WO2011027829A1 - 乳酸菌由来のｒｎａを有効成分とする組成物 - Google Patents

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牛田　一成
井上　亮
卓巳 渡邉
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京都府公立大学法人
コンビ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a composition comprising RNA derived from lactic acid bacteria as an active ingredient, and to the use of the composition for immunity regulation or cytokine production regulation.
  • Macrophages and dendritic cells which are cells that control innate immunity, are receptors (pattern-recognition receptors: PRRs) that recognize unique molecular patterns (pathogen-associated molecular patterns: PAMPs) that exist in pathogenic microorganisms that have invaded the body. Is expressed.
  • PRRs pattern-recognition receptors
  • PAMPs pathogen-associated molecular patterns
  • TLR Toll-like receptor
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • IL interleukin
  • IL-12 IL-12 in macrophages and dendritic cells. It is involved in suppression of expansion and determination of T cell differentiation.
  • dendritic cells matured by TLR signal induce antigen-specific proliferation of lymphocytes by presenting antigens to lymphocytes such as B cells and T cells.
  • TLR plays an important role not only for the innate immune system but also for the acquired immune system.
  • Patent Document 1 discloses an isolated RNA oligomer having a length of 5 to 40 nucleotides having a base sequence containing at least one guanine and at least one uracil for the purpose of immunostimulation by TLR signaling, and as required. Discloses techniques for immunostimulatory compositions comprising cationic lipids. And it is described that it is preferable to use an isolated RNA oligomer produced by a nucleic acid synthesis method as a nucleic acid which is an active ingredient of an immunostimulatory composition (paragraph 73 of the specification).
  • Patent Document 2 discloses a technique of oligodeoxynucleotide having an immunostimulatory action and having a specific base sequence. However, Patent Document 2 discloses only mitogenic activity on the genomic DNA of the genus Bifidobacterium, that is, the result of examination of cell mitogenic activity, in the Examples, and has a direct immunostimulatory effect. There is no disclosure of the results of experiments on the presence or absence.
  • Non-Patent Documents 1 to 5 studies on the intestinal regulation, cancer risk reduction, prevention of atopic dermatitis, allergy reduction, biological defense mechanism, blood cholesterol reduction, blood pressure lowering, etc.
  • Orally ingested lactic acid bacteria are taken from Peyer's patch (PP) in the intestine and phagocytosed by macrophages and dendritic cells deployed in PP. This is thought to activate immune cells and activate innate immunity.
  • lactic acid bacteria are recognized by TLR (Non-patent Document 6), and it is considered that lactic acid bacteria regulate the functions of macrophages and dendritic cells via TLR signals.
  • identification of the active ingredient of lactic acid bacteria leads to the development of a drug that regulates the production of specific cytokines and may be used in the medical field.
  • a drug that regulates the production of specific cytokines and may be used in the medical field.
  • the details of the substance that is the main body of the action of regulating immunity and cytokine production in lactic acid bacteria have not yet been clarified.
  • the present invention has been achieved in view of the above circumstances, and its purpose is to identify a substance that is the main body of an action that regulates immune regulation and cytokine production in lactic acid bacteria, and uses the substance.
  • An object of the present invention is to provide a composition having an immunomodulating action and a composition having an action of regulating cytokine production.
  • the present inventors have promoted the production of IL-12 and the like by RNA derived from lactic acid bacteria via TLR7 and Myd88, or the production of TNF- ⁇ . As a result, the present inventors have found that the present invention has been suppressed.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a composition having an immunomodulating action comprising RNA derived from lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • a composition having an action of regulating cytokine production comprising RNA derived from lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • the composition according to (2) which has an action of promoting production of at least one cytokine selected from the group consisting of IL-12, CCL2, CCL5, CCL7, CXCL10, IL-6, and IL-1 ⁇ . object.
  • the composition according to (2) which has an action of suppressing production of TNF- ⁇ .
  • composition according to any one of (1) to (5) which has an immunomodulatory action dependent on at least one biomolecule selected from the group consisting of TLR7 and Myd88 or an action of regulating cytokine production object.
  • RNA is a single-stranded RNA.
  • the lactic acid bacterium is Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuococcus on, and Leu
  • composition according to any one of (1) to (7) which is at least one lactic acid bacterium selected from the group consisting of lactic acid bacteria belonging to the genus Bifidobacterium.
  • composition according to any one of (1) to (8), wherein the lactic acid bacterium is lactic acid cocci.
  • (11) The composition according to any one of (1) to (10), which is a composition for oral intake.
  • RNA derived from lactic acid bacteria as an active ingredient, in vivo TLR7 or Myd88-dependent signaling, etc. is activated, production of IL-12 or the like is promoted, or TNF- ⁇ Production can be suppressed.
  • the immune function of the living body is activated to suppress a decrease in the immune function, and the immune function is not adversely affected. Can do.
  • lactic acid bacteria have been included in fermented foods such as fermented milk for a long time and have a long dietary experience.
  • 2 is a bar graph summarizing the ability of EC-12-derived RNA to induce CCL5 production.
  • 2 is a bar graph summarizing the ability of EC-12-derived RNA to induce CCL7 production.
  • 2 is a bar graph summarizing the ability of EC-12-derived RNA to induce CXCL10 production.
  • 2 is a bar graph summarizing the ability of EC-12-derived RNA to induce IL-6 production.
  • 2 is a bar graph summarizing the ability of EC-12-derived RNA to induce IL-1 ⁇ production.
  • 2 is a bar graph summarizing the ability of EC-12-derived RNA to induce TNF- ⁇ production.
  • 2 is a bar graph summarizing the ability of EC-12-derived RNA to induce IL-12 production.
  • the present invention provides a composition having an activity of regulating immune regulation or cytokine production, comprising RNA derived from lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • lactic acid bacteria refers to a general term for bacteria that produce lactic acid by lactic acid fermentation, that is, metabolism.
  • the lactic acid bacteria include, but are not limited to, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconocto And at least 1 or more types of lactic acid bacteria selected from the group which consists of lactic acid bacteria which belong to Bifidobacterium (Bifidobacterium) can be used.
  • examples of bacteria belonging to the genus Enterococcus include Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium.
  • Lactobacillus The bacteria belonging to the genus Lactobacillus include Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sacvarius, Lactobacillus sacvarius, Rhamnosus (Lactobacillus rhamnosus) etc. are mentioned.
  • bacteria belonging to the genus Lactococcus include Lactococcus cremoris and Lactococcus lactis.
  • bacteria belonging to the genus Streptococcus include Streptococcus thermophilus (Streptococcus thermophilus) and the like.
  • bacteria belonging to the genus Pediococcus include Pediococcus damnosus.
  • Leuconostoc examples include Leuconostoc mesenteroides.
  • Bacteria belonging to the genus Bifidobacterium include Bifidobacterium adolecentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brevetium, Bifidobacterium brevebacterium, Infantitis (Bifidobacterium infantis), Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum), etc. are mentioned.
  • the lactic acid bacterium may be a lactic acid cocci.
  • lactic acid cocci include, but are not necessarily limited to, the aforementioned Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcus cremolith, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus and the like.
  • Enterococcus faecalis as the lactic acid bacterium.
  • Enterococcus faecalis examples include strains such as Enterococcus faecalis EC-12, ATCC 19433, ATCC 14508, ATCC 23655, IFO 16803, IFO 16804, and mutants thereof.
  • the EC-12 strain is most preferred as the active ingredient.
  • mutant strain means that a specific strain has been mutated by a method well known to those skilled in the art to the extent that the person skilled in the art does not change its properties or is equivalent to that. It means to include what can be done.
  • the Enterococcus faecalis EC-12 strain (Enterococcus faecalis EC-12) was issued on February 25, 2005 (original deposit date), and is a patent biological deposit center (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology). Deposited at 1-6 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-5466, Japan. The accession number is FERM BP-10284.
  • RNA in the present invention can be derived from natural or non-natural origin.
  • Naturally-occurring RNA is generally a linear polymer of specific ribonucleoside units, each ribonucleoside unit is composed of a purine or pyrimidine base and a ribose sugar, and the nucleosides are linked by phosphodiester bonds. It is a kind of nucleic acid that means something.
  • “linear” refers to the primary structure of RNA.
  • RNA is single-stranded or double-stranded, but can also include partially double-stranded.
  • the active ingredient of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is RNA derived from lactic acid bacteria, and may be single-stranded RNA, double-stranded RNA, or partially double-stranded RNA. Of these, single-stranded RNA is preferable from the viewpoint of being recognized by Toll-like receptor 7 (TLR7) in vivo. Since lactic acid bacteria have been included in fermented foods such as fermented milk for a long time and have a long dietary experience, the composition of the present invention containing RNA derived from lactic acid bacteria as an active ingredient is considered to be highly safe. In addition, about lactic acid bacteria, only 1 type may be used and RNA of 2 or more types of lactic acid bacteria may be mixed and used. Furthermore, any RNA can be used regardless of the type of RNA, such as messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), and other RNA.
  • mRNA messenger RNA
  • tRNA transfer RNA
  • RNA of lactic acid bacteria used as an active ingredient As a method for producing RNA of lactic acid bacteria used as an active ingredient, a conventionally used method can be employed.
  • a method for producing RNA of lactic acid bacteria for example, a method of synthesis by a nucleic acid synthesis method or the like may be employed, or a method obtained from an existing nucleic acid source (for example, genomic DNA or cDNA) may be employed.
  • examples of the method for producing RNA of lactic acid bacteria include a phenol method, a spin column, a glass filter, and a method using ion exchange, but are not particularly limited to these methods.
  • Immuno modulating action in the present invention refers not only to activating the immune function of a living body ingesting the composition of the present invention to suppress a decrease in immune function, but also to an excessively enhanced immunity such as an allergic reaction. It means the action of suppressing the function and thus adjusting the balance of immune function.
  • the present invention also provides a composition having an action of regulating cytokine production, comprising the RNA derived from lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • the effect of regulating cytokine production is, for example, at least one protein selected from the group consisting of IL-12, CCL2, CCL5, CCL7, CXCL10, IL-6, and IL-1 ⁇ . It not only promotes production but also has an effect of suppressing production of TNF- ⁇ .
  • IL-12 Interleukin-12
  • IL-12p35 IL-12p40
  • a heterodimer composed thereof IL-12p70
  • IL-12p40 is preferable.
  • IL-12p35 derived from human
  • ACCESSION No. The protein (gene) specified by NP_000873.2 (NM_000882.2) can be mentioned, and as typical IL-12p40 derived from human, ACCESSION No. Examples include proteins (genes) specified by NP_002178.2 (NM_002187.2).
  • CCL2 (Chemokine (CC motif) ligand 2) is a typical example derived from humans such as ACCESSION No. Examples include proteins (genes) specified by NP_002973.1 (NM_002982.3).
  • CCL5 (Chemokine (CC motif) ligand 5) is a typical example of human origin, ACCESSION No. Examples include proteins (genes) specified by NP_002976.2 (NM_002985.2).
  • CCL7 (Chemokine (CC motif) ligand 7) is a typical example of human origin, ACCESSION No.
  • the protein (gene) specified by NP_006264.2 (NM_006273.2) is mentioned.
  • CXCL10 (Chemokine (C—C—C—motif) ligand 10) is a typical example of human origin, ACCESSION No. Examples include proteins (genes) specified by NP_001556.2 (NM_001565.2).
  • IL-6 also referred to as Interleukin-6 or Interferon beta 2
  • Interleukin-6 is a typical example derived from humans such as ACCESSION No.
  • proteins include proteins (genes) specified by NP_000591.1 (NM_000000600.2).
  • IL-1 ⁇ Interleukin-1 alpha
  • NP_000566.3 NM_000575.3
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor-alpha
  • NP_000585.2 NM_000594.2
  • amino acid sequence of a protein can be mutated in nature (ie, non-artificially). Therefore, in the present invention, such natural mutants are included in cytokines such as IL-12 and TNF- ⁇ .
  • the production of cytokines such as IL-12 and TNF- ⁇ includes not only the production of the protein itself but also the expression of genes encoding each protein.
  • the immunomodulating action or the cytokine regulating action is preferably an action dependent on at least one biomolecule selected from the group consisting of TLR7 and Myd88.
  • TLR7 is a Toll-like receptor (TLR), a receptor for macrophages and dendritic cells to recognize foreign microorganisms. It is expressed in intracellular endosomes and is a single chain derived from a virus. It is a receptor that recognizes RNA and the like.
  • Myd88 myloid differentiation primary response gene (88)) recognizes each ligand (such as single-stranded RNA derived from a virus in TLR7) in the cytoplasm of Toll-like receptors (excluding TLR3). It is an adapter protein that binds to the TIR domain of and induces the activation of NF- ⁇ B and MAPK.
  • TLR7 is ACCESSION No. as a typical example of human origin. Examples thereof include a protein (gene) specified by NP_057666.1 (NM_0166562.3). In addition, Myd88 is a typical example derived from humans such as ACCESSION No. Examples include proteins (genes) specified by NP_002459.2 (NM_002468.4).
  • amino acid sequence of a protein can be mutated in nature (ie, non-artificially). Therefore, in the present invention, such natural mutants are also included in TLR7 and Myd88.
  • the effective intake of the composition of the present invention is 1 ⁇ g / kg / day to 10 mg / kg / day in terms of RNA.
  • the content of lactic acid bacteria in the composition of the present invention preferably includes 1 to 10,000 mg of lactic acid bacteria per day in terms of dry matter, and more preferably includes 10 to 1000 mg.
