ES2611277T3

ES2611277T3 - Péptidos contra una infección por rotavirus

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Publication number: ES2611277T3
Application number: ES12180141.9T
Authority: ES
Inventors: Montserrat Rivero Urgell; Joan FÀBREGA SÁNCHEZ; José Antonio MORENO MUÑOZ; Esther Bataller Leiva; Javier BUESA GÓMEZ; Salvador GENOVÉS MARTÍNEZ; Daniel RAMÓN VIDAL; Adela Villanueva Roig; Beatriz Casinos Ramo
Original assignee: Laboratorios Ordesa SL
Current assignee: Laboratorios Ordesa SL
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2008-06-26
Publication date: 2017-05-08
Anticipated expiration: 2028-06-26
Also published as: EP2179028A1; EP2522358A1; ES2523575T3; EP2522358B1; SA08290392B1; WO2009000899A1; EP2179028B1; ES2523575T8

Abstract

Uso de un péptido que tiene una longitud de 11 a 17 aminoácidos y una secuencia aminoacídica que comprende SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia aminoacídica se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-16, o una sal farmacéuticamente aceptable del péptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de la diarrea en un animal que incluye un humano, en donde la diarrea está causada por un rotavirus.

Description

DESCRIPCION

Peptidos contra una infeccion por rotavirus

5 [0001] La presente invencion se refiere a una nueva cepa de Bifidobacterium que tiene actividad anti-rotavirus. Por tanto, la invencion se refiere al uso de estos agentes para el tratamiento o la profilaxis de la diarrea producida por rotavirus.

Tecnica anterior

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[0002] El rotavirus pertenece a la familia Reoviridae y recibio el nombre de “rota” debido a su doble capside que se

parece a una rueda de carro. Desde que se descubrio se ha confirmado, mediante muchos estudios epidemiologicos realizados en todo el mundo, que el rotavirus es una causa principal de diarrea aguda en bebes y en ninos

pequenos. Los rotavirus se dividen en 6 grupos antigenicos diferentes (A-F). Los rotavirus del grupo A, B y C se

15 encuentran tanto en seres humanos como en animales, y los rotavirus de los grupos D, E y F solo se encuentran en animales. Los rotavirus del grupo A se distribuyen principalmente entre cepas derivadas de ser humano y los

subgrupos se determinan por su protema de la capside interna VP6 y los tipos serologicos se determinan por las

protemas de la capside externa VP7 y VP4. Dentro del grupo A, se han diferenciado 4 subgrupos. Existen al menos 14 serotipos G, de G1 a G14, en base a la antigenicidad de la protema VP7, y 12 serotipos P, en base a las 20 propiedades antigenicas de la protema VP4.

[0003] Se sabe que los rotavirus son la causa principal de diarrea aguda y enteritis en ninos y en animales jovenes de ganado, caballos, cerdos y monos. La transmision de la infeccion se produce principalmente mediante la via fecal-oral. Los rotavirus producen frecuentemente una diarrea acuosa aguda en ninos menores de 5 anos.

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[0004] Esta diarrea inducida por rotavirus es el resultado de alteraciones en la absorcion de celulas epiteliales de la mucosa intestinal causadas por la infeccion viral. Una vez infectados los enterocitos del intestino delgado, el virus prolifera en su citoplasma y ocasiona una disfuncion en diversos sistemas de transporte (iones y/o solutos y agua). Las celulas danadas sufren descamacion y desprenden hacia el exterior el virus en el lumen intestinal, de tal manera

30 que el virus puede encontrarse en las heces. Cuando los rotavirus se replican, las celulas de las vellosidades danadas se reemplazan por celulas inmaduras de la cripta que no tienen capacidad de absorcion, produciendo una mala absorcion del sodio y la glucosa, lo que da como resultado la diarrea. Ademas, se ha identificado una protema de rotavirus no estructural, la NSP4, como una enterotoxina viral. La NSP4 aumenta los niveles de calcio intracelular y afecta a la permeabilidad de las membranas plasmaticas, produciendo una salida de cloro, sodio y agua, 35 induciendo por lo tanto una diarrea secretora.

[0005] La Organizacion Mundial de la Salud calcula que cinco millones de ninos menores de 5 anos mueren de diarrea cada ano, y el 20 % de ellos mueren por diarrea inducida por rotavirus. La diarrea inducida por rotavirus prevalece durante el invierno y es una de las causas principales de mortalidad infantil en pafses desarrollados. La

40 mejor medida para prevenir la enfermedad es la lactancia materna. Dado que la leche de la madre contiene IgA que actuan contra rotavirus, la lactancia materna puede impedir la diarrea infantil causada por rotavirus.

[0006] En los ultimos anos las investigaciones se han centrado en el posible uso de agentes probioticos. Los probioticos se definen como microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren

45 al hospedador un beneficio saludable. Los beneficios que se conocen sobre la administracion enteral de

microorganismos probioticos incluyen defensa potenciada del hospedador contra la enfermedad mejorando las

propiedades de la microflora endogena y aumento de la resistencia a la colonizacion contra la microflora perjudicial. Se ha sugerido que los probioticos desempenan una importante funcion en la formacion o establecimiento de una microflora intestinal bien equilibrada, indfgena, en ninos recien nacidos o en adultos que reciben altas dosis de 50 antibioticos. Se han recomendado bacterias acidolacticas, especialmente cepas espedficas de Lactobacillus y de especies de los generos Streptococcus, Enterococcus y Bifidobacterium para su uso como probioticos.

[0007] Desde 1960 el genero bacteriano Lactobacillus se ha estudiado frecuentemente en ninos con respecto a sus propiedades antidiarreicas. Estudios publicados en la bibliograffa mundial han llegado a la conclusion de que el

55 Lactobacillus es de hecho inocuo y eficaz en el tratamiento y prevencion de la diarrea infecciosa, diarrea asociada

con antibioticos y diarrea en ninos que son muy susceptibles como resultado de una mala nutricion, estado

inmunitario alterado, o frecuente exposicion a patogenos. A pesar de estos informes, medicos de los Estados Unidos no recomiendan rutinariamente el uso Lactobacillus, pensando quizas que su eficacia aun no se ha probado (consultese, C.W. Christakis et al., “Lactobacillus therapy for acute infectious diarrhea in children: A meta-analysis” 60 Pediatrics 2002, vol. 109, pags. 678-84). J.M. Saavedra et al., “Feeding of Bifidobacterium bifidum and Streptococcus thermophilus to infants in hospital for prevention of diarrhea and shedding of rotavirus” Lancet 1994, vol. 344, pags. 1046-9, analizaron una formula con Bifidobacterium bifidum y Streptococcus thermophilus con ninos hospitalizados.

65 [0008] Diversos estudios han mostrado la eficacia de otros agentes probioticos, incluyendo Lactobacillus

rhamnosus GG (LGG), en la prevencion de la diarrea. Diversos ensayos clmicos pediatricos mostraron la eficacia del LGG en el tratamiento de la gastroenteritis por rotavirus (consultese, Guandalini et al., “Lactobacillus GG administered in oral rehydration solution to children with acute diarrhea: a multicenter European study”, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2000, vol. 30, pags. 54-60).

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[0009] Se han propuesto otras estrategias para el tratamiento de la diarrea, por ejemplo:

[0010] El documento EP 1571213 A1 desvela una nueva cepa de Bifidobacterium longum AR81 (KCCM-10492) y una protema activa separada de la cepa con la secuencia de 10 aminoacidos HLDLAVENT, que tiene actividad

10 inhibidora de rotavirus.

[0011] Todos los ejemplos y datos que figuran en el documento EP 1571213 A1 se realizan con una protema citoplasmatica, una proteasa presente en las celulas. Por tanto, para obtener el ingrediente activo en primer lugar las celulas deben procesarse (lisarse) para obtener los componentes citoplasmaticos o los componentes de la pared

15 celular.

[0012] El documento JP 08259597 desvela una protema preparada a partir del cultivo de la cepa SBT 2928 de Bifidobacterium longum capaz de interferir con la adhesion de patogenos (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, etc.) a la asialo-GM1. La protema presenta un peso molecular de 10,4 kDa (filtracion en gel) o de 52

20 kDa (SDS-PAGE) y un pl de 5,8. Sus aminoacidos N-terminales se definen como VDPHAIVPSNFDFAFL.

[0013] El documento EP 1353681 A1 describe el uso de la cepa CNCM-2168 de Bifidobacterium para prevenir la infeccion de celulas intestinales por rotavirus.

25 [0014] El documento WO 2003010297 A1 describe cepas probioticas de Bifidobacterium, AH208, AH209, AH210, AH211, AH212 o AH214, y su uso en el tratamiento de diversas enfermedades.

