ES2245801T3

ES2245801T3 - Preparacion farmaceutica que comprende lactobacillus casei rhamnosus.

Info

Publication number: ES2245801T3
Application number: ES98928734T
Authority: ES
Inventors: Eva Grahn Hakansson; Stellan Hakansson
Original assignee: Essum AB
Current assignee: Essum AB
Priority date: 1997-06-02
Filing date: 1998-06-02
Publication date: 2006-01-16
Anticipated expiration: 2018-06-02
Also published as: CA2291623A1; AU726217B2; CN1153575C; WO1998055131A1; SE9702083D0; NO995794L; NO326122B1; EP1005353A1; DE69831578D1; NO995794D0; JP2002507200A; JP4350170B2; CN1272791A; SE511524C2; AU8046098A; DK1005353T3; ATE304366T1; EP1005353B1; DE69831578T2; SE9702083L

Abstract

Una preparación farmacéutica para la profilaxis contra y/o el tratamiento de trastornos digestivos en el hombre y en los animales caracterizada por que comprende una cepa de microorganismo viable en forma de la cepa LB21 de Lactobacillus casei rhamnosus con el número de acceso NCIMB 40564 en, al menos, un medio excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el microorganismo mantiene su viabilidad.

Description

Preparación farmacéutica que comprende Lactobacillus casei rhamnosus.

La presente invención se refiere a una preparación farmacéutica para la profilaxis contra y/o el tratamiento de trastornos digestivos en el hombre y los animales.

Antecedentes

Un problema de salud que está ampliamente diseminado en muchos contextos es la diarrea y otros trastornos intestinales causados por diversos microorganismos patógenos. Los problemas son particularmente comunes en las personas que han sido tratadas con antibióticos o radioterapia en el tratamiento contra el cáncer, en las personas que padecen estrés, en los turistas que viajan al extranjero y en los centros de asistencia ambulatoria. Ejemplos de bacterias patógenas en el intestino que, así, causan diarrea son Salmonella, Shigella, Yersinia, E. coli, Pseudomonas, Clostridium difficile y sordelli, Staphylococcus aureus, Klebsiella, Helicobacter pyroli y Campylobacter.

Desde hace tiempo, se tiene el conocimiento muy extendido de que los microorganismos se afectan unos a otros positiva o negativamente al favorecer o inhibir el crecimiento del otro. Este fenómeno de interferencia se ha estudiado sobre todo en la microflora de la piel, la faringe y los intestinos humanos. No se conocen del todo los mecanismos subyacentes, pero se ha encontrado que la microflora bacteriana habitual es muy importante para la defensa contra las bacterias patógenas. Las bacterias invasoras están inhibidas por las bacterias de la microflora habitual de diferentes maneras, una de las cuales es la producción de sustancias parecidas a los antibióticos, las llamadas bacteriocinas. A diferencia de los antibióticos, las bacteriocinas tienen, la mayoría de las veces, un efecto muy selectivo sobre un grupo de bacterias, pero no afectan a la microflora bacteriana restante. La posibilidad de administrar bacterias inofensivas con tal efecto específico a los pacientes que padecen una infección no sólo se ha discutido sino que también se ha utilizado hasta cierto grado. No hace falta decir que las bacterias administradas deben ser capaces de establecerse ellas mismas en el entorno sobre el que tienen que actuar. Por ejemplo, ésta ha sido la idea por la que se da leche ácida a los pacientes que tienen una microflora intestinal alterada, debido a una diarrea grave que se ha tratado con antibióticos. No obstante, no se ha analizado científicamente lo que ha ocurrido en la microflora intestinal, y el efecto, si lo hay, ha sido poco claro la mayoría de las veces. Probablemente, esto se ha debido al hecho de que no se ha producido ninguna colonización en los intestinos, o que las bacterias añadidas no tuvieron ninguna posibilidad de interferir con la bacteria que causaba la diarrea. También se han realizado experimentos para reemplazar la microflora bacteriana por microorganismos inofensivos en la membrana de la mucosa nasal, la piel y la faringe, y estos experimentos han demostrado que la llamada recolonización es posible y que puede producir los efectos pretendidos.

Como se mencionó anteriormente, los experimentos que se han realizado para administrar bacterias a los pacientes que padecen varios trastornos causados por microorganismos patógenos han dado unos resultados no concluyentes la mayoría de las veces. Aparentemente, no hay conocimientos suficientes sobre qué cepas bacterianas son las más adecuadas para conseguir la colonización y la interferencia.

Trabajando en determinadas condiciones, en los últimos años ha sido posible establecer unos importantes principios básicos de los mecanismos que controlan la interacción entre los microorganismos y también desarrollar métodos para estudiar esta interacción. Esto ha abierto nuevas posibilidades de obstruir esta interacción de una manera reproducible y significativa y, consecuentemente, también de utilizar esto terapéutica y profilácticamente en el tratamiento de las infecciones.