  • composition of the present invention exerts effects on intestinal regulation, cancer risk reduction, prevention of atopic dermatitis, allergy reduction, infection protection and the like.
  • the composition of the present invention can be suitably used as a composition for oral consumption.
  • the RNA derived from the lactic acid bacterium can be used as it is, or it can be used as it is in the form of the lactic acid bacterium, and further, excipients, sweeteners, fragrances, coloring agents and the like are added. And it can also use what was processed into the dosage form for internal use, such as a granular form, a tablet, and a capsule.
  • additives such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, diluents, surfactants, and the like that are widely used for ordinary drugs can be used as a formulation carrier.
  • a complex with a positively charged carrier such as a cationic liposome may be formed so as to be suitable for delivery to and incorporation into the target cells.
  • composition for oral consumption of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include general foods, confectionery, jelly, gummy, candy, gum, snack confectionery, baked confectionery, retort food, instant food, and nutritional supplements.
  • examples include foods, beverages, sheet-like foods, chewables, jelly beverages (chua packs), kneaded products, rice porridges, boiled potatoes, and the like.
  • specific examples are not limited to these.
  • the cells When the cells reach 80% confluence, they are treated with a 2.5 g / L trypsin-1 mM EDTA (ethylenediametracetic acid) solution (manufactured by Nacalai Tesque) for 5 minutes, and then detached with a cell scraper (manufactured by IWAKI). The passage was done.
  • trypsin-1 mM EDTA ethylenediametracetic acid
  • EC-12 bactericidal lactic acid bacteria EC-12 (combined by Combi Co., Ltd.) was added to 5% FCS RPMI 1640 medium so as to be 10 mg / mL, and output was disrupted with an ULTRASONIC DISCUPTOR (manufactured by Tomy) with 3 outputs. The sonication was performed on ice for 2 minutes and 30 seconds for a total of 2 minutes and 30 seconds. After sonication, the cell suspension was serially diluted in 3 stages (10 times, 10 times, 5 times) with 5% FCS RPMI 1640 medium, adjusted to 20 ⁇ g / mL, and then subjected to culture.
  • J774.1 cells with EC-12> J774.1 cells prepared as described above and reaching 80% confluence were washed with 0.1 M PBS (Phosphate buffered saline) and then treated with 2.5 g / L trypsin-1 mM EDTA solution for 5 minutes.
  • the cell suspension obtained by peeling the cells from the incubator with a cell scraper was centrifuged at 1,000 rpm (170 g) at room temperature for 5 minutes.
  • the cells obtained by accumulation were resuspended in 5% FCS RPMI 1640 medium, the number of cells was measured using a hemocytometer, and the number of cells was adjusted to 5 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the prepared cell suspension is seeded in a 96-well plate for cell culture (SUMILON: manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) at 100 ⁇ L / well (5 ⁇ 10 4 cells), and 5% CO 2 at 37 ° C. until the cells adhere. Pre-cultured for 4 hours under the conditions.
  • SUMILON manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • EC-12 for addition (20 ⁇ g / mL) prepared as described above was added in an amount of 100 ⁇ L at a time, so that the final concentration of EC-12 was 10 ⁇ g / mL.
  • J774.1 cells cultured in a basal medium without EC-12 were used as a control.
  • the culture time for all experiments was 20 hours, and experimental treatment and control wells were performed in triplicate.
  • RNA extraction from cells after 20 hours of culture For extraction of total RNA from cells, QuickGene RNA structured cell HC kit S (manufactured by FUJIFILM Corporation) was used. The LRP solution attached to the kit (10 ⁇ L of 2-mercaptoethanol added per mL) was added at 100 ⁇ L / well, transferred to a screw cap tube containing 5 mm zirconia beads, and FastPrep FP120 (Funakoshi Co., Ltd.) was used to speed 4. Cell disruption was performed for 0, 40 seconds. After adding 15 ⁇ L of SRP solution attached to the extraction kit and vortexing for 15 seconds, 50 ⁇ L of 99.5% ethanol was added and vortexed for 1 minute.
  • RNA was extracted from the RNA as a template.
  • a reverse transcription reaction was performed using PrimeScript (TM) RT reagent Kit for Perfect Real Time (manufactured by Takara) to synthesize cDNA. That is, using 150 ng of total RNA as a template, using Oligo dT Primer and Random 6 mers attached to the kit as reverse transcription primers, making the total volume 10 ⁇ L with sterilized water (RNase free), reverse transcription according to the instructions attached to the kit Reaction was performed and cDNA was synthesized.
  • TM PrimeScript
  • RT reagent Kit for Perfect Real Time manufactured by Takara
  • ⁇ Quantification of IL-12p40 gene expression level> Using the synthesized cDNA as a template, the expression level of IL-12p40 gene was measured using real-time PCR.
  • LightCycler (R) 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science) was used.
  • the composition of the reaction solution was 2 ⁇ L of template cDNA, 5 ⁇ L of LightCycler® 480 Probes Master (manufactured by Roche Applied Science), and 100 nM Universal Probe Library Probe (10 ⁇ m each of RocApplied).
  • the reaction was performed after initial denaturation at 95 ° C. for 5 minutes, followed by 50 cycles of 95 ° C. for 10 seconds, 60 ° C.
  • glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was used as an internal correction factor.
  • Primers were designed with probe finder software (Roche Applied Science). Table 1 shows the base sequence and universal probe library probe number of each primer. The results of real-time PCR were analyzed using LightCycler® 480 software (manufactured by Roche Applied Science), and the relative quantitative analysis by ⁇ Ct method was performed after calculating the Threshold Cycle (Ct) value by the 2nd Derivative Maximum method.
  • ⁇ Quantification of IL-12 protein The concentration of IL-12 protein in the cell culture supernatant after culturing for 20 hours was measured using a Mouse Interleukin-12 ELISA Kit (BioSource: manufactured by Invitrogen). The measurement procedure followed the kit protocol.
  • FIG. 1 A and B are bar graphs comparing the IL-12p40 gene expression levels of J774.1 cells, and C is a graph comparing the IL-12p40 protein production levels of J774.1 cells.
  • ** (two asterisks) indicates p ⁇ 0.01.
  • the expression level of IL-12p40 gene in J774.1 cells cultured with EC-12 (“EC-12” in A and B in FIG. 1) was not added to J774.
  • the expression level of IL-12p40 gene in one cell (“medium” in A and B in FIG. 1) is about 600 times in the first time (A in FIG. 1) and about 1200 times in the second time (B in FIG. 1). Met.
  • the IL-12p40 protein production amount of J774.1 cells cultured with EC-12 (“EC-12” in C in FIG. 1) is the IL-12p40 protein production amount of J774.1 cells without addition (FIG. 1). It was about 35 times that of “medium” in middle C).
  • Test Example 2 Treatment of EC-12 with DNase / RNase (nuclease treatment), and culture of the treated cells with J774.1 cells ⁇ Preparation of EC-12 for addition> 5% FCS RPMI 1640 EC-12 (10 mg / mL) dispersed in the medium was treated with 20 units / mL RNase free DNase I (Takara) or 0.1 mg / mL RNase A (Invitrogen) at 37 ° C. for 30 minutes. did. After the treatment, EC-12 after each nuclease treatment was diluted in three stages as described above, and cultured with J774.1 cells in the same manner as in Test Example 1.
  • LPS Lipopolysaccharides from Escherichia Coli 0111: B4: manufactured by Sigma
  • LPS Lipopolysaccharides from Escherichia Coli 0111: B4: manufactured by Sigma
  • LPS prepared to 10 ⁇ g / mL with 5% FCS RPMI 1640 medium was treated with DNase or RNase in the same manner as EC-12, and further diluted to 0.6 ⁇ g / mL with 5% FCS RPMI 1640 medium.
  • the final concentration of LPS was 0.3 ⁇ g / mL.
  • FIG. 2A and 2B are bar graphs comparing IL-12p40 gene expression levels of J774.1 cells
  • FIG. 2C is a graph comparing IL-12 protein production levels of J774.1 cells ( Significant difference between different signs (ag): p ⁇ 0.05.
  • the bar graph described as “medium” shows the results of culturing J774.1 cells without addition of bacteria
  • the bar graph described as “EC-12” shows cultures of EC-12 and J774.1 cells.
  • the bar graph described as “LPS” is a graph showing the results of culturing LPS and J774.1 cells, respectively.
  • both the IL-12p40 gene expression level and the IL-12p40 protein production level of J774.1 cells are the same as when untreated EC-12 was added. It was found that there was a significant decrease in comparison, and in particular, a significant decrease was observed during RNase treatment.
  • EC-12 was treated with both DNase and RNase (nuclease treatment) and cultured with J774.1 cells. That is, both EC-12 (10 mg / mL) dispersed in 5% FCS RPMI 1640 medium, 20 units / mL RNase free DNase I (Takara) and 0.1 mg / mL RNase A (Invitrogen) At 37 ° C. for 30 minutes. After the treatment, the EC-12 sample was diluted in three stages, and cultured with J774.1 cells in the same manner as in Test Example 1, and the IL-12p40 gene expression level in these cells was measured. The obtained results are shown in FIG. In FIG.
  • a and B are both bar graphs comparing the expression level of IL-12p40 gene in J774.1 cells (significant difference between different symbols (ab): p ⁇ 0.01).
  • the bar graph described as “medium” shows the results of culturing J774.1 cells without addition
  • the bar graph described as “EC-12” shows cultures of EC-12 and J774.1 cells.
  • the bar graph described as “nuclease-treated EC-12” is a graph showing the results of culturing EC-12 and J774.1 cells treated with DNase and RNase, respectively.
  • Test Example 3 Culture of J774.1 cells and EC-12 under inhibition of TLR7 or TLR9 signaling
  • a phosphorothioated (S-modified) synthetic oligonucleotide (ODN) was used (Barrat) , FJ et al., J. Exp. Med. 2005, 202 (8): 1131-9). That is, IRS661 was used as an antagonist of TLR7, and IRS869 was used as an antagonist of TLR9. Further, CL097 (manufactured by InvivoGen) was used as an agonist of TLR7, and ISS1018, which is a phosphorothioated synthetic ODN, was used as an agonist of TLR9. The sequence of each synthetic ODN is shown in Table 2.
  • IRS661 was added to the medium at 5.6 ⁇ M and IRS869 at 0.7 ⁇ M, and the cells were cultured in a CO 2 incubator. Thereafter, culture with EC-12 was carried out in the same manner as in Test Example 1. Moreover, what added ISS1018 to 0.7 micromol and CL097 to the culture medium so that it might become 1 microgram / mL, and culture
  • FIG. 4A and 4B are both bar graphs comparing the IL-12p40 gene expression level of J774.1 cells
  • FIG. 4C is a graph comparing the IL-12 protein production levels of J774.1 cells. (Significant difference between different signs (af): p ⁇ 0.05).
  • “ND” means “No Data”, that is, not measured.
  • the bar graph described as “medium” shows the results of culturing J774.1 cells without addition of bacteria
  • the bar graph described as “EC-12” shows cultures of EC-12 and J774.1 cells.
  • the bar graph described as “CL097 (TLR7 agonist)” shows the results of the culture of TLR7 agonist and J774.1 cells
  • the bar graph described as “ISS1018 (TLR9 agonist)” shows the results of TLR9 agonist and J774.
  • 1 is a graph showing the results of culture with 1 cell, respectively.
  • TLR7 As is apparent from the results shown in the three bar graphs labeled “CL097 (TLR7 agonist)” and the three bar graphs labeled “ISS1018 (TLR9 agonist)” in FIGS. 4A to 4C, TLR7 It was confirmed that the IL-12p40 gene expression level by the agonist and the TLR9 agonist, and the protein production amount were significantly decreased by the addition of the TLR7 antagonist or the TLR9 antagonist (p ⁇ 0.05). The TLR7 antagonist and the TLR9 antagonist were appropriately It was confirmed that each signaling of TLR7 or TLR9 was inhibited.
  • the amount of IL-12 protein produced by J774.1 cells in culture with untreated EC-12 When the average value (value indicated by the white bar graph of “EC-12” in C in FIG. 4) was 100%, 51.9 ⁇ 3.1% (in C in FIG. 4) with the addition of the TLR7 antagonist The amount of protein production decreased to “EC-12” (value indicated by the hatched bar graph), and 63.9 ⁇ 6.5% (indicated by the horizontal broken line of “EC-12” in C in FIG. 4) when TLR9 antagonist was added. The amount of protein production decreased to the value shown in the bar graph.
  • IL-12p40 gene expression level of J774.1 cells induced by EC-12 was significantly reduced by the addition of a TLR7 antagonist or a TLR9 antagonist (p ⁇ 0.05). It was also revealed that the suppression of IL-12p40 production inducing ability exhibited by EC-12 was more marked when TLR7 signaling was inhibited than when TLR9 signaling was inhibited. This indicates that IL-12p40 production when RNase-treated EC-12 was added was lower than IL-12p40 production when EC-12 treated with DNase was added as shown in Test Example 2. Consistent with what was shown, it was strongly suggested that the active ingredient of EC-12 that induces IL-12 production from J774.1 cells is a nucleic acid, particularly RNA.
  • RNA extraction from EC-12 was performed using QuickGene RNA tissue kit S II (manufactured by FUJIFILM Corporation). Specifically, 500 ⁇ L of LRT solution (10 ⁇ L of 2-mercaptoethanol added per mL) was added to 150 mg of EC-12, transferred to a screw cap tube containing 0.1 mm glass beads, and FastPrep FP120 (Funakoshi Co., Ltd.) was homogenized for 90 seconds at a speed of 6.5. Subsequent operations were performed in accordance with the kit extraction protocol. In addition, RNase free DNase I (manufactured by Takara) was used for DNase treatment, and the on-column method was performed according to the protocol attached to the kit S II.
