NO326122B1 - Farmasoytisk preparat inneholdende "Lactobacillus casei rhamnosus" - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et farmasøytisk materiale for profylakse mot og/eller behandling av gastrointestinale forstyrrelser i menneske og dyr og en fremgangsmåte for produksjon derav, samt en Lactobacillus casei rhamnosus stamme som er i stand til å hindre og/eller behandle gastrointestinale forstyrrelser i menneske og dyr og anvendelse derav.

Bakgrunn og teknikkens stilling.

Et helseproblem som er sterkt utbredt i mange sammen-henger er diaré og andre enteriske forstyrrelser forårsaket av forskjellige patogene mikroorganismer. Dette problem er spesielt vanlig i mennesker som har blitt behandlet med antibiotika, eller bestråling ved kreftbehandling, i folk som lider av stress, i turister som reiser utenlands, og ved hjemmenjelpssentre. Eksempler på intestinale patogene bakterier som kan forårsake diaré er Salmonella, Shigella, Yersinia, E. coli, Pseudomonas, Clostridium difficile og sordelli, Stafylococcus aureus, Klebsiella, Helicobacter pyroi i og Campylobacter.

Det har vært kjent i lang tid at mikroorganismer kan påvirke hverandre positivt eller negativt ved å fremme eller inhibere hverandres vekst. Dette samvirkefenomen har fremfor alt blitt undersøkt i hud-floraen, svelget og tarmene fra mennesket. Den underliggende mekanisme er ikke fullstendig kjent, men det har blitt funnet at den normale bakterielle flora er svært viktig.ved forsvar mot patogene bakterier. Invaderende bakterier inhiberes av bakteriene i den normale flora på forskjellige måter, f.eks. ved produksjon av antibiotika-lignende substanser, såkalte bakteriociner. I motsetning til antibiotika, har bakteriocinene i de fleste tilfeller en svært selektiv effekt på en gruppe bakterier, men har ingen effekt på den gjenværende bakterielle flora. Muligheten for å administrere ufarlige bakterier med en slik spesifikk effekt til pasienter som lider av infeksjoner har ikke bare blitt diskutert, men har også i noen utstrekning blitt anvendt. De administrerte bakterier må være i stand til å etablere seg i det miljø som de skal påvirke. F.eks. har dette vært ideen med å gi surmelk til pasienter som har en forstyrret intestinal flora, forårsaket av alvorlig diaré etter å ha blitt behandlet med antibiotika. Imidlertid har det ikke blitt vitenskapelig analysert hva som fant sted i den intestinale flora, og effekten, dersom noen, har i de fleste tilfeller vært usikker. Dette har sannsynligvis vært grunnet i det faktum at ingen kolonisering har funnet sted i tarmene, eller at de tilsatte bakterier ikke hadde noen mulighet for å samvirke med bakteriene som forårsaket diaré. Forsøk har også blitt utført for å erstatte den bakterielle flora med ufarlige mikroorganismer i den nasale mukøse membran, huden og svelget, og disse forsøk har vist at en såkalt rekoloni-sering er mulig, og kan gi de tiltenkte effekter.

Som nevnt ovenfor har forsøkene som har blitt utført for å administrere bakterier til pasienter som lider av forskjellige forstyrrelser, forårsaket av patogene mikroorganismer, i de fleste tilfeller gitt ikke konkluderende resultater. Således har kunnskapen om hvilke bakterie-stammer som er best egnet for å oppnå kolonisering og interferens ikke vært tilstrekkelig.

Ved å arbeide under definerte betingelser har det i løpet av de siste år blitt mulig å etablere viktige hoved-prinsipper for de mekanismer som regulerer interaksjonen mellom mikroorganismer, og også utvikle fremgangsmåter for å studere dette samvirke. Dette har åpnet nye muligheter for å påvirke denne interaksjon på en meningsfull, reprodu-serbar måte, og således som en konsekvens også terapeutisk/ profylaktisk utnytte dette i behandlingen av infeksjoner.

I nyfødte barn er det Lactobacillus-stammer som sammen med Bifido-bakterier først koloniserer de sterile tarmer. Også i voksne er Lactobacillus en dominerende normal flora i tarmene. Mange Lactobacillus-stammer produserer faktisk melkesyre, eddiksyre og hydrogenperoksid, som har en inhi-berende effekt på potensielle patogene bakterier i tarmen. Noen av disse har effekt mot spesifikke stammer, mens andre har en bredere inhibitorisk effekt.

Betydningen av Lactobacillus-stammer i den intestinale flora har blitt vist i mange forskjellige forsøk (se litteraturreferansene 1-8). F.eks. har det blitt vist at visse Lactobacillus-stammer beskytter mot kolonisering av patogene bakterier, produserer bakteriociner og andre anti-mikrobielle komponenter, stimulerer immunsystemet, ned-setter risikoen for tumorer og tarmkreft, reduserer serum-kolesterolinnhold, forbedrer den gastrointestinale beveg-else i eldre mennesker, forbedrer toleransen for laktose etc. Der er også forsøk hvor det har blitt mulig å vise disse effekter, avhengig av det faktum at alle Lactobacillus-stammer ikke fungerer i det testede henseende. I noen forsøk, har man benyttet et uegnet Lactobacillus-materiale, f.eks. frysetørket i tørrblandingform eller som ikke-belagte kapsler.

