JP7181208B2 - ワクチン構築物およびブドウ球菌感染症に対するその使用 - Google Patents

ワクチン構築物およびブドウ球菌感染症に対するその使用 Download PDF

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Description

関連出願の参照
なし
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
なし
発明の分野
本発明は、ワクチン構築物およびブドウ球菌感染症に対するその使用に関する。より具体的には、本発明は、抗原を組み合わせたワクチン構築物およびウシ乳腺内感染（ＩＭＩ）などのブドウ球菌感染症に対するその使用に関する。
配列表の参照
米国特許施行規則第１．８２１条（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１（ｃ））に従い、２０１７年１０月５日に作成し、２７８キロバイトのサイズのＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ ＵＳＰ６２４１１１２０＿ＳＴ２５という名前のＡＳＣＩＩ準拠のテキストファイルとして、本明細書とともに配列表を提出する。前述のファイルの全内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
発明の背景
ウシ乳房炎は、酪農業者にとって最も頻繁な、かつコストにかかる疾患であり、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、この疾患の発生に最も多い原因である伝染性細菌であると考えられている（Sears et al., 2003）。乳腺炎に至る可能性があるブドウ球菌ＩＭＩは、処置することが困難であり、頻繁な再発がよくみられる（Sandholm et al., 1990）。
黄色ブドウ球菌ＩＭＩを予防および管理するためのワクチンの開発は、広く検討されているが、現在までのところ予防効果を示している製剤はない。これはおそらく、ワクチンの標的が不適切であること（Middleton, 2008; Middleton 2009）、乳腺炎を誘導できる株間の多様性が高いこと（Buzzola, 2007; Kerro-Dego, 2006; Middleton, 2008）または適切な免疫応答を誘導できないこと（Bharathan, 2011; Ferens, 2000; Fowler, 2014; Proctor, 2012）が原因である。ワクチンで誘導された抗体にもっぱら基づく免疫は重要な可能性があるが、黄色ブドウ球菌に対する防御を誘導するには不十分であることの理解が深まってきている（Middleton 2008; Middleton 2009）。Ｔｈ１およびＴｈ１７型の応答に基づく細胞性免疫（ＣＭＩ）は、防御を完全なものにするのに必要である可能性があると思われる（Fowler, 2014; Lin, 2009; Proctor, 2012; Spellberg, 2012）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗生物質に対する細菌感受性は、慢性的に感染した雌ウシにおける治療効果の予測因子としては不十分である（Owens et al., 1997）。乳腺炎の処置に続発する感染症は、新たに獲得した株に起因し得るが、その感染症は、元の感染性微生物が残存していた結果であることが多い（Sandholm et al., 1990; Myllys et al., 1997）。よって、既存の治療法は、しばしば感染症の排除に失敗し、ブドウ球菌ＩＭＩを予防または処置するための新規のアプローチを見出すことが、強く望まれるであろう。
市販の黄色ブドウ球菌ワクチンに対しては、ワクチンの有効性および防御能の欠如が認められている（Middleton, 2008）。このため、ＩＭＩの発症中に発現することで知られる非常に効果のある黄色ブドウ球菌抗原を、ＩＭＩおよび乳腺炎に対して防御するためのワクチン成分として使用することが、強く望まれるであろう。
本発明は、これらのニーズおよびその他のニーズを満たすことを目的とする。
本明細書は、多数の文書を参照しており、その全内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
発明の概要
第一の態様では、本発明は、増大した免疫原性を示す融合ポリペプチド、およびブドウ球菌ＩＭＩに対するワクチンとしてのその使用を提供する。
黄色ブドウ球菌ＩＭＩなどのブドウ球菌の特徴は、黄色ブドウ球菌が宿主細胞内に持続することができる能力である。特に、黄色ブドウ球菌の小コロニー変異体（ＳＣＶ）は、一般に侵襲性感染症を生じず、宿主細胞に内部移行することがある。したがって、さらなる態様では、本発明は、そのような株に対する免疫応答を示し、ワクチンの予防効果を増大させるため、ＳＣＶの表現型の側面に基づいたワクチン目的での弱毒生型黄色ブドウ球菌株を提供する。
一態様では、本発明は以下の項目を提供する。
項目１：式（Ｉ）：Ｘ－Ａ－リンカー－Ｂ－Ｚ（Ｉ）の融合構築物であって、式中、（１）ＡおよびＢは同一または異なり、独立して、（ａ）ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＣ＿００２９５１．２に記載の黄色ブドウ球菌ＣＯＬ（ＳＡＣＯＬ）ゲノムに由来する遺伝子命名法に基づいた、図２４に示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ００２９ポリペプチド（配列番号５および１２１～１３１）、ＳＡＣＯＬ０２６４ポリペプチド（配列番号１８５）、図２２Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０４４２ポリペプチド（配列番号２９および８２～９２）、ＳＡＣＯＬ０７１８ポリペプチド（配列番号１８６）、図２３Ｉ～Ｋに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０７２０ポリペプチド（配列番号１１および１０９～１２０）、ＳＡＣＯＬ１３５３ポリペプチド（配列番号１８７）、ＳＡＣＯＬ１４１６ポリペプチド（配列番号１８８）、ＳＡＣＯＬ１６１１ポリペプチド（配列番号１８９）、図２５Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ１８６７ポリペプチド（配列番号１５２～１６４）、ＳＡＣＯＬ１９１２ポリペプチド（配列番号４３）、ＳＡＣＯＬ１９４４ポリペプチド（配列番号１９０）、ＳＡＣＯＬ２１４４ポリペプチド（配列番号１９１）、ＳＡＣＯＬ２３６５ポリペプチド（配列番号１９２）、ＳＡＣＯＬ２３８５ポリペプチド（配列番号５０）またはＳＡＣＯＬ２５９９ポリペプチド（配列番号１９３）を含んでなるポリペプチド；（ｂ）（ａ）のポリペプチドをコードする遺伝子と同じオペロンに由来する遺伝子によりコードされるポリペプチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチド；（ｄ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドの配列と全体が少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；または（ｅ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの少なくとも１３個の連続したアミノ酸を含んでなる免疫原性変異体を含んでなるポリペプチドであり、（２）リンカーが少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列である、または存在しない；（３）Ｘが存在しない、または少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列である；かつ（４）Ｚが存在しない、または少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列である、融合構築物。
項目２：（１）（ａ）が、図２４に示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ００２９ポリペプチド（配列番号５および１２１～１３１）、図２２Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０４４２ポリペプチド（配列番号２９および８２～９２）、図２３Ｉ～Ｋに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０７２０ポリペプチド（配列番号１１および１０９～１２０）、または図２５Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ１８６７ポリペプチド（配列番号１５２～１６４）を含んでなるポリペプチドである、項目１に記載の構築物。
項目３：ＡおよびＢの少なくとも１つが、（ａ）図２４に示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ００２９ポリペプチドを含んでなるポリペプチド（配列番号５および１２１～１３１）；（ｂ）（ａ）のポリペプチドをコードする遺伝子と同じオペロンに由来する遺伝子によりコードされるポリペプチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチド；（ｄ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドの配列と全体が少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；または（ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つの少なくとも１３個の連続したアミノ酸を含んでなる免疫原性変異体を含んでなるポリペプチドであり、かつ、ＡおよびＢの他方が、（ａ’）図２５Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ１８６７ポリペプチドを含んでなるポリペプチド（配列番号１５２～１６４）；（ｂ’）（ａ’）のポリペプチドをコードする遺伝子と同じオペロンに由来する遺伝子によりコードされるポリペプチド；（ｃ’）（ａ’）または（ｂ’）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチド；（ｄ’）（ａ’）～（ｃ’）のいずれか１つのポリペプチドの配列と全体が少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；または（ｅ’）（ａ’）～（ｄ’）のいずれか１つの少なくとも１２個の連続したアミノ酸を含んでなる免疫原性変異体を含んでなるポリペプチドである、項目２に記載の構築物。
項目４：ＡおよびＢの少なくとも１つが、（ａ）図２２Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０４４２ポリペプチドを含んでなるポリペプチド（配列番号２９および８２～９２）；（ｂ）（ａ）のポリペプチドをコードする遺伝子と同じオペロンに由来する遺伝子によりコードされるポリペプチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチド；（ｄ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドの配列と全体が少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；または（ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つの少なくとも１３個の連続したアミノ酸を含んでなる免疫原性変異体を含んでなるポリペプチドであり、かつ、ＡおよびＢの他方が、（ａ’）図２３Ｉ～Ｋに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０７２０ポリペプチドを含んでなるポリペプチド（配列番号１１および１０９～１２０）；（ｂ’）（ａ’）のポリペプチドをコードする遺伝子と同じオペロンに由来する遺伝子によりコードされるポリペプチド；（ｃ’）（ａ’）または（ｂ’）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチド；（ｄ’）（ａ’）～（ｃ’）のいずれか１つのポリペプチドの配列と全体が少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；または（ｅ’）（ａ’）～（ｄ’）のいずれか１つの少なくとも１２個の連続したアミノ酸を含んでなる免疫原性変異体を含んでなるポリペプチドである、項目２に記載の構築物。
項目５：ＡおよびＢが同一または異なり、（ａ）図２３Ｉ～Ｋに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０７２０ポリペプチドを含んでなるポリペプチド（配列番号１１および１０９～１２０）；（ｂ）（ａ）のポリペプチドをコードする遺伝子と同じオペロンに由来する遺伝子によりコードされるポリペプチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチド；（ｄ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドの配列と全体が少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；または（ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つの少なくとも１３個の連続したアミノ酸を含んでなる免疫原性変異体を含んでなるポリペプチドである、項目２に記載の構築物。
項目６：前記免疫原性フラグメント（ｄ）が、以下のアミノ酸配列：ＫＤＴＩＮＧＫＳＮＫＳＲＮＷ（配列番号３４）；およびＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）のうち１つ以上を含んでなる、項目１～２および４のいずれか一項に記載の構築物。
項目７：前記免疫原性フラグメント（ｄ）が、以下のアミノ酸配列：
Figure 0007181208000001
 のうち１つ以上を含んでなる、項目６に記載の構築物。
項目８：前記免疫原性フラグメント（ｄ）が、以下のアミノ酸配列：ＱＦＧＦＤＬＫＨＫＫＤＡＬＡ（配列番号２１）；ＴＩＫＤＱＱＫＡＮＱＬＡＳ（配列番号２２）；ＫＤＩＮＫＩＹＦＭＴＤＶＤＬ（配列番号２３）；およびＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤ（配列番号２４）のうち１つ以上を含んでなる、項目１～２および４～５のいずれか一項に記載の構築物。
項目９：前記免疫原性フラグメント（ｄ）が、以下のアミノ酸配列：
Figure 0007181208000002
 のうち１つ以上を含んでなる、項目８に記載の構築物。
項目１０：前記免疫原性フラグメント（ｃ’）が、以下のアミノ酸配列：ＰＹＮＧＶＶＳＦＫＤＡＴＧＦ（配列番号１６５）；ＡＨＰＮＧＤＫＧＮＧＧＩＹＫ（配列番号１６７）；ＳＩＳＤＹＰＧＤＥＤＩＳＶＭ（配列番号１６９）；ＲＧＰＫＧＦＮＦＮＥＮＶＱＡ（配列番号１７２）；ＱＦＥＳＴＧＴＩＫＲＩＫＤＮ（配列番号１７５）；およびＧＮＳＧＳＰＶＬＮＳＮＮＥＶ（配列番号１７８）のうち１つ以上を含んでなる、項目１～３のいずれか一項に記載の構築物。
項目１１：前記免疫原性フラグメント（ｄ）が、以下のアミノ酸配列：
Figure 0007181208000003
 を含んでなる、項目１０に記載の構築物。
項目１２：リンカーが、グリシン、セリン、アラニン、アスパラギン酸塩（ａｓｐａｒｔａｔｅ）、グルタミン酸塩（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）およびリジンからなる群から選択される少なくとも４つの同一または異なるアミノ酸を含んでなる、項目１～１１のいずれか一項に記載の構築物。
項目１３：リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６７）、（ＥＲＫＹＫ）ｎ（配列番号６１）；または（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６３）を含んでなり、ｎ＝１～５である、項目１～１２のいずれか一項に記載の構築物。
項目１４：前記Ｘが、６～１０個のアミノ酸のポリヒスチジンを含んでなる、項目１～１３のいずれか一項に記載の構築物。
項目１５：前記Ｘが存在しない、項目１～１３のいずれか一項に記載の構築物。
項目１６：前記Ｚが存在しない、項目１～１５のいずれか一項に記載の構築物。
項目１７：項目１～１６のいずれか一項に定義される構築物をコードする単離核酸分子。
項目１８：項目１７に定義される単離核酸を含んでなるベクター。
項目１９：項目１８に定義されるベクターを含んでなる宿主細胞。
項目２０：弱毒生型の黄色ブドウ球菌である、項目１９に記載の細胞。
項目２１：弱毒生型の黄色ブドウ球菌が、安定化した小コロニー変異体（ＳＣＶ）表現型を有する、項目２０に記載の細胞。
項目２２：安定化したＳＣＶ表現型を有する弱毒生型の黄色ブドウ球菌が、ΔｈｅｍＢΔ７２０黄色ブドウ球菌である、項目２１に記載の細胞。
項目２３：（Ａ）項目１～１６のいずれか一項に定義される構築物のうち少なくとも１つ；項目１７に定義される核酸分子のうち少なくとも１つ；項目１８に定義されるベクターのうち少なくとも１つ；または項目１９～２２のいずれか一項に定義される細胞のうち少なくとも１つ；および（Ｂ）（ｉ）項目１～１１のいずれか一項に定義されるポリペプチド；（ｉｉ）弱毒生型黄色ブドウ球菌；（ｉｉｉ）薬学的に許容可能な賦形剤；（ｉｖ）アジュバント；または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のうち少なくとも２つの組み合わせを含んでなる組成物。
項目２４：弱毒生型の黄色ブドウ球菌が、（ａ）ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＣ＿００２９５１．２に記載の黄色ブドウ球菌ＣＯＬ（ＳＡＣＯＬ）ゲノムに由来する遺伝子命名法に基づいた、図２４に示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ００２９ポリペプチド（配列番号５および１２１～１３１）、ＳＡＣＯＬ０２６４ポリペプチド（配列番号１８５）、図２２Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０４４２ポリペプチド（配列番号２９および８２～９２）、ＳＡＣＯＬ０７１８ポリペプチド（配列番号１８６）、図２３Ｉ～Ｋに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０７２０ポリペプチド（配列番号１１および１０９～１２０）、ＳＡＣＯＬ１３５３ポリペプチド（配列番号１８７）、ＳＡＣＯＬ１４１６ポリペプチド（配列番号１８８）、ＳＡＣＯＬ１６１１（配列番号１８９）、図２５Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ１８６７ポリペプチド（配列番号１５２～１６４）、ＳＡＣＯＬ１９１２ポリペプチド（配列番号４３）、ＳＡＣＯＬ１９４４（配列番号１９０）、ＳＡＣＯＬ２１４４ポリペプチド（配列番号１９１）、ＳＡＣＯＬ２３６５ポリペプチド（配列番号１９２）、ＳＡＣＯＬ２３８５ポリペプチド（配列番号５０）またはＳＡＣＯＬ２５９９ポリペプチド（配列番号１９３）を含んでなるポリペプチド；（ｂ）（ａ）のポリペプチドをコードする遺伝子と同じオペロンに由来する遺伝子によりコードされるポリペプチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチド；（ｄ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドの配列と全体が少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；または（ｅ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの少なくとも１３個の連続したアミノ酸を含んでなる免疫原性変異体を含んでなるポリペプチドを発現する、項目２３に記載の構築物。
項目２５：弱毒生型の黄色ブドウ球菌が、安定化した小コロニー変異体（ＳＣＶ）表現型を有する、項目２３または２４に記載の組成物。
項目２６：アジュバントが、ミョウバン、油（例えば、乳化油、鉱油）、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ－Ａ（商標））、環状ジグアノシン－５’－一リン酸（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ）、ポリホスファジン、インドリシジン、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）、またはそのうち少なくとも２つの組み合わせを含んでなる、項目２３～２５のいずれか一項に記載の組成物。
項目２７：哺乳類におけるブドウ球菌乳腺内感染（ＩＭＩ）を予防および／または処置する方法であって、項目１～１６のいずれか一項に定義される構築物；項目１７に定義される核酸分子；項目１８に定義されるベクター；項目１９～２２のいずれか一項に定義される細胞；または項目２３～２６に定義される組成物の有効量を前記哺乳類に投与することを含んでなる、方法。
項目２８：前記ブドウ球菌ＩＭＩが、１つ以上の黄色ブドウ球菌株によって引き起こされる、項目２７に記載の方法。
項目２９：前記哺乳類が雌ウシである、項目２７または２８に記載の方法。
項目３０：哺乳類におけるブドウ球菌乳腺内感染（ＩＭＩ）を予防および／または処置するための、（ｉ）項目１～１６のいずれか一項に定義される構築物；（ｉｉ）項目１７に定義される核酸分子；（ｉｉｉ）項目１８に定義されるベクター；項目１９～２２のいずれか一項に定義される細胞；（ｉｖ）項目２３～２６のいずれか一項に定義される組成物；または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のうち少なくとも２つの組み合わせの有効量の使用。
項目３１：前記ブドウ球菌ＩＭＩが、１つ以上の黄色ブドウ球菌株によって引き起こされる、項目３０に記載の使用。
項目３２：前記哺乳類が雌ウシである、項目３０または３１に記載の使用。
項目３３：哺乳類におけるブドウ球菌乳腺内感染（ＩＭＩ）の予防および／または処置に使用するための、項目１～１６のいずれか一項に定義される構築物；項目１７に定義される核酸分子；項目１８に定義されるベクター；項目１９～２２のいずれか一項に定義される細胞；項目２３～２６のいずれか一項に定義される組成物またはそのうち少なくとも２つの組み合わせ。
項目３４：前記ブドウ球菌ＩＭＩが、１つ以上の黄色ブドウ球菌株によって引き起こされる、項目３３に記載の構築物、核酸分子、ベクター、細胞、組成物または組み合わせ。
項目３５：前記哺乳類が雌ウシである、項目３３または３４に記載の構築物、核酸分子、ベクター、細胞または組成物。
項目３６：（Ａ）（ｉ）項目１～１６のいずれか一項に定義される構築物のうち少なくとも１つ；（ｉｉ）項目１７に定義される核酸分子のうち少なくとも１つ；（ｉｉｉ）項目１８に定義されるベクターのうち少なくとも１つ；（ｉｖ）項目１９～２２のいずれか一項に定義される細胞のうち少なくとも１つ；または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のうち少なくとも２つの組み合わせ、および（Ｂ）（ｉ）項目１～１１のいずれか一項に定義されるポリペプチド；（ｉｉ）弱毒生型黄色ブドウ球菌；（ｉｉｉ）薬学的に許容可能な賦形剤；（ｉｖ）アジュバント；（ｖ）哺乳類におけるブドウ球菌乳腺内感染（ＩＭＩ）を予防および／または処置するためのキットの使用に関する使用説明書；または（ｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうち少なくとも２つの組み合わせを含んでなる、哺乳類におけるブドウ球菌乳腺内感染（ＩＭＩ）を予防および／または処置するためのキット。
添付図面において、
図１Ａ～Ｄは、ワクチンの各抗原、すなわちＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ１８６７、ＳＡＣＯＬ１９１２およびＳＡＣＯＬ２３８５に関する、２回目の免疫化の４週後（実験感染の直前）におけるワクチン接種（９）雌ウシおよびプラセボ（１０）雌ウシの血清中総ＩｇＧ（図１Ａ）、ＩｇＧ１（図１Ｂ）およびＩｇＧ２（図１Ｃ）力価を示す。図１Ｄでは、ワクチン接種雌ウシに対してＩｇＧ２／ＩｇＧ１比を示している。図１Ａ、ＢおよびＣでは、白丸（○）は、ワクチン接種雌ウシのデータを表し、黒四角（黒四角）は、プラセボ雌ウシのデータを表す。各記号は、１頭の雌ウシに対する力価を表す。水平線は中央値を表す。破線は、ワクチン接種雌ウシに対する中央値を表し、一方、実線は、プラセボ雌ウシに対する中央値を表す。図１Ａ、ＢおよびＣでは、ワクチン接種雌ウシに対する力価は、プラセボ雌ウシに対する力価より高い（Ｐ＜０．０００１）。図１Ｄでは、記号は、各雌ウシに対するＩｇＧ２／ＩｇＧ１比を表す。水平線は中央値を表す。異なる文字は、統計学的差を示す。＊＊＊，Ｐ＜０．００１。 図２は、各抗原に関する、２回目の免疫化の４週後におけるワクチン接種雌ウシ（９）およびプラセボ雌ウシ（１０）に由来する血中ＣＤ４＋細胞の抗原依存的増殖を示す。各記号は、陽性対照（ＣｏｎＡ）または各抗原、すなわちＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ１８６７、ＳＡＣＯＬ１９１２およびＳＡＣＯＬ２３８５によるインキュベーションの１週後における、各雌ウシに対する増殖しているＣＤ４＋細胞の割合を示す。白丸（○）は、ワクチン接種雌ウシのデータを表し、黒四角（黒四角）は、プラセボ雌ウシのデータを表す。水平線は中央値を表す。破線は、ワクチン接種雌ウシに対する中央値を表し、一方、実線は、プラセボ雌ウシに対する中央値を表す。統計解析：ＳＡＳの混合手順。記号＊は、抗原ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ１９１２に関するワクチン接種群とプラセボ群との間の統計学的差を示す（＊，Ｐ＜０．０５）。さらに、ＣＤ８＋細胞の増殖は、全抗原に関してワクチン接種雌ウシとプラセボ雌ウシとで同程度であったが、抗原ＳＡＣＯＬ０７２０は例外で、ＣＤ８＋細胞の高い増殖がワクチン接種雌ウシに認められた（データ未掲載）。 図３は、乳牛における実験的黄色ブドウ球菌乳腺内感染を示す。２回目の免疫化の４週後および４日後に、黄色ブドウ球菌の６３コロニー形成単位（ＣＦＵ）を、夕方の搾乳時に、ワクチン接種雌ウシ（９）およびプラセボ雌ウシ（１０）の４乳区のうち３乳区に注入した（１日目、図３中の矢印）。朝の搾乳時に無菌乳試料を採取し、体細胞数（ＳＣＣ）をＶａｌａｃｔａ社（サン＝タンヌ＝ド＝ベルビュー、ケベック州）が測定した。白丸（○）および破線は、ワクチン接種雌ウシのデータを表し、一方、黒四角（黒四角）および実線は、プラセボ雌ウシのデータを表す。各白丸は、ワクチン接種雌ウシの全感染乳区（２７）に対するＳＣＣの平均を表し、各四角は、プラセボ雌ウシの全感染乳区（３０乳区）に対するＳＣＣの平均を表す。負荷期にわたり、乳中体細胞数は、プラセボ雌ウシよりもワクチン接種雌ウシにおいて有意に低いことが認められた（＊＊＊；Ｐ＜０．００１）。 図４Ａ～Ｃ 図４Ａは、各雌ウシに対するＣＦＵとＳＣＣとの相関を示し、図４Ｂは、各雌ウシに関するＳＡＣＯＬ０４４２に対する血清中ＩｇＧ１力価とＳＣＣとの相関を示す。各記号は、１頭の雌ウシのデータを表す。図４Ａでは、各記号は、感染症の最初から最後までの３感染乳区に対するＳＣＣおよびＣＦＵの平均を表す。図４Ｂでは、各記号は、感染症の最初から最後までの３感染乳区に対するＳＣＣの平均と、２回目の免疫化の４週後および実験感染の直前におけるＳＡＣＯＬ０４４２に対する血清中ＩｇＧ１力価を表す。白丸は、ワクチン接種雌ウシのデータを表し、黒四角は、プラセボ雌ウシのデータを表す。ＳＣＣ／ｍｌとＣＦＵ／ｍｌとの間には強い相関が認められ、ＳＣＣとＳＡＣＯＬ０４４２に対するＩｇＧ１力価との間には負の相関が認められる。図４Ｃでは、実験感染の１０日後（２回目の免疫化の６週後）における各雌ウシに対して、ＳＡＣＯＬ００２９に対する乳中ＩｇＧ２力価とＳＣＣまたはＣＦＵとの相関を示している。各記号は、実験感染１０日後の１頭の雌ウシのデータを表す。朝の搾乳時に無菌乳試料を採取し、黄色ブドウ球菌の生菌数は、１０倍希釈およびトリプティックソイ寒天（ＴＳＡ）プレートへの播種により測定し、一方、ＳＣＣは、Ｖａｌａｃｔａ社（サン＝タンヌ＝ド＝ベルビュー、ケベック州）が測定した。各雌ウシに対するＳＣＣおよびＣＦＵデータは、実験感染１０日後における３感染乳区に対するデータの平均を表す。乳中ＩｇＧ２力価の測定のための乳試料は、実験感染１０日後（２回目の免疫化の６週後）における各雌ウシの４乳区からの等量の乳の混合物である。黒四角（黒四角）は、プラセボ雌ウシのデータを表し、白丸（○）は、ワクチン接種雌ウシのデータを表す。 図５は、融合抗原ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７（ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７として示す）ならびに抗原ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０を含んでなるワクチンの各抗原に関する、ワクチン接種雌ウシに対する血清中総ＩｇＧ力価を示す。ＥＬＩＳＡでは、標的抗原は、ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７、ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ１８６７、ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０であった。