[0015] El documento WO 0042168 A1 describe una cepa de Bifidobacterium (Bifidobacterium longum infantis UCC35624) con efectos significativamente inmunomodulares, utiles en la profilaxis y/o tratamiento de la actividad

30 inflamatoria no deseable, especialmente actividad inflamatoria gastrointestinal tal como enfermedad inflamatoria intestinal o smdrome del intestino irritable.

[0016] El documento US 5922375 describe una cepa de Bifidobacterium longum (JBL 28-1/3300) y su uso contra la diarrea.

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[0017] Por otro lado, el documento EP1359157 desvela peptidos derivados de casema, obtenidos por hidrolisis de casema por Lactobacillus helveticus y que tienen el efecto de inhibir una metaloproteinasa. Los peptidos se usan en productos alimenticios para la inhibicion de metaloproteinasas de la matriz y por lo tanto se aplican para la inhibicion de invasion y metastasis cancerosa, ulceracion tisular, artritis y periodontitis, asf como para la inhibicion de

40 osteoclastos.

[0018] El documento WO 0230958 desvela el decapeptido de secuencia HQPHQPLPPT que, una vez aislado por hidrolisis enzimatica de casema bovina, influye en el crecimiento de una lmea de celulas de insecto (en concreto la lmea de celulas de insecto IPLB-Sf-21).

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[0019] Hay una necesidad urgente, tanto en el mundo desarrollado como en pafses endesarrollo, de productos y metodos que sean eficaces en el tratamiento de la diarrea infecciosa, y espedficamente la diarrea causada por infeccion por rotavirus o asociada con terapia con antibioticos.

50 Sumario de la invencion

[0020] El problema a resolver por la presente invencion es el suministro de agentes con actividad anti-rotavirus y por tanto, eficaces para el tratamiento de la diarrea.

55 [0021] Durante los intensos estudios que condujeron a la presente invencion los inventores han investigado diferentes cepas bacterianas aisladas de heces de bebes alimentados con leche materna. Se examinaron diferentes cepas con respecto a su capacidad para prevenir la infeccion de celulas intestinales con rotavirus que se sabe que producen diarrea.

60 [0022] La solucion se basa en la cepa de Bifidobacterium longum biovariedad infantis depositada con el Numero de registro CECT 7210.

[0023] Como se ilustrad mas adelante, de una manera no limitada, los inventores han descubierto que la cepa de Bifidobacterium longum biovariedad infantis de la presente invencion es eficaz para la proteccion contra infeccion por 65 rotavirus. La cepa de la invencion ha demostrado ser particularmente util para la inhibicion de la replicacion de

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diversas cepas de rotavirus. El efecto inhibidor se obtiene tanto con las celulas probioticas intactas como con los sobrenadantes de cultivos de la cepa que crece en presencia de casema. El efecto se observa con celulas probioticas completas intactas, no siendo necesario la lisis de las celulas probioticas para observar el efecto inhibidor. Esto hace que la cepa de la invencion sea util en composiciones y productos en los que la cepa esta en 5 forma entera/viva. La cepa de la invencion es activa contra infecciones por diarrea debido al efecto en la potenciacion de la respuesta inmunitaria y tambien debido a la presencia de peptidos en el sobrenadante dando como resultado la fermentacion de la cepa.

[0024] Por tanto, en un aspecto, la presente invencion proporciona una cepa de Bifidobacterium longum 10 biovariedad infantis depositada en la “Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT)” con el numero de registro CECT

7210, o un mutante de la misma que tiene una actividad de inhibir la infeccion por rotavirus y que tiene la capacidad de producir un peptido a partir de la fermentacion de la p-casema de la leche de vaca, teniendo dicho peptido una longitud de 11 a 17 aminoacidos y una secuencia de aminoacidos que comprende la SEC ID N°: 1. La cepa CECT 7210 se deposito el 20 de noviembre de 2006.

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[0025] En un segundo aspecto, la presente invencion se refiere a un cultivo bacteriano que comprende la cepa de la invencion.

[0026] Un tercer aspecto de la invencion se refiere a una preparacion bacteriana que comprende la cepa de la 20 invencion.

[0027] Un cuarto aspecto de la invencion se refiere a un producto alimenticio que comprende una cantidad nutricionalmente eficaz de la cepa de la invencion, junto con cantidades apropiadas de otros ingredientes comestibles.

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[0028] En un quinto aspecto, la invencion se refiere a una composicion nutricional que comprende una cantidad nutricionalmente eficaz de la cepa de la invencion, junto con cantidades apropiadas de otros ingredientes comestibles.

30 [0029] En un sexto aspecto, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de la cepa de la invencion, junto con cantidades apropiadas de excipientes y/o vehmulos farmaceuticamente aceptables.

[0030] Un septimo aspecto de la invencion se refiere a la cepa como se define anteriormente, para su uso como 35 un probiotico.

[0031] Otros aspectos de la presente invencion se refieren al uso de la cepa de la invencion, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o preventivo de la diarrea en un animal, incluyendo un ser humano, o para la fabricacion de un producto alimenticio, o de una composicion nutricional.

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[0032] Otro aspecto se refiere al uso de la cepa de la invencion para la preparacion de un peptido que tiene una longitud de 11 a 17 aminoacidos y una secuencia de aminoacidos que comprende la SEC ID N°: 1, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.

45 [0033] Como alternativa la invencion puede formularse como un metodo para el tratamiento terapeutico y/o preventivo de la diarrea, en un animal que incluye un ser humano, que comprende administrar a dicho animal que lo necesite una cantidad eficaz de la cepa de la invencion. El tratamiento de la diarrea se amplfa a diarrea causada por virus gastrointestinales, tales como norovirus, rotavirus y astrovirus, o por patogenos microbianos, tales como miembros de los generos Escherichia, Clostridium, Salmonella, Shigella y Vibrio. El tratamiento de la invencion es 50 particularmente util para la diarrea causada por infeccion por rotavirus.

[0034] Finalmente, la invencion se refiere a un proceso para la preparacion de un peptido como se ha definido anteriormente, o de una sal del mismo farmaceuticamente aceptable, comprendiendo el proceso la fermentacion de la p casema de leche de vaca, que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID N°: 1, con la cepa de la

55 invencion, y opcionalmente aislar el peptido y convertirlo en una sal farmaceuticamente aceptable.

[0035] Estos y otros objetos de la presente invencion se describiran adicionalmente en la seccion de descripcion detallada mas adelante, y no pretenden limitar la presente invencion. A menos que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en el presente argumento tienen el mismo significado al normalmente

60 entendido por un experto habitual en la tecnica a la cual pertenece esta invencion. Los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la practica de la presente invencion. A lo largo de la descripcion y de las reivindicaciones, la palabra “comprende” y sus variaciones no pretende excluir otras caractensticas, aditivos, componentes o etapas tecnicas. Otros objetos, ventajas y caractensticas de la invencion se pondran de manifiesto para los expertos en la tecnica despues de examinar la 65 descripcion o pueden adquirirse a traves de la realizacion practica de la invencion.

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Descripcion detallada de realizaciones particulares

[0036] En las siguientes secciones se describe la caracterizacion detallada de la cepa de la invencion y los peptidos aislados del sobrenadante de la cepa despues de la fermentacion, y su actividad anti-rotavirus.

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[0037] Como se usa en la tecnica, el termino “microorganismo” se refiere a organismos que son microscopicos e incluyen bacterias, levaduras, hongos, arqueas o protistas. En el presente documento, el termino “bacteria” se usa, al igual que en la tecnica, para indicar un microorganismo unicelular que es procariota, es decir, que carece de un nucleo y organulos delimitados por una membrana. El termino “probiotico” se refiere a bacteria en el contexto de

10 complementos dieteticos. Generalmente, el termino probiotico se refiere a complementos dieteticos que contienen bacterias o levaduras posiblemente beneficiosas, siendo las bacterias acidolacticas los microbios mas comunes usados. La expresion “cantidad eficaz”, como se usa en el presente documento, significa una cantidad de un ingrediente activo lo suficientemente alta como para administrar el beneficio deseado, pero lo suficientemente baja como para impedir que se produzcan efectos secundarios graves dentro del ambito del criterio medico. La expresion 15 “farmaceuticamente aceptable” como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificacion que son, dentro del ambito del buen criterio medico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto (por ejemplo, ser humano) sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica, u otro problema o complicacion, acorde con una relacion beneficio/riesgo razonable. Cada vetnculo, excipiente, etc., tambien debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la 20 formulacion. Vetnculos, excipientes, etc. adecuados pueden encontrarse en textos farmaceuticos convencionales, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990.

