NO327792B1 - Bifidobakteriumstamme, formulering omfattende nevnte stamme, og anvendelse derav i matprodukter eller medikamenter ved behandling av sykdom. - Google Patents

Description

Introduksjon

Foreliggende oppfinnelse omhandler probiotiske Bifidobakteriumstammer som har ulike anvendelser i matprodukter og i medisin. Mer spesielt omhandler den foreliggende oppfinnelsen probiotiske stammer av bifidobakterier som er i stand til, på en fordelaktig måte, å modifisere og derved lindre observerbare symptomer i inflammatorisk sykdom.

Forbrukere blir mer og mer oppmerksomme på forhold som kan være nødvendige for opprettholdelse av deres miljø, helse og ernæring. Som en respons på dette har vitenskapelig forskning fokusert på rollene som diett, stress og moderne medisinsk praksis (for eksempel antibiotika og radioterapi) kan spille med hensyn til å true human helse. Spesielt øker befolkningsdynamikken, som beveger seg mot et eldre samfunn, forekomsten) av sykdommer som kan være forårsaket av svekket eller kompromittert mikroflora, så som gastrointestinal trakt (GIT) infeksjoner, forstoppelse, irritabelt tarmsyndrom (IBS), inflammatorisk tarmsykdom (IBD) - Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, matallergier, antibiotikaindusert diare, kardiovaskulær sykdom og visse typer av kreft (for eksempel kolorektal kreft). Probiotika har blitt definert som levende mikrobielle matsupplementer som på en fordelaktig måte påvirker verten ved å bedre den mikrobielle balansen i tarmene, eller i videre forstand, som levende mikroorganismer som ved inntak i et visst antall utøver helseeffekter som strekker seg utover iboende basisernæring. Blandinger av ulike mikroorganismer, spesielt arter av Lactobacillus og Streptococcus, har tradisjonelt vært benyttet i fermenterte meieriprodukter for å fremme helse.

I de senere årene har den kommersielle produksjonen og markedsføringen av funksjonell mat (mat som påvirker funksjoner i kroppen på en målrettet måte slik at den positivt påvirker fysiologi og ernæring), spesielt probiotiske { Acidophilus Bifidus) yoghurter, spredd seg fra det veletablerte japanske nisjemarkedet til den lukrative og ekspanderende europeiske unionen. Mens et antall av probiotiske bakterier av human opprinnelse nå blir utnyttet kommersielt (for eksempel L. Acidophilus LA-1), er mange forbrukere, forbrukerorganisasjoner og medlemmer av det vitenskapelige samfunnet skeptiske til slike produkter og deres publiserte probiotiske krav. Meierimatvareindustrien er derfor under vesentlig press for vitenskapelig å validere disse nye probiotiske matproduktene.

Kriterier som har blitt foreslått for utvelgelsen av potensielt effektive probiotiske

mikroorganismer kan bli oppsummert som følger: Human opprinnelse, ikke-patogen oppførsel, motstand mot teknologiske prosesser (det vil si levedyktighet og aktivitet i avleveringstransportmidler), motstand mot mavesurhet og galletoksisitet, adhesjon til tarmepitelvev, evne til å kolonisere i GT, produksjon av antimikrobielle

substanser, evne til å modulere immunrespons og evnen til å influere på metabolske aktiviteter (for eksempel kolesterolassimilering, laktaseaktivitet, vitaminproduksjon) (Huis in't Veid J, Shortt C. Celection criteria for probiotic

micro-organisms. I: Leeds, A.R., Rowland, I.R. red. Gut Fora and Health - Past Present and Future. London: The Royal Society of Medicine Press Ltd., 1996: 19-26).

Bifidobakteria er en av flere dominerende dyrkbare bakterier som er tilstede i tykktarmmikrofloraen.

Funksjonene av endogene bifidobakterier i tykktarmen har ikke blitt belyst fullstendig. Imidlertid er det kjent at spedbarn som kun mottar brysternæring har redusert risiko for diaré sammenlignet med formuleringsmatede spedbarn. Det faktum at disse spedbarna har større antall med tykktarmbiifdobakterier kan delvis forklare denne observerte helsefordelen, ettersom okkupasjonen av tilgjengelige nisjer i G1T av et stort antall med ikke-patogene bifidobakterier kan hjelpe til med å forhindre bakterieinfeksjon. Patogenesen ved Crohns sykdom er antatt å være relatert til tykktarmbakteriemikrofloraen (Targan, S. og Shanahan, F. Inflammatory bowel disease: From bench to bedside. Williams og Wilkins 1994). Det har nylig blitt funnet at pasienter som lider av aktiv Crohns sykdom har signifikant mindre gjenfunnede bifidobakterier i sin avføring sammenlignet med friske individer. Denne reduksjonen i bifidobakterieantall ble observert til å være direkte korrelert med reduserte nivåer av p-D galaktosidaseproduksjon og aktivitet (Favier, C. et al, Dig. Dis. Sei. 1997; 42: 817-822). P-D galaktosidase er et enzym som produseres av bifidobakterier. Disse resultatene støtter forslaget som er fremsatt i andre studier om at stammer av bifidobakterier kan spille viktige roller i å opprettholde en balansert, frisk intestinal mikroflora.

Bifidobakterier er antatt å være probiotika, ettersom de er levende organismer som utøver helseeffekter utover basisernæring når de inntas i et tilstrekkelig antall. Flere inntatte bifidobakterier må nå virkningsstedet i tarmen for å utøve en probiotisk effekt. Et minimumsnivå på omkring 10-10 levedyktige bifidobakterier per gram intestinalinnhold har blitt antydet (Bouhnik, Y., Lait 1993: 73: 241-247). Det er rapporter i litteraturen som viser at in vivo studier utført på voksne og på barn indikerer at noen stammer av bifidobakterier er i stand til å overleve passasje gjennom gastrointestinal traktus. Signifikante forskjeller har blitt observert mellom evnen til ulike bifidobakteriestammer har til å tolerere syre og gallesalter, noe som indikerer at overlevelse er et viktig kriterium for utvelgelsen av potensielle probiotiske stammer.

Inntak av bifidobakterier kan bedre gastrointestinal transport.

En internasjonal patentsøknad publisert som WO 98/00035 beskriver et enteralt preparat inneholdende Streptococcus thermophilus og Bifidobacterium longum, som hver ved en konsentrasjon tilsvarende eller større enn 1 x 10<11> CFU per gram er anvendelig som hjelpestoff for enterale formuleringer og som oralt næringssupplement.

Europeisk patent nummer EP 0 768 375 Bl beskriver Bifidobakteriumstammene Bifidobacterium breve CNCM 1-1226, Bifidobacterium infantis CNCM 1-1227 og Bifidobacterium longum CNCM 1-1228 og anvendelse derav for terapeutisk eller profylaktiske formål in det gastrointestinale system hos mennesker og dyr.

Engelsk patentsøknad nr. GB 2 244 998 beskriver en ekstracellulær eksopolymer som i det vesentlige er et polysakkarid men som kan omfatte en proteinfraksjon, utstyrt med immunmodulerende egenskaper og som fremstilles ved å dyrke Bifidobacterium infantis longum stamme 1-885.

US patent nr. 5,711,977 beskriver bifidobakteriestammer som er tolerante i gastrointestinale miljøer og en fremgangsmåte for å dyrke stammene. Stammene er Bifidobacterium longum-stammer deponert under numrene ATCC 55815, 55816, 55817 og 55818.

Videre demonstrerer indirekte bevis i mennesker at det å drikke melk fermentert med bifidobakterier kan føre til reduserte nivåer av visse avføringsenzymer så som P-D galaktosidase implisert i omdannelsen av prokarsinogener til karsinogener (Bouhnik Y. et al, Eur. J. Clin. Nutr. 1996; 50: 269-273). Forråtnelsesmetabolitter av avføringsopprinnelse, så som p-kresol, indol og ammoniakk, ble også redusert når subjektene konsumerte melk fermentert med Bifidobakterium longum og S. Thermophilus (Takiguchi, R. et al. Bifidus - Flores, Fructus et Semina 1996; 9: 135-140).

Antimikrobiell aktivitet har vært rapportert å være assosiert med bifidobakterier. Bifidobakterier har også blitt vist å modulere ulike parametere i immunsystemet.