WO Al 953304 6 beskriver at Lactobacillus-stammer kan isoleres fra faeces av friske nyfødte barn fra første til sjette levedagen og fra avvente barn. Den bakterielle tarmfloraen i en baby som er opp til en uke gammel, varierer betydelig avhengig av matinntaket som også inkluderer morsmelken, og dokumentet omtaler ikke Lactobacillus casei rhamnosus-stammer.

WO 96/38159 (Lafor Lab Ltd.) beskriver et farmasøytisk materiale for behandling av antibiotika-assosiert diaré, idet nevnte materiale inneholder, blant annet, levedyktige lactobacillus rhamnosus-stammer.

Japansk patentsøknad 172,94 9 av Jakult Honsa KK beskriver, blant annet, lactobacillus rhamnosus og casei som en aktiv ingrediens i et anti-allergisk middel.

WO 93/01823 beskriver en fremgangsmåte for å isolere en stamme av lactobacillus som har evnen til å kolonisere i tarm i menneske. F.eks. har stammen av L. casei sp. rhamnosus 271 blitt isolert, og det hevdes at den er an-vendelig for profylakse eller behandling av bakterielle infeksjoner, spesielt i form av et fermentert nærings-materiale. Den aktuelle stamme har blitt isolert fra tarmene i voksne.

EP-A-0 271 364 beskriver et preparat for behandling av profylakse av enteriske forstyrrelser i dyr. Dette materiale omfatter én eller flere melkesyre-bakterier utvalgt blant fenotypene av, inter alia, Lactobacillus casei spp. rhamnosus. Materialet er en ikke spesifikk blanding av et flertall stammer, og er videre ikke tiltenkt for anvendelse i menneske. De aktuelle stammer synes å være isolert fra kveg og sau og kan dermed ikke appliseres til menneske. Videre har forsøk kun blitt utført på kveg og sau.

DT-A1-2,421,066 beskriver et materiale for å re-etablere en forstyrret intestinal flora til en normal tilstand, idet materialet omfatter en blanding av bifido-bakterier og muligens også en Lactobacillus casei var rhamnosus-stamme.

I våre analyser av interaksjonen mellom forskjellige bakterier har vi studert, inter alia, hvordan visse Lactobacillus-stammer kan motvirke diaré som skyldes inntak av antibiotika, og hindre vekst av patogene bakterier så som Helicobacter. I laboratorieskala har kulturer av Lactobacillus blitt testet, hvorfra et stort antall kloner med forskjellige biologiske egenskaper har blitt isolert. Én av disse, Lactobacillus casei rhamnosus LB21, nedenfor også benevnt som "LB21", har blitt isolert fra faeces i spedbarn, og har vist seg å ha en bestemt uttalt inhibitorisk effekt på majoriteten av de bakterier som er viktige for forskjellige typer infeksjoner i menneske, så som Staphylococcus aureus, forskjellige former av Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Klebsiella- Enterobacter, Campylo-bactus, Clostridium difficile, Helicobacter pylori etc. Den sterkt inhibitoriske effekt av akkurat LB21 på intestinale patogene bakterier skyldes sannsynligvis det faktum at den produserer et spesifikt lav-molekylært protein eller et spesifikt lav-molekylært peptid, som er termisk stabilt, som har en molekylvekt på under 5.000 Dalton og som på en unik måte har en skadelig effekt på intestinelle patogene bakterier.

Imidlertid beskriver ingen av de ovenfor nevnte publikasjoner den spesifikke stamme Lactobacillus casei rhamnosus LB21, som har blitt isolert fra faeces i spedbarn, og som har en betydelig forbedret effekt på gastrointestinale forstyrrelser sammenlignet med nært beslektede stammer.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å lindre de ovenfor nevnte helseproblemer mer effektivt enn det som muliggjøres med de fremgangsmåter for behandling som er kjent fra teknikkens stilling. Formålet oppnås med et farmasøytisk materiale av den type som er nevnt i introduk-sjonen, som i tillegg har de trekk som er definert i den karakteriserende del av det medfølgende krav 1. Foretrukne utførelser er angitt i de medfølgende underkrav 2-9.

Således er det farmasøytiske materialet i følge oppfinnelsen kjennetegnet ved at det omfatter en levedyktig mikroorganismestamme i form av Lactobacillus casei rhamnosus stamme LB21 med katalognr. NCIMB 40564, og/eller én eller flere varianter derav med tilsvarende funksjon i minst ett farmasøytisk akseptabelt bærermedium, hvori mikroorganismene opprettholder sin levedyktighet.