  • LRT solution 10 ⁇ L of 2-mercaptoethanol added per mL
  • DNA extraction from EC-12 was performed using QuickGene DNA tissue kit S (manufactured by FUJIFILM Corporation). 38. That is, 250 ⁇ L of the MDT solution attached to the kit was added to 150 mg of EC-12, transferred to a screw cap tube containing 0.1 mm glass beads, and homogenized at a speed of 6.5 for 90 seconds using FastPrep FP120 (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.). did. Thereafter, 25 ⁇ L of the EDT solution attached to the kit was added and incubated at 55 ° C. for 60 minutes.
  • the mixture is centrifuged at 13,000 rpm (12,000 g) at room temperature for 10 minutes, 200 ⁇ L of the supernatant is dispensed into a new microtube, 60 ⁇ L of RNase A (20 mg / mL: manufactured by Invitrogen) is added, and then at room temperature for 2 minutes. Incubated. Further, 180 ⁇ L of the LDT solution attached to the kit was added, vortexed for 15 seconds, incubated at 70 ° C. for 10 minutes, 240 ⁇ L of 99.5% ethanol was added, and vortexed for 15 seconds. Subsequent processing was performed using QuickGene-Mini80 according to the protocol attached to the kit.
  • RNA and DNA were mixed with 5% FCS RPMI 1640 medium, added to the medium so that RNA was 5.6 ng / ⁇ L and DNA was 4.6 ng / ⁇ g, and cultured with J774.1 cells. .
  • the quantification of IL-12p40 gene expression in the cultured cells was carried out in the same manner as in Test Example 1. The obtained results are shown in FIG. Note that A and B in FIG. 5 are both bar graphs comparing the expression levels of IL-12p40 gene in J774.1 cells (significantly different between different signs (ab): p ⁇ 0.01). . In addition, the bar graph described as “medium” in FIG.
  • FIG. 5 shows the results of the culture of the additive-free J774.1 cells, and the bar graph described as “DNA” shows the extracted EC-12 DNA and J774.1 cells.
  • the bar graph described as “DNase-treated DNA” shows the results of culture of DNase-treated EC-12 DNA and J774.1 cells, and the bar graph described as “RNA”
  • the bar graph labeled “RNase-treated RNA” shows the results of the culture of EC-12 RNA and J774.1 cells, and the results of the culture of EC-12 RNA treated with RNase and J774.1 cells. It is the graph which each showed.
  • J774.1 cells definitely recognized DNA as an antigen.
  • IL-12p40 production from J774.1 cells hardly changed. This is because TLR7 and TLR9 are expressed in intracellular endosomes (Nishiya, T. et al. J. Biol. Chem. 2005, 4; 280 (44): 37107-17, and Leifer, CA). et al., J. Immunol. 2004, 173 (2): 1179-83), in order for free DNA molecules or RNA molecules to be recognized by TLR7 and TLR9, they need to be taken up into cells. It is believed that there is.
  • Example 1 Lipofection of EC-12-derived RNA into J774.1 cells Since J774.1 cells were judged to have no uptake of free RNA, lipofection was performed in order to introduce RNA into the cells. .
  • FuGENE HD Transfection Reagent manufactured by Roche Applied Science was used for lipofection. Total RNA extracted and prepared from EC-12 in the same manner as in Test Example 4 was adjusted to 20 ⁇ g / ⁇ L with serum-free medium (Opti-MEM), then 6 ⁇ L of FuGENE HD Transfection Reagent was added, reacted for 10 minutes, and FuGENE / An RNA complex was formed. 5 ⁇ L of this complex was added dropwise per 0.5 ⁇ 10 5 cells and cultured for 20 hours.
  • lipofection was also performed in the same manner on EC-12-derived total RNA (50 ⁇ g / ⁇ L) treated with 0.1 mg / mL RNase A (Invitrogen). Furthermore, J774.1 cells that inhibited TLR7 signaling were prepared in the same manner as in Test Example 3, and the cells obtained by the preparation were lipofected in the same manner.
  • FIG. 6A and 6B are bar graphs comparing the IL-12p40 gene expression levels of J774.1 cells
  • FIG. 6C is a graph comparing the IL-12p40 protein production levels of J774.1 cells.
  • the bar graph labeled “medium” shows the results of culturing J774.1 cells with no additive
  • the bar graph labeled “lipofectant reagent” shows the results of culturing the lipofection reagent and J774.1 cells.
  • the bar graph described as “EC-12 RNA lipofection” is the bar graph described as “RNase-treated EC-12 RNA lipofection” as a result of culturing of the RNA of EC-12 subjected to lipofection and J774.1 cells. Shows the results of the culture of EC-12 RNA and J774.1 cells lipofected after RNase treatment, and the bar graph described as “TLR7 antagonist EC-12 RNA lipofection” shows the EC-1 after lipofection.
  • RNA and the results of culture with J774.1 cells inhibited TLR7 signaling is a graph showing respectively.
  • the comparison between the “lipofection reagent” bar graph and the “EC-12 RNA lipofection” bar graph shows that the expression level of IL-12p40 gene in J774.1 cells is determined by lipofection of RNA extracted from EC-12. , About 400 times (A in FIG. 6) in the first time, and about 400 times (B in FIG. 6) in the second time, and the EC-12-derived RNA As a result, it became clear that the IL-12 protein production amount of J774.1 cells increased about 8 times (C in FIG. 6) with respect to no addition.
  • the ligand recognized by TLR7 is generally a single-stranded RNA derived from a virus (Lund, JM et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004, 101 (15). : 5598-603)), the results revealed for the first time that RNA derived from bacteria was recognized by TLR7.
  • the prepared cells, RNase-treated cells, and DNase-treated cells were sensitized to J774.1 cells at a final concentration of 10 ⁇ g / ml, and the concentration of IL-12 protein was measured.
  • the protein concentration was similarly measured for unsensitized J774.1 cells.
  • the concentration of IL-12 protein in the culture supernatant was measured in the same manner as in Test Example 1, and the induction of IL-12 production in each bacterial cell was the untreated result value of Enterococcus faecalis EC-12 as 1. Expressed as a relative value of 00 (reference value). The obtained results are shown in FIG. Incidentally, FIG.
  • Enterococcus faecalis EC-12 strain Enterococcus faecalis (strains difference), Enterococcus faecium, Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium Breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, IL-12 production inducing ability of untreated cells (upper white bar graph), cells after RNase treatment (middle black bar graph), cells after DNase treatment The results when using the body (lower shaded bar graph) are shown.
  • Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri on two by two examples for Bifidobacterium breve, by three examples for Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum, although each respectively four cases results are shown for Bifidobacterium longum, These are the results for the same and different strains, respectively.
  • thermophilus As is clear from the results shown in FIG. faecalis, E .; faecium, L.M. cremoris, L.M. lactis, S. et al.
  • thermophilus there was almost no difference between the value when using untreated cells and the value when using cells after DNase treatment.
  • the value when using the microbial cells after RNase treatment is 1/2 to 30 times smaller than the value when using untreated microbial cells or microbial cells after DNase treatment. It became clear that it decreased significantly. This shows that IL-12 production-inducing ability of lactic acid cocci is markedly reduced by RNase treatment.
  • thermophilus was used, similar results were obtained in several strains.
  • Test Example 6 Analysis using knockout mice
  • spleen cells of Myd88, TLR2, and TLR4 knockout mice were isolated and shown in Table 3. Evaluation was performed using lactic acid strains (EC-12, Lactobacillus 5 strain and Enterococcus 5 strain). In addition, spleen cells of TLR7 knockout mice were isolated and evaluated using EC-12.
  • isolation and culture of spleen cells from each knockout mouse, measurement of IL-12 protein amount in the culture supernatant, and preparation of lactic acid bacteria added to each spleen cell were performed as follows.
  • mice 10-week-old TLR2-, TLR4-, TLR7-, Myd88-deficient mice and wild type mice of the C57BL / 6 strain were used.
  • the wild type mouse used the mouse purchased from Japan SLC Co., Ltd.
  • TLR2-, TLR4-, TLR7-, and Myd88-deficient mice are based on those obtained from Oriental Bioservice Co., Ltd., and mice that are bred in SPF animal facilities (in the absence of specific pathogenic microorganisms) are used. It was. All of these mice were fed with rodent food (product name: Labo MR Stock, manufactured by Nippon Agricultural Industry Co., Ltd.) and water constantly. In addition, experiments using these mice were performed according to the guidelines for research using experimental animals of the Kyoto Prefectural University Animal Experiment Committee.
  • mice were anesthetized by intraperitoneal injection of 30 ⁇ l of pentobarbital sodium (manufactured by Schering-Plough Co., Ltd.), followed by exsanguination. After incising the abdomen of the mouse, the spleen was removed and immersed in an ice-cooled Hank's balanced salt solution. Then, spleen cells were isolated from the extracted spleen using a 70 ⁇ m cell strainer (manufactured by BD Falcon).
  • ACK lysis solution (0.15M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 , and 0.1 mM Na 2 EDTA, pH 7.4) was added to the isolated spleen cells to lyse erythrocytes.
  • the spleen cells thus treated were washed twice with sterilized phosphate buffered saline, and cultured for cell culture (10% fetal calf serum (Equitech-Bio), 100 U / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml). Suspended in streptomycin-added RPMI 1640).
  • spleen cells isolated from three mice having the same genetic background were pooled and used. As a control, spleen cells were similarly prepared from wild type mice in addition to the knockout mice.
  • ⁇ Culture of spleen cells The number of viable cells was measured by trypan blue dye exclusion method, and spleen cells prepared as described above were seeded at 1 ⁇ 10 6 cells (100 ⁇ l of cell culture medium) in each well of a 96-well culture plate (Orange Scientific). did. Then, 20 ⁇ g (wet weight) of live bacteria or heat-sterilized bacteria suspended in 100 ⁇ l of cell culture medium is added to each hole, and spleen cells and lactic acid bacteria are added in a humidified 5% CO 2 incubator for 20 hours. And co-cultured. In addition, the co-culture of lactic acid bacteria and spleen cells was performed in three holes.
  • ⁇ Quantification of IL-12p70> After the culture, the culture supernatant is collected, and the concentration of IL-12 protein in the culture supernatant is determined using a DuoSet® ELISA Development System (manufactured by R & D Systems) for mouse IL-12p70 according to the instruction manual. It was measured.
  • Lactobacillus 5 strains (Lactobacillus acidophilus strain JCM1132, Lactobacillus casei strain JCM1134, Lactobacillus gasseri strain JCM5344, Lactobacillus plantarum strain JCM1149 and Lactobacillus rhamnosus strain ATCC53103), and Enterococcus 5 strains (Enterococcus faecium strain JCM8714, Enterococcus faecium strain JCM8727, Enterococcus faecalis strain ATCC14508 , Enterococcus fae alis strain ATCC 19433 and Enterococcus faecalis strain ATCC 23655 are from ATCC (American Culture Culture Collection), American Type Culture Collection, JCM (Independent Administrative Institution RIKEN Bioresource Center Micromaterials Department, the Jol Obtained.
  • FIG. 8 The analysis results for Myd88, TLR2, and TLR4 knockout mice performed as described above are shown in FIG. Moreover, the analysis result about a TLR7 knockout mouse is shown in FIG.
  • the bar graph described as “Viable” indicates the result of co-culture of spleen cells derived from each knockout mouse and viable bacteria
  • the bar graph described as “Heat-killed” indicates the bacteria subjected to heat sterilization treatment.
  • the result of co-culture with is shown.
  • the black bar graph shows the result for the wild type mouse
  • the white bar graph shows the result for the MyD88-knockout mouse
  • the hatched bar graph shows the result for the TLR2 knockout mouse
  • the dot bar graph shows the result for the TLR4 knockout mouse.
  • the results are shown respectively (there are significant differences between the same signs (a to g): p ⁇ 0.05).
  • spleen cells other than Myd88 knockout mice produced IL-12p70 in the same amount as wild type mice, but IL-12p70 was produced from spleen cells derived from Myd88 knockout mice. Production was hardly observed. Moreover, this tendency was confirmed in both cases when co-cultured with live bacteria and when co-cultured with heat-sterilized bacteria.
  • Example 2 Examination of IL-12 production inducing ability by RNA content
  • Example 3 Examination of IL-12 production inducing ability by RNA content
  • the possibility that IL-12 production was caused by the RNA content of the strain was examined. That is, the amount of total RNA extracted by treating in the same manner as in Test Example 4 from 150 mg of each bacterial cell shown in Table 4 was measured with an absorptiometer (product name: NanoDrop, manufactured by LMS Co., Ltd.). Calculation was made based on the measured absorbance at a wavelength of 260 nm.
  • Each total RNA obtained was introduced into cells by the lipofection method in the same manner as in Example 1, and the protein amount of IL-12p70 was measured in the same manner as in Test Example 6. The obtained result is shown in FIG.
  • Example 3 Examination of the ability of EC-12-derived RNA to induce the production of cytokines and chemokines other than IL-12
  • RNA derived from EC-12 were introduced into J774.1 cells by the lipofection method and cultured.
  • RNA may be extracted from the cultured cells in the same manner as in Test Example 1, and the expression level may vary depending on the presence or absence of RNA derived from EC-12 using a cytokine-chemokine array by real-time PCR. 15 genes excluding IL-12 were selected. Specifically, it was performed as follows.