En los recién nacidos, las cepas de Lactobacillus son las que, junto con las bifidobacterias, colonizan primero los intestinos estériles. También en los adultos, Lactobacillus es una microflora habitual dominante en los intestinos. De hecho, muchas cepas de Lactobacillus producen ácido láctico, ácido acético y peróxido de hidrógeno, que tienen un efecto inhibidor sobre las bacterias potencialmente patógenas en el intestino. Algunas de ellas tienen un efecto contra cepas específicas, mientras que otras tienen un efecto inhibidor más amplio.

Se ha demostrado la importancia de las cepas de Lactobacillus en la microflora intestinal en muchos estudios diferentes (véanse las referencias 1 a 8 de la bibliografía básica). Por ejemplo, se ha demostrado que determinadas cepas de Lactobacillus protegen contra la colonización de bacterias patógenas, producen bacteriocinas y otros componentes antimicrobianos, estimulan el sistema inmunitario, disminuyen el riesgo de tumores y de cáncer de colon, reducen el contenido de colesterol en suero, mejoran la movilidad gastrointestinal de las personas mayores, mejoran la tolerancia a la lactosa, etc. También hay estudios en los que no ha sido posible demostrar estos efectos, dependiendo del hecho de que todas las cepas de Lactobacillus no funcionan en la situación probada. En algunos estudios se ha utilizado una preparación inapropiada de Lactobacillus, p. ej., liofilizada en estado pulvurulento o en cápsulas sin recubrimiento.

La solicitud de patente internacional WO 96/38159 (Lafor Lab Ltd.) describe una composición farmacéutica para el tratamiento de la diarrea asociada a los antibióticos, dicha composición contiene, entre otras cosas, cepas viables de Lactobacillus rhamnosus.

La solicitud de patente japonesa 172949 de Jakult Honsa KK describe, entre otras cosas, que Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus casei son un ingrediente activo en un fármaco antialérgico.

La solicitud de patente internacional WO 93/01823 se refiere a un procedimiento para aislar una cepa de Lactobacillus que tiene la capacidad de colonizar los intestinos humanos. Por ejemplo, se ha aislado la cepa de L. casei sp. rhamnosus 271 y se dice que es adecuada para la profilaxis o el tratamiento de infecciones bacterianas, sobre todo en forma de una composición de nutrientes fermentados. La cepa en cuestión se ha aislado de los intestinos en adultos.

La patente europea EP-A-0271364 se refiere a la preparación para el tratamiento o la profilaxis de trastornos intestinales en los animales. Esta preparación comprende una o más bacterias acidolácticas que se seleccionan de los fenotipos de, entre otras, Lactobacillus casei spp rhamnosus. La preparación es una mezcla inespecífica de diferentes cepas y, además, no está pensada para usarse en el hombre. Las cepas en cuestión parecen haberse aislado a partir de ganado y ovejas y, así, no son aplicables en el hombre. Además, sólo se han hecho experimentos en ganado y en ovejas.

La patente DT-A1-2421066 se refiere a una preparación para reestablecer una microflora intestinal alterada a un estado normal, la preparación comprende una mezcla de bifidobacterias y, posiblemente, también una cepa de Lactobacillus casei var. rhamnosus.

En nuestros análisis de la interacción entre las diferentes bacterias, hemos estudiado, entre otras cosas, cómo determinadas cepas de Lactobacillus pueden neutralizar la diarrea que se ha producido debido a la toma de antibióticos y prevenir el desarrollo de bacterias patógenas, tales como Helicobacter. A escala de laboratorio, se han probado los cultivos de Lactobacillus, de los cuales se han aislado un gran número de clones con propiedades biológicas variadas. Uno de éstos, Lactobacillus casei rhamnosus LB21, posteriormente también mencionado como "LB21", se ha aislado de heces de lactantes y se ha demostrado que tiene un efecto inhibidor particularmente pronunciado sobre la mayoría de las bacterias que son importantes para diferentes tipos de infecciones en el hombre, tales como Staphylococcus aureus, diferentes especies de Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Campylobactus, Clostridium difficile, Helicobacter pylori, etc. Probablemente, el efecto fuertemente inhibidor de precisamente LB21 sobre las bacterias patógenas en el intestino se debe al hecho de que produce una proteína específica de baja masa molecular o un péptido específico de baja masa molecular, que es térmicamente estable, tiene una masa molecular por debajo de 5000 Da y que, de una manera única, tiene un efecto perjudicial sobre las bacterias patógenas en el intestino.

Sin embargo, ninguna de las publicaciones anteriormente mencionadas describe la cepa específica LB21 de Lactobacillus casei rhamnosus, que se ha aislado a partir de heces de lactantes y que tiene un efecto considerablemente mejor sobre los trastornos digestivos en comparación con las cepas estrechamente relacionadas.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es mitigar los problemas de salud anteriormente mencionados de una manera más eficaz que la que permiten los métodos de tratamiento de la técnica previa. Este objeto se alcanza gracias a una preparación farmacéutica del tipo mencionado por la introducción que, además, tiene las características definidas en la cláusula característica de la reivindicación 1 adjunta. Las realizaciones preferidas se mencionan en las subreivindicaciones adjuntas.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a una preparación farmacéutica para la profilaxis contra y/o el tratamiento de trastornos digestivos en el hombre y en los animales; dicha preparación se caracteriza por comprender una cepa de microorganismo viable en forma de una cepa de Lactobacillus casei rhamnosus LB21 en, al menos, un medio de excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el microorganismo conserva su viabilidad. Más específicamente, la presente invención se refiere a una preparación farmacéutica para la profilaxis contra y/o el tratamiento de, entre otras, la diarrea asociada a los antibióticos, la infección por Helicobacter en el estómago, la diarrea del turista y los trastornos digestivos inducidos por el estrés.

