TW202003001A - 包含細菌菌株之組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含細菌菌株之組成物,其用於刺激免疫系統且治療及預防疾病。

Description

包含細菌菌株之組成物
本發明處於包含自哺乳動物消化道分離之細菌菌株之組成物及此等組成物治療疾病、尤其在疾病治療中刺激免疫系統之用途的領域中。
人類腸管據信在子宮內為無菌的,但在出生後即刻暴露於多種母體及環境微生物。此後,微生物定殖及演替之動態週期出現,該動態週期受如下因素影響:諸如遞送模式、環境、飲食及宿主基因型,所有該等因素尤其在早期生活期間影響腸道微生物區之組成。隨後,微生物區穩定且變得類似成人[1]。人類腸道微生物區含有超過500-1000種不同種系型,其基本上屬於兩個主要細菌門,擬桿菌門(Bacteroidete)及厚壁菌門(Firmicute)[2]。自人類腸道之細菌定殖產生之成功共生關係已得到廣泛多種代謝、結構、保護及其他有益功能。經定殖腸道之增強之代謝活性確保以其他方式不可消化之膳食組分隨著副產物之釋放而降解,為宿主提供重要營養物來源。類似地,腸道微生物區之免疫學重要性為公認的且在具有在引入共生細菌之後功能上重構之受損免疫系統之無菌動物中例示[3-5]。
微生物區組成之巨大變化在諸如炎性腸病(IBD)之胃腸病症中已有文獻記載。舉例而言,梭菌(Clostridium)群XIVa細菌之水準在IBD患者中降低,而大腸桿菌(E.coli)之數目增加,表明腸道內共生有機體與致病有機體之平衡的偏移[6-9]。令人感興趣地,此微生物生態失調亦與T效應細胞群體中之不平衡相關聯。
在某些細菌菌株對動物腸道可能具有之潛在正向作用之識別中,已 提議各種菌株用於治療各種疾病(參見例如[10-13])。亦已提議主要包括乳桿菌(Lactobacillus)及雙叉桿菌(Bifidobacterium)菌株之某些菌株用於治療與腸無直接關聯之各種炎性及自體免疫疾病(對於評述,參見[14]及[15])。已提出某些鏈球菌(Streptococcus)及範永氏球菌(Veillonella)菌株且在較小程度上腸球菌(Enterococcus)及乳桿菌菌株具有免疫調節作用,在試管內對不同細胞激素具有變化之作用,表明試管內用個別菌株獲得之資料不可能充分代表對活體內腸道微生物區群落之混合物之免疫反應[88]。然而,不同疾病與不同細菌菌株之間的關係及特定細菌菌株對腸道及在全身水準下以及對任何特定類型之疾病的確切作用不良特徵化。
在此項技術中需要治療疾病之新方法。亦需要特徵化腸道細菌之潛在作用以便可開發使用腸道細菌之新療法。
本發明者已開發包含鶉雞腸球菌(Enterococcus gallinarum)菌種之細菌菌株之新組成物,其可用於刺激免疫系統且治療及預防疾病。本發明者已鑑別鶉雞腸球菌菌種之菌株可強效地活化免疫系統且可治療癌症,指示其可能能夠亦治療免疫系統之活化可能有用之其他疾病。
本發明因此提供一種包含鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株之組成物,其用於刺激個體中之免疫系統。
在其他態樣中,本發明提供一種包含鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株之組成物,其用於治療、預防或延遲免疫衰老。
在其他態樣中,本發明提供一種包含鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株之組成物,其用作疫苗佐劑。
在其他態樣中,本發明提供一種包含鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株之組成物,其用於增強細胞療法,諸如CAR-T。
較佳地,本發明中所用之細菌為以登錄號42488寄存於NCIMB之菌株。
在其他較佳實施方案中,本發明中所用之細菌為以登錄號42761寄存於NCIMB之菌株。
圖1A:小鼠乳癌模型-腫瘤誘發後之腫瘤體積變化及指示在各時間點處每兩個處理之間的統計顯著性之表格。
圖1B:上圖:EMT6腫瘤中之壞死面積(未經處理n=6,媒劑n=6,MRx0518 n=8)。下圖:EMT6腫瘤中分裂細胞之百分比。P=0.019(未經處理n=4,計數之細胞總數=37201,媒劑n=6,計數之細胞總數=64297,MRx0518 n=6,計數之細胞總數=33539)。
圖1C:小鼠乳癌模型-浸潤性免疫細胞。散佈圖描繪來自各處理組之個別動物之不同免疫標誌物之細胞計數。
圖1D:小鼠乳癌模型-腫瘤溶解產物中之細胞激素產生。柱代表來自各處理組之總蛋白質之平均值pg/mL。*p<0.05,在組之間使用單因子ANOVA繼之以鄧奈特氏多重比較檢驗(Dunnett's multiple comparisons test)。
圖1E:小鼠乳癌模型-血漿中之細胞激素產生。柱代表來自各處理組之平均值pg/mL(+/- SEM)。
圖1F:用針對CD8α之抗體免疫標記(下圖)及用DAPI對比染色(上圖)之來自經媒劑、MRx0518及抗CTLA-4處理之小鼠之迴腸冷凍切片之代表性影像。