Således er fremgangsmåten i følge oppfinnelsen kjennetegnet ved at nevnte Lactobacillus casei rhamnosus stamme LB21 med katalognr. NCIMB 40564 og/eller én eller flere varianter derav med tilsvarende funksjon, som ble isolert fra faeces fra en 1-8 dagers gammel baby, fortrinnsvis 5 dager gammel, tilsettes til et farmasøytisk akseptabelt bærermateriale, hvori mikroorganismene opprettholder sin levedyktighet.

Således er Lactobacillus casei rhamnosus stammen i følge oppfinnelsen kjennetegnet ved at den har katalognr. NCIMB 40564 og/eller én eller flere varianter derav med tilsvarende funksjon.

Således er anvendelsen i følge oppfinnelsen kjennetegnet ved anvendelse av en Lactobacillus casei rhamnosus stamme som definert ovenfor for fremstilling av et medikament for profylakse mot og/eller behandling av antibiotika-assosiert diaré, helicobacter-infeksjon i mage og den øvre tynntarm, turist-diaré, stress-induserte gastrointestinale forstyrrelser, cytotoksisk-indusert intestinal påvirkning, allergier i barn, forstoppelse og/eller profylakse mot intestinale infeksjoner i barn som har gjennomgått en lever-transplantasjon eller blitt operert for gallekanal-atresia eller i babyer som er nyfødte eller født for tidlig.

Derved vedrører den foreliggende oppfinnelsen et farmasøytisk materiale for profylakse mot og/eller behandling av gastrointestinale forstyrrelser i menneske og dyr, idet nevnte materiale omfatter en levedyktig mikroorganisme-stamme i form av stammen Lactobacillus casei rhamnosus LB21 og/eller én eller flere varianter derav med i hovedsak lignende funksjon, i minst ett farmasøytisk akseptabelt bærermedium, hvori mikroorganismen beholder sin levedyktighet. Nærmere bestemt er dette et farmasøytisk materiale for profylakse mot og/ eller behandling av, inter alia, antibiotika-assosiert diaré, helicobacter-infeksjon i mage, turist-diaré og stress-induserte gastrointestinale forstyrrelser.

Videre vedrører foreliggende oppfinnelse Lactobacillus casei rhamnosus stamme NCIMB 40564, som er i stand til å hindre og/eller helbrede gastrointestinale forstyrrelser i menneske og dyr, og som har blitt isolert fra faeces i spedbarn som er ca. 1-8 dager gamle.

Det farmasøytiske materiale ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder mikroorganisme-stammen Lactobacillus casei rhamnosus LB21 eller varianter derav i en mengde fra lO^-lO-^, fortrinnsvis 10^-10^^, kolonidannende enheter per ml i det preparat som er klart til anvendelse.

Med uttrykket "kolonidannende enheter" menes det antall kolonier som inneholder én eller flere bakterier som vokser på et substrat.

Med uttrykket "helicobacter-infeksjon" menes symptomer på magesår hvor Helicobacter har blitt identifisert til å foreligge i magen eller i den øvre del av tynntarmen.

Med uttrykket "turist-diaré" menes diaréer som forekommer når den gastrointestinale flora forandres, f.eks. i utlandet, og også tilfeller av infeksjoner forårsaket av f.eks. Salmonella og E. coli.

Med uttrykket "stress-indusert gastrointestinale forstyrrelser" menes ubalanse i den gastrointestinale flora som forårsaker magesmerter, diaré, gassdannelse etc.

I en foretrukket utførelse av følgende oppfinnelse er bæreren for LB21 et surnet eller fermentert melkeprodukt, så som surnet melk, yoghurt, melk, eller det er fruktjuice, iskrem, suppe eller fruktdrikker. Bakteriestammen kan anvendes som start-kultur i fremstillingen av slike melkeprodukter, noe som resulterer i et surnet eller fermentert melkeprodukt som har en øket mengde av den fordelaktige stamme. Det er selvsagt også mulig å tilsette LB21 til fremstilte melkeprodukter, fruktjuice, suppe eller iskrem for å oppnå på denne måte en høyere mengde av de ønskelige bakterier i mediumet. Denne utførelse er meget viktig siden det oppnådde preparat er et sunt og verdsatt næringsstoff. Et slikt materiale kan gis profylaktisk eller kurativt mot diaré og andre intestinale infeksjoner som ofte påvirker spedbarn. I tillegg kan det gis til folk som behandles med antibiotika eller bestråling ved kreftbehandling, til mennesker som har helicobacter-infeksjon i magen og til turister som reiser utenlands, hvor en bakteriell flora som ikke er kjent for den gastrointestinale kanal ofte møtes.

Preparatet kan også foreligge i tørr form for oral administrering, f.eks. i form av kapsler, tabletter eller pulver, eller i form av en suspensjon, valgfritt frossen, så som NaCl-løsning, glukose-løsning eller skummet melk. Bærermedium som anvendes her er av konvensjonell type og godt kjent for fagkyndige. Kapslene kan være av en type som er resistent til magesaft, slik at bakteriene beskyttes mot magesaften og kun frigis i tarmene. Av den samme grunn kan tabletter administreres med en type belegging (som er kjent fra teknikkens stilling) som er resistent til magesaft. Pulverne kan være tiltenkt å bli opprørt i en vandig væske før administrering, f.eks. vann, fruktjuice eller et melkeprodukt.

