867 부분에 상응하는 각각의 아미노산 서열의 이론적 분자량은 ExPASy™ 생물정보학 자원 포탈 (http://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)을 사용해 계산하였다.
5 마이크로그램의 융합체를 한 그룹의 마우스에게 투여하였다. 5 ㎍의 SACOL0029-1867 융합체의 상응하는 몰 분량은 이의 이론적 분자량에 대해서, 168.55 pmol인 것으로 결정되었다. 168.55 pmol의 각 항원을 제공하기 위해서, 각각 1.15 ㎍ 및 3.69 ㎍의 SACOL0029 및 SACOL1867의 양을 2개의 다른 마우스 그룹에게 투여하였다. 마지막 마우스 그룹은 2종의 개별 항원의 조합 (각각 168.55 pmol)을 투여받았다.
면역화 용량의 제조를 위해서, SACOL0029, SACOL1867 및 SACOL0029-1867 융합체 폴리펩티드는 개별적으로 혼합하였고 PBS에 현탁하여서 100 ㎕의 부피 중에 각 항원성 용량의 최종 등몰량을 수득하였다. 20마리의 CD-1 암컷 마우스를 무작위로 4개 그룹으로 분류하였다: 그룹 A (5마리 마우스)는 5 ㎍의 SACOL0029-1867 융합체 단백질을 투여받았고 (융합체); 그룹 B (5마리 마우스)는 1.15 ㎍의 SACOL0029 및 3.69 ㎍의 SACOL1867을 투여받았으며 (조합); 그룹 C (5마리 마우스)는 1.15 ㎍의 SACOL0029를 투여받았고 (0029), 그룹 D는 3.69 ㎍의 SACOL1867을 투여받았다 (1867). CD-1 마우스는 2주 간격으로 목에 2회 피하 주사를 통해서 면역화되었다. 전체 실험 면역화 기간 동안 부작용이 관찰되지 않았다. 혈액 샘플은 1차 프라이밍 주사 직전 (면역전 혈청)에 채취되었고 부스트 면역화 후 10일 (면역 혈청)에 채취되었다. 혈액 분취액을 1시간 동안 실온에서 응고될 수 있게 하였고, 10,000 g로 10분간 4℃에서 원심분리하였다. 혈청을 채취하고 후속 분석 전까지 -20℃에 유지시켰다.
ELISA에 의한 총 IgG의 검출. SACOL0029 및 SACOL1867 재조합 단백질에 대한 혈청 총 IgG의 검출은 약간 변형을 가하여 이전에 기술된 대로 수행하였다 (Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318). Nunc MaxiSorp™ 96-웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)는 75 ㎕의 각각의 검사 항원 (카보네이트/바이카보네이트 완충액에 희석된 6.67 ㎍/mL, Sigma Aldrich, Oakville, ON)으로 코팅하였고 실온에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음으로 플레이트를 5% 탈지유 분말을 함유하는 PBS로 1시간 동안 37℃에서 포화시켰다. 3% 우유 및 0.025% Tween™ 20을 함유하는 PBS 중 혈청의 4배 연속 희석물 100 마이크로리터를 플레이트에 적재하였고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트는 0.05% Tween™ 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 100 마이크로리터의 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 2차 항체를 플레이트에 첨가하였다. 사용된 2차 항체는 3% 우유 및 0.025% Tween™ 20을 함유하는 PBS에 1/5000로 희석된, 상업적 염소 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후 3회 세척 후에, 퍼옥시다제 활성은 제조사의 추천에 따라서 100 마이크로리터의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 시약 (KPL Inc., Gaithersburg, MD)을 첨가하여 검출하였다.
통계적 분석. 항체 역가 및 상관성의 통계적 분석은 GraphPad Prism™ v6.05를 사용해 수행하였다.
실시예 9: 항원의 융합체는 1가 항원 또는 항원의 조합과 비교하여 유의하게 더 높은 항체 역가를 유도한다 - 백신 #3
도 6은 융합체 폴리펩티드 (즉, SACOL0029-1867 융합체 단백질)에 포함된 항원 (SACOL1867)은 그 특이적 항원 (SACOL1867)에 대하여 강력하고 특이적인 항체 면역 반응을 유도할 수 있고, 보다 중요하게, 이 반응은 이 항원의 1가 형태 (단독 투여된 SACOL1867) 또는 융합체 (SACOL1867과 SACOL0029의 조합)의 일부분인 개별 폴리펩티드의 다가 조합으로 수득된 것보다 유의하게 더 높을 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 다수 폴리펩티드 표적에 대하여 면역 반응을 생성시키는 장점이외에도, 이러한 융합된 항원은 또한 그들 표적에 대하여 항체 역가를 상당히 개선시키는 추가적인 이득을 제공한다.
실시예 10: SACOL0720 단편(들) 및/또는 SACOL442 단편(들)을 포함하는 백신에 대한 재료 및 방법 - 백신 #4-6
항원의 생산. 길이가 15 내지 50개 아미노산이고 서열 SACOL0442 및/또는 SACOL0720으로부터 유래된 펩티드 및 아미노산 단편은 B-세포 에피토프의 존재를 기반으로 선택되었다. 펩티드 에피토프의 융합체는 또한 아미노산 링커 (예를 들어, EAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 62), 또는 ERKYK (SEQ ID NO: 61) 또는 KDYERKYKKHIVS (SEQ ID NO: 196))가 다양한 에피토프와 연결된 것이 디자인되었다. 펩티드 및 아미노산 단편은 Biomatik, Inc. (Cambridge, ON)에 의해 합성되었다. 수령시, 동결건조된 펩티드 및 아미노산 단편은 5 mg/mL의 농도로 멸균수에 현탁시켜서 사용 당일까지 -80℃에 보관하였다.
마우스의 면역화. 펩티드 및 아미노산 단편은 마우스의 면역화를 위한 항원으로서 사용하였다. 면역화 용량의 제조를 위해서, 각각의 펩티드 및 아미노산 단편 또는 이들의 조합을 혼합하였고 20%의 EMULSIGEN®-D 수중유 에멀션 보강제를 함유하는 PBS에 현탁시켜서 달리 명시하지 않으면 용량 당 100 ㎍의 최종 용량의 폴리펩티드를 수득하였다. CD-1 암컷 마우스를 3 내지 4마리 동물의 상이한 그룹으로 임의 분배하였다. 마우스는 2주 간격으로 목에 2회 피하 주사를 통해 면역화하였다. 총 실험 기간 동안 부작용은 관찰되지 않았다. 혈액 샘플은 1차 프라이밍 주사 직전 (면역전 혈청)에 채혈하였고 부스트 면역화 후 10일 (면역 혈청)에 채혈하였다. 혈액 분취액을 실온에서 1시간 동안 응고되도록 둔 후에, 10,000 g로 10분간 4℃에서 원심분리하였다. 혈청을 채취하여 후속 분석까지 -20℃에 유지시켰다.
ELISA에 의한 총 IgG의 검출. 마우스의 면역화에 사용된 항원에서 발견된 특이적 아미노산 서열에 대한 혈청 총 IgG의 검출은 일부 변형을 가하여 이전에 기술된 대로 수행하였다 (Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318). Nunc MaxiSorp™ 96-웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)는 카보네이트/바이카보테이트 완충액 (Sigma Aldrich, Oakville, ON)에 5 ㎍/mL의 최종 농도로 희석된 100 ㎕의 각각의 표적 아미노산 서열로 코팅하였고 밤새 실온에서 인큐베이션시켰다. 다음으로 플레이트는 5% 탈지유 분말을 함유하는 PBS로 1시간 동안 37℃에서 포화시켰다. 1% 우유 및 0.025% Tween™ 20을 함유하는 PBS 중 혈청의 4배 또는 2배 연속 희석물 100 마이크로리터를 플레이트에 적재하였고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 다음으로 0.05% Tween™ 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 100 마이크로리터의 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 2차 항체를 플레이트에 첨가하였다. 사용된 2차 항체는 1% 우유 및 0.025% Tween™ 20을 함유하는 PBS에 1/5000로 희석된 염소 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)였다. 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고 Tween™ 20을 함유하는 PBS로 3회 세척시키고 PBS로 최종 세척 후에, 퍼옥시다제 활성은 제조사의 추천에 따라서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 시약 (KPL Inc., Gaithersburg, MD)으로 검출하였다.
통계적 분석. 항체 역가 및 광학 밀도의 통계적 분석은 GraphPad Prism™ v6.05를 사용하여 수행하였다.
실시예 11: 서열 SACOL0442 및 SACOL0720로부터 코딩되는 에피토프를 포함하는 펩티드의 융합체에 대한 면역 반응 - 백신 #4
SACOL0442 및 SACOL0720으로부터 코팅되는 펩티드 에피토프의 융합체가 마우스 (n = 4)를 백신접종하는데 사용되었다. 펩티드의 융합체의 서열은 KDGGKYTLESHKELQ EAAAKEAAAK KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 3) (백신 #4)이었고, 여기서 링커는 이탤릭체로 표시되어 있으며 상이한 에피토프는 굵은체로 확인된다. 에피토프는 SACOL0442로부터 코딩되는 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1), SACOL0720으로부터 코딩되는 KDINKIYFMTDVDL (SEQ ID NO: 23), 및 또한 SACOL0720로부터 코딩되는 DVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 24)였다. 동물로부터 채취된 혈청 유래의 IgG 항체는 ELISA 어세이에서 SACOL0442 (즉, KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1)) 및/또는 SACOL0720 (즉, QFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO: 21); KDINKIYFMTDVDL (SEQ ID NO: 23), DVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 24)) 유래의 B-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 단편에 결합할 수 있었고 항체의 역가는 1/6400 또는 그 이상이었다. 면역화에 사용된 펩티드의 융합체 및 ELISA 어세이에서 항체 표적으로서 사용된 아미노산 단편 또는 폴리펩티드는 하기 표 III에 표시되어 있다. 이 표에서, 에피토프는 굵게 표시되어 있고 링커 서열은 이탤릭체이다.
표 III: 폴리펩티드 백신 및 항체 반응 표적
Figure pct00011
Figure pct00012
상기에 표시된 모든 항체 표적은 상기 융합체 항원으로 백신접종된 마우스 유래 IgG에 의해 ELISA 어세이에서 결합되었다.
이것은 SACOL0442 및 SACOL0720 둘 모두에 의해 코딩되는 펩티드 에피토프의 융합체를 사용하여 면역화시키고 포유동물에서 면역 반응을 유발시킬 수 있다는 것을 입증한다. 수득된 면역 반응은 SACOL0442 또는 SACOL0720를 인식하는 항체, SACOL0442 또는 SACOL0720으로부터 코딩되는 아미노산 단편 또는 변이체의 생산을 포함한다.
실시예 12: 면역화에서 항원으로서 사용되는 다수 에피토프의 융합체는 단일 에피토프에 대한 면역 반응을 유의하게 증강시킨다 - 백신 #4
SACOL0442 및 SACOL0720으로부터 코딩되는 펩티드 에피토프의 융합체를 사용하여 마우스 (n = 4)를 백신접종시켰다. 펩티드의 융합체의 서열은 KDGGKYTLESHKELQ EAAAKEAAAK KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 3)이었고, 여기서 링커는 이탤릭체이고 상이한 에피토프는 굵은체로 확인된다. 에피토프는 SACOL0442로부터 코딩되는 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1), SACOL0720으로부터 코딩되는 KDINKIYFMTDVDL (SEQ ID NO: 23), 및 또한 SACOL0720으로부터 코딩되는 DVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 24)였다. 다른 그룹의 마우스 (n = 4)는 SACOL0442로부터 코딩되는 단일 펩티드 에피토프 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1)로 면역화되었다.
혈청을 동물로부터 채취하였고 펩티드 에피토프 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1)를 함유하는, SACOL0442로부터 코딩되는 아미노산 단편 (GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD) (SEQ ID NO: 2)에 대하여 유도된 IgG 항체의 존재를 검사하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 3종의 펩티드 에피토프 (하나는 SACOL0442로부터 코딩되고 둘은 SACOL0720으로부터 코딩됨)의 융합체에 의한 면역화는 면역화용 항원으로서 펩티드 에피토프 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1)만을 사용했을 때 수득된 항체 수준과 비교하여, 펩티드 에피토프 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1)를 함유하는 SACOL0442로부터 코딩되는 아미노산 단편 (GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD) (SEQ ID NO: 2)에 대한 항체 생산을 유의하게 증가시켰다.