圖1G:定量自經媒劑、MRx0518或抗CTLA-4處理之小鼠之迴腸隱窩區獲取之每個視場具有超過3個CD8α+細胞之動物研究子組之圖。
圖2:小鼠肺癌模型-腫瘤誘發後之腫瘤體積變化及指示在各時間點 處每兩個處理之間的統計顯著性之表格。
圖3A:小鼠肝癌模型-肝重量。
圖3B:小鼠腎癌模型-腫瘤誘發後之腫瘤體積變化及指示在各時間點處每兩個處理之間的統計顯著性之表格。
圖4A:未成熟樹突狀細胞(無細菌)中之細胞激素水準(pg/mLmL)。
圖4B:添加LPS之後未成熟樹突狀細胞中之細胞激素水準(pg/mLmL)。
圖4C:添加MRx0518MRx0518之後未成熟樹突狀細胞中之細胞激素水準(pg/mLmL)。
圖4D:添加MRx0518MRx0518及LPS之後未成熟樹突狀細胞中之細胞激素水準(pg/mLmL)。
圖5A:THP-1細胞(無細菌)中之細胞激素水準。
圖5B:添加細菌沈積物之後THP-1細胞中之細胞激素水準。
圖5C:添加單獨或與LPS組合之MRx0518MRx0518之後THP-1細胞中之細胞激素水準。
圖6及圖7:免疫刺激反應-TNFα
圖8:免疫刺激反應-IL-12p70
圖9:免疫調節反應-IL-10
圖10:免疫刺激反應-IL-8
圖11:免疫刺激反應-IL-23
圖12:免疫刺激反應-IL-1β
圖13:免疫刺激反應-IL-6
圖14:作用機制-NFκB之活化
圖15:作用機制-TLR5之活化
圖16A:下文所述之實施例8中使用之不同組之處理時程之示意圖示。
圖16B:帶有由EMT-6細胞形成之腫瘤之小鼠中之平均腫瘤體積。小鼠未經處理或經YCFA媒劑(媒劑)、含MRx0518細菌之YCFA培養基(MRx0518)、抗CTLA-4抗體及YCFA培養基(抗CTLA-4)或MRx0518與抗CTLA-4抗體之組合處理。所提供之表格指示在各時間點處每兩個處理之間的統計顯著性。
圖17:小鼠乳癌模型-腫瘤體積。
圖18:MRx0554之API 50 CHL型態。
圖19:作用機制-HEK-BlueTM hTLR9報導細胞系中MRx0518(MRx0518LV)、熱殺滅MRx0518(MRx0518HK)及MRx0518培養物上清液(MRx0518SN)對TLR9之活化。ODN2006用作陽性對照且YCFA培養基作為MRx0518SN之陰性對照包括在內。條形圖描繪至少三個生物重複實驗之平均值。使用GraphPad Prism(普通單因子ANOVA分析繼之以塔基氏多重比較檢驗(Tukey's Multiple comparison test))進行統計分析。與相關對照之統計顯著差異以****(p<0.0001)示於圖中。
圖20A-B:在不添加細胞激素(無細胞激素)之情況下,使用熱殺滅MRx0518(HK 518)、來自MRx0518培養物或RPMI培養基之上清液,(A)T輔助細胞及(B)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)之群體中T細胞分化之誘導。*=p
Figure 108109417-A0202-12-0005-87
0.05;**=p
Figure 108109417-A0202-12-0005-88
0.01;***=p
Figure 108109417-A0202-12-0005-89
0.001;****=p
Figure 108109417-A0202-12-0005-90
0.0001。
圖21A-D:由(A)PBMC細胞、(B)脾細胞或(C)THP-1細胞試管內產生細胞激素;該等細胞經YCFA+培養基(「媒劑」)或MRx0518(「MRx0518」)之無細胞細菌上清液處理。圖21D展示用活細菌(「MRx0518」)處理CaCo-2細胞之後相對於未經處理之細胞之細胞激素表現的倍數變化。
圖21E:由來自未經處理(「未經處理」)、經YCFA空白培養基(「10% YCFA」)處理或經MRx0518無細胞細菌上清液(「10% MRx0518」)處理之細胞之脾細胞(N=3)試管內產生細胞激素。
圖21F:如藉由MTT檢定量測,自小鼠(N=4)提取之脾細胞之活力。細胞未經處理(「未經處理」)、經YCFA空白培養基(「10% YCFA」)處理或經MRx0518無細胞細菌上清液(「10% MRx0518」)處理。
圖22A-D:(A)HEK-BlueTM-hNOD2細胞、(B)HEK-BlueTM-hTLR4細胞、(C)HEK-BlueTM-hTLR9細胞或(D)HEK-BlueTM-hTLR5細胞中之NF-κB啟動子活化。細胞未經處理、經YCFA培養基(「YCFA」)處理、經MRx0518(「MRx0518」)處理或經陽性對照處理。
圖23:描繪在用YCFA媒劑(「媒劑」)或MRx0518(「MRx0518」)處理之後EMT6腫瘤微環境之NanoString分析之熱圖。
細菌菌株
本發明之組成物包含鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株。實施例證實此屬之細菌適用於刺激免疫系統及治療疾病。