  • the reaction using these primers was performed using a Taqman probe selected from the Light Cycler (R) 480 Probe Master (Roche Applied Science) and the Universal Probe Library (Roche Applied Science). Specifically, 5 ⁇ l of Probe Master, 0.2 ⁇ l of forward and reverse primer solutions (10 pM), 0.1 ⁇ l of Universal Probe (10 pM) solution, 2.5 ⁇ l of sterile distilled water and 2 ⁇ l of template cDNA were added as reaction systems. A total of 10 ⁇ l was prepared. Then, after initial denaturation at 95 ° C. for 5 minutes, an amplification curve was obtained by applying a temperature cycle of 95 ° C. for 10 seconds and 60 ° C. for 20 seconds to the reaction system 50 times.
  • each cDNA solution was diluted with sterile distilled water so that the GAPDH gene expression levels would be equal.
  • the cDNA solutions prepared in this way were pooled by a certain amount for each group, and the expression levels of genes such as cytokines were comprehensively analyzed. That is, using the primer sets shown in Tables 5 to 9, the real-time PCR method was performed in the same manner as the measurement of the expression level of the housekeeping gene, and the expression level of genes such as cytokines in each sample was measured.
  • RNA derived from lactic acid bacteria into cells, production of IL-12, CCL2, CCL5, CCL7, CXCL10, IL-6, and IL-1 ⁇ is promoted, and production of TNF- ⁇ is suppressed. It became clear.
  • RNA derived from lactic acid bacteria as an active ingredient, signaling and the like dependent on TLR7 and Myd88 in the living body are activated, and production of IL-12 and the like is promoted. Or the production of TNF- ⁇ can be suppressed.
  • the immune function of the living body is activated to suppress a decrease in the immune function, and the immune function is not adversely affected. Can do.
  • lactic acid bacteria have been included in fermented foods such as fermented milk for a long time and have a long dietary experience.
  • the composition of the present invention is superior in that it activates the immune function and safely suppresses the decrease in immune function, so that the intestinal adjustment, reduction of cancer risk, prevention of atopic dermatitis, allergy reduction, It is useful as a composition for oral intake for the purpose of infection prevention.

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Abstract

　乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする、免疫調整作用を有する組成物。または乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする、サイトカイン産生を調整する作用を有する組成物。

Description

乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする組成物
　本発明は、乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする組成物、並びに、免疫調整のための、またはサイトカインの産生調整のための当該組成物の利用に関する。
　自然免疫を司る細胞であるマクロファージや樹状細胞は、体内に侵入してきた病原微生物に存在する特有の分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｔｅｒｎｓ：ＰＡＭＰｓ）を認識する受容体（Ｐａｔｔｅｒｎ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＰＲＲｓ）を発現する。
　マクロファージや樹状細胞が外来微生物を認識するために、最も重要な役割を果たしているＰＲＲｓの１つに、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）が挙げられる。現在、哺乳類で確認されているＴＬＲは１３種類であり、それらＴＬＲの多くは主に細菌のＰＡＭＰｓを認識することが知られている。ＴＬＲはＰＡＭＰｓを認識した後、細胞質内のＴＩＲ（Ｔｏｌｌ／ＩＬ－１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）からシグナルが伝達され、最終的にＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）の活性化を誘導する。
　ＮＦ－κＢやＭＡＰＫ等の活性化は、マクロファージや樹状細胞において、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α）、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－６、ＩＬ－１２といった炎症性サイトカインの産生を誘導し、感染拡大の抑制、Ｔ細胞の分化決定に関与する。また、ＴＬＲシグナルにより成熟した樹状細胞は、Ｂ細胞やＴ細胞などのリンパ球への抗原提示により、抗原特異的なリンパ球の増殖を誘導する。このように、ＴＬＲは自然免疫系だけでなく獲得免疫系に対しても重要な役割を果たしている。
　近年、ＴＬＲシグナルを利用した、免疫賦活性物質の開発が行われている。例えば、特許文献１は、ＴＬＲシグナル伝達による免疫賦活化を目的とする、少なくとも１つのグアニンおよび少なくとも１つのウラシルを含む塩基配列を有する５～４０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡオリゴマー、ならびに必要に応じて、陽イオン性脂質を含む免疫賦活性組成物の技術を開示している。そして、免疫賦活性組成物の有効成分である核酸として、核酸合成法により作製した単離ＲＮＡオリゴマーを用いるのが好ましい旨記載されている（明細書の７３段落）。しかしながら、当該文献には生体内で行う、いわゆるｉｎ　ｖｉｖｏ実験の結果が開示されていないため、このような合成ＲＮＡオリゴマーが、実際に生体内で安全に免疫賦活作用を示すかどうかは明らかではない。また、このような合成ＲＮＡオリゴマーが、生体内において具体的にどの程度有効な免疫賦活効果を示すかについては、当該文献には一切開示されていない。
　また、特許文献２は、免疫賦活作用を有する、ある特定の塩基配列を有するオリゴデオキシヌクレオチドの技術を開示している。しかしながら、特許文献２においては、実施例において、ビフィドバクテリウム属細菌のゲノムＤＮＡについてのマイトジェン活性、すなわち、細胞の分裂促進活性の検討結果が開示されているのみであり、直接免疫賦活作用の有無について実験した結果については一切開示されていない。
　ところで、乳酸菌の保健効果については、整腸作用、発ガンリスクの低減作用、アトピー性皮膚炎の予防、アレルギー低減作用、生体防御機構、血中コレステロール低減作用、血圧降下作用等がこれまでの研究で報告されている（非特許文献１～５）。また、経口摂取された乳酸菌は腸管内でパイエル板（Ｐｅｙｅｒ’ｓ　ｐａｔｃｈ：ＰＰ）から取り込まれ、ＰＰに配備されているマクロファージや樹状細胞等に貪食される。これにより免疫細胞が活性化し、自然免疫が賦活化すると考えられている。また、乳酸菌はＴＬＲによって認識されるという報告もあり（非特許文献６）、乳酸菌はＴＬＲシグナルを介してマクロファージや樹状細胞の機能を調整すると考えられている。したがって、乳酸菌の有効成分の同定は、特定のサイトカイン産生を調整する薬剤の開発につながり、医療の分野にも利用できる可能性がある。しかしながら、乳酸菌における、免疫調整作用やサイトカインの産生を調整する作用の本体となる物質の詳細については、いまだ明らかになっていない。
特開２００６－８３１８４号公報 特開２００６－２２３１１０号公報
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ、２００４年、１６巻、１８８－１９４ページ Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｕｒｏｌｏｇｙ、２００１年、１６６巻、２５０６－２５１１ページ Ｆｏｏｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、２００２年、４５巻、１４号、４９－５４ページ 新薬と臨牀、２００４年、５３巻、３号、２９８－３０８ページ Ｔｈｅ　Ｆｏｏｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、２００１年、４４巻、４号、２６－３３ページ Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３年３月、１０巻、２号、２５９－２６６ページ
　本発明は、上記実状を鑑みて成し遂げられたものであり、その目的は、乳酸菌における、免疫調整作用やサイトカインの産生を調整する作用の本体となる物質を同定し、当該物質を利用して、免疫調整作用を有する組成物、及びサイトカイン産生を調整する作用を有する組成物を提供することにある。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、乳酸菌由来のＲＮＡがＴＬＲ７やＭｙｄ８８等を介して、ＩＬ－１２等の産生を促進させること、またはＴＮＦ－αの産生を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする、免疫調整作用を有する組成物。
（２）乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする、サイトカイン産生を調整する作用を有する組成物。
（３）ＩＬ－１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－６、および、ＩＬ－１αからなる群から選択される少なくとも一のサイトカインの産生を促進する作用を有する（２）に記載の組成物。
（４）前記ＩＬ－１２がＩＬ－１２ｐ４０である、（３）に記載の組成物。
（５）ＴＮＦ－αの産生を抑制する作用を有する（２）に記載の組成物。
（６）ＴＬＲ７およびＭｙｄ８８からなる群から選択される少なくとも一の生体分子に依存的な免疫調整作用またはサイトカイン産生を調整する作用を有する（１）～（５）のうちのいずれかに記載の組成物。
（７）前記ＲＮＡが一本鎖ＲＮＡである、（１）～（６）のうちのいずれかに記載の組成物。
（８）前記乳酸菌が、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、および、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する乳酸菌からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌である、（１）～（７）のうちのいずれに記載の組成物。
（９）前記乳酸菌が乳酸球菌である、（１）～（８）のうちのいずれかに記載の組成物。
（１０）前記乳酸菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）である、（１）～（９）のうちのいずれかに記載の組成物。
（１１）経口摂取用組成物である、（１）～（１０）のうちのいずれかに記載の組成物。
　本発明によれば、乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分として含むことにより、生体内におけるＴＬＲ７やＭｙｄ８８に依存的なシグナリング等を活性化させ、ＩＬ－１２等の産生を促進させ、またはＴＮＦ－αの産生を抑制することができる。また、本発明によれば、生体の免疫機能を賦活化させ免疫機能低下を抑制し、生体に悪影響を及ぼすことなく、免疫機能の過度の亢進を抑制するため、免疫機能のバランスを調節することができる。さらに、本発明によれば、乳酸菌は古くから発酵乳等の発酵食品に含まれており食経験も長いため、安全性が高いと考えられる。
Ｊ７７４．１細胞のＥＣ－１２との培養の結果についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２の、ＤＮａｓｅ処理菌体、又は、ＲＮａｓｅ処理菌体のＪ７７４．１細胞との培養の結果についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２の、ＤＮａｓｅ処理及びＲＮａｓｅ処理菌体（ヌクレアーゼ処理菌体）のＪ７７４．１細胞との培養の結果についてまとめた棒グラフである。 Ｊ７７４．１細胞のＴＬＲ７・ＴＬＲ９シグナリングの阻害と、ＥＣ－１２との培養の結果についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２からの抽出核酸とＪ７７４．１細胞との培養の結果についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＪ７７４．１細胞へのリポフェクションの結果についてまとめた棒グラフである。 乳酸菌の各菌体のＩＬ－１２産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 Ｍｙｄ８８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４ノックアウトマウスにおける、乳酸菌の各菌体のＩＬ－１２産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 ＴＬＲ７ノックアウトマウスにおける、ＥＣ－１２のＩＬ－１２産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 乳酸菌の各菌体のＲＮＡ含有量と、ＩＬ－１２産生誘導能との相関を示す散布図である。 ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＣＣＬ２産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＣＣＬ５産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＣＣＬ７産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＣＸＣＬ１０産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＩＬ－６産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＩＬ－１α産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＴＮＦ－α産生誘導能についてまとめた棒グラフである。 ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＩＬ－１２産生誘導能についてまとめた棒グラフである。
　本発明は、乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする、免疫調整作用またはサイトカイン産生を調整する作用を有する組成物を提供する。
　本発明において、「乳酸菌」とは、乳酸発酵、すなわち、代謝により乳酸を生成する細菌類の総称を指す。
　本発明においては、前記乳酸菌として、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、および、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する乳酸菌からなる群より選択される少なくとも１種以上の乳酸菌を用いることができる。
　ここで、エンテロコッカス属に属する細菌としては、例えば、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）等が挙げられる。
　ラクトバシルス属に属する細菌としては、ラクトバシルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）等が挙げられる。
　ラクトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）等が挙げられる。