실시예 13: SACOL0720의 변이체로부터 코딩되는 50개 아미노산의 폴리펩티드 단편에 대한 면역 반응 - 백신 #5
마우스 (n = 3)의 한 그룹을 서열 SACOL0720으로부터 코딩되는 B-세포 에피토프 (굵은체), 보다 특히 에피토프 KDINKIYFMTDVDL (SEQ ID NO: 23), DVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 24) 및 QFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO: 21)를 함유하는 50개-아미노산 펩티드 단편 (KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYERKYKKHIVSQFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO: 27)) (백신 #5)으로 백신접종하였다. KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYERKYKKHIVSQFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO: 27)의 전체 서열은 에피토프 DVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 24) 및 QFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO: 21)를 연결하는 영역에서 4개 아미노산이 SACOL0720의 천연 서열과 다르다. 따라서 백신 #5는 링커 ERKYK (SEQ ID NO: 61)에 의해 간격을 둔, SACOL0720 유래 에피토프의 융합체 또는 SACOL0720의 변이체 단편으로 간주될 수 있다.
혈청은 SACOL0720 (SEQ ID NO: 25)에 의해 코딩되는 천연 단백질의 단편 (즉, 도 21D, 항목 II에 도시된 폴리히스티딘 형태)에 대해 유도된 IgG 항체의 존재에 대해 검사되었다. 양쪽 마우스는 1/6400 또는 그 이상의 역가로 ELISA 어세이에서 아미노산의 본래 서열의 에피토프를 인식하는 항체를 생산하는 아미노산의 변이체 서열에 상응하는 펩티드 단편 (또는 융합체 SACOL0720-720)으로 백신접종하였다.
이것은 서열 SACOL0720으로부터 코딩되는 에피토프를 포함하는 아미노산 단편이 포유동물에서 면역 반응을 유발시킬 수 있다는 것을 입증한다. 이것은 또한 천연 서열의 변이체가 B-세포 에피토프를 함유하는 본래 단편 서열에 대하여 면역계를 자극시키는 능력을 갖는다는 것을 더욱 입증한다.
실시예 14: 융합체의 조합 (펩티드 융합체 0442-0720 및 폴리펩티드 융합체 0029-1867)에 대한 면역 반응 - 백신 #6
SACOL0442 및 SACOL0720로부터 코딩되는 펩티드 에피토프의 융합체 (도 21I, 항목 VII- 융합체의 서열 참조)는 SACOL0029 및 SACOL1867의 서열을 함유하는 폴리펩티드 융합체 (도 21I, 항목 VII 융합체의 서열 참조)와 조합시켰고 마우스를 백신접종하는데 사용하였다 (백신 #6).
면역화 용량의 제조를 위해서, 펩티드 융합체 0442-0720 및 폴리펩티드 융합체 1867-0029를 20%의 EMULSIGEN®-D 수중유 에멀션 보강제를 함유하는 PBS에서 혼합하고 현탁하여 펩티드 융합체 (0442-0720) 및 폴리펩티드 융합체 (0029-1867)의 용량 당 각각 100 ㎍ 및 5 ㎍의 최종 농도를 수득하였다. CD-1 암컷 마우스 (n = 3)는 목에 3회 피하 주사로 면역화시켰다. 처음 2회 주사는 1주 간격으로 수행하였고 3차 주사는 2차 주사 이후 3주에 수행하였다. 실험 기간 전체 동안 부작용이 관찰되지 않았다. 혈액 샘플은 제1 프라이밍 주사 직전 (면역전 혈청)에 채취하였고 마지막 부스트 면역화 후 14일 (면역 혈청)에 채취하였다. 혈액 분취액을 실온에서 1시간 동안 응고되도록 한 후에, 10,000 g로 10분간 4℃에서 원심분리하였다. 혈청을 채취하여 후속 분석까지 -20℃에 유지시켰다.
동물로부터 채취된 혈청 유래 IgG 항체는 1/6400 또는 그 이상의 항체 역가로 ELISA 어세이에서 폴리펩티드 SACOL0029 또는 SACOL1867 또는 SACOL0442 또는 SACOL0720 유래의 에피토프를 포함하는 아미노산 단편에 결합할 수 있었다. 면역화에 사용된 펩티드 및 폴리펩티드의 융합체 및 ELISA 어세이에서 항체 표적으로서 사용된 폴리펩티드 또는 아미노산 단편은 하기 표 IV에 표시되어 있다.
표 IV: 혼합 폴리펩티드 융합체 백신 및 항체 반응 표적
Figure pct00013
이것은 융합체의 조합 (예를 들어, 폴리펩티드 융합체 0029-1867와 혼합된 펩티드 융합체 0442-0720)을 사용하여 면역화시키고 포유동물에서 면역 반응을 유발시킬 수 있다는 것을 입증한다. 수득된 면역 반응은 SACOL0442 또는 SACOL0720 또는 SACOL0029 또는 SACOL1867로부터 코딩되는 아미노산 서열을 인식하는 항체의 생산을 포함한다.
실시예 15: 약독화 생 돌연변이체에 대한 재료 및 방법
박테리아 균주 및 성장 조건. 실시예 15-25에서 사용되는 균주는 표 V에 열거되어 있다. 에스. 아우레우스 ATCC 29213 및 이의 동계 돌연변이체 Δ720은 이전에 기술되었다 (Allard et al. 2013). 달리 언급하는 것을 제외하고, 에스. 아우레우스 균주는 TSB (tryptic soy broth) 및 TSA (tryptic soy agar) (BD, ON, Canada)에서 성장시켰고, 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) DH5α는 LB 및 LBA 배지 (BD)에서 성장시켰다. 필요할 때마다, 암피실린 (100 ㎍/mL) (Sigma, Oakville, Ontario, Canada), 클로람페니콜 (20 ㎍/mL) (ICN Biomedicals, Irvine, CA), 및 에리쓰로마이신 (10 ㎍/mL) (Sigma)을 한천 플레이트에 첨가하였다. 면역학적 검사를 위해서, 4종의 상이한 소 유선염 단리주는 캐나다 젖소 무리 및 전세계 다른 곳에서 발견되는 우세한 에스. 아우레우스 spa 유형의 일부에 상응하는 것을 선택하였다 (Veh et al., 2015; Mitra et al., 2013). 균주 SHY97-3906 (spa t529)는 수유 기간 동안 발생된 임상적 소 유선염의 사례로부터 단리되었고, CLJ08-3 (spa t359)은 드라이-오프 (dry-off) 시 잔존 유선염을 갖는 소로부터 본래 단리되었다 (Allard et al., 2013). 균주 Sa3151 (spa t13401) 및 Sa3181 (spa t267)은 캐나다 소 유선염 및 우유 품질 연구 네트워크 (Canadian Bovine Mastitis and Milk Quality Research Network) (CBMMQRN) 유선염 병원체 균주 센터 (Mastitis Pathogen Culture Collection) (Universite de Montreal, Faculte de medecine veterinaire, St-Hyacinthe, QC, Canada)로부터 수득하였고, 준임상적 유선내 감염 사례로부터 단리되었다.
표 V: 실시예 15-25에서 사용된 균주 및 플라스미드
Figure pct00014
세포 배양 조건. 확립된 소 유선 상피 세포주 (BMEC), MAC-T (Huynh et al., 1991)를 감염의 세포 배양 모델로서 사용하였다. MAC-T 세포는 5 ㎍/mL 인슐린 (Roche Diagnostics Inc., Laval, Canada) 및 1 ㎍/mL 히드로코티손 (Sigma)이 보충된, 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 둘베코의 변형 이글 배지 (DMEM)에서 통상적으로 배양시키고 유지시켰으며, 37℃의 5% CO2 가 가습된 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 세포 배양 시약은 Wisent (St-Bruno, QC, Canada)에서 구매하였다.
DNA 조작. 키트의 제조사 추천에 따라서 게놈 DNA 단리 (Sigma), 플라스미드 DNA 단리 (Qiagen, ON, Canada), 아가로스 겔로부터 DNA 단편의 추출 (Qiagen) 및 PCR 생성물 및 분해된 DNA 단편의 정제 (Qiagen)를 수행하였다. 200 ㎍/mL의 리소스타핀 (Sigma)으로 1시간의 추가 처리를 게놈 및 플라스미드 DNA 단리시에 에스. 아우레우스 세포의 효율적인 용해를 달성하기 위해 사용하였다. 프라이머 (IDT® Integrated DNA Technologies; Coraville, Iowa, USA)는 증폭된 생성물의 상류 및 하류에 제한효소 부위를 첨가하도록 디자인되었다. PCR은 통상의 PCR의 경우에 Taq DNA 중합효소 (NEB, Pickering, ON, Canada)를 사용하거나 클로닝의 경우에 Q5 고충실도 DNA 중합효소 (NEB)를 사용하여 수행하였고, 사이클링 횟수 및 온도는 각 프라이머쌍에 대해 최적화시켰다. 플라스미드 구성체는 이. 콜라이 DH5a (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), 제한 효소 (NEB), 및 T4 DNA 리가제 (NEB)를 사용하여 생성되었다. 플라스미드 구성체는 에스. 아우레우스 RN4220 (Kreiswirth et al., 1983) 및 최종 숙주 균주에서 전기천공 전에 제한효소 분해 패턴 및 DNA 서열분석을 통해서 검증하였다. 실시예 15-25에서 사용된 플라스미드는 상기 표 V에 열거되어 있다.
생 약독화 에스. 아우레우스 균주 Δ720 및 ΔhemB의 생성. ATCC 29213 균주의 동계 hemB 돌연변이체를 제작하였는데, 여기서 hemB 유전자는 상동성 재조합에 의한 emrA 카세트의 삽입을 통해서 결실시키고 교체시켰다. 유전자 SACOL0720에 대한 에스. 아우레우스 ATCC 29213 돌연변이체 (Δ720)는 에스. 아우레우스 ATCC29213의 뉴클레오티드 803 및 804 사이에 그룹 II 인트론 (이전에 기술된 바와 같이 대략 2 Kb의 단편 크기 (Allard et al., 2013))의 삽입을 통한 박테리아 유전자의 파괴를 위해 TargeTron™ Gene Knockout System (TargeTron™ 벡터 pNL9164 사용 (Sigma-Aldrich Canada Ltd.)) (Chen et al., 2007)을 사용하여 생성시켰다. 제조사 프로토콜 및 추천을 따랐다.
ΔhemBΔ720의 생성. Δ720 돌연변이체 유전자 배경의 SCV 표현형을 수득하기 위해 유전자 hemB에 제2 돌연변이를 획득하도록, 다른 전략을 사용하였다: 감온성 pBT2-hemB:emrA (pBT-E:hemB)를 일부 변형을 가하여 이전에 기술된 전략에서 사용하였다 (Mitchell et al., 2008). 간략하게, pBT-E 플라스미드는 감온성 셔틀 벡터 pBT2의 XbaI 및 SalI 부위 사이에 ermA 카세트의 삽입을 통해서 구축하였다 (Bruckner, 1997). 유전자 hemB (SACOL1715) DNA 단편의 측접 영역을 에스. 아우레우스 ATCC 29213으로부터 증폭시켰고, ermA 카세트의 양 측면 상에서 플라스미드 pBT-E에 클로닝시켰다. 다음으로 플라스미드는 에스. 아우레우스 RN4220 (res-)에서 증식을 위해 전달하였다. 리소스타핀 (200 ㎍/mL로 1시간 동안 실온)으로 박테리아의 용해 이후, 플라스미드 DNA를 단리하였고 전기천공을 통해서 ATCC 29213 및 Δ720를 형질전환시키는데 사용하였다. 플라스미드 통합 및 돌연변이체 생성을 위해서, 박테리아를 10 ㎍/mL의 에리쓰로마이신 및 1 ㎍/mL 헤민을 보충하여 밤새 30℃에서 먼저 성장시켰다 (Sigma-Aldrich, ON, Canada). 다음으로 박테리아를 1:1000으로 희석하였고 2.5 ㎍/mL의 에리쓰로마이신 및 1 ㎍/mL의 헤민 존재 하에 밤새 42℃에서 성장시켰다. 이 단계를 2회 반복하였다. 마지막으로, 박테리아를 1:1000으로 희석하였고 항생제없이 밤새 42℃에서 성장시켰다. hemB 유전자가 불활성화된 돌연변이체는 한천 플레이트 상에서 5 ㎍/mL 헤민을 보충하여 보완 (즉, 정상 성장 표현형으로 복귀)될 수 있는 SCV 표현형과 함께, 에리쓰로마이신에 대한 내성 및 클로람페니콜에 대한 감수성으로서 선택하였다. ATCC 29213 (즉, ΔhemB) 및 Δ720 (즉, ΔhemBΔ720) 균주에서 hemB 의 결실은 PCR을 통해 확인하였다 (도 8A 및 B 참조).