鶉雞腸球菌形成球菌狀細胞,大多成對或為短鏈。其為運動性的且在血液瓊脂或營養瓊脂上之菌落為環狀且平滑的。鶉雞腸球菌與藍斯費氏D群抗血清(Lancefield group D antiserum)反應。鶉雞腸球菌之典型菌株為F87/276=PB21=ATCC 49573=CCUG 18658=CIP 103013=JCM 8728=LMG 13129=NBRC 100675=NCIMB 702313(原名NCDO 2313)=NCTC 12359[16]。鶉雞腸球菌之16S rRNA基因序列之GenBank登錄號為AF039900(本文中以SEQ ID NO:1揭示)。例示性鶉雞腸球菌菌株在[16]中描述。
在實施例中測試以登錄號NCIMB 42488寄存之鶉雞腸球菌細菌且在 本文中亦稱作菌株MRx0518。對MRx0518及MRx0518之提及可互換使用。所測試之MRx0518菌株之16S rRNA序列以SEQ ID NO:2提供。菌株MRx0518係由4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)於2015年11月16日以「腸球菌種(Enterococcus sp)」寄存於國際寄存機構NCIMB,Ltd.(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)且指定登錄號NCIMB 42488。
菌株MRx0518之基因體包含染色體及質體。菌株MRx0518之染色體序列以WO2017/085520之SEQ ID NO:3提供。菌株MRx0518之質體序列以WO2017/085520之SEQ ID NO:4提供。此等序列係使用PacBio RS II平台產生。
在實施例中亦測試以登錄號NCIMB 42761寄存之鶉雞腸球菌細菌且在本文中亦稱作菌株MRx0554。對MRx0554及MRx0554之提及可互換使用。菌株MRx0554係由4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)於2017年5月22日以「鶉雞腸球菌MRx0554」寄存於國際寄存機構NCIMB,Ltd.(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)且指定登錄號NCIMB 42761。此細菌之基因體序列在本文中以WO2018/215782之SEQ ID NO:2揭示。基因體序列自多個重疊群裝配。序列中之N代表重疊群之間的空位。「N」可代表A、G、C或T核苷酸。MRx0554菌株之16S rRNA基因序列以SEQ ID NO:3提供。SEQ ID NO:3代表裝配體中存在之全長序列,而非MRx0554中存在之五個16S基因之共同序列。
亦預期與實施例中測試之菌株密切相關之細菌菌株有效模擬免疫系統。在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有與SEQ ID NO:1或2至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA基因序列。較佳地,序列一致性係對於SEQ ID NO:2。較佳地,用於本發明中之細菌菌株具有由SEQ ID NO:2代表之16s rRNA基因序列。在某些實施方案中,用於本發明 中之細菌菌株具有與SEQ ID NO:3至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA基因序列。
亦預期作為以登錄號42488寄存之細菌之生物型的細菌菌株有效刺激免疫系統。生物型為具有相同或極其類似之生理及生物化學特徵之密切相關菌株。
作為以登錄號NCIMB 42488寄存之細菌之生物型且適合用於本發明中之菌株可藉由對以登錄號NCIMB 42488寄存之細菌之其他核苷酸序列進行定序來鑑別。舉例而言,可對實質上全基因體進行定序且用於本發明中之生物型菌株跨越至少80%之其全基因體(例如跨越至少85%、90%、95%或99%,或跨越其全基因體)可具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性。舉例而言,在一些實施方案中,生物型菌株跨越至少98%之其基因體具有至少98%之序列一致性,或跨越99%之其基因體具有至少99%之序列一致性。用於鑑別生物型菌株之其他適合序列可包括hsp60或重複序列,諸如BOX、ERIC、(GTG)5或REP或[17]。生物型菌株可具有與以登錄號NCIMB 42488寄存之細菌之相應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列。在一些實施方案中,生物型菌株具有與以NCIMB 42488寄存之菌株MRx0518之相應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列且包含與SEQ ID NO:2至少99%一致(例如至少99.5%或至少99.9%一致)之16S rRNA基因序列。在一些實施方案中,生物型菌株具有與以NCIMB 42488寄存之菌株MRx0518之相應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列且具有SEQ ID NO:2之16S rRNA序列。