Materialet har således blitt vist å ha et spesielt stort potensiale som et profylaktisk middel mot og/eller som et middel for å behandle antibiotika-assosiert diaré.

Materialet kan også med fordel anvendes for profylakse mot og/eller behandling av helicobacter-infeksjon i mage og øvre tynntarm i menneske og dyr, men også mot såkalte turist-diaréer og stress-induserte gastriske forstyrrelser.

I det farmasøytiske materiale i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan også andre melkesyrebakterier valgfritt inkorporeres, så som én eller flere av Lactococcus eller Lactobacillus-stammer, og fortrinnsvis er stammen av Lactococcus lactis LIA også inkorporert.

Det farmasøytiske materiale i samsvar med foreliggende oppfinnelse har også vist seg å være spesielt fordelaktig ved profylakse og/eller behandling av barn i følgende situasjoner. a) Nyfødte babyer og prematurt fødte babyer med behov for intensiv behandling.

En slik intensiv behandling kan faktisk resultere i at den normale kolonisering av tarmene med Lactobacilli og bifido bakterier ikke forekommer, noe som øker risikoen for at patogene bakterier dominerer. Dette øker også risikoen for infeksjoner og anvendelse av antibiotika. Tilsetting av LB21 kan normalisere tarmfloraen i disse babyer, og motvirke den uønskede utvikling som beskrevet ovenfor.

b) Babyer som eksponeres til en øket risiko for å få type 1 diabetes, cøliaki (gluten-allergi) og forskjellige

autoimmune tilstander.

En faktor som forårsaker disse forstyrrelser er sannsynligvis forstyrret immun-regulering i tarmene slik at antigener (substanser som ikke forekommer naturlig i kroppen) fra næringsstoffer, intestinale bakterier, virus eller andre mikroorganismer kan forårsake en immunreaksjon mot egne kroppsvev. Tilsetting av LB21 kan normalisere den intestinale flora og dermed motvirke forekomst av disse forstyrrelser.

c) Barn som har gjennomgått en operasjon for gallekanal-atresia (kongenital feildannelse med fullstendig

eller delvis tapte gallekanaler i og/eller på utsiden av leveren), og barn som har gjennomgått en levertransplanta-sjon.

Disse kategorier barn løper en øket risiko for å bli rammet av infeksjoner som virker på lever/gallekanaler etter operasjonen. Tilsetting av LB21 kan redusere risikoen for slike komplikasjoner ved å inhibere veksten av bakterier som vanligvis forårsaker disse typer infeksjoner.

Det farmasøytiske materiale ifølge foreliggende oppfinnelse kan også benyttes i forbindelse med cytotoksisk behandling. Pasienter med kreft-lidelser behandles ofte med cytotoksiner som har en negativ effekt på tarmenes funksjon, og som har en skadelig effekt på strukturen og ny vekst av den intestinale mukøse membran. Således forårsaker denne type behandling ofte en redusert assimilasjon av næringsstoffer og diaré. En ytterligere konsekvens er at intestinale bakterier kan spres til blodkarene gjennom den svekkede intestinale mukøse membran og forårsake alvorlige infeksjoner. Dette fører til et øket forbruk av antibiotika, som deretter ytterligere skader funksjonen av tarmene og kan medføre at forskjellige intestinale bakterier utvikler resistens til antibiotika.

Ved å tilsette LB21 sammen med behandlingen med cytotoksiner, kan de negative effekter på funksjonen og strukturen av den intestinale mukøse membran reduseres, og dermed redusere risikoen for alvorlige infeksjoner forårsaket av bakterier i tarmene.

Videre er det farmasøytiske materiale i samsvar med foreliggende oppfinnelse nyttig for å hindre allergier i barn, f.eks. atopisk eksem, og for å hindre og behandle forstoppelse, først og fremst i eldre folk.

Når det farmasøytiske materiale i samsvar med foreliggende oppfinnelse er tiltenkt for behandling av dyr, er bæreren et egnet næringsstoff, så som i form av myse, tørrfor eller en konsentrert suspensjon.

Mikroorganismene kan lagres i en fryse-tørret form, fortrinnsvis i skummet melk på en mørk og tørr plass, men også fryses ved en temperatur på -70°C.

Den nødvendige dosering av materialet ifølge foreliggende oppfinnelse kan justeres i avhengighet av slike faktorer som pasientens alder og tilstand, og likeledes i henhold til graden av alvorlighet av sykdommen. Det er også innen kompetansen av en fagkyndig å bestemme en egnet dosering mot denne bakgrunn. En ytterligere fordel med oppfinnelsen er at en sterk overdose av det farmasøytiske materiale knapt betyr en risiko for pasienten.

Mikroorganismer ifølge oppfinnelsen.