액체 배양 중 헤민 보충. 에스. 아우레우스 hemB 및 이중 돌연변이체 Δ720ΔhemB 의 최적 성장 동역학을 복원시키는 헤민의 능력을 평가하기 위해서, 밤샘 박테리아 배양물을 다양한 농도로 첨가된 헤민 (Sigma)이 보충된 신선한 BHI를 함유하는 배양 튜브 중에 대략 0.1의 A600nm 로 희석하였다. 배양물의 A600nm 를 35℃에서 인큐베이션 (225 rpm) 동안 상이한 시점에 모니터링하였다.
소 유선 상피 세포 (BMEC)의 에스. 아우레우스 감염. MAC-T BMEC은 ATCC 29213 (WT) 및 이의 동계 돌연변이체의 세포내 감염성 및 잔존성의 특징규명을 위해 사용되었다. 감염 전 48시간에, 1x105/mL MAC-T 세포를 30% 컨플루언스를 수득할 때까지 처리된 24-웰 플레이트 (Corning) 상에 파종하였다. 단일층을 10% CO2 하에 37℃에서 컨플루언스까지 성장시켰다. 감염 전 6시간에, 단층을 DMEM으로 세척하였고 침습 배지 (IM) (1% 열-불활성화 FBS를 함유하고 항생제는 없는 성장 배지)와 인큐베이션하였다. 밤샘 박테리아 배양물을 신선한 TSB에 1:20으로 희석하였고 중간-대수 성장기까지 성장시키고 나서, PBS로 세척하였고, 10의 다중 감염도까지 IM으로 희석하였다. 3시간 동안 박테리아와 단일층을 인큐베이션시켜서 침습을 수행하였다. 다음으로 단일층을 DMEM으로 세척하였고 세포외 박테리아를 사멸시키기 위해서 20 ㎍/mL 리소스타핀을 함유하는 IM과 인큐베이션시켰다. 세포외 정상 및 SCV 에스. 아우레우스를 사멸시키기 위해 리소스타핀의 사용은 세포 침습 어세이에서 이전에 검증되었다 (Moisan et al., 2006 and Tuchscherr et al, 2011). 감염 3시간, 또는 추가 12시간 또는 24시간에 CFU를 결정하기 위해서 30분간 처리될 수 있게 하였다. 다음으로, 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS)로 광범위 세척후에, 단일층을 트립신처리로 탈착시키고 0.05% Triton X-100을 사용해 용해시켰으며 PBS를 첨가하여 최종 1X 농도를 수득하였다. 용해물을 연속 희석하였고 CFU 결정을 위해 TSA 상에 플레이팅하였다.
BMEC 생존능 및 물질대사 활성 어세이. MAC-T 세포에 대해 에스. 아우레우스 및 이의 동계 돌연변이체에 의해 가해지는 세포독성 손상을 결정하기 위해서, 생존 세포에서 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5 디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT)의 불용성 포르마잔 생성물로의 환원을 측정하는 MTT 세포 물질대사 활성 어세이를 수행하였다. 어세이는 일부 변형을 가하여 Kubica 등 (Kubica et al, 2008)의 방법에 따랐다. 간략하게, 세포의 에스. 아우레우스 감염은 잔존성 어세이에서 기술된 바와 같이 수행하였지만, 12시간 또는 24시간 후 용해 대신에, 세포를 DPBS 중 100 ㎕의 DPBS 중 MTT 시약 (5 mg/mL) (Sigma)과 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이후에, 16% SDS 및 40% PMF (pH 4.7)의 산성 용매 용액을 첨가하여 세포를 용해시켰고 포르마잔의 결정을 밤새 가용화시켰다. 샘플은 570 nm 파장에서 Epoch 마이크로플레이트 판독기 (Biotek Instruments Inc.)를 사용해 판독하였다. 모든 어세이는 삼중으로 수행하였고, 미감염된 세포 (고생존율 대조군) 또는 용해된 WT 감염된 세포 (박테리아 배경 대조군; MTT 첨가 전 10분 동안 0.05% triton X-100 처리)가 있는 대조군 웰을 각 플레이트에 포함시켰다. 물질대사 활성의 수준은 다음의 식을 사용해 계산하였다:
(샘플의 흡광도 - 배경 대조군 / 고 대조군) x 100.
마우스 유선염 모델에서 병독성. 감염의 마우스 유선염 모델은 이전에 기술된 것을 기반으로 한다 (Brouillette, 2005; Brouillette, 2004). 마우스로 수행된 모든 실험은 셔브루크 대학 과학부의 동물 실험에 관한 윤리 위원회의 승인을 받았고 캐나다 동물 보호 위원회의 지침에 따라서 수행되었다. 간략하게, 12-14일령 새끼를 이동시키고 1시간 후, 수유중인 CD-1마우스 (Charles River Laboratories)를 각각 체중 기준으로 87 및 13 mg/kg의 케타민 및 자일라진으로 마취시켰고, 쌍안경 하에 유선에 접종하였다. 유선관을 젖꼭지의 말단 근처에서 작게 절개하여 노출시키고 내독소-무함유 포스페이트-완충 염수 (PBS, Sigma) 중 102 CFU를 함유하는 100 ㎕-박테리아 현탁액을 32-게이지 블런트 바늘을 사용해 유두관을 통해서 주사하였다. 각 동물에 대해 2개 유선 (머리에서 꼬리쪽으로 우측 4번째 [R4] 및 좌측 4번째 [L4])을 접종하였다. 표시된 시간에 유선을 무균적으로 채취하여, 칭량하였고 육안으로 염증을 평가하였다. PBS 중 기계적 조직 균질화, 연속 희석, 및 CFU 결정을 위해 한천 배지 상에 플레이팅 후에 박테리아 부하량을 평가하였다. 제2 실험에서, 균질화된 유선을 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성 효소 어세이를 위한 단백질 추출용으로 보존하였다.
유선 단백질 추출. 유선으로부터 총 단백질 추출은 일부 변형을 가하여, 이전에 기술된 최적 방법으로 수행하였다 (Pulli et al., 2013). 유선 조직을 50 mM의 인산칼슘의 최종 농도, pH 6.0, 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 50 mM를 함유하는 완충액 (Sigma)에서 균질화시켰다. 다음으로, 샘플을 초음파처리하고, 액체 질소에서 냉동-해동시켰으며, 2000 g로 15분간 4℃에서 원심분리시켰다. 마지막으로, 지방층을 흡입을 통해 제거하였고, 상청액은 모든 세포 찌꺼기를 버리기 위해, 15분간 15 000 g에서의 최종 원심분리를 위해 보관하였다. 상청액을 분취액으로 분배하였고 BCA (bicinchoninic acid) 방법 단백질 어세이 키트 (Thermo-Scientific)에 의해 측정되는 단백질 농도 결정 또는 효소 어세이를 위한 사용까지 -80℃에 유지시켰다.
MPO 활성 어세이. 유선 조직에서 호중구 동원은 마이크로플레이트용으로 변형시킨, o-디아니시딘-H2O2 방법을 통한 MPO 효소 활성의 정량에 의해 측정하였다 (Bradley, RD. 및 Rothstein, GPPC., 1982). 96-웰 마이크로플레이트에서, 10 ㎕의 조직 추출 상청액을 50 mM CTAB 포스페이트 완충액 50 mM, pH 6.0 중 o-디아니시딘 히드로클로라이드(0.167 mg/mL) (Sigma) 및 0.0005% H2O2 (Sigma)의 용액과 인큐베이션시켰다. MPO 활성은 460 nm로 Epoch 마이크로플레이트 판독기에서 5분의 기간 동안 15초 간격으로 동역학적으로 측정하였다. MPO의 유닛은 25℃에서 1 μmol의 H2O2/분을 분해하는 효소의 양으로서 간주되고, o-디아니시딘에 대해 460 nm에서 11.3 mM- 1 cm- 1 의 흡광 계수로 가정한다 (Zhang et al., 2004). 결과는 유선 g 당 MPO의 유닛으로 표시하였다.
생 약독화 돌연변이체 Δ720ΔhemB에 의한 마우스 면역화. 생 백신으로서 투여되는 약독화 균주 Δ720ΔhemB 의 면역원성 특성을 마우스에서 평가하였다. 예비 실험에서, 마우스는 약독화 균주의 근육내 및 피하 (SC) 주사에 충분히 내성이였다. 106, 107 및 108 CFU의 용량 및 SC 경로가 후속 실험을 위해 선택되었다. 박테리아 접종원의 제조를 위해서, BHIA 플레이트 상에서 이전에 성장시킨 에스. 아우레우스 Δ720ΔhemB 콜로니를 빙냉 PBS에서 2회 세척하였고 15% 글리세롤을 함유하는 PBS에 현탁시키고 나서, 분취하고 후속 사용까지 -80℃에 유지시켰다. 접종원 제조시에 생박테리아 계측치는 BHIA 상에서 연속 희석 플레이팅으로 검증하였다. CD-1 마우스는 3개 그룹으로 무작위로 분류하였다: 그룹 1 (n=3)은 106 CFU의 용량을 투여받았고; 그룹 2 (n=3)는 107 CFU, 및 그룹 3 (n=3)은 108 CFU를 투여받았다. 마우스는 2주 간격으로, 목에 PBS (100 ㎕) 중 박테리아의 2회 피하 주사를 통해서 면역화되었다. 혈액 샘플은 프라이밍 주사 직전 (면역전 혈청)에 채혈되었고 부스트 면역화 후 10일 (면역 혈청)에 채혈되었다. 혈액 분취액은 실온에서 1시간 동안 응고되도록 두고 난 후에 10,000 g로 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 혈청을 채취하였고 후속 분석까지 -20℃에서 유지하였다.
에스. 아우레우스 세포 추출물의 제조. 에스. 아우레우스 전체 세포의 제조는 일부 변형을 가하여 이전에 기술된 대로 수행하였다 (Asli et al., 2016). 간략하게, 밤샘 박테리아 배양물을 신선한 BHI 액체배지에 1/1000로 희석하고 나서, ∼0.8의 A600nm에 도달할 때까지 35℃ (225 rpm)에서 인큐베이션하였다. 박테리아 세포는 원심분리하였고 펠렛을 빙냉 PBS에서 2회 세척하였고 펠렛 mL 당 5 mL의 PBS를 첨가하여 현탁시켰다. 박테리아 현탁액을 먼저 리소스타핀 (Sigma) (펠렛 mL 기준으로 100 ㎍/mL)으로 1시간 동안 37℃에서 처리하고 나서, 펠렛 mL 당 3 ㎍의 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma), 8 ㎍의 RNAse A (Sigma) 및 8 ㎍의 DNAse (Qiagen)를 현탁액에 첨가하였다. 실온에서 30분 후에, 세포를 SLM Aminco™ 프렌치 프레셔 세포 분쇄기에서 3 내지 4회 통과시켜 물리적으로 파쇄시켰고, 이어서 12,000 x g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 미파쇄된 세포를 제거하였다. 상청액을 채취하였고 총 단백질 농도는 BCA 단백질 어세이 키트를 사용해 이전에 기술된 대로 결정하였다.