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有序列一致性之染色體。在較佳實施方案中, 用於本發明中之細菌菌株具有跨越至少60%(例如至少65%、70%、75%、80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少90%之序列一致性(例如至少92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性)之染色體。舉例而言,用於本發明中之細菌菌株可具有如下染色體:跨越70%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少90%之序列一致性,或跨越80%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少90%之序列一致性,或跨越90%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少90%之序列一致性,或跨越100%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少90%之序列一致性,或跨越70%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少95%之序列一致性,或跨越80%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少95%之序列一致性,或跨越90%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少95%之序列一致性,或跨越100%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少95%之序列一致性,或跨越70%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少98%之序列一致性,或跨越80%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少98%之序列一致性,或跨越90%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少98%之序列一致性,或跨越95%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少98%之一致性,或跨越100%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少98%之序列一致性,或跨越90%之 WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少99.5%之序列一致性,或跨越95%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少99.5%之一致性,或跨越98%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少99.5%之一致性,或跨越100%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少99.5%之序列一致性。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有序列一致性之質體。在較佳實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有跨越至少60%(例如至少65%、70%、75%、80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少90%之序列一致性(例如至少92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性)之質體。舉例而言,用於本發明中之細菌菌株可具有如下質體:跨越70%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少90%之序列一致性,或跨越80%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少90%之序列一致性,或跨越90%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少90%之序列一致性,或跨越100%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少90%之序列一致性,或跨越70%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少95%之序列一致性,或跨越80%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少95%之序列一致性,或跨越90%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少95%之序列一致性,或跨越100%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少 