Mucosa inflammasjon i IL-10 utilstrekkelige mus har blitt rapportert å bli redusert ved å fore dyrene med en preparering av melkesyrebakterier (Madsen, K. et al. Gastroenterol. 1997; 112: A1030). Ytterligere studier utført på rotter har demonstrert at inntak av bifidobakterier kan undertrykke avvikende crypt foci (tidlige preneonplastiske skader) dannelse i tykktarmen (Kulkarni, N. og Reddy, B. Proe. Soc. Experim. Biol. Med. 1994; 207; 278-283), i tillegg til signifikant reduksjon i tykktarmtumorinsidens og i antallet tumorer som er tilstede (Singh, J. et al, Carcinogenesis 1997; 18: 833-841).

Det er pågående søking etter probiotiske stammer med spesielt fordelaktige effekter på ernæring og terapi, og på helse generelt.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en stamme av Bifidobakterium, nærmere angitt Bifidobakterium longum infantis UCC35624, eller muntant eller variant derav, isolert fra bortoperert og vasket human gastrointestinal traktus som er signifikant immunmodulerende etter oral konsumering i mennesker.

Den foreliggende Bifidobakterium-stammen fremkaller fortrinnsvis endringer i en immunologisk markør når den introduseres inn i et system som omfatter celler som interagerer med immunsystemet og celler i immunsystemet. Fortrinnsvis er cellene som interagerer med immunsystemet epitelceller. Fortrinnsvis er den immunologiske markøren et cytokin, spesielt TNFa.

Cellene som interagerer med immunsystemet er av gastrointestinal-, respiratorisk-eller urogenital opprinnelse.Videre er cellene i immunsystemet fortrinnsvis av gastrointestinal-, respiratorisk- eller urogenital opprinnelse.

Bifidobakterium longum infantis-stammen i følge oppfinnelsen er signifikant immunmodulerende etter oral konsumering i mennesker. Videre har Bifidobakterium-stammen i følge oppfinnelsen signifikant antiinflammatorisk effekt etter oral konsumering i mennesker.

Bifidobakterium-stammen i følge oppfinnelsen blir fortrinnsvis isolert fra bortoperert og vasket human gastrointestinal traktus som er i stand til å bekjempe effektene av inflammatorisk tarmsykdom, og nevnte evne blir opprettholdt i nærværet av fysiologiske konsentrasjoner av human galle og human magesaft. Evnen til å bekjempe effektene av inflammatorisk tarmsykdom blir målt ved å måle en tilbakegang av en tærende sykdom indusert i alvorlig kombinert immunsviktmottakende mus (SCID) som har blitt administrert renset CD4<+>, CD45RB<høy>T-celler.

Evnen den foreliggende Bifidobakterium longum infantis-stammen har til å bekjempe effektene av inflammatorisk tarmsykdom kan også bli målt ved å måle reduksjonen i tykktarminflammasjon i IL-10 utilstrekkelige mus (IL-10<+> 129 Svex stamme) etter administrering av Bifidobakterium longum infantis-stammen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.

Interleukin 10 (IL-10) er et viktig regulatorisk cytokin som undertrykker effektorfunksjoner av makrofager/monocytter, T hjelper 1 (Thl) celler og naturlige dreperceller. I tillegg forsterker IL-10 proliferasjon og differensiering av B-celler. Murine modeller som mangler IL-10-genet utvikler spontant inflammatorisk tarmsykdom og gastrointestinale tumorer. Den gastrointestinale floraen har vært involvert i patogenesen av disse sykdomstilstandene, ettersom bakteriefrie dyr ikke utvikler sykdom.

Bifidobakterium-stammen i følge oppfinnelsen har fortrinnsvis inhibitorisk aktivitet mot et bredt spekter av Gram positive og Gram negative bakterier.

Fortrinnsvis viser Bifidobakterium-stammen i følge oppfinnelsen et bredt spekter av aktivitet mot bakterier inkludert Staphylococcus, Pseudomonas, Coliform og Bacillus-arter.

En deponering av Bifidobakterium longum infantis stamme UCC 35624 ble gjort ved National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) den 13. januar 1999, og ble gitt adgangsnummer NCIMB 41003.

I en utførelsesform er mutanten en genetisk modifisert mutant.

Bifidobakterium-stammen i følge oppfinnelsen kan være i form av levedyktige celler. Alternativt er Bifidobakterium-stammen i følge oppfinnelsen i form av ikke-levedyktige celler.

Det beskrives også et antimikrobielt agens fremskaffet fra Bifidobakterium-stammen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, som er antagonistisk til veksten av andre organismer.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen følgelig en formulering som omfatter en stamme av Bifidobakterium i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.

Formuleringen kan inkludere et annet probiotisk materiale. Alternativt, eller i tillegg, inkluderer formuleringen et probiotisk materiale.

Det er beskrevet at formuleringen kan inkludere en stamme av Lactobacillus salivarius. En Lactobacillus salivarius-stamme kan være i form av levedyktige celler eller i form av ikke-levedyktige celler. Lactobacillus salivarius kan isoleres fra bortoperert og vasket human gastrointestinal traktus. Lactobacillus salivarius er signifikant immunmodulerende etter oral konsumering i mennesker. Stammen av Lactobacillus salivarius kan videre isoleres fra bortoperert og vasket human gastrointestinal traktus som inhiberer et bredt spekter av Gram positive og Gram negative mikroorganismer.

En Lactobacillus salivarius-stamme utskiller et produkt som har antimikrobiell aktivitet inn i en cellefri supernatant, nevnte aktivitet blir produsert kun av voksne celler og blir ødelagt av proteinase K og pronase E, de inhibitoriske egenskapene til nevnte stamme og dens utskilte produkter blir opprettholdt i nærværet av fysiologisk konsentrasjon av human galle og human magesaft. Slike stammer av Lactobacillus salivarius er angitt i WO 98/35014.

Lactobacillus salivarius-stammen er ideelt Lactobacillus salivarius-stamme UCC 118 eller en mutant eller variant derav. Mutanten er en genetisk modifisert mutant. Varianten kan være en naturlig forekommende variant av Lactobacillus salivarius. En deponering av Lactobacillus salivarius-stamme UCC 118 ble gjort ved NCIMB 7.november 1996, og ble gitt adgangsnummer NCIMB 40829.

I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse inkluderer formuleringen en spiselig bærer. Den spiselige bæreren kan være en farmasøytisk akseptabel bærer så som en kapsel, tablett eller pulver.

Den spiselige bæreren kan være et matprodukt så som surgjort melk, yoghurt, frossen yoghurt, melkepulver, melkekonsentrat, smøreost, dressinger eller drikkevarer.

Formuleringen i følge en utførelsesform kan omfatte et protein og/eller peptid, spesielt proteiner og/eller peptider som er rike på glutamin/glutamat, et lipid, et karbohydrat, et vitamin, mineral og/eller sporeelement. 1 en utførelsesform er Bifidobakterium til stede i mer enn IO<6> cfu per gram avleveringssystem.

I en annen utførelsesform inkluderer formuleringen et adjuvans.

Formuleringen i følge en utførelsesform av oppfinnelsen kan videre inkludere en bakteriekomponent. Formuleringen kan alternativt, eller i tillegg, inkludere en medikamentenhet. Formuleringen kan også inkludere en biologisk forbindelse.

Formuleringen i følge oppfinnelsen kan være i en form for oral immunisering.

Videre tilveiebringes det en stamme av Bifidobakterium i følge oppfinnelsen eller en formulering derav for anvendelse i matprodukter.

I følge en annen utførelsesform tilveiebringes en av Bifidobakterium i følge oppfinnelsen eller en formulering derav for anvendelse som et medikament.

Stammen eller formuleringen i følge oppfinnelsen kan være for anvendelse i profylaksen og/eller behandlingen av uønsket inflammatorisk aktivitet.

Stammen eller formuleringen i følge oppfinnelsen kan være for anvendelse i profylaksen og/eller behandlingen av uønsket gastrointestinal inflammatorisk aktivitet så som inflammatorisk tarmsykdom, f. eks. Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt, irritabelt tarmsyndrom, pouchitis eller etterinfeksjonskolitt.

Den uønskede inflammatoriske aktiviteten kan skyldes kreft. Følgelig tilveiebringes en stammen eller formuleringen i følge oppfinnelsen for anvendelse ved profylaksen og/eller behandlingen av gastrointestinal kreft.

I følge en utførelsesform anvendes stammen eller formuleringen i følge oppfinnelsen i profylaksen av kreft. Videre kan stammen eller formuleringen i følge oppfinnelsen også benyttes i profylaksen og/eller behandlingen av systemisk sykdom så som reumatoid artritt.