　ストレプトコッカス属に属する細菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が挙げられる。
　ペディオコッカス属に属する細菌としては、ペディオコッカス・ダムノーサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｄａｍｎｏｓｕｓ）等が挙げられる。
　ロイコノストック属に属する細菌としては、ロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。
　ビフィドバクテリウム属に属する細菌としては、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）等が挙げられる。
　本発明においては、前記乳酸菌が乳酸球菌であるという構成をとることができる。乳酸球菌としては、上述したエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトコッカス・クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス等が例示できるが、必ずしもこれらに限定されない。
　本発明においては、前記乳酸菌として、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）を用いることが好ましい。
　エンテロコッカス・フェカリスとしては、例えば、エンテロコッカス・フェカリス・ＥＣ－１２株、ＡＴＣＣ　１９４３３、ＡＴＣＣ　１４５０８、ＡＴＣＣ　２３６５５、ＩＦＯ　１６８０３、ＩＦＯ　１６８０４等の菌株またはその変異株が例示できる。有効成分として用いられる細菌としては、このうち、前記ＥＣ－１２株が最も好ましい。
　ここで「変異株」とは、特定の菌株に対し、当業者に周知の方法により当業者がその性質に変化を及ぼさない範囲で変異させたもの、あるいは、それと同等であると当業者が確認できるものを包含する意味である。
　なお、エンテロコッカス・フェカリス・ＥＣ－１２株（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＥＣ－１２）は、平成１７年（２００５年）２月２５日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５－５４６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０２８４である。
　本発明における「ＲＮＡ」は、天然もしくは非天然由来のものとすることができる。天然に存在する状態のＲＮＡは、一般に、特定のリボヌクレオシド単位の線状ポリマーであって、各リボヌクレオシド単位がプリンもしくはピリミジン塩基およびリボース糖で構成され、ヌクレオシド間がホスホジエステル結合によって連結されているものを意味する一種の核酸である。その際、「線状」とは、ＲＮＡの一次構造を指して言う。一般に、ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であるが、部分的に二本鎖のものも含むことができる。
　本発明の組成物の有効成分は、乳酸菌由来のＲＮＡであれば、特に限定されることはなく、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、部分的に二本鎖のものでもあってもよいが、これらの中では、生体内のＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）に認識されるという観点から、一本鎖ＲＮＡであることが好ましい。乳酸菌は、古くから発酵乳等の発酵食品に含まれており食経験も長いため、乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分として含む本発明の組成物は、安全性が高いと考えられる。なお、乳酸菌については１種類のみを用いてもよいし、２種類以上の乳酸菌のＲＮＡを混合して用いてもよい。さらに、ＲＮＡについては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、その他のＲＮＡ等、ＲＮＡの種類を問わずいずれも用いることができる。
　有効成分として用いられる乳酸菌のＲＮＡの製造方法は、従来から用いられている方法を採用することができる。乳酸菌のＲＮＡの製造方法としては、例えば、核酸合成法等により合成する方法を採用してもよいし、既存の核酸供給源（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）から得る方法を採用してもよい。また、乳酸菌のＲＮＡの製造方法としては、フェノール法やスピンカラム、ガラスフィルター、イオン交換を利用する方法等が例示できるが、特にこれらの方法に限定されるものではない。
　本発明における「免疫調整作用」とは、本発明の組成物を摂取した生体の免疫機能を賦活化させて免疫機能の低下を抑制することのみならず、アレルギー反応のような過度に亢進した免疫機能を抑制し、ひいては免疫機能のバランスを調整する作用を意味する。
　また、本発明は、前記乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする、サイトカイン産生を調整する作用を有する組成物をも提供する。本発明における、「サイトカイン産生を調整する作用」としては、例えば、ＩＬ－１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－６、および、ＩＬ－１αからなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質の産生を促進するだけではなく、ＴＮＦ－αの産生を抑制する作用が挙げられる。
　本発明において、ＩＬ－１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２）は、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－１２ｐ４０、及び、これらからなるヘテロダイマー、ＩＬ－１２ｐ７０であってもよいが、これらの中では、ＩＬ－１２ｐ４０が好ましい。また、ヒト由来の典型的なＩＬ－１２ｐ３５としては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００８７３．２（ＮＭ＿０００８８２．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒト由来の典型的なＩＬ－１２ｐ４０としては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿００２１７８．２（ＮＭ＿００２１８７．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　また、本発明において、ＣＣＬ２（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ－Ｃ　ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ２）は、ヒト由来の典型例として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿００２９７３．１（ＮＭ＿００２９８２．３）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　さらに、本発明において、ＣＣＬ５（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ－Ｃ　ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ５）は、ヒト由来の典型例として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿００２９７６．２（ＮＭ＿００２９８５．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　また、本発明において、ＣＣＬ７（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ－Ｃ　ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ７）は、ヒト由来の典型例として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿００６２６４．２（ＮＭ＿００６２７３．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　さらに、本発明において、ＣＸＣＬ１０（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ－Ｘ－Ｃ　ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１０）は、ヒト由来の典型例として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１５５６．２（ＮＭ＿００１５６５．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　また、本発明において、ＩＬ－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６、またはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｂｅｔａ２とも称される。）は、ヒト由来の典型例として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００５９１．１（ＮＭ＿０００６００．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　さらに、本発明において、ＩＬ－１α（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１　ａｌｐｈａ）は、ヒト由来の典型例として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００５６６．３（ＮＭ＿０００５７５．３）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　また、本発明において、ＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ）は、ヒト由来の典型例として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００５８５．２（ＮＭ＿０００５９４．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明において、ＩＬ－１２等やＴＮＦ－αといったサイトカインには、このような天然の変異体も含まれる。
　なお、本発明において、ＩＬ－１２等やＴＮＦ－αといったサイトカインの産生とは、タンパク質自体の産生のみならず、各タンパク質をコードする遺伝子の発現を含むものである。
　また、本発明において、前記免疫調整作用またはサイトカイン産生を調整する作用は、ＴＬＲ７およびＭｙｄ８８からなる群から選択される少なくとも一の生体分子に依存的な作用であることが好ましい。
　ＴＬＲ７は、マクロファージや樹状細胞が外来微生物を認識するための受容体、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）の１種であり、細胞内エンドソームに発現し、ウィルス由来の一本鎖ＲＮＡ等を認識する受容体である。また、Ｍｙｄ８８（ｍｙｅｌｏｉｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｇｅｎｅ　（８８））は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３は除く）が各々のリガンド（ＴＬＲ７におけるウィルス由来の一本鎖ＲＮＡ等）を認識すると、該受容体の細胞質内のＴＩＲドメインに結合し、ＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫの活性化を誘導するアダプタータンパク質である。
　本発明において、ＴＬＲ７は、ヒト由来の典型例として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿０５７６４６．１（ＮＭ＿０１６５６２．３）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。また、Ｍｙｄ８８は、ヒト由来の典型例として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿００２４５９．２（ＮＭ＿００２４６８．４）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明において、ＴＬＲ７やＭｙｄ８８には、このような天然の変異体も含まれる。
　本発明の組成物の有効摂取量は、ＲＮＡ換算で１μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日である。したがって、本発明の組成物における乳酸菌の含有量は、乳酸菌を乾物換算で、１日当り１～１００００ｍｇ摂取できるように含むことが好ましく、１０～１０００ｍｇ摂取できるように含むことがより好ましい。
　本発明の組成物は、整腸作用、発ガンリスクの低減作用、アトピー性皮膚炎の予防、アレルギー低減作用、感染防御効果等に効果を発揮する。
　本発明の組成物は、経口摂取用組成物として好適に用いることができる。本発明の経口摂取用組成物としては、上記乳酸菌由来のＲＮＡをそのまま用いることも、あるいは上記乳酸菌の形でそのまま用いることもできるし、更に賦形剤、甘味料、香料、着色料等を添加して顆粒状、錠剤、カプセル剤等の内服用剤型に加工したものを用いることもできる。製剤化にあたっては、製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤等の添加剤を使用できる。また、製剤化に際し、目的の細胞への送達及び取り込みに適するように、カチオン性リポソームなど正電荷を持つキャリアーとの複合体を形成させてもよい。
　本発明の経口摂取用組成物の具体的な形態としては、特に限定されず、例えば、一般食品、菓子類、ゼリー、グミ、キャンディー、ガム、スナック菓子、焼き菓子、レトルト食品、インスタント食品、栄養補助食品、飲料、シート状食品、チュアブル、ゼリー飲料（チュアパック）、練り製品、おかゆ、佃煮等に加工されたもの等が挙げられる。もっとも、具体例としてはこれらに限定されることはない。
　以下、実施例及び試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
　（試験例１）　Ｊ７７４．１細胞とＥＣ－１２との共培養
　＜マウス由来マクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の維持＞
　マウス由来マクロファージ様細胞株であるＪ７７４．１細胞株の維持は、５％ＣＯ２、３７℃の条件下の５％量のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ－グルタミン含有：ナカライテスク株式会社製）中で行った。細胞が８０％コンフルエントに達した時点で、２．５ｇ／Ｌ　トリプシン‐１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）溶液（ナカライテスク株式会社製）で５分間処理後、セルスクレーパー（ＩＷＡＫＩ社製）で細胞を剥離し、継代を行った。
　＜添加用ＥＣ－１２の調製＞
　乳酸菌として、殺菌乳酸菌体ＥＣ－１２（コンビ株式会社製）を、５％ＦＣＳ　ＲＰＭＩ１６４０培地に１０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、確実に分散するようＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ　ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ（Ｔｏｍｙ社製）で出力３、破砕３０秒、休止３０秒のインターバルを５反復、計２分３０秒間氷上で超音波処理した。超音波処理後、５％ＦＣＳ　ＲＰＭＩ１６４０培地で菌体懸濁液を３段階に連続希釈し（１０倍、１０倍、５倍）、２０μｇ／ｍＬに調製後、培養に供した。
　＜Ｊ７７４．１細胞のＥＣ－１２との培養＞
　前記の通りに調製し、８０％コンフルエントに達したＪ７７４．１細胞を、０．１Ｍ　ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、２．５ｇ／Ｌ　トリプシン‐１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液で５分間処理した。処理後、セルスクレーパーで培養器から細胞を剥がして得られた細胞懸濁液を１，０００ｒｐｍ（１７０ｇ）、室温で５分間遠心した。集積して得られた細胞を５％ＦＣＳ　ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞数を測定して、細胞数を５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬに調製した。調製した細胞懸濁液を細胞培養用９６ウェルプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ：住友ベークライト株式会社製）に１００μＬ／ウェル（５×１０４ｃｅｌｌ）ずつ播種し、細胞が接着するまで５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４時間前培養した。
　培養後、前記の通りに調製した添加用ＥＣ－１２（２０μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつ加え、ＥＣ－１２の終濃度を１０μｇ／ｍＬとした。対照として、ＥＣ－１２無添加の基礎培地で培養したＪ７７４．１細胞を使用した。全ての実験の培養時間は２０時間とし、実験処理、対照のウェルは３連で行った。
　＜２０時間培養後の細胞からのＲＮＡ抽出＞
　細胞からの全ＲＮＡ抽出には、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ　ＲＮＡ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌ　ＨＣ　ｋｉｔ　Ｓ（富士フイルム株式会社製）を用いた。キット添付のＬＲＰ溶液（１ｍＬあたり１０μＬの２－メルカプトエタノール添加済み）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、５ｍｍジルコニアビーズ入りのスクリューキャップチューブに移し、ＦａｓｔＰｒｅｐ　ＦＰ１２０（フナコシ株式会社製）を用いて、速度４．０、４０秒間で細胞破砕を行った。抽出キット添付のＳＲＰ溶液を１５μＬ加え、１５秒間ボルテックスした後、９９．５％エタノールを５０μＬ加え、１分間ボルテックスした。その後の処理は、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ－Ｍｉｎｉ８０を用い、キット添付のプロトコルに準拠した。ＤＮａｓｅ処理には、ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、キット添付のプロトコール通り、オンカラム法にて行った。