各白丸は、１１頭の雌ウシの各々に対する２回目の免疫化の４週後における力価を表し、一方、各黒菱形は、免疫前力価を表す。水平線は中央値を表す。実線は、免疫前血清に対する中央値を表し、点線は、免疫化の４週後に採取した試料に対する中央値を表す。ワクチン接種雌ウシに対する力価は、免疫前血清の力価より高い（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，試験した他の抗原に対するＰ＜０．００１）。 図６は、等モル量での融合タンパク質（ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７；融合物）、別々のタンパク質の組み合わせ（ＳＡＣＯＬ００２９＋ＳＡＣＯＬ１８６７；組み合わせ）、ＳＡＣＯＬ００２９タンパク質のみ（００２９）またはＳＡＣＯＬ１８６７タンパク質のみ（１８６７）で免疫化したマウスのＳＡＣＯＬ１８６７抗原に対する血清中総ＩｇＧ力価を示す。白丸（○）は、免疫前力価のデータを表し、黒四角（黒四角）は、免疫力価のデータを表す。免疫前力価に関しては、各免疫化群のマウス５匹の間で免疫前血清を等しく混合し、免疫前プール力価（１群あたり１個の白丸で表した）を得た。免疫力価に関しては、各四角記号は、マウス１匹に対する力価を表す。水平線は中央値を表す。黒線は、免疫血清に対する中央値を表し、一方、破線（および白丸）は、免疫前血清プールの力価に対する中央値を表す。融合物群、組み合わせ群および１８６７群におけるワクチン接種マウスの力価は、免疫前マウスの力価よりも高く（Ｐ＜０．００１）、ＳＡＣＯＬ００２９一価抗原のみを投与されたマウスの力価は、ＳＡＣＯＬ１８６７に対する免疫前プールの力価と有意差があるとは認められなかった。組み合わせ群および２つの一価ワクチン群に対する融合物群の免疫力価の統計学的有意性が示されている（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。 図７ ＳＡＣＯＬ０４４２のアミノ酸配列（ＧＥＨＬＰＫＧＮＩＶＩＮＴＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱＫＤＲＥＮＶＫＩＮＴＡＤ、配列番号２）のフラグメントに含有されるＢ細胞エピトープ配列ＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）に対するものであり、かつ、ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０からコードされるペプチドの融合物ＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＫＤＩＮＫＩＹＦＭＴＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤ（配列番号３）（群１）またはＳＡＣＯＬ０４４２からコードされるペプチドＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）（群２）のいずれかで免疫化したマウスから得た血清中総ＩｇＧ（ＥＬＩＳＡアッセイにおいて光学密度４５０ｎｍにより測定）。各群は、等モル量の配列ＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）（群１ではＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＫＤＩＮＫＩＹＦＭＴＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤ（配列番号３）１００μｇおよび群２ではＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）３１．２５μｇに相当）で、２週間間隔で２回注入された４匹（ｎ＝４）から構成され、最後の注入の１週後に採取した血液から血清を調製した。ＥＬＩＳＡアッセイは、１０００００倍に希釈した血清試料を用いて実施し、ＳＡＣＯＬ０４４２からのフラグメント（ＧＥＨＬＰＫＧＮＩＶＩＮＴＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱＫＤＲＥＮＶＫＩＮＴＡＤ、（配列番号２））を、ペプチドエピトープＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）を含有する標的抗原として用いた。個々のデータは、グラフ上の円およびバーによる中央値として表している。群間差は、統計学的に有意であることが認められた（Ｐ＜０．０２８６、クラスカル・ワリス(Kuskal-Wallis)検定、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）７．００）。 図８Ａ～Ｂ 黄色ブドウ球菌のＡＴＣＣ２９２１３およびΔ７２０株におけるｈｅｍＢの欠失。（図８Ａ）野生型（ＷＴ）株ＡＴＣＣ２９２１３およびその同質遺伝子変異体Δ７２０におけるｈｅｍＢ遺伝子を、相同組換えおよびｅｒｍＡカセットとの置換により欠失させ、それぞれ変異体株ΔｈｅｍＢおよびΔ７２０ΔｈｅｍＢを作製した。太線および数字は、親（１）株およびｈｅｍＢ欠失（２）株に関するＢに示したＰＣＲ増幅領域を表す。（図８Ｂ）ＷＴ株およびその同質遺伝子ΔｈｅｍＢ変異体のＰＣＲ産物（Δ７２０株およびΔ７２０ΔｈｅｍＢ株でも同様の結果が得られた）。 図９Ａ～Ｃは、ＭＡＣ－Ｔ細胞の感染性に対する黄色ブドウ球菌ΔｈｅｍＢ、Δ７２０およびΔｈｅｍＢΔ７２０変異の影響を示す。ＭＡＣ－Ｔ細胞を、４つの各株で３時間感染させた後、リゾスタフィンでさらに３０分（ｔ＝３ｈ）、１２時間または２４時間インキュベートし、生存細胞内細菌（ＣＦＵ）の測定のために溶解した。（図９Ａ）Δ７２０および（図９Ｂ）ΔｈｅｍＢΔ７２０変異体に関するｔ＝３ｈにおいて細胞内に認められた最初の接種材料の相対回収率。結果は、それぞれＡＴＣＣ２９２１３（ＷＴ）またはΔｈｅｍＢに対して得られた結果に従って正規化しており、ＳＤとともに平均で表している（＊＊，Ｐ≦０．０１；＊＊＊，Ｐ≦０．００１；対応のないｔ検定）。（図９Ｃ）１２時間（左）および２４時間（右）におけるＷＴおよび変異体に関する細胞内ＣＦＵの平均およびＳＤ。２元配置分散分析およびチューキーの多重比較検定を用いた（＊：Ｐ≦０．０５；＊＊＊：Ｐ≦０．００１）。すべての値は、３つの独立した実験（各々３回実施）の平均を示す。 図１０は、ＭＡＣ－Ｔ細胞内の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３（ＷＴ）および同質遺伝子変異体の経時的な持続を示す。ＭＡＣ－Ｔ細胞を、４つの各株で３時間感染させた後、リゾスタフィンでさらに３０分、１２時間または２４時間インキュベートし、細胞内細菌（ＣＦＵ）の測定のために溶解した。細胞内細菌のＣＦＵは、１０を底とする対数値で変換した後の最初の接種材料の割合として表している（Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ）。値は、標準偏差とともに、３つの独立した３回の実験の平均を示す。 図１１Ａ～Ｂは、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３（ＷＴ）および同質遺伝子変異体によって感染されたＭＡＣ－Ｔ細胞の生存率を示す。ＭＡＣ－Ｔ細胞を、４つの各株で３時間感染させた後、リゾスタフィンで１２時間（図１１Ａ）または２４時間（図１１Ｂ）インキュベートした。次に、Kubica et al., 2008に記載の方法を用いて、ＭＴＴ生存率アッセイを実施した。結果は、非感染細胞と比較した生存率として報告しており、３回実施した３つの独立した実験の平均とともにＳＤとして表している。（Φ）の記号を付した統計学的有意性は、ＷＴに対して比較している（２元配置分散分析およびチューキーの多重比較検定：＊またはΦ：Ｐ≦０．０５；＊＊：Ｐ≦０．０１；＊＊＊：Ｐ≦０．００１；ΦΦΦΦ：Ｐ≦０．０００１）。 図１２は、親（ＷＴ）株およびΔｈｅｍＢΔ７２０（ΔΔ）株によるマウスＩＭＩを示す。マウスを前述のように感染させ、感染後の指定の時間（ｈ）または日（Ｄ）に腺を採取した。各カラムは、腺の群に関する細菌ＣＦＵ数の中央値を表し、範囲はバーで示している。Ｄ７のＷＴ株（腺２個：１匹のみが生存した）を除き、１群あたり最低６個の腺を使用した。特定の時点におけるマウスの死亡率を、矢印で示している。アスタリスクは、腺からΔｈｅｍＢΔ７２０が排除されたこと（１０ＣＦＵ／腺の検出限界未満）を示す。 図１３ 二重変異体（Δ７２０ΔｈｅｍＢ）は、感染後最初の２４時間において、乳腺における好中球の流入を、ＷＴと比較して同レベルまで刺激する。マウスを材料と方法での記載通りに感染させ、対照群（ＰＢＳ）のマウスに滅菌ＰＢＳ注入を行った。腺を指定の時間に採取し、ホモジナイズし、材料と方法での記載通りにＭＰＯ活性について動態学的に分析した。各ドットは、１つの腺に対するＭＰＯ単位を表し、腺のグラムで調整した生の値で示している。平均は太線で表している。 図１４ 黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３（ＷＴ）および二重変異体Δ７２０ΔｈｅｍＢ（ΔΔ）によるマウスＩＭＩの２４時間後の大きなＲ４およびＬ４の乳腺の視覚的炎症。マウスを材料と方法での記載通りに感染させ、対照群（ＰＢＳ）のマウスに滅菌ＰＢＳ注入を行った。写真は、２４時間後に採取した腺を示す。各パネルでは、Ｒ４（左）およびＬ４（右）の腺を示している。 図１５Ａ：二重変異体Δ７２０ΔｈｅｍＢの排除後、好中球浸潤は正常レベルに戻る。マウスを材料と方法での記載通りに感染させ、対照群（ＰＢＳ）のマウスに滅菌ＰＢＳ注入を行った。腺を指定の時間に採取し、ホモジナイズし、材料と方法での記載通りにＭＰＯ活性について動態学的に分析した。カラムは、腺のグラムで調整した６個の腺の群（ＰＢＳ対照では４個）のＭＰＯ単位の平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。感染後の４日目群と１２日目群との間の統計学的有意性を、（Φ）の記号で示している。１元配置分散分析およびチューキーの多重比較検定を用いた（ΦΦ：Ｐ≦０．０１；ＮＳ：群間の有意差なし）。図１５Ｂ～Ｃ：弱毒生二重変異体（Δ７２０ΔｈｅｍＢ）によるマウスの免疫化は、通常認められるｓｐａ型の黄色ブドウ球菌ウシ乳房炎分離菌に対する強い液性応答を刺激する。マウスを前述のように免疫化した。プライミング免疫化前（免疫前）およびブースト免疫化の１０日後（免疫）に血清を採取した。図１５Ｂ．弱毒生株Δ７２０ＧΔｈｅｍＢの増量とともに、ＩｇＧ力価は上昇する。各ドットは、Δ７２０ＧΔｈｅｍＢ全細胞抽出液に対する１匹のマウスの総ＩｇＧ力価を表す。中央値は、免疫力価に関しては太線で、免疫前力価に関しては破線で示している。力価を、それに対応する免疫前力価と比較した（２元配置分散分析およびチューキーの多重比較検定：＊＊＊＊：Ｐ≦０．０００１）。図１５Ｃ．弱毒生変異体Δ７２０ＧΔｈｅｍＢによる免疫化は、通常認められるｓｐａ型の乳腺炎株によって共有される成分に対するＩｇＧ力価を与える。各ドットは、指定の株の全細胞抽出液に対する１匹のマウスの総ＩｇＧ力価を表す。中央値は、免疫力価に関しては太線で、免疫前力価に関しては破線で示している。すべての免疫力価を、それに対応する免疫前力価と比較し（Ｐ≦０．０００１）、臨床株間で比較した（２元配置分散分析およびシダックの多重比較検定：ＮＳ：有意差なし）。 図１６は、タンパク質混合物（抗原ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合物５μｇから構成される）、弱毒生株Δ７２０ΔｈｅｍＢのみ１０５ＣＦＵまたはタンパク質混合物とΔ７２０ΔｈｅｍＢ株の組み合わせで免疫化したマウスのＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合タンパク質に対する血清中総ＩｇＧ力価を示す。白丸（○）は、免疫前力価のデータを表し、黒四角（黒四角）は、免疫力価のデータを表す。各記号は、１匹のマウスに対する力価を表す。水平線は中央値を表す。黒線は、免疫血清に対する中央値を表し、一方、破線は、免疫前血清に対する中央値を表す。タンパク質混合物群および組み合わせ群におけるワクチン接種マウスに対する力価は、免疫前マウスに対する力価より高い（Ｐ＜０．００１）。他の２つのワクチン接種マウス群に対する、組み合わせ群の免疫力価の統計学的有意性が示されている（＊＊：Ｐ＜０．０１）。 図１７は、タンパク質混合物（抗原ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合物５μｇから構成される）、弱毒生株Δ７２０ΔｈｅｍＢのみ１０５ＣＦＵまたはタンパク質混合物とΔ７２０ΔｈｅｍＢ株の組み合わせで免疫化したマウスのＳＡＣＯＬ００２９に対する血清中総ＩｇＧ力価を示す。白丸（○）は、免疫前力価のデータを表し、黒四角（黒四角）は、免疫力価のデータを表す。各記号は、１匹のマウスに対する総ＩｇＧ力価を表す。水平線は中央値を表す。黒線は、免疫血清に対する中央値を表し、一方、破線は、免疫前血清に対する中央値を表す。３つのマウス群の免疫力価と免疫前力価との間の統計学的有意性が示されている（＊＊：Ｐ＜０．０１）。 図１８は、ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７タンパク質混合物、弱毒生株Δ７２０ΔｈｅｍＢのみ１０５ＣＦＵまたはタンパク質混合物とΔ７２０ΔｈｅｍＢの組み合わせで免疫化したマウスに関する、ブドウ球菌表面タンパク質ＣｌｆＡに対する血清中総ＩｇＧ力価を示す。白丸（○）は、免疫前力価のデータを表し、黒四角（黒四角）は、免疫力価のデータを表す。各記号は、１匹のマウスに対する力価を表す。水平線は中央値を表す。黒線は、免疫血清に対する中央値を表し、一方、破線は、免疫前血清に対する中央値を表す。免疫前力価と免疫力価との間の統計学的有意性が示されている（＊：Ｐ＜０．０５）。 下記図１９は、タンパク質混合物、またはタンパク質混合物と弱毒生Δ７２０ΔｈｅｍＢ株の組み合わせで免疫化されたマウスに関する、ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合ポリペプチドに対するＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１力価の血清比を示す。 図２０は、ＳＡＣＯＬ００２９抗原に対する血清比を示す。白四角（□）は、免疫前力価のデータを表し、黒四角（黒四角）は、免疫力価のデータを表す。各記号は、１匹のマウスに対する力価比を表す。水平線は中央値を表す。組み合わせ群の比に対するタンパク質混合物群の統計学的有意性が示されている（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１）。 図２１Ａ～Ｊ Ｉ．ＳＡＣＯＬ００２９ポリヌクレオチド（全長配列、配列番号４）およびポリペプチド（全長、フラグメントおよび変異体配列、配列番号５～９）。選択したエピトープを網掛けおよび／または太字で示している；ＩＩ．ＳＡＣＯＬ０７２０ポリヌクレオチド（全長配列、配列番号１０）およびポリペプチド（全長、フラグメントおよび変異体配列、配列番号１１～２７）。選択したエピトープを網掛けで示している；ＩＩＩ．ＳＡＣＯＬ０４４２ポリヌクレオチド（全長配列、配列番号２８）およびポリペプチド（全長、フラグメントおよび変異体配列、配列番号２９～３６および１）。選択したエピトープを網掛けで示している；ＩＶ．ＳＡＣＯＬ１８６７ポリヌクレオチド（全長配列、配列番号３７）およびポリペプチド（全長、フラグメントおよび変異体配列、配列番号３８～４１）。選択したエピトープを網掛けで示している。予測した膜貫通（http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html）領域を太字で示している；Ｖ．ＳＡＣＯＬ１９１２ポリヌクレオチド（全長配列、配列番号４２）およびポリペプチド（全長および変異体配列、配列番号４３～４４）。選択したエピトープを網掛けで示している（例えば、配列番号４５～４８参照）；ＶＩ．ＳＡＣＯＬ２３８５ポリヌクレオチド（全長、配列番号４９）およびポリペプチド（全長および変異体配列、配列番号５０～５１）。選択したエピトープを網掛けで示している（例えば、配列番号５２～５３参照）；ＶＩＩ．融合物：（ｉ）ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合ポリヌクレオチド配列（配列番号５４および５６）およびポリペプチド配列（配列番号５５、５７～５８）。ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列において、二重下線の配列（ある場合）はポリヒスチジンの配列であり、イタリック体の配列はＳＡＣＯＬ００２９フラグメントの配列であり、一本下線の配列はリンカーの配列であり、太字の配列はＳＡＣＯＬ１８６７フラグメントの配列である；（ｉｉ）ＳＡＣＯＬ０７２０－７２０融合ポリペプチド配列（配列番号２７）。ポリペプチド配列において、二重下線の配列（ある場合）はポリヒスチジンの配列であり、イタリック体の配列はＳＡＣＯＬ０７２０フラグメントの配列であり、一本下線の配列はリンカーの配列である；（ｉｉｉ）ＳＡＣＯＬ０４４２－７２０融合ポリペプチド配列（配列番号３）。ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列において、二重下線の配列（ある場合）はポリヒスチジンの配列であり、イタリック体の配列はＳＡＣＯＬ０４４２フラグメントの配列であり、一本下線の配列はリンカーの配列であり、太字の配列はＳＡＣＯＬ０７２０フラグメントの配列である；ＶＩＩＩ．リンカーの配列（配列番号５９～７０）。 図２２Ａ～Ｄ Ｉ．全長ＳＡＣＯＬ０４４２および相同分子種に対する多重ポリヌクレオチド配列（配列番号７１～７２、２８、７３～８１）アラインメント；ＩＩ．全長ＳＡＣＯＬ０４４２、相同分子種に対する多重ポリペプチド配列（配列番号２９および８２～９２）アラインメントおよびそれに由来するコンセンサス配列を示している。これらの配列において、「＊」は、そのカラム内の残基がアラインメントの全配列において同一であることを表し、「：」は、保存置換が認められていることを表し、「．」は、半保存置換が認められていることを表す。これらのアラインメントに由来するコンセンサス配列も示しており、Ｘはいずれかのアミノ酸である。ポリペプチド配列において、選択したエピトープを網掛けで示している（例えば、配列番号１、３４、９３～９７参照）。 図２３Ａ～Ｋ Ｉ．全長ＳＡＣＯＬ０７２０および相同分子種に対する多重ポリヌクレオチド配列（配列番号９８～１０４、１０および１０５～１０８）アラインメント；ＩＩ．全長ＳＡＣＯＬ０７２０、相同分子種に対する多重ポリペプチド配列（配列番号１１および１０９～１２０）アラインメントおよびそれに由来するコンセンサス配列を示している。これらの配列において、「＊」は、そのカラム内の残基がアラインメントの全配列において同一であることを表し、「：」は、保存置換が認められていることを表し、「．」は、半保存置換が認められていることを表す。これらのアラインメントに由来するコンセンサス配列も示しており、Ｘはいずれかのアミノ酸である。ポリペプチド配列において、選択したエピトープを網掛けで示している（例えば、配列番号２２、１９および２１参照）。 図２４ 全長ＳＡＣＯＬ００２９、相同分子種に対する多重ポリペプチド配列（配列番号５および１２１～１３１）アラインメントおよびそれに由来するコンセンサス配列を示している。これらの配列において、「＊」は、そのカラム内の残基がアラインメントの全配列において同一であることを表し、「：」は、保存置換が認められていることを表し、「．」は、半保存置換が認められていることを表す。これらのアラインメントに由来するコンセンサス配列も示しており、Ｘはいずれかのアミノ酸である。ポリペプチド配列において、選択したエピトープを網掛けで示している（例えば、配列番号１３２～１３９参照）。太字のエピトープは、ＢＣＰｒｅｄ（商標）で同定されたものである。網掛けのエピトープは、ＡＡｐ予測で同定されたものである。 図２５Ａ～Ｄ Ｉ－全長ＳＡＣＯＬ１８６７および相同分子種に対する多重ポリヌクレオチド配列（配列番号１４０～１５１）アラインメント；ＩＩ－全長ＳＡＣＯＬ１８６７、相同分子種に対する多重ポリペプチド配列（配列番号１５２～１６４）アラインメントおよびそれに由来するコンセンサス配列を示している。これらの配列において、「＊」は、そのカラム内の残基がアラインメントの全配列において同一であることを表し、「：」は、保存置換が認められていることを表し、「．」は、半保存置換が認められていることを表す。これらのアラインメントに由来するコンセンサス配列も示しており、Ｘはいずれかのアミノ酸である。ポリペプチド配列において、選択したエピトープを網掛けで示しており（例えば、配列番号１６５～１８０参照）、シグナルペプチド領域および／または膜貫通領域の末端は、線を付している（シグナルペプチドおよび／または膜貫通領域の分泌型からの分離）。 図２６ Ｉ－全長ＳＡＣＯＬ１７１５（ｈｅｍＢ）に対するポリヌクレオチド配列（配列番号１８１）；およびＩＩ－全長ＳＡＣＯＬ１７１５（ｈｅｍＢ）に対するアミノ酸配列（配列番号１８２）。 図２７ Ｉ－全長ＣｌｆＡ（ＮＷＭＮ＿０７５６、ｎｅｗｍａｎ）に対するポリヌクレオチド配列（配列番号１８３）；およびＩＩ－全長ＣｌｆＡに対するアミノ酸配列（配列番号１８４）。
例示的な実施形態の説明
本発明は、２つの抗原の融合物が、免疫応答において予想外の相乗作用を生み出したことを示した。
さらに、本発明は、ｈｅｍＢ（完全欠失のため、侵襲性の表現型への復帰の可能性を損なう（Tuchscherr, 2011））を通じたブドウ球菌のＳＣＶ表現型の安定化も行い、ワクチン送達システムとしてのその使用を可能にした。ＨｅｍＢはＨｅｍＢタンパク質／モノマーをコードしており、ＨｅｍＢタンパク質／モノマーは、組み合わさって、ポルフォビリノーゲン合成酵素またはアミノレブリン酸デヒドラターゼ酵素を産生する［EC 4.2.1.24］。さらに、本発明の抗原、すなわち遺伝子ＳＡＣＯＬ０７２０の不活性化によって、さらなる弱毒化がもたらされた。この遺伝子は、カチオン性ペプチド耐性（Falord, 2012; Kawada-Matsuo, 2011; Meehl, 2007）およびＩＭＩ中のｉｎ ｖｉｖｏ（Allard, 2013）において黄色ブドウ球菌に対して重要であることが以前に示されている。それゆえ、本発明の構築物を発現するこの弱毒二重変異体株は、ＩＭＩに対する免疫化および防御に使用可能である。
一般的な定義
見出しおよびその他の識別子、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）、（ｉｉ）などは、明細書および請求項を単に読みやすくするために示している。明細書または請求項における見出しまたはその他の識別子の使用は、工程または要素をアルファベット順もしくは番号順またはそれらが示される順番で実施することを必ずしも必要とするわけではない。
本明細書において、多数の用語が広範に使用される。そのような用語が示される範囲を含む、明細書および請求項を明確かつ一貫して理解するために、以下の定義が提供される。
請求項および／または明細書において用語「を含んでなる」とともに使用する場合の単語「１つ（a）」または「１つ（an）」の使用は、「１つ（one）」を意味し得るが、「１つ以上（one or more）」、「少なくとも１つ」および「１つ以上（one or more than one）」の意味にも一致する。
本明細書を通じて、用語「約」は、値が、その値を測定するのに用いられるデバイスまたは方法における誤差の標準偏差を含むことを示すのに用いられる。一般に、用語「約」は、最大１０％の変動の可能性を示すことを意図されている。したがって、値の１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０％の変動は、用語「約」に含まれる。特に断りのない限り、範囲の前の用語「約」の使用は、範囲の両端に適用される。
本明細書および請求項で使用するとき、単語「含んでなる（comprising）」（ならびに「含んでなる（comprise）」および「含んでなる（comprises）」などのいずれの形式の「含んでなる（comprising）」）、「有する（having）」（ならびに「有する（have）」および「有する（has）」などのいずれの形式の「有する（having）」）、「含む（including）」（ならびに「含む（includes）」および「含む（include）」などのいずれの形式の「含む（including）」）または「含有する（containing）」（ならびに「含有する（contains）および「含有する（contain）」などのいずれの形式の「含有する（containing）」」は、包括的すなわち非制限的であり、それ以外の列挙されない要素または方法工程を排除しない。
本明細書で使用する場合、用語「からなる（consists of）」または「からなる（consisting of）」は、特定の請求項に係る実施形態または請求項において具体的に列挙される要素、工程または成分のみを含むことを意味する。
ポリペプチド、核酸および送達システム
本明細書で使用する場合、用語「ワクチン」は、宿主において免疫応答を誘導／惹起でき、感染症および／または疾患の処置および／または予防が可能ないずれの化合物／剤（「ワクチン成分」）またはその組み合わせを意味する。したがって、そのような剤の非限定的な例としては、タンパク質、ポリペプチド、タンパク質／ポリペプチドフラグメント、免疫原、抗原、ペプチドエピトープ、エピトープ、タンパク質、ペプチドまたはエピトープの混合物、および別々に添加される、または核酸ワクチンにおいてなどの連続した配列における核酸、遺伝子または遺伝子の部分（目的のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメントをコードする）などが挙げられる。
本発明の一態様では、式Ｉ：
Ｘ－Ａ－リンカー－Ｂ－Ｚ（式（Ｉ））の融合構築物であって、
式中、ＡおよびＢは同一または異なり、各々独立して本発明の抗原性ポリペプチド（すなわち、天然フラグメントまたはその変異体）である、融合構築物が提供される。
特定の実施形態では、Ａおよび／またはＢは、（ａ）図２４に示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ００２９ポリペプチド（配列番号５および１２１～１３１）、ＳＡＣＯＬ０２６４ポリペプチド（配列番号１８５）、図２２Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０４４２ポリペプチド（配列番号２９および８２～９２）、ＳＡＣＯＬ０７１８ポリペプチド（配列番号１８６）、図２３Ｉ～Ｊに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０７２０ポリペプチド（配列番号１１および１０９～１２０）、ＳＡＣＯＬ１３５３ポリペプチド（配列番号１８７）、ＳＡＣＯＬ１４１６ポリペプチド（配列番号１８８）、ＳＡＣＯＬ１６１１（配列番号１８９）、図２５Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ１８６７ポリペプチド（配列番号１５２～１６４）、図２１Ｇ～Ｖに記載のＳＡＣＯＬ１９１２ポリペプチド（配列番号４３）、ＳＡＣＯＬ１９４４（配列番号１９０）、ＳＡＣＯＬ２１４４ポリペプチド（配列番号１９１）、ＳＡＣＯＬ２３６５ポリペプチド（配列番号１９２）、図２１ＨのＶＩに記載のＳＡＣＯＬ２３８５ポリペプチド（配列番号５０）またはＳＡＣＯＬ２５９９ポリペプチド（配列番号１９３）を含んでなるポリペプチドである。特定の実施形態では、上記のポリペプチド（ａ）は、上記で定義されたポリペプチドの分泌型または細胞外フラグメントである。例えば、ソフトウェアＴＭｐｒｅｄ（商標）（ＥｘＰＡＳｙ）http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html、http://www.psort.org/psortb/index.htmlhttp://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.htmlおよび／またはＳｉｇｎｌＰ４．１（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）を用いて、膜貫通領域を予測することができる。ＴＭｐｒｅｄ（商標）およびＳｉｇｎａｌＩＰ４．１は、ＳＡＣＯＬ０７２０：ＡＡ３１０～５０８；ＳＡＣＯＬ０４４２ＡＡ３６～２０３に対する細胞外領域を予測した。Ｅｎｚｉｍは、細胞外領域がＡＡ４１～２３９であるように膜貫通領域ＳＡＣＯＬ１８６７（１～４０）を予測し、一方、http://www.psort.org/psortb/index.html
は、ＳＡＣＯＬ１８６７が細胞外タンパク質であると予測した。上記の膜貫通領域および／またはシグナルペプチド領域は推定上のものであるため、本発明は、本明細書に示す抗原（例えば、ＳＡＣＯＬ１８６７）がシグナルペプチド領域および／または膜貫通領域を有するまたは有さないケースを包含し、対応する細胞外フラグメントを包含する。一実施形態では、上記のポリペプチドは、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）の表面に通常分泌されるまたは発現するポリペプチドである。
本発明が包含する本明細書に記載の黄色ブドウ球菌遺伝子およびそれらにコードされる抗原性ポリペプチドに対するＧｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号を、以下の表Ｉに示す。
Figure 0007181208000004
Figure 0007181208000005
Figure 0007181208000006
Figure 0007181208000007