I følge enda en utførelsesform anvendes stammen eller formuleringen i følge oppfinnelsen ved profylaksen og/eller behandlingen av autoimmune sykdommer som skyldes uønsket inflammatorisk aktivitet.

I følge enda en utførelsesform anvendes stammen eller formuleringen i følge oppfinnelsen ved profylaksen og/eller behandlingen av kreft som en følge av uønsket inflammatorisk aktivitet.

I følge enda en utførelsesform anvendes stammen eller formuleringen i følge oppfinnelsen ved profylaksen og/eller behandlingen av diarésykdom som skyldes uønsket inflammatorisk aktivitet, så som Clostridium difficile-assosiert diaré, Rotavirus-assosiert diaré eller postinfeksiøs diaré.

Kort beskrivelse av tegningene

I de vedlagte tegningene er:

Figur 1 en graf av cfu/ml versus tid for Bifidobakterium longum infantis-stamme 35612 som beskrevet i eksempel 2; Figur 2 en graf av cfu/ml versus tid for Bifidobakterium longum infantis-stamme 35624 som beskrevet i eksempel 2; Figur 3 en graf av prosent vektendring versus tid (dager) for fem SCID-mus (1-5) administrert stamme UCC 35624 som beskrevet i eksempel 5; Figur 4 en graf over gjennomsnittlig prosent vektendring versus tid (dager) for SCID-musene (1-5) administrert stamme UCC 35624 som beskrevet i eksempel 5; Figur 5 en graf over prosent vektendring versus tid (dager) for mus (6-10) administrert en kombinasjon av stamme Lactobacillus salivarius UCC 118 og UCC 35624 som beskrevet i eksempel 5; Figur 6 en graf over gjennomsnittlig prosent vektendring versus tid (dager) for mus (6-10) administrert en kombinasjon av stammer UCC 118 og UCC 35624 som beskrevet i eksempel 5; Figur 7 en graf over prosent vektendring versus tid (dager) for mus (11-15) administrert en kombinasjon av stammer UCC 118 og UCC 35624 som beskrevet i eksempel 5; Figur 8 en graf over gjennomsnittlig prosent vektendring versus tid (dager) for mus (11-15) administrert en kombinasjon av stammer UCC 118 og UCC 35624 som beskrevet i eksempel 5; Figur 9 et stolpediagram av TNFa-nivåer i en pasient og kontrollprøver i nærværet av PBMCer og Bifidobakterium longum infantis som beskrevet i eksempel 7; Figur 10 et stolpediagram som viser TNFa- og IL-8-nivåer co-kulturer av epitelceller, PBMCer og Bifidobakterium longum infantis som beskrevet i eksempel 7. Kontroller representerer kokulturer av epitelceller og PBMCer alene. Figur 11 er et stolpediagram av perifere blodcytokinnivåer etter konsumering av Bifidobakterium longum infantis av friske humane frivillige (n = 18) i tre uker som beskrevet i eksempel 8; Figur 12 er stolpediagrammer over serumnivåer av TNFa og IL-IRA etter konsumering av Bifidobakterium longum infantis i friske humane frivillige (n = 18) som beskrevet i eksempel 8; Figur 13 er et stolpediagram av TNFa-nivåer i cellefri oppbrukt dyrkningssupernatant fra Bifidobakterium longum infantis og en MRS-kontroll som beskrevet i eksempel 9; Figur 14 er en diagramrepresentasjon av en SCID-mus sin nedre tarm etter behandling med Bifidobakterium longum infantis; og Figur 15 er en diagramrepresentasjon av den lavere tarmen i en ubehandlet SCID-mus.

Vi har isolert stammer av probiotiske bakterier som er i stand til, på en fordelaktig måte, å modifisere og derved lindre observerbare symptomer i inflammasjonssykdommer. Disse stammene, og formuleringene som er fremstilt, kan bli benyttet i ulike matvarer og medikamenter for å bekjempe effekten av inflammatoriske sykdommer.

In vivo- og in vz7ro-studier ble utført ved å benytte de probiotiske bakteriestammene. Det ble funnet at mennesker som ble matet med yoghurt som inneholdt Bifidobakterium longum infantis UCC35624 viste markert reduksjon i sine systemiske nivåer av 1L-8. Denne stammen kan derfor ha potensiell anvendelse i behandlingen av et spekter av inflammatoriske sykdommer, spesielt dersom den benyttes i kombinasjon med nåværende antiinflammatoriske terapier, så som ikke-steroid antiinflammatoriske medikamenter (NSAID'er) eller Infliximab.

Konsumeringen av Bifidobakterium longum infantis av SCID-mus ble også studert. Mens dette eksperimentet signifikant svekket inflammatorisk aktivitet, forble avføringen hos mus som konsumerte Bifidobakterium longum infantis fast, mens kontrollmus led av diaré. Denne antidiaréeffekten kan tilskrives den antiinflammatoriske aktiviteten i den foreliggende oppfinnelsen, muligens mediert via cAMP-modulering.

Det er ikke kjent hvorvidt intakte bakterier er nødvendige for å utøve en antiinflammatorisk effekt, eller om individuelle aktive komponenter i den foreliggende oppfinnelsen kan bli benyttet alene. Proinflammatoriske komponenter av visse bakteriestammer har blitt identifisert. De proinflammatoriske effektene til Gram-negative bakterier blir utøvet av lipopolysakkarid (LPS). LPS alene induserer et proinflammatorisk nettverk, delvis som en følge av LPS-binding til CD 14-reseptoren på monocytter. Det er antatt at komponentene i probiotiske bakterier viser antiinflammatorisk aktivitet som en følge av effektene av de hele cellene. Ved isolering av disse komponentene antas en farmasøytisk kvalitets manipulering.

Den generelle anvendelsen av Bifidobakterium longum infantis UCC35624 er i formen av levedyktige celler. Imidlertid kan den også bli utvidet til ikke-levedyktige celler, så som drepte kulturer eller sammensetninger som inneholder fordelaktige faktorer uttrykt av Bifidobakterium longum infantis UCC35624. Dette kan inkludere termisk drepte mikroorganismer eller mikroorganismer drept ved eksponering for endret pH eller utsatt for trykk. Med ikke-levedyktige celler er produktfremstillingen enklere, celler kan enkelt bli inkorporert i farmasøytiske midler og lagringskravene er mye mindre begrenset enn for levedyktige celler. Lactobacillus casei YIT 9018 er et eksempel på den effektive anvendelsen av varmedrepte celler som en fremgangsmåte for behandlingen og/eller hindringen av tumorvekst som beskrevet i US patent nr. US4347240.

Oppfinnelsen vil nå tydeligere bli forstått fra de følgende eksemplene.

Eksempel 1

Isolering av probiotiske bakterier

Blindtarmer og snitt i tykk- og tynntarm i den humane G.I.T., oppnådd under gjenoppbyggende kirurgi, ble screenet for probiotiske bakteriestammer som vist i tabell 1.

Alle prøvene ble lagret umiddelbart etter kirurgi ved -80°C i sterile beholdere. Frossent vev ble tint, veid og plassert i cysteinert (0,05%) en fjerdedels styrke Ringers løsning. Hver prøve ble ristet forsiktig for å fjerne løselig adherte mikroorganismer (betegnet - vask "W"). Etter overføring til et andre volum med Ringers løsning ble prøvene virvlet (vortexed) i 7 minutter for å fjerne godt adherte bakterier (betegnet - prøve "S"). For å isolere vevsinnkapslede bakterier, ble prøver A, B og C også homogenisert i en Braun-blander (betegnet - homogenat "H"). Løsningene ble serielt fortynnet (fortynning 10"' fra en vaskeprøve ble merket Wl, fortynning 10" ble merket W2 og prøvemerkingssystemet ble benyttet for "S" og "H"-prøvene) og smurt utover en plate (spread-plated) (100 |il) på de følgende agarmediene: RCM (forsterket clostridiamedium) og RCM juster til pH 5,5 ved å benytte eddiksyre; TPY (trypticase, pepton og gjærekstrakt), Chevalier, P. et al.

(1990) J. Appl. Bacteriol 68, 619-624). MRS (deMann, Rogosa og Sharpe); ROG (acetatmedium (SL) av Rogosa); LLA (leverlaktoseagar av Lapiere); BH1 (hjernehjerteinfusjonsagar); LBS (Lactobacillus selektiv agar) og TSAYE (trypton soyaagar supplert med 0,6% gjærekstrakt). Alle agarmedier ble skaffet tilveie av Oxoid Chemicals med unntak av TPY-agar. Plater ble innkubert i anaerobe krukker (BBL, Oxoid) ved å benytte C02-genererende sett (Anaerocult A, Merck) i 2-5 dager ved 37°C.