　＜ｃＤＮＡの合成＞
　抽出したＲＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。すなわち、全ＲＮＡ１５０ｎｇを鋳型として用い、逆転写プライマーとしてキット添付のＯｌｉｇｏ　ｄＴ　Ｐｒｉｍｅｒ及びＲａｎｄｏｍ　６　ｍｅｒｓを使用し、滅菌水（ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ）で全量を１０μＬにし、キット添付の説明書に準拠し、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
　＜ＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量の定量＞
　合成して得られたｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲを用いてＩＬ－１２ｐ４０遺伝子の発現量を測定した。リアルタイムＰＣＲには、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を用いた。反応液の組成は、鋳型ｃＤＮＡ２μＬ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ製）５μＬ、１００ｎＭ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｏｂｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｏｂｅ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ製）、２００ｎＭの各プライマーで全量１０μＬとした。反応は、９５℃：５分間の初期変性後、９５℃：１０秒間、６０℃：１０秒間、７２℃：１０秒間のサイクルを５０サイクルかけて行った。また、内部補正因子としてグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。プライマーはプローブファインダーソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ製）でデザインした。各プライマーの塩基配列及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｏｂｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｏｂｅナンバーを表１に示す。また、リアルタイムＰＣＲの結果の解析にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０　ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を用い、２ｎｄ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　Ｍａｘｉｍｕｍ法でＴｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）値を算出後、ΔΔＣｔ法による相対定量解析を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜ＩＬ－１２タンパク質の定量＞
　２０時間培養後の細胞培養上清中のＩＬ－１２タンパク質の濃度はＭｏｕｓｅ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定した。測定手順はキットのプロトコルに準拠した。
　このようにして得られたＪ７７４．１細胞とＥＣ－１２との培養の結果を図１に示す。なお、図１中ＡおよびＢはＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量を比較した棒グラフであり、ＣはＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０タンパク質産生量を比較したグラフである。また、図１においては、＊＊（アスタリスク２つ）は、ｐ＜０．０１であることを示す。
　図１に示した結果から明らかなように、ＥＣ－１２と培養したＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量（図１中Ａ及びＢにおける「ＥＣ－１２」）は、無添加のＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量（図１中Ａ及びＢにおける「ｍｅｄｉｕｍ」）に対して、１回目（図１中Ａ）は約６００倍、２回目（図１中Ｂ）は約１２００倍であった。また、ＥＣ－１２と培養したＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０タンパク質産生量（図１中Ｃにおける「ＥＣ－１２」）は、無添加のＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０タンパク質産生量（図１中Ｃにおける「ｍｅｄｉｕｍ」）に対して、約３５倍であった。
　これらの結果から、ＥＣ－１２との培養によって、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量、及び、ＩＬ－１２ｐ４０タンパク質産生量はいずれも有意に増加することが分かり（ｐ＜０．０１）、ＥＣ－１２によるマクロファージのＩＬ－１２産生誘導が確認された。
　（試験例２）　ＥＣ－１２のＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ処理（ヌクレアーゼ処理）、並びにその処理菌体とＪ７７４．１細胞との培養
　＜添加用ＥＣ－１２の調製＞に記載した通りに、５％ＦＣＳ　ＲＰＭＩ１６４０培地に分散させたＥＣ－１２（１０ｍｇ／ｍＬ）を、２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｔａｋａｒａ社製）、又は０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ　Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で３７℃、３０分間処理した。処理後、各ヌクレアーゼ処理後のＥＣ－１２を前述の通りに３段階に希釈して、試験例１と同様にしてＪ７７４．１細胞との培養を行った。
　また、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ処理のコントロールとして、ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ　０１１１：Ｂ４：シグマ社製）を使用した。５％ＦＣＳ　ＲＰＭＩ１６４０培地で１０μｇ／ｍＬに調製したＬＰＳをＥＣ－１２と同様にＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅで処理し、さらに５％ＦＣＳ　ＲＰＭＩ１６４０培地で０．６μｇ／ｍＬに希釈した後、これを１００μＬずつ加え、ＬＰＳの終濃度を０．３μｇ／ｍＬとした。
　そして、２０時間培養後の細胞におけるＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量、並びに培養上清中のＩＬ－１２タンパク質の濃度を、試験例１と同様にして測定した。得られた結果を図２に示す。なお、図２中Ａ及びＢはＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量を比較した棒グラフであり、図２中ＣはＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２タンパク質産生量を比較したグラフである（異符号（ａ～ｇ）間に有意差あり：ｐ＜０．０５）。また、図中の「ｍｅｄｉｕｍ」と記載された棒グラフは菌無添加のＪ７７４．１細胞の培養の結果を、「ＥＣ－１２」と記載された棒グラフはＥＣ－１２とＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ＬＰＳ」と記載された棒グラフはＬＰＳとＪ７７４．１細胞との培養の結果を、それぞれ示したグラフである。
　図２に示した結果から明らかなように、未処理のＥＣ－１２との培養によるＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量の平均値（図２中Ａ及びＢにおける「ＥＣ－１２」の白い棒グラフが示す値）を１００％として評価した際に、ＤＮａｓｅ処理したＥＣ－１２の添加で、１回目においては９４．１±２５．７％（図２中Ａにおける「ＥＣ－１２」の斜線の棒グラフが示す値）に、２回目においては６９．２±２４．４％（図２中Ｂにおける「ＥＣ－１２」の斜線の棒グラフが示す値）に遺伝子発現量が減少した。また、ＲＮａｓｅ処理したＥＣ－１２の添加で、１回目においては３３．８±１．２％（図２中Ａにおける「ＥＣ－１２」の黒い棒グラフが示す値）に、２回目においては３５．２±６．１％（図２中Ｂにおける「ＥＣ－１２」の黒い棒グラフが示す値）に遺伝子発現量が減少した。
　さらに、未処理のＥＣ－１２との培養によるＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０タンパク質産生量の平均値（図２Ｃ中の「ＥＣ－１２」の白い棒グラフが示す値）を１００％として評価した際に、ＤＮａｓｅ処理したＥＣ－１２の添加で、６８．４±５．０％（図２中Ｃにおける「ＥＣ－１２」の斜線の棒グラフが示す値）にタンパク質産生量が減少し、ＲＮａｓｅ処理したＥＣ－１２の添加で、５８．６±２．５％（図２中Ｃにおける「ＥＣ－１２」の黒い棒グラフが示す値）にタンパク質産生量が減少した。なお、コントロールとして使用したＬＰＳおいては、ＲＮａｓｅ処理したものと未処理との間で有意差はなかった。
　これらの結果から、ＥＣ－１２をＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅのいずれかで処理することにより、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量、ＩＬ－１２ｐ４０タンパク質産生量とも、未処理のＥＣ－１２添加時と比較して有意に減少し、特にＲＮａｓｅ処理時において顕著な減少がみられることが明らかになった。
　また、これらとは別に、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅの両方でＥＣ－１２を処理（ヌクレアーゼ処理）し、Ｊ７７４．１細胞との培養を行った。すなわち、５％ＦＣＳ　ＲＰＭＩ１６４０培地に分散させたＥＣ－１２（１０ｍｇ／ｍＬ）を２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｔａｋａｒａ社製）、及び０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ　Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の両方で３７℃、３０分間処理した。処理後、ＥＣ－１２サンプルを３段階希釈し、試験例１と同様にして、Ｊ７７４．１細胞との培養を行い、かかる細胞におけるＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量を測定した。得られた結果を図３に示す。図３中Ａ及びＢは、いずれもＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量を比較した棒グラフである（異符号間（ａ～ｂ）に有意差あり：ｐ＜０．０１）。また、図３中の「ｍｅｄｉｕｍ」と記載された棒グラフは無添加のＪ７７４．１細胞の培養の結果を、「ＥＣ－１２」と記載された棒グラフはＥＣ－１２とＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ヌクレアーゼ処理ＥＣ－１２」と記載された棒グラフはＤＮａｓｅ処理及びＲＮａｓｅ処理したＥＣ－１２とＪ７７４．１細胞との培養の結果を、それぞれ示したグラフである。
　図３に示した結果から明らかなように、未処理のＥＣ－１２との培養によるＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量の平均値（図３中Ａ及びＢ中における「ＥＣ－１２」の白い棒グラフが示す値）を１００％として評価した際に、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅの両方で処理したＥＣ－１２の添加で、１回目においては３．０±０．１％（図３中Ａにおける「ヌクレアーゼ処理ＥＣ－１２」の斜線の棒グラフが示す値）に、２回目においては２．１±０．２％（図３中Ｂにおける「ヌクレアーゼ処理ＥＣ－１２」の斜線の棒グラフが示す値）に遺伝子発現量が有意に減少した（ｐ＜０．０１）。
　かかる結果から、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅの両方で処理することにより、ＥＣ－１２の示すＩＬ－１２ｐ４０産生誘導能はほぼ消滅することが明らかになり、前述のＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅのいずれかで処理したＥＣ－１２を加した際に得られた結果と併せ、マクロファージのＩＬ－１２産生を誘導するＥＣ－１２の主成分は核酸、特にＲＮＡであることが示唆された。
　（試験例３）　ＴＬＲ７又はＴＬＲ９シグナリングの阻害下でのＪ７７４．１細胞とＥＣ－１２との培養
　ＴＬＲ７及びＴＬＲ９のアンタゴニストとして、ホスホロチオエート化（Ｓ化）した合成オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いた（Ｂａｒｒａｔ，Ｆ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００５，２０２（８）：１１３１－９　参照）。すなわち、ＴＬＲ７のアンタゴニストとしてＩＲＳ６６１、ＴＬＲ９のアンタゴニストとしてＩＲＳ８６９を使用した。また、ＴＬＲ７のアゴニストとしてＣＬ０９７（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）、ＴＬＲ９のアゴニストとしてホスホロチオエート化した合成ＯＤＮであるＩＳＳ１０１８を用いた。各合成ＯＤＮの配列は表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前述の２０時間の培養を開始する３０分前に、ＩＲＳ６６１を５．６μＭ、ＩＲＳ８６９を０．７μＭになるようそれぞれ培地に添加し、ＣＯ２インキュベータ内で培養した。その後、試験例１と同様にしてＥＣ－１２との培養を行った。また、ＩＳＳ１０１８を０．７μＭ、ＣＬ０９７を１μｇ／ｍＬとなるようそれぞれ培地に添加して２０時間培養したものをアンタゴニストの阻害確認用の対照とした。
　そして、前記アンタゴニスト又はアゴニストの存在下で培養した細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量、並びに培養上清中のＩＬ－１２ｐ４０タンパク質の濃度は試験例１と同様にして測定した。得られた結果を図４に示す。なお、図４中Ａ及びＢは、いずれもＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量を比較した棒グラフであり、図４中ＣはＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２タンパク質産生量を比較したグラフである（異符号（ａ～ｆ）間に有意差あり：ｐ＜０．０５）。また、図４のグラフにおいて、「Ｎ．Ｄ．」とは「Ｎｏ　Ｄａｔａ」、すなわち測定していないことを意味している。また、図中の「ｍｅｄｉｕｍ」と記載された棒グラフは菌無添加のＪ７７４．１細胞の培養の結果を、「ＥＣ－１２」と記載された棒グラフはＥＣ－１２とＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ＣＬ０９７（ＴＬＲ７アゴニスト）」と記載された棒グラフは、ＴＬＲ７アゴニストとＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ＩＳＳ１０１８（ＴＬＲ９アゴニスト）」と記載された棒グラフは、ＴＬＲ９アゴニストとＪ７７４．１細胞との培養の結果を、それぞれ示したグラフである。
　先ず、図４中Ａ～Ｃの「ＣＬ０９７（ＴＬＲ７アゴニスト）」と記載された３つの棒グラフ、及び「ＩＳＳ１０１８（ＴＬＲ９アゴニスト）」と記載された３つの棒グラフに示した結果から明らかなように、ＴＬＲ７アゴニスト及びＴＬＲ９アゴニストによるＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量、並びにタンパク質産生量は、ＴＬＲ７アンタゴニスト又はＴＬＲ９アンタゴニストの添加により有意に減少することが確認され（ｐ＜０．０５）、ＴＬＲ７アンタゴニスト及びＴＬＲ９アンタゴニストが適切にＴＬＲ７又はＴＬＲ９の各シグナリングを阻害していることが確認された。
　次に、図４中Ａ及びＢの「ＥＣ－１２」と記載された３つの棒グラフに示した結果から明らかなように、未処理のＥＣ－１２との培養によるＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量の平均値（図４中Ａ及びＢにおける「ＥＣ－１２」の白い棒グラフが示す値）を１００％として評価した際に、ＴＬＲ７アンタゴニストの添加で、１回目においては１６．０±１，０％（図４中Ａにおける「ＥＣ－１２」の斜線の棒グラフが示す値）に、２回目においては１１．５±２．４％（図４中Ｂにおける「ＥＣ－１２」の斜線の棒グラフが示す値）に遺伝子発現量が減少した。また、ＴＬＲ９アンタゴニストの添加で、１回目においては４３．７±６．０％（図４中Ａにおける「ＥＣ－１２」の横破線の棒グラフが示す値）に、２回目においては２５．４±４．８％（図４中Ｂにおける「ＥＣ－１２」の横破線の棒グラフが示す値）に遺伝子発現量が減少した。
　そして、図４中Ｃの「ＥＣ－１２」と記載された３つの棒グラフに示した結果から明らかなように、未処理のＥＣ－１２との培養によるＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２タンパク質産生量の平均値（図４中Ｃにおける「ＥＣ－１２」の白い棒グラフが示す値）を１００％として評価した際に、ＴＬＲ７アンタゴニストの添加で、５１．９±３．１％（図４中Ｃにおける「ＥＣ－１２」の斜線の棒グラフが示す値）にタンパク質産生量が減少し、ＴＬＲ９アンタゴニストの添加で、６３．９±６．５％（図４中Ｃにおける「ＥＣ－１２」の横破線の棒グラフ示す値）にタンパク質産生量が減少した。