ELISA에 의한 마우스 총 IgG의 검출. Δ720ΔhemB 백신접종 균주 및 각각의 소 IMI 단리주에 대한 혈청 총 IgG의 검출을 수행하여 마우스의 면역화에 의해 발생된 전신 체액성 반응을 입증하고 측정하였다. 표적 항원의 경우, Nunc MaxiSorp™ 96-웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)를 100 ㎕의 각각의 전체 에스. 아우레우스 세포 추출물 (카보네이트/바이카보테이트 완충액에 희석된 10 ㎍/mL, Sigma)로 코팅하였고, 밤시 실온에서 인큐베이션시켰다. 다음으로 플레이트를 5% 탈지유 분말을 함유하는 PBS로 1시간 동안 37℃에서 포화시키고 나서, 비특이적 에스. 아우레우스 단백질 A 상호작용을 방지하도록 5% 돼지 혈청의 첨가로 제2 차단 단계를 후속하였다. 희석 완충액 (2% 우유, 5% 돼지 혈청 및 0.025% Tween™ 20을 포함하는 PBS) 중 혈청의 2배 연속 희석물 100 마이크로리터를 플레이트에 적재하였고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 다음으로 플레이트를 0.05% Tween™ 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였으며, 희석 완충액에 1/5000로 희석된 100 ㎕의 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 염소 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)를 적재하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션과 이후 3회 세척 후에, 퍼옥시다제 활성은 제조사의 추천에 따라서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 시약 (KPL Inc., Gaithersburg, MD)으로 검출하였다.
통계적 분석. 통계적 분석은 GraphPad Prism™ 소프트웨어 (v.6.02)를 사용해 수행하였다. 세포내 박테리아 CFU 및 박테리아 CFU/유선 g (마우스의 IMI)은 통계적 분석에 사용하기 전에 밑수가 10인 로그값으로 전환하였다. 각 실험에서 사용된 통계적 검정법 및 유의성은 도면의 범례에 명시되어 있다.
실시예 16: 균주 에스. 아우레우스 ATCC 29213 Δ720, ΔhemB 및 Δ720 ΔhemB 의 구축
자연 감염을 모방하는 생 약독화 유기체는 강력한 방식으로 면역계를 자극하여, 질환에 대하여 보호하도록 상승적으로 작용하는 이펙터 및 기억 T 세포, 및 혈액 및 점막 항체 둘 모두를 생산하는 광범위하고 강건한 면역 반응을 생성시킨다 (Detmer, 2006; Kollaritsch, 2000; Pasetti, 2011).
유전자 SACOL0720의 돌연변이는 소에서 실험적 IMI 감염시 에스. 아우레우스의 병독성을 변경시키는 것으로 확인되었다 (Allard et al., 2013).
추가의 생-약독화 균주가 에스. 아우레우스 SCV의 표현형 양상을 기반으로 백신 목적으로 제조되었다. SCV는 일반적으로 침습성 감염을 발생시키지 않고 (즉, 추가적 약독화), 숙주 세포 내에 내재화될 수 있어서 체액성 면역 반응이외에도 세포-매개 면역 반응을 자극시키게 될 것이다.
안정한 에스. 아우레우스 SCV가 먼저 hemB 유전자의 결실 (ΔhemB)을 통해서 생성되었다 (실시예 15, 생 약독화 에스 . 아우레우스 균주 Δ720 및 ΔhemB의 생성 참조). 이 SCV의 추가 약독화가 이후에 유전자 SACOL0720의 불활성화 (Δ720)에 의해 수행되었다 (실시예 15, ΔhemBΔ720의 생성 참조).
MAC-T 소 유선 상피 세포의 감염 이후에, 이중 돌연변이체 (Δ720ΔhemB)는 각각 ΔhemB 및 Δ720에서 확인된 것과 비교하여 더 낮은 내재성 및 세포 파괴성을 유의하게 보여주었다.
실시예 17: 균주 에스. 아우레우스 ΔhemB Δ720은 MAC-T 세포에서 약독화된다.
ATCC 29213 (WT), Δ720, ΔhemB 및 ΔhemBΔ720 균주의 감염성을 MAC-T 세포를 사용하는 세포내 잔존성 어세이에서 비교하였다. 그들의 동계 WT 부모와 3종의 돌연변이체 균주를 비교함으로써, 유전자 hemB 및 SACOL0720에서의 돌연변이의 별개 효과를 관찰하였다. 세포 단일층과 박테리아의 단기 3-시간 인큐베이션 후 세포외 박테리아의 제거를 위한 리소스타핀의 첨가는 생존 세포내 박테리아의 회수율 (CFU) 기반으로, WT 및 ΔhemB 균주 둘 모두에 대해 MAC-T 세포로의 높은 수준의 내재화를 입증하였다 (도 9A 및 B). 그러나 단일 Δ720 돌연변이체는 이의 부모 WT 균주와 비교하여 유의하게 낮은 (P ≤ 0.01) 내재화를 보여주었다 (도 9A). Δ720에서 확인된 내재화의 감소는 이중 돌연변이체 ΔhemBΔ720 을 ΔhemB 와 비교했을때 보다 더 두드러졌는데, 이러한 3-시간 내재화 어세이에서 접종원 회수율이 10배 감소되었다 (P ≤ 0.001, 도 9B). 내재화된 박테리아 적재량의 초기 감소는 ΔhemB 에 대해서 관찰된 것과 비교하여 양쪽 시점에서 CFU/mL의 1-log10 감소로 예시되는 바와 같이 (P ≤ 0.001), 이중 돌연변이체 균주 ΔhemBΔ720의 경우에 침습 후 (PI) 12시 및 24시에도 여전히 분명하였다 (도 9C). 단일 Δ720 돌연변이체 및 WT 균주 간 초기 세포내 박테리아 적재량의 편차 (도 9A)는 인큐베이션 시간이 길어짐에 따라서 점차적으로 사라졌는데 (도 9C), 양쪽 균주가 MAC-T 세포에서 충분히 잔존하지 않았기 때문이다 (도 10). 반대로, 단일 ΔhemB 균주에 대해 회수된 세포내 CFU는 24 h PI의 24시간에 3종의 다른 균주에 대해 회수된 것과 비교하여 유의하게 더 높았다 (도 9C, 전부에 대해 P ≤ 0.001). 전반적으로 SCV 표현형에 대해 예상한 바와 같이, ΔhemB 균주는 시간 경과에 따라 임의의 다른 균주보다 더 높은 세포내 잔존성을 보였다 (도 10). 이들 결과는 Δ720 돌연변이가 주로 MAC-T 세포로의 내재화 과정을 감소시킨다는 것을 시사한다. 결과는 ΔhemBΔ720 돌연변이체가 여전히 BMEC로 내재화되어 잔존할 수 있지만 단일 ΔhemB 돌연변이체에서 보이는 것보다 훨씬 더 낮은 정도라는 것을 더욱 입증한다.
ΔhemBΔ720 및 ΔhemB SCV는 낮은 BMEC 파괴를 야기한다. 상기에 보고된 바와 같이, ΔhemB 및 ΔhemBΔ720 SCV 균주는 WT 및 Δ720 균주와 비교하여 PI의 12시간 및 24시간에 그들의 지속되는 생존능으로 예시된 바와 같이, MAC-T 세포에서 시간 경과에 따라 더 큰 잔존성을 보였다 (도 9C 및 10). 세포로부터 회수된 접종원의 백분율은 이중 및 단일 hemB 돌연변이체 둘 모두의 경우, 리소스타핀 첨가 후 0 내지 24시간에 거의 동일한 채로 남아있었고, 12시간에는 약간 증가하여, 세포내 성장을 의미한다 (도 10). 양쪽 균주는 이러한 감염 시점 이후에 느린 속도로 저하되기 시작되었다. 그러나, WT 및 Δ720 균주에 대한 세포내 CFU의 분명한 감소는 SCV 표현형 균주에서 관찰된 것과 비교하여, 시간 경과에 따라서 세포 단일층에 대한 손상 증가의 육안 관찰을 수반하였다.
MAC-T 세포 생존능을 또한 실험된 4종 균주 각각에 의한 감염 후에 평가하였다. MAC-T 세포 생존능은 MTT 방법으로 평가하였다 (Kubica et al., 2008). 결과는 양쪽 SCV 균주 (ΔhemB 및 ΔhemBΔ720)가 WT 및 Δ720 균주와 대조적으로 이 어세이에서 MAC-T 사멸을 유의하게 덜 야기시켰다는 것을 보여준다. ΔhemB와 비교했을 때, WT 균주는 12시간에 세포의 생존능을 거의 절반까지 감소시켰다 (도 11A: WT: 25.4%; ΔhemB: 48.4%). 이러한 편차는 박테리아 적재량이 ΔhemB 돌연변이체의 경우에 10배가 더 높았더라도 (도 9C), 24시간에도 여전히 분명하였다 (도 11B: 각각 16.3% 대 34.5%). MAC-T 세포는 이중 돌연변이체 Δ720ΔhemB 에 의한 것보다 ΔhemB 에 의해서 더 손상되었지만 편차는 24시간에만 유의하였다 (P ≤ 0.01). WT 균주와 직접 비교했을 때, 이중 돌연변이체 Δ720ΔhemB 는 12시간에 2.3배 (도 11A) 및 24시간에 2.7배 (도 11B)로 더욱 상피 세포 생존율을 지속시켰다 (12시간 및 24시간: P ≤ 0.0001). 그러므로, 시간 경과에 따라서 WT 및 Δ720 균주와 비교하여 양쪽 SCV 균주의 더 큰 세포내 잔존성 (도 10)은 아마도 MAC-T 세포에 대한 SCV의 보다 낮은 독성에 기인하는 것으로 여겨졌다 (도 11). 함께 취합하여, BMEC 감염 어세이에 의한 결과는 WT 균주의 약독화에 대한 ΔhemB 및 Δ720 돌연변이 둘 모두의 가산 효과의 증거를 제공하였다.
실시예 18: 균주 에스. 아우레우스 ΔhemB Δ720는 마우스 IMI 모델에서 약독화된다.
감염의 생체 내 모델에서 ΔhemBΔ720의 약독화를 증명하기 위해서, 이중 돌연변이체의 병독성을 마우스 IMI 모델에서 평가하고 WT 균주와 비교하였다 (Brouillette and Malouin, 2005). 양쪽 균주에서, 감염의 지수기는 감염 후 처음 12시간 이내에 주로 일어났고, 한편 최대 박테리아 부하량은 이중 돌연변이체의 경우 24시간에 도달하였고 WT 균주의 경우 48시간 (2일 [D2])에 도달하였다. 24시간에, 이중 돌연변이체는 WT와 비교하여 평균 CFU/유선 g이 1.9 log10 의 감소를 보였다 (P ≤ 0.05). 또한 24시간 후에, 돌연변이체 박테리아 부하량은 완전한 박테리아 제거가 12일에 도달할 때까지 일정한 하락을 보였다 (도 12에 별표로 표시됨). 대조적으로, 부모 WT 균주는 돌연변이체와 비교하여 심각한 침습성 감염을 유발시켜서, 그 그룹들에서 유선을 채취할 수 있기 전에 2일에 9마리의 남은 마우스 중 3마리 및 7일에 3마리 마우스 중 2마리가 폐사하였다 (도 12; 화살표). WT 감염에서 살아남은 마우스는 7일에 높은 생 계측치 (9 log10 CFU/유선 g)를 유지하였고, 이중 돌연변이체와 비교하여 박테리아 부하량에서 대략 5 log10 편차였다. 이들 결과는 유선에서 복제되어 생존하는 균주 ΔhemBΔ720의 능력의 두드러진 감소를 분명하게 입증한다. 그러므로 ΔhemBΔ720 이중 돌연변이체는 마우스 유선내 감염 (IMI) 모델에서 강력하게 약독화되어 유선으로부터 효율적으로 제거된다.
약독화 균주 ΔhemBΔ720은 백신접종 목적 및 항원의 세포내 전달에 이상적인 것으로 보인다. 실제로, ΔhemBΔ720의 낮고 일시적인 내재화는 에스. 아우레우스에 대한 방어에 중요한 면역 반응의 성분인, 세포-매개 면역성의 자극을 도와야 한다 (Fowler and Proctor, 2014).