特定の上記のポリペプチドのアラインメントに由来するコンセンサスを、図２１～２５に示す。これらのコンセンサスの特定の実施形態では、コンセンサス配列（例えば、図２１～２５におけるコンセンサス）における各Ｘは、いずれかのアミノ酸と定義され、または、アラインメントに示される１つ以上の相同分子種においてこの位置が存在しない場合は、存在しないと定義される。これらのコンセンサスの特定の実施形態では、コンセンサス配列における各Ｘは、アラインメントに示される相同分子種の対応する位置でのいずれかのアミノ酸の保存置換もしくは半保存置換を構成するいずれかのアミノ酸と定義され、または、アラインメントに示される１つ以上の相同分子種においてこの位置が存在しない場合は、存在しないと定義される。図２１～２５において、保存的置換は記号「：」で表し、半保存的置換は記号「．」で表している。別の実施形態では、各Ｘは、アラインメントに示される相同分子種の対応する位置でのいずれかのアミノ酸と同じクラスに属するいずれかのアミノ酸を意味し、または、アラインメントに示される１つ以上の相同分子種においてこの位置が存在しない場合は、存在しないことを意味する。別の実施形態では、各Ｘは、アラインメントに示される相同分子種の対応する位置でのいずれかのアミノ酸を意味し、または、アラインメントに示される１つ以上の相同分子種においてこの位置が存在しない場合は、存在しないことを意味する。特定の実施形態では、Ａおよび／またはＢは、これらのコンセンサスのいずれか１つまたはそのフラグメントを満たすポリペプチドである。
保存的アミノ酸変異は、アミノ酸の付加、欠失または置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、本明細書において、類似した化学特性（例えば、サイズ、電荷または極性）を有する別のアミノ酸残基に対するアミノ酸残基の置換と定義される。そのような保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性または酸性アミノ酸の、同じ群の別のアミノ酸（例えば、以下の表ＩＩ参照）に対する置換であり得る。用語「塩基性アミノ酸」とは、通常は生理的ｐＨで正に帯電する、７を超える側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸は、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）およびリジン（ＬｙｓまたはＫ）を含む。用語「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」とも言う）は、生理的ｐＨでは帯電しないが、２個の原子によって共有される電子対がその原子のうちの１つによってより密接に保持されている少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸は、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）およびグルタミン（ＧＩｎまたはＱ）を含む。用語「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」とも言う）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）の正規化コンセンサス疎水性スケールに従って、ゼロより大きい疎水性を示すアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸は、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、イソロイシン（ＨｅまたはＩ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、バリン（ＶａＩまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）およびグリシン（ＧＩｙまたはＧ）を含む。「酸性アミノ酸」は、通常は生理的ｐＨで負に帯電する、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味する。酸性アミノ酸は、グルタミン酸（ＧＩｕまたはＥ）およびアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）を含む。
半保存アミノ酸は、１つの残基を、類似した立体配座を有するが、化学特性を共有しない別の残基と置換する。半保存的置換の例としては、アラニンもしくはロイシンに対するシステインの置換；アスパラギンに対するセリンの置換；トレオニンに対するバリンの置換；またはアラニンに対するプロリンの置換が挙げられるであろう。
Figure 0007181208000008
アミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間の類似性および同一性は、アラインメント後の配列における各位置を比較することにより、判定することができる。類似性および／または同一性を比較するための配列の最適なアラインメントは、種々のアルゴリズムを用いて、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ（商標）、ＳＡＧＡ（商標）、ＵＧＥＮＥ（商標）またはＴ－ｃｏｆｆｅｅ（商標）などの当技術分野で周知の多重配列アラインメントプログラム／ソフトウェアを用いて実施し得る。多重配列アラインメントの例は、以下の実施例において説明しており、図２１Ａ～２５に示している。
遺伝子オペロン
別の実施形態では、Ａおよび／またはＢは、（ｂ）上記で定義された（ａ）のポリペプチドをコードする遺伝子と同じオペロンに由来する遺伝子によりコードされるポリペプチドである。例えば、ＳＡＣＯＬ０７１８は、ＳＡＣＯＬ０７２０と同じオペロンに由来する遺伝子である。
フラグメント
別の実施形態では、Ａおよび／またはＢは、（ｃ）上記で定義された（ａ）または（ｂ）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチドである。
タンパク質／ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、宿主において免疫応答を誘導／惹起できるタンパク質／ポリペプチドの一部と定義される。一実施形態では、免疫原性フラグメントは、タンパク質／ポリペプチドと種類が同じであるが、必ずしも量が同じではない免疫応答を惹起することができる。タンパク質／ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、好ましくは、前記タンパク質／ポリペプチドの１つ以上のエピトープを含んでなる。タンパク質／ポリペプチドのエピトープは、特異抗体および／または前記エピトープに特異的に結合できる受容体を有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）を惹起できる、長さが少なくとも約４または５個のアミノ酸の前記タンパク質／ポリペプチドのフラグメントと定義される。２つの異なる種類のエピトープ、すなわち、直線状エピトープおよび立体構造エピトープが存在する。直線状エピトープは、一続きの連続したアミノ酸を含んでなる。立体構造エピトープは、所定の位置で折り畳まれ、適切に折り畳まれたタンパク質において一緒になってエピトープを形成する数個の一続きの連続したアミノ酸によって、通常形成される。本明細書で使用する免疫原性フラグメントは、前記の種類のエピトープのいずれか１つ、または両方を意味する。免疫原性フラグメントが単独で使用される（すなわち、大きなポリペプチド構築物（例えば、他の抗原性フラグメントとの融合物）において融合されない）一実施形態では、タンパク質／ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、少なくとも１６個のアミノ酸残基を含んでなる。さらなる実施形態では、免疫原性フラグメントは、天然タンパク質／ポリペプチドの少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０または１６０個の連続したアミノ酸を含んでなる。特定の実施形態では、フラグメントは、天然タンパク質／ポリペプチドの少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個または５０個以上の連続したアミノ酸を有する。少なくとも１つの免疫原性フラグメントが、大きなポリペプチド構築物（例えば、他の抗原性ポリペプチド、フラグメントまたはその変異体との融合物）の一部を形成する一実施形態では、免疫原性フラグメントは、ポリペプチドの少なくとも１３個の連続したアミノ酸残基を含んでなる。これらに限定されずに、本発明により包含されるフラグメントは、図２１に示すＳＡＣＯＬ０２９（および（例えば、図２４に示す）ＳＡＣＯＬ０２９相同分子種における対応するフラグメント）；図２１に示すＳＡＣＯＬ０４４２（および（例えば、図２２に示す）ＳＡＣＯＬ０４４２相同分子種における対応するフラグメント）；図２１に示すＳＡＣＯＬ０７２０（および（例えば、図２３に示す）ＳＡＣＯＬ０７２０相同分子種における対応するフラグメント）；ならびに図２１に示すＳＡＣＯＬ１８６７（および（例えば、図２５に示す）ＳＡＣＯＬ１８６７相同分子種における対応するフラグメント）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなる。別の実施形態では、本発明により包含されるフラグメントは、本発明の抗原性タンパク質／ポリペプチド（上記のポリペプチド（ａ））の少なくとも１つのエピトープを含んでなる免疫原性フラグメントを含む。別の実施形態では、本発明により包含されるフラグメントは、図２１～２５のいずれか１つに示す抗原性タンパク質／ポリペプチドのうちいずれか１つにおいて示される（網掛け）少なくとも１つのエピトープを含んでなる免疫原性フラグメントを含む。これらに限定されずに、配列中のエピトープは、ＢＣＰｒｅｄ（商標）、ＡＡＰ（商標）、ＦＢＣＰｒｅｄ（商標）およびＡＢＣＰｒｅｄ（商標）などのソフトウェアを用いて予測し得る。
一実施形態では、上記の免疫原性フラグメントは、少なくとも２つの異なる黄色ブドウ球菌株において保存される（すなわち、同一である）配列を含んでなる。さらなる実施形態では、上記の免疫原性フラグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる黄色ブドウ球菌株において保存される（すなわち、同一である）配列を含んでなる。別の実施形態では、上記の黄色ブドウ球菌株は、ＣＯＬ、ＲＦ１２２、ＮＣＴＣ８３２５、ＪＨ１、ＪＨ９、Ｎｅｗｍａｎ、Ｍｕ３、Ｍｕ５０、ＵＳＡ３００－ＦＰＲ３７５７、Ｎ３１５、ＭＷ２またはＭＳＳＡ４７６である。一実施形態では、上記の黄色ブドウ球菌株は、ウシ乳房炎に関連する（例えば、ＲＦ１２２）。
変異体
別の実施形態では、上記のポリペプチド、または前記ポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドは、少なくとも２つの異なる黄色ブドウ球菌株において発現する。本明細書で使用する実質的に同一とは、アミノ酸配列において少なくとも６０％の同一性、実施形態では少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドを意味する。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、それらが比較される他のポリペプチドと、それらのアミノ酸配列において少なくとも６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
別の実施形態では、Ａおよび／またはＢは、（ｄ）上記で定義された（ａ）～（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドの配列と全体が少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである。他の実施形態では、アミノ酸は、（例えば、それらの全長にわたって）（ａ）と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。さらなる実施形態では、アミノ酸は、（ａ）と少なくとも６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。例えば、図２１～２５のアラインメントに示される抗原相同分子種は同一ではないが、それらが比較される抗原またはフラグメントと特定の同一性を示す。これらの図に示されるコンセンサスは、そのようなパーセントの同一性を具体化している。
別の実施形態では、Ａおよび／またはＢは、（ｅ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの少なくとも１３個の連続したアミノ酸を含んでなる免疫原性変異体を含んでなるポリペプチドである。タンパク質／ポリペプチドの免疫原性変異体は、宿主において免疫応答を誘導／惹起できるタンパク質／ポリペプチドの一部と定義される。当業者であれば理解するであろうが、非自然発生的な修飾（例えば、免疫原性変異体）を有し、非修飾剤に特異的な免疫応答を誘導できる（例えば、非修飾剤を認識できる抗体の産生を誘導できる）剤（タンパク質／ポリペプチド、そのフラグメント）も、用語「ワクチン成分」の範囲内である。例えば、本発明のワクチン成分は、それらの活性、安定性および／もしくはバイオアベイラビリティを亢進する、および／またはそれらの毒性を減少させるように修飾され得る。保存的アミノ酸置換は、例えば、酸性側鎖を含んでなるアミノ酸の酸性側鎖を含んでなる別のアミノ酸による置換、嵩高いアミノ酸の別の嵩高いアミノ酸による置換、塩基性側鎖を含んでなるアミノ酸の塩基性側鎖を含んでなる別のアミノ酸による置換などのように、実施し得る。当業者であれば、タンパク質／ポリペプチドの変異体を作製することが十分可能である。これは、例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを通じて、またはペプチド変更プログラムによって実施される。本発明に係る免疫原性変異体は、基本的に、前記タンパク質と種類が同じであるが、必ずしも量が同じではない免疫原特性を有する。本発明のタンパク質/ポリペプチドの免疫原性変異体は、例えば、融合タンパク質および／またはキメラタンパク質を含んでなり得る。例えば、外毒素、エンテロトキシンまたはスーパー抗原と予測される、本明細書で同定されたタンパク質（例えば、ＳＡＣＯＬ０４４２）の生物学的機能は、哺乳類の免疫系および抗体産生と潜在的に干渉する、および／または宿主において多少の毒性を示す可能性がある。ＳＡＣＯＬ０４４２ポリペプチドを、免疫化中に例えばＳＡＣＯＬ０７２０と組み合わせて用いた場合、そのような干渉は認められなかったが、外毒素の生物活性を減少させるために、ワクチン接種に用いたタンパク質またはポリペプチドを修飾することが有用であり得る。そのような目的で、化学物質（例えば、ホルムアルデヒド）で外毒素を不活性化することが可能である。分子生物学的手法を用いて、免疫原性を失うことなく、外毒素活性に関与する推定上の領域を欠失または変異させることも可能である（Chang et al., 2008）。別の例としては、細菌多糖類莢膜またはバイオフィルムにおいて認められるものなど、核酸（例えば、別々に添加される、または連続した配列における遺伝子または遺伝子の部分）炭水化物とアミノ酸ベースの成分との抱合物または混合物が挙げられる。変異体の他の例としては、本明細書でに記載の抗原、または、精製（例えば、親和性精製）に有用な、またはスペーサーもしくはリンカーとして有用なオリゴペプチドを、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかで含んでなる、または抗原配列内に挿入した、そのフラグメントが挙げられる。親和性精製に有用なオリゴペプチドの例としては、ポリヒスチジンタグ（例えば、ＲＧＳタグを含むまたは含まない６～１０個のヒスチジン残基（例えば、ＨＨＨＨＨＨ、ＲＧＳＨＨＨＨＨＨまたはＲＧＳＨＨＨＨＨＧＳ））が挙げられる。ｈｉｓタグの後には、エンドペプチダーゼを用いたポリヒスチジンタグの除去を促進するのに好適な１つのアミノ酸配列が続いてもよい。式（Ｉ）に列挙される「Ｘ」および／または「Ｚ」セグメントは、精製に有用なそのようなオリゴペプチドおよび／または精製に有用なそのようなオリゴペプチドの除去を促進するのに好適な配列を含んでなってもよい。
特定の実施形態では、免疫原性フラグメントは、ポリペプチド（ａ）の少なくとも１つのエピトープを含んでなる。これらに限定されずに、特定の実施形態では、免疫原性フラグメントは、図２１～２５に示す配列において（網掛けで）示されるポリペプチド（ａ）の少なくとも１つのエピトープを含んでなる。他の特定の実施形態では、変異体は、図２１～２５に開示した通りである。
リンカー
融合タンパク質領域間へのリンカーの挿入は、領域間の距離を広げ、構築物の異なるセグメント（例えば、抗原性フラグメント）間の潜在的な斥力を軽減し、その結果、タンパク質フォールディングを改善および／または回復することにより、生物活性を増大することができる。異なる配列のポリペプチドリンカーを使用することができ、それらは、可動性リンカー、剛直リンカーまたは切断可能リンカーなどの異なる特性を有することで知られる。本発明は、例えば、Chen et. al, Adv Drug Deliv Rev. (2013), 65(10):1357-69に記載のリンカーのいずれか１つを含むそのようないずれかのリンカーの使用を包含する。本明細書における実施例では、使用した特定のリンカー（すなわち、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６０）、ＥＲＫＹＫ（配列番号６１）またはＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号６２））、すなわち、２つの連結された領域間の距離を維持し、フォールディングを改善する小さな親水性アミノ酸に富む可動性リンカー構造を図示している。
別の特定の実施形態では、Ｆｃは、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域およびヒンジ領域を含んでなる。別の特定の実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－３およびＩｇＧ－４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常領域である。別の特定の実施形態では、Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ－１の定常領域である。
リンカーは、融合物の連続した抗原間に含まれ得る（例えば、２つの抗原を含んでなる融合物に１つのリンカー、３つの抗原を含んでなる融合物に２つのリンカー、４つの抗原を含んでなる融合物に３つのリンカーなど）。大きなタンパク質領域が用いられる融合物においては、リンカーは大きくてもよく、フラグメントの結晶性領域（Ｆｃ）を含んでなってもよい。
特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列である、または存在しない。特定の実施形態では、リンカーは、グリシン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびリジンからなる群から選択される少なくとも３つの（少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の）アミノ酸を含んでなる。特定の実施形態では、リンカーは、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６３）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６７）；または（ＸＰＸＰＸＰ）ｎ（配列番号６９）（Ｘはいずれかのアミノ酸であり、ｎは１～５のいずれか１つ、より具体的には、１、２、３、４または５である）；ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号６２）；ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号６４）；ＧＧＧＧＳ（配列番号６７）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６０）；ＸＰＸＰＸＰ（配列番号６９）（Ｘはいずれかのアミノ酸である）；ＸＰＸＰＸＰＸＰＸＰＸＰ（配列番号７０）（Ｘはいずれかのアミノ酸である）；ＥＲＫＹＫ（配列番号６１）；ＥＲＫＹＫＥＲＫＹＫ（配列番号６５）；ＥＲＫＹＫＥＲＫＹＫＥＲＫＹＫ（配列番号６６）である。さらに特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６０）、ＥＲＫＹＫ（配列番号６１）またはＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号６２）である。
構築物のＮ末端およびＣ末端
ＸおよびＺは、それぞれ独立して、存在しない、または少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列である。これらに限定されずに、それらは、クローニング戦略の結果得られる１つ以上のアミノ酸、構築物（例えば、ポリヒスチジン）の精製を促進するために用いられるアミノ酸、エンドペプチダーゼを用いた精製タグの除去を促進するのに好適なアミノ酸であり得る。融合構築物が３つ以上の抗原ポリペプチドを含んでなる特定の実施形態では、Ｘおよび／またはＺのいずれか１つは、さらなる抗原（抗原Ｃ、抗原Ｄなど）の配列、および任意選択で、少なくとも１つのさらなるリンカーの配列を含んでもよい。Ｘおよび／またはＺが１つ以上のさらなる抗原および任意選択でリンカーを含んでなるそのような実施形態は、例えば、以下の式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）、すなわち、融合物が少なくとも３つの抗原を含んでなる場合はＸ’－Ｃ－リンカー１－Ａ－リンカー２－Ｂ－Ｚ’（ＩＩ）；または融合物が少なくとも４つの抗原を含んでなる場合はＸ’－Ｃ－リンカー１－Ａ－リンカー２－Ｂ－リンカー３－Ｄ－Ｚ’（ＩＩＩ）として、より具体的に示される。式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の両方において、Ｘ’、Ｚ’、リンカー１、リンカー２および該当する場合はリンカー３は、同一または異なり、本明細書で定義される式（Ｉ）におけるＸ、Ｚおよびリンカーとして独立して定義される。
したがって、特定の実施形態では、融合構築物は、２、３、４個以上の抗原ポリペプチド（および該当する場合はさらなるリンカー）を含んでなる。さらに特定の実施形態では、これらに限定されずに、融合構築物は、ＳＡＣＯＬ００２９＿ＳＡＣＯＬ０４４２；ＳＡＣＯＬ００２９＿ＳＡＣＯＬ０７２０；ＳＡＣＯＬ００２９＿ＳＡＣＯＬ１８６７；ＳＡＣＯＬ００２９＿ＳＡＣＯＬ０７２０＿ＳＡＣＯＬ１８６７；ＳＡＣＯＬ００２９＿ＳＡＣＯＬ１８６７＿ＳＡＣＯＬ０４４２；ＳＡＣＯＬ００２９＿ＳＡＣＯＬ０７２０＿ＳＡＣＯＬ０４４２；ＳＡＣＯＬ０４４２＿ＳＡＣＯＬ００２９＿ＳＡＣＯＬ０７２０；ＳＡＣＯＬ０４４２＿ＳＡＣＯＬ００２９＿ＳＡＣＯＬ１８６７；ＳＡＣＯＬ０４４２＿ＳＡＣＯＬ１８６７＿ＳＡＣＯＬ０７２０；ＳＡＣＯＬ０７２０＿ＳＡＣＯＬ０４４２＿ＳＡＣＯＬ１８６７；もしくはＳＡＣＯＬ００２９＿ＳＡＣＯＬ１８６７＿ＳＡＣＯＬ０７２０＿ＳＡＣＯＬ０４４２、または抗原ポリペプチドがいずれかのその他の順番である前述の構築物のいずれかであり得る。
組み合わせ
本発明の構築物は、本発明の組成物（例えば、ワクチン）の単独の免疫原性成分として、または、１つ以上のさらなる融合構築物、免疫原性ポリペプチド、フラグメントもしくはその変異体および／または（融合構築物および／またはポリペプチド、フラグメントもしくはその変異体を発現している、またはしていない）弱毒生細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）と組み合わせて使用し得る。
１つ以上の融合構築物は、上記で定義されるさらなる融合構築物を含むいずれかの免疫原性融合構築物であり得る（例えば、例１４参照）。
本発明の組成物に使用するための１つ以上の免疫原性ポリペプチド、フラグメントまたはその変異体は、本明細書で定義される本発明の組成物の免疫原性に寄与するいずれかのポリペプチド、フラグメントまたは変異体であり得る。これらに限定されずに、そのようなポリペプチド、フラグメントまたは変異体は、上記で定義される、図２４に示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ００２９ポリペプチド（配列番号５および１２１～１３１）、ＳＡＣＯＬ０２６４ポリペプチド（配列番号１８５）、図２２Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０４４２ポリペプチド（配列番号２９および８２～９２）、ＳＡＣＯＬ０７１８ポリペプチド（配列番号１８６）、図２３Ｉ～Ｋに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ０７２０ポリペプチド（配列番号１１および１０９～１２０）、ＳＡＣＯＬ１３５３ポリペプチド（配列番号１８７）、ＳＡＣＯＬ１４１６ポリペプチド（配列番号１８８）、ＳＡＣＯＬ１６１１（配列番号１８９）、図２５Ｄに示す配列のいずれか１つに記載のＳＡＣＯＬ１８６７ポリペプチド（配列番号１５２～１６４）、ＳＡＣＯＬ１９１２ポリペプチド（配列番号４３）、ＳＡＣＯＬ１９４４ポリペプチド（配列番号１９０）、ＳＡＣＯＬ２１４４ポリペプチド（配列番号１９１）、ＳＡＣＯＬ２３６５ポリペプチド（配列番号１９２）、ＳＡＣＯＬ２３８５ポリペプチド（配列番号５０）またはＳＡＣＯＬ２５９９ポリペプチド（配列番号１９３）を含んでなるポリペプチド；（ｂ）（ａ）のポリペプチドをコードする遺伝子と同じオペロンに由来する遺伝子によりコードされるポリペプチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の少なくとも１３個の連続したアミノ酸の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチド；（ｄ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つのポリペプチドの配列と全体が少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；または（ｅ）（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの少なくとも１３個の連続したアミノ酸を含んでなる免疫原性変異体を含んでなるポリペプチド、を含む。これらに限定されずに、いずれのそのようなポリペプチド、フラグメントまたは変異体も、例１～１４および２１～２６に例示される組成物（例えば、ワクチン番号１～８）に含まれるものを包含する。
弱毒生細菌
本発明の組成物に使用するための弱毒生細菌（例えば、黄色ブドウ球菌）は、本発明の融合構築物および／またはポリペプチド、フラグメントもしくはその変異体と独立していてよく、または、本発明のそのような融合構築物および／またはポリペプチド、フラグメントもしくはその変異体のための容器（すなわち、それらを発現するもの）であってもよい。
これらに限定されずに、本明細書に示されるように、本発明の組み合わせの文脈において有用な弱毒生細菌は、変異もしくは欠失した、ビルレンスに寄与する（例えば、Δ７２０）または宿主における適応度に寄与する（例えば、代謝関連遺伝子）少なくとも１つの遺伝子を有するブドウ球菌（例えば、黄色ブドウ球菌）を含む。これらに限定されずに、そのような遺伝子は、Novick 2003、Novick 2008またはMaresso and Schneewind 2008において同定された遺伝子のいずれか１つであってもよい。
さらなる実施形態では、弱毒生細菌は、安定化したＳＣＶ表現型を有することによって、さらに弱毒化され得る。本明細書で使用する場合、用語「ＳＣＶ表現型」とは、緩徐な増殖を引き起こす機能障害性の酸化的代謝、ビルレンス因子の発現の変化、および宿主細胞に内部移行する能力を有する細菌を意味する。本明細書で使用する場合、用語「安定化したＳＣＶ表現型」は、ＳＣＶ表現型を保持する、すなわち、侵襲性の復帰変異体を産生できない（すなわち、通常の増殖表現型への復帰）ＳＣＶ株を表すのに用いられる。そのような安定化したＳＣＶの黄色ブドウ球菌は、以下の表ＩＩＩに記載の遺伝子（例えば、ΔｈｅｍＢ）のいずれか１つを変異または欠失させることにより、産生し得る。限定されずに、本発明は、例１５～２５に例示する安定化したＳＣＶの黄色ブドウ球菌の使用を包含する。本明細書で使用する変異は、本発明の遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を防止する、または機能性ポリペプチドの発現を防止する１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含む。好ましい実施形態では、変異は、ポリペプチドの発現を防止する。別の特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌の同じ弱毒生株または不活性化株における２つの変異は、欠失または挿入である。ポリペプチドの発現を防止する本発明の遺伝子の１つのいずれかの位置での変異を有する黄色ブドウ球菌の変異株を、本発明に従って弱毒生ワクチンとして使用できることが期待される。弱毒生ワクチン、すなわち、本発明に係る細菌を弱毒生型で含んでなるワクチンは、感染の自然な様式を最もよく模倣している不活性化ワクチンに勝る利点を有する。さらに、そのワクチンの複製能力は、少量の細菌でのワクチン接種を可能とする。そのワクチンの数は、免疫系のトリガーレベルに達するまで、自動的に増加する。その瞬間から、免疫系は惹起され、最終的に細菌を排除する。しかし、弱毒生細菌を使用することの小さな不利点は、本質的に特定レベルのビルレンスが残ることである可能性がある。このことは、ビルレンスレベルが許容可能である限り、すなわち、ワクチンが細菌感染症（例えば、ＩＭＩ）症状を少なくとも減少させる限り、必ずしも本当の不利点とはならない。もちろん、弱毒生ワクチンの残存するビルレンスが低いほど、ワクチン接種がワクチン接種中／後に体重増加に及ぼす影響は小さくなる。