[0038] El ambito de la presente invencion tambien incluye bacterias obtenidas por mutacion de la cepa Bifidobacterium longum biovariedad infantis CECT 7210, siempre que las bacterias resultantes tengan la actividad

25 de inhibir rotavirus. En realizaciones particulares de la invencion, el mutante es un mutante modificado geneticamente obtenido por mutagenesis clasica (es decir, usando agentes qmmicos o ffsicos) o por tecnicas de modificacion por ingeniena genetica.

[0039] El uso general de la cepa de la invencion es en forma de celulas viables. Esto significa la introduccion de 30 las bacterias vivas en una composicion no fermentada. De esta manera, la administracion de dichas composiciones

permite que se produzca la actividad anti-rotavirus en el tracto gastrointestinal individual.

[0040] Sin embargo, la invencion tambien puede ampliarse a celulas no viables en composiciones que comprenden factores beneficiosos expresados por la cepa en un proceso previo. En particular, en la presente

35 invencion, esto puede ser el resultado de exponer la cepa de la invencion a fermentacion en un medio adecuado de tal manera que pueda producirse el peptido producido por la cepa de la invencion. Son medios adecuados para la produccion del peptido producido por la cepa de la invencion los medios basados en leche de vaca que comprenden P-casema pero en la produccion del peptido tambien son eficaces otras composiciones de medios que comprendan P-casema de leche de vaca. Por tanto, el individuo ingiere el producto fermentado que comprende el peptido 40 producido por la cepa de la invencion y las celulas no viables resultantes del proceso de fermentacion. Las composiciones pueden comprender una combinacion de celulas no viables y viables.

[0041] En este sentido, una realizacion de la presente invencion es una preparacion bacteriana que comprende la cepa de la invencion en forma de pfldoras, capsulas o polvo liofilizado para administrar directamente.

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[0042] En otras realizaciones, la cepa de la invencion puede usarse para la preparacion de diversos productos alimenticios, tales como productos lacteos, un yogur, una cuajada, un queso (por ejemplo, queso batido (quark), cremoso, procesado, blando y duro), una leche fermentada, una leche en polvo, una leche basada en producto fermentado, un helado, un producto basado en cereal fermentado, un polvo basado en leche, una bebida, un postre,

50 y un alimento para mascotas. Ejemplos de otros productos alimenticios son productos carnicos (por ejemplo, pasta de tngado, salchichas Frankfurt y salami o pastas de carne para untar), pastas de chocolate para untar, rellenos (por ejemplo, trufa, crema) y merengues, chocolate, golosinas (por ejemplo, caramelo, dulce de caramelo o toffee), productos de panadena (galletas, pasteles), salsas y sopas, zumos de fruta y blanqueadores de cafe. Sin embargo, la expresion “producto alimenticio” se usa en el presente documento en su amplio significado, incluyendo cualquier 55 tipo de producto, en cualquier forma de presentacion, que pueda ingerir un animal.

[0043] En otras realizaciones, la cepa de la invencion puede usarse para la preparacion de diversas composiciones nutricionales. Son realizaciones particulares un complemento dietetico, un aditivo y una formula lactea infantil. Los complementos dieteticos estan destinados a aportar nutrientes (vitaminas, minerales, acidos

60 grasos o aminoacidos) que se pierden o que una persona no consume en cantidades suficientes en la dieta (ninos, gestantes, personas de avanzada edad, etc.). En una realizacion particular, la cepa de la invencion esta homogeneizada con otros ingredientes, tales como cereales o leche en polvo para constituir una formula lactea infantil.

65 [0044] En dichos productos y composiciones, la cepa esta presente en una cantidad de aproximadamente 105

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ufc/g a aproximadamente 109 ufc/g de la composicion, y preferentemente en una cantidad de 107 ufc/g de acuerdo con la actual legislacion. Para los fines de la presente invencion, la abreviatura “ufc” designara una “unidad formadora de colonias” que se define como el numero de celulas bacterianas revelado por recuentos microbianos en placas de agar. Dependiendo del producto, las bacterias seran vivas o no viables.

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[0045] La presente invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden una cepa de la invencion. En este sentido, la composicion farmaceutica puede prepararse en forma de comprimidos, complementos orales deshidratados, alimentacion seca por sonda, etc., estando incluida la cantidad de bacterias a incorporar en el intervalo de 107 ufc/g a aproximadamente 1011 ufc/g de producto y preferentemente una cantidad de 109 ufc/g.

10 Dependiendo del objetivo deseado, el experto en la tecnica seleccionara los excipientes y/o vehmulos apropiados. Bifidobacterium no es estable en forma lfquida, por tanto se prefieren preparaciones deshidratadas.

[0046] En general, las composiciones pueden comprender las bacterias de la invencion como un solo agente probiotico contra la diarrea, como combinaciones de dichos probioticos o como combinaciones con otros agentes

15 terapeuticos/nutraceuticos dependiendo de la afeccion.

[0047] En una realizacion particular, la secuencia peptfdica de aminoacidos producida por la cepa de la invencion se selecciona del grupo que consiste en SEC ID N°: 1-16: En una realizacion mas particular, el peptido tiene la secuencia de aminoacidos MHQPHQPLPPT (SEC ID N°: 1) y un peso molecular de 1286,63 Da. En otra realizacion,

20 el peptido tiene 13 aminoacidos, un peso molecular de 1513 Da y una secuencia MHQPHQPLPPTVM (SEC ID N°: 3). Estas secuencias corresponden a fragmentos de p-casema de la leche de vaca. Otros peptidos con una secuencia de aminoacidos que comprende la SEC ID N°: 1 y producida por la cepa de la invencion pueden ser utiles para los fines de la invencion (SEC ID N°: 2, 4-16).

25 [0048] La invencion se refiere a un proceso para la preparacion de los peptidos descritos anteriormente, que comprende fermentar la p-casema de la leche de vaca, que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID N°: 1, con una cepa de la invencion y opcionalmente aislar el peptido y/o convertirlo en una sal farmaceuticamente aceptable.

30 [0049] Las siguientes secciones describen la caracterizacion de la cepa de la invencion, la caracterizacion de los peptidos aislados del sobrenadante de la cepa de la invencion despues de la fermentacion y la actividad antirotavirus de la cepa y los peptidos.

1. Aislamiento de microorganismos 35

[0050] Se disolvio 1 g de heces de bebes alimentados con leche materna en tampon PBS (tampon fosfato pH 7,0) homogeneizando la muestra por maceracion durante 3 minutos en un stomacher (Bagmixer 400P, Interscience Worlwide, Francia). Se incubo 1 ml de almuota del homogeneizado en caldo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) complementado con 0,05 % (p/v) de cistema (MRS-C; Sigma, St. Louis, Mo) a pH 3,0 con HCl durante 17 h a 37 °C 40 en condiciones anaerobias. Almuotas de esta preincubacion se sembraron en placas a diferentes diluciones en un medio general de MSR-C y dos medios selectivos para Bifidobacferium: BSM (BSM, Fluka, Buchs, Suiza) y BFM (BFM; Y. Nebra et al., “A new selective medium for Bifidobacteriumspp." Applied and Enviromental Microbiology, 1999, vol. 65, pags. 5173-6) y se incubaron durante 36 a 72 h. La morfologfa de la colonia y el tipo de pared celular de las cepas obtenidas se determinaron por tincion Gram. Con este protocolo, las bacterias resistentes a pH acido 45 se seleccionan por preincubacion de las muestras de heces en MRS-C lfquido durante 17 h a pH 3,0. De todas las cepas obtenidas, se seleccionaron 30 aislados para sembrar simultaneamente en placas de medio de Lactobacillus (MRS-C) y en medios selectivos de Bifidobacferium (BSM y BFM). Se observo que un 70 % perteneda al genero Bifidobacferium a diferencia del 30 % que perteneda al genero Lactobacillus.

50 [0051] Algunas cepas se seleccionaron para la caracterizacion. Los siguientes resultados son para la cepa seleccionada de la invencion, Bifidobacterium longue biovariedad infantis depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con el numero de registro CECT 7210.

2. Caracterizacion taxonomica de la cepa CECT 7210 por secuenciacion 55

[0052] Casi toda la secuencia del ARNr 16S se amplifico y se secuencio usando un Kit de Reaccion de Ciclo de Secuenciacion Rapido BigDye Terminador de ABI PRISM. Se comprobo la pureza del ADN usando procedimientos convencionales.