Además, la presente invención se refiere a la cepa de Lactobacillus casei rhamnosus NCIMB 40564, que puede prevenir y/o curar los trastornos digestivos en el hombre y los animales, y que se ha aislado a partir de las heces de un lactante con aproximadamente de 1 a 8 días.

La preparación farmacéutica de la invención contiene la cepa del microorganismo Lactobacillus casei rhamnosus LB21 en una cantidad de 10^{2} a 10^{12}, preferiblemente de 10^{6} a 10^{10} unidades formadoras de colonias por mililitro de la preparación lista para usar.

Con la expresión "unidades formadoras de colonias" se hace referencia al número de colonias que contienen una o más bacterias que proliferan en un sustrato.

Con la expresión "infección por Helicobacter" se hace referencia a los síntomas de la úlcera gástrica en la que se ha identificado que Helicobacter aparece en el estómago o en la parte superior del intestino delgado.

Con la expresión "diarrea del turista" se hace referencia a que la diarrea se produce cuando cambia la microflora gastrointestinal, por ejemplo en el extranjero, y también en el caso de una infección causada, p. ej., por Salmonella y E. coli.

Con la expresión "trastornos digestivos provocados por el estrés" se hace referencia al desequilibrio en la microflora gastrointestinal que causa dolor de estómago, diarrea y formación de gases, etc.

En una realización preferida de la invención, el excipiente de LB21 es un producto lácteo ácido o fermentado, tal como leche ácida, yogur y leche, o es un zumo de frutas, un helado, sopa o bebida de frutas. Se puede usar la cepa de la bacteria como un cultivo de partida para preparar tales productos de la leche, que da lugar a productos lácteos ácidos o fermentados, que tienen una mayor cantidad de la cepa ventajosa. Por supuesto, también es posible añadir LB21 a los productos lácteos preparados o al zumo de frutas, la sopa o al helado para obtener, de esta manera, una mayor cantidad de la bacteria deseada en el medio. Esta realización es muy importante ya que la preparación obtenida así es un producto alimenticio saludable y apreciado. Se puede dar tal preparación profiláctica o curativamente contra la diarrea u otras infecciones intestinales, que afectan a los lactantes con frecuencia. Además, se puede dar a las personas tratadas con antibióticos o con radioterapia para el tratamiento contra el cáncer, a las personas que tienen una infección por Helicobacter en el estómago y a los turistas que viajan al extranjero, donde se encuentran frecuentemente con una microflora bacteriana que no es la habitual para su tubo digestivo.

La preparación también puede aparecer en forma seca para administración oral, por ejemplo, en forma de cápsulas, comprimidos o polvo, o en forma de una suspensión, opcionalmente congelada, tal como una disolución de NaCl, una disolución de glucosa o leche desnatada. Los medios excipientes que se utilizan aquí son de tipo convencional y los expertos en la técnica los conocen bien. Las cápsulas pueden ser de un tipo resistente a los jugos gástricos, de tal manera que las bacterias estén protegidas de los jugos gástricos y sólo se liberen en el intestino. Por la misma razón, se pueden administrar comprimidos con un tipo de técnica previa de recubrimiento resistente al jugo gástrico. Los polvos pueden estar pensados para agitarlos en un líquido acuoso antes de su administración, por ejemplo, agua, zumo de frutas o algún producto lácteo.

Así, se ha encontrado que la preparación tiene un potencial particularmente grande como un fármaco profiláctico contra y/o un fármaco para tratar la diarrea asociada a antibióticos.

También se puede usar ventajosamente la preparación para la profilaxis contra y/o el tratamiento de la infección por Helicobacter en el estómago y en el intestino delgado superior en el hombre y los animales, pero también contra la llamada diarrea del turista y los trastornos provocados por el estrés.

En una preparación farmacéutica según la presente invención, posiblemente también se puede incorporar otra bacteria acidoláctica, tal como una o más cepas de Lactococcus o Lactobacillus, pero preferiblemente también se incorpora la cepa de Lactococcus lactis L1A.

También se ha encontrado que la preparación farmacéutica según la presente invención es particularmente ventajosa para la profilaxis y/o el tratamiento de los niños en las situaciones siguientes.

a) Recién nacidos y prematuros que necesiten cuidados intensivos.