　以上より、ＴＬＲ７アンタゴニスト又はＴＬＲ９アンタゴニストの添加により、ＥＣ－１２に誘導されるＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量は有意に減少することが明らかになった（ｐ＜０．０５）。また、ＴＬＲ９シグナリングを阻害した場合と比較すると、ＴＬＲ７シグナリングを阻害した場合の方が、ＥＣ－１２の示すＩＬ－１２ｐ４０産生誘導能の抑制は顕著であることも明らかになった。このことは、試験例２において示した、ＤＮａｓｅ処理したＥＣ－１２を添加した際のＩＬ－１２ｐ４０産生よりも、ＲＮａｓｅ処理したＥＣ－１２を添加した際のＩＬ－１２ｐ４０産生の方が低い値を示したことと一致し、Ｊ７７４．１細胞からＩＬ－１２産生を誘導するＥＣ－１２の有効成分が核酸、特にＲＮＡであることが強く示唆された。
　また、図２及び図４に示した結果から明らかなように、ＲＮａｓｅ処理したＥＣ－１２によるＩＬ－１２ｐ４０産生誘導能の低下率と、ＴＬＲ７シグナリングの阻害によるＩＬ－１２ｐ４０産生誘導能の低下率とは、遺伝子発現量、タンパク質産生量の両方でほぼ一致していた。
　（試験例４）　ＥＣ－１２からの核酸抽出、並びに抽出核酸とＪ７７４．１細胞との培養
　＜ＥＣ－１２からのＲＮＡ抽出＞
　ＥＣ－１２からのＲＮＡ抽出は、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ　ＲＮＡ　ｔｉｓｓｕｅ　ｋｉｔ　Ｓ　ＩＩ（富士フイルム株式会社製）を用いて行った。すなわち、ＥＣ－１２　１５０ｍｇにキット添付のＬＲＴ溶液（１ｍＬあたり１０μＬの２－メルカプトエタノール添加済み）を５００μＬ添加し、０．1ｍｍグラスビーズ入りのスクリューキャップチューブに移し、ＦａｓｔＰｒｅｐ　ＦＰ１２０（フナコシ株式会社製）を用いて、速度６．５、９０秒間ホモジナイズした。その後の操作は、キットの抽出プロトコルに準拠して行った。また、ＤＮａｓｅ処理には、ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、上記ｋｉｔ　Ｓ　ＩＩ添付のプロトコル通りオンカラム法にて行った。
　＜ＥＣ－１２からのＤＮＡ抽出＞
　ＥＣ－１２からのＤＮＡ抽出は、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ　ＤＮＡ　ｔｉｓｓｕｅ　ｋｉｔ　Ｓ（富士フイルム株式会社製）を用い、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅのアプリケーションガイドＮｏ．３８に準拠して行った。すなわち、ＥＣ－１２　１５０ｍｇにキット添付のＭＤＴ溶液を２５０μＬ添加し、０．1ｍｍグラスビーズ入りのスクリューキャップチューブに移し、ＦａｓｔＰｒｅｐ　ＦＰ１２０（フナコシ株式会社製）を用いて、速度６．５、９０秒間ホモジナイズした。その後、キット添付のＥＤＴ溶液を２５μＬ加え、５５℃で６０分間のインキュベートを行った。インキュベート後、１３，０００ｒｐｍ（１２，０００ｇ）、室温で１０分間遠心し、上清２００μＬを新しいマイクロチューブに分取し、ＲＮａｓｅ　Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を６０μＬ加え、室温で２分間インキュベートした。さらに、キット添付のＬＤＴ溶液を１８０μＬ加え、１５秒間ボルテックスした後、７０℃で１０分間インキュベートし、９９．５％エタノールを２４０μＬ加え、１５秒間ボルテックスした。その後の処理は、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ－Ｍｉｎｉ８０を用い、キット添付のプロトコルに準拠して行った。
　抽出後、ＲＮＡ、ＤＮＡをそれぞれ５％ＦＣＳ　ＲＰＭＩ１６４０培地に混合し、ＲＮＡは５．６ｎｇ／μＬ、ＤＮＡは４．６ｎｇ／μｇとなるよう培地に添加し、Ｊ７７４．１細胞との培養を行った。培養後の細胞におけるＩＬ－１２ｐ４０遺伝子の発現定量は試験例１と同様にして行った。得られた結果を図５に示す。なお、図５中のＡ及びＢは、いずれもＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量を比較した棒グラフである（異符号（ａ～ｂ）間に有意差あり：ｐ＜０．０１）。また、図５中の「ｍｅｄｉｕｍ」と記載された棒グラフは無添加のＪ７７４．１細胞の培養の結果を、「ＤＮＡ」と記載された棒グラフは抽出されたＥＣ－１２のＤＮＡとＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ＤＮａｓｅ処理ＤＮＡ」と記載された棒グラフは、ＤＮａｓｅ処理されたＥＣ－１２のＤＮＡとＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ＲＮＡ」と記載された棒グラフは抽出されたＥＣ－１２のＲＮＡとＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ＲＮａｓｅ処理ＲＮＡ」と記載された棒グラフは、ＲＮａｓｅ処理されたＥＣ－１２のＲＮＡとＪ７７４．１細胞との培養の結果を、それぞれ示したグラフである。
　図５中の「ｍｅｄｉｕｍ」の棒グラフ及び「ＤＮＡ」の棒グラフに示した結果から明らかなように、ＥＣ－１２から抽出したＤＮＡの添加によって、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量は無添加に対して、１回目においては約１３００倍（図５中Ａ）、２回目においては約９００倍（図５中Ｂ）に増加することが確認された。また、「ＤＮａｓｅ処理ＤＮＡ」の棒グラフに示した結果から明らかなように、ＤＮＡをＤＮａｓｅ処理することによって、ＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量の亢進が見られなくなることも確認された。
　一方、「ｍｅｄｉｕｍ」の棒グラフと「ＲＮＡ」の棒グラフとの比較から、ＥＣ－１２から抽出したＲＮＡの添加では、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量の変化は見られず、また、「ＲＮａｓｅ処理ＲＮＡ」の棒グラフに示した結果においても、ＲＮＡをＲＮａｓｅ処理しても同様に変化は見られないことが明らかになった。
　以上の結果から、Ｊ７７４．１細胞が間違いなくＤＮＡを抗原として認識していたことが確認された。しかし一方で、ＥＣ－１２から抽出したＲＮＡを添加しても、Ｊ７７４．１細胞からのＩＬ－１２ｐ４０産生はほとんど変化しなかった。これは、ＴＬＲ７とＴＬＲ９が細胞内エンドソームに発現している（Ｎｉｓｈｉｙａ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５，４；２８０（４４）：３７１０７－１７、及び、Ｌｅｉｆｅｒ，Ｃ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７３（２）：１１７９－８３　参照）ことを考慮すると、遊離のＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子がＴＬＲ７とＴＬＲ９に認識されるためには、細胞内に取り込まれる必要があると考えられる。マクロファージは細菌由来のＤＮＡを、スカベンジャー受容体を介して取り込むという報告はあるが（Ｚｈｕ，Ｆ．Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．　２００１，１０３（２）：２２６－３４　参照）、ＲＮＡを取り込む機構の報告はまだない。遊離のＤＮＡはスカベンジャー受容体を介して細胞内に取り込まれ、ＴＬＲ９に認識されたと推測できるが、マクロファージにはＲＮＡを取り込む機構が存在しないため、遊離のＲＮＡは細胞に取り込まれず、抗原として認識されなかった可能性が示唆される。
　（実施例１）　ＥＣ－１２由来ＲＮＡのＪ７７４．１細胞へのリポフェクション
　Ｊ７７４．１細胞は、遊離のＲＮＡの取り込みが無いものと判断したので、ＲＮＡを細胞内に導入するため、リポフェクションを行った。リポフェクションにはＦｕＧＥＮＥ　ＨＤ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を用いた。試験例４と同様にしてＥＣ－１２から抽出、調製した全ＲＮＡを無血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）で２０μｇ／μＬに調製後、ＦｕＧＥＮＥ　ＨＤ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔを６μＬ添加し、１０分間反応させ、ＦｕＧＥＮＥ／ＲＮＡ複合体を形成させた。この複合体を細胞数０．５×１０５ｃｅｌｌあたり５μＬ滴下し、２０時間培養した。また、ＥＣ－１２由来の全ＲＮＡ（５０μｇ／μＬ）を０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ　Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で処理したものも同様の方法でリポフェクションを行った。さらに、ＴＬＲ７シグナリングを阻害したＪ７７４．１細胞を試験例３と同様にして調製し、調製して得られた細胞にも同様の方法でリポフェクションを行った。
　また、これらの細胞における、ＩＬ－１２ｐ４０遺伝子の発現量、並びに培養上清中のＩＬ－１２タンパク質の濃度は、試験例１と同様にして測定した。得られた結果を図６に示す。なお、図６中Ａ及びＢは、いずれもＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量を比較した棒グラフであり、図６中ＣはＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０タンパク質産生量を比較したグラフである（異符号（ａ～ｂ）間に有意差あり：ｐ＜０．０１）。グラフ中の「Ｎ．Ｄ．」とは「Ｎｏｔ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ」、すなわち検出できなかったことを意味している。また、図中の「ｍｅｄｉｕｍ」と記載された棒グラフは無添加のＪ７７４．１細胞の培養の結果を、「ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ」と記載された棒グラフはリポフェクション試薬とＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ＥＣ－１２　ＲＮＡ　ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ」と記載された棒グラフは、リポフェクションを行ったＥＣ－１２のＲＮＡとＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ＲＮａｓｅ処理　ＥＣ－１２　ＲＮＡ　ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ」と記載された棒グラフは、ＲＮａｓｅ処理後にリポフェクションを行ったＥＣ－１２のＲＮＡとＪ７７４．１細胞との培養の結果を、「ＴＬＲ７アンタゴニスト　ＥＣ－１２　ＲＮＡ　ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ」と記載された棒グラフは、リポフェクションを行ったＥＣ－１２のＲＮＡとＴＬＲ７シグナリングを阻害したＪ７７４．１細胞との培養の結果を、それぞれ示したグラフである。
　図６中、「ｍｅｄｉｕｍ」の棒グラフと「ＥＣ－１２　ＲＮＡ　ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ」の棒グラフに示した結果から、ＥＣ－１２から抽出したＲＮＡのリポフェクションによって、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量は無添加に対して、１回目においては約６００倍（図６中Ａ）、２回目においては約８００倍（図６中Ｂ）に増加し、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０タンパク質産生量は無添加に対して、約１５倍（図中６Ｃ）に増加することが明らかになった。
　また、図６中、「ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ」の棒グラフと「ＥＣ－１２　ＲＮＡ　ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ」の棒グラフとの比較から、ＥＣ－１２から抽出したＲＮＡのリポフェクションによって、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現量は、リポフェクション試薬のみを作用させた細胞に対して、１回目においては約４００倍（図６中Ａ）、２回目においては約４００倍（図６中Ｂ）に増加し、ＥＣ－１２由来のＲＮＡによって、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２タンパク質産生量は、無添加に対して約８倍（図６中Ｃ）に増加することが明らかになった。
　さらに、「ＲＮａｓｅ処理　ＥＣ－１２　ＲＮＡ　ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ」の棒グラフ及び「ＴＬＲ７アンタゴニスト　ＥＣ－１２　ＲＮＡ　ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ」の棒グラフに示した結果から、ＥＣ－１２由来ＲＮＡをリポフェクションすることによるＪ７７４．１細胞のＩＬ－１２ｐ４０遺伝子発現誘導は、ＲＮＡのＲＮａｓｅ処理、又はＪ７７４．１細胞のＴＬＲ７シグナルの阻害によってほぼ消滅したことが分かる。
　これらの結果から、Ｊ７７４．１細胞は細胞内でＲＮＡを抗原として認識していたことが明らかになった（図６）。また、ＴＬＲ７シグナリングを阻害した細胞へのＲＮＡの導入がＩＬ－１２ｐ４０産生を誘導しなかったことから、ＥＣ－１２由来のＲＮＡは細胞内のＴＬＲ７に認識され遺伝子発現を誘導していることが示唆された。従って、ＥＣ－１２が細胞内に取り込まれた後に、細胞内のＴＬＲ７によってＥＣ－１２中のＲＮＡが抗原として認識されることが考えられる。
　また、ＴＬＲ７が認識するリガンドは一般的に、ウィルス由来の一本鎖ＲＮＡとされているが（Ｌｕｎｄ，Ｊ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００４，１０１（１５）：５５９８－６０３　参照）、かかる結果から、細菌由来のＲＮＡがＴＬＲ７に認識されることが初めて明らかになった。
　（試験例５）　ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ処理された各菌との培養による、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２産生誘導能の変化
　各菌体（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＥＣ－１２株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ（株違い）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）にＲＮａｓｅ処理（０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で３７℃、３０分）、又はＤＮａｓｅ処理（２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅＩ（ＴａＫａＲａ社製）で３７℃，３０分）したものを調製し、実験に供した。
　調製した菌体、ＲＮａｓｅ処理菌体、ＤＮａｓｅ処理菌体を終濃度１０μｇ／ｍｌで、Ｊ７７４．１細胞に感作させＩＬ－１２タンパク質の濃度を測定した。又、対照として無感作のＪ７７４．１細胞についても同様にタンパク質濃度の測定を行った。なお、培養上清中のＩＬ－１２タンパク質の濃度は試験例１と同様にして測定し、各菌体におけるＩＬ－１２産生誘導は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＥＣ－１２の未処理の結果の値を１．００（基準値）とした相対値として表した。得られた結果を図７に示す。なお、図７は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＥＣ－１２株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ（株違い）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍの各菌体のＩＬ－１２産生誘導能について、未処理の菌体（上段の白い棒グラフ）、ＲＮａｓｅ処理後の菌体（中段の黒い棒グラフ）、ＤＮａｓｅ処理後の菌体（下段の斜線の棒グラフ）を用いた際の結果がそれぞれ示されている。また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅについてはそれぞれ２例ずつ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓについては３例ずつ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍについてはそれぞれ４例ずつ結果が示されているが、これらはそれぞれ、同種かつ株違いの菌における結果である。
　図７に示した結果から明らかなように、乳酸球菌であるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓについては、未処理の菌体を用いた際の値及びＤＮａｓｅ処理後の菌体を用いた際の値との間にはほぼ差が見られなかった。これに対し、ＲＮａｓｅ処理後の菌体を用いた際の値が、未処理の菌体又はＤＮａｓｅ処理後の菌体を用いた際の値と比較して、２分の１～３０分の１と顕著に低下していることが明らかになった。これは、ＲＮａｓｅ処理することで乳酸球菌のＩＬ－１２産生誘導能が顕著に低下することを示している。特に、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを用いた場合には、複数例の株において同様の結果が得られた。
　また、乳酸桿菌であるＬ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓについては、株間には差があるものの、ＲＮａｓｅ処理後の菌体を用いた際の値が、未処理の菌体又はＤＮａｓｅ処理後の菌体を用いた際の値と比較して概ね低下していることも明らかになった。特にＬ．ｃａｓｅｉを用いた場合には、株違いである２例ともＲＮａｓｅ処理後の菌体を用いた際の値に顕著な低下がみられたのに対し、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍを用いた場合には、特に上から３例目においてＲＮａｓｅ処理後の菌体を用いた際の値に顕著な低下がみられた。これは、乳酸菌として乳酸桿菌を用いた場合では、菌種間及び株間の差はあるものの、概ねＲＮａｓｅ処理することでＩＬ－１２産生誘導能が顕著に低下することを示している。