Gram-positive, catalasenegative stavformede eller todelte/pleomorfe bakterieisolater ble streket for renhet på komplekst ikke-selektivt medium (TPY). Isolater ble rutinemessig dyrket i TPY-medium, med mindre annet er sagt, ved 37°C under anaerobe betingelser. Presumptive Bifidobakteriearter ble samlet i 40% glyserol og lagret ved -20°C og -80°C.

Fermenteringssluttproduktanalyse

Metabolisme av karbohydratglukosen og de påfølgende organiske syresluttproduktene ble studert ved å benytte en LKB Bromma, Aminex HPX-87H High Performance Liquid Chromatography (HPLC) kolonne. Kolonnen ble opprettholdet ved 60°C med en strømningshastighet på 0,6 ml/min (konstant trykk). HPLC-bufferen som ble benyttet var 0,01 N H2SO4. Før analyse ble kolonnen kalibrert ved å benytte 10 mM citrat, 10 mM glukose, 20 mM laktat og 10 mM acetat som standarder. Kulturer ble dyrket i modifisert MRS næringsmedium i 1-2 dager ved 37°C anaerobt. Etter sentrifugering i 10 minutter ved 14000 g ble supernatanten fortynnet 1:5 med HPLC-buffer og 200 fil ble analysert i HPLC. Alle supernatanter ble analysert i duplikat.

Biokjemisk og fysiologisk karakterisering

Biokjemiske og fysiologiske egenskaper til bakteriei sol åtene ble bestemt for å hjelpe til med identifisering. Nitratreduksjon, indoldannelse og ekspresjon av (3-galaktosidaseaktivitet ble studert. Vekst ved både 15°C og 45 °C og proteaseaktivitet på gelatin ble bestemt. Vekstkarakteristika til stammene i lakmusmelk ble også vurdert.

Antibiotikasensitivitetsprofiler

Antibiotikasensitivitetsprofiler til isolatene ble bestemt ved å benytte "diskfølsomhets" assay. Kulturer ble dyrket i passende næringsmedium i 24-48 timer, smurt ut (100 \ x\) på agarmedium og disker som inneholdt kjente konsentrasjoner av antibiotikaene ble plassert på agaren. Stammer ble studert for antibiotikasensitivitet etter 1-2 dagers innkubering ved 37°C under anaerobe betingelser. Stammer ble vurdert sensitive dersom inhibisjonssoner på 1 mm eller mer ble observert.

Isolering av Bifidobacteria sp.

Syv vevssnitt tatt fra human G.I.T. ble screenet for nærværet av stammer som tilhører Bifidobakterium-slekten. Det var noe variasjon mellom vevsprøvene som følger. Prøver A (mellomtarm) og E (blindtarm) hadde de laveste tellingene med omkring 10 celler isolert per gram vev. Til sammenligning ble mer enn 10J cfu/g vev gjenvunnet fra de andre prøvene. Tilsvarende antall bakterier ble isolert i løpet av "vask" og "prøve"-trinnene med litt høyere tellinger i "prøve"-løsninger av F (mellomtarm) og G (ileal-caecal). Av de som ble screenet for tett vedheftede bakterier (homogenisert) var C (ileal-caecal) det eneste vevssnittet som ga signifikante tellinger.

I løpet av screeningen av noen vevssnitt, for eksempel C og B, var det ingen direkte sammenheng mellom tellinger oppnådd under en fortynningsserie. Dette indikerer at noen vekstfaktorer, enten blod- eller vevsavledede, ble tilveiebrakt for veksten av de kresne bakteriene i den initielle suspensjonen, som deretter ble fortynnet ut.

Stammeseleksjon og karakterisering

Omkring 1500 katalasenegative bakterieisolater fra forskjellige prøver ble valgt og karakterisert i form av sin Gram-reaksjon, cellestørrelse og morfologi, vekst ved 15 °C og 45°C og fermenteringsendeprodukter fra glukose. Mer enn 60% av isolatene som ble testet var Gram-positive, homofermentative cocci arrangert enten som tråder, kjeder eller bunter. 18% av isolatene var Gram-negative staver og heterofermentative coccobacilli.

De gjenværende isolatene (22%) var hovedsakelig homofermentative coccobacilli. 38 stammer ble karakterisert i mer detalj - 13 isolater fra G; 4 fra F; 8 fra D; 9 fra C; 3 fra B og 1 fra E. Alle 38 isolatene testet negativt både for nitratreduksjon og produksjon av indol fra tryptofan.

Antibiotikasensitivitetsprofiler

Antibiotika av human klinisk viktighet ble benyttet for å fastslå sensitivitetsprofiler av valgte bifidobakterier. Bifidobakteriene som ble testet var sensitive for ampicillin, amoxycillin, ceftaxim, ceftriaxon, ciprofloxacin, cephradin, rifampicin, amikacin, gentamicin, kloramfenikol. De var også motstandsdyktige mot netilmicin, trimetoprim, nalidixinsyre, cefuroxim, vancomycin og tetracyklin.

Eksempel 2

Svreresistens

Den første linjen av vertsforsvar som en mikroorganisme når etter humant inntak er magesyre i magesekken. En nøkkelfaktor som influerer på bakterier er overlevelse i magesaft. Overlevelsen og vekst av Bifidobakterium longum infantis-stammer 35612 og 35624 i et lavt pH-miljø ble studert. Stammene ble rutinemessig dyrket i trypticase-pepton-gjærekstrakt (TPY) medium ved 37°C under strenge anaerobe betingelser (BBL gasskrukker ved å benytte Merck Anaerocult A gasspakkesystemet) i 12-24 timer. Human magesaft ble oppnådd fra friske subjekter ved aspirering gjennom et nesegastrisk rør (Mercy Hospital, Cork, Irland). Det ble umiddelbart sentrifugert ved 13000 g i 30 minutter for å fjerne alle faste partikler, sterilisert gjennom 0,45 Jim filtre og 0,2 jxm filtre og lagret ved 4°C. pH og pepsinaktivitet ble målt før eksperimentanvendelse. Pepsinaktivitet ble målt ved å benytte kvantitativt hemoglobinassay (Guantam, S. og R.S. da la Motte. 1989. Proteolytic enzymes, a practical approach. Kapittel 3. R.J. Beynon og J.S. Bond (red.), IRL Press, Oxford University Press; Dawson, R.M. 1969. pH and buffers. I Data for Biochemical Research side 138. R.M. Dawson, D.C. Elliot og K.M. Jones (red.), Clarendon Press, Oxford). Overlevelse av stammene ved lav pH in vitro ble studert ved å benytte de følgende prøver: (a) Celler ble høstet fra friske overnatten-kulturer, vasket to ganger i fosfatbuffer (pH 6,5) og resuspendert i MRS næringsmedium justert til pH 3,5, 3,0, 2,5 og 2,0 (med 1 N HC1) til en sluttkonsentrasjon på omkring IO<6> cfu/ml. Cellene ble innkubert ved 37°C og overlevelse målt ved intervaller på 5, 30, 60 og 120 minutter ved å benytte platetellingsmetoden.

Stammene overlevde uten tap av levedyktighet ved pH 3,5. Ved pH 2,5 var det en 3 log reduksjon i løpet av 60 minutters innkuberingsperiode som avtegnet i figurene 1 og 2.

Overlevelse av stammer av Bifidobakterium i human magesaft

Friske overnattkulturer ble høstet, vasket to ganger i buffer (pH 6,5) og resuspendert i human magesaft til en sluttkonsentrasjon på IO<6> cfu/ml. Overlevelse ble målt over en 30-60 minutters innkuberingsperiode ved 37°C. Eksperimentet ble utført ved å benytte magesaft ved pH 1,2 (ujustert) og pH 2,0 og 2,5 (justert ved å benytte 1 N NaOH).

Overlevelse av stammene ble økt i magesaft ved pH 2,0 sammenlignet ved magesaft ved pH 1,2. Etter 30 minutters innkubering ble ingen levedyktige celler gjenvunnet ved noen pH, som vist i tabell 2.

Eksempel 3

Galleresistens

I evalueringen av effektiviteten av å benytte melkesyrebakterier som fordelaktige medlemmer av den gastrointestinale traktus, blir det antatt at motstandsdyktig-heten mot gallesyrer er en viktig biologisk stammekarakteristikk som kreves for overlevelse i det fiendtlige miljøet, og i tillegg må de ikke gjøre inngrep på helsen til verten ved å produsere toksiske forbindelser så som deoksykolin (DCA) og litokolinsyre (LCA) som har vært involvert i et antall av cytotoksiske fenomener.