60 [0053] Los moldes de ADN se amplificaron por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) en un termociclador usando cebadores universales que amplifican una region de 1000 pb del gen de ARNr 16S, 616V: 5'- AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3' (SEC ID N°: 17), 699R: 5'-RGGGTTGCGCTCGTT-3' (SEC ID N°: 18). La mezcla de amplificacion (100 |il) comprendfa 2 |il (50 pmol/^l) de cada uno de los cebadores 616V y 699R, 0,5 |il (2 U/|il) de Taq ADN Polimerasa (Finnzymes), 10 |il de tampon de reaccion 10x (Finnzymes), 10 |il de mezcla de dNTP (que

contema 1 mM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, Roche), 70 |il de agua filtrada esteril (Milli-Q purification system, Millipore) y 5,5 |il de molde de ADN. Los moldes de ADN se amplificaron por desnaturalizacion inicial a 94 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalizacion a 94 °C durante 1 min, hibridacion a 55 °C durante 1 min, extension a 72 °C durante 1 min, y una extension final a 72 °C durante 10 min. Los controles, sin ADN, se 5 incluyeron simultaneamente en el proceso de amplificacion. Se evaluo la integridad de los productos de la PCR mediante el revelado de bandas sencillas despues de la electroforesis durante 1 h a 100 V en geles de agarosa al 2 % (p/v) en tampon de Tris-borato EDTA.

[0054] Los amplicones se purificaron usando un kit comercial y se realizaron reacciones de secuenciacion 10 posteriores usando el kit de Ciclo de Secuenciacion Big Dye Terminador v3.1, formato premezclado. Los cebadores

de secuenciacion eran los mismos que se utilizaron en la reaccion de amplificacion pero diluidos diez veces (5 pmol). Las secuencias resultantes se alinearon automaticamente y despues se inspeccionaron visualmente. Las secuencias genicas resultantes del ARNr 16S se compararon con las del NCBI utilizando la herramienta de busqueda BLAST.

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[0055] La secuencia obtenida fue como se describe en SEC ID N°: 19 y se correlaciona con la identificacion de la cepa CECT 7210 como Bifidobacterium longum biovariedad infantis.

3. Caracterizacion fisiologica de la cepa CECT 7210 para su uso como probiotico

20

3.1. Resistencia a jugos gastrointestinales

[0056] Se prepararon jugos gastricos y pancreaticos inmediatamente antes de su uso, resuspendiendo, en solucion salina esteril al 0,5 % (p/w), pepsina de membrana mucosa de estomago de cerdo (3 g/l) y pancreatina de 25 pancreas de cerdo (1 g/l). La cepa bacteriana crecio durante 24 h a 37 °C en condiciones anaerobias, se lavo dos veces en solucion salina al 0,5 % y se llevo a un inoculo de 108-109 ufc/ml. El ensayo emulo las condiciones y el tiempo de exhibicion a los que se someten las bacterias en su paso por el tracto gastrico e intestinal en dos fases. La primera fase consistfa en la simulacion del paso por el tracto gastrico, para lo cual se preparo un inoculo del 1 % (v/v) de las bacterias en 10 ml de solucion salina con pepsina ajustado a un pH de 3,0 con HCl e incubando a 37 °C 30 en condiciones anaerobias durante 120 min. La segunda fase consistfa en la simulacion del paso por el tracto intestinal, para lo cual las celulas se neutralizan lavandolas con un tampon fosfato (PBS) a un pH de 7,0 y se resuspendieron en la solucion salina con la pancreatina ajustada a un pH de 8,0 con NaOH e incubando a 37 °C en condiciones anaerobias durante 240 min. Las muestras se tomaron a los 0/90/120 minutos en la primera fase y a los 0/60/240 minutos en la segunda, preparando, en cada caso, diluciones en serie, sembrando 100 |il de cada dilucion 35 por placa de medio solido MRS-C e incubando durante dos dfas a 37 °C en condiciones anaerobias. Como control de viabilidad a lo largo del proceso, la cepa se inoculo en solucion salina y se incubo en las mismas condiciones tomando alfcuotas al inicio, despues de 120 minutos y al final del ensayo.

[0057] Despues de la incubacion, las bacterias se recuperaron en placas con MRS-C y se realizaron recuentos 40 viables despues de 48 h de incubacion. La cepa CECT 7210 mostro una perdida de viabilidad despues de la exposicion a los jugos, similar a la obtenida usando otros probioticos comerciales. El porcentaje de viabilidad se calculo como la relacion entre el numero de celulas viables obtenido en cada una de las fases del ensayo por el numero de celulas viables en el tiempo cero (inoculo 107-108 ufc/ml).

45

TABLA 1. Efecto in vitro de los jugos c: astrointestinales en la viabilidad de la cepa CECT 7210

: Pepsina pH 3, 120 min Pancreatina pH 8, 240 min

Inoculo ufc/ml: recuento % viable recuento % viable

1,6 x 108: 5,5 x 106 3,4 % 3,10 x 105 0,2 %

3.2. Perfil de sensibilidad a antibioticos

[0058] La sensibilidad de la cepa CECT 7210 a antibioticos se determino mediante tecnicas de difusion en agar 50 usando discos impregnados con diferentes concentraciones de antibioticos. Las bacterias crecieron en MRS-C lfquido a 37 °C durante 24 h, se recogieron lavandolas varias veces con solucion salina y ajustando el inoculo a 109 ufc/ml (DO600 = 5). En estas condiciones se tomaron 100 |il de la suspension celular y se sembraron en 10 ml de agar MRS-C semisolido al 0,7 % (p/v) a 50 °C. Este agar se derramo sobre una placa de MRS-C y se dejo solidificar a temperatura ambiente. Una vez seco, los discos con antibioticos se colocaron sobre la superficie. Despues de 24 h 55 de incubacion en condiciones anaerobias, se observo la presencia o ausencia de halos de inhibicion. Para observar la resistencia o sensibilidad de la cepa, se ensayo un total de 16 antibioticos (TABLA 2).

TABLA 2. Resistencia a antibioticos para la cepa CECT 7210. Valores expresados en mml de halo inhibicion

Antibiotico: Cepa CECT 7210

Amoxicilina (25 |ig): 25

Carbenicilina (100 |ig): 32

Oxacilina (1 |ig): 0

Penicilina (6 |ig): 30

Vancomicina (30 |ig): 0

Cloramfenicol (30 |ig): 21

Eritromicina (15 |ig): 26

Gentamicina (10 |ig): 0

Kanamicina (30 |ig): 0

Tetraciclina (30 |ig): 30

Metronidazol (5 |ig): 0

Acido nalidfxico (30 |ig): 0

Rifampicina (5 |ig): 33

Trimetoprim (5 |ig): 12

Polimixina B (300 UI): 0

Sulfonamida (200 |ig): 0

3.3. Resistencia a sales biliares, a NaCI y a pH acido

5 [0059] Se analizo la resistencia de la cepa CECT 7210 a diferentes concentraciones de sales biliares Oxgall, NaCl y pH. El ensayo se baso en la monitorizacion del crecimiento de las bacterias en placas de 96 pocillos. A cada pocillo se anadieron 100 |il de un inoculo a una DO600 = 1 y 175 |il de medio MRS-C complementado con Oxgall (p/v) al 0 %, 0,5 %, 1 %, 2 % y 3 %, medio MRS-C complementado con NaCl (p/v) al 0 %, 2 %, 3 %, 6 %, 8 % y 10 % o MRS-C a pH 6,2, pH 3,0, pH 2,0 y pH 1,5. El crecimiento se analizo a 655 nm en un lector de microplacas durante 10 24 h de incubacion a 37 °C en condiciones anaerobias. Los resultados mostraron que la cepa CECT 7210 era capaz de crecer en presencia de diferentes concentraciones de sales biliares, no encontrandose diferencias entre las cuatro concentraciones ensayadas. En lo que respecta a la resistencia al pH, los resultados muestran que, para los pH acidos ensayados, existe una inhibicion del crecimiento de la cepa CECT 7210 para un pH mas bajo de 3,0. Estos datos sirven como un indicador de la sensibilidad de la cepa CECT 7210 a pH acidos en ensayos in vivo 15 durante largos periodos de tiempo (24 h). Sin embargo, es necesario considerar que las condiciones in vivo son otras. Por un lado, el tiempo transitorio del probiotico en el estomago, donde se alcanzaban estos pH, no supera normalmente las dos horas y pasa rapidamente al intestino delgado donde se neutraliza el pH permitiendo el crecimiento bacteriano. Por otro lado, in vivo, el probiotico se ingiere junto con otros compuestos (vehfculo) que pueden amortiguar el efecto inhibidor del pH del estomago. En lo que se refiere a la resistencia a NaCl, el resultado 20 mostro que para concentraciones entre 0 y 2 % no se apreciaba una inhibicion del crecimiento. Sin embargo, una vez que la concentracion era de hasta el 3-6 %, se observaba una pequena inhibicion del crecimiento pero era con NaCl al 8-10 % cuando el crecimiento se inhibfa aparentemente.