　なお、ビフィドバクテリウム属に属する菌においては、今回検討した４種の菌種においてはＲＮａｓｅ処理によるＩＬ－１２産生量の低下は認められなかった。
　このように、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ等の乳酸菌類を、ＲＮａｓｅで処理することにより、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２産生誘導能が、未処理の菌体添加時と比較して顕著に減少することから、ＥＣ－１２由来のＲＮＡのみならず、乳酸菌由来のＲＮＡによっても、Ｊ７７４．１細胞のＩＬ－１２産生誘導能が亢進されることが明らかになった。
　（試験例６）　ノックアウトマウスを用いた解析
　前述の、乳酸菌由来のＲＮＡによるＩＬ－１２産生誘導機構を特定するために、Ｍｙｄ８８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４ノックアウトマウスの脾臓細胞を単離し、表３に示した乳酸菌株（ＥＣ－１２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　５株及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　５株）を用いて、評価を行なった。また、ＴＬＲ７ノックアウトマウスの脾臓細胞を単離し、ＥＣ－１２を用いて、評価を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　なお、各ノックアウトマウスからの脾臓細胞の単離及び培養、及びその培養上清におけるＩＬ－１２タンパク質量の測定、並びに各脾臓細胞に添加した乳酸菌の調製は下記の通りに行った。
　＜ノックアウトマウス＞
　本試験例においては、Ｃ５７ＢＬ/６系統の１０週齢の、ＴＬＲ２－、ＴＬＲ４－、ＴＬＲ７－、Ｍｙｄ８８－欠損マウス、及び、野生型マウスを用いた。なお、野生型マウスは日本ＳＬＣ株式会社から購入したマウスを用いた。また、ＴＬＲ２－、ＴＬＲ４－、ＴＬＲ７－、Ｍｙｄ８８－欠損マウスは株式会社オリエンタルバイオサービスから得たものを基に、ＳＰＦ動物施設内（特定の病原微生物の非存在下）で繁殖させたマウスを用いた。そして、これら全てのマウスには、げっ歯類用食（製品名：ラボＭＲストック、日本農産工業株式会社製）及び水を不断に与えて飼育した。また、これらマウスを用いた実験は、京都府立大学動物実験委員会の実験動物を用いた研究についてのガイドラインに従って行った。
　＜脾臓細胞の調製＞
　ペントバルビタールナトリウム（シェリング・プラウ株式会社製）３０μｌを腹腔内に注射することにより、マウスを麻酔し、続いて放血させた。かかるマウスの腹部を切開した後、脾臓を摘出し、氷冷したハンク平衡塩溶液に浸けた。そして、摘出した脾臓から、脾臓細胞を７０μｍセルストレーナー（ＢＤファルコン社製）を用いて単離した。さらに、単離した脾臓細胞にＡＣＫ溶解溶液（０．１５Ｍ　ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ　ＫＨＣＯ３、及び０．１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を加え、赤血球を溶解させた。このように処理した脾臓細胞を、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、細胞培養用培地（１０％ウシ胎仔血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁した。なお、解析には、遺伝的背景が同一のマウス３匹から単離した脾臓細胞を溜めて用いた。また、コントロールとして、前記ノックアウトマウス以外に野生型マウスからも脾臓細胞を同様に調製した。
　＜脾臓細胞の培養＞
　生細胞数をトリパンブルー色素排除法によって測定し、前記の通り調製した脾臓細胞を、９６穴培養プレート（Ｏｒａｎｇｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各穴に１×１０６個（細胞培養用培地１００μｌ）ずつ播種した。そして、１００μｌの細胞培養用培地に懸濁した２０μｇ（湿重量）の生菌又は加熱殺菌処理した菌を各穴に添加し、脾臓細胞と乳酸菌とを２０時間、加湿５％ＣＯ２培養器内にて共培養した。なお、乳酸菌と脾臓細胞との共培養は３連穴で行った。
　＜ＩＬ－１２ｐ７０の定量＞
　前記培養後、培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ－１２タンパク質の濃度は、マウスＩＬ－１２ｐ７０用ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ）　ＥＬＩＳＡ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、使用説明書に従って測定した。
　＜添加用乳酸菌の調製＞
　ラクトバシルス５株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　ＪＣＭ１１３２，　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ｓｔｒａｉｎ　ＪＣＭ１１３４，　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ　ｓｔｒａｉｎ　ＪＣＭ５３４４，　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ｓｔｒａｉｎ　ＪＣＭ１１４９　ａｎｄ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　ＡＴＣＣ５３１０３）、及び、エンテロコッカス５株（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ　ｓｔｒａｉｎ　ＪＣＭ８７１４，　Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ　ｓｔｒａｉｎ　ＪＣＭ８７２７，　Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　ＡＴＣＣ１４５０８，　Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　ＡＴＣＣ１９４３３　ａｎｄ　Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　ＡＴＣＣ２３６５５）は、ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、又はＪＣＭ（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室、ｔｈｅ　Ｊａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）から各々得た。また、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　ＥＣ－１２は、コンビ株式会社が保有しているものを用いた。そして、これらの乳酸菌は、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ　ＭＲＳ　ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いて、３７℃で２０時間培養した後、滅菌水で洗浄し、次いで９０００ｇで１０分間遠心をかけることにより、菌体を回収し、これを生菌として用いた。また、この菌体をサーモアルミバス（Ｉｗａｋｉ社製）内にて、９５℃で３０分間処理することにより、加熱殺菌処理した菌として調製した。
　上記の通り行った、Ｍｙｄ８８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４ノックアウトマウスについての解析結果は図８に示す。また、ＴＬＲ７ノックアウトマウスについての解析結果は図９に示す。なお、図８中、「Ｖｉａｂｌｅ」と記載された棒グラフは各ノックアウトマウス由来の脾臓細胞と生菌との共培養の結果を示し、「Ｈｅａｔ－ｋｉｌｌｅｄ」と記載された棒グラフは加熱殺菌処理した菌との共培養の結果を示す。また、図８中、黒い棒グラフは野生型マウスについての結果を、白い棒グラフはＭｙＤ８８－ノックアウトマウスについての結果を、斜線の棒グラフはＴＬＲ２ノックアウトマウスについての結果を、点の棒グラフはＴＬＲ４ノックアウトマウスについての結果を各々示す（同符号（ａ～ｇ）間に有意差あり：ｐ＜０．０５）。
　図８に示した結果から明らかなように、Ｍｙｄ８８ノックアウトマウス以外の脾臓細胞では野生型マウスと同程度の量のＩＬ－１２ｐ７０が産生されたが、Ｍｙｄ８８ノックアウトマウス由来の脾臓細胞からはＩＬ－１２ｐ７０の産生がほとんど認められなかった。また、かかる傾向は、生菌と共培養した場合、加熱殺菌処理した菌と共培養した場合、どちらにおいても同様に確認された。
　また、図９に示した結果から明らかなように、ＴＬＲ７ノックアウトマウス由来の脾臓細胞からのＩＬ－１２ｐ７０の産生量は、野生型マウスのそれと比較して、９２．５％抑制されているものであった。したがって、ＥＣ－１２を始めとする乳酸菌はＴＬＲ２、ＴＬＲ４非依存的に、そして、ＴＬＲ７又はＭｙｄ８８依存的にＩＬ－１２産生を誘導していることが明らかになった。
　（実施例２）　ＲＮＡ含有量によるＩＬ－１２産生誘導能についての検討
　次に、ＩＬ－１２産生が菌株のＲＮＡ含有量に起因している可能性を検証した。すなわち、表４に示した各菌体１５０ｍｇから試験例４と同様にして処理して抽出した全ＲＮＡの量を、吸光度計（製品名：ＮａｎｏＤｒｏｐ、株式会社エル・エム・エス社製）にて測定した波長２６０ｎｍにおける吸光度の値を基に算出した。また得られた各全ＲＮＡを実施例１と同様にしてリポフェクション法により細胞に導入し、試験例６と同様にしてＩＬ－１２ｐ７０のタンパク質量を測定した。得られた結果を図１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図１０に示した結果から明らかなように、ＲＮＡ含有量は菌株ごとで異なるものの、ＩＬ－１２産生との相関は認められなかった。このことより、菌株間のＩＬ－１２産生の違いは単純に菌株のＲＮＡ含有量に起因するものでない可能性が高いことがわかった。
　（実施例３）　ＥＣ－１２由来ＲＮＡによるＩＬ－１２以外のサイトカイン・ケモカイン産生誘導能についての検討
　次に、ＥＣ－１２由来のＲＮＡが、ＩＬ－１２以外のサイトカイン・ケモカインの発現に与える影響を検討した。すなわち、先ず、実施例１と同様にして調製した、ＥＣ－１２由来の全ＲＮＡ及びそのＲＮａｓｅ処理物をＪ７７４．１細胞にリポフェクション法にて導入して培養した。次に、培養後の細胞から、試験例１と同様にしてＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによるサイトカイン・ケモカインアレイを用いて、ＥＣ－１２由来のＲＮＡの有無によって発現量が変化する可能性のある、ＩＬ－１２を除く１５遺伝子を選抜した。具体的には、以下の通りに行った。
　＜サイトカイン等の遺伝子発現量の網羅的な解析方法＞
　先ず、Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０を用いたリアルタイムＰＣＲ法により各試料に含まれるハウスキーピング遺伝子（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ：ＧＡＰＤＨ）の発現量を測定した。また、Ｇａｐｄｈに加え、Ｈｉｐｏｘａｎｔｉｎｅ－ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｈｐｒｔ）とβ－ａｃｔｉｎも合わせて測定し、ハウスキーピング遺伝子として必要に応じた補正のために用いた。プライマーの設計と使用するプローブの選出を、ロシュ・アプライド・サイエンス社のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｏｃｈｅ－ａｐｐｌｉｅｄ－ｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）上にて行った。そして、これらのプライマーを用いた反応は、Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０　Ｐｒｏｂｅ　Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）とＵｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｏｂｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ロシュ・アプライド・サイエンス社製）から選抜したＴａｑｍａｎプローブを用いて行った。具体的には、反応系として、Ｐｒｏｂｅ　Ｍａｓｔｅｒ　５μｌ、フォワードとリバースプライマー溶液（１０ｐＭ）をそれぞれ０．２μｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｏｂｅ（１０ｐＭ）溶液　０．１μｌ、滅菌蒸留水２．５μｌと鋳型ｃＤＮＡ　２μｌを加えた合計１０μｌを用意した。そして、９５℃で５分間の初期変性後に、９５℃で１０秒間、６０℃で２０秒間の温度サイクルをその反応系に５０回かけて増幅曲線を得た。増幅終了後は４０℃で３０秒間冷却した。Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ４８０（Ｒ）　ソフトウェア（ロシュ・アプライド・サイエンス社製）によって得られたＣｔ値をもとに、ＧＡＰＤＨの遺伝子発現量が等しくなるようそれぞれのｃＤＮＡ溶液を滅菌蒸留水で希釈した。
　そして、このように調製したｃＤＮＡ溶液を群ごとに一定量ずつプールし、サイトカイン等の遺伝子の発現量を網羅的に解析した。すなわち、表５～９に示したプライマーセットを用いて、前記ハウスキーピング遺伝子の発現量の測定と同様にしてリアルタイムＰＣＲ法を行い、各試料におけるサイトカイン等の遺伝子の発現量を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　かかる網羅的な解析によって選抜されたＩＬ－１２を除く１５遺伝子に対して更に個別の解析（リアルタイムＰＣＲ）を行い、ＲＮａｓｅ処理の有無によって発現量が有意に変動した遺伝子を更に選抜した。得られた結果は図１１～１７に示す。また、ＩＬ－１２についての結果も図１８に示す。なお、図１１～１８中の縦軸はβアクチンの発現量で標準化された各遺伝子の発現量を示し、「対照」と記載された棒グラフは、添加しない状態で培養された細胞の結果を示す。
　図１１～１８に示した結果から明らかなように、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－６、ＩＬ－１α、ＴＮＦ－αの遺伝子発現がＲＮａｓｅ処理により有意に変動し、ＴＮＦ－α以外の遺伝子はＲＮａｓｅ処理により発現が低下した。しかし、これらの減少量はＩＬ－１２遺伝子と比較すると小さいことから、ＩＬ－１２がＲＮａｓｓｅ処理により最も強く影響を受けるサイトカインであることが示された。また、その一方で、ＴＮＦ－αはＲＮａｓｅ処理により発現量が増加した。すなわち、乳酸菌由来のＲＮＡを細胞に導入することにより、ＩＬ－１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－６、及び、ＩＬ－１αの産生が促進され、ＴＮＦ－αの産生は抑制されることが明らかになった。
　以上説明したように、本発明によれば、乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分として含むことにより、生体内におけるＴＬＲ７やＭｙｄ８８に依存的なシグナリング等を活性化させ、ＩＬ－１２等の産生を促進させ、またはＴＮＦ－αの産生を抑制することができる。また、本発明によれば、生体の免疫機能を賦活化させ免疫機能低下を抑制し、生体に悪影響を及ぼすことなく、免疫機能の過度の亢進を抑制するため、免疫機能のバランスを調節することができる。さらに、本発明によれば、乳酸菌は古くから発酵乳等の発酵食品に含まれており食経験も長いため、安全性が高いと考えられる。
　したがって、本発明の組成物は、免疫機能を賦活化させ免疫機能低下を安全に抑制するという点に優れているため、整腸、発ガンリスクの低減、アトピー性皮膚炎の予防、アレルギー低減、感染防御等を目的とした経口摂取用組成物等として有用である。

Claims (11)

  1. 　乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする、免疫調整作用を有する組成物。
  2. 　乳酸菌由来のＲＮＡを有効成分とする、サイトカイン産生を調整する作用を有する組成物。
  3. 　ＩＬ－１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－６、および、ＩＬ－１αからなる群から選択される少なくとも一のサイトカインの産生を促進する作用を有する請求項２に記載の組成物。
  4. 　前記ＩＬ－１２がＩＬ－１２ｐ４０である、請求項３に記載の組成物。
  5. 　ＴＮＦ－αの産生を抑制する作用を有する請求項２に記載の組成物。
  6. 　ＴＬＲ７およびＭｙｄ８８からなる群から選択される少なくとも一の生体分子に依存的な免疫調整作用またはサイトカイン産生を調整する作用を有する請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の組成物。
  7. 　前記ＲＮＡが一本鎖ＲＮＡである、請求項１～６のうちのいずれか一項に記載の組成物。
  8. 　前記乳酸菌が、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、および、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する乳酸菌からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌である、請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の組成物。
  9. 　前記乳酸菌が乳酸球菌である、請求項１～８のうちのいずれか一項に記載の組成物。
  10. 　前記乳酸菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）である、請求項１～９のうちのいずれか一項に記載の組成物。
  11. 　経口摂取用組成物である、請求項１～１０のうちのいずれか一項に記載の組成物。
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