실시예 19: IMI 이후에 Δ720Δ hemB 및 WT 균주에 대한 염증 반응
WT 및 돌연변이체 균주에 의한 감염에 대한 마우스의 염증 반응 (면역 반응)을 모니터링하기 위해서, 유선 내 호중구 침윤을 유선 균질물의 총 단백질 추출물의 MPO 효소 활성에 의해 평가하였다. 생물학적 샘플 중 MPO 활성은 이전에 호중구의 절대수와 강력하게 상관관계가 있었고 (Xia, 1997), 그러한 이유로 적당한 마커이다. 감염 후 처음 몇 시간 동안, 호중구 동원은 이중 돌연변이체 및 WT 감염된 유선에 대해 유사한 프로파일을 따랐고 (도 13), 일정한 지연에도 불구하고 박테리아 성장과 일치되게 감염 후 12시간부터 24시간까지 분명한 호중구 침윤의 지수적 강화가 있었다. 유선 내 박테리아 적재량과 관련하여 다형핵 세포의 절대수는 동시에 항상 피크는 아닌 것으로 이전에 확인되었다 (Brouillette, 2005). 돌연변이체 WT 균주에 의해 감염된 유선 사이에서 6, 12 및 24시간에 MPO 활성의 유의한 편차는 관찰할 수 없었다 (도 13). 그러나 분명한 호중구 침윤의 등가량은 이중 돌연변이체와 비교하여 WT 감염이 감염된 유선의 광범위 발적을 발생시킨 시점인, 24시간에 염증의 육안 관찰과는 상관관계가 없었다 (도 14의 사진). 대조적으로, 돌연변이체 감염된 유선은 PBS 대조군과 비교하여 현미경 수준 상에서 시각적으로 변경되지 않았다. 염증의 육안 평가 및 호중구 침윤 결과 간 차이는 박테리아 적재량 (도 9A-C) 및 WT 균주의 세포독성 활성 (도 11)의 편차때문일 수 있고, 독소 및 효소 발현을 통한 균주의 고도의 침습능 및 파종능과 일관적일 수 있다. 그러한 이유로, 이들 결과는 돌연변이체 균주에 의해 감염된 유선에서 호중구 동원이 WT 균주에서 확인된 것과 균등하였고 돌연변이체 박테리아 적재량의 후속 하락 및 제거를 가능케하는데 충분하였다는 것을 의미한다.
마지막으로, 균주 안전성을 확증하고, 이러한 염증 반응이 허용불가한 반응원성 균주의 결과로 발생된 것이 아님을 평가하기 위해서, 감염 후 4일 및 12일에 Δ720ΔhemB 감염된 유선에서 MPO 활성을 모니터링하였다. 다음으로 활성 수준을 PBS 주사된 마우스에서 수득된 수준과 비교하였다. 도 15에 예시된 바와 같이, 돌연변이체 감염된 유선에서 분명한 호중구 존재가 감염 후 4일에도 여전히 높았고, MPO 활성은 8 내지 21 유닛/유선 g의 범위였다. 게다가, 수유 유선이 형태적으로 거의 임신전 상태로 복귀되는 과정인 유선 퇴축은 조직의 리모델링 동안 아폽토시스 세포의 식균작용을 가능하게 하는 호중구 동원과 일반적으로 연관된다 (Stein, 2007). 이 모델에서 감염 후 날들에서, 마우스 유선은 그들의 빠른 수축으로 표시된 바와 같이, 이미 정상 변형 상태이다. 그러나, 돌연변이체 감염된 유선에서 MPO 수준은 4일 내지 12일 사이에 유의한 하락을 겪었다 (P ≤ 0.01). 이후에, MPO 수준은 PBS-주사된 마우스에서 수득된 것과 유의한 편차를 보이지 않아서 12일에 정상 수준으로 되돌아 온 것으로 여겨졌다. Δ720ΔhemB 감염된 유선의 염증 반응은 박테리아 제거에 따라 정상 수준으로 되돌아간다 (도 15).
실시예 20: Δ720 GΔhemB 에 의한 면역화는 몇몇 에스. 아우레우스 소 유선내 감염 단리주에 대하여 강력한 체액성 반응을 생성시킨다.
생 Δ720ΔhemB 에 의한 면역화가 실제로 에스. 아우레우스 유선내 감염에 대하여 추정 생 백신으로서 이의 용도에 적합한 강력한 면역 반응을 생성시킬 수 있는지를 확증하기 위해서, 마우스를 상이한 용량의 생 백신으로 면역화시켰고 혈청 총 IgG는 다양한 에스. 아우레우스 소 단리주의 전체 세포 추출물과의 결합에 대해 어세이하였다. 먼저, 106, 107 및 108 CFU의 용량을 목에 피하로 투여하였고, 면역화 기간 전반에서 면역화 부위의 염증 또는 괴사 징후 또는 마우스 거동의 변형과 같은 부작용이 촉발되지 않았다. 더 나아가서, 증가된 양의 생 이중 돌연변이체 ATCC 29213 Δ720ΔhemB 를 사용한 면역화는 이 자신의 항원의 전체 세포 추출물에 대하여 전신 IgG 항체의 높은 역가를 산출하였다 (도 15B). 면역 혈청의 역가는 면역전 혈청의 것보다 유의하게 높았고, 생 백신에 존재하는 에스. 아우레우스 항원에 대한 항체 생산의 특이성을 입증하였다. 가장 중요하게도, 증가된 양의 Δ720ΔhemB 를 사용한 면역화는 또한 캐나다 및 전세계의 다른 곳에서 발견된 주요 spa 유형 유래의 균주를 포함하는, 소 유선염으로부터 단리된 다양한 에스. 아우레우스 균주에 대하여 항체 역가의 중대한 상승을 일으켰다 (도 15C). 이들 결과는 (i) 이중 돌연변이체가 면역 반응을 상승시킬 수 있고, (ii) 균주 배경 (ATCC 29213)이 소 유선염 균주와 충분한 공통 특성을 공유하여서 항체 반응이 또한 주요 spa 유형의 균주를 강력하게 인식한다는 것을 분명하게 보여준다.
생 Δ720ΔhemB의 피하 주사를 사용한 마우스의 면역화는 전체 박테리아 세포 추출물에 대해 측정된 총 IgG의 높은 역가로 판단되는 바에 따라 강력한 체액성 반응을 상승시켰다. 또한, 백신 균주 Δ720ΔhemB 는 소 유선염 균주와 충분한 공통 특성을 가져서 항체 반응이 또한 다양한 공통 유선염 연관 spa 유형 유래의 균주를 강력하게 인식하였다.
이것이 이중 돌연변이체 배경 (ATCC 29213)이 소 유선염 균주와 많은 공통 특성을 공유한다는 것을 입증하더라도, 이러한 이중 돌연변이체는 원한다면, 특히 소 유선염, 예컨대 제한없이 에스. 아우레우스 균주 RF122로부터 단리된 임의 균주에서, 임의의 바람직한 유전적 배경으로 생성될 수 있다.
이들 결과는 일부 잔류 세포내 능력을 갖는 SCV 균주가 중증 감염을 고착시키지 않으면서 면역 세포 동원을 가능케 할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 SCV 균주는 세포내 능력을 갖는 병원체와 싸우도록 면역 반응을 적절하게 자극시키는 생-약독화 백신으로서 작용할 수 있다.
실시예 21: 재료 및 방법 - SACOL0442, SACOL0720, SACOL0029 및 SACOL1867과 SACOL0029의 융합체 + 약독화 생 박테리아 (백신 #7)
항원의 생산. 항원의 생산은 항원 SACOL0029의 추가적인 존재를 제외하고 실시예 6의 항원의 생산 부분에서 기술된 대로 수행하였다. SACOL0029의 His-태그화 재조합 단백질은 GenScript, Inc. (Piscataway, NJ)가 조작하여 생산하였다. (도 21A, 항목 I, his-태그화 서열 참조).
생 약독화 에스. 아우레우스 균주 Δ720ΔhemB의 생성. 생 약독화 에스. 아우레우스 균주의 생성은 실시예 15 (ΔhemBΔ720의 생성)에 기술된 대로 수행하였다.
마우스의 면역화. SACOL0442, SACOL0720, SACOL0029 유전자, 및 SACOL0029 및 SACOL1867 유전자의 융합체에 의해 코딩되는 재조합 에스. 아우레우스 단백질의 면역원성 특성을 생 약독화 박테리아 균주 에스. 아우레우스 Δ720ΔhemB 와 조합하거나 또는 조합하지 않고, 마우스에서 평가하였다. 마우스는 목에 피하 주사 및 대퇴에 근육내 주사에 의한 103, 105, 106, 107 및 108 CFU의 용량에 충분히 내성이었다. 105 의 용량 및 피하 경로가 후속 실험에 선택되었다.
박테리아 접종원의 제조를 위해서, BHIA 플레이트 상에서 이전에 성장시킨 에스. 아우레우스 Δ720ΔhemB 콜로니를 빙냉 PBS에서 2회 세척하였고 15% 글리세롤을 함유하는 PBS에 재현탁시킨 후, 분취하여 후속 사용까지 -80℃에서 유지시켰다. 105 CFU의 약독화 박테리아에 상응하는 최종 마우스 면역화 용량을 수득하기 위해서, 냉동된 접종원 박테리아 농도는 BHIA 상에 연속 희석물의 플레이팅을 통해서 평가하였고 그 다음으로 면역화 당일에 PBS 중에 105 CFU/mL의 최종 농도로 희석하였다.
단백질 용량의 제조를 위해서, SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, 및 SACOL0029-1867 융합체 폴리펩티드를 PBS에 혼합하여 현탁시켜서 각각 5 ㎍의 최종 용량을 수득하였다. CD-1 암컷 마우스를 무작위로 3개 그룹으로 나누었다: 그룹 1 (5마리 마우스)은 혼합 단백질 용량을 투여받았고 (단백질 믹스); 그룹 2 (5마리 마우스)는 약독화 박테리아 (Δ720ΔhemB) 용량을 투여받았으며 (Δ720ΔhemB); 그룹 3 (6마리 마우스)은 혼합 단백질과 약독화 박테리아의 조합을 투여받았다 (조합). CD-1 암컷 마우스는 2주 간격으로 목에 2회 피하 주사를 통해 면역화시켰다. 단백질 및 박테리아 균주 용량은 이전에 기술된 대로 PBS에 희석하였으며 각 마우스 그룹 당 100 ㎕의 최종 부피로 투여하였다. 실험적 면역화 기간 전체 동안 부작용이 관찰되지 않았다. 혈액 샘플은 제1 프라이밍 주사 직전 (면역전 혈청)에 채혈하였고 부스트 면역화 후 10일 (면역 혈청)에 채혈하였다. 혈액 분취액을 실온에서 1시간 동안 응고될 수 있게 하였고, 10,000 g로 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 혈청을 채취하였고 후속 분석까지 -20℃에 유지시켰다.
ELISA에 의한 총 IgG, IgG1 및 IgG2의 검출. 면역화를 위해 이전에 사용된 항원 각각에 대한 혈청 총 IgG, IgG1 및 IgG2의 검출은 일부 변형을 가하여 이전에 기술된 대로 수행하였다 (Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318). 또한, 스타필로코커스 표면 단백질 ClfA에 대한 IgG의 검출을 수행하여 에스. 아우레우스에 대한 면역 반응을 증강시키고 균형맞추기 위해 생 균주를 사용하는 추가적인 장점을 입증하였다. Nunc MaxiSorp™ 96-웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, NY)는 75 ㎕의 각각의 검사 항원 (카보네이트/바이카보테이트 완충액에 희석된 6.67 ㎍/mL, Sigma Aldrich, Oakville, ON)으로 코팅하였고 밤새 실온에서 인큐베이션시켰다. 다음으로 플레이트를 5% 탈지유 분말을 함유하는 PBS로 1시간 동안 37℃에서 포화시켰다. 3% 우유 및 0.025% Tween™ 20을 함유하는 PBS 중 혈청의 4배 연속 희석액 100 마이크로리터를 플레이트에 적재하였고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 0.05% Tween™ 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 100 마이크로리터의 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 2차 항체를 플레이트에 첨가하였다. 사용된 2차 항체는 3% 우유 및 0.025% Tween™ 20을 함유하는 PBS에 각각 1/5000으로 희석된, 항-마우스 IgG, IgG2a 및 IgG1 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)이었다. 37℃에서 1시간의 인큐베이션 이후에 3회 세척 후, 퍼옥시다제 활성은 제조사의 추천에 따라서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 시약 (KPL Inc., Gaithersburg, MD)을 사용해 검출하였다.
통계적 분석. 항체 역가 및 상관성의 통계적 분석은 GraphPad Prism™ v6.05를 사용해 수행하였다.
실시예 22: 항원의 융합체 및 생 약독화 에스. 아우레우스 균주와의 조합은 마우스에서 높은 항체 역가를 유도시킨다 - 백신 #7
항원 및 생 약독화 에스. 아우레우스 Δ720ΔhemB는 실시예 21에 기술된 바와 같이 생산된다. 마우스는 실시예 21에 기술된 대로 면역화하고 IgG를 검출한다.