Figure 0007181208000009
核酸
本発明の核酸は、好ましくは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルなどの遺伝子発現に必要な調節エレメントに操作可能なように結合した上記の１つ以上のタンパク質／ポリペプチド（またはそのフラグメント）をコードするヌクレオチド配列を含んでなる。調節エレメントは、好ましくは、投与される種において操作可能な選択されたものである。特定の実施形態では、核酸は図２１～２５に示す通りである。
本発明の文脈において、本発明の核酸の哺乳類へのｉｎ ｖｉｖｏ投与は、目的の１つ以上のタンパク質／ポリペプチド（またはそのフラグメント）が、哺乳類において発現されるようにするものである（例えば、核酸ワクチン、ＤＮＡまたはＲＮＡワクチン）。
送達システム
本ワクチンの核酸は、「ネイキッド（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡであり得、または操作可能なようにベクターに組み込むことができる。核酸は、ＤＮＡの直接注入、受容体を介したＤＮＡの取り込み、ウイルスを介したトランスフェクションまたは非ウイルストランスフェクションおよび脂質ベースのトランスフェクション（そのすべてがベクターの使用に関与し得る）などの当技術分野で周知の方法を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞に送達し得る。直接注入は、ネイキッドＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで細胞内に導入するのに用いられている（例えば、Acsadi et al. (1991) Nature 332:815-818; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468参照）。ＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで細胞内に注入するための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）を用い得る。そのような装置は、市販の装置（例えば、ＢｉｏＲａｄ社製）でもよい。ネイキッドＤＮＡは、細胞表面受容体に対するリガンドと共役するポリリジンなどのカチオンに対してＤＮＡを組み合わせることにより、細胞内に導入してもよい（例えば、Wu, G. and Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967；および米国特許第５，１６６，３２０号参照）。受容体へのＤＮＡリガンド複合体の結合は、受容体依存性エンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みを促進し得る。細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するために、エンドソームを破壊することにより物質を細胞質内に放出するアデノウイルスカプシドに結合するＤＮＡリガンド複合体を用いてもよい（例えば、Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126参照）。
有用なデリバリーベクターは、生体分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）またはリポソーム、および細胞、ウイルスまたは細菌などの遺伝子改変弱毒生ベクターを含む。
リポソームベクターは、親油性材料から作られる膜部分および内側の水性部分を有する単層または多層小胞である。水性部分は、本発明において、標的細胞に送達されるポリヌクレオチド材料を含有するために用いられる。材料を形成するリポソームは、四級アンモニウム群などのカチオン群、および約６～約３０個の炭素原子を有する飽和または不飽和アルキル群などの１つ以上の親油性群を有することが、一般に好ましい。好適な材料の１つの群は、欧州特許公報第０１８７７０２号に記載されており、Ｗｏｌｆｆらに対する米国特許第６，２２８，８４４号においてさらに考察されており、その関連開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。その他の多くの好適なリポソーム形成カチオン性脂質化合物は、文献において記載されている。例えば、L. Stamatatos, et al., Biochemistry 27:3917 3925 (1988);およびH. Eibl, et al., Biophysical Chemistry 10:261 271 (1979)を参照。代わりに、ポリラクチド－コグリコリド生分解性ミクロスフェアなどのミクロスフェアを利用することができる。核酸構築物は、被包されるか、そうでなければ、当技術分野で周知の核酸を組織に送達するためのリポソームまたはミクロスフェアと複合体を形成する。
好ましいウイルスベクターは、バクテリオファージ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、欠損性レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびトリポックスを含む。外因性ＤＮＡ構築物を用いたウイルスベクターをトランスフォームする方法も、当技術分野で十分に説明されている。上記のＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌを参照。
上記で示したように、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、トランスフェクションまたはトランスフォーメーションによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏにおける宿主細胞（例えば、樹状細胞などの免疫細胞）などの宿主、または上記で示したように、弱毒細菌宿主（例えば、弱毒黄色ブドウ球菌、ＳＣＶなど。例えば、例２５～２６参照）に組み込んでよく、目的のポリペプチド（例えば、多重抗原の融合物もしくはそれに対するフラグメントおよび／または単一抗原もしくはそのフラグメント）を発現するトランスフェクションまたはトランスフォームされた細胞または微生物を、対象に投与してもよい。投与後、細胞が、対象において目的のタンパク質またはポリペプチド（または変異体もしくはそのフラグメント）を発現し、それが次に、タンパク質、ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する免疫応答の誘導に至る。
本発明の特定の構築物または抗原混合物を免疫化および／または送達するための弱毒生細菌の使用は、免疫応答を改善するための興味深いアプローチとなっている（Griffiths and Khader, 2014）。自然感染を模倣する弱毒生細菌は、免疫系を強力に刺激し、血清および粘膜抗体の双方を産生する広範かつ強力な免疫応答を惹起し、疾患から防御するために相乗的に作用するエフェクターおよびメモリーＴ細胞を惹起する（Detmer and Glenting, 2006; Kollaritsch et al, 2000; Pasetti et al., 2011）。好適な弱毒生細菌ベクターの例としては、黄色ブドウ球菌、ネズミチフス菌、チフス菌、赤痢菌、桿菌、乳酸桿菌、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、大腸菌、コレラ菌、カンピロバクター、または当技術分野で周知のその他のいずれかの好適な細菌ベクターが挙げられる。外因性ＤＮＡ構築物を用いた生細菌ベクターをトランスフォームする方法は、当技術分野で十分に説明されている。例えば、Joseph Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照。本発明は、弱毒生細菌（例えば、単独の免疫原性成分として、または、各々本発明の別のポリペプチド、フラグメントもしくはその変異体（例えば、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０またはフラグメントもしくはその変異体）を発現する他の弱毒生細菌と組み合わせて、本発明の構築物を発現するΔｈｅｍＢΔ７２０黄色ブドウ球菌）を含んでなる組成物を包含する。
組成物
本明細書に記載のポリペプチド、核酸および送達システム（例えば、前記核酸またはベクターを含んでなる宿主細胞）は、組成物に処方され得る。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容可能な」とは、対象に投与した場合、生理学的に許容でき、急性胃蠕動異常亢進、めまいなどのアレルギー反応または類似した有害反応を通常生じないワクチン成分（例えば、賦形剤、担体、アジュバント）および組成物を意味する。好ましくは、本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容可能な」とは、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されていること、または米国薬局方もしくは動物およびヒトにおいて使用するためのその他の一般的に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。用語「賦形剤」とは、それを用いて本発明のワクチン成分を投与し得る希釈剤、担体または溶媒を意味する。滅菌水または生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液を、担体として、特に注射液用に用いてもよい。
一実施形態では、本発明の剤は、アジュバントまたは免疫賦活剤と組み合わせて投与される。免疫応答を増大させるために成分の有効性を改善し得る好適なアジュバントまたは免疫賦活剤には、油（例えば、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）もしくはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）－Ｄなどの鉱油、乳化油）、金属塩（例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム）、インドリシジンなどのカチオン性ペプチド（Bowdish et al., 2005; Hancock, et al., 2000）、雌ウシの免疫細胞により産生されるカチオン性ペプチド（Falla et al., 1996）、天然および人工微生物成分（例えば、細菌性リポ多糖類（bacterial liposaccharides））、フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、環状ジグアノシン－５’－一リン酸（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ）、表面多糖類、リポ多糖類、グリカン、ペプチドグリカンもしくは微生物ＤＮＡ（例えば、ＣｐＧ）などの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）、サポニンなどの植物成分（例えば、Ｑｕｉｌ－Ａ（商標））、ならびに／または、担体効果を有する１つ以上の材料（例えば、ベントナイト、ラテックス粒子、リポソーム、ＩＳＣＯＭ（商標）、ＤＮＡおよびポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）共重合体）が含まれるが、これらに限定されない。抗原、およびＴＬＲを介してシグナルを伝達し、炎症性サイトカインを刺激するリガンドを含有する合成ナノ粒子（ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）などの生分解性合成重合体から作られたものなど）を用いた免疫化も可能である（Kasturi et al, 2011）。
本発明のワクチン成分は、医薬組成物で投与し得る。医薬組成物は、単位剤形で投与し得る。いずれかの適切な投与経路を用いてよく、例えば、非経口、皮下、筋肉内、乳腺内、頭蓋内、眼窩内、眼、脳室内、嚢内、関節内、脊髄内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾルまたは経口投与が挙げられる。特定の投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、乳腺内；経口（例えば、吸入）；経皮（局所）；経粘膜および直腸投与が挙げられる。
アジュバントがありまたはなしでそのようなワクチン成分を対象に投与するための好適な製剤または組成物を提供するために、従来の薬務を用いてもよい。医薬組成物および製剤を作製するための当技術分野で周知の方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (第20版)A. R. Gennaro A R.編, 2000, Lippincott: Philadelphiaにおいて認められる。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ミグリオール、植物由来の油または水素化ナフタレンを含有し得る。化合物の遊離を制御するために、生体適合性および生分解性のラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体またはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体を用いてもよい。その他の潜在的に有用な本発明の化合物の非経口送達システムは、エチレン酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入システムおよびリポソームを含む。吸入または乳腺内注射用の製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含有してもよく、または、例えば、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ミグリオール、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含有する水溶液であってもよく、または、点鼻剤の形態でまたはゲルとして投与するための油性溶液（例えば、パラフィン油）であってもよい。
治療製剤は、溶液または懸濁液の形態でもよく、経口投与では、製剤は、錠剤またはカプセル剤の形態でもよく、鼻腔内製剤では、散剤、点鼻剤またはエアロゾルの形態でもよい。非経口、皮内、乳腺内または皮下適用に用いる溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る。注射用水、生理食塩水、固定油（例えば、パラフィン油）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、ミグリオールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；ジチオスレイトールなどの還元剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの緊張度の調節のための剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多人数用バイアルに封入することができる。
注射用途に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性）または分散剤、および滅菌注射液または分散剤の即時調製用の滅菌散剤を含む。静脈内または乳腺内投与では、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル剤に封入することができ、または、錠剤または飼料に圧縮することができる。経口ワクチン接種の目的で、有効成分を賦形剤とともに組み込むことができ、錠剤、トローチ剤、カプセル剤の形態で、または飼料中に使用することができる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または類似した性質の化合物を含有し得る。微結晶性セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（商標）もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロート（sterote）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味剤などの香味剤。
吸入による投与では、ワクチン成分は、好適な噴霧剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含有する加圧容器もしくはディスペンサーからのエアロゾルスプレー、またはネブライザーの形態で送達される。
全身投与は、経粘膜または経皮の手段によるものでもあり得る。経粘膜または経皮投与では、透過されるバリアに適切な浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は、当技術分野で一般に既知であり、例えば、経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成し得る。経皮投与では、活性化合物は、当技術分野で一般に既知の軟膏剤（ointment）、軟膏剤（salve）、ゲルまたはクリームに処方される。
リポソーム懸濁液（特定の細胞型を標的とするリポソームを含む）は、薬学的に許容可能な担体としても使用し得る。
医薬組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、オドラント、浸透圧の変動のための塩、緩衝剤、コーティング剤または抗酸化剤も含有し得る。医薬組成物は、その他の治療的に有用な剤も含有し得る。
静脈内、筋肉内、皮下、乳腺内または経口投与は、好ましい使用形態である。本発明の成分が有効量で投与される用量は、特定の有効成分、宿主および対象の要件の性質ならびに適用様式に依存する。
微生物の標的
本発明のポリペプチド、核酸および送達システムは、乳腺内感染（ＩＭＩ）を引き起こすものを含むブドウ球菌感染症に対する抗菌剤として使用し得る。好ましい実施形態では、ブドウ球菌感染症は、黄色ブドウ球菌により引き起こされる。
ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、組成物および送達システムを用いた免疫化の方法
本発明の方法、使用、医薬組成物およびキットに包含されるものは、受動および能動免疫化である。
受動免疫化とは、レシピエント動物を感染症または将来の感染症から防御するまたはそれを治癒するために、病原体（または本明細書に記載の抗原）に対して先に作製された抗体または抗血清を注射することである。防御は、数週間の間に徐々に消失し、その期間中、ポリペプチド、核酸または送達システム（例えば、上記のもの）による能動免疫化は、持続する防御反応を生じる時間を有するであろう。受動免疫化用の血清は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸または送達システムを用いたドナー動物の免疫化によって作製され得る。抗原に対する抗体を含有するこの血清は、直ちに使用される、または適切な条件下で保存されることができる。この血清は、急性感染症（例えば、ＩＭＩ）と戦うために、または予防薬として使用され得る（Tuchscherr et al., 2008）。受動免疫化における抗体または血清の使用は、現在進行中の感染症の治癒率を増加させるため、または切迫した感染症に対する防御を増大させるために、抗生物質などの他の剤と併用され得る。
能動免疫化とは、本明細書に記載のポリペプチド、核酸または送達システムを対象に投与することである。
本発明の教示に従って同定された成分は、疾患または状態、より詳しくは微生物感染症に関連した疾患または状態を予防するおよび／またはそれと戦うために免疫応答の増大に使用され得るといった、予防的および／または治療的価値を有する。
本明細書で使用する用語「予防する／予防（prevent/preventing/prevention）」または「処置する／処置（treat/treating/treatment）」は、対象において所望の生物学的応答、すなわち、それぞれ予防効果および治療効果を惹起することを意味する。本発明によれば、治療効果は、処置前の対象における重症度、強度および／もしくは持続期間と比較した場合、または感染症もしくはそのいずれかの症状を有する非処置対照対象におけるものと比較した場合の、本発明のポリペプチド、核酸または送達システム（本発明の剤／組成物）の投与後の微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）またはそのいずれかの症状の重症度、強度および／または持続期間の１つ以上の増大／減少を含んでなる。本発明によれば、予防効果は、微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）、または微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）を経験するリスクにある無症候性の対象におけるそのいずれかの症状、または将来の時点でのその症状の発症の遅延；あるいは、非処置対照対象（すなわち、微生物（例えば、細菌）感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）またはそのいずれかの症状を経験するリスクにある無症候性の対象）における発症のタイミングまたは重症度、強度および／もしくは持続期間と比較した場合の、本発明の剤／組成物の投与後に生じた微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）またはそのいずれかの症状の重症度、強度および／または持続期間の増大／減少；ならびに／あるいは、そのような既存の微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）またはそのいずれかの症状を有する非処置対照対象における微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）またはそのいずれかの症状の進行と比較した場合の、本発明の剤／組成物の投与後の対象におけるいずれかの既存の微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）またはそのいずれかの症状の進行の増大／減少を含んでなり得る。本明細書で使用する場合、治療的処置において、本発明の剤／組成物は、微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）またはそのいずれかの症状の発症後に投与される。本明細書で使用する場合、予防的処置において、本発明の剤／組成物は、微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）もしくはそのいずれかの症状の発症前、またはその発症後であるがその進行前に投与される。
本明細書で使用する場合、微生物感染症（例えば、ブドウ球菌感染症）またはそのいずれかの症状の「減少（decrease）」または「減少（reduction）」は、対照の対象（本発明の剤／組成物で処置されていない対象）と比較して、少なくとも１０％、一実施形態では少なくとも２０％低い、さらなる実施形態では少なくとも３０％低い、さらなる実施形態では少なくとも４０％低い、さらなる実施形態では少なくとも５０％低い、さらなる実施形態では少なくとも６０％低い、さらなる実施形態では少なくとも７０％低い、さらなる実施形態では少なくとも８０％低い、さらなる実施形態では少なくとも９０％低い、さらなる実施形態では１００％（完全阻害）の症状の減少を意味する。
本明細書で使用する場合、ブドウ球菌感染症に関連した「症状」という用語は、疼痛、炎症、発熱、嘔吐、下痢、疲労、筋痛、食欲不振、脱水、低血圧、蜂巣炎、膿痂疹、おできおよび熱傷様皮膚症候群などのいずれかのブドウ球菌感染症の症状を意味する。より詳しくは、ブドウ球菌ＩＭＩに関連して、ブドウ球菌ＩＭＩの症状は、例えば、乳の視覚的異常（例えば、水様の外観、薄片、塊、悪臭、血液の存在など）、乳房の発赤、乳房の腫脹、乳房の圧痛、直腸温の上昇（３９．０℃超）、食欲不振、第一胃の運動性減少および疲労を意味する。乳中体細胞数（ＳＣＣ）の増加は、別のブドウ球菌ＩＭＩである。乳中体細胞は、白血球または好中球などの白血球細胞に加え、上皮細胞を含む。２００，０００／ｍＬ超のＳＣＣは、ブドウ球菌ＩＭＩ症状を示し得る、またはブドウ球菌ＩＭＩであることを示すものであると、一般的に合意されている。
用量
免疫応答を惹起するワクチン成分の毒性または有効性は、細胞培養または実験動物における標準手順によって判定され得る。毒性作用と免疫刺激作用との間の用量比を測定することができる。大きな比を示す成分が好まれる。中毒性副作用を示す成分を使用してもよいが、細胞への潜在的な損傷を最小限にし、それにより副作用を減少させるために、送達システムの設計には注意を払う必要がある。
細胞培養アッセイおよび実験動物試験から得られたデータは、大型動物およびヒトにおいて使用するための用量の範囲の処方に用いられ得る。そのような成分の用量は、好ましくは、毒性をほとんど示さない、または全く示さない有効性を含む投与濃度の範囲内である。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内を変動し得る。
いずれの好適な量の医薬組成物も、対象に投与してよい。用量は、多くの因子に依存する。典型的には、単一用量内に含有される有効成分の量は、重大な毒性を誘導することなく、ＩＭＩを効果的に予防または処置する量となる。当業者は、対象における免疫応答を効果的に増大させるのに必要な用量に影響を及ぼし得る特定の因子を認識するであろう。さらに、本発明の抗原（例えば、融合構築物）の治療的有効量は、一連の用量を必要とし得る。一般に、１回の投与あたり、融合構築物を含む抗原約０．０１ｍｇ～５００ｍｇの量が検討される。特定の実施形態では、１回の投与あたり、融合構築物を含む抗原約０．１ｍｇ～１ｍｇの量が検討される。一般に、ワクチンの１、２または３回の投与が、免疫の最適な発症に好都合であり得る。２回の投与間の時間は、３または４週と短くてもよいが、プライミング投与（初回投与）とブースター投与（２回目の投与）との間を、ブースター投与で免疫系を刺激する５、６、７、８、９または１０週間空けることが好まれ得る。その後のブースター投与（リコール投与）も、持続性の免疫をもたらすのに最適となり得る。このリコールは、例えば、半年（６ヵ月）毎、１年毎、２年毎、３年毎または５年毎に生じ得る。
「試料」または「生体試料」とは、生体から単離されたいずれかの固体または液体試料を意味する。特定の実施形態では、それは、乳、生検材料（例えば、固体組織試料）、血液（例えば、血漿、血清または全血）、唾液、滑液、尿、羊水および脳脊髄液などの哺乳類から単離されたいずれかの固体（例えば、組織試料）または液体試料を意味する。そのような試料は、例えば、感染病原体の発現レベルの分析前に、新鮮であり得、固定（例えば、ホルマリン、アルコールもしくはアセトン固定）、パラフィン包埋または凍結され得る。
患者
本明細書で使用する場合、用語「対象」または「患者」は、処置、観察または実験の対象である動物、好ましくは、ヒト、雌ウシ（例えば、若い雌ウシ、多胎、初産、仔ウシ）、ヤギ、ヒツジ、雌ヒツジ、ロバ、ウマ、ブタ、ニワトリ、ネコ、イヌなどであるがこれらに限定されない哺乳類を意味する。特定の実施形態では、それは雌ウシ（例えば、ブドウ球菌（例えば、ＩＭＩ）感染症を経験するリスクにある）である。
本明細書で使用する場合、用語「将来、ブドウ球菌感染症（例えば、ブドウ球菌感染症（例えば、ＩＭＩ））またはそのいずれかの症状を経験するリスクにある対象」とは、乳または肉の生産に使用される哺乳類（例えば、雌ウシ（例えば、若い雌ウシ、多胎、初産、仔ウシ）、ヤギ、ヒツジ）を意味する。
一実施形態では、上記の哺乳類は雌ウシである。
検出方法
特定のタンパク質／ポリペプチドの量／レベルを測定する方法の例としては、ウエスタンブロット、免疫ブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴、化学発光、蛍光偏光、リン光、免疫組織化学的分析、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、顕微鏡検査、フローサイトメトリー、およびＤＮＡ結合、リガンド結合、他のタンパク質パートナーとの相互作用または酵素活性を含むがこれらに限定されないタンパク質の特性に基づいたアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本発明の方法内でのポリペプチド／タンパク質の量は、ポリペプチド／タンパク質に対して特異的である抗体を用いて検出される。本明細書で使用する「抗体」という用語は、所望の生物活性または特異性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを包含する。「抗体フラグメント」は、全長抗体の部分、一般に、その抗原結合領域または可変領域を含んでなる。抗体と標的ポリペプチドとの間の相互作用は、放射測定、比色分析または蛍光定量的な手段によって検出される。抗原抗体複合体の検出は、例えば、酵素、フルオロフォアまたは発色団などの検出可能なタグに共役する二次抗体の添加によって、達成され得る。