3.4. Adhesion de la cepa CECT 7210 a la mucosa intestinal 25

[0060] Se utilizo mucina de cerdo de tipo III a una concentracion de 0,5 mg/ml. La cepa CECT 7210 se marco con radioactividad anadiendo al medio de cultivo 10 |il/ml de timidina tritiada (5-3H-timidina 120 Ci/mmol; Amserham Biosciences) y se incubo a 37 °C durante 17 h en condiciones anaerobias. Como controles en el estudio de adhesion se utilizaron tres cepas comerciales de Lactobacillus casei (LC), Lactobacillus rhamnosus (LR) y Bifidobacterium 30 longum biovariedad infantis (BLI). La mucosa se disolvio en tampon HEPES (acido (W-2-hidroxietil piperazin-A/-2- etanosulfonico) - Hanks (HH; HEPES 10 mM, pH 7,4) a la concentracion deseada y se inmovilizo en placas multipocillo de poliestireno (Maxisorp, Nunc) anadiendo 100 |il de esta solucion a cada uno de los pocillos e incubando a 4 °C durante una noche. La mucosa no inmovilizada se retiro mediante dos lavados sucesivos con 200 |il de tampon HH. Despues del ultimo lavado, a cada pocillo se anadieron 100 |il de tampon HH. Las bacterias 35 marcadas con radioactividad se centrifugaron (6000 rpm durante 7 minutos) y se lavaron dos veces con tampon HH para eliminar la timidina no metabolizada, despues de lo cual la concentracion de las bacterias se determino midiendo la absorbancia a 600 nm ajustando a una DO de 0,25 + 0,05 con el fin de normalizar el numero de bacterias a 107-108 ufc/ml. A cada uno de los pocillos donde estaba inmovilizada la mucosidad se anadieron 100 |il de celulas marcadas y se incubo durante 1 h a 37 °C. La eliminacion de las bacterias no adherentes se realizo 40 mediante dos lavados de 200 |il con tampon HH. Las bacterias adheridas se liberaron mediante un raspado de la mucosidad inmovilizada en cada pocillo y se sometieron a lisis mas tarde con 1 % (p/v) de SDS en NaOH 0,1 M (200

8

|il por pocillo) incubando las placas a 60 °C durante 1 h. El contenido de las celulas se transfirio a tubos eppendorf que conteman Kquido de centelleo para medir la radioactividad en un contador de centelleo. La adhesion se expreso como porcentaje de radioactividad recuperada despues de la adhesion en relacion con la radioactividad de la suspension bacteriana anadida a la mucosidad inmovilizada. La adhesion bacteriana se determino en tres 5 experimentos independientes y cada ensayo se realizo por cuadriplicado.

[0061] La cepa CECT 7210 mostro una buena capacidad de adhesion del 9,9 % similar a la de las cepas control (BLI 6,4 %, LC 7,0 % y LR 9,8 %).

4. Actividad in vitro contra rotavirus

10

4.1. Efecto competitivo de la cepa CECT 7210 frente a sitios de union celular contra rotavirus Wa humano

[0062] La cepa CECT 7210 se cultivo durante 17 h a 37 °C en condiciones anaerobias. Los cultivos se lavaron con solucion salina (0,09 %) a un inoculo de 3x106 ufc/ml. Simultaneamente, se indujo la formacion de una monocapa de

15 celulas HT-29 y MA-104 en placas de 96 pocillos. Los ensayos se realizaron siguiendo dos estrategias A y B.

[0063] Estrategia A - primero incubacion de la cepa CECT 7210 con el rotavirus y despues infeccion de los cultivos celulares con la mezcla de suspension bacteriana-virus. Estrategia B - primero incubacion de cepa CECT 7210 con los cultivos celulares y despues infeccion con rotavirus.

20

[0064] Estrategia A: 30 |il de la suspension bacteriana de la cepa CECT 7210 que contema 3x106 se mezclaron con 70 |il de medio D-MEM sin suero. A esta suspension se anadieron 100 |il de rotavirus Wa humano a una concentracion de 1x107 uff/ml fuff” es unidades formadoras de focos), a la dilucion adecuada, en medio D-MEM. Las mezclas de suspension bacteriana-virus se incubaron a 37 °C durante 1 h. Las monocapas de celulas se lavaron 3

25 veces con tampon PBS y se inocularon con la mezcla de suspension bacteriana-virus durante 18 h a 37 °C con 5 % de CO2. Las celulas infectadas con rotavirus se identificaron mediante la tecnica de inmunoperoxidasa para evaluar la capacidad inhibidora de la replicacion viral.

[0065] Estrategia B: 30 |il de la suspension bacteriana de la cepa CECT 7210 que contema 3x106 se mezclaron 30 con 70 |il de medio D-MEM sin suero. El medio de mantenimiento de las monocapas celulares se elimino lavandolas

3 veces con tampon PBS y se anadieron 100 |il/pocillo de la suspension bacteriana. Despues de una hora de incubacion a 37 °C, se anadieron 100 |il/pocillo de virus (1x107 uff/ml) en medio D-MEM. Despues, se incubo durante 18 h a 37 °C con 5 % de CO2 y las celulas infectadas con rotavirus se identificaron tambien usando la tecnica de inmunoperoxidasa (vease a continuacion).

35

[0066] Para detectar el anffgeno viral con inmunoperoxidasa en cultivos de celulas HT-29 y MA-104, despues de infectar los cultivos celulares con el virus, estos se lavaron dos veces con tampon PBS, se fijaron con metanol- acetona (1:1) durante 15 minutos y se lavaron de nuevo con tampon PBS. Se anadio el anticuerpo monoclonal anti- VP6 2F3E7 diluido 1/200 en tampon PBS que contema BSA al 1 % (100 |il/pocillo) y se incubo a 37 °C durante 1 h.

40 Despues de dos lavados con tampon PBS, se anadieron 100 |il/pocillo de anticuerpo anti-IgG de raton conjugado con peroxidasa (Sigma) diluido a 1/2000 en tampon PBS-BSA al 1 %, y se incubo a 37 °C durante 1 h. Despues de tres lavados con tampon PBS, se anadieron 100 |il/pocillo de sustrato de diamin-bencidina (6 mg DAB, 9 ml de Tris- HCl 50 mM pH 7,6 y 0,1 ml de H2O2). Los focos infecciosos tenidos con peroxidasa se contaron con un microscopio invertido. El recuento del numero de focos infecciosos se realizo en 5 campos definidos por pocillo. La media 45 aritmetica se calculo para determinar el numero de focos por campo microscopico y se comparo con los datos de un control de virus sin tratamiento con la cepa CECT 7210 para obtener el porcentaje de reduccion de focos infecciosos.

[0067] Se usaron cultivos de celulas HT-29 y MA-104 y se anadio un inoculo de bacterias de la cepa CECT 7210 50 de 3x106 ufc/ml, en tampon PBS a una alta dosis de rotavirus Wa humano. Estos ensayos se realizaron siguiendo

las dos estrategias explicadas anteriormente. Los resultados obtenidos en ambos ensayos fueren similares. Considerando los medios de ambos ensayos, la cepa CECT 7210 produjo una reduccion de focos infecciosos de un 39,17 % en celulas HT29 y de un 25 % en celulas MA104. Sin embargo, se detecto un aumento ligero de inhibicion en el ensayo B indicando que la interaccion del probiotico con la superficie de las celulas de mamffero desempena 55 una funcion importante en el mecanismo de inhibicion.

4.2.1. Produccion de sobrenadante que contiene la sustancia de interes

[0068] Se realizo una fermentacion de 10 litros con la cepa CECT 7210 en medio MRS complementado con 60 cistema (0,005 % p/v) para obtener un sobrenadante. La incubacion se realizo a 37 °C durante 17 horas sin agitacion

y con generacion de anaerobiosis, alcanzandose un valor final de densidad optica a 600 nm de 5 unidades. La cantidad de inoculo utilizada fue el 1 % del volumen de fermentacion. El sobrenadante se sometio en primer lugar a un proceso de neutralizacion basado en una centrifugacion a 10000 rpm durante 15 min y una neutralizacion con NaOH 10 N hasta alcanzar un pH de 6,5. Despues de esto, se realizo un proceso de concentracion mediante una

filtracion con filtros de 0,22 |im de diametro de poro, seguido de congelacion a -80 °C y finalmente liofilizacion. Este ultimo proceso permitio obtener una muestra enriquecida de la sustancia con la cual hacer los ensayos posteriores.