Den ovenfor angitte mikroorganisme-stamme Lactobacillus casei rhamnosus LB21 ble isolert som én av ca. hundre Lactobacillus-stammer fra faeces fra en ca. 5 dagers gammel frisk baby, og ble deretter selektert til å være den mest effektive stamme for oppfinnelsens formål. Det er svært viktig at LB21 isoleres fra spedbarnet i løpet av første uke, så som fra den første til den åttende dag, fortrinnsvis ved den femte dag. LB21 skilles fra andre Lactobacillus casei rhamnosus-stammer ved anvendelse av pulsert feltgelelektroforese (PFGE) i samsvar med metoden ifølge Fasola og BioRad. LB21 har tidligere ikke blitt isolert og definert, og er dermed en fullstendig ukjent Lactobacillus casei rhamnosus-stamme, som har blitt funnet å ha spesielle fordelaktige effekter med de ovenfor angitte helseproblemer og sykdomsbilder.

Tabellen nedenfor viser testresultater fra det inn-ledende seleksjonstrinn, hvor LB21 sammenlignes med andre

Lactobacillus-stammer som har blitt isolert fra faeces fra babyer med hensyn til inhibitorisk effekt på flere pato-gener.

Som- angitt ovenfor inkluderes LB21-stammen som en aktiv ingrediens i det oppfinneriske materiale, og den ble deponert den 11. juni 1993 ved The National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, England. Dens katalognr. er NCIMB 40564. Det skal bemerkes at stammen ble deponert med identifikasjonsreferansen Lactobacillus casei rhamnosus L20 05, men at den vanlige designering av stammen senere har blitt forandret til Lactobacillus casei rhamnosus LB21. Stammen typifiseres eller klassifiseres i samsvar med API 50CH-systemet (API-System - La Balme les Grottes - 38390 Montalieu - Vercieu), slik det fremgår av den følgende typifiseringstabell.

API 50 CL

37°C, C02-blodagar.

Det er her viktig å understreke at der er en stor forskjell mellom forskjellige Lactobacillus-stammer, slik det også er tilfelle for undergrupper av Lactobacillus casei rhamnosus (LB21). LB21 i det farmasøytiske materiale i samsvar med foreliggende oppfinnelse har med sikkerhet blitt identifisert som en Lactobacillus casei rhamnosus-stamme, men dette betyr ikke at den aktuelle stamme er identisk med eller lik andre Lactobacillus casei rhamnosus-stammer beskrevet i litteraturen, så som i WO 93/01823. Disse undergrupper vokser f.eks. forskjellig i oksygenomgivelser og ved forskjellige temperaturer. Det er åpenbart at dette ikke skyldes identiske stammer, og en detaljert karak-terisering av de respektive undergrupper (jamfør ovenfor) viser at de har forskjellige egenskaper, noe en fagkyndig vil innse. En stor forskjell er f.eks. at LB21 har blitt isolert fra faeces fra baby, mens stamme 271 i WO 93/01823 har blitt isolert fra tarmene i voksne.

Det farmasøytiske materiale i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatter imidlertid også varianter av Lactobacillus casei rhamnosus-stamme LB21 som har i hovedsak lignende funksjon, dvs. en evne til å hindre og/eller helbrede de ovenfor nevnte gastrointestinale forstyrrelser, f.eks. mutanter.

Utførte eksperimenter.

Passering gjennom den gastrointestinale kanal.

Et krav for at probiotiske stammer av melkesyre-bakterier, så som LB21 i materialene ifølge oppfinnelsen, er i stand til å virke i tynn- og tykktarmen i mennesker og dyr er at de må overleve passeringen gjennom det sure miljø i magen. Et forsøk har blitt utført for å vise at Lactobacillus casei rhamnosus LB21 kan overleve passeringen gjennom magen, og kan finnes i faeces fra friske frivillige. Videre har vi studert for hvor lang tid denne stamme kan finnes i faeces etter at individet i eksperimentet har avsluttet det orale inntak av samme.

I et deleksperiment A, ga 25 friske frivillige mennesker en prøve faeces i et sterilt plastrør. Prøven ble lagret på et kaldt sted (maks. 4°C), inntil dyrkning. Før dyrkning, ble prøven blandet inn i en 0,9% saltløsning med et forhold på 1:10. Deretter ble 10 ul av prøven dyrket på Rogosa-plater med 128 p/ml vancomycin. Platene ble inkubert ved 37°C i C^-omgivelse, og ble deretter avlest etter 48 timer. Grensen for deltagelse i deleksperiment B ble satt til å være maks 4 x 10^ kolonidannende enheter av vancomycin-resistent lactobacilli per g faeces.

I deleksperiment B, deltok 13 av de 25 ovenfor nevnte personer, som hadde en relativ vancomycin-sensitiv lactobacilli-flora i tarmene. Individene ble instruert å ikke spise næringsstoffer inneholdende lactobacilli fra 2 uker før starten av forsøket, og til siste forsøksdag. Hvert individ hadde i forbindelse med et måltid 10 ml saltløsning med 10^ kolonidannende enheter av levedyktig LB21 per dag i 5 dager. Disse individer ga en faecesprøve dagen før inntak av lactobacilli (null-prøve) og deretter fra den 4. dag av LB21-inntaket og til og med den 12. dag etter den avsluttede behandling. Prøvetaking og dyrkning av prøver ble utført i samsvar med fremgangsmåten som beskrevet i eksperiment del A. Identifiseringen av lactobacillus casei rhamnosus LB21 ble utført ved hjelp av Gram-farging og API-klassifisering (CHL-medium).