도 16의 결과는 다른 항원 또는 생 약독화 균주와 공동 투여될 때 SACOL0029-1867 융합체에 의한 면역화는 마우스에서 높고 특이적인 항체 반응을 유도하는 것을 보여준다.
실시예 23: 생 약독화 에스. 아우레우스 균주는 일부 특이적 항원에 대한 항체 면역 반응을 유의하게 개선시킨다 - 백신 #7
항원 및 생 약독화 에스. 아우레우스 균주 Δ720ΔhemB는 실시예 21에 기술된 대로 생산한다. 마우스는 실시예 21에 기술된 대로 면역화시키고 IgG를 검출한다.
도 17의 결과는 약독화된 생균주 Δ720ΔhemB 에 의한 면역화가 단백질 믹스 단독으로 면역화된 마우스로부터 수득된 IgG 항체와 비교하여, SACOL0029 항원에 대한 특이적 IgG 항체의 생산을 유의하게 증가시키는 것을 보여준다.
실시예 24: 생 약독화 에스. 아우레우스 균주는 에스. 아우레우스의 추가적인 표면 단백질에 대해 상당한 항체 역가를 유도한다 - 백신 #7
항원 및 생 약독화 에스. 아우레우스 균주 Δ720ΔhemB는 실시예 21에 기술된 대로 생산한다. 마우스는 실시예 21에 기술된 대로 면역화시키고 IgG를 검출한다.
도 18의 결과는 약독화된 생균주 Δ720ΔhemB 에 의한 면역화 (단독으로 또는 폴리펩티드 항원과 공동 투여 시)가 SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, 및 SACOL0029-1867로 구성된 단백질 믹스 단독으로 획득된 것과 비교하여, 스타필로코커스 표면 단백질 ClfA에 대한 특이적 항체의 생산을 유의하게 증가시킨다는 것을 보여준다.
실시예 25: 생 약독화 에스. 아우레우스 균주는 Th1/Th2 면역 반응을 유의하게 균형맞춘다 - 백신 #7
항원 및 생 약독화 에스. 아우레우스 균주 Δ720ΔhemB는 실시예 21에 기술된 대로 생산한다.
SACOL0029-1867 융합체 단백질에 대한 혈청 IgG2a 및 IgG1 이소타입은 이전에 기술된 대로 백신접종된 마우스의 혈청에서 검출되었고 각 마우스의 IgG2a 대 IgG1 역가의 비율을 결정하였다. IgG2a 이소타입은 마우스에서 Th1 면역 반응과 연관되는 반면, IgG1은 Th2 반응에 대한 마커이다. 실시예 5에 기술된 바와 같이, 소에서 IgG2 생산의 유도 및 우유 중 IgG2 역가의 정도는 소의 우유 중 상응하는 체세포 (SCC) 또는 박테리아 계측치 (CFU)의 수준으로 판단하여, 에스. 아우레우스에 의한 챌린지에 대한 소의 보호성과 유의하게 상관관계가 있다 (도 4C).
도 19 및 20에 도시된 결과는 조합 면역화 백신에 포함된 약독화 생균주 Δ720ΔhemB (Δ720ΔhemB 에스. 아우레우스를 SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, 및 SACOL0029-1867과 투여함)가 단백질 믹스 면역화 (SACOL0029, SACOL0442, SACOL0720, 및 SACOL0029-1867)로 확인된 것보다 SACOL0029-1867 융합체 및 SACOL0029 단백질에 대해서 유의하게 더 높은 IgG2a/IgG1 항체 비율을 유도하여, 그 결과로 유의하게 더욱 균형잡힌 Th1/Th2 반응이 일어난다는 것을 입증한다.
상기 실시예 21 내지 25는 강력한 항체 반응이 단백질 믹스 조성물 중 상이한 항원 (예를 들어, SACOL0029-1867 융합체 포함)에 의한 면역화에 의해 수득되었더라도, 생 약독화 균주와 이들 항원의 조합으로 마우스의 면역화는 일부 특이적 항원 (예를 들어, SACOL0029)에 대한 보다 높은 항체 역가의 유도에 의해서, 다른 스타필로코커스 단백질 (예를 들어, ClfA)에 대한 항체의 생산에 의해서, 그리고 생 균주와 공동 투여된 항원에 대해, 더 강력한 Th1 유형 반응의 좋은 마커인, 보다 균형잡힌 IgG2a/IgG1 비율의 획득에 의해서, 에스. 아우레우스에 대한 면역 반응을 상당히 개선시켰다는 것을 보여준다.
실시예 26: 균주 에스. 아우레우스 ΔhemB Δ720에서 재조합 단백질의 발현 - 백신 #8, 9, 10 등
유전자 SACOL0442, SACOL0720, SACOL0029, 및/또는 SACOL1867을 비롯하여 유전자 SACOL0029 및 SACOL1867 (SACOL0029-SACOL1867)의 융합체 (예를 들어, 50 AA 이상의 크기) (또는 이의 단편), SACOL720 및/또는 SACOL0442의 단편 (예를 들어, 에피토프)의 융합체 (융합체 720-720) (융합체 442-720) 또는 유전자의 임의의 다른 융합체 또는 이의 단편 예를 들어, SACOL0029-SACOL0442, SACOL0029-SACOL0720, SACOL0029-SACOL0720-SACOL0442, SACOL0029-SACOL0720-SACOL1867, SACOL0029-SACOL1867-SACOL0442 SACOL0442-SACOL0029-SACOL0720, SACOL0442-SACOL0029-SACOL0720, SACOL0442-SACOL1867-SACOL0720, SACOL0720-SACOL0442-SACOL1867, SACOL04029-SACOL1867-SACOL0720-SACOL0442를 항상성 프로모터 (pCN40 유래의 PblaZ) (Charpentier et al., 2004) 하의 플라스미드 pCN36 (Charpentier et al., 2004)에 클로닝하였고, 에스. 아우레우스 ΔhemBΔ720 균주에서 발현시켰다. 본 명세서에서 제안하는 일정한 단백질 항원은 외독소, 장독소 또는 초항원 (예를 들어, SACOL0442) 또는 숙주 방어에 대한 보호에 유용한 단백질 (예를 들어, SACOL0720)일 것으로 예측되며 잠재적으로 포유동물 면역계 및 항체 생산을 방해할 수 있고/있거나, 숙주에서 일부 독성을 보인다. 이러한 방해가 본 명세서에 기술되는 백신 조성물 및 제제에서 관찰되지는 않았지만, 클로닝된 유전자가 이의 병독성을 보완하지 않도록 에스. 아우레우스 ΔhemBΔ720 균주에서 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드를 변형시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 면역원성을 상실하지 않고 이러한 단백질 활성에 관여하는 추정 영역(들)을 결실시키거나 또는 돌연변이시키기 위해서 분자 생물학 기술을 사용하는 것이 가능하다 (Chang et al., 2008). 이것은 본 발명의 백신 조성물의 항원을 제조하기 위해서 출원인이 사용한 접근법이다.
구축된 발현 벡터 중 하나를 보유하는 각각의 에스. 아우레우스 ΔhemBΔ720 균주에 의한 개별 재조합 단백질 생성물의 발현은 LC-MS/MS 분석으로 검증한다. 간략하게, 15 ㎍/mL 테트라사이클린을 포함한 BHI에서 대수기 중간까지 성장된 균주를 원심분리시켰고 펠렛을 에탄올로 불활성화시켰다. 샘플은 세포 용해 및 트립신 분해 절차까지 -20℃에서 유지시켰다. 샘플을 리소스타핀 및 트립신과 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 유리 비드 및 비드비터를 사용한 기계적 균질화로 세포 파괴를 후속하였다. 다음으로 트립신에 의한 단백질 분해를 후속하기 전에 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 25분 동안 13 000 rpm로 4℃에서 원심분리시켰고, 환원 및 알킬화는 LC-MS/MS의 MRM 방법을 사용한 단백질 검출을 위해 샘플 주입 전에 표준 절차를 통해 수행되었다.
대안적으로, 재조합 단백질 발현은 또한 박테리아 용해물의 웨스턴 블롯으로 확증한다.
실시예 27: 항원을 발현하는 약독화 균주에 의한 마우스 면역화 - 백신 #8 등.
CD-1 암컷 마우스는 2주 간격으로 2회 피하 주사로 백신접종된다. 구축된 발현 벡터 중 하나를 보유하거나 또는 보유하지 않는 각각의 에스. 아우레우스 ΔhemBΔ720 균주는 염수에 희석하여 용량 당 100 ㎕의 최종 부피로 투여된다. 그룹 1은 이중-돌연변이체 균주를 단독으로 투여받고; 그룹 2는 융합체 SACOL0029-1867을 발현하는 이중-돌연변이체 균주를 투여받고; 그룹 3은 융합체 SACOL0029-0442를 발현하는 이중-돌연변이체 균주를 투여받고; 그룹 4는 융합체 SACOL0029-0720을 발현하는 이중-돌연변이체 균주를 투여받고; 그룹 5는 융합체 SACOL0029-1867를 발현하는 하나 및 융합체 SACOL0029-0442를 발현하는 하나인, 이중-돌연변이체 균주의 혼합물을 투여받으며; 그룹 6은 융합체 SACOL0029-1867을 발현하는 하나 및 융합체 SACOL0029-0720을 발현하는 하나인, 이중-돌연변이체 균주의 혼합물을 투여받고; 그룹 7은 이중-돌연변이체 균주의 혼합물을 투여받는다. 혈액 샘플은 제1 주사 직전 및 제2 주사 후 12일에 채혈된다. 샘플은 1시간 동안 실온에서 응고되도록 한 후에, 2 000 g로 10분 동안 4℃에서 원심분리한다. 상청액 (혈청)을 채취하고 후속 분석까지 -20℃에서 유지시킨다. 마우스를 27일에 안락사시키고 혈액을 심장 천자를 통해 채혈한다. 면역 혈청을 회수하여, 분취하고 면역전 혈청으로서 저장한다.
백신접종에 대한 면역 반응을, 에스. 아우레우스 전체 세포 (Wood 균주) 또는 특이적 재조합 단백질에 대해 유도된 혈청 다클론 IgG 항체의 존재에 대해서 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA)를 통해 평가한다. 항-마우스 IgG-HRP (HRP: 홀스래디쉬 퍼옥시다제)가 분광광도계를 사용하여 퍼옥시다제 활성에 의한 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질의 비색 생성을 검출하기 위한 2차 항체로서 사용된다.