Estos cuidados intensivos pueden dar lugar al hecho de que no se produzca la colonización normal de los intestinos con los lactobacilos y las bifidobacterias, lo que aumenta el riesgo de que dominen las bacterias patógenas. Esto también aumenta el riesgo de infecciones y el uso de antibióticos. La adición de LB21 puede normalizar la microflora intestinal en estos recién nacidos y neutralizar el desarrollo desfavorable como se describe anteriormente.

b) Recién nacidos expuestos a un mayor riesgo de adquirir la diabetes de tipo I, la celiaquía (alergia al gluten) y varias enfermedades autoinmunitarias.

Un factor que causa estos trastornos probablemente es la alteración del control inmunitario en el intestino, de tal manera que los antígenos (sustancias que no se producen naturalmente en el cuerpo) de la comida, las bacterias intestinales, los virus u otros microorganismos pueden causar una reacción inmunitaria contra los propios tejidos del cuerpo. La adición de LB21 puede normalizar la microflora intestinal y, así, neutralizar la aparición de estos trastor-
nos.

c) Niños que se han sometido a una operación de atresia de las vías biliares (malformación congénita con una pérdida total o parcial de las vías biliares en y/o fuera del hígado) y niños que se han sometido a un transplante de hígado.

Estas categorías de niños corren un mayor riesgo de sufrir infecciones que afectan el hígado/vías biliares tras la operación. El suministro de LB21 puede reducir el riesgo de tales complicaciones inhibiendo el desarrollo de las bacterias que, normalmente, causan estos tipos de infecciones.

También, la preparación farmacéutica de la invención es útil en conexión con el tratamiento citotóxico. Frecuentemente, los pacientes con enfermedades neoplásicas se tratan con citotoxinas, que tienen un efecto negativo sobre la funcionalidad de los intestinos y un efecto perjudicial en la estructura y en el nuevo desarrollo de la mucosa intestinal. En consecuencia, este tipo de tratamiento a menudo causa una reducción de la asimilación de nutrientes y diarrea. Una consecuencia más es que las bacterias intestinales pueden diseminarse por los vasos sanguíneos a través de la mucosa intestinal debilitada y causar infecciones graves. Esto lleva a un aumento del consumo de antibióticos que, a su vez, deteriora más el funcionamiento de los intestinos y puede implicar que varias bacterias intestinales se hagan resistentes a los antibióticos.

Con el suministro de LB21 en conexión con el tratamiento con citotoxinas, se pueden reducir los efectos negativos sobre el funcionamiento y la estructura de la mucosa intestinal, con lo cual se reduce el riesgo de infecciones graves que las bacterias causan en el intestino.

Además, la preparación farmacéutica según la presente invención es útil para prevenir la alergia en los niños, p. ej., el eccema atópico, y para prevenir y tratar el estreñimiento, sobre todo en las personas mayores.

Cuando la preparación farmacéutica según la invención está pensada para tratar animales, el excipiente es un alimento adecuado, como en forma de suero, pienso seco o una suspensión concentrada.

Se debe almacenar el microorganismo en estado liofilizado, preferiblemente en leche desnatada, en un lugar oscuro y seco, pero también congelado a una temperatura de aproximadamente -70ºC.

Se puede ajustar la dosis necesaria de la preparación de la invención dependiendo de tales factores como la edad del paciente y la enfermedad, como también el tipo y el grado de dificultad de la enfermedad. Se encuentra dentro de la competencia de una persona experta en la técnica determinar una dosis adecuada para cada una de las situaciones. Además, una ventaja de la invención es que una gran sobredosis de la administración del fármaco difícilmente significa un riesgo para el paciente.

Microorganismo de la invención

La cepa del microorganismo anteriormente mencionado Lactobacillus casei rhamnosus LB21 se aisló como una de las aproximadamente cien cepas de Lactobacillus aisladas de las heces de un lactante sano de aproximadamente 5 días y, luego, se seleccionó por ser la cepa más eficaz para el propósito de la invención. Es muy importante que se aísle LB21 del lactante durante la primera semana, tal que a partir del primer al quinto día de vida, preferiblemente en torno al quinto día de vida. Se distinguió LB21 de otras cepas de Lactobacillus casei rhamnosus usando electroforesis en gel en campo pulsante (PFGE) según el método de Faola y BioRad. No se ha aislado ni definido previamente LB21 y, así, es una cepa de Lactobacillus casei rhamnosus totalmente desconocida, que se ha encontrado que tiene unos efectos particularmente favorables para los problemas de salud anteriormente mencionados y para los estados de mala salud.

La siguiente tabla muestra los resultados de la prueba de la etapa inicial de selección, en la que se compara LB21 con otras cepas de Lactobacillus que se han aislado de las heces de lactantes en relación al efecto inhibidor sobre varios patógenos.

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TABLA DE INTERFERENCIAS

Patógeno	LB 6	LB 8	LB 14	LB 18	LB 21	LB 27	LB 32
E. coli	4/5	1/5	0/5	2/5	5/5	0/5	1/5
Klebsiella	2/5	2/5	1/5	2/5	5/5	1/5	3/5
Cocos intest.	0/5	0/5	0/5	1/5	3/5	0/5	1/5
GBS	2/5	0/5	0/5	2/5	5/5	0/5	2/5

Como se mencionó anteriormente, se incluye la cepa de LB21 como un ingrediente activo en la preparación de la invención y se depositó el 11 de junio de 1993 en The National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 lRY, Reino Unido. Su número de acceso es NCIMB 40564. Se debe observar que se depositó la cepa con la referencia de identificación Lactobacillus casei rhamnosus L20 05, pero luego se cambió la designación usual de la cepa por Lactobacillus casei rhamnosus LB21. La cepa está tipificada o clasificada según el sistema API 50CH (API-System La Balme les Grottes, 38390 Montalieu, Vercieu), lo que es evidente en la siguiente tabla de tipificación.