抗体を作製する方法は、当技術分野で周知である。ポリクローナル抗体は、好適な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳類）を目的のポリペプチド／タンパク質またはそのフラグメントを免疫原として免疫化することにより、調製することができる。ポリペプチド／タンパク質の「フラグメント」、「部分」または「セグメント」とは、上記のポリペプチドの少なくとも約５、７、１０、１４、１５、２０、２１個以上のアミノ酸の一続きのアミノ酸残基である。免疫化された対象における抗体価は、固定化エキソソームマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントを用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるものなど、標準的な方法によって経時的に測定することができる。免疫化後の適切な時点、例えば、抗体価が最高である場合に、抗体産生細胞は、動物、通常はマウスから得ることができ、Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497によって最初に記載されたハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4: 72）、ＥＢＶハイブリドーマ法（Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld and Sell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), pp. 77-96）またはトリオーマ法などの標準的な方法によって、モノクローナル抗体の調製に使用することができる。ハイブリドーマを産生するための方法は、周知である（一般にColigan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY参照）。
あるいは、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製するために、ポリペプチドまたはそのフラグメントで組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングして、それにより、そのポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、モノクローナル抗体を同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを生成およびスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）、カタログ番号２７－９４００－０１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。
さらに、本明細書に記載の１つ以上のポリペプチド/タンパク質に対する抗体は、商業的供給源から得られ得る。
ポリペプチド／タンパク質に特異的な固定化抗体の使用も、本発明によって企図されており、当業者に周知である。抗体は、磁性またはクロマトグラフィーマトリックス粒子などの種々の固相担体、アッセイ場所（マイクロタイターウェルなど）の表面、固体支持材料（プラスチック、ナイロン、紙など）の一部などに固定化され得る。アッセイストリップは、固相担体上のアレイにおける抗体または複数の抗体をコーティングすることにより、調製され得る。このストリップは、次に、試験試料に浸漬された後、洗浄および検出工程を通じて迅速に処理され、有色スポットなどの測定可能シグナルを生成し得る。
複数（２つ以上）のポリペプチド／タンパク質の分析は、別々に、または１つの試験試料と同時に実施してもよい。複数の試料を効率的に処理するために、いくつかのポリペプチド／タンパク質をまとめて１つの試験に供してもよい。
ポリペプチド／タンパク質の分析は、種々の物理フォーマットにおいても実施することができる。例えば、多数の試験試料の処理を促進するために、マイクロタイタープレートまたは自動化が用いられ得る。あるいは、時宜を得た迅速な処置および診断を促進するために、単一の試料フォーマットが開発され得る。特に、有用な物理フォーマットは、複数の異なる分析物を検出するための複数の別々のアドレス指定可能な場所を有する表面を含んでなる。そのようなフォーマットは、タンパク質マイクロアレイ、すなわち「タンパク質チップ」（例えば、Ng and Ilag, J. Cell Mol. Med. 6: 329-340, 2002参照）およびキャピラリーデバイスを含む。
一実施形態では、上記の発現レベルは、前記１つ以上の遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルを測定することにより決定される。
核酸（ｍＲＮＡ）レベルを決定する方法は、当技術分野で既知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ、定量的ＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）、サザンブロット、ノーザンブロット、配列解析、マイクロアレイ解析、レポーター遺伝子の検出、またはその他のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションプラットフォームを含む。ＲＮＡ発現に関して、好ましい方法は、細胞ｍＲＮＡの抽出、および本発明のタンパク質／ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸のすべてまたは一部をコードする転写物をハイブリダイズする標識プローブを用いたノーザンブロッティング；特異的プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いた、本発明のタンパク質／ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸から発現するｍＲＮＡの増幅に続いて、いずれかの種々の手段による産物の定量的検出；生体試料から全ＲＮＡを抽出した後、これを標識して、いずれかの種々の表面に整列した本発明のタンパク質／ポリペプチドをコードする核酸のすべてまたは一部をコードするｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを探索するために使用する方法を含むが、これらに限定されない。
キット
本発明はまた、本発明の成分を含んでなるキットも包含する。例えば、キットは、１つ以上の成分を含んでなり得る。成分は、好適な投与用の容器およびデバイスに包装され得る。キットは、キットの使用に関する使用説明書をさらに含んでなる。
本発明はまた、１つ以上の構築物、ポリペプチド、核酸、ベクター、宿主、本発明の組成物、またはそのうち少なくとも２つの組み合わせを、ブドウ球菌ＩＭＩの処置および／または予防のためにそれを必要とする対象に投与するのに有用な試薬を含んでなるキットまたはパッケージも提供する。そのようなキットは、例えば、方法を実施するのに有用な、ブドウ球菌ＩＭＩの予防および／または処置に関する使用説明書、容器、試薬をさらに含んでなり得る。キットは、必要な場合、試験におけるバックグラウンド干渉を低減させるための剤、シグナルを増大させるための剤、目的とする臨床成績の予測をもたらすためのマーカー値を併合および内挿するためのソフトウェアおよびアルゴリズム、試験を実施するための装置、較正曲線およびチャート、標準曲線およびチャートなどをさらに含み得る。
発明を実施するための形態
本発明を以下の非限定的な例によりさらに詳細に説明する。
例１：ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ１８６７、ＳＡＣＯＬ１９１２およびＳＡＣＯＬ２３８５を含むワクチン（ワクチン番号１）に関する材料と方法
抗原の産生。黄色ブドウ球菌ウシ乳腺内感染中に高度に発現する６個の抗原を、最初のウシワクチン（ワクチン番号１）に組み入れるために選択した。これらの抗原は、ＳＡＣＯＬ００２９（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８４９４０．１）（配列番号５）、ＳＡＣＯＬ０４４２（ＹＰ＿１８５３３２．１）（配列番号２９）、ＳＡＣＯＬ０７２０（ＹＰ＿１８５６０１．１）（配列番号１１）、ＳＡＣＯＬ１８６７（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８６６９５．１）（配列番号３８）、ＳＡＣＯＬ１９１２（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８６７３７．１）（配列番号４３）およびＳＡＣＯＬ２３８５（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８７１８９．１）（配列番号５０）である。ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ１８６７、ＳＡＣＯＬ１９１２およびＳＡＣＯＬ２３８５のｈｉｓタグ組換えタンパク質は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が設計および作製した。ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０のｈｉｓタグ組換えタンパク質は、製造業者の推奨に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）からのＱＩＡ発現法（ｐＱＥ３０プラスミド）を用いて設計および作製した。抗原のｈｉｓタグ配列については、図２１Ｉ～ＶＩを参照。例２～５および図１～４は、このワクチン番号１に関する。
乳牛の免疫化。１９頭の泌乳中期の健康な多胎ホルスタイン雌ウシを、Ｄａｉｒｙ ａｎｄ Ｓｗｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｇｒｉ－Ｆｏｏｄ Ｃａｎａｄａ（シャーブルック、ケベック州）にあるレベルＩＩのバイオセイフティー畜舎で飼育した。雌ウシをランダムに２群に分けた。１つの群（雌ウシ１０頭）には生理食塩水を投与し（プラセボ群）、もう一方の群（雌ウシ９頭）にはワクチン番号１を投与した（ワクチン接種群）。ワクチンは、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）－Ｄ（ＭＶＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オマハ、ネブラスカ州）、ＣｐＧ ＯＤＮ２００７（ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号１９４）、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）（ＶＩＤＯ、サスカトゥーン、サスカチュワン州）および雌ウシの免疫応答を誘導するために用いたカチオン性ペプチドインドリシジン（ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ（配列番号１９５）（Ｃｈｅｍｐｒｅｐ Ｉｎｃ．、マイアミ、フロリダ州）とともに、６個の抗原（ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ１８６７、ＳＡＣＯＬ１９１２およびＳＡＣＯＬ２３８５）各３００μｇから構成された。２回の免疫化を、１０週間隔で頸部の皮下に実施した。有害な副作用は認められなかった。尾静脈からの血液および乳試料を初回免疫化の前に採取し（免疫前血清）、その後、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の検出のために２週毎に採取した。頸静脈からの大量の血液（１５０ｍＬ）を初回免疫化の前に採取し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の分離および細胞性免疫応答の分析のために、初回免疫化の１４週後（すなわち、２回目の免疫化の４週後）に採取した。
ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の検出。血清および乳中の各抗原に対する総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の検出を、多少の変更を加えて以前の記述通りに実施した（Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318）。Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ロチェスター、ニューヨーク州）を試験抗原（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液に希釈した５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、オークビル、オンタリオ州）で被覆し、３７℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを０．５％ゼラチンを含有するＰＢＳ（ＢＤ、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）で３７℃で１時間飽和させた。０．５％ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳ中の血清の２倍段階希釈液１００μＬをプレートにロードし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合二次抗体１００μＬをプレートに添加した。使用した二次抗体は、０．５％ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳにそれぞれ１／５０，０００、１／２０，０００および１／２０，０００に希釈したヤギ抗ウシＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）、ヒツジ抗ウシＩｇＧ１（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ローリー、ノースカロライナ州）またはヒツジ抗ウシＩｇＧ２（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）であった。３７℃で１時間インキュベーションした後に３回洗浄した後、製造業者の推奨に従って、３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（ＫＰＬ Ｉｎｃ．、ゲイザースバーグ、メリーランド州）を用いてペルオキシダーゼ活性を検出した。
乳中の総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の検出は、わずかな変更を加えて同じ手順で実施した。乳試料を０．５％ゼラチンを含有するＰＢＳに希釈した。ヒツジ抗ウシＩｇＧ２は、０．５％ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳに１／１０，０００希釈した。
細胞性免疫応答の評価。以前の記述通りに（Loiselle et al., J. Dairy. Sci. (2009), 92:1900-1912）、ＰＢＭＣを頸静脈血から分離し、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（carboxyfluoroscein diacetate, succinimidyl ester）（ＣＦＤＡ－ＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン州）で標識した。ＣＦＤＡ－ＳＥ標識手順の最後に、ＰＢＭＣを５％ＦＢＳおよび１倍抗生物質／抗真菌剤を含有するＲＰＭＩ培地（Ａ５９５５、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｌｄｒｉｃｈ）に懸濁した。ＰＢＭＣ（ウェルあたり５×１０６個）を、最終濃度１μｇ／ｍＬのマイトジェンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；陽性対照；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）または各抗原（ウェルあたり５μｇ）で刺激し、３７℃で７日間インキュベートした。陰性対照として、ＰＢＭＣをいずれのマイトジェンも用いずにインキュベートした。刺激は２回実施した（Ster et al., 2010）。
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の増殖は、異なるマイトジェンを用いたインキュベーション後に実施した。細胞は、３００×ｇで５分間遠心分離し、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳに懸濁した。次に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７と共役したマウス抗ウシＣＤ８（１／２０希釈、ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ）およびｒＰＥと共役したマウス抗ウシＣＤ４（１／２０希釈、ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ）を添加した。氷上で２０分間インキュベーションした後、細胞を０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで３回洗浄した。次に、細胞を０．５％ホルムアルデヒドでＰＢＳに懸濁した。増殖集団の割合を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを用いたＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターでのフローサイトメトリーにより決定した。
乳牛におけるＩＭＩにおける実験的黄色ブドウ球菌。実験的ＩＭＩにおいて使用する前に、細菌培養液の吸光度（Ａ６００ｎｍ）とＣＦＵとの間の関係性を決定した。負荷日に、ミュラーヒントン液体培地（ＭＨＢ；ＢＤ）における黄色ブドウ球菌の一晩培養液の量を新鮮ＭＨＢ２００ｍＬに移し、０．１のＡ６００ｎｍを得、その後、Ａ６００ｎｍが増殖の対数期における１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当する値に達するまで、３５℃で増殖させた。この実験感染に使用した株（ＣＬＪ０８－３）は、共同発明者の研究室において以前に特徴づけられていた（Allard et al., Vet. Microbiol. (2013) 162: 761- 770）。乳腺内注入のために、細菌を滅菌ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にルーチン的に希釈し、３ｍＬ中約５０ＣＦＵを得た。この実験において、接種材料をＴＳＡに播種し、３ｍＬ中６３ｃｆｕを含有することが認められた。
体細胞数（ＳＣＣ）の測定および無菌乳区乳試料の細菌分析を実験的ＩＭＩ前に実施し、すべての雌ウシがＩＭＩを有さないことを確認した。細菌を用いた乳区の実験的注入を、わずかな変更を加えて以前に記述された手順（Petitclerc et al., J. Dairy. Sci. (2007), 90: 2778-2787）に従って、夕方の搾乳後の各雌ウシの４乳区のうち３乳区（ランダムに選択）において実施した。簡潔に述べると、接種前に、７０％エタノールに浸漬したガーゼで乳首をごしごし洗った。細菌懸濁液（６３ＣＦＵ含有）３ｍＬを４乳区のうち３乳区へ乳腺内注入する前に、乳首を風乾させた。注入直後、全乳区を徹底的にマッサージし、乳首をヨードフォア（iodophore）系乳首消毒剤に浸漬した。使い捨て手袋を手順全体で着用し、次の動物に進む前に消毒した。黄色ブドウ球菌を注入した全乳区が感染となり、全雌ウシが、黄色ブドウ球菌の注入後最初の数日中のある時点で乳腺炎の臨床徴候（炎症および／または乳の外観不良）を示した。
実験感染後の黄色ブドウ球菌の生菌数の評価。無菌乳試料を、実験感染後の最初の３週間中は週３回、その後、残りの２週間は週２回、朝の搾乳前に採取した。初乳を廃棄し、乳首を７０％エタノールで消毒した後、個々の各乳区に対して、乳試料１０ｍＬを５０ｍＬ滅菌バイアルに無菌的に採取した。乳試料を段階希釈し、ＣＦＵの測定および黄色ブドウ球菌の同定のために、各希釈液１００μＬをトリプティックソイ寒天（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびマンニトール食塩寒天プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の双方に播種した。次に、プレートを３５℃で２４時間インキュベートした後、コロニーを数えた。３０～３００コロニーを示した希釈液を用いて、細菌濃度を算出した。各希釈液は、２回播種した。
体細胞数の評価。無菌乳試料と同じ頻度で、個々の乳区搾乳ユニットを用いて朝の搾乳時に乳を採取し、乳区の乳産生量の決定のために計量した。民間研究所（Ｖａｌａｃｔａ Ｉｎｃ．、サン＝タンヌ＝ド＝ベルビュー、ケベック州、カナダ）によって、ＳＣＣの測定のために、非無菌５０ｍＬ試料も各乳区搾乳ユニットから採取した。搾乳ユニットは、各雌ウシに使用する度に、徹底的に洗浄し、ヨード系殺菌洗浄剤（Ｋ．Ｏ． Ｄｙｎｅ（商標）、ＧＥＡ Ｆａｒｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウェストモアランド、ニューヨーク州）で消毒した。乳に接触するその他のすべての材料は、７０％エタノールで消毒した。
統計解析。実験感染データの統計解析を、ＳＡＳの混合手順（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、ケーリー、ノースカロライナ州）を用いて、反復測定として実施した。ＳＣＣおよびＣＦＵの解析では、解析前にデータをｌｏｇ１０変換した。抗体価、ならびにＣＦＵとＳＣＣとの間の相関の統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ｖ６．０５を用いて実施した。
倫理に関する記載。すべての動物実験は、カナダ農務省の地方施設動物管理委員会により承認され、カナダ動物管理協会のガイドラインに従って実施した。
例２：ワクチン接種後の血清中総ＩｇＧ１力価－ワクチン番号１
ＳＡＣＯＬ００２９（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８４９４０．１）（配列番号５）、ＳＡＣＯＬ０４４２（配列番号２９）、ＳＡＣＯＬ０７２０（配列番号１１）、ＳＡＣＯＬ１８６７（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８６６９５．１）（配列番号３８）、ＳＡＣＯＬ１９１２（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８６７３７．１）（配列番号４３）およびＳＡＣＯＬ２３８５（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８７１８９．１）（配列番号５０）に対する組換えｈｉｓタグ抗原を、例１（抗原の産生および乳牛の免疫化）に記載の通りに調製し、健康な雌ウシに投与した。９頭の乳牛がワクチンを投与され、１０頭の雌ウシが生理食塩水（プラセボ）を投与された。例１（ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の検出）に記載の通りに、血清中総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２力価を検出した。
予想通りに、また、図１Ｂ～Ｃに示すように、免疫化は、プラセボ群と比較して、ワクチン接種群における抗原特異的血清中ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の産生増加を誘導した。興味深いことに、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１比はＳＡＣＯＬ０４４２に対しては１であり（図１Ｄ参照）、これは、この抗原に対するバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答の指標である。抗原ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ１９１２およびＳＡＣＯＬ２３８５については、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１比は、ＳＡＣＯＬ０４４２の比よりも有意に低く、これらの抗原は、Ｔｈ２経路を通じたＩｇＧ１抗体応答を主に誘導したことが示された。
例３：ワクチン接種後の血中ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の抗原依存的増殖－ワクチン番号１
ワクチン接種雌ウシ（９）およびプラセボ雌ウシ（１０）に由来する血中ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の抗原依存的増殖を、各抗原に対する２回目の免疫化の４週後（実験感染の直前）に、例１（細胞性免疫応答の評価）に記載の通りに評価した。ＣＤ４＋細胞の結果を図２に示す。各記号は、陽性対照（ＣｏｎＡ）または各抗原によるインキュベーションの１週後における、各雌ウシに対する増殖しているＣＤ４＋細胞の割合を表す。白丸（○）は、ワクチン接種雌ウシのデータを表し、黒四角（黒四角）は、プラセボ雌ウシのデータを表す。水平線は中央値を表す。破線は、ワクチン接種雌ウシに対する中央値を表し、一方、実線は、プラセボ雌ウシに対する中央値を表す。
記号＊は、抗原ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ１９１２に関するワクチン接種群とプラセボ群との間の統計学的差を示す（＊，Ｐ＜０．０５）。
さらに、ＣＤ８＋細胞の増殖は、全抗原に関してワクチン接種雌ウシとプラセボ雌ウシとで類似していたが、抗原ＳＡＣＯＬ０７２０は例外であり、ＣＤ８＋細胞の高い増殖がワクチン接種雌ウシに認められた（データ未掲載）。ＣＤ８＋細胞の誘導は、感染症の消散にとって重要であるようにも思われた（Riollet et al., 2001; Burton and Erskine, 2003）。ワクチンは、細胞性（ＣＤ８＋）免疫応答および液性（ＣＤ４＋）免疫応答の双方を刺激することができた。異なる抗原を有するワクチン番号１は、バランスの取れた免疫応答をもたらす。
例４：体細胞数（ＳＣＣ）の急速な変化に従うことにより評価したワクチンの防御効果－ワクチン番号１
例１（乳牛における実験的黄色ブドウ球菌ＩＭＩ、実験感染後の黄色ブドウ球菌の生菌数の評価、体細胞数の評価、および統計解析）に記載の通りに、乳牛における実験的黄色ブドウ球菌ＩＭＩ感染を実施し、評価した。２回目の免疫化の４週後および４日後に、黄色ブドウ球菌の６３ＣＦＵを、夕方の搾乳時に、ワクチン接種雌ウシ（９）およびプラセボ雌ウシ（１０）の４乳区のうち３乳区に注入した（１日目、図３中の矢印）。朝の搾乳時に無菌乳試料を採取し、ＳＣＣをＶａｌａｃｔａ社（サン＝タンヌ＝ド＝ベルビュー、ケベック州）が測定した。結果を図３に示す。白丸（○）および破線は、ワクチン接種雌ウシのデータを表し、一方、黒四角（黒四角）および実線は、プラセボ雌ウシのデータを表す。各白丸は、ワクチン接種雌ウシの全感染乳区（２７）に対するＳＣＣの平均を表し、各四角は、プラセボ雌ウシの全感染乳区（３０乳区）に対するＳＣＣの平均を表す。
負荷期にわたり、乳中ＳＣＣは、プラセボ雌ウシよりもワクチン接種雌ウシにおいて有意に低いことが認められ（＊＊＊；Ｐ＜０．００１）、ワクチン接種雌ウシにおいて炎症が少なく、感染症のコントロールが良好であることが示された。
例５：特異抗原に対する血清中または乳中ＩｇＧ力価に関するＳＣＣまたは黄色ブドウ球菌の生菌数（ＣＦＵ）の間の相関－ワクチン番号１
図４Ａ～Ｂに示すように、ＳＣＣは、負荷期の黄色ブドウ球菌ＣＦＵと正の相関を示し（図４Ａ、ｒ＝０．８２、Ｐ＜０．０００１）、感染症前に測定したＳＡＣＯＬ０４４２に対する血清中ＩｇＧ１力価と負の相関を示した（図４Ｂ、ｒ＝－０．４９、Ｐ＜０．０５）。よって、ワクチン接種は、負荷により誘導された炎症のこの基準を減少させた。１０日目に採取した試料を用いて、同様の分析を実施した。先に得られたものと同じ相関が認められたが、この特定の時点では、ＳＣＣおよび黄色ブドウ球菌ＣＦＵは、ＳＡＣＯＬ００２９に対する乳中ＩｇＧ２力価とも相関していた（図４Ｃ、それぞれｒ＝－０．４８、Ｐ＜０．０５およびｒ＝－０．５８、Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、２つ以上の抗原が感染症に対する免疫応答に関与していることを示している。
例６：ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０、およびＳＡＣＯＬ１８６７とＳＡＣＯＬ００２９との融合物を含むワクチンに関する材料と方法－ワクチン番号２