Et antall med Bifidobakterium longum infantis-stammer ble streket ut på TPY agarplater supplert med svinegalle (B-8631, Sigma Chemical Co. Ltd., Poole) ved konsentrasjoner på 0,3, 0,5, 1,0, 1,5, 5,0 og 7,5% (vekt/volum) (Legrand-Defretin, R. et al., Lipids 1991; 26(8), 578-583). Svinegalle er den nærmeste i sammenligning til human galle med hensyn til gallesalt/kolesterol og fosfolipid/kolesterolforhold. Plater ble innkubert ved 37°C under anaerobe betingelser og vekst ble målt etter 24-48 timer. Stamme 35624 ble funnet å være sterkt galleresistent og vokste til konfluens ved opp til 55 svinegalle som vist i tabell 3.

Human galle ble oppnådd fra flere humane galleblærer og sterilisert ved 80°C i 10 minutter. Gallesyresammensetningen i human galle ble bestemt ved å benytte revers fase High Performance Liquid Chromatography (HPLC) i kombinasjon med en pulset amperemetrisk detektor i henhold til metoden til Dekker, R.R. et al., Chromatographia, 1991, 31 (11/12), 255-256. Human galle ble tilsatt ved en konsentrasjon på 0,3% (volum/volum). Nylig utstrekede kulturer ble studert for vekst etter 24 og 48 timer.

Stamme 35624 var i stand til å vokse i nærværet av fysiologisk relevant human galle (0,3% (volum/volum)).

Vekst av stammene ble studert i nærværet av individuelt konjugerte og dekonjugerte gallesyrer. Under fysiologiske betingelser er gallesyrer ofte å finne som natriumsalter. Stammene ble screenet for vekst på TPY-agar som inneholdt de konjugerte og dekonjugerte natriumsaltene til hver av de følgende gallesyrene.

(a) konjugert form: Glykolinsyre (GCA); glykodoksykolinsyre (GDCA); og

glykohendodeoksykolinsyre (GCDCA); (b) dekonjugertform: Litokolinsyre (LCA); chenodeoksykolinsyre (CDCA);

deoksykolinsyre (DCA) og kolinsyre (CA). For hver gallesyre ble konsentrasjoner på 1, 3 og 4 mM benyttet. Vekst ble målt etter 24 og 48 timer med anaerob inkubasjon.

De fem stammene som ble studert vokste på agarmedium supplert med 5 mM GCA og GCDCA og på agarmedium supplert med 1 mM GDCA som vist i tabell 4. Stamme 35624 var motstandsdyktig mot konsentrasjoner på 5 mM LCA (data ikke vist) og stammer 35612 og 35624 var i stand til å vokse ved konsentrasjoner på 5 mM CA som vist i tabell 5. Ingen vekst ble observert nærværet av 1 mM CDCA (data ikke vist).

GCDCA, glykochenodeoksykolinsyre; GDCA, glykodeokaykolinsyre; CGA, glykokolinsyre.

Eksempel 4

Antimikrobiell aktivitet

Bifidobakteriumarter viser inhibitorisk effekter på andre bakterier ved å ekskludere langtids kolonisering ved invasiv patogenese. Deres antagonistiske aktivitet skyldes produksjonen av eddik- og melkesyre gjennom fermentering (Scardovi, V. (1986) Bifidobakterium in Bergey's Manua of systemic bacteriology, Vol. 2, Red. Scheath, P.H., Main, N.S., Sharpe, M. og Holdt, J.G., Williams og Wilkins Publishers, Baltimore M.D., side 1418). Svært få rapporter eksistere om produksjonen av antimikrobielle forbindelser bortsett fra syrer (Anand, S.K. et al., Cult. Dairy Prods. 1985; J. 2, 21-23). Bakteriociner og andre forbindelser kan influere på overlevelsen til en bakterie i en økologisk nisje, og tillate dem effektivt å dominere fermenteringsøkosystemer. Et slikt trekk er en god egenskap for en probiotisk stamme.

Inhibisjonsspektra til ulike bifidobakterielle stammer ble bestemt ved metoden til Tagg et al. (Tagg, J.R. et al., Bacteriol. Rev. 1976; 40, 722-756). Cellefrie supernatant ble testet for inhibitorisk aktivitet mot en bredt spekter av Gram-positive og Gram-negative mikroorganismer. Belegg (overlays) av hver indikator ble fremstilt på agarplater og tillatt å tørke. Flekker (5 ml) med cellefri supernatant ble plassert på de sådde platene, tillatt å tørke og platene ble innkubert over natten.

Det ble observert at stammer var inhibitoriske mot et bredt spekter av Staphylococcus, Pseudomonas, Coliform og Bacillus sp. når de ble testet på TPY-medium. Inhibisjonssoner på opptil 4,4 mm ble målt mot Pseudomonas og Staphylococcus, og opptil 7,0 mm rundt Bacillus sp. som vist i tabell 6 og 7. Imidlertid, når den utsatte prøven ble utført på bufret TPY-medium, ble inhibisjonssoner ikke observert mot noen indikatorstamme. Derfor synes inhibisjon å være en følge av nærværet av syre produsert av bifidobakteriene.

Eksempel 5

Murint mateforsøk for å studere evnen til Lactobacillus salivarius underart Salivarius UCC 118 og Bifidobacteria longum infantis 35624 har til å lindre symptomene på inflammatorisk tarmsykdom (IBD)

Bakgrunn

Et antall musemodeller har nylig blitt generert enten ved genetiske eller ved immunologiske metoder for å studere mekanismene ved IBD. En av disse modellene involverer overføring av milt eller lymfeknuteavledede CD4<+>T-lymfocytter fra normale mus inn i alvorlig kombinerte immunutilstrekkelige mottakende mus (SCID). Det har vært vist at mus som mottar renset CD4<+>, CD45RB<høy>T-celler utvikler en ødeleggende sykdom karakterisert ved kronisk tarminflammasjon som er mer alvorlig i tykktarmen. I dette studiet ble en kontrollgruppe med SCID-mus injisert med CD4<+> CD45RB<høy> og musene utviklet en progressiv ødeleggende sykdom, lutet overhyppighet, piloereksjon av pelsen, diaré, vekttap og makro- og mikroskopisk tykktarmskade. Et foringsforsøk ble satt opp som administrerte UCC 118 og stamme 35624 (også referert til heri som UCC 35624) for å bestemme hvorvidt symptomene på IBD kunne bli modifisert i denne modellen.

Bakteriestammer

Lactobacillus salivarius underart Salivarius UCC 118 og Bifidobakterium longum infantis UCC 35624 ble isolert fra den ileal-caecale regionen til et voksent menneske som beskrevet i eksempel 1.1 dette eksempelet ble spontan rifampicin og streptomycinresistente derivater av stammene generert ved å plate ut på celler, som på forhånd var dyrket over natten og deretter vasket i en kvart streng Ringers løsning på MRS og TPY-agar som inneholdt 50 (J.g/ml rifampicin (Sigma) henholdsvis og MRS som inneholdt 400 fig/ml streptomycin (Sigma). Platene ble innkubert i 2 dager ved 37°C anaerobt. De resulterende antibiotikaresistente derivatene ble bestemt til på annen måte fenotypisk å være lignende til forelderstammen. Denne selekterbare egenskapen gjorde det mulig at stammene enkelt ble telt opp etter passasje gjennom tarmen.

Dyr og opprettholdelse

Donormus (C57BL/6 x BALB/c) Fl ble kjøpt fra Simosen Laboratories (Gilroy, CA) og oppbevart ved Universitetet i California - Los Angeles dyrehage i ventilerte burstativ (Thoren bursystemer, Hazelton, PA) under spesifikke patogenfrie (SPF) betingelser. CB-17 SCID-mus ble formert i ventilerte burstativer opprinnelig tilveiebrakt fra Universitetet i California - Los Angeles SCID kjernefasilitet. Musene var redusert flora (RF) mus heller enn bakteriefrie, og fungerte som mottakermus (ArandaR. et al., J. of Immunol. 1997; 158(7), 3464-3473).