참조문헌
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
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SEQUENCE LISTING <110> SOCPRA SCIENCES ET GENIE S.E.C. MALOUIN, FRANCOIS STER, CELINE COTE-GRAVEL, JULIE BROUILLETTE, ERIC <120> VACCINE CONSTRUCTS AND USES THEREOF AGAINST STAPHYLOCOCCUS INFECTIONS <130> 193 481 m2/m14/mfe <140> PCT/CA2017/051253 <141> 2017-10-20 <150> 62/411,120 <151> 2016-10-21 <160> 196 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Lys Asp Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln 1 5 10 15 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2 Gly Glu His Leu Pro Lys Gly Asn Ile Val Ile Asn Thr Lys Asp Gly 1 5 10 15 Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Lys Asp Arg Glu 20 25 30 Asn Val Lys Ile Asn Thr Ala Asp 35 40 <210> 3 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 3 Lys Asp Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Glu Ser His Lys Glu Leu Gln Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Lys Asp Ile Asn Lys Ile Tyr 20 25 30 Phe Met Thr Asp Val Asp Leu Gly Gly Pro Thr Phe Val Leu Asn Asp 35 40 45 <210> 4 <211> 168 <212> 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tattttacat cattagcata tatgaaatta atgggtacaa cgaatcaaat accggttttc 1800 atagtaatgg gattatacat ttgtatgtat gctgtttttg cagtgacggc ttataatcat 1860 tccaagcgaa cattagacat tccatataa 1889 <210> 11 <211> 629 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 11 Met Thr Phe Asn Glu Ile Ile Phe Lys Asn Phe Arg Gln Asn Leu Ser 1 5 10 15 His Tyr Ala Ile Tyr Leu Phe Ser Leu Ile Thr Ser Val Val Leu Tyr 20 25 30 Phe Ser Phe Val Ala Leu Lys Tyr Ala His Lys Leu Asn Met Thr Glu 35 40 45 Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser Tyr Phe Leu 50 55 60 Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val Leu Phe Ile 65 70 75 80 Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ser 85 90 95 Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu Leu Ile Phe 100 105 110 Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe Gly Ser Lys 115 120 125 Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys Glu Lys Val 130 135 140 Pro Ile Ile Phe Ser Leu Arg Ala Val Phe Glu Thr Leu Met Leu Ile 145 150 155 160 Gly 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gtgctaataa acgagatgta gttgaaaaat tatatcaaga aaatggtaaa 480 acaagcttcg aaccagccga tttaaaagca catagaatgg taaatgttat tcttgataaa 540 gaagcggctg caggtttacc tgaagatgtt aaagcttact ttacgtcacg ctttgcttaa 600 <210> 43 <211> 199 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 43 Met Ala Met Asn Phe Lys Val Phe Asp Asn Ser Gln Leu Val Ala Glu 1 5 10 15 Tyr Ala Ala Asp Ile Ile Arg Lys Gln Phe Asn Asn Asn Pro Thr Thr 20 25 30 Ile Ala Gly Phe His Leu Asp Thr Asp Gln Ala Pro Val Leu Asp Glu 35 40 45 Leu Lys Lys Asn Val Glu Lys His Ala Val Asp Phe Ser Gln Ile Asn 50 55 60 Ile Leu Asp Tyr Asp Asp Lys Lys Ser Tyr Phe Glu Ala Leu Gly Val 65 70 75 80 Pro Ala Gly Gln Val Tyr Pro Ile Ala Tyr Glu Lys Asp Ala Ile Glu 85 90 95 Leu Ile Ala Asp Lys Ile Lys Thr Lys Glu Asn Lys Gly Lys Leu Thr 100 105 110 Leu Gln Val Val Ser Ile Asp Glu Gln Gly Lys Leu Asn Val Ser Ile 115 120 125 Arg Gln Gly Leu Met Glu Ala Arg Glu Ile Phe Leu Val Val Thr Gly 130 135 140 Ala Asn Lys Arg Asp Val Val Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Asn Gly Lys 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ggcaagggga 1680 ctaaagttta aaattatgtt taattttggg ttacctttag ttattgcact atcacatgca 1740 tattttacat cattagcata tatgaaatta atgggtacaa cgaatcaaat accggttttc 1800 atagtaatgg gattatacat ttgtatgtat gctgtttttg cagtgacggc ttataatcat 1860 tccaagcgaa caattagaca ttccatataa 1890 <210> 109 <211> 629 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 109 Met Thr Phe Asn Glu Ile Ile Phe Lys Asn Phe Arg Gln Asn Leu Ser 1 5 10 15 His Tyr Ala Ile Tyr Leu Phe Ser Leu Ile Thr Ser Val Val Leu Tyr 20 25 30 Phe Ser Phe Val Ala Leu Lys Tyr Ala His Lys Leu Asn Met Thr Glu 35 40 45 Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser Tyr Phe Leu 50 55 60 Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val Leu Phe Ile 65 70 75 80 Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ser 85 90 95 Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu Leu Ile Phe 100 105 110 Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe Gly Ser Lys 115 120 125 Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys Glu Lys Val 130 135 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Staphylococcus aureus <400> 113 Met Thr Glu Ser Tyr Pro Ile Ile Lys Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser 1 5 10 15 Tyr Phe Leu Phe Phe Ile Ile Ile Ala Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Val 20 25 30 Leu Phe Ile Lys Arg Arg Ser Tyr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Thr Leu 35 40 45 Gly Leu Ser Lys Phe Asn Ile Ile Tyr Ile Leu Met Leu Glu Gln Leu 50 55 60 Leu Ile Phe Ile Ile Thr Ala Ile Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Phe 65 70 75 80 Gly Ser Lys Leu Leu Leu Met Ile Val Phe Thr Leu Leu Gly Ile Lys 85 90 95 Glu Lys Val Pro Ile Ile Phe Ser Leu Arg Ala Val Phe Glu Thr Leu 100 105 110 Met Leu Ile Gly Val Ala Tyr Phe Leu Thr Ser Ala Gln Asn Phe Ile 115 120 125 Leu Val Phe Lys Gln Ser Ile Ser Gln Met Ser Lys Asn Asn Gln Val 130 135 140 Lys Glu Thr Asn His Asn Lys Ile Thr Phe Glu Glu Val Val Leu Gly 145 150 155 160 Ile Leu Gly Ile Val Leu Ile Ile Thr Gly Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn 165 170 175 Ile Val Gln Tyr Tyr Asp Ser Ile Gly Ile Leu Met Phe Ile Leu Leu 180 185 190 Ser Thr Val Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Phe Lys Ser Ser Val Ser Leu 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naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (79)..(81) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (83)..(83) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (85)..(88) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 131 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Ser Val Xaa Xaa Tyr Glu Thr 35 40 45 Phe Phe Xaa Arg Phe Asp Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Xaa Ile Glu Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Arg Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa 85 <210> 132 <211> 14 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 132 Glu Ser Arg Glu 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(9)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 138 Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Ser Val Xaa Xaa Tyr Glu Thr Phe 1 5 10 <210> 139 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 139 Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 140 <211> 720 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 140 ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60 attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120 agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180 attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240 aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300 taatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcaa ctgcttgttc 360 ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420 atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtc tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480 ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540 cgcatcttta aatgaaacga cgccattata tggaaaaata tttgtatctt taacttgcgt 600 aacattcttc tctgcatttg ctatttgttg tgtctcttca acgactgcag catttattcc 660 agttactgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720 <210> 141 <211> 720 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 141 ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60 attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120 agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180 attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240 aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300 taatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcaa ctgcttgttc 360 ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420 atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtc tggatgggca gtaattctat 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cgcatcttta aatgaaacga cgccattata tggaaaaata tttgtatctt taacttgcgt 600 aacattcttc tctgcatttg ctatttgttg tgtctcttca acgactgcag catttattcc 660 agttactgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720 aaaagcacat tgaacaataa 740 <210> 143 <211> 720 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 143 ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60 attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120 agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180 attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240 aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300 gaatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcga ctgcttgttc 360 ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420 atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtt tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480 ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540 cgcatcttta aatgaaacga cgccattata tggaaaaata tttgtatctt taacttgcgt 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<213> Staphylococcus aureus <400> 146 ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60 attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120 agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180 attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240 aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300 gaatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcaa ctgcttgttc 360 ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420 atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtt tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480 ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540 cgcatcctta aatgaaacga cgccattata tggaaaatta tttgtatctt taacttgcgt 600 aacattcttc tctgcatttg ctatttgttg tgtctcttca acgactgcag catttattcc 660 agttactgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720 <210> 147 <211> 720 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 147 ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt 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tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240 aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300 gaatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcaa ctgcttgttc 360 ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420 atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtt tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480 ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540 cgcatcctta aatgaaacga cgccattata tggaaaatta tttgtatctt taacttgcgt 600 aacattcttc tctgcatttg ctatttgttg tgtctcttca acgactgcag catttattcc 660 agttactgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720 <210> 150 <211> 720 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 150 ttattgttca atgtgctttt gaataaaatc tttgatttga ggcgtaaagt atacggcacc 60 attatattca gaaccaattt ttccaatacc gccatacacc acacctatga cctcattgtt 120 agaatttaga actggtgatc ctgaattccc gggttcaatg tatgcatcaa aatttaaaat 180 attgtctttg attcttttta tagttcctgt agattcaaac tgtttaaaac tattttgagc 240 aggtaatggg taaccaataa ctttaatttt gtcatcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300 gaatgcttgg acattttcat taaaattaaa gccttttggt ccacgttcaa ctgcttgttc 360 ttcaatattc atgacagaga tgtcttcatc acccggataa tcagaaatgc ttttaatttt 420 atatatacca ccatttcctt tgtcaccgtt tggatgggca gtaattctat cgccaacttt 480 ataatctttt gatacatgtt tattggtgat aattgtattt tttccaatta caaaacctgt 540 cgcatcctta aatgaaacga cgccattata tggaaaatta tttgtatctt taacttgcgt 600 aacattcttc tctgcatttg ctatttgttg tgtctcttca acgactgcag catttattcc 660 agttactgag gttagaatgg ctaatgctgc catgctttta atgactatat ttttattcat 720 <210> 151 <211> 720 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 151 ttattgttca atgtgctttt gaataaattc tttgatttga ggcgtaaaat aaactgcacc 60 attgtattct gatccgattt ttccaatacc tccatacaca actcctacga cttcattatt 120 taaatttaaa actggggatc ctgaatttcc aggctcgata tatgcatcaa aatttaaatt 180 attatcttta atacttttta cagttccagt tgattcaaat tgtttgaatg tattttgagc 240 tggtaaaggg tatccaataa ctttaatttt gtcgtcaact ttagcatctt tcgcaaaatt 300 gaatgcttgg acattttcat taaaattata accatttgct ccacgttcaa cagcattttc 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can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (91)..(91) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (111)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (119)..(119) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (122)..(122) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(129) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (131)..