\newpage

API 50 CL

37ºC, CO_{2} agar sangre

	Compuesto	Código	24 h	48 h

0	Testigo	-	-	-
1	Glicerol	-	-	-
2	Eritritol	-	+	-
3	D-arabinosa	-	-	-
4	L-arabinosa	-	-	-
5	Ribosa	+	+	+
6	D-xilosa	-	-	-
7	L-xilosa	-	-	-
8	Adonitol	-	-	-
9	\beta-metilxilósido	-	-	-
10	Galactosa	+	+	+
11	D-glucosa	+	+	+
12	D-fructosa	+	+	+
13	D-manosa	+	+	+
14	L-sorbosa	-	-	-
15	Ramnosa	V	V	V
16	Dulcitol	+	V	+
17	Inositol	-	-	-
18	Manitol	+	+	+
19	Sorbitol	+	V	+
20	\alpha-metil-D-manósido	-	-	-
21	\alpha-metil-D-glucósido	-	-	-
22	N-acetilglucosamina	+	+	+
23	Amigdalina	V	-	V
24	Arbutina	+	-	+
25	Esculina	+	+	+
26	Salicina	+	+	+
27	Celobiosa	+	-	+
28	Maltosa	-	-	-
29	Lactosa	+	+	+
30	Melibiosa	-	-	-
31	Sacarosa	-	-	-
32	Trealosa	+	+	+
33	Inulina	-	-	-
34	Melecitosa	+	-	+
35	D-rafinosa	-	-	-
36	Almidón	-	-	-
37	Glucógeno	-	-	-
38	Xilitol	-	-	-
39	\beta-gentiobiosa	V	-	V
40	D-turanosa	-	-	-
41	D-lixosa	-	-	-
42	D-tagatosa	+	+	+
43	D-fucosa	-	-	-
44	L-fucosa	-	-	-
45	D-arabitol	-	-	-
46	L-arabitol	-	-	-
47	Gluconato	V	V	V
48	2-cetogluconato	-	-	-
49	5-cetogluconato	-	-	-

V = color verde
+ = cambio total a color amarillo
- = color original lila azulado

\newpage

Aquí es importante enfatizar que hay una gran diferencia entre las diferentes cepas de Lactobacillus, como es el caso también en la subespecie Lactobacillus casei rhamnosus (LB21). Se ha identificado con certeza LB21 en la preparación farmacéutica según la presente invención como una cepa de Lactobacillus casei rhamnosus, pero se está lejos de querer decir que la cepa en cuestión es idéntica o similar a otras cepas de Lactobacillus casei rhamnosus descritas en la bibliografía, como en la solicitud de patente internacional WO 93/01823. Estas subespecies se desarrollan, por ejemplo, diferencialmente bien en un entorno con oxígeno y a diferentes temperaturas. Es evidente que no se trata de una cuestión de cepas idénticas y una caracterización detallada de las respectivas subespecies (cf. anteriormente) muestra que tienen diferentes propiedades, de lo que se da cuenta una persona experta en la técnica. Una gran diferencia es, por ejemplo, que LB21 se ha aislado a partir de heces de un lactante, mientras que la cepa 271 en la solicitud de patente internacional WO 93/01823 se ha aislado del intestino de adultos.

Experimentos realizados Paso a través del tubo digestivo

Un requisito para las cepas probióticas de las bacterias acidolácticas, como LB21 en la preparación de la invención, para que puedan actuar en el intestino delgado y el intestino grueso del hombre y de los animales es que deben sobrevivir al paso a través del entorno ácido del estómago. Se realizó un estudio para comprobar que Lactobacillus casei rhamnosus LB21 puede sobrevivir al paso por el estómago y se pueden encontrar en las heces de voluntarios sanos. Además, hemos estudiado durante cuánto tiempo se puede encontrar esta cepa en las heces después de que los individuos del experimento hayan interrumpido la toma oral de la misma.

En la parte A del experimento, 25 personas voluntarias sanas suministraron una muestra de heces en un tubo de plástico estéril. Se almacenó la muestra en un lugar frío (4ºC máx.) hasta que se pudiera cultivar. Antes del cultivo, se mezcló la muestra en una disolución salina al 0,9% en una proporción de 1:10. Luego, se cultivaron 10 \mul de la muestra en placas Rogosa con 128 \mug/ml de vancomicina. Se incubaron las placas a 37ºC en un entorno de CO_{2} y se leyeron a las 48 h. El límite para participar en el experimento de la parte B se estableció para estar a lo sumo en 4 x 10^{4} unidades formadoras de colonias de Lactobacillus resistentes a la vancomicina por gramo de heces.