Åtte uker gamle hunn CB-17 (SCID) mus ble oppbevart i par i filtertoppbur i ventilerte stativ. Musene ble delt i fire grupper. Gruppe A: Konsumerte 10% skummet melk, kontroll; gruppe B: Konsumerte Lactobacillus salivarius UCC 118, gruppe C konsumerte Lactobacillus salivarius UCC 118 og Bifidobakterium longum UCC 35624 9 (1:1 forhold); gruppe D: Konsumerte Bifidobakterium longum UCC 35624. UCC 118 og UCC 35624, som var dyrket over natten i henholdsvis MRS-næringsmedium og MRS-næringsmedium supplert med 0,05% cystein (Sigma), ble vasket i PBS, resuspendert i skummet melk (10% (volum/volum)) og administrert i det ellers sterile drikkevannet (PBS). Musene i hver respektive gruppe mottok 2,55 x 10<8> cfu/ml med UCC 118 og 2,35 x IO<8> cfu/ml med UCC 35624 daglig i løpet av foringsperioden. Kontrollmus mottok steril melk fortynnet i steril fosfatbufret saltløsning (PBS) og ble oppbevart under identiske betingelser som testgruppen.

Eksperimentdesign

Alle CB-17-musene ble administrert sine respektive for i henhold til deres gruppering, i 2 dager før injeksjon med CD4<+> CD45RB<høy->cellene. De sorterte donorlymfocyttene (3-4 x 10<5>) ble resuspendert i 200 \\\ med steril PBS og injisert i.p. inn i mottakende CB-17 SCID-musene. Alle musene ble veid ved igangsetting, deretter to ganger i uken. De ble observert for kliniske tegn på sykdom: Lutet overhyppighet, piloereksjon av pelsen og diaré.

Evaluering av effektene av de administrerte probiotika på antallet av medfødte bakterier som er dyrkbare fra museavføring

Influeringen utøvet ved de administrerte UCC 118 og UCC 35624, som enten ble administrert alene eller i kombinasjon med hverandre, på mikrofloraen til den CB-17 SCID-murine tarmen ble studert. Avføringsprøver ble samlet fra hver mus ukentlig, veid og resuspendert i 10 ml PBS. Prøvene ble deretter serielt fortynnet i PBS og enten støpeplatet eller spredt ut på plater i passende fortynninger på passende media i duplikat. De følgende bakteriegruppene ble telt opp: Lactobacilli; bifidobakterier; enterococcer, bakteroider og coliformer. De selektive mediene som ble benyttet var: de Mann Rogosa & Sharpe (MRS) agar; MRS agar supplert med 0,2% litiumklorid (BDH), 0,3% natriumpropionat (Fluke kjemi), 0,5% cysteinhydroklorid (Sigma) og 5% saueblod. Slanetz og Bartley agar; Wilkins og Chalgren agar supplementert med anaerobt supplement SR 108 og 5% hesteblod; og fiolett rød galleagar. (Alt oksoid med mindre annet er angitt). VRBA- og Slanetz-og Bartley-platene ble innkubert aerobt i henholdsvis 24 og 45 timer. Alle andre plater ble innkubert anaerobt i 48 timer ved 37°C.

Opptelling av dyrkbar medfødt flora fra spesifikke segmenter av den CB- 18 SCID-murine G. I. T.

Etter matingsperiodene ble alle musene ofret og dissekert. Segmenter av ileal-caecal-regionen, tynntarmen og tykktarmen ble fjernet. En perifer lymfeknute (PLN), mesentreisk lymfeknute (MLN) og et stykke av milten ble også tatt. Alle vevene ble veid før de ble resuspendert i 10 ml med PBS. Prøvene ble deretter homogenisert og serielt fortynnet i PBS og enten spredt utover plater eller støpt i plater ved passende fortynninger på passende medier i duplikat. Bakteriegruppene ble spesifisert tilsvarende de som ble spesifisert i avføringsanalysen, og prøver ble innkubert som beskrevet tidligere.

Preparering av intraepiteliale og lamiinaproprialymfocytter

Isoleringen av slimhinnelymfocytter ble utført i henhold til metoden til Aranda, R. et al ((1997) supra).

Flow- cytometrisk analyse av lymfocyttpopulasioner

Analysen ble utført som beskrevet av Aranda, R. et al. ((1997) supra).

Preparering av vev for histopatologiske analyse

Vevsprøver ble tatt fra tynntarm, tykktarm og ileal-caecal region og fiksert i 10% formalin. Prosedyren var som beskrevet i Aranda, R. et al. ((1997) supra).

Det ble observert fra eksperimentene som ble utført at, i overensstemmelse med tidligere resultater, utviklet SCID-musene rekonstituert med CD4<+> CD45RB<høy>T-lymfocytter, og som konsumerte skummet melk alene (kontroll) en progressiv ødeleggende sykdom, identifisert ved deres signifikante vekttap. Sykdommen ble åpenbar ved omkring 2,5-3 uker, og de syke musene manifesterte på en karakteristisk måte et lutet utseende, piloereksjon av pelsen og løs avføring. En av musene i kontrollgruppen (mus 4) døde etter 25 dager, og mus 1, 2, 3 og 5 viste henholdsvis -20%, 25%, 21% og -35% vektendring som avtegnet i figurene 3 og 4.

CB-17 SCID-mus som konsumerte UCC 118 alene ga et lignende resultat som kontrollene med det karakteristiske vekttapet. Mus 3 døde etter 14 dager, og mus 4, 5 og 6 viste henholdsvis -15%, -25% og -28% vektendring (data ikke vist). Musene som konsumerte en kombinasjon av UCC 118 og UCC 35624 ble funnet å ha en markert forbedring på kontrollmusen. Disse musene tapte ikke så mye vekt som kontrollmusene i løpet av foringsperioden. Selv etter 35 dager viste tre av musene i denne gruppen små prosentvise vektendringer (figurene 5 og 6). To av musene i denne gruppen viste et vekttap kun etter omkring 30 dager, mens kontrollmusene viste vekttap etter 14 dager (figurene 3 og 4).

Mus som konsumerte UCC 35624 alene synes å være ved god helse og igjen var vekttapet, når dette ble sammenlignet med kontrollene, vesentlig mindre (figurene 7 og 8). Det kan derfor konkluderes med at konsumering av UCC 35624 enten alene eller i kombinasjon med UCC 118 lindrer symptomene på inflammatorisk tarmsykdom.

Tabell 8 er en oppsummering av eksperimentdata for studiet med behandling av CD45RB kolittindusert CB-17 og SCID-mus med en blanding av UCC 118 og UCC 35624.

Det ble funnet i studiene at musene med suksess ble rekonstituert med lymfocytter og lymfocytter som hadde blitt avledet fra donormodellen (data ikke vist).

Eksempel 7

In v/fr-ø-studier for å studere immunpersepsjonen av Bifidobakterium longum infantis

Over natten vaskede kulturer av bifidobakterier ble innkubert med humane perifere blodmononukleære celler (PBMCer) fra både friske frivillige (n = 9) og pasienter som lider av inflammatorisk tarmsykdom (n = 5). Produksjon av den proinflammatoriske cytokin tumor nekrosefaktoren a (TNFa) ble målt ved ELISA i 72 timers dyrkningssupernatanter. Co-innkubering av Bifidobakterium longum infantis med humane PBMCer førte ikke til stimuleringen av TNFa-produksjon (figur 9). Således induserer eksponering av det systemiske immunsystemet for denne bakterien en inflammatorisk respons.

For å vurdere immunpersepsjonen av Bifidobakterium longum infantis ved slimhinneoverflater, ble co-dyrking av epitelceller og PBMCer utført i transbrønnkamre. I korthet ble et epitelcellemonolag dyrket i det øvre kammeret og PBMCer ble innkubert i den lavere delen. Disse ble separert fra hverandre ved hjelp av en porøs membran som tillot passasjen av løselige mediatorer mellom de to avdelingene, men tillot ikke celle-celle-kontakt. Ved å benytte denne modellen ble produksjonen av TNFa og interleukin-8 (IL-8) målt i nærværet og fraværet av Bifidobakterium longum infantis i PBMC-delen. Co-kulturer av epitelceller, PBMCer og Bifidobakterium longum infantis resulterte i signifikant undertrykking av TNFa- og IL-8-produksjon (figur 10). Således resulterer et tre-cellulært nettverk som involverer epitelceller, PBMCer og Bifidobakterium longum infantis i undertrykking av proinflammatorisk cytokinproduksjon.