(131) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> 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<222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 171 Xaa Ile Ser Asp Tyr Pro Gly Xaa Glu Asp Ile Ser Val Met 1 5 10 <210> 172 <211> 14 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 172 Arg Gly Pro Lys Gly Phe Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala 1 5 10 <210> 173 <211> 14 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 173 Arg Gly Ala Asn Gly Tyr Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala 1 5 10 <210> 174 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 174 Arg Gly Xaa Xaa Gly Xaa Asn Phe Asn Glu Asn Val Gln Ala 1 5 10 <210> 175 <211> 14 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 175 Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Ile Lys Arg Ile Lys Asp Asn 1 5 10 <210> 176 <211> 14 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 176 Gln Phe Glu Ser Thr Gly Thr Val Lys Ser Ile Lys Asp Asn 1 5 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gagaatcatg taagaaaaga agatttaata tatccaattt ttgtagttga aaaagacgat 120 gtgaaaaaag aaattaagtc attgccaggt gtataccaaa tcagtttgaa tttacttgaa 180 agtgaattaa aagaagctta tgacttaggc atacgtgcca ttatgttttt cggtgttcca 240 aactcaaaag atgatatagg tactggtgca tacattcacg atggtgttat tcaacaggca 300 acacgtattg ctaaaaaaat gtatgatgac ttattaattg ttgcagacac ttgtttatgt 360 gaatatactg atcatggtca ttgtggcgtg attgatgacc atacacatga cgttgacaat 420 gataaatcat tgccactact tgttaaaaca gcaatttctc aagtggaagc tggtgctgat 480 attattgcgc caagtaatat gatggatggt tttgttgctg aaattcgtcg tggattagat 540 gaagccggct attacaatat tcctataatg agttatggtg tcaagtatgc atcaagtttc 600 tttggacctt ttagagatgc agcagattca gcgccatcat ttggggatag aaaaacgtat 660 cagatggacc ctgctaaccg tttggaagca cttcgtgaat tagaaagtga tcttaaagaa 720 gggtgcgaca tgatgattgt taaacctgct ctaagttatt tagatatagt tcgagatgtt 780 aaaaatcata cgaatgttcc agttgttgca tataatgtga gtggagaata tagtatgact 840 aaagcagcgg cacaaaatgg ttggatagat gaagaacgtg tcgttatgga acaaatggtt 900 tcaatgaaac gtgcaggtgc tgatatgatt attacgtatt ttgcaaagga catttgtcgc 960 tatttagata aataa 975 <210> 182 <211> 324 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 182 Met Lys Phe Asp Arg His Arg Arg Leu Arg Ser Ser Ala Thr Met Arg 1 5 10 15 Asp Met Val Arg Glu Asn His Val Arg Lys Glu Asp Leu Ile Tyr Pro 20 25 30 Ile Phe Val Val Glu Lys Asp Asp Val Lys Lys Glu Ile Lys Ser Leu 35 40 45 Pro Gly Val Tyr Gln Ile Ser Leu Asn Leu Leu Glu Ser Glu Leu Lys 50 55 60 Glu Ala Tyr Asp Leu Gly Ile Arg Ala Ile Met Phe Phe Gly Val Pro 65 70 75 80 Asn Ser Lys Asp Asp Ile Gly Thr Gly Ala Tyr Ile His Asp Gly Val 85 90 95 Ile Gln Gln Ala Thr Arg Ile Ala Lys Lys Met Tyr Asp Asp Leu Leu 100 105 110 Ile Val Ala Asp Thr Cys Leu Cys Glu Tyr Thr Asp His Gly His Cys 115 120 125 Gly Val Ile Asp Asp His Thr His Asp Val Asp Asn Asp Lys Ser Leu 130 135 140 Pro Leu Leu Val Lys Thr Ala Ile Ser Gln Val Glu Ala Gly Ala Asp 145 150 155 160 Ile Ile Ala Pro Ser Asn Met Met Asp Gly Phe Val Ala Glu Ile Arg 165 170 175 Arg Gly Leu Asp Glu Ala 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Leu Ile Ile Lys Gln Lys Leu Asp Ile Ser Leu Ala Glu Ser 35 40 45 Val Val Ser Ser Pro Ile Ala Ser Glu His Val Ile Glu Gln Leu Thr 50 55 60 Leu Phe Gln His Glu Arg Arg His Leu Arg Pro Lys Ile Ser Ala Thr 65 70 75 80 Phe Leu Ala Trp Leu Leu Ile Phe Leu Met Phe Ala Leu Pro Ile Gly 85 90 95 Ile Ala Tyr Gln Phe Ser Asp Trp Phe Gln Asn Gln Tyr Val Ser Ala 100 105 110 Trp Ile Glu Tyr Leu Thr Gln Thr Thr Leu Leu Asn His Asp Ile Leu 115 120 125 Gln His Ile Leu Phe Gly Asp Tyr Gly Val Leu Ser Leu Gly Thr Tyr 130 135 140 Ser Leu Val Trp Ala Leu Pro Val Val Ile Leu Ile Ser Leu Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ile Ile Asp Gln Thr Gly Leu Lys Ser Trp Met Ile Trp Ala Ile 165 170 175 Glu Pro Ser Met Leu Trp Ile Gly Leu Gln Gly Asn Asp Ile Val Pro 180 185 190 Leu Leu Glu Gly Phe Gly Cys Asn Ala Ala Ala Ile Ser Gln Ala Ala 195 200 205 His Gln Cys His Thr Cys Thr Lys Thr Gln Cys Met Ser Leu Ile Ser 210 215 220 Phe Gly Ser Ser Cys Ser Tyr Gln Ile Gly Ala Thr Leu Ser Ile Phe 225 230 235 240 Ser Val Ala Gly Lys Ser Trp Leu Phe Met Pro Tyr Leu Ile Leu Val 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Ile Leu His Asn Arg Ile Trp Leu Lys Lys Asn Asp 260 265 270 Gln Gln Leu Ser Val Pro Leu Pro Tyr Asp Arg Gln Leu His Met Pro 275 280 285 Asn Ile Arg Gln Met Leu Leu Gln Met Trp Gln Asn Ile Gln Met Phe 290 295 300 Ile Val Gln Ala Leu Pro Ile Phe Ile Thr Ile Cys Leu Ile Val Ser 305 310 315 320 Ile Leu Ser Leu Thr Pro Ile Leu Asn Val Leu Ser Gln Ile Phe Thr 325 330 335 Pro Ile Leu Ser Leu Leu Gly Ile Ser Ser Glu Leu Ser Pro Gly Ile 340 345 350 Leu Phe Ser Met Ile Arg Lys Asp Gly Met Leu Leu Phe Asn Leu His 355 360 365 Gln Gly Ala Leu Leu Gln Gly Met Thr Ala Thr Gln Leu Leu Leu Leu 370 375 380 Val Phe Phe Ser Ser Thr Phe Thr Ala Cys Ser Val Thr Met Thr Met 385 390 395 400 Leu Leu Lys His Leu Gly Gly Gln Ser Ala Leu Lys Leu Ile Gly Lys 405 410 415 Gln Met Val Thr Ser Leu Ser Leu Val Ile Gly Val Gly Ile Ile Val 420 425 430 Lys Ile Val Met Leu Ile Ile 435 <210> 194 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 194 tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22 <210> 195 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 195 Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 1 5 10 <210> 196 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 196 Lys Asp Tyr Glu Arg Lys Tyr Lys Lys His Ile Val Ser 1 5 10

Claims (36)

  1. 하기 식 (I)의 융합체 구성체:
    X-A-링커-B-Z (I)
    [여기서,
    (1) A 및 B는 동일하거나 또는 상이하고, 독립적으로,
    (a) NCBI 기준 서열 NC_002951.2에 기재된 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) COL (SACOL) 게놈 유래의 유전자 명명법을 기반으로, 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131), SACOL0264 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 185), 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92), SACOL0718 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 186), 도 23I-K에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120), SACOL1353 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 187), SACOL1416 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 188), SACOL1611 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 189), 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164), SACOL1912 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 43), SACOL1944 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 190), SACOL2144 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 191), SACOL2365 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 192), SACOL2385 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 50) 또는 SACOL2599 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 193)를 포함하는 폴리펩티드;
    (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드;
    (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는
    (e) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드
    이고;
    (2) 링커는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열이거나 또는 부재하고;
    (3) X는 부재하거나 또는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열이고;
    (4) Z는 부재하거나 또는 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 서열임].
  2. 제1항에 있어서, (1) (a)는 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131), 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92), 도 23I-K에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120), 또는 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164)를 포함하는 폴리펩티드인 융합체 구성체.
  3. 제2항에 있어서, A 및 B 중 적어도 하나는 (a) 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131)를 포함하는 폴리펩티드; (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드이고; A 및 B 중 나머지 하나는 (a') 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164)를 포함하는 폴리펩티드; (b') (a')의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c') (a') 또는 (b')의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d') (a') 내지 (c') 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e') (a') 내지 (c') 중 어느 하나의 적어도 12개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드인 융합체 구성체.
  4. 제2항에 있어서, A 및 B 중 적어도 하나는 (a) 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92)를 포함하는 폴리펩티드; (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드이고; A 및 B 중 나머지 하나는 (a') 도 23I-K에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120)를 포함하는 폴리펩티드; (b') (a')의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c') (a') 또는 (b')의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d') (a') 내지 (c') 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e') (a') 내지 (d') 중 어느 하나의 적어도 12개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드인 융합체 구성체.
  5. 제2항에 있어서, A 및 B는 동일하거나 또는 상이하고, (a) 도 23I-K에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120)를 포함하는 폴리펩티드; (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드; (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 (e) (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드인 융합체 구성체.
  6. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 융합체 구성체: KDTINGKSNKSRNW (SEQ ID NO: 34); 및 KDGGKYTLESHKELQ (SEQ ID NO: 1).
  7. 제6항에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 융합체 구성체:
    Figure pct00023
  8. 제1항, 제2항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 융합체 구성체: QFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO: 21); TIKDQQKANQLAS (SEQ ID NO: 22); KDINKIYFMTDVDL (SEQ ID NO: 23); 및 DVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 24).
  9. 제8항에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 융합체 구성체:
    Figure pct00024
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 단편 (c')은 하기 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 융합체 구성체: PYNGVVSFKDATGF (SEQ ID NO: 165); AHPNGDKGNGGIYK (SEQ ID NO: 167); SISDYPGDEDISVM (SEQ ID NO: 169); RGPKGFNFNENVQA (SEQ ID NO: 172); QFESTGTIKRIKDN (SEQ ID NO: 175); 및 GNSGSPVLNSNNEV (SEQ ID NO: 178).
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역원성 단편 (d)는 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합체 구성체:
    Figure pct00025
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 아스파테이트, 글루타메이트 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 4종의 동일하거나 또는 상이한 아미노산을 포함하는 것인 융합체 구성체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 (GGGGS)n (SEQ ID NO: 67), (ERKYK)n (SEQ ID NO: 61); 또는 (EAAAK)n (SEQ ID NO: 63)을 포함하고, 여기서 n = 1 내지 5인 융합체 구성체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 6 내지 10개 아미노산의 폴리히스티딘을 포함하는 것인 융합체 구성체.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 부재하는 것인 융합체 구성체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Z는 부재하는 것인 융합체 구성체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 구성체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  18. 제17항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  19. 제18항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태인 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태는 안정화된 소형 콜로니 변이체 (SCV) 표현형을 갖는 것인 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 안정화된 SCV 표현형을 갖는 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태는 ΔhemBΔ720 에스. 아우레우스인 숙주 세포.
  23. (A) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 구성체 중 적어도 하나; 제17항에 따른 핵산 분자 중 적어도 하나; 제18항에 따른 벡터 중 적어도 하나; 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포 중 적어도 하나; 및
    (B) (i) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드;
    (ii) 생 약독화 스타필로코커스 아우레우스;
    (iii) 약학적으로 허용가능한 부형제;
    (iv) 보강제; 또는
    (v) (i) 내지 (iv) 중 적어도 2종의 조합
    을 포함하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태는
    (a) NCBI 기준 서열 NC_002951.2에 기재된 스타필로코커스 아우레우스 COL (SACOL) 게놈 유래의 유전자 명명법을 기반으로, 도 24에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0029 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 5 및 121 내지 131), SACOL0264 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 185), 도 22D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0442 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 29 및 82 내지 92), SACOL0718 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 186), 도 23I-J에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL0720 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 11 및 109 내지 120), SACOL1353 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 187), SACOL1416 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 188), SACOL1611 (SEQ ID NO: 189), 도 25D에 도시된 서열 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 SACOL1867 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 152 내지 164), SACOL1912 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 43), SACOL1944 (SEQ ID NO: 190), SACOL2144 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 191), SACOL2365 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 192), SACOL2385 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 50) 또는 SACOL2599 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 193)를 포함하는 폴리펩티드;
    (b) (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 동일한 오페론 유래의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (c) (a) 또는 (b)의 적어도 13개의 연속되는 아미노산의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드;
    (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 서열과 전체로 적어도 60%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는
    (e) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 적어도 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드
    를 발현하는 것인 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 스타필로코커스 아우레우스의 생 약독화 형태는 안정화된 소형 콜로니 변이체 (SCV) 표현형을 갖는 것인 조성물.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 보강제는 명반, 오일, 사포닌, 환형-디구아노신-5'-모노포스페이트 (c-di-GMP), 폴리포스파신, 인돌리시딘, 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP), 리포솜 또는 이의 적어도 2종의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  27. 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 포유동물에게 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 구성체; 제17항에 따른 핵산 분자; 제18항에 따른 벡터; 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포; 또는 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 스타필로코커스 IMI는 하나 이상의 스타필로코커스 아우레우스 균주에 의해 야기되는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 포유동물은 소인 방법.
  30. 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)을 예방 및/또는 치료하기 위한, (i) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 구성체; (ii) 제17항에 따른 핵산 분자; (iii) 제18항에 따른 벡터; 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포; (iv) 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물; 또는 (v) (i) 내지 (iv) 중 적어도 2종의 조합의 유효량의 용도.
  31. 제30항에 있어서, 상기 스타필로코커스 IMI는 하나 이상의 스타필로코커스 아우레우스 균주에 의해 야기되는 것인 용도.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 포유동물은 소인 용도.
  33. 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 구성체; 제17항에 따른 핵산 분자; 제18항에 따른 벡터; 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포; 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 이의 적어도 2종의 조합.
  34. 제33항에 있어서, 상기 스타필로코커스 IMI는 하나 이상의 스타필로코커스 아우레우스 균주에 의해 야기되는 것인 구성체, 핵산 분자, 벡터, 세포, 조성물 또는 조합.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 포유동물은 소인 구성체, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 조성물.
  36. 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)을 예방 및/또는 치료하기 위한 키트로서,
    (A) (i) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 구성체 중 적어도 하나; (ii) 제17항에 따른 핵산 분자 중 적어도 하나; (iii) 제18항에 따른 벡터 중 적어도 하나; (iv) 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포 중 적어도 하나; 또는 (v) (i) 내지 (iv) 중 적어도 2종의 조합, 및
    (B) (i) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드;
    (ii) 생 약독화 스타필로코커스 아우레우스;
    (iii) 약학적으로 허용가능한 부형제;
    (iv) 보강제;
    (v) 포유동물에서 스타필로코커스 유선내 감염 (IMI)을 예방 및/또는 치료하기 위해 키트를 사용하기 위한 지시서; 또는
    (vi) (i) 내지 (v) 중 적어도 2종의 조합
    을 포함하는 것인 키트.
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