抗原の産生。黄色ブドウ球菌ウシ乳腺内感染中に高度に発現する４つの抗原を、ワクチン番号２に含めるために選択した。抗原は、ＳＡＣＯＬ００２９（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８４９４０．１）（配列番号５）、ＳＡＣＯＬ１８６７（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８６６９５．１）（配列番号３８）、ＳＡＣＯＬ０４４２（配列番号２９）およびＳＡＣＯＬ０７２０（配列番号１１）によりコードされるポリペプチドである。ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７抗原は、融合物の形態で含めた。ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７のｈｉｓタグ組換えタンパク質は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が設計および作製した。ＳＡＣＯＬ０４４２のｈｉｓタグ組換えタンパク質は、製造業者の推奨に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）からのＱＩＡ発現法（ｐＱＥ３０プラスミド）を用いて設計および作製した（ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７のｈｉｓタグ配列については、図２１Ｄ～ＥおよびＩ、ならびに項目ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩＩを参照）。表面タンパク質ＣｌｆＡ（配列番号１８４）も、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９０４に由来するｃｌｆＡ遺伝子のクローニングによって、ＱＩＡ発現ベクターを用いて追加で作製した。後者の組換えタンパク質はワクチン組成物の一部ではなかったが、ＣｌｆＡなどのその他の黄色ブドウ球菌タンパク質に対する血清のＩｇＧ力価を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイに用いた。
ワクチンは、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）－Ｄ（ＭＶＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オマハ、ネブラスカ州）、ＣｐＧ ＯＤＮ２００７（すなわち、ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号１９４）（ＩＤＴ、コーラルビル、アイオワ州））およびインドリシジン（ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ（配列番号１９５、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、Ｃｈｅｍｐｒｅｐ Ｉｎｃ．、マイアミ、フロリダ州）（ワクチン番号２）とともに、３つの抗原（例１で定義されるＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０、ならびに融合物ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７）各３００μｇから構成された。
乳牛の免疫化。１１頭の泌乳中期の健康な多胎ホルスタイン雌ウシを、Ｄａｉｒｙ ａｎｄ Ｓｗｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｇｒｉ－Ｆｏｏｄ Ｃａｎａｄａ（シャーブルック、ケベック州）にあるレベルＩＩのバイオセイフティー畜舎で飼育した。雌ウシをランダムに２群に分けた。雌ウシに対してワクチン番号２を投与した（ワクチン接種群）。２回の免疫化を、１０週間隔で頸部の皮下に実施した。有害な副作用は認められなかった。尾静脈からの血液および乳試料を初回免疫化の前に採取し（免疫前血清）、その後、総ＩｇＧの検出のために毎週採取した。
ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧの検出。血清中の各抗原に対する総ＩｇＧの検出を、多少の変更を加えて以前の記述通りに実施した（Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318）。Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ロチェスター、ニューヨーク州）を試験抗原（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液に希釈した５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、オークビル、オンタリオ州）で被覆し、３７℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを、０．５％ゼラチンを含有するＰＢＳ（ＢＤ、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）で３７℃で１時間飽和させた。０．５％ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳ中の血清の２倍段階希釈液１００μＬをプレートにロードし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合二次抗体１００μＬをプレートに添加した。使用した二次抗体は、０．５％ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳに１／１０００，０００に希釈したヤギ抗ウシＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）であった。３７℃で１時間インキュベーションした後に３回洗浄した後、製造業者の推奨に従って、３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（ＫＰＬ Ｉｎｃ．、ゲイザースバーグ、メリーランド州）を用いてペルオキシダーゼ活性を検出した。
例７：抗原の融合物は高抗体価を誘導する－ワクチン番号２
図５は、（融合抗原ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７（図５における標識ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７）を含む）ワクチンの各抗原に関する、ワクチン接種雌ウシに対する血清中総ＩｇＧ力価を示す。各白丸は、各雌ウシに対する２回目の免疫化の４週後（実験感染直前）における力価を表し、一方、各黒菱形は、免疫前力価を表す。水平線は中央値を表す。実線は、免疫前血清に対する中央値を表し、点線は、免疫化の４週後に採取した試料に対する中央値を表す。ワクチン接種雌ウシに対する力価は、免疫前血清の力価より高い（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，試験した他の抗原に対するＰ＜０．００１）。
よって、図５は、融合ペプチドを含む３つの別々の抗原から構成されるワクチンは、雌ウシにおいて強力な免疫応答を誘導することを示している。さらに、図５は、驚くべきことに、融合抗原ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７（融合物ＳＡＣＯＬ００２９－ＳＡＣＯＬ１８６７）は、各抗原単独により上昇した値よりも高く抗体価を上昇させたことを示し（図１Ａと図５とを比較）、そのような融合抗原は、ワクチンに対してさらなる利点をもたらすことを示している。
より詳しくは、ワクチンにおいて個々に投与した場合、ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７に対する免疫雌ウシの力価は、それぞれ３２００および５１２００に達し（図１Ａ）、一方、これらの抗原を融合物として投与した場合、免疫雌ウシの力価は、それぞれ１２８００および４０９６００に達し（図５）、融合物は免疫応答において予想外の相乗作用を生むことが示された。
例８：ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ１８６７、およびＳＡＣＯＬ１８６７とＳＡＣＯＬ００２９との融合物を含んでなるワクチンに関する材料と方法－ワクチン番号３
抗原の産生。黄色ブドウ球菌ウシ乳腺内感染中に高度に発現する２つの遺伝子に由来する４つの抗原を、ワクチンに含めるために選択した。これらの抗原は、ＳＡＣＯＬ００２９（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８４９４０．１）（配列番号５）、ＳＡＣＯＬ１８６７（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８６６９５．１）（配列番号３８）およびＳＡＣＯＬ１８６７とＳＡＣＯＬ００２９との融合物（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）アクセッション番号：ＹＰ＿１８４９４０．１）（配列番号５）である。ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ１８６７およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７のｈｉｓタグ組換えタンパク質は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ， Ｉｎｃ．（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が設計および作製した（ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ１８６７およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７のｈｉｓタグ配列については、図２１Ａ、ＦおよびＩ、項目Ｉ、ＩＶおよびＶＩＩを参照）。
マウスの免疫化。ＳＡＣＯＬ００２９遺伝子、ＳＡＣＯＬ１８６７遺伝子、およびＳＡＣＯＬ００２９とＳＡＣＯＬ１８６７との融合物によりコードされる組換え黄色ブドウ球菌タンパク質の免疫原特性を、マウスにおいて評価した。一価型（ＳＡＣＯＬ００２９もしくはＳＡＣＯＬ１８６７）または多価型（融合物ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７もしくはＳＡＣＯＬ００２９とともにＳＡＣＯＬ１８６７の組み合わせ）のいずれかの正確な等モル量のタンパク質を投与したマウスの４群を比較した。
簡潔に述べると、全融合物、または融合物のＳＡＣＯＬ００２９もしくはＳＡＣＯＬ１８６７部分に対応する各アミノ酸配列の理論分子量を、ＥｘＰＡＳｙ（商標）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｏｒｔａｌ（http://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool）を用いて算出した。
融合物５μｇを１群のマウスに投与した。ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合物５μｇの対応するモル量は、その理論分子量に関して、１６８．５５ｐｍｏｌであると決定された。ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７それぞれ１．１５μｇおよび３．６９μｇの量を、それぞれ各抗原１６８．５５ｐｍｏｌをもたらすために、その他の２群のマウスに投与した。最後の群のマウスには、２つの個々の抗原（各１６８．５５ｐｍｏｌ）の組み合わせを投与した。
免疫化用量の調製のために、ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ１８６７およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合ポリペプチドを個々に混合し、ＰＢＳに懸濁して、１００μｌの容量での各抗原用量の最終等モル量を得た。２０匹のＣＤ－１雌マウスをランダムに４群に分けた。Ａ群（５匹）には、ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合タンパク質５μｇを投与した（融合物）。Ｂ群（５匹）には、ＳＡＣＯＬ００２９ １．１５μｇおよびＳＡＣＯＬ１８６７ ３．６９μｇを投与した（組み合わせ）。Ｃ群（５匹）には、ＳＡＣＯＬ００２９ １．１５μｇを投与し（００２９）、Ｄ群には、ＳＡＣＯＬ１８６７ ３．６９μｇを投与した（１８６７）。ＣＤ－１マウスに対し、２週間隔で頸部への２回の皮下注射により免疫化した。全実験免疫化期間中に有害な副作用は認められなかった。血液試料を、初回プライミング注射の直前（免疫前血清）およびブースト免疫化の１０日後（免疫血清）に採取した。血液アリコートを室温で１時間凝固させ、４℃で１０分間１０，０００ｇで遠心分離した。血清を採取し、その後の分析まで－２０℃で保存した。
ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧの検出。ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７組換えタンパク質に対する血清中総ＩｇＧの検出を、多少の変更を加えて以前の記述通りに実施した（Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318）。Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ロチェスター、ニューヨーク州）を試験抗原（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液に希釈した６．６７μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、オークビル、オンタリオ州）各７５μｌで被覆し、室温で一晩インキュベートした。次に、プレートを５％脱脂粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で１時間飽和させた。３％ミルクおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳ中の血清の４倍段階希釈液１００μＬをプレートにロードし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合二次抗体１００μＬをプレートに添加した。使用した二次抗体は、３％ミルクおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳに１／５０００に希釈した市販のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）であった。３７℃で１時間インキュベーションした後に３回洗浄した後、製造業者の推奨に従って、３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（ＫＰＬ Ｉｎｃ．、ゲイザースバーグ、メリーランド州）１００μＬを添加してペルオキシダーゼ活性を検出した。
統計解析。抗体価および相関の統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ｖ６．０５を用いて実施した。
例９：抗原の融合物は、一価抗原または抗原の組み合わせと比較して、有意に高い抗体価を誘導する－ワクチン番号３
図６は、融合ポリペプチド（すなわち、ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合タンパク質）に含まれる抗原（ＳＡＣＯＬ１８６７）が、その特異抗原（ＳＡＣＯＬ１８６７）に対する強力かつ特異的な抗体免疫応答を誘導し得ることを示し、さらに重要なことには、この応答は、この抗原の一価型（投与されたＳＡＣＯＬ１８６７のみ）または融合物（ＳＡＣＯＬ１８６７とＳＡＣＯＬ００２９の組み合わせ）の一部である個々のポリペプチドの多価組み合わせで得られる応答よりも有意に高いことがあることを示している。よって、複数のポリペプチド標的に対する免疫応答を生じるという利点に加え、そのような融合抗原は、それらの標的に対する抗体価を大幅に改善するという追加の利点をももたらす。
例１０：ＳＡＣＯＬ０７２０フラグメントおよび／またはＳＡＣＯＬ４４２フラグメントを含むワクチンに関する材料と方法－ワクチン番号４～６
抗原の産生。長さが１５～５０アミノ酸であり、配列ＳＡＣＯＬ０４４２および／またはＳＡＣＯＬ０７２０に由来するペプチドおよびアミノ酸フラグメントを、Ｂ細胞エピトープの存在に基づき選択した。ペプチドエピトープの融合物も、アミノ酸リンカー（例えば、ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号６２）、またはＥＲＫＹＫ（配列番号６１）もしくはＫＤＹＥＲＫＹＫＫＨＩＶＳ（配列番号１９６））が種々のエピトープに連結するように設計した。ペプチドおよびアミノ酸フラグメントは、Ｂｉｏｍａｔｉｋ， Ｉｎｃ．（ケンブリッジ、オンタリオ州）が合成した。受領時、凍結乾燥されたペプチドおよびアミノ酸フラグメントを、濃度５ｍｇ／ｍＬで滅菌水に懸濁し、使用日まで－８０℃で保存した。
マウスの免疫化。ペプチドおよびアミノ酸フラグメントを、マウスの免疫化のために抗原として用いた。免疫化用量の調製のために、特に断りのない限り、各ペプチドおよびアミノ酸フラグメントまたはその組み合わせを混合し、２０％のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）－Ｄ水中油型エマルションアジュバントを含有するＰＢＳに懸濁し、用量あたりポリペプチド１００μｇの最終用量を得た。ＣＤ－１雌マウスを、３～４匹の異なる群にランダムに分けたマウスに対し、２週間隔で頸部への２回の皮下注射により免疫化した。全実験期間中に有害な副作用は認められなかった。血液試料を、初回プライミング注射の直前（免疫前血清）およびブースト免疫化の１０日後（免疫血清）に採取した。血液アリコートを室温で１時間凝固させ、４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離した。血清を採取し、その後の分析まで－２０℃で保存した。
ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧの検出。マウスの免疫化に用いた抗原に認められた特異的なアミノ酸配列に対する血清中総ＩｇＧの検出を、多少の変更を加えて以前の記述通りに実施した（Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318）。Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ロチェスター、ニューヨーク州）を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、オークビル、オンタリオ州）に最終濃度５μｇ／ｍＬで希釈した標的アミノ酸配列各１００μｌで被覆し、室温で一晩インキュベートした。次に、プレートを、５％脱脂粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で１時間飽和させた。１％ミルクおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳ中の血清の４倍または２倍段階希釈液１００μＬをプレートにロードし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合二次抗体１００μＬをプレートに添加した。使用した二次抗体は、１％ミルクおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳに１／５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）であった。３７℃で１時間インキュベーションした後にＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０で３回洗浄し、ＰＢＳで最終洗浄した後、製造業者の推奨に従って、３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（ＫＰＬ Ｉｎｃ．、ゲイザースバーグ、メリーランド州）を用いてペルオキシダーゼ活性を検出した。
統計解析。抗体価および光学密度の統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ｖ６．０５を用いて実施した。
例１１：配列ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるエピトープを含むペプチドの融合物に対する免疫応答－ワクチン番号４
ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるペプチドエピトープの融合物を用いて、マウス（ｎ＝４）をワクチン接種した。ペプチドの融合物の配列は、
Figure 0007181208000010
 であり、リンカーはイタリック体で示しており、異なるエピトープは太字で識別している。エピトープは、ＳＡＣＯＬ０４４２によりコードされるＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）、ＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるＫＤＩＮＫＩＹＦＭＴＤＶＤＬ（配列番号２３）およびこれもＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤ（配列番号２４）であった。動物から採取した血清に由来するＩｇＧ抗体は、抗体価が１／６４００以上で、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＳＡＣＯＬ０４４２（すなわち、ＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１））および／またはＳＡＣＯＬ０７２０（すなわち、ＱＦＧＦＤＬＫＨＫＫＤＡＬＡ（配列番号２１）；ＫＤＩＮＫＩＹＦＭＴＤＶＤＬ（配列番号２３）、ＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤ（配列番号２４））のいずれかに由来するＢ細胞エピトープを含んでなるアミノ酸フラグメントに結合することができた。免疫化に用いたペプチドの融合物およびＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗体標的として用いたアミノ酸フラグメントまたはポリペプチドを、以下の表ＩＩＩに示す。この表では、エピトープは太字で、リンカー配列はイタリック体で示している。
Figure 0007181208000011
上記に示したすべての抗体標的は、上記の融合抗原でワクチン接種したマウス由来のＩｇＧによって、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合された。
このことは、ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０の双方によりコードされるペプチドエピトープの融合物は、哺乳類における免疫化および免疫応答の惹起に使用し得ることを示している。得られた免疫応答は、ＳＡＣＯＬ０４４２またはＳＡＣＯＬ０７２０を認識する抗体、ＳＡＣＯＬ０４４２またはＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるアミノ酸フラグメントまたは変異体の産生を含む。
例１２：免疫化における抗原として使用される多重エピトープの融合物は、単一エピトープに対する免疫応答を有意に亢進する－ワクチン番号４
ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるペプチドエピトープの融合物を用いて、マウス（ｎ＝４）をワクチン接種した。ペプチドの融合物の配列は、
Figure 0007181208000012
 であり、リンカーはイタリック体で示しており、異なるエピトープは太字で識別している。エピトープは、ＳＡＣＯＬ０４４２によりコードされるＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）、ＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるＫＤＩＮＫＩＹＦＭＴＤＶＤＬ（配列番号２３）およびこれもＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤ（配列番号２４）であった。別の群のマウス（ｎ＝４）に対しては、ＳＡＣＯＬ０４４２によりコードされる単一のペプチドエピトープＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）で免疫化した。
血清を動物から採取し、ペプチドエピトープＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）を含有するＳＡＣＯＬ０４４２（ＧＥＨＬＰＫＧＮＩＶＩＮＴＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱＫＤＲＥＮＶＫＩＮＴＡＤ）（配列番号２）によりコードされるアミノ酸フラグメントに対するＩｇＧ抗体の存在に関して試験した。
図７に示すように、３つのペプチドエピトープ（１つはＳＡＣＯＬ０４４２によりコードされ、２つはＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされる）の融合物による免疫化は、ペプチドエピトープＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）のみを免疫化の抗原として用いた場合に得られた抗体レベルと比較して、ペプチドエピトープＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱ（配列番号１）を含有するＳＡＣＯＬ０４４２（ＧＥＨＬＰＫＧＮＩＶＩＮＴＫＤＧＧＫＹＴＬＥＳＨＫＥＬＱＫＤＲＥＮＶＫＩＮＴＡＤ）（配列番号２）によりコードされるアミノ酸フラグメントに対する抗体産生を有意に増加させた。
例１３：ＳＡＣＯＬ０７２０の変異体によりコードされる５０アミノ酸のポリペプチドフラグメントに対する免疫応答－ワクチン番号５
配列ＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるＢ細胞エピトープ（太字）を含有する５０アミノ酸ペプチドフラグメント（ＫＤＩＮＫＩＹＦＭＴＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤＫＤＹＥＲＫＹＫＫＨＩＶＳＱＦＧＦＤＬＫＨＫＫＤＡＬＡ（配列番号２７））（ワクチン番号５）、より具体的には、エピトープＫＤＩＮＫＩＹＦＭＴＤＶＤＬ（配列番号２３）、ＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤ（配列番号２４）およびＱＦＧＦＤＬＫＨＫＫＤＡＬＡ（配列番号２１）を用いて、１群のマウス（ｎ＝３）をワクチン接種した。ＫＤＩＮＫＩＹＦＭＴＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤＫＤＹＥＲＫＹＫＫＨＩＶＳＱＦＧＦＤＬＫＨＫＫＤＡＬＡ（配列番号２７）の全体的な配列は、エピトープＤＶＤＬＧＧＰＴＦＶＬＮＤ（配列番号２４）およびＱＦＧＦＤＬＫＨＫＫＤＡＬＡ（配列番号２１）を連結する領域における４つのアミノ酸によって、ＳＡＣＯＬ０７２０の天然配列とは異なっている。よって、ワクチン番号５は、リンカーＥＲＫＹＫ（配列番号６１）により間隔が空いているＳＡＣＯＬ０７２０の変異体フラグメントまたはＳＡＣＯＬ０７２０由来のエピトープの融合物であるとみなすことができる。
ＳＡＣＯＬ０７２０（配列番号２５）によりコードされる天然タンパク質のフラグメント（すなわち、図２１Ｄ、項目ＩＩに示すポリヒスチジンバージョン）に対するＩｇＧ抗体の存在に関して、血清を試験した。アミノ酸の変異体配列に対応するペプチドフラグメント（または融合物ＳＡＣＯＬ０７２０－７２０）でワクチン接種した双方のマウスは、力価が１／６４００以上でＥＬＩＳＡアッセイにおいてアミノ酸の最初の配列内のエピトープを認識した抗体を産生した。
このことは、配列ＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるエピトープを含んでなるアミノ酸フラグメントは、哺乳類において免疫応答を惹起し得ることを示している。このことはまた、天然配列の変異体は、Ｂ細胞エピトープを含有する最初のフラグメント配列に対する免疫系を刺激する能力を有することも、さらに示している。
例１４：融合物の組み合わせ（ペプチド融合物０４４２－０７２０およびポリペプチド融合物００２９－１８６７）に対する免疫応答－ワクチン番号６
ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０によりコードされるペプチドエピトープの融合物（図２１Ｉ、項目ＶＩＩ－融合物における配列を参照）を、ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７の配列を含有するポリペプチド融合物（図２１Ｈ、項目ＶＩＩにおける配列を参照）と組み合わせて、マウスのワクチン接種に使用した（ワクチン番号６）。
免疫化用量の調製のために、ペプチド融合物０４４２－０７２０およびポリペプチド融合物１８６７－００２９を混合し、２０％のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）－Ｄ水中油型エマルションアジュバントを含有するＰＢＳに懸濁し、用量あたりペプチド融合物（０４４２－０７２０）およびポリペプチド融合物（００２９－１８６７）それぞれ１００μｇの最終用量を得た。ＣＤ－１雌マウス（ｎ＝３）を頸部への３回の皮下注射により免疫化した。最初の２回の注射は１週間隔で実施し、３回目の注射は、２回目の注射の３週後に実施した。全実験期間中に有害な副作用は認められなかった。血液試料を、初回プライミング注射の直前（免疫前血清）および最後のブースト免疫化の１４日後（免疫血清）に採取した。血液アリコートを室温で１時間凝固させた後、４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離した。血清を採取し、その後の分析まで－２０℃で保存した。
動物から採取した血清に由来するＩｇＧ抗体は、抗体価が１／６４００以上で、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＳＡＣＯＬ０４４２もしくはＳＡＣＯＬ０７２０のいずれかに由来するエピトープを含んでなるアミノ酸フラグメント、またはポリペプチドＳＡＣＯＬ００２９もしくはＳＡＣＯＬ１８６７に結合することができた。免疫化に用いたペプチドおよびポリペプチドの融合物ならびにＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗体標的として用いたポリペプチドまたはアミノ酸フラグメントを、以下の表ＩＶに示す。