En la parte B del experimento, participaron 13 de las 25 personas mencionadas anteriormente que tenían una microflora de lactobacilos relativamente sensible a la vancomicina en el intestino. Se informó a los sujetos que no comieran alimentos que contuvieran lactobacilos desde 2 semanas antes de comenzar el estudio, incluido el último día del estudio. Cada sujeto ingirió, en conexión con una comida, 10 ml de una disolución salina con 10^{11} unidades formadoras de colonias de LB21 viable al día durante 5 días. Este objetos suministraron una muestra de heces el día antes de la toma de los lactobacilos (muestra cero) y, luego, a partir del día 4 de la toma de Lb21 y alta el día 12, éste inclusive, tras la cura total. El muestreo y el cultivo de las muestras se realizaron según el mismo método que en la parte A del experimento. Se realizó la identificación de Lactobacillus casei rhamnosus LB21 por medio de la tinción de Gram y la clasificación API (medios CHL).

Se debe advertir que el sujeto n.º 8 tomó penicilina durante el estudio. Por lo tanto, este sujeto tomó LB21 durante 10 días comenzando al mismo tiempo que el resto del grupo de sujetos.

Se interrumpió la parte B del experimento 12 días después de cesar la toma de LB21. Esto se produjo aunque todavía se pudiera encontrar LB21 en las heces de 4 de los 13 sujetos. En los 9 objetos restantes, se pudo aislar LB21 de las heces a los 5 días de promedio después de cesar la toma. En el sujeto n.º 8 que tomó penicilina se encontró LB21 en las heces durante toda la cura con penicilina y 2 días después de que cesara la toma. En las muestras de heces se encontró LB21 en el orden de 1 x 10^{3} a 5 x 10^{5} unidades formadoras de colonias por gramo de heces.

Sujeto	Número de días después de cesar el tratamiento
	con la LB21 presente en las heces.
1	3
2	6
3	3
4	12
5	12
6	3
7	5

(Continuación)

Sujeto	Número de días después de cesar el tratamiento
	con la LB21 presente en las heces.
8	2
9	7
10	12
11	3
12	7
13	12

Recapitulando, se pudo establecer que la cepa LB21 de Lactobacillus casei rhamnosus sobrevivió al paso por el estómago y se pudo encontrar en las heces de todos los sujetos, también en el sujeto que se había sometido a un tratamiento con penicilina. Cuatro de los 13 sujetos todavía tenían LB21 en las heces 12 días después de cesar la toma oral de LB21. Los 9 sujetos restantes todavía tenían LB21 a los 5 días de promedio después de haber cesado la toma de LB21. El promedio de todo el grupo de 13 sujetos fue de 6 días.

Efecto inhibidor de Lactobacillus casei rhamnosus LB21

Se ha probado la bacteria acidoláctica LB21 mencionada más arriba por su efecto inhibidor sobre un gran número de bacterias patógenas en el intestino. Se ha encontrado que tiene un efecto inhibidor satisfactorio, y también se realizó un experimento con el propósito de investigar si también podía inhibir E.coli 0-157, Clostridium difficile y Helicobacter pylori.

Se aislaron dos cepas de E. coli 0-157, una que era tox^{-} y la otra que era tox^{+}, de los pacientes. También se probaron cinco cepas de Clostridium difficile de pacientes que sufrían una diarrea asociada a antibióticos, y tres cepas de Helicobacter pylori de material clínico (biopsias). En la prueba de interferencia realizada, se usó el método de la capa de agar, que se ajustó a las bacterias probadas. Este método significa que se cultivaron las cepas de Lactobacillus en medio MRS (Merck) a 37ºC con CO_{2} al 5% durante una noche. Luego, cada cepa se pasó separadamente a la capa de agar con MRS (25 ml de agar). Se incubaron las placas de agar en las condiciones mencionadas más arriba durante 24 h. Se vertió una nueva capa de agar (agar M17 (Merck), 25 ml) o de agar sangre (BHI + sangre de caballo) sobre la primera capa y, luego, se dejó solidificar la segunda capa durante 4 h. Luego, se cultivaron por separado las bacterias de la prueba en un medio TY (Holm, S. E. y Falsen, E., APMIS 1967; 69, 264) a 37ºC. Se pasaron las bacterias al caldo de Bertani (0,25 ml, 10^{6} bacterias por ml). Se diluyeron las bacterias a 1:10 en NaCl en un caldo de Bertani nuevo. Luego, desde estos medios, se marcaron las cepas de la prueba (24 por caldo) en la placa de agar con un replicador de puntas de acero de Steers. Se incubaron las placas de E. coli a 37ºC, las de Clostridium difficile a 37ºC y anaerobiamente, y las de Helicobacter pylori a 37ºC en un medio microaerófilo (Steers E. et al., J. Antibiot. Chemoter. 179; 9, 307). Se usaron placas sin LB a modo de testigo.

La cepa de LB21 inhibió todas las bacterias probadas.