Det skal bemerkes at individ nr. 8 tok penicillin under forsøket. Dette individ tok derfor LB21 i 10 dager og startet samtidig som resten av forsøksindividene.

Deleksperiment B ble avsluttet 12 dager etter at inntak av LB21 hadde blitt avsluttet. Dette fant sted selv om LB21 fremdeles kunne finnes i faeces fra 4 av 13 individer. I de gjenværende 9 individer, ble LB21 isolert fra faeces i gjennomsnitt 5 dager etter at inntaket var avsluttet. I individ 8 som tok penicillin, ble LB21 funnet i faeces under hele penicillinkuren, og 2 dager etter at inntaket hadde blitt avsluttet. I faecesprøvene ble LB21 funnet i en størrelsesorden på 1 x 10^ til 5 x 10^ kolonidannende enheter per g faeces.

For å oppsummere, det ble etablert at Lactobacillus casei rhamnosus-stamme LB21 overlevde passering gjennom magen, og kunne finnes i faeces til alle individer, også det individ som hadde undergått en penicillinbehandling. 4 av 13 av individene hadde fremdeles LB21 i faeces 12 dager etter avslutning av det orale inntak av LB21. De gjenværende 9 individer hadde fremdeles LB21 i gjennomsnittlig 5 dager etter at inntak av LB21 ble avsluttet. Det gjennom-snittlige antall for hele gruppen på 13 individer var 6 dager.

Inhibitorisk effekt av Lactobacillus casei rhamnosus LB21.

Den ovenfor angitte' melkesyrebakterie LB21 har blitt testet for dets inhibitoriske effekt på et stort antall patogene bakterier fra tarm. Den har blitt funnet å ha en tilfredsstillende inhibitorisk effekt, og et eksperiment ble også utført med formål å undersøke om den også kunne inhibere E. coli 0-157, Clostridium difficile og Helicobacter pylori.

To stammer av E. coli 0-157, den ene tox- og den andre tox+, ble isolert fra pasienter. Fem stammer av Clostridium difficile fra pasienter som led av antibiotika-assosiert diaré, og tre stammer av Helicobacter pylori fra klinisk materiale (biopsier) ble også testet. I den utførte interferens-test ble agar-sjikt-metoden benyttet, som ble justert til de bakterier som ble testet. Denne metode betyr at Lactobacillus-stammene kultiveres i MRS-broth (Merck) ved 37°C i 5% CO2 over natten. Hver stamme ble deretter støpt separat i MRS-agar (25 ml agar). Agarplatene ble inkubert ved de ovenfor angitte betingelser i 24 timer. Et nytt agarsjikt (M17 agar(Merck), 25 ml) eller blodagar (BHI + blod fra hest) ble helt over det første sjikt, og det andre sjikt for deretter størkne i 4 timer. Testbakteriene ble deretter dyrket separat i TY-medium (S.E. Holm og E. Falsen, APMIS 1967, Vol 69, p 264) ved 37°C. Bakteriene ble overført til Bertani-trau (0,25 ml, 10^ bakterier per ml). Bakteriene ble fortynnet til 1:10 i NaCl i et nytt Bertani-trau. Fra disse trau ble teststammene (25 per trau) stemplet på agarplaten ved hjelp av en pinne-replikator av typen Steers steel. Platene ble inkubert ved 37°C for E. coli, og ved 37°C og anaerobisk for Clostridium difficile, og ved 37°C i mikroaerofile omgivelser for Helicobacter pylori. (E. Steers at al., J. Antibiot. Chemoter., 179, Vol 9, p 307). For kontroll ble plater uten LB anvendt.

LB21-stammen inhiberte alle testbakteriene.

Det endelige resultat viste at LB21-stammen hadde en utmerket inhibitorisk effekt på disse tarmpatogener, noe som følger av den påfølgende tabell.

Testene ble utført i samsvar med agarsjiktmetoden, og også i "brotn". De ble gjentatt og utført ved flere forskjellige pH-verdier.

Evnen til Lactobacillus casei rhamnosus LB21 til å inhibere antibiotika- assosiert diaré.

31 friske individer deltok i forsøket, 16 menn og 15 kvinner. Individene ble oppdelt i samsvar med kjønn, og deretter vilkårlig i test- og kontrollgrupper. Testgruppen inkluderte 16 individer, og kontrollgruppen 15 individer. Gjennomsnittsalder i testgruppen var 24,6 år, i området 19 til 31 år. Gjennomsnittsalderen i kontrollgruppen var 24,4 år, i området 20 til 33 år. To individer i kontrollgruppen avsluttet forsøket på grunn av graviditet og problemer forårsaket av inntak av antibiotika. De som avsluttet utgjorde 6,5%. For den siste faeces-test, avsluttet ytterligere ett individ på grunn av en idrettsskade. Ingen av individene var røykere eller inntok snus, eller hadde tatt antibiotika i løpet av de siste 6 måneder før forsøket. Ingen medisi-nering med unntak av Kåvepenin ble tillatt under forsøket. Individene ble ikke tillatt å innta fermenterte produkter to uker før starten av inntaket av penicillin, og under forsøket. Eksperimentet ble utført som en dobbeltblindet placebo-kontrolltest og ble godkjent av den forsknings-etiske komite ved det Medisinske Fakultet, Universitetet i Umeå, Umeå.