95%之序列一致性,或跨越70%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少98%之序列一致性,或跨越80%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少98%之序列一致性,或跨越90%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少98%之序列一致性,或跨越100%之WO2017/085520之SEQ ID NO:4與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有至少98%之序列一致性。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有序列一致性之染色體及與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有序列一致性之質體。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所述與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有序列一致性之染色體,及例如如上文所述與SEQ ID NO:1或2中之任一者具有序列一致性之16S rRNA序列,較佳具有與SEQ ID NO:2至少99%一致之16s rRNA序列,更佳包含SEQ ID NO:2之16S rRNA序列,且視情況包含如上文所述與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有序列一致性之質體。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所述與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有序列一致性之染色體,且視情況包含如上文所述與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有序列一致性之質體,且有效刺激免疫系統。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所述與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有序列一致性之染色體,及例如如上文所述與SEQ ID NO:1或2中之任一者具有序列一致性之16S rRNA序列,且視情況包含如上文所述與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有序列一致性之質體, 且有效刺激免疫系統。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有與由SEQ ID NO:2代表之16s rRNA序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列(例如包含SEQ ID NO:2之16S rRNA序列)及跨越至少90%之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少95%之序列一致性的染色體,且視情況包含如上文所述與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有序列一致性之質體,且該細菌菌株有效刺激免疫系統。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有與由SEQ ID NO:2代表之16s rRNA基因序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列(例如包含SEQ ID NO:2之16S rRNA序列)及跨越至少98%(例如跨越至少99%或至少99.5%)之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少98%之序列一致性(例如至少99%或至少99.5%之序列一致性)之染色體,且視情況包含如上文所述與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有序列一致性之質體,且該細菌菌株有效刺激免疫系統。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株為鶉雞腸球菌且具有與由SEQ ID NO:2代表之16s rRNA序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列(例如包含SEQ ID NO:2之16S rRNA序列)及跨越至少98%(例如跨越至少99%或至少99.5%)之WO2017/085520之SEQ ID NO:3與WO2017/085520之SEQ ID NO:3具有至少98%之序列一致性(例如至少99%或至少99.5%之序列一致性)之染色體,且視情況包含如上文所述與WO2017/085520之SEQ ID NO:4具有序列一致性之質體,且該細菌菌株有效刺激免疫系統。