El resultado final demostró que la cepa de LB21 tenía un efecto inhibidor excelentemente satisfactorio sobre estos patógenos intestinales, lo que resulta evidente en la tabla siguiente.

Efecto inhibidor de Lactobacillus LB21

Bacterias de la prueba	Número	Número inhibido	% de inhibición
E. coli	48	48	100
Enterococos	41	34	83
Estreptococos del grupo B	100	100	100
Estreptococos del grupo A	5	5	100
Klebsiella	36	36	100
Proteus mir.	16	16	100
Salmonella	15	15	100
Shigella	15	15	100
Ps. aureginosa	15	15	100

(Continuación)

Bacterias de la prueba	Número	Número inhibido	% de inhibición
Yersinia	10	10	100
Staphylococcus sapro	6	4	67
Lactobacilos	11	0	0
H. pylori	3	3	100
E. coli 0-157	2	2	100
Clostridium difficile	5	5	100

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Se realizaron las pruebas según el método de la capa de agar así como también en medio. Se repitieron y se realizaron a diversos valores de pH diferentes.

Capacidad de Lactobacillus casei rhamnosus LB21 para inhibir la diarrea asociada a antibióticos

Participaron 31 sujetos sanos en el estudio, 16 hombres y 15 mujeres. Luego, se dividieron los sujetos según el sexo y entonces se distribuyeron al azar entre el grupo de prueba y el grupo de control. El grupo de prueba incluyó a 16 sujetos y el grupo de control a 15 sujetos. La edad media en el grupo de prueba fue de 24,6 años, en el margen de 19 a 31 años. La edad media en el grupo de control fue de 24,4 años, en el margen de 20 a 33 años. Dos sujetos del grupo de control abandonaron durante el estudio debido a un embarazo y a un problema causado por la toma de antibióticos. Así, el abandono ascendió al 6,5%. Para la última prueba de heces, abandonó un sujeto más en el grupo de control debido a una lesión por realizar deporte. Ninguno de estos sujetos era fumador ni mascador de tabaco ni había tomado antibióticos durante los últimos seis meses antes del estudio. No se dejó tomar ningún medicamento, salvo K\ring{a}vepenin, durante el transcurso el estudio. No se dejó que los sujetos tomaran ningún producto fermentado dos semanas antes de comenzar a tomar penicilina y durante el transcurso el estudio. El experimento se realizó como una prueba controlada con placebo de doble anonimato y fue aprobado por el comité ético de búsqueda de la Faculty of Medicine, (University of Ume\ring{a}, Ume\ring{a}).

El grupo de prueba así como el grupo de control tomó 500 mg de K\ring{a}vepenin en cápsulas por vía oral (fenoximetil-penicilina potásica, Astra Läkemedel, Södertälje) dos veces al día durante diez días.

Al grupo de la prueba se le dio leche desnatada congelada con LB21 (Essum, Ume\ring{a}) a una concentración de 10^{11} de ufc (unidades formadoras de colonias) por ml. Al grupo de control se le dio leche desnatada a modo de placebo. Los sujetos en el grupo de prueba tomaron 5 ml de leche desnatada congelada con LB21 o placebo dos veces al día. La toma comenzó simultáneamente con la penicilina y duró 15 días.

Las muestras de heces se recogieron antes de tomar K\ring{a}vepinin a día 0, durante la toma de Kavepenin y LB21 o placebo al día 10, y al día 15 durante la toma de LB2l/placebo tras la cura completa con K\ring{a}vepenin. Las muestras se almacenaron en un lugar frío (entre +4 y +8ºC) antes de mandarlas al laboratorio, donde se congelaron y se guardaron a -20ºC antes de analizarlas. Todas las muestras se congelaron antes de las 24 h de haberlas muestreado.

Los sujetos registraron el número de defecaciones por día y la consistencia de las heces en un formulario desde la primera semana antes de la toma de K\ring{a}vepenin hasta el quinto día, éste inclusive, después de la cura total. El dolor de estómago y otros síntomas subjetivos también quedaron registrados.

Las muestras de las heces se pesaron y se diluyeron con agua estéril en una proporción den1:10. Se midió el pH con papel indicador (Merck, pH 5 a 10) en medio de la muestra. Se cultivó LB21 después de haberla diluido con agua estéril en placas de Rogosa con 128 \mug de vancomicina. Las muestras se incubaron a 37ºC en un ambiente de CO_{2} durante 48 h.

Todos los lactobacilos se cultivaron tras haber sido diluidos con agua estéril en placas de Rogosa. Las muestras se incubaron a 37ºC anaerobiamente durante 48 h. Luego, las muestras se almacenaron a -20ºC.

Las pruebas para la toxina de Clostridium difficile se llevaron a cabo de acuerdo con Aronsson et al.

La frecuencia de las defecaciones, la consistencia de las heces, el dolor de estómago y otros síntomas subjetivos quedaron registrados, y se calcularon el promedio, la mediana y el intervalo.