Figure 0007181208000013
このことは、融合物の組み合わせ（例えば、ポリペプチド融合物００２９－１８６７と混合したペプチド融合物０４４２－０７２０）は、哺乳類における免疫化および免疫応答の惹起に使用し得ることを示している。得られる免疫応答は、ＳＡＣＯＬ０４４２またはＳＡＣＯＬ０７２０またはＳＡＣＯＬ００２９またはＳＡＣＯＬ１８６７のいずれかによりコードされるアミノ酸配列を認識する抗体の産生を含む。
例１５：弱毒生変異体に関する材料と方法
細菌株および増殖条件。例１５～２５で使用した株を表Ｖに記載する。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３およびその同質遺伝子変異体Δ７２０は、以前に記述されていた（Allard et al. 2013）。特に断りのない限り、黄色ブドウ球菌株はトリプシンソイブロス（ＴＳＢ）およびトリプシンソイ寒天（ＴＳＡ）（ＢＤ、オンタリオ州、カナダ）で増殖させ、大腸菌ＤＨ５αはＬＢおよびＬＢＡ培地（ＢＤ）で増殖させた。必要に応じて、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、オークビル、オンタリオ州、カナダ）、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、アーバイン、カリフォルニア州）およびエリスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を寒天プレートに添加した。免疫学的検査のために、カナダの乳牛群および世界各地で発見された主な黄色ブドウ球菌ｓｐａ型の一部に相当する４つの異なるウシ乳房炎分離菌を選択した（Veh et al., 2015; Mitra et al., 2013）。授乳期中に生じた臨床ウシ乳房炎の例から株ＳＨＹ９７－３９０６（ｓｐａ ｔ５２９）を分離し、乾乳時に乳腺炎が持続していた雌ウシからＣＬＪ０８－３（ｓｐａ ｔ３５９）を最初に分離した（Allard et al., 2013）。株Ｓａ３１５１（ｓｐａ ｔ１３４０１）およびＳａ３１８１（ｓｐａ ｔ２６７）を、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｂｏｖｉｎｅ Ｍａｓｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｋ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＢＭＭＱＲＮ）Ｍａｓｔｉｔｉｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｆａｃｕｌｔｅ ｄｅ ｍｅｄｅｃｉｎｅ ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅ、サンティアシント、ケベック州、カナダ）から得、無症候性の乳腺内感染の例から分離した。
Figure 0007181208000014
細胞培養条件。確立されたウシ乳腺上皮細胞（ＢＭＥＣ）株ＭＡＣ－Ｔ（Huynh et al., 1991）を、感染症の細胞培養モデルとして用いた。ＭＡＣ－Ｔ細胞を、１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）でルーチン的に培養および維持し、５μｇ／ｍｌインスリン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、ラヴァル、カナダ）および１μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）で補充し、５％ＣＯ２を有する加湿インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。細胞培養試薬は、Ｗｉｓｅｎｔ（サン＝ブルノ、ケベック州、カナダ）から購入した。
ＤＮＡ操作。ゲノムＤＮＡの単離（Ｓｉｇｍａ）、プラスミドＤＮＡの単離（Ｑｉａｇｅｎ、オンタリオ州、カナダ）、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの抽出（Ｑｉａｇｅｎ）、ならびにＰＣＲ産物および消化ＤＮＡフラグメントの精製（Ｑｉａｇｅｎ）については、キットの製造業者の推奨に従った。ゲノムおよびプラスミドＤＮＡの単離において黄色ブドウ球菌細胞の効率的な溶解を達成するために、２００μｇ／ｍｌのリゾスタフィン（Ｓｉｇｍａ）を用いた１時間の追加処理を用いた。増幅産物の上流および下流の制限酵素認識部位を付加するように、プライマー（ＩＤＴ（商標）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；コーラルビル（Coraville）、アイオワ州、米国）を設計した。ルーチンのＰＣＲに対してはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、ピカリング、オンタリオ州、カナダ）を用いて、クローニングに対してはＱ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてＰＣＲを実施し、サイクル時間および温度を各プライマー対に対して最適化した。大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）、制限酵素（ＮＥＢ）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、プラスミド構築物を作製した。黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０（Kreiswirth et al., 1983）および最後の宿主株におけるエレクトロポレーションの前に、制限消化パターンおよびＤＮＡシークエンシングにより、プラスミド構築物を検証した。例１５～２５で用いたプラスミドを上記の表Ｖに記載する。
弱毒生型黄色ブドウ球菌株Δ７２０およびΔｈｅｍＢの作製。ＡＴＣＣ２９２１３株の同質遺伝子ｈｅｍＢ変異体を構築物し、相同組換えによるｅｍｒＡカセットの挿入によって、ｈｅｍＢ遺伝子を欠失および置換させた。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３におけるヌクレオチド８０３と８０４との間にグループＩＩイントロン（以前に記述されたようにフラグメントサイズは約２Ｋｂ（Allard et al., 2013））を挿入することによる細菌遺伝子の破壊のために、ＴａｒｇｅＴｒｏｎ（商標）遺伝子ノックアウトシステム（ＴａｒｇｅＴｒｏｎ（商標）ベクターｐＮＬ９１６４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．）を用いた）を用いて、遺伝子ＳＡＣＯＬ０７２０（Δ７２０）の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３変異体を作製した（Chen et al., 2007）。製造業者のプロトコルおよび推奨に従った。
ΔｈｅｍＢΔ７２０の作製。Δ７２０変異体の遺伝的背景におけるＳＣＶ表現型を得るための遺伝子ｈｅｍＢの２回目の変異を達成するために、別の戦略を用いた。温度感受性ｐＢＴ２－ｈｅｍＢ：ｅｍｒＡ（ｐＢＴ－Ｅ：ｈｅｍＢ）を、多少の変更を加えて以前の記述通りに戦略に用いた（Mitchell et al., 2008）。簡潔に述べると、温度感受性シャトルベクターｐＢＴ２のＸｂａＩ部位とＳａｌＩ部位の間にｅｒｍＡカセットを挿入することにより、ｐＢＴ－Ｅプラスミドを構築した（Brueckner, 1997）。遺伝子ｈｅｍＢ（ＳＡＣＯＬ１７１５）ＤＮＡフラグメントの隣接領域を、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３から増幅し、ｅｒｍＡカセットの両側でプラスミドｐＢＴ－Ｅにクローン化した。次に、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０（ｒｅｓ－）への伝播のために、プラスミドを導入した。リゾスタフィンによる溶菌後（室温で１時間２００μｇ／ｍｌ）、プラスミドＤＮＡを単離し、エレクトロポレーションによるＡＴＣＣ２９２１３およびΔ７２０へのトランスフォームのために用いた。プラスミド組込みおよび変異体作製のために、エリスロマイシン１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌヘミン添加（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、オンタリオ州、カナダ）を用いて、最初に細菌を３０℃で一晩増殖させた。次に、細菌を１：１０００に希釈し、エリスロマイシン２．５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌヘミンを用いて４２℃で一晩増殖させた。この工程を２回繰り返した。最後に、細菌を１：１０００に希釈し、抗生物質を用いずに４２℃で一晩増殖させた。不活性化ｈｅｍＢ遺伝子を有する変異体を、寒天プレートへの５μｇ／ｍｌヘミン添加により補完され得る（すなわち、正常な増殖表現型への復帰）ＳＣＶ表現型とともに、エリスロマイシンに抵抗性であり、クロラムフェニコールに感受性があるものとして選択した。ＡＴＣＣ２９２１３（すなわち、ΔｈｅｍＢ）株およびΔ７２０（すなわち、ΔｈｅｍＢΔ７２０）株におけるｈｅｍＢの欠失を、ＰＣＲにより確認した（図８ＡおよびＢ参照）。
ブロス培養におけるヘミン添加。黄色ブドウ球菌ΔｈｅｍＢおよび二重変異体Δ７２０ΔｈｅｍＢの最適な増殖動態を回復できるヘミンの能力を評価するために、一晩細菌培養液を、種々の濃度で添加されたヘミンにより補充された新鮮ＢＨＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有する培養試験管においてＡ６００ｎｍ約０．１に希釈した。培養液のＡ６００ｎｍを、３５ｏＣ（２２５ｒｐｍ）でのインキュベーション期間中の異なる時点で測定した。
ウシ乳腺上皮細胞（ＢＭＥＣ）の黄色ブドウ球菌感染。ＡＴＣＣ２９２１３（ＷＴ）およびその同質遺伝子変異体の細胞内感染性および持続の特徴づけのために、ＭＡＣ－Ｔ ＢＭＥＣを用いた。感染の４８時間前に、１×１０５／ｍｌのＭＡＣ－Ｔ細胞を処理済み２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、３０％のコンフルエンスを得た。３７ｏＣで１０％ＣＯ２の下、単層をコンフルエンスまで増殖させた。感染の６時間前に、単層をＤＭＥＭで洗浄し、浸潤培地（ＩＭ）（１％熱失活ＦＢＳを含有する抗生物質を含まない増殖培地）でインキュベートした。一晩細菌培養液を新鮮ＴＳＢに１：２０に希釈し、中対数増殖期まで増殖させた後、ＰＢＳで洗浄し、感染多重度１０までＩＭに希釈した。細菌で３時間単層をインキュベートすることにより、浸潤を達成した。次に、単層をＤＭＥＭで洗浄し、２０μｇ／ｍｌリゾスタフィンを含有するＩＭでインキュベートして細胞外細菌を死滅させた。細胞外正常およびＳＣＶ黄色ブドウ球菌を死滅させるためのリゾスタフィンの使用は、細胞浸潤アッセイにおいて以前に検証された（Moisan et al., 2006 and Tuchscherr et al, 2011）。処置を感染の３時間時のＣＦＵを測定するために３０分間実施し、または、追加で１２もしくは２４時間実施した。次に、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）による広範な洗浄の後、単層をトリプシン処理により剥離し、０．０５％トリトンＸ１００で溶解し、ＰＢＳを添加して最終１倍濃度を得た。ライセートを段階希釈し、ＣＦＵの測定のためにＴＳＡに播種した。
ＢＭＥＣの生存率および代謝活性アッセイ。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２１３（ＷＴ）およびその同質遺伝子変異体により与えられるＭＡＣ－Ｔ細胞に対する細胞傷害を測定するために、３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の生存細胞における不溶性ホルマザン産物への還元を測定するＭＴＴ細胞代謝活性アッセイを実施した。アッセイは、多少の変更を加えてＫｕｂｉｃａらの方法（Kubica et al, 2008）に従った。簡潔に述べると、細胞の黄色ブドウ球菌感染は、持続アッセイにおいて述べられた通りに達成されたが、１２時間または２４時間後の溶解の代わりに、細胞をＤＰＢＳ中でＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを用いて３７℃で２時間インキュベートした。この後、ｐＨ４．７の１６％ＳＤＳおよび４０％ＰＭＦの酸性溶媒溶液を添加して、細胞を溶解し、ホルマザンの結晶を一晩可溶化させた。波長５７０ｎｍのＥｐｏｃｈマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を用いて、試料を読み取った。すべてのアッセイは３回実施し、非感染細胞を有する対照ウェル（高生存率対照）または溶解後のＷＴ感染細胞（細菌バックグラウンド対照；ＭＴＴ添加前に０．０５％トリトンＸ１００で１０分間処理）を各プレートに含めた。代謝活性のレベルは、以下の式を用いて算出した。
（試料の吸光度－バックグラウンド対照）／高対照）×１００。
マウス乳腺炎モデルにおけるビルレンス。感染症のマウス乳腺炎モデルは、以前に記述されたものに基づく（Brouillette, 2005; Brouillette, 2004）。マウスを用いて実施したすべての実験は、Ｆａｃｕｌｔｅ ｄｅｓ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔe ｄｅ Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅの動物実験倫理委員会により承認され、カナダ動物管理協会のガイドラインに従って実施した。簡潔に述べると、１２～１４日齢の子孫を除去した１時間後に、授乳中のＣＤ－１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をそれぞれ体重の８７および１３ｍｇ／ｋｇのケタミンおよびキシラジンで麻酔し、乳腺を両眼下で接種した。乳首の近端で小さく切開することにより乳管を露出させ、エンドトキシンフリーリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）中に１０２ＣＦＵを含有する１００μｌ細菌懸濁液を、３２ゲージ鈍針を用いて、乳頭管を通じて注射した。２つの腺（頭部から尾にかけて右側４番目［Ｒ４］および左側４番目［Ｌ４］）を各動物に対して接種した。乳腺を指定の時間に無菌的に採取し、秤量し、炎症に関して視覚的に評価した。ＰＢＳ中での機械的組織均質化、段階希釈、およびＣＦＵ測定のための寒天への播種後に、細菌負荷を評価した。２回目の実験では、ホモジナイズした腺を、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性酵素アッセイでのタンパク質抽出のために保存した。
乳腺タンパク質の抽出。乳腺からの総タンパク質の抽出を、多少の変更を加えて以前に記述された最適化された方法により実施した（Pulli et al., 2013）。ｐＨ６．０の最終濃度５０ｍＭのリン酸カリウムおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）５０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）を含有する緩衝液中で、乳腺組織をホモジナイズした。次に、試料を超音波処理し、液体窒素で凍結融解し、４℃で１５分間２０００ｇで遠心分離した。最後に、脂肪層を吸引により除去し、上澄みを１５０００ｇでの１５分間の最終遠心分離のために保存し、すべての壊死細胞片を廃棄した。上澄みをアリコートに分布させ、酵素アッセイまたはビシンコニン酸法（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定するタンパク質濃度測定に使用するまで、－８０℃で保存した。
ＭＰＯ活性アッセイ。マイクロプレート用に改変したｏ－ジアニシジン－Ｈ２Ｏ２法によるＭＰＯ酵素活性の定量により、乳腺組織における好中球動員を測定した（Bradley, RD. and Rothstein, GPPC., 1982）。９６ウェルマイクロプレートにおいて、ｐＨ６．０の５０ｍＭ ＣＴＡＢリン酸緩衝液５０ｍＭ中のｏ－ジアニシジン塩酸塩（０．１６７ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）および０．０００５％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）の溶液で、組織抽出上澄み液１０μｌをインキュベートした。４６０ｎｍのＥｐｏｃｈマイクロプレートリーダーにおいて、ＭＰＯ活性を１５秒の間隔をおいて５分間動態学的に測定した。ＭＰＯの単位は、ｏ－ジアニシジンに対する４６０ｎｍでの吸収係数１１．３ｍＭ－１ｃｍ－１を想定し、２５℃で１μｍｏｌのＨ２Ｏ２／分を分解する酵素の量とみなした（Zhang et al., 2004）。結果は、腺のｇあたりのＭＰＯの単位として表した。
弱毒生変異体Δ７２０ΔｈｅｍＢによるマウスの免疫化。生ワクチンとして投与した弱毒株Δ７２０ΔｈｅｍＢの免疫原特性を、マウスにおいて評価した。予備試験において、マウスは、弱毒株の筋肉内注射および皮下（ＳＣ）注射に良好な忍容性を示した。１０６、１０７および１０８ＣＦＵの用量、ならびにＳＣ経路を、その後の実験に選択した。細菌接種材料の調製のために、先にＢＨＩＡプレートで増殖させた黄色ブドウ球菌Δ７２０ΔｈｅｍＢコロニーを、氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、１５％グリセロール含有ＰＢＳに懸濁した後、分注し、その後使用するまで－８０℃で保存した。接種材料調製物中の生細菌数を、ＢＨＩＡへの段階希釈液の播種により検証した。ＣＤ－１マウスをランダムに３群に分けた。第１群（ｎ＝３）には１０６ＣＦＵの用量を投与し、第２群（ｎ＝３）には１０７ＣＦＵを、第３群（ｎ＝３）には１０８ＣＦＵを投与した。マウスに対し、２週間隔で頸部へのＰＢＳ（１００μｌ）中の細菌の２回の皮下注射により免疫化した。血液試料を、プライミング注射の直前（免疫前血清）およびブースト免疫化の１０日後（免疫血清）に採取した。血液アリコートを室温で１時間凝固させた後、４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離した。血清を採取し、その後の分析まで－２０℃で保存した。
黄色ブドウ球菌の細胞抽出液の調製。黄色ブドウ球菌の全細胞抽出液の調製を、多少の変更を加えて以前の記述通りに実施した（Asli et al., 2016）。簡潔に述べると、一晩細菌培養液を新鮮ＢＨＩブロスに１／１０００に希釈した後、約０．８のＡ６００ｎｍに達するまで３５℃（２２５ｒｐｍ）でインキュベートした。細菌細胞を遠心分離し、ペレットを氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、ペレット１ｍｌあたりＰＢＳ５ｍｌを添加して懸濁した。細菌懸濁液を最初にリゾスタフィン（Ｓｉｇｍａ）（ペレット１００μｇ／ｍｌ）で３７℃で１時間処理した後、ペレット１ｍｌあたりプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）３μｇ、リボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）８μｇおよびデオキシリボヌクレアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）８μｇを懸濁液に添加した。室温で３０分後、ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ（商標）Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ細胞破壊器中での３～４継代により細胞を機械的に破壊した後、１２，０００×ｇおよび４℃で１０分間遠心分離し、破壊されていない細胞を除去した。上澄みを回収し、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて、総タンパク質濃度を以前の記述通りに測定した。
ＥＬＩＳＡによるマウス総ＩｇＧの検出。マウスの免疫化により生じる全身性液性応答を実証および測定するために、Δ７２０ΔｈｅｍＢワクチン接種株および各ウシＩＭＩ分離菌に対する血清中総ＩｇＧの検出を実施した。標的抗原に関しては、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ロチェスター、ニューヨーク州）を全黄色ブドウ球菌細胞抽出液（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液に希釈した１０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）各１００μｌで被覆し、室温で一晩インキュベートした。次に、プレートを、５％脱脂粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で１時間飽和させた後、非特異的な黄色ブドウ球菌タンパク質Ａの相互作用を防ぐために、５％ブタ血清を添加して２番目のブロッキング工程を実施した。希釈緩衝液（２％ミルク、５％ブタ血清および０．０２５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を有するＰＢＳ）中の血清の２倍段階希釈液１００μＬをプレートにロードし、３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、希釈緩衝液に１／５０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）１００μｌを用いてロードした。３７℃で１時間インキュベーションした後に３回洗浄した後、製造業者の推奨に従って、３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（ＫＰＬ Ｉｎｃ．、ゲイザースバーグ、メリーランド州）を用いてペルオキシダーゼ活性を検出した。
統計解析。統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（ｖ．６．０２）を用いて実施した。腺（マウスにおけるＩＭＩ）の細胞内細菌のＣＦＵおよび細菌ＣＦＵ／ｇを、統計解析に使用する前に、底１０の対数値に変換した。各実験および有意性の解析に用いた統計検定は、図の凡例に明記している。
例１６：黄色ブドウ球菌株ＡＴＣＣ２９２１３Δ７２０、ΔｈｅｍＢおよびΔ７２０ΔｈｅｍＢの構築
自然感染を模倣する弱毒生細菌は、免疫系を強力に刺激し、血清および粘膜抗体の双方を産生する広範かつ強力な免疫応答を惹起し、疾患から防御するために相乗的に作用するエフェクターおよびメモリーＴ細胞を惹起する（Detmer, 2006; Kollaritsch, 2000; Pasetti, 2011）。
遺伝子ＳＡＣＯＬ０７２０における変異は、雌ウシにおける実験的ＩＭＩ感染での黄色ブドウ球菌のビルレンスを変化させることが示された（Allard et al., 2013）。
黄色ブドウ球菌ＳＣＶの表現型の側面に基づき、さらなる弱毒生株をワクチン目的で調製した。ＳＣＶは、一般に侵襲性感染症（すなわち、さらなる弱毒化）を生じず、宿主細胞内に内部移行し得るため、液性免疫応答に加え細胞性免疫応答を刺激する。
ｈｅｍＢ遺伝子（ΔｈｅｍＢ）の欠失を通じて、安定的な黄色ブドウ球菌ＳＣＶを最初に作製した（例１５、弱毒生型黄色ブドウ球菌株Δ７２０およびΔｈｅｍＢの作製を参照）。次に、このＳＣＶのさらなる弱毒化を、遺伝子ＳＡＣＯＬ０７２０（Δ７２０）の不活性化によって達成した（例１５、ΔｈｅｍＢΔ７２０の作製を参照）。
ＭＡＣ－Ｔウシ乳腺上皮細胞の感染後、二重変異体（Δ７２０ΔｈｅｍＢ）は、それぞれΔｈｅｍＢおよびΔ７２０でみられたものと比較して、低い内部移行および細胞破壊を有意に示した。
例１７：黄色ブドウ球菌株ΔｈｅｍＢΔ７２０はＭＡＣ－Ｔ細胞において弱毒化される
次に、ＡＴＣＣ２９２１３（ＷＴ）、Δ７２０、ΔｈｅｍＢおよびΔｈｅｍＢΔ７２０株の感染性を、ＭＡＣ－Ｔ細胞を用いた細胞内持続アッセイにおいて比較した。３つの変異体株をそれらの同質遺伝子ＷＴ親と比較することにより、遺伝子ｈｅｍＢおよびＳＡＣＯＬ０７２０における変異の別々の作用が認められた。細胞単層を用いた細菌の短時間の３時間インキュベーションの後に、リゾスタフィンを添加して細胞外細菌を排除した結果、生存細胞内細菌（ＣＦＵ）の回収率に基づき、ＷＴ株およびΔｈｅｍＢ株双方で、ＭＡＣ－Ｔ細胞への内部移行のレベルが高いことが示された（図９ＡおよびＢ）。しかし、単一Δ７２０変異体は、その親ＷＴ株と比較して、有意に低い（Ｐ≦０．０１）内部移行を示した（図９Ａ）。二重変異体ΔｈｅｍＢΔ７２０をΔｈｅｍＢと比較した場合、Δ７２０にみられた内部移行の減少は、さらにより顕著であり、この３時間内部移行アッセイにおいて接種材料の回収率に１０倍の減少がみられた（Ｐ≦０．００１、図９Ｂ）。内部移行した細菌量のこの最初の減少は、二重変異体株ΔｈｅｍＢΔ７２０で浸潤（ＰＩ）後１２および２４時間でも明らかであり（図９Ｃ）、これは、ΔｈｅｍＢ（Ｐ≦０．００１）で認められたものと比較して、両時点でのＣＦＵ／ｍｌの１－ｌｏｇ１０の減少により示されている。単一Δ７２０変異体とＷＴ株との間の最初の細胞内細菌量の差（図９Ａ）は、両株はＭＡＣ－Ｔ細胞内に十分持続しなかったため（図１０）、インキュベーション時間が長いほど徐々に消えた（図９Ｃ）。反対に、単一ΔｈｅｍＢ株に関して回収された細胞内ＣＦＵは、２４時間ＰＩにおける他の３つの株に関して回収されたものと比較して、有意に高かった（図９Ｃ、すべてに対するＰ≦０．００１）。全体的に見て、およびＳＣＶ表現型に関して予想されたように、ΔｈｅｍＢ株は、経時的に他のいずれの株よりも高い細胞内持続を示した（図１０）。これらの結果は、Δ７２０変異は、ＭＡＣ－Ｔ細胞内への内部移行プロセスを主に減少させることを示唆している。結果はさらに、ΔｈｅｍＢΔ７２０変異体は、ＢＭＥＣへの内部移行および持続が依然として可能であるが、単一ΔｈｅｍＢ変異体でみられるものよりもかなり低い程度であることを示している。
ΔｈｅｍＢΔ７２０およびΔｈｅｍＢ ＳＣＶは低ＢＭＥＣ破壊を引き起こす。上記で報告したように、ΔｈｅｍＢおよびΔｈｅｍＢΔ７２０ ＳＣＶ株は、ＭＡＣ－Ｔ細胞において経時的に大きな持続を示し、これは、ＷＴ株およびΔ７２０株との比較において、１２時間および２４時間ＰＩのそれらの持続した生存率によって示されている（図９Ｃおよび１０）。細胞から回収した接種材料の割合は、二重および単一ｈｅｍＢ変異体の双方に関して、リゾスタフィン添加後０～２４時間にほぼ同じままであり、１２時間にわずかな増加を示し、細胞内増殖が示された（図１０）。両株とも、この感染時点後に遅い速度で減少し始めた。しかし、ＷＴ株およびΔ７２０株に関する細胞内ＣＦＵの見かけの減少は、ＳＣＶ表現型の株で認められたものと比較して、経時的な細胞単層への損傷の増加という視覚的観察を伴った。
試験した４つの各株による感染後、ＭＡＣ－Ｔ細胞の生存率も評価した。ＭＡＣ－Ｔ細胞の生存率をＭＴＴ法により評価した（Kubica et al., 2008）。結果は、両ＳＣＶ株（ΔｈｅｍＢおよびΔｈｅｍＢΔ７２０）は、ＷＴ株およびΔ７２０株と対照的に、このアッセイにおいて有意に少ないＭＡＣ－Ｔの死滅を引き起こしたことを示している。ΔｈｅｍＢと比較した場合、ＷＴ株は、１２時間において細胞の生存率をほぼ半分に減少させた（図１１Ａ：ＷＴ：２５．４％；ΔｈｅｍＢ：４８．４％）。この差は、たとえ細菌量がΔｈｅｍＢ変異体で１０倍高かったとしても（図９Ｃ）、２４時間において依然として明らかであった（図１１Ｂ：それぞれ１６．３％対３４．５％）。ＭＡＣ－Ｔ細胞は、二重変異体Δ７２０ΔｈｅｍＢよりもΔｈｅｍＢによる損傷が大きかったが、差は２４時間でのみ有意であった（Ｐ≦０．０１）。ＷＴ株と直接比較した場合、二重変異体Δ７２０ΔｈｅｍＢは、上皮細胞生存率を１２時間において２．３倍高く維持し（図１１Ａ）、２４時間において２．７倍高く維持した（図１１Ｂ）（１２および２４時間：Ｐ≦０．０００１）。したがって、ＷＴ株およびΔ７２０株と比較して、両ＳＣＶ株の細胞内持続が経時的に大きかったこと（図１０）は、ＭＡＣ－Ｔ細胞に対するＳＣＶの毒性が低いことに起因していた可能性が高い（図１１）。まとめると、ＢＭＥＣ感染アッセイの結果は、ＷＴ株の弱毒化に対するΔｈｅｍＢおよびΔ７２０変異の双方の相加効果の証拠をもたらした。
例１８：黄色ブドウ球菌株ΔｈｅｍＢΔ７２０はマウスＩＭＩモデルにおいて弱毒される
感染症のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるΔｈｅｍＢΔ７２０の弱毒化を証明するために、二重変異体のビルレンスを評価し、マウスＩＭＩモデルにおけるＷＴ株と比較した（Brouillette and Malouin, 2005）。両株に関して、感染の対数期は、主に感染後最初の１２時間以内に生じたが、最大細菌負荷は、二重変異体で２４時間に達し、ＷＴ株で４８時間（２日目［Ｄ２］）に達した（図１２）。２４時間において、二重変異体は、ＷＴと比較して、腺の平均ＣＦＵ／ｇの１．９ｌｏｇ１０の減少を示した（Ｐ≦０．０５）。また、２４時間後も、変異体の細菌負荷は、１２日目に完全な細菌排除が達成されるまで（図１２のアスタリスクで示す）、一定の減少を示した。対照的に、親ＷＴ株は、変異体と比較して、重度の侵襲性感染症を誘発し、その群で腺を採取できる前に、２日目に残りのマウス９匹中３匹および７日目に３匹中２匹が死亡した（図１２；矢印）。ＷＴ感染症から生存したマウスは、７日目に高い生菌数（９ｌｏｇ１０ＣＦＵ／腺のｇ）を維持し、二重変異体と比較して細菌負荷における約５ｌｏｇ１０の差を示した。これらの結果は、ΔｈｅｍＢΔ７２０株が乳腺において増殖および生存できる能力が著明に減少したことを明らかに示している。したがって、ΔｈｅｍＢΔ７２０二重変異体は、マウス乳腺内感染（ＩＭＩ）モデルにおいて強く弱毒化され、乳腺から効率的に除去される。