4.2.2. Analisis de la capacidad del sobrenadante para inhibir la proliferacion de rotavirus SA-11 en la linea celular 5 MA-104

[0069] Al igual que en los estudios previos usando celulas intactas, este ensayo se realizo siguiendo dos estrategias:

Estrategia A - infeccion de celulas MA-104 con rotavirus SA-11, previamente incubadas con el sobrenadante 10 obtenido en la seccion anterior.

Estrategia B - incubacion de las celulas con el sobrenadante y posterior infeccion con rotavirus SA-11.

[0070] El protocolo seguido para la infeccion comenzo con la formacion de una monocapa de celulas mediante la siembra de celulas MA-104 en medio MEM en placas de 96 pocillos (1,5x105 celulas/ml). Las placas se incubaron

15 durante 24 h a 37 °C en atmosfera con 5 % (v/v) de CO2. Al mismo tiempo se realizo la activacion del rotavirus (inoculo de 2x108 uff) por medio de la incubacion con tripsina de tipo IX a 10 |ig/ml durante 30 min a 37 °C.

[0071] Estrategia A: una dilucion adecuada del virus se mezclo con las diferentes alfcuotas de sobrenadante y se incubo a 37 °C durante 1 h. La mezcla virus/sobrenadante se inoculo (100 |il/pocillo) en las monocapas de celulas

20 MA-104 y se incubo a 37 °C durante 1 h con 5 % (v/v) de CO2. Despues del periodo de adsorcion, se retiraron los inoculos de virus y las celulas se lavaron con tampon PBS. Se anadio medio MEM (100 |il/pocillo) sin suero a las celulas y finalmente se incubo durante 15-18 h a 37 °C con 5 % (v/v) de CO2. Despues de la incubacion, los cultivos celulares infectados se ensayaron con el analisis de deteccion de focos con inmunoperoxidasa evaluando la capacidad inhibidora de replicacion viral mediante el calculo de reduccion de focos infecciosos.

25

[0072] Estrategia B: se mezclaron alfcuotas de sobrenadante con celulas MA-104 y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Despues, el sobrenadante se extrajo de los pocillos y las celulas se infectaron con una dilucion adecuada de rotavirus SA-11, previamente activado. Esto se incubo a 37 °C durante 1 h con 5 % (v/v) de CO2. Despues del periodo de adsorcion, se retiraron los inoculos de virus y las celulas se lavaron con tampon PBS. Se anadio medio

30 MEM sin suero a las celulas (100 |il/pocillo) y finalmente se incubo durante 15-18 h a 37 °C con 5 % (v/v) de CO2. Despues de la incubacion, los cultivos celulares infectados se ensayaron con el analisis de deteccion de focos con inmunoperoxidasa evaluando la capacidad inhibidora de replicacion viral mediante el calculo de reduccion de focos infecciosos.

35 [0073] En la estrategia A, la cepa CECT 7210 produjo una reduccion de focos infecciosos de un 51,6 % (1,0x107 uff/ml de virus). En la estrategia B, el porcentaje de reduccion fue del 83 % (2,53x106 uff/ml de virus). Al igual que en el estudio anterior usando las celulas microbianas intactas, tambien en este caso la interaccion preliminar entre el sobrenadante microbiano y las celulas de mairnfero era mas eficaz. Estos hechos sugieren contundentemente que las interacciones entre la superficie de la celula eucariota y el sobrenadante son factores importantes para la 40 inhibicion de la replicacion del virus.

[0074] Como conclusion, estos dos estudios muestran que el sobrenadante de la cepa CECT 7210 produce inhibicion de la infeccion por rotavirus, siendo mayor la inhibicion cuando las alfcuotas del sobrenadante se incuban previamente con celulas MA-104.

45

5.1. Caracterizacion de la sustancia de interes. Procesamiento del sobrenadante con proteasas

[0075] Para verificar la posible naturaleza proteica de la sustancia de interes, las muestras liofilizadas de 25 ml de sobrenadante se trataron con las proteasas proteinasa K y pepsina. La muestra liofilizada tratada con pepsina se

50 resuspendio en 1,25 ml de tampon Mcllvaine 50 mM pH 4,0, al cual se anadieron 0,109 mm de una solucion con pepsina (50 mg/ml). Esta mezcla se incubo a 37 °C durante 2 h, y para detener la reaccion, la pepsina se inactivo llevando la solucion a un pH de 6,5 con la adicion de 1,14 ml de tampon fosfato sodico 50 mM pH 8. La muestra liofilizada tratada con proteinasa K se resuspendio en 2,4 ml del tampon fosfato 50 mM pH 6,5, al cual se anadieron 0,1 ml de una solucion de proteinasa K (50 mg/ml). Esta mezcla se incubo 37 °C durante 2 h y para detener la 55 reaccion, la proteinasa K se inactivo incubando la solucion a 100 °C durante 15 minutos.

[0076] El analisis de la inhibicion de la proliferacion de rotavirus SA-11 para las alfcuotas procesadas por proteasas, se realizo como se explica en la seccion anterior, siguiendo las dos estrategias. Los resultados se muestran en las TABLAS 3 y 4.

TABLA 3. Muestras de virus y affcuotas incubadas durante 1: h a 37 °C con la Estrategia A.

Muestra: uff/ml virus % de infeccion

Pepsina: 2,9x10' 134,6

Proteinasa K: 2,5x10' 117,9

Control negativo QC3: 2,6x107 121,7

Control positivo de ensayo: 2,1x107 100,0

Sobrenadante con cepa CECT 7210: 1,0x10' 48,4

Control negativo C1: 2,1x107 100,0

TABLA 4. Muestras de celulas y affcuotas incubadas durante 1 h a 37 °C con la Estrategia B

Muestra: uff/ml virus % de infeccion

Pepsina: 1,76x107 117,9

Proteinasa K: 1,52x107 101,8

Control negativo QC3: 1,44x107 96,4

Control positivo de ensayo: 1,49x107 100,0

Sobrenadante con cepa CECT 7210: 2,53x106 17,0

Control negativo C1: 1,49x107 100,0

5 [0077] El volumen de todas las muestras en las TABLAS 3 y 4 fue de 2,5 ml obtenido concentrando diez veces la solucion con respecto al volumen de sobrenadante inicial. Como muestra de inhibicion ensayada se utilizo una muestra liofilizada (sobrenadante de la cepa CECT 7210) no tratada con proteasas. En este caso, la muestra liofilizada de 25 ml se resuspendio en 2,5 ml de tampon de fosfato sodico 50 mM pH 6,5.

10 [0078] Como control de inhibicion negativo, se uso una muestra liofilizada no fermentada. En este caso, la muestra liofilizada de 25 ml de medio de cultivo se resuspendio en 2,5 ml de tampon fosfato sodico 50 mM pH 6,5. Los controles negativos incluidos en ambos ensayos eran con sobrenadante de medio de cultivo MRS-S sin inoculacion (C1) y con este mismo sobrenadante pero incubado como el resto de las muestras durante 2 h a 37 °C (QC3).

15 [0079] Como control de infeccion positivo, se uso una solucion compuesta por celulas y virus.

[0080] Como se muestra en las TABLAS 3 y 4, el tratamiento con diferentes proteasas dio lugar a la perdida de la capacidad de inhibicion, conforme con la protema natural de la sustancia/sustancias responsables de la inhibicion de la infeccion por rotavirus. Estos resultados se confirmaron mediante tratamientos similares con lipasas que no 20 produjeron una reduccion de la capacidad de inhibicion.

5.2. Purificacion e identificacion de la sustancia/sustancias de interes por intercambio ionico, cromatograffa seguida de cromatograffa en fase inversa.

25 [0081] Se aplicaron 620 ml del sobrenadante de la cepa CECT 7210 a una columna de intercambio cationico (HiPrep 16/10 SP FF). Todas estas protemas de naturaleza cationica que se adsorbieron a la resina de la columna se eluyeron con tampon equilibrado con NaCl 1 M sin gradiente. Por lo tanto, todas las protemas se eluyeron simultaneamente en pocas fracciones (fracciones 2, 3 y 4) y en un volumen mmimo, de tal manera que la sustancia de interes se concentro. El volumen de cada faccion recogida fue de 10 ml. Cada faccion recogida por intercambio 30 cationico se sometio a un proceso de ultrafiltracion usando filtros de 5000 Da (Amicon Ultra, Millipore). Por tanto, el volumen filtrado contema aquellas protemas con un peso molecular menor de 5000 Da y el volumen retenido mantema a aquellas protemas con un peso molecular superior.