Testgruppen, og også kontrollgruppen, inntok 500 mg Kåvepenin i kapsler peroralt (fenoksymetylpenicillinkalium, Astra Låkemedel, Sødertelje) to ganger per dag i 10 dager.

Testgruppen ble gitt frossen skummet melk med LB21 (Essum, Umeå) i en konsentrasjon på 10cfu (kolonidannende enheter) per ml. Kontrollgruppen ble gitt skummet melk som placebo. Individene i testgruppen tok 5 ml frossen skummet melk med LB21 eller placebo to ganger per dag. Inntaket startet samtidig med penicillin-inntaket, og varte i 15 dager.

Prøver av faeces ble innsamlet før inntaket av Kåvepenin ved dag 0, under inntaket av Kåvepenin og LB21 eller placebo ved dag 10, og ved dag 15 under inntaket av LB21/placebo etter den avsluttede Kåvepenin-behandling. Prøvene ble lagret på et kaldt sted (+4-8°C) før de ble levert til laboratoriet hvor de ble frosset og lagret ved -20°C før analyse. Alle prøver ble frosset innen 24 timer etter prøvetaking.

Individene noterte antallet avføringer per dag, og konsistensen av faeces fra 1 uke før inntaket av Kåvepenin og opptil inkluderende 5 dager etter avslutning av kuren. Magesmerte og andre subjektive symptomer ble også notert.

Faecesprøvene ble veiet og fortynnet med sterilt vann i et forhold på 1:10. pH ble målt med indikatorpapir (Merck, pH 5-10) i midten av blandingen. LB21 ble dyrket etter å ha vært fortynnet med sterilt vann på Rogosa-plater med 128 ug vancomycin. Prøvene ble inkubert ved 37°C i CO2-miljø i 48 timer.

Alle lactobacilli ble dyrket etter å ha blitt fortynnet med sterilt vann på Rogosa-plater. Prøvene ble anaerobisk inkubert ved 37°C i 48 timer. Deretter ble prøvene lagret ved -20°C.

Tester for Clostridium difficile toksin ble utført i samsvar med metoden ifølge Aronsson et al.

Avføringsfrekvensen, faeceskonsistens, magesmerte og andre subjektive symptomer ble notert, og gjennomsnitt, middel og område ble kalkulert.

Statistiske beregninger ble utført med SPSS for Windows. Resultatene ble presentert som gjennomsnitts-verdier og middelverdier. Verdiene for lactobacilli ble logaritmisert (log 10) før den statistiske beregning. Middelverdiene og området mellom maksimum- og minimums-verdier ble beregnet på basis av antallet avføringer, faeceskonsistens og pH-verdi. Statistisk sammenligning mellom gruppene, hvor et normalområde ikke ble funnet eller var lite pålitelig, ble utført med Mann-Whitney U-test (antall avføringer, faeceskonsistens, lactobacilli, pH). En pH på mindre enn 0,05 ble vurdert som statistisk signifi-kant .

Resultater.

Individene som tok LB21 hadde betydelig færre av-føringer/diaré under inntaket av fenoksymetyl-penicillin sammenlignet med placebogruppen, nemlig 0,24 og 0,98 respektivt (p<0,05). Videre økte frekvensen av avføringene og forekomst av magesmerte i betydelig grad under penicillin-behandlingen i placebogruppen sammenlignet med situasjonen før inntaket av penicillin. Der var også en betydelig økning i mengden Lactobacillus casei rhamnosus i faeces i den gruppe som hadde blitt forsynt med LB21. Der var imidlertid ingen betydelige forskjeller i frekvensen av avføringer, eller med hensyn til totalantallet lactobacilli i prøvene av faeces i de to grupper. Videre var der ingen tilfeller av Clostridium difficile toksin i noen av de to grupper.

LITTERATUR REFERANSER:

1. Sandine, W.E. 1919. Roles of lactobacillus in the gastrointestinal tract. J, Food Protect. 42, 259-262. 2. Fuller, R. 1986. Probiotics. J. Appl. Bacteriol. Symp. Suppl. 1S-7S. 3. Gillilånd, S.E., Nelson, CR. och Maxwell, C. 1985. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 33, 15-18.. v 4. Goldin, B.R. and Gorbach, S.L. 1980. Effect of Lactobacillus acidodophilus dietary supplements bn 1,2-di-metylhydrazine dihydrochlorid induced intestihal cancer in rats. J. Nati. Cancer. Inst. 64, 263-271. 5. Goldin, B.R. and Gorbach, S.L. 1987. Lactobacillus GG: a new stråin with properties favorable for survival, adhesion and antimicrobial activity in the gastrointestinal tract. FEMS Microbiol. Rev. 46, P72. 6. Lessard, M. and Briss.on, G.J. 1987. Effect of lactobacillus fermentation product /on growth immune response and fecal enzyme activity in weahéd pigs. Can. J. Anim.