Eksempel 8

In vivo antiinflammatorisk aktivitet av Bifidobakterium longum infantis Bifidobakterium longum infantis (1 x IO<9> celler per dag) ble konsumert av 18 friske mennesker i et fermentert melkeprodukt (yoghurt) i tre uker. Serum ble samlet for cytokinanalyse før og etter konsumering av denne probiotiske stammen. Avføringsprøver ble oppnådd for mikrobiologisk analyse.

Vesentlig modifikasjon av perifere blodcytokinnivåer ble observert i dette matingsstudiet. Serumløselig interleukin-6-reseptor (sIL-6R, p = 0,007), interferon-y (IFNy, p = 0,041) og IL-8 (p = 0,004) nivåer ble signifikant redusert etter konsumering av denne probiotiske stammen (figur 11). Ingen endring i serum TNFa og interleukin-l-reseptorantagonist (IL-IRA) nivåer ble observert (figur 12). Bifidobakterium longum infantis ble påvist ved omkring 1 x 10<5> kolonidannende enheter per gram med avføringsmateriale i løpet av forløpet av dette matingsstudiet. Målrettede in vitro seleksjonskriterier som reflekterer de komplekse interaksjonene med GT-miljøet tillater identifiseringen av probiotiske stammer som er i stand til å fungere effektivt når de reintroduseres inn i det miljøet. Ved å benytte seleksjonskriteriene som er skissert over, har de probiotiske bakteriene Bifidobakterium longum infantis påviselige immunmodulerende egenskaper in vitro. Etter konsumering av SCID-mus og humane frivillige, ble signifikant modifikasjon av systemiske immunparametere merket. Således er anvendelsen av Bifidobakterium longum infantis som et bioterapeutisk middel i behandlingen av immunmedierte sykdommer berettiget.

Eksempel 9

Målinger av TNFa i Bifidobakterium longum infantis UCC 35624 cellefri supernatant

Over natten-kulturer av Bifidobakterium longum infantis ble sentrifugert og den cellefrie dyrkningssupernatanten ble studert for nærværet av cytokininhibitorer. Cellefrie supernatanter ble innkubert med human TNFa i 20 minutter ved 37°C. TNFa-nivåer ble deretter kvantifisert ved hjelp av ELISA. Etter eksponering for bifidobakteriesupernatanten, var TNFa-nivåene signifikant redusert (figur 13). Således utskiller Bifidobakterium longum infantis UCC 35624 en faktor som antagoniserer TNFa-aktivitet. Produksjon av denne faktoren av Bifidobakterium longum infantis på overflaten av gastrointestinal traktus, in vivo, vil signifikant begrense vertens inflammasjonsrespons.

Dette indikerer at antagonisme av TNFa også finner sted på et molekylært nivå som en følge av løselige faktorer frigitt av UCC 335624.

Inflammasjon

Inflammasjon er begrepet som benyttes for å beskrive den lokale akkumuleringen av væske, plasmaproteiner og hvite blodceller på et sted som har opprettholdt fysisk skade, infeksjon eller der det er en pågående immunrespons. Kontroll av den inflammatoriske responsen blir utøvet på et antall nivåer (for gjennomgang se Henderson B., og Wilson M. 1998. i "Bacteria-Cytokine interactions in health and disease. Portland Press, 79-130). De kontrollerende faktorene inkluderer cytokiner, hormoner (for eksempel hydrokortison), prostaglandiner, reaktive intermediater og leukotriener. Cytokiner er lavmolekylvekts biologisk aktive proteiner som er involvert i genereringen og kontrollen av immunologisk og inflammatorisk respons, mens de også regulerer utvikling, vevsreparasjon og haematopoese. De tilveiebringer en metode for kommunikasjon mellom leukocytter selv, og også med andre celletyper. De fleste cytokinene er pleiotrofiske og uttrykker multiple biologiske overlappende aktiviteter. Cytokinkaskader og nettverk kontrollerer den inflammatoriske responsen heller enn virkningen av et spesielt cytokin på en spesiell celletype (Arai Kl, et al., Annu. Rev. Biochem 1990; 59: 783-836). Nedgang i den inflammatoriske responsen resulterer i lavere konsentrasjoner av de passende aktiveringssignalene og andre inflammatoriske mediatorer som fører til opphør av den inflammatoriske responsen. TNFa er et sentralt proinflammatorisk cytokin ettersom det initierer en kaskade av cytokiner og biologiske effekter som resulterer i den inflammatoriske tilstanden. Derfor blir midler som inhiberer TNFa i dag benyttet i behandlingen av inflammatoriske sykdommer, for eksempel lnfliximab.

Proinflammatoriske cytokiner er antatt å spille en viktig rolle i patogenesen av mange inflammatoriske sykdommer, inkludert inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Nåværende terapier for å behandle IBD er rettet mot å redusere nivåene av disse proinflammatoriske cytokinene, inkludert IL-8 og TNFa. Det er blitt foreslått at slike terapier også kan spille en signifikant rolle i behandlingen av systemiske inflammatoriske sykdommer så som reumatoid artritt. Mennesker som spiser yoghurt som inneholder Bifidobakterium longum infantis UCC 35624 har vist markert nedgang i sine systemiske nivåer av IL-8. Denne stammen kan derfor ha en mulig anvendelse i behandlingen av et spekter av inflammatoriske sykdommer, spesielt dersom den benyttes i kombinasjon med nåværende antiinflammatoriske terapier, så som ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter (NSAID'er) eller lnfliximab.

Diarésykdom

Barrierefunksjonen til tarmepitelen kan bli redusert under nervøs (acetylkolin) og immun (histamin) mediert sekresjon. Visse bakterietoksiner kan også indusere Ca2<+ >og PKC-avhengig sekresjon og derved kan de forstyrre den epiteliale barrieren (Ganguly NK og Kaur T. Indian J Med Res 1996; 104: 28-37, Groot JA. Vet Q 1998; 20(S3): 45-9). Flere studier har studert forhindringen og behandlingen av diaré ved å benytte probiotiske bakterier. Prospektive studier har vist effekten av melkesyreadministrering for både profylaktisk og terapeutisk anvendelse mot diaré i premature barn, nyfødte, barn (Isolauri E, et al., Dig Dis Sei 1994 Des; 39(12): 2595-600) og i behandlingen av antibiotikarelatert diaré (Siitonen S, et al., Ann Med 1990 Feb; 22(1): 57-9) og reisediaré (Oksanen PJ, et al., Ann Med 1990 Feb: 22(1): 53-6).

Vi har studert konsumeringen av Bifidobakterium longum infantis UCC 35624 av SCID-mus. Det ble funnet at inflammatorisk aktivitet ble signifikant svekket, og mus som konsumerte Bifidobakterium longum infantis UCC 35624 opprettholdt fast avføring mens kontrollmus led av diaré. Figurene 14 og 15 illustrerer den nedre tarmen av behandlede og ubehandlede SCID-mus. Den nedre tarmen som er vist inkluderer caecum 2, intestine 3 og anus 5.1 figur 14 ble musene behandlet med Bifidobakterium longum infantis UCC 35624, og det er åpenbart at fast avføring 4 har blitt tilbakeholdt i tarmen. Til sammenligning viser figur 15 ubehandlet musetarm 3, karakteristisk betent. Ingen vannabsorpsjon har funnet sted slik at ingen fast avføring blir tilbakeholdt, noe som resulterer i diaré.

Antidiaréeffekten observert kan muligens bli relatert til den antiinflammatoriske aktiviteten, muligens mediert via cAMP-modulering. Syklisk AMP-avhengig Cl-sekresjon er den viktigste sekresjon svei en i den humane tarmen (Brzuszczak IM, et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 1996; 11(9): 804-10). Det kan konkluderes med at antidiaréeffekten til Bifidobakterium longum infantis UCC 35624 ikke er begrenset kun til diaré som resulterer fra gastrointestinal inflammasjon, men kan bli anvendt for den generelle behandlingen av diarésykdom.

Autoimmun sykdom

Immunsystemet har et stort repertoar av spesifisiteter uttrykt av B- og T-celler. Noen av disse spesifisitetene vil være rettet mot selvkomponenter. Selvgjenkjenning er normalt kontrollert av klonal delesjon og inaktivering av selvreaktive lymfocytter. Imidlertid er det en konstant bakgrunn av autoimmunitet der antistoffer til mange proteiner blir funnet i serum. En nedbryting i selv- ikkeselv-gjenkjenningssystemet resulterer i autoimmunitet. Når autoimmun sykdom finner sted, skader den resulterende immunresponsen vevet som bærer det skyldige antigenet. Immunkompleksavsetting, type II hypersensitivitet og cellemedierte reaksjoner er det vanligste mekanismene som immunpatologisk finner sted via. Eksempler på autoimmune sykdommer inkluderer, men er ikke begrenset til, systemisk lupus erytematosus, reumatoid artritt, insulinavhengig diabetes mellitus, myastenia gravis og pernicious anemi. Bifidobakterium longum infantis og Lactobacillus salivarius underart salivarius er immunmodulerende bakterier. Således kan konsumering, enten som enkeltkomponenter eller en kombinasjon av disse bakteriene i pasienter som lider av autoimmune sykdommer, begrense organskade og hjelpe til med å gjenopprette normal kroppshomeostase.