[0082] Los volumenes filtrados obtenidos con las fracciones 2, 3 y 4 del intercambio cationico se sometieron a otra 35 etapa de cromatograffa de fase inversa para purificar y despues identificar por espectrometna de masas, la

sustancia/sustancias que proporcionan la inhibicion de la infeccion por rotavirus. Para la cromatograffa de fase inversa, se utilizo una columna RESOURCE RPC de 3 ml, que funcionaba en gradiente con los eluyentes A) 2- propanol al 5 %, acido trifluoroacetico (ATF) al 0,1 % en agua destilada y B) ATF al 0,1 % en 2-propanol. En esta cromatograffa se obtuvieron fracciones de 2 ml. Una affcuota de estos 2 ml se llevo hasta la sequedad para eliminar 40 el disolvente y se resuspendio en un volumen de tampon MEM justo antes de comenzar el ensayo de inhibicion de rotavirus con los cultivos celulares.

[0083] Las fracciones seleccionadas para ensayar la capacidad inhibidora de la infeccion por rotavirus de la fraccion 2 de intercambio cationico eran fracciones de fase inversa 2/5, 2/6, 2/7, 2/8, 2/9, 2/13, 2/14, 2/18, 2/20 y

45 2/23. De la fraccion 3 de intercambio cationico, se seleccionaron las siguientes fracciones de fase inversa: 3/7, 3/8, 3/9, 3/10, 3/11, 3/12, 3/13, 3/16, 3/17, 3/19, 3/20 y 3/21 y de la fraccion 4 de intercambio cationico, se seleccionaron

las fracciones de fase inversa 4/5, 4/6, 4/7, 4/8, 4/11 y 4/27.

TABLA 5. Inhibicion de infeccion por rotavirus por fracciones de fase inversa obtenida de la fraccion 2 de intercambio _______cationico (incubacion previa de celulas con alicuotas durante 1 h a 37 °C (Estrategia B)_______

Muestra: uff/ml virus % de infeccion

2/5: 1,65x10' 199,6

2/6: 9,00x106 108,9

2/7: 9,30x106 112,5

2/8: 9,10x106 110,1

2/9: 8,40x106 101,6

2/13: 4,50x106 54,4

2/14: 1,21x107 146,4

2/18: 8,60x10° 104,0

2/20: 1,24x107 150,0

2/23: 8,40x106 101,6

Control: 8,27x106 100,0

5

TABLA 6. Inhibicion de infeccion por rotavirus por fracciones de fase inversa obtenida de la fraccion 3 de intercambio _______cationico (incubacion previa de celulas con alicuotas durante 1 h a 37 °C (Estrategia B)_______

Muestra: uff/ml virus % de infeccion

3/7: 2,07x107 143,8

3/8: 1,84x107 127,8

3/9: 8,20x106 56,9

3/10: 3,40x106 23,6

3/11: 1,64x107 113,9

3/12: 1,80x107 125,0

3/13: 2,21x107 153,5

3/16: 2,18x107 151,4

3/17: 2,04x107 141,7

3/19: 1,68x107 116,7

3/20: 1,65x107 114,6

3/21: 1,79x107 124,3

Control: 1,44x106 100,0

TABLA 7. Inhibicion de infeccion por rotavirus por fracciones de fase inversa obtenida de la fraccion 4 de intercambio 10 _______cationico (incubacion previa de celulas con alicuotas durante 1 h a 37 °C (Estrategia B)_______

Muestra: uff/ml virus % de infeccion

4/5: 9,40x106 72,9

4/6: 1,48x107 114,7

4/7: 1,41x107 109,6

4/8: 3,40x106 23,6

4/11: 3,60x106 27,9

4/27: 9,10x106 70,5

Control: 1,29x107 100,0

[0084] Las fracciones que produjeron un resultado de inhibicion positivo se analizaron por MALDI para determinar los pesos moleculares del peptido/peptidos presentes en cada fraccion. Analizando todos los espectros, la unica senal presente en todas las fracciones seleccionadas correspondfan a un peptido con un peso molecular de 1282,63 15 Da. Por tanto, una de las fracciones se determino por secuenciacion, y el resultado fue un peptido de 11 aminoacidos cuya secuencia fue MHQPHQPLPPT y cuya masa molecular fue 1282,63 Da. Esta secuencia se confronto con la base de datos de proternas/peptidos mediante el algoritmo BLAST y se observo que esta secuencia era parte de la p-caserna de la leche de vaca. El analisis de todos los resultados experimentales condujo a pensar que la cepa CECT 7210 no produda este peptido. En lugar de esto, el peptido debe ser el resultado de la digestion

de la p-casema de la leche de vaca mediante una proteasa segregada por la cepa CECT 7210. En la mayona de las fracciones tambien estaba presente un peptido de 13 aminoacidos y de un peso molecular de 1513 Da.

6. Proteccion in vivo contra rotavirus 5

6.1. Estudios de la capacidad de colonizacion del tracto intestinal de raton y su implicacion en la proteccion in vivo contra infecciones con rotavirus

[0085] Cultivos de bacterias de la cepa CECT 7210 crecieron durante 24 h a 37 °C en condiciones anaerobias. A 10 partir de estos cultivos, se realizaron inoculos al 1 % (p/v) en 25 ml de medio MRS-C. Despues de 17 h de

incubacion en identicas condiciones, se lavaron dos veces en solucion salina al 0,09 % para un inoculo de 1x109 ufc/ml.

[0086] Las bacterias se resuspendieron en tampon de bicarbonato sodico y se congelaron a -70 °C en glicerol al 15 20 % hasta su uso.

[0087] Se ensayaron dos grupos de nueve ratones BALB/c de 8 semanas de vida. El grupo 1 fue el grupo control y el grupo 2 se trato con la cepa CECT 7210. El grupo control se trato en cada dosis con 100 |il/raton de bicarbonato sodico. El segundo grupo se trato en cada dosis con 109 ufc/raton de la cepa CECT 7210 resuspendida en 100 |il de

20 bicarbonato sodico tambien. Todos los ensayos se realizaron a diferentes tiempos en cada uno de los grupos. El esquema de inoculacion fue el siguiente:

TABLA 8. (1 horas desde la inoculacion de la 1a dosis de la cepa CECT 7210)

Dfa: Dosis de la cepa CECT 7210 Recogida de heces

1: 1a dosis 4 horas1 y 10 horas

2: 2a dosis 24 horas'

3: 3a dosis 48 horas1

4: -- --

5: - 96 horas1

6: -- --

7: -- --

8: -- 168 horas1

25 [0088] Antes de la administracion a los ratones, se elimino el glicerol de las muestras bacterianas por centrifugacion a 4000 rpm durante 5 min, y se resuspendieron de nuevo en tampon de bicarbonato sodico. Despues, a cada raton, se administraron 100 |il de la suspension a una concentracion de 109 ufc/ml, con un cateter a traves del tracto gastrico. A los ratones del grupo control se les administraron 100 |il de tampon de bicarbonato sodico. Se recogieron muestras de heces a diferentes horas desde la primera inoculacion de la cepa CECT 7210 (vease la 30 TABLA 8) y se homogeneizaron en tampon PBS (10 % p/v). Despues, se agitaron energicamente, se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 min, y se conservaron en refrigeracion para procesar en menos de 24 horas. El sobrenadante se congelo a -30 °C hasta su uso en los estudios de estimulacion del sistema inmunitario.

[0089] El analisis de la viabilidad de la cepa CECT 7210 en el tracto gastrointestinal se realizo mediante la siembra 35 de muestras de heces en medio selectivo. El medio utilizado fue una placa de medio selectivo para Bifidobacterium

(BFM). Antes de la siembra, se realizaron diluciones en serie y diversas de estas diluciones se sembraron en placas por duplicado. Los resultados mostraron que la cepa CECT 7210 alcanzaba su viabilidad maxima a las 10 h desde el inoculo, con valores en este punto entre 0,3 y 1x109 ufc/ml muy proximos al 100 % de viabilidad. Este tiempo se considero como el adecuado para observar efectos posibles de la actividad probiotica y por lo tanto se utilizo para la 40 infeccion con rotavirus en ensayos posteriores.

[0090] La determinacion de anticuerpos de clase IgA en las muestras fecales se realizo por ELISA. Se trataron placas de poliestireno (Costar) con 100 |il de dilucion 1/250 de suero de oveja anti-IgA de raton (Sigma) en tampon de carbonato/bicarbonato pH 9,6, incubandolas durante 2,5 horas a 37 °C y durante una noche a 4 °C hasta su uso.

45 Despues, el sobrenadante se elimino y se lavo tres veces con 200 |il de tampon PBS que contema 0,1 % de Tween 20 (v/v) (PBS-T). A cada pocillo, se anadieron 100 |il de los sobrenadantes de las muestras diluidos a 1/1000 en tampon PBS-T que contema 1 % de BSA. Para detectar los anticuerpos, se usaron los anticuerpos anti-IgA de raton marcados con peroxidasa a una dilucion de 1/2000 en tampon PBS-T con BSA al 1 %. Finalmente, se anadieron 100 |il/pocillo de sustrato OPD (ortofenilendiamina) y H2O2 y despues de 5 o 10 min de incubacion a temperatura 50 ambiente la reaccion se detuvo con 50 |il de solucion H2SO4 3 M. La lectura de la absorbancia se determino con un espectrofotometro a 492 nm. Para la determinacion de las concentraciones de IgA, se preparo una curva patron con diluciones en serie de una solucion de IgA de raton de concentracion bien conocida.