'Sei. 62509-516.

r

. 7. Siitonen, S., Vapaatalo, H.., Salminen, S., Goldin, A., Saxelih/ M,, Wikberg,. R., and Kirkkola, A-L. 1990. Effect of lactobacillus GG. Yoghurt in prevention of antibiotic associated diarrhoea. Anhual Med. 22/ 57-59.

<r>'~

8 .^Fernandes., C., Shahani, K. Amer, M. 1987. Therapeiitic

role of dietary lactobacilli and lactobacilli fermented. dairy products. FÉMS microbiol. R,ew. 4,6: 3.43-356.

Claims (12)

1. Farmasøytisk materiale for profylakse mot og/eller behandling av gastrointestinale forstyrrelser i menneske og dyr, karakterisert ved at det omfatter en levedyktig mikroorganismestamme i form av Lactobacillus casei rhamnosus stamme LB21 med katalognr. NCIMB 40564, og/eller én eller flere varianter derav med tilsvarende funksjon i minst ett farmasøytisk akseptabelt bærermedium, hvori mikroorganismene opprettholder sin levedyktighet.

2. Farmasøytisk materiale i samsvar med krav 1, ka r-a kterisert ved at mikroorganismestammen foreligger i en mengde på 10<2->10<12> kolonidannende enheter per ml i det materiale som skal anvendes.

3. Farmasøytisk materiale i samsvar med krav 2, kara kterisert ved at mikroorganismestammen foreligger i en mengde på 10<6->10<10> kolonidannende enheter per ml i det materiale som skal anvendes.

4. Farmasøytisk materiale i samsvar med krav 1, kara kterisert ved at det farmasøytisk akseptable bærermedium er et surnet eller fermentert melkeprodukt, fortrinnsvis sur melk, yoghurt og melk eller fruktjuice, iskrem, suppe eller fruktdrikker.

5. Farmasøytisk materiale i samsvar med et av kravene 1-4, karakterisert ved at det farma-søytisk akseptable bærermedium er egnet som dyre-forstoff, fortrinnsvis myse, tørrfor eller som en konsentrert suspensjon, ved administrering av nevnte materialet til dyr.

6. Farmasøytisk materiale i samsvar med krav 1, kara kterisert ved at bakteriestammen tilsettes til bærermediumet som en startkultur og/eller til et materiale ferdig til bruk.

7. Farmasøytisk materiale i samsvar med et av kravene 1-6, karakterisert ved at det foreligger i tørr form, så som kapsler, tabletter eller pulver, eller i form av en suspensjon, valgfritt frossen, fortrinnsvis NaCl-løsning, glukose-løsning eller skummet melk, sammen med et farmasøytisk akseptabelt bærermateriale.

8. Farmasøytisk materiale i samsvar med et av kravene 1-7, karakterisert ved at Lactobacillus casei rhamnosus stamme LB21 har blitt isolert fra faeces fra en 1-8 dagers gammel baby, fortrinnsvis en baby som er 5 dager gammel.

9. Farmasøytisk materiale i samsvar med et av kravene 1-8, karakterisert ved at minst én annen Lactococcus, Lactobacillus eller Bifidobacterium-stamme, fortrinnsvis Lactococcus lactis Lia, også inkorporeres i materialet.

10. Lactobacillus casei rhamnosus stamme som er i stand til å hindre og/eller behandle gastrointestinale forstyrrelser i menneske og dyr, karakterisert ved at det har katalognr. NCIMB 40564 og/eller én eller flere varianter derav med tilsvarende funksjon.

11. Anvendelse av en Lactobacillus casei rhamnosus stamme ifølge krav 10 for fremstilling av et medikament for profylakse mot og/eller behandling av antibiotika-assosiert diaré, helicobacter-infeksjon i mage og den øvre tynntarm, turist-diaré, stress-induserte gastrointestinale forstyrrelser-, cytotoksisk-indusert intestinal påvirkning, allergier i barn, forstoppelse og/eller profylakse mot intestinale infeksjoner i barn som har gjennomgått en lever-transplantasjon eller blitt operert for gallekanal-atresia eller i babyer som er nyfødte eller født for tidlig.

12. Fremgangsmåte for produksjon av et farmasøytisk materiale ifølge et av kravene 1-9, karakteris, ert ved at nevnte Lactobacillus casei rhamnosus stamme LB21 med katalognr. NCIMB 40564 og/eller én eller flere varianter derav med tilsvarende funksjon, som ble isolert fra faeces fra en 1-8 dagers gammel baby, fortrinnsvis 5 dager gammel, tilsettes til et farmasøytisk akseptabelt bærermateriale, hvori mikroorganismene opprettholder sin levedyktighet.