Inflammasjon og kreft

Produksjonen av multifunksjonelle cytokiner over et bredt spekter av tumortyper tyder på at signifikant inflammatorisk respons pågår i pasienter med kreft. Det er på det nåværende tidspunkt uklart hvilken beskyttende effekt denne responsen har mot vekst og utvikling av tumorceller in vivo. Imidlertid kan disse inflammatoriske responsene på en skadelig måte påvirke den tumorbærende verten. Komplekse cytokininteraksjoner er involvert i reguleringen av cytokinproduksjon og celleproliferasjon inne i tumorer og normalt vev (McGee DW, et al., Immunology 1995 Sept; 86(1): 6-11, Wu S, et al., Gynecol Oncol 1994 Apr; 53(1): 59-63). Det har lenge vært kje*nt at vekttap (cachexi) er den viktigste årsaken til død hos pasienter med kreft (Inagaki J, et al., Cancer 1974 Feb; 33(2): 568-73) og begynnende feilernæring indikerer en dårlig prognose (Van Eys J. Nutr Rev 1982 Des; 40(12): 353-9). For at en tumor skal vokse og spre seg må den indusere dannelsen av nye blodårer og degradere den ekstracellulære matriksen. Den inflammatoriske responsen kan ha signifikante roller å spille i ovennevnte mekanismer, og således bidra til svekkelse av verten og progresjon av tumoren. Som en følge av den antiinflammatoriske egenskapen til disse bakteriestammene kan de redusere hastigheten på ondartet celletransformasjon. Videre kan tarmbakterier produsere, fra diettforbindelser, substanser med genotoksiske-, carcinogene- og tumorfremmende aktiviteter, og tarmbakterier kan aktivere pro-carcinogener til DNA-reaktive midler (Rowland l.R. (1995). Toxicology of the colon: role of the intestinal microflora. I: Gibson G.R. (red.) Human colonic bacteria: role in nutrition, physiology and pathology, sidene 155-174. Boca Raton CRC Press). Generelt har arter av Bifidobacteria og Lactobacillus lave aktiviteter av xenobiotikametaboliserende enzymer sammenlignet med andre populasjoner inne i tarmen, så som bakterioder, eubakterier og clostridia (Saito Y., et al., Microb. Ecol. Health Dis., 1992; 5, 105-110). Derfor kan det å øke antallet melkesyrebakterier i tarmen på en fordelaktig måte modifisere nivåene av disse enzymene.

Prebiotika

Introduksjonen av probiotiske organismer blir oppnådd ved inntaket av mikroorganismene i en passende bærer. Det vil være fordelaktig å tilveiebringe et medium som vil fremme veksten av disse probiotiske stammene i tykktarmen. Tilsettingen av en eller flere oligosakkarider, polysakkarider eller andre prebiotika øker veksten av melkesyrebakterier i gastrointestinal traktus (Gibson, GR. Br. J. Nutr. 1998; 80(4): S209-12). Prebiotika refererer til en hvilken som helst ikke-levedyktig matkomponent som blir spesielt fermentert i tarmen av medfødte bakterier som antas å være av positiv verdi, for eksempel bidifidobakterier, lactobacilli. Typer av prebiotika kan inkludere de som inneholder fruktose, xylose, soya, galaktose, glukose og mannose. Den kombinerte administreringen av en probiotisk stamme med en eller flere prebiotiske forbindelser kan øke veksten av det administrerte probiotika in vivo og resultere i en mer uttalt helsefordel, og blir betegnet synbiotisk.

Andre aktive ingredienser

Det vil være åpenbart at Bifidobakterium kan bli administrert profylaktisk eller som en fremgangsmåte for behandling enten alene eller sammen med andre probiotika og/eller prebiotiske materialer som beskrevet over. I tillegg kan bakteriene bli benyttet som en del av en profylaktisk eller behandlingsregime som benytter andre aktive materialer så som de som blir benyttet for å behandle inflammasjon eller andre sykdommer, spesielt de i den gastrointestinale traktus. Slike kombinasjoner kan bli administrert i en enkelt formulering eller som separate formuleringer administrert ved det samme eller ved ulike tidspunkter, og ved å benytte de samme eller ulike administrasjonsveier.

Claims (29)

1. Stamme, karakterisert ved Bifidobakterium longum infantis UCC35624, eller mutant eller variant derav.

2. Stamme ifølge krav 1 karakterisert ved at mutanten er en genetisk modifisert mutant.

3. Stamme ifølge krav 1, karakterisert ved at varianten er en naturlig forekommende variant.

4. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at den er i form av levedyktige celler.

5. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at den er i form av ikke levedyktige celler.

6. Formulering, karakterisert ved at den omfatter en stamme ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5.

7. Formulering ifølge krav 6, karakterisert ved at den omfatter et annet probiotisk materiale.

8. Formulering ifølge ethvert av kravene 6 eller 7, karakterisert ved at den omfatter et prebiotisk materiale.

9. Formulering ifølge ethvert av kravene 6-8, karakterisert ved at den omfatter en spiselig bærer.

10. Formulering ifølge krav 9, karakterisert ved at den spiselige bæreren er en farmasøytisk akseptabel bærer slik som en kapsel, tablett eller pulver.

11. Formulering ifølge krav 9, karakterisert ved at den spiselige bæreren er et matprodukt slik som surgjort melk, yoghurt, frossen yoghurt, melkepulver, melkekonsentrat, smøreost, dressinger eller drikkevarer.

12. Formulering ifølge ethvert av kravene 6-11, karakterisert ved at den videre omfatter et protein og/eller peptid, spesielt proteiner og/eller peptider som er rike på glutamin/glutamat, et lipid, et karbohydrat, et vitamin, mineral og/eller sporelement.

13. Formulering ifølge ethvert av kravene 6-12, karakterisert ved at Bifidobakterium er til stede i mer enn IO<6> cfu per gram med avleveringssystem.

14. Formulering ifølge ethvert av kravene 6-13, karakterisert ved at den omfatter en adjuvans.

15. Formulering ifølge ethvert av kravene 6-14, karakterisert ved at den omfatter en bakteriekomponent.

16. Formulering ifølge ethvert av kravene 6-15, karakterisert ved at den omfatter en medikamentenhet.

17. Formulering ifølge ethvert av kravene 6-16, karakterisert ved at den omfatter en biologisk forbindelse.

18. Formulering ifølge ethvert av kravene 6-17, karakterisert ved at den er for oral immunisering.

19. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18, til anvendelse i matprodukter.

20. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18, til anvendelse som et medikament.

21. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18, til anvendelse i profylaksen og/eller behandling av uønsket inflammatorisk aktivitet.

22.. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18 for anvendelse i profylaksen og/eller behandling av uønsket gastrointestinal inflammatorisk aktivitet så som inflammatorisk tarmsykdom, for eksempel Crohns sykdom eller ulcerativ kolitt, irritabelt tarmsyndrom; pouchitis; eller postinfeksjonskolitt.

23. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18 for anvendelsen i profylaksen og/eller behandlingen av gastrointestinal kreft.

24. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18 for anvendelse i profylaksen og/eller behandling av systemisk sykdom slik som reumatoid artritt.

25. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18 for anvendelse i profylaksen og/eller behandling av autoimmune sykdommer som skyldes uønsket inflammatorisk aktivitet.

26. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18 for anvendelse i profylaksen og/eller behandling av kreft som skyldes uønsket inflammatorisk aktivitet.

27. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18 for anvendelse i profylaksen av kreft.

28. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18 for anvendelse i profylaksen og/eller behandling av diarésykdom som skyldes uønsket inflammatorisk aktivitet, så som Clostridium difficile-assosiert diaré, Rotavirus-assosiert diaré eller postinfeksjonsdiaré.

29. Stamme ifølge ethvert av kravene 1-5, eller en formulering ifølge ethvert av kravene 6-18 for anvendelse i profylaksen og/eller behandlingen av irritabelt tarmsyndrom.