弱毒株ΔｈｅｍＢΔ７２０は、ワクチン接種の目的および抗原の細胞内送達にとって理想的であるようである。実際に、ΔｈｅｍＢΔ７２０の低いおよび一時的な内部移行は、黄色ブドウ球菌に対する防御にとって重要である免疫応答の構成要素である細胞性免疫の刺激に役立つはずである（Fowler and Proctor, 2014）。
例１９：ＩＭＩ後のΔ７２０ΔｈｅｍＢ株およびＷＴ株に対する炎症反応
ＷＴ株および変異体株による感染に対するマウスの炎症反応（免疫応答）を測定するために、腺における好中球浸潤を、腺ホモジネートの総タンパク質抽出液のＭＰＯ酵素活性により評価した。生体試料中のＭＰＯ活性は、好中球の絶対数と以前に強く相関しており（Xia, 1997）、よって、適切なマーカーである。感染後の最初の１時間の間、好中球動員は、二重変異体およびＷＴに感染した腺に対して類似したプロファイルをたどり（図１３）、ある程度の遅延がみられたものの、細菌増殖と一致した、感染後１２～２４時間に見かけの好中球浸潤の指数関数的増大を示した。乳腺における細菌量と関連した多形核細胞の絶対数は、常に同時にピークとなるわけではないことが以前に示された（Brouillette, 2005）。変異体株およびＷＴ株により感染した腺の間には、ＭＰＯ活性の有意差は６、１２および２４時間には認められなかった（図１３）。しかし、見かけの好中球浸潤におけるこの同等性は、２４時間における炎症の視覚的観察とは相関せず、この時点において、ＷＴ感染は、二重変異体と比較して、感染腺の広範な発赤を生じさせた（図１４の写真）。反対に、変異体感染腺は、ＰＢＳ対照と比較して、肉眼レベルで視覚的変化はなかった。炎症の視覚的評価と好中球浸潤の結果との不一致は、細菌量（図９Ａ－Ｃ）およびＷＴ株の細胞傷害活性（図１１）における差に起因していた可能性があり、毒素および酵素発現を通じた株の高侵襲性および播種性の能力と整合がとれていた可能性がある。それゆえ、これらの結果は、変異体株により感染した腺における好中球動員は、ＷＴ株でみられたものと同等であったこと、ならびに、これは、変異体の細菌量のその後の減少および排除を可能とするために十分であったことを示している。
最後に、株の安全性を確認するため、およびこの炎症反応は許容されない反応性株の結果として生じたものではないことを評価するため、感染の４および１２日後のΔ７２０ΔｈｅｍＢ感染腺においてＭＰＯ活性を測定した。次に、活性のレベルを、ＰＢＳ注射マウスで得られたレベルと比較した。図１５に示すように、変異体感染腺における見かけの好中球の存在は、感染の４日後にも依然として高く、ＭＰＯ活性は８～２１単位／腺のｇの範囲であった。その上、乳腺が形態的にほぼ妊娠前の状態に戻るプロセスである腺退縮は、組織のリモデリング中にアポトーシス細胞の貪食を可能にする好中球動員と元々関連している（Stein, 2007）。このモデルにおける感染後の数日以内に、マウスの腺はすでに修飾の正常状態にあり、このことは腺の迅速な萎縮によって示されている。しかし、変異体感染腺におけるＭＰＯレベルは、４日目と１２日目の間に実質的な減少を経た（Ｐ≦０．０１）。次に、ＭＰＯレベルは、１２日目に正常レベルに戻ったとみなされ、ＰＢＳ注射マウスで得られたものとの有意差は示されなかった。Δ７２０ΔｈｅｍＢ感染腺の炎症反応は、細菌排除とともに正常レベルに戻る（図１５）。
例２０：Δ７２０ＧΔｈｅｍＢによる免疫化は、いくつかの黄色ブドウ球菌ウシ乳腺内感染分離菌に対して強力な液性応答を生じさせる
生Δ７２０ΔｈｅｍＢによる免疫化は、黄色ブドウ球菌乳腺内感染に対する推定上の生ワクチンとして使用するのに好適な強力な免疫応答を実際に生じさせ得ることを確認するために、マウスを異なる用量の生ワクチンで免疫化し、種々の黄色ブドウ球菌ウシ分離菌の全細胞抽出液への結合に関して血清中総ＩｇＧを定量した。最初に、頸部へ皮下投与した１０６、１０７および１０８ＣＦＵの用量は、免疫化期間を通じて、マウスの行動の修飾または免疫化部位での炎症もしくは壊死の徴候などの有害作用を惹起しなかった。さらに、生二重変異体ＡＴＣＣ２９２１３ Δ７２０ΔｈｅｍＢの量を増加させて用いた免疫化は、それ自身の抗原の全細胞抽出液に対する全身ＩｇＧ抗体の力価の増加をもたらした（図１５Ｂ）。免疫血清の力価は、免疫前血清の力価よりも有意に高く、生ワクチン中に存在する黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体産生の特異性が示された。最も重要なことに、Δ７２０ΔｈｅｍＢの量を増加させて用いた免疫化は、カナダおよび世界各地で発見された主要なｓｐａ型に由来する株を含む、ウシ乳房炎から分離された種々の黄色ブドウ球菌株に対する抗体価の必然的な上昇ももたらした（図１５Ｃ）。これらの結果は、（ｉ）二重変異体による免疫化は免疫応答を増大させ得ること、および（ｉｉ）株バックグラウンド（ＡＴＣＣ２９２１３）は、抗体応答が主要なｓｐａ型の株も強く認識するように、ウシ乳房炎株と十分な共通の特徴を共有していること、を明確に示している。
生Δ７２０ΔｈｅｍＢの皮下注射を用いたマウスの免疫化は、全細菌細胞抽出液に対して測定した総ＩｇＧの高力価により判断した結果、強力な液性応答を生じさせた。また、ワクチン株Δ７２０ΔｈｅｍＢは、抗体応答が種々の一般的な乳腺炎関連ｓｐａ型に由来する株も強く認識するように、ウシ乳房炎株と十分な共通の特徴を有していた。
このことは、二重変異体バックグラウンド（ＡＴＣＣ２９２１３）はウシ乳房炎株と多くの共通の特徴を共有していることを示したが、望む場合は、いずれかの所望の遺伝的背景において、特に、これに限定されないが黄色ブドウ球菌株ＲＦ１２２などのウシ乳房炎から分離されたいずれかの株において、そのような二重変異体を作製することができる。
これらの結果は、ある程度の残存細胞内能力を有するＳＣＶ株は、重度の感染症を確立することなく、免疫細胞動員を可能にし得ることを示している。そのようなＳＣＶ株は、細胞内能力で病原体と戦うために免疫応答を適切に刺激する弱毒生ワクチンとして作用し得る。
例２１：材料と方法－ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７とＳＡＣＯＬ００２９との融合物＋弱毒生細菌（ワクチン番号７）
抗原の産生。抗原の産生は、抗原ＳＡＣＯＬ００２９の追加の存在を除き、例６の抗原の産生の項での記載通りに実施した。ＳＡＣＯＬ００２９のｈｉｓタグ組換えタンパク質は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ， Ｉｎｃ．（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が設計および作製した（図２１Ａ、項目Ｉ、ｈｉｓタグ配列を参照）。
弱毒生型黄色ブドウ球菌株Δ７２０ΔｈｅｍＢの作製。弱毒生型黄色ブドウ球菌株の作製は、例１５（ΔｈｅｍＢΔ７２０の作製）での記載通りに実施した。
マウスの免疫化。弱毒生細菌株黄色ブドウ球菌Δ７２０ΔｈｅｍＢと組み合わせた、または組み合わせない、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ００２９遺伝子、ならびにＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７遺伝子の融合物にコードされる組換え黄色ブドウ球菌タンパク質の免疫原特性をマウスにおいて評価した。マウスは、頸部への皮下注射および大腿への筋肉内注射による１０３、１０５、１０６、１０７および１０８ＣＦＵの用量に良好な忍容性を示した。１０５の用量および皮下経路を、以下の実験に選択した。
細菌接種材料の調製のために、先にＢＨＩＡプレートで増殖させた黄色ブドウ球菌Δ７２０ΔｈｅｍＢコロニーを、氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、１５％グリセロール含有ＰＢＳに懸濁した後、分注し、その後使用するまで－８０℃で保存した。弱毒細菌１０５ＣＦＵに相当する最終マウス免疫化用量を得るために、凍結接種材料の細菌濃度を、ＢＨＩＡに播種した段階希釈液により評価した後、免疫化日にＰＢＳに最終濃度１０５ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。
タンパク質用量の調製のために、ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合ポリペプチドを混合し、ＰＢＳに懸濁して、各々５μｇの最終用量を得た。ＣＤ－１雌マウスをランダムに３群に分けた。第１群（５匹）には混合タンパク質用量を投与した（タンパク質混合物）。第２群（５匹）には弱毒細菌（Δ７２０ΔｈｅｍＢ）用量を投与した（Δ７２０ΔｈｅｍＢ）。第３群（６匹）には混合タンパク質と弱毒細菌の組み合わせを投与した（組み合わせ）。ＣＤ－１雌マウスに対し、２週間隔で頸部への２回の皮下注射により免疫化した。タンパク質および細菌株の用量は、以前の記述通りにＰＢＳに希釈し、各群のマウスに対して最終容量１００μｌで投与した。全実験免疫化期間中に有害な副作用は認められなかった。血液試料を、初回プライミング注射の直前（免疫前血清）およびブースト免疫化の１０日後（免疫血清）に採取した。血液アリコートを室温で１時間凝固させ、４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離した。血清を採取し、その後の分析まで－２０℃で保存した。
ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の検出。免疫化のために以前に用いた各抗原に対する血清中総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の検出を、多少の変更を加えて以前の記述通りに実施した（Ster et al., Vet. Immunol. Immunopathol. (2010), 136: 311-318）。さらに、黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を亢進し、バランスを取るために生株を用いることの補足的な利点を示すために、ブドウ球菌表面タンパク質ＣｌｆＡに対するＩｇＧの検出を実施した。Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ロチェスター、ニューヨーク州）を試験抗原（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液に希釈した６．６７μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、オークビル、オンタリオ州）各７５μｌで被覆し、室温で一晩インキュベートした。次に、プレートを、５％脱脂粉乳を含有するＰＢＳで３７℃で１時間飽和させた。３％ミルクおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳ中の血清の４倍段階希釈液１００μＬをプレートにロードし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合二次抗体１００μＬをプレートに添加した。使用した二次抗体は、３％ミルクおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳに１／５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）であった。３７℃で１時間インキュベーションした後に３回洗浄した後、製造業者の推奨に従って、３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（ＫＰＬ Ｉｎｃ．、ゲイザースバーグ、メリーランド州）を用いてペルオキシダーゼ活性を検出した。
統計解析。抗体価および相関の統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ｖ６．０５を用いて実施した。
例２２：抗原の融合物および弱毒生型黄色ブドウ球菌株との組み合わせは、マウスにおける高抗体価を誘導する－ワクチン番号７
抗原および弱毒生型黄色ブドウ球菌株Δ７２０ΔｈｅｍＢを、例２１に記載の通りに作製する。例２１に記載の通りに、マウスを免疫化し、ＩｇＧを検出する。
図１６の結果は、ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合物（他の抗原または弱毒生株のいずれかと同時投与した場合の）による免疫化は、マウスにおいて高特異抗体応答を誘導することを示している。
例２３：弱毒生型黄色ブドウ球菌株は、一部の特異抗原に対する抗体免疫応答を有意に改善する－ワクチン番号７
抗原および弱毒生型黄色ブドウ球菌株Δ７２０ΔｈｅｍＢを、例２１に記載の通りに作製する。例２１に記載の通りに、マウスを免疫化し、ＩｇＧを検出する。
図１７の結果は、弱毒生株Δ７２０ΔｈｅｍＢによる免疫化は、タンパク質混合物単独で免疫化したマウスに由来するＩｇＧ抗体で得られたものと比較して、ＳＡＣＯＬ００２９抗原に対する特異ＩｇＧ抗体の産生を有意に増加させることを示している。
例２４：弱毒生型黄色ブドウ球菌株は、黄色ブドウ球菌の追加の表面タンパク質に対する有意な抗体価を誘導する－ワクチン番号７
抗原および弱毒生型黄色ブドウ球菌株Δ７２０ΔｈｅｍＢを、例２１に記載の通りに作製する。例２１に記載の通りに、マウスを免疫化し、ＩｇＧを検出する。
図１８の結果は、弱毒生株Δ７２０ΔｈｅｍＢ（単独またはポリペプチド抗原と同時投与した場合）による免疫化は、ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７から構成されるタンパク質混合物単独で達成されたものと比較して、ブドウ球菌表面タンパク質ＣｌｆＡに対する特異抗体の産生を有意に増加させることを示している。
例２５：弱毒生型黄色ブドウ球菌株はＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答のバランスを有意に取る－ワクチン番号７
抗原および弱毒生型黄色ブドウ球菌株Δ７２０ΔｈｅｍＢを例２１に記載の通りに作製する。
ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合物タンパク質に対する血清中ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１アイソタイプを、以前の記述通りにワクチン接種マウスの血清において検出し、各マウスのＩｇＧ１力価に対するＩｇＧ２ａの比を決定した。ＩｇＧ２ａアイソタイプはマウスにおけるＴｈ１免疫応答と関連しているが、ＩｇＧ１はＴｈ２応答に関するマーカーである。例５に記載したように、雌ウシにおけるＩｇＧ２産生の誘導および乳中のＩｇＧ２力価の程度は、雌ウシの乳中の対応する体細胞（ＳＣＣ）または細菌数（ＣＦＵ）のレベルで判断した結果、黄色ブドウ球菌による負荷に対する雌ウシの防御と有意に相関している（図４Ｃ）。
図１９および２０に示す結果は、免疫化ワクチンの組み合わせ（ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７とともに投与したΔ７２０ΔｈｅｍＢ黄色ブドウ球菌）に含まれる弱毒生株Δ７２０ΔｈｅｍＢは、タンパク質混合物での免疫化（ＳＡＣＯＬ００２９、ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０およびＳＡＣＯＬ００２９－１８６７）でみられたものよりも有意に高いＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合物およびＳＡＣＯＬ００２９タンパク質に対するＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１抗体比を誘導し、有意にバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２応答をもたらすことを示している。
上記の例２１～２５は、タンパク質混合組成物における異なる抗原（例えば、ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７融合物を含む）での免疫化により強力な抗体応答が得られたとしても、これらの抗原と弱毒生株との組み合わせによるマウスの免疫化は、一部の特異抗原（例えば、ＳＡＣＯＬ００２９）に対する高い抗体価を誘導すること、その他のブドウ球菌タンパク質（例えば、ＣｌｆＡ）に対する抗体を産生すること、および生株と同時投与される抗原に対するよりバランスの取れたＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比（より強力なＴｈ１型応答の優れたマーカー）を達成することにより、黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を有意に改善したことを示している。
例２６：黄色ブドウ球菌株ΔｈｅｍＢΔ７２０における組換えタンパク質の発現－ワクチン番号８、９、１０など
遺伝子ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ００２９および／もしくはＳＡＣＯＬ１８６７に加え、遺伝子（もしくはそのフラグメント）ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７（ＳＡＣＯＬ００２９－ＳＡＣＯＬ１８６７）の融合物（例えば、サイズ５０ＡＡ以上）、ＳＡＣＯＬ７２０および／もしくはＳＡＣＯＬ０４４２のフラグメント（例えば、エピトープ）の融合物（融合物７２０－７２０）（融合物４４２－７２０）または遺伝子もしくはそのフラグメントの他のいずれかの融合物、例えば、ＳＡＣＯＬ００２９－ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ００２９－ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ００２９－ＳＡＣＯＬ０７２０－ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ００２９－ＳＡＣＯＬ０７２０－ＳＡＣＯＬ１８６７、ＳＡＣＯＬ００２９－ＳＡＣＯＬ１８６７－ＳＡＣＯＬ０４４２、ＳＡＣＯＬ０４４２－ＳＡＣＯＬ００２９－ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ０４４２－ＳＡＣＯＬ００２９－ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ０４４２－ＳＡＣＯＬ１８６７－ＳＡＣＯＬ０７２０、ＳＡＣＯＬ０７２０－ＳＡＣＯＬ０４４２－ＳＡＣＯＬ１８６７、ＳＡＣＯＬ０４０２９－ＳＡＣＯＬ１８６７－ＳＡＣＯＬ０７２０－ＳＡＣＯＬ０４４２を、構成的プロモーター（プラスミドｐＣＮ４０に由来するＰｂｌａＺ）（Charpentier et al., 2004）の下でプラスミドｐＣＮ３６（Charpentier et al., 2004）においてクローン化し、黄色ブドウ球菌ΔｈｅｍＢΔ７２０株において発現させる。本明細書で提案する特定のタンパク質抗原は、外毒素、エンテロトキシンもしくはスーパー抗原（例えば、ＳＡＣＯＬ０４４２）または宿主防御に対する防御に有用なタンパク質（例えば、ＳＡＣＯＬ０７２０）であると予測され、哺乳類の免疫系および抗体産生と潜在的に干渉する可能性があり、ならびに／あるいは、宿主において多少の毒性を示す。そのような干渉は、本明細書に記載のワクチン組成物および製剤では認められなかったが、クローン化した遺伝子がビルレンスを補完しないように、黄色ブドウ球菌ΔｈｅｍＢΔ７２０株において発現するタンパク質またはポリペプチドを修飾することが有用であり得る。そのような目的のために、分子生物学的手法を用いて、免疫原性を失うことなく、そのようなタンパク質活性に関与する推定上の領域を欠失または変異させることが可能である（Chang et al., 2008）。これは、本発明のワクチン組成物の抗原を調製するために出願人が用いたアプローチである。
構築された発現ベクターの１つを保有する各黄色ブドウ球菌ΔｈｅｍＢΔ７２０株による個々の組換えタンパク質産物の発現を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により検証する。簡潔に述べると、１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンで、ＢＨＩ中、中対数期まで増殖させた株を遠心分離し、ペレットをエタノールで不活性化した。細胞溶解およびトリプシン消化手順まで、試料を－２０℃で保存した。試料を３７℃でリゾスタフィンおよびトリプシンでインキュベートした後、ガラスビーズおよびビーズビーターを用いた機械的均質化による細胞破壊を行う。次に、壊死組織片を除去するために、ライセートを、４℃で１３０００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、トリプシンによるタンパク質消化後、標準手順により還元およびアルキル化を実施し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのＭＲＭ法を用いたタンパク質検出のために試料を注射した。
あるいは、組換えタンパク質の発現を、バクテリアライセートのウエスタンブロットによっても確認する。
例２７：抗原を発現する弱毒株によるマウスの免疫化－ワクチン番号８など
ＣＤ－１雌マウスに対し、２週間隔で２回の皮下注射によりワクチン接種する。構築された発現ベクターの１つを保有するまたはしない各黄色ブドウ球菌ΔｈｅｍＢΔ７２０株を、生理食塩水に希釈し、用量あたり１００μｌの最終容量で投与する。第１群には、二重変異体株単独を投与する。第２群には、融合物ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７を発現する二重変異体株を投与する。第３群には、融合物ＳＡＣＯＬ００２９－０４４２を発現する二重変異体株を投与する。第４群には、融合物ＳＡＣＯＬ００２９－０７２０を発現する二重変異体株を投与する。第５群には、一方が融合物ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７を発現し、もう一方が融合物ＳＡＣＯＬ００２９－０４４２を発現する二重変異体株の混合物を投与する。第６群には、一方が融合物ＳＡＣＯＬ００２９－１８６７を発現し、もう一方が融合物ＳＡＣＯＬ００２９－０７２０を発現する二重変異体株の混合物を投与する。第７群には、二重変異体株の混合物を投与する。血液試料を、初回注射の直前および２回目の注射の１２日後に採取する。試料を室温で１時間凝固させ、４℃で１０分間、２０００ｇで遠心分離する。上澄み（血清）を採取し、その後の分析まで－２０℃で保存する。マウスを２７日目に安楽死させ、心臓穿刺により血液を採取する。免疫血清を回収し、分注し、免疫前血清用として保存する。
ワクチン接種に対する免疫応答を、黄色ブドウ球菌の全細胞（Ｗｏｏｄ株）または特異組換えタンパク質に対する血清中ポリクローナルＩｇＧ抗体の存在に関して、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により評価する。抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ）を二次抗体として用いて、分光光度計を用いたペルオキシダーゼ活性による３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質酸化の比色産生量を検出する。
参考文献
Figure 0007181208000015
Figure 0007181208000016
Figure 0007181208000017
Figure 0007181208000018
Figure 0007181208000019
Figure 0007181208000020
Figure 0007181208000021
Figure 0007181208000022

Claims (23)

  1. 配列番号５５のアミノ酸配列を含み、ＳＡＣＯＬ１８６７およびＳＡＣＯＬ００２９を含む融合構築物を含んでなる、単離ポリペプチド構築物。
  2. 配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０由来のエピトープの組合せを含んでなる、単離ポリペプチド構築物。
  3. 配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド構築物を含んでなる、単離ポリペプチド構築物。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードする単離核酸分子。
  5. 請求項４に記載の単離核酸分子を含んでなるベクター。
  6. 請求項５に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
  7. 弱毒生型の黄色ブドウ球菌である、請求項６に記載の宿主細胞。
  8. 弱毒生型の黄色ブドウ球菌が、安定化した小コロニー変異体（ＳＣＶ）表現型を有する、請求項７に記載の宿主細胞。
  9. 安定化したＳＣＶ表現型を有する弱毒生型の黄色ブドウ球菌が、ΔｈｅｍＢΔ７２０黄色ブドウ球菌である、請求項８に記載の宿主細胞。
  10. 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物を含んでなる、組成物。
  11. 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物の少なくとも２つの組合せを含んでなる、組成物。
  12. 配列番号５のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ００２９、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ０４４２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ０７２０、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ１８６７、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ１９１２、および配列番号５０のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ２３８５を含む、ポリペプチド構築物を含んでなる、組成物。
  13. 配列番号２９のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ０４４２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ０７２０、ならびに配列番号５５のアミノ酸配列を含み、ＳＡＣＯＬ１８６７およびＳＡＣＯＬ００２９を含む融合構築物を含むポリペプチド構築物を含んでなる、組成物。
  14. 配列番号５のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ００２９、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＳＡＣＯＬ１８６７、ならびに配列番号５５のアミノ酸配列を含み、ＳＡＣＯＬ１８６７およびＳＡＣＯＬ００２９を含む融合構築物を含むポリペプチド構築物を含んでなる、組成物。
  15. 配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０由来のエピトープの組合せを含むポリペプチド構築物を含んでなる、組成物。
  16. 配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド構築物を含んでなる、組成物。
  17. 配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＳＡＣＯＬ０４４２およびＳＡＣＯＬ０７２０の組合せを含むポリペプチド構築物、ならびに配列番号５５のアミノ酸配列を含み、ＳＡＣＯＬ００２９およびＳＡＣＯＬ１８６７のポリペプチド融合構築物の２つのポリペプチド構築物を含んでなる、組成物。
  18. 弱毒生型の黄色ブドウ球菌をさらに含んでなる、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 弱毒生型の黄色ブドウ球菌が、安定化した小コロニー変異体（ＳＣＶ）表現型を有する、請求項１８に記載の組成物。
  20. 安定化したＳＣＶ表現型を有する弱毒生型の黄色ブドウ球菌が、ΔｈｅｍＢΔ７２０黄色ブドウ球菌である、請求項１９に記載の組成物。
  21. アジュバントをさらに含んでなる、請求項１０～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. アジュバントが、ミョウバン、油、サポニン、環状ジグアノシン－５’－一リン酸（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ）、ポリホスファジン、インドリシジン、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）、リポソームまたはそのうち少なくとも２つの組み合わせを含んでなる、請求項２１に記載の組成物。
  23. 哺乳類におけるブドウ球菌乳腺内感染（ＩＭＩ）の治療のための医薬の製造における、請求項１０～２２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
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