[0091] La cepa CECT 7210 produjo un aumento de la concentracion de IgA en las heces. A tiempos mas prolongados a partir de la primera dosis (96 h), los animales tratados con la cepa CECT 7210 alcanzaron una concentracion de IgA de 30 mg/g en comparacion con un valor de 18 mg/g en el grupo control de animales no 5 tratados.

6.2. Estudio de la capacidad de proteccion de la cepa CECT 7210 en frente de la infeccion con rotavirus murino de la cepa McN

10 [0092] Se utilizaron los mismos grupos de ratones del estudio anterior. Despues de la primera semana, se administro una nueva dosis de la cepa CECT 7210 a cada raton. Esta dosis se repitio durante 4 dfas mas. Ademas, un solo inoculo oral de rotavirus murino de la cepa McN contema 100 dosis productoras de diarrea en el 50% (DD50) en 50 |il de solucion salina equilibrada de Earle (EBSS). Este inoculo se realizo 10 horas despues de la primera dosis de memoria de la cepa CECT 7210. Se tomaron muestras fecales durante los nueve dfas siguientes para 15 evaluar la presencia de la cepa CECT 7210 por recuento de celulas viables y la eliminacion de virus en heces por ELISA.

TABLA 9. (1horas desde la inoculacion de la 1a dosis de la cepa CECT 7210; 2inoculacion de rotavirus 10 horas despues de la 1a dosis de memoria de la cepa CECT 7210; 3horas desde la inoculacion de rotavirus)

Dfa: Dosis de la cepa CECT 7210 e infeccion por rotavirus Recogida de heces

1: 1a inoculacion de la dosis de memoria de rotavirus2 10 horas'

2: 2a dosis 24 horas3 34 horas1

3: 3a dosis 48 horas3 54 horas1

4: 4a dosis 72 horas3

5: 5a dosis 96 horas3 106 horas1

6: -- 120 horas3

7: -- 144 horas3

8: -- 168 horas3

9: -- 192 horas3

20

[0093] Para el recuento microbiano despues de la infeccion, las muestras se tomaron despues de 10, 34, 58, 106 y 168 horas de la primera dosis de la cepa CECT 7210. Las heces se resuspendieron en tampon EBSS al 10 %, se homogeneizaron con un hisopo, se agitaron energicamente y se centrifugaron (4000 rpm 5 min). Se recogio el

25 sedimento con la cepa CECT 7210 y se almaceno en refrigeracion para procesarse en menos de 24 horas. El sobrenadante se congelo a -30 °C hasta su uso posterior en los estudios de cuantificacion del antfgeno viral. Como en la seccion anterior, el analisis de viabilidad de la cepa CECT 7210 se realizo usando placas de medio selectivo. Se realizaron diluciones en serie y diversas de estas diluciones se sembraron en placas por duplicado:

30 [0094] Para evaluar la eliminacion del virus en las heces, el protocolo ELISA comenzo con el tratamiento de la placa de 96 pocillos de poliestireno con 100 |il de una dilucion de 1/500 de un suero de oveja anti-rotavirus (Chemicon) en tampon carbonato-bicarbonato pH 9,6, incubandola durante 2,5 h a 37 °C y durante una noche a 4 °C. Despues de tres lavados con tampon PBS-T, se anadieron 100 |il de sobrenadante de muestras de heces, se trataron como se describe en la seccion anterior, a una dilucion de 1/2 en tampon PBS-T con BSA al 1 % (p/v).

35 Despues de 1,5 h de incubacion a 37 °C, el sobrenadante se elimino y se lavo cuatro veces con tampon PBS-T para anadir 100 |il/pocillo del anticuerpo monoclonal anti-VP6 2F3E7. Esto se incubo de nuevo durante 1,5 h a 37 °C y despues se realizaron cuatro lavados, 100 |il/pocillo de una dilucion 1/2000 de un anticuerpo anti-IgG de raton conjugado con peroxidasa en tampon PBS-T-BSA. Despues de 1 h de incubacion, esto se lavo cuatro veces con PBS-T y se anadio la solucion de OPD y H2O2. La reaccion se detuvo despues de 5-10 min con 50 |il de solucion

40 H2SO4 3M. La lectura de la absorbancia se determino a 492 nm. Para cuantificar la concentracion del virus, se analizaron diluciones en serie de una suspension de virus valorada, con el proposito de hacer una curva patron y extrapolar los resultados de absorbancia. Los resultados obtenidos mostraron que el recuento de celulas viables estaba en su maximo de viabilidad durante los cinco dfas durante los que se proporciono la cepa CECT 7210 y que este maximo se establecio 10 horas despues de cada dosis de cepa CECT 7210.

45

[0095] Para cuantificar la cantidad de antfgeno viral en las heces, se tomaron muestras durante los nueve dfas siguientes de la inoculacion de los rotavirus murinos McN de acuerdo con el calendario. La deteccion del antfgeno se realizo por ELISA. Como control positivo, el grupo control se inoculo con la misma cantidad de rotavirus.

50 [0096] Respecto a la evolucion de la infeccion viral, los resultados indicaron la existencia de un retraso en la proliferacion de rotavirus las primeras 48 h despues de la infeccion (106 uff/ml en comparacion con 4x107 uff/ml en

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un peptido que tiene una longitud de 11 a 17 aminoacidos y una secuencia aminoaddica que comprende SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia aminoaddica se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-16, o

5 una sal farmaceuticamente aceptable del peptido para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o preventivo de la diarrea en un animal que incluye un humano, en donde la diarrea esta causada por un rotavirus.
2. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el medicamento comprende ademas una bacteria que tiene la 10 capacidad de producir el peptido.
3. Uso de un peptido que tiene una longitud de 11 a 17 aminoacidos y una secuencia aminoaddica que comprende SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia aminoaddica se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-16 o una sal farmaceuticamente aceptable del peptido, para la fabricacion de un producto alimenticio.

15
4. Uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde el producto alimenticio comprende ademas una bacteria que tiene la capacidad de producir el peptido.
5. Uso de un peptido que tiene una longitud de 11 a 17 aminoacidos y una secuencia aminoaddica que comprende 20 SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia aminoaddica se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-16 o

una sal farmaceuticamente aceptable del peptido, para la fabricacion de una composicion nutricional.
6. Uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde la composicion nutricional comprende ademas una bacteria que tiene la capacidad de producir el peptido.

25
7. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia aminoaddica es SEQ ID NO: 1.
8. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia aminoaddica es SEQ ID NO: 3.

30 9. Peptido que tiene una longitud de 11 a 17 aminoacidos y una secuencia aminoaddica que comprende SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia aminoaddica se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-16 o una sal farmaceuticamente aceptable del peptido, para su uso en el tratamiento y/o prevencion de la diarrea en un animal que incluye un humano, en donde la diarrea esta causada por un rotavirus.

35

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es unicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilacion de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripcion

10

15

• EP 1571213 A1 [0009]

• JP 08259597 B[0010]

• EP 1353681 A1 [0011]

• WO 2003010297 A1 [0012]

• WO 0042168 A1 [0013]

US 5922375 A [0014]

EP 1359157 A [0017]

WO 0230958 A [0018]

EP 08774380 A [0033]

EP 2008058206 W [0033]

Literatura diferente de patentes citadas en la descripcion

20

25

30

• C.W. CHRISTAKIS et al. Lactobacillus therapy for acute infectious diarrhea in children: A meta-analysis. Pediatrics, 2002, vol. 109, 678-84 [0007]

• J.M. SAAVEDRA et al. Feeding of Bifidobacterium bifidum and Streptococcus thermophilus to infants in hospital for prevention of diarrhea and shedding of rotavirus. Lancet, 1994, vol. 344, 1046-9 [0007]

• S. GUANDALINI et al. Lactobacillus GG administered in oral rehydration solution to children with acute diarrhea: a multicenter European study. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 2000, vol. 30, 54-60 [0008]

SUPERTI et al. Involvement of bovine lactoferrin metal saturation, sialic acid and protein fragments in the inhibition of rotavirus infection. BIOCHIMICA ET BIOPHISICA ACTA, 03 October 2001, vol. 1528 (2-3), 107-115 [0015]

Remington’s Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, 1990 [0027]