Los cálculos estadísticos se llevaron a cabo con SPSS para Windows. Los resultados se presentaron como los valores de promedio y los valores de mediana. Se tomó el logaritmo (log_{10}) de los valores de los lactobacilos antes de realizar los cálculos estadísticos. La mediana y el intervalo entre los valores máximo y mínimo se calcularon en base al número de defecaciones, consistencia de las heces y el valor del pH. Las comparaciones estadísticas entre los grupos, donde no se daba un intervalo normal o donde no era digno de confianza, se llevaron a cabo con la prueba de la U de Mann-Whitney (número de defecaciones, consistencia de las heces, lactobacilos, pH). Un pH de menos de 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Los sujetos que tomaron LB21 tuvieron considerablemente menos defecaciones/diarrea durante la toma de fenoximetil-penicilina en comparación con el grupo de placebo, a saber, 0,24 y 0,98, respectivamente (p < 0,05). Además, la frecuencia de las defecaciones y la aparición de dolor de estómago aumentaron considerablemente durante el tratamiento con penicilina en el grupo de placebo en comparación con la situación previa a la toma de la penicilina. También hubo un considerable aumento de la cantidad de Lactobacillus casei rhamnosus en las heces en el grupo al que se le había proporcionado la LB21. Sin embargo, no se encontraron diferencias considerables en la frecuencia de las defecaciones o con respecto al número total de lactobacilos en las muestras de las heces en los dos grupos. Aún más, no se dieron casos de la toxina de Clostridium difficile en ninguno de los dos grupos.

Referencias bibliográficas

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4. Goldin, B. R. y Gorbach, S. L. 1980. Effect of Lactobacillus acidodophilus dietary supplements on 1,2-dimetylhydrazine dihydrochlorid induced intestinal cancer in rats. J. Natl. Cancer. Inst. 64, 263-271.

5. Goldin, B. R. y Gorbach, S. L. 1987. Lactobacillus GG: a new strain with properties favorable for survival, adhesion and antimicrobial activity in the gastrointestinal tract. FEMS Microbiol. Rev. 46, P72.

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7. Siitonen, S., Vapaatalo, H., Salminen, S., Goldin, A., Saxelin, M., Wikberg, R. y Kirkkola, A-L. 1990. Effect of Lactobacillus GG yoghurt in prevention of antibiotic associated diarrhoea. Annual Med. 22, 57-59.

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(Formulario pasa a página siguiente)

1

2

3

4

Claims

1. Una preparación farmacéutica para la profilaxis contra y/o el tratamiento de trastornos digestivos en el hombre y en los animales caracterizada por que comprende una cepa de microorganismo viable en forma de la cepa LB21 de Lactobacillus casei rhamnosus con el número de acceso NCIMB 40564 en, al menos, un medio excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el microorganismo mantiene su viabilidad.

2. Una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la cepa del microorganismo está presente en una cantidad de 10^{2} a 10^{12} unidades formadoras de colonias por mililitro de una solución lista para usar.

3. Una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada por que la cepa del microorganismo está presente en una cantidad de 10^{6} a 10^{10} unidades formadoras de colonias por mililitro de una solución lista para usar.

4. Una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que el medio excipiente farmacéuticamente aceptable es un producto de leche ácida o fermentada, preferiblemente leche ácida, yogur y leche o zumo de frutas, helado, sopa y bebidas de frutas.

5. Una preparación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que el medio excipiente farmacéuticamente aceptable es un alimento animal adecuado, preferiblemente suero, pienso seco o una suspensión concentrada, cuando se administra la preparación de acuerdo con la invención a los animales.

6. Una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la cepa bacteriana se ha añadido al medio excipiente como un cultivo de partida y/o a la preparación lista para usar.

7. Una preparación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que está presente en forma seca, tales como cápsulas, comprimidos o polvo, o en forma de una suspensión, opcionalmente congelada, preferiblemente en disolución con NaCl, disolución con glucosa o con leche descremada, junto con una sustancia excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. Una preparación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que al menos unos de las cepas de Lactococcus, Lactobacillus o Bifidobacterium, preferiblemente Lactococcus lactis L1a, también se incorpora en la preparación.

9. Una cepa de Lactobacillus casei rhamnosus capaz de prevenir y/o curar enfermedades digestivas en el hombre y los animales, la cual tiene un número de acceso NCIMB 40564.

10. Uso de una cepa Lactobacillus casei rhamnosus de acuerdo con la reivindicación 9 para la producción de un medicamento para la profilaxis contra y/o el tratamiento de la diarrea asociada a antibióticos, infección por Helicobacter en el estómago y en el intestino delgado superior, diarrea del turista, trastornos digestivos provocados por el estrés, influjo intestinal inducido por citotoxicidad, alergias en los niños, estreñimiento y/o para la profilaxis contra las infecciones intestinales en niños que se han sometido a un trasplante de hígado o que se han operado de atresia de la vías biliares o en lactantes que son recién nacidos o prematuros.

11. Procedimiento para la producción de una preparación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la cepa Lactobacillus casei rhamnosus LB21 con el número de acceso NCIMB 40564 aislada a partir de las heces de un lactante de 1 a 8 días, preferiblemente de 5 días, se añade a un medio excipiente farmacéuticamente aceptable, en el cual el microorganismo mantiene su viabilidad.