或者,作為以登錄號NCIMB 42488寄存之細菌之生物型且適合用於本發明中之菌株可藉由使用登錄號NCIMB 42488寄存物及限制片段分析及/或PCR分析,例如藉由使用螢光擴增片段長度多形性(FAFLP)及重複DNA元件 (rep)-PCR指紋分析或蛋白質分型(protein profiling)或部分16S或23s rDNA定序來鑑別。在較佳實施方案中,此等技術可用於鑑別其他鶉雞腸球菌菌株。
在某些實施方案中,作為以登錄號NCIMB 42488寄存之細菌之生物型且適合用於本發明中之菌株為如下菌株:當藉由擴增核糖體DNA限制分析(ARDRA)進行分析時,例如當使用Sau3AI限制酶(對於例示性方法及導則,參見例如[18])時,該等菌株提供與以登錄號NCIMB 42488寄存之細菌相同之模式。或者,生物型菌株經鑑別為具有與以登錄號NCIMB 42488寄存之細菌相同之碳水化合物醱酵模式之菌株。在一些實施方案中,碳水化合物醱酵模式係使用API 50 CHL面板(bioMérieux)確定。在一些實施方案中,本發明中所用之細菌菌株為:(i)對以下至少一者(例如至少2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者、16者、17者或全部)之醱酵呈陽性:L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、柳苷、D-纖維雙糖、D-麥芽糖、蔗糖、D-海藻糖、龍膽雙糖、D-塔格糖及葡萄糖酸鉀;及/或(ii)以下至少一者(例如至少2者、3者、4者或全部)之醱酵之中間物:D-甘露糖醇、甲基-αD-葡萄哌喃糖苷、D-乳糖、澱粉及L-海藻糖;較佳如藉由API 50 CHL分析(較佳使用來自bioMérieux之API 50 CHL面板)確定。
適用於本發明之組成物及方法中之其他鶉雞腸球菌菌株,諸如以登錄號NCIMB 42488寄存之細菌之生物型可使用任何適當方法或策略鑑別,包括實施例中所述之檢定。舉例而言,用於本發明中之菌株可藉由如在實施例中進行之評估其對細胞激素水準之影響來鑑別。特別地,與以登錄號NCIMB 42488寄存之細菌具有類似生長模式、代謝類型及/或表面抗原之細菌菌株可適用於本 發明中。適用之菌株將具有與NCIMB 42488菌株可比之免疫調節活性。特別地,生物型菌株將引出與實施例中所示之作用可比的對癌症疾病模型之作用,該等作用可藉由使用實施例中所述之培養及投藥方案鑑別。根據一些實施方案,可用於本發明中之生物型菌株為當在本發明之方法中投予時能夠引出實施例中所示之對癌症疾病模型之可比作用的菌株。
在一些實施方案中,本發明中所用之細菌菌株為:(i)對以下至少一者(例如至少2者、3者、4者、5者、6者、7者或全部)呈陽性:甘露糖醱酵、麩胺酸脫羧酶、精胺酸芳基醯胺酶、苯丙胺酸芳基醯胺酶、焦麩胺酸芳基醯胺酶、酪胺酸芳基醯胺酶、組胺酸芳基醯胺酶及絲胺酸芳基醯胺酶;及/或(ii)以下至少一者(例如至少2者或全部)之中間物:β-半乳糖苷酶-6-磷酸、β-葡萄糖苷酶及N-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷酶;及/或(iii)對以下至少一者(例如至少2者、3者、4者、5者、6者或全部)呈陰性:棉子糖醱酵、脯胺酸芳基醯胺酶、白胺醯基甘胺酸芳基醯胺酶、白胺酸芳基醯胺酶、丙胺酸芳基醯胺酶、甘胺酸芳基醯胺酶及麩胺醯基麩胺酸芳基醯胺酶,較佳如藉由碳水化合物、胺基酸及硝酸鹽代謝之檢定及視情況藉由鹼性磷酸酶活性之檢定確定,更佳如藉由Rapid ID 32A分析(較佳使用來自bioMérieux之Rapid ID 32A系統)確定。
在一些實施方案中,本發明中所用之細菌菌株為:(i)對以下至少一者(例如至少2者、3者或全部4者)呈陰性:甘胺酸芳基醯胺酶、棉子糖醱酵、脯胺酸芳基醯胺酶及白胺酸芳基醯胺酶,例如,如藉由碳水化合物、胺基酸及硝酸鹽代謝之檢定確定,較佳如藉由Rapid ID 32A分析(較佳使用來自bioMérieux之Rapid ID 32A系統)確定;及/或(ii)對L-海藻糖醱酵呈陽性之中間物,較佳如藉由API 50 CHL分析(較佳使用來 自bioMérieux之API 50 CHL面板)確定。
在一些實施方案中,本發明中所用之細菌菌株為細胞外ATP生產者,例如產生如使用ATP檢定套組(Sigma-Aldrich,MAK190)量測之6-6.7ng/μl(例如6.1-6.6ng/μl或6.2-6.5ng/μl或6.33±0.10ng/μl)ATP之生產者。細菌細胞外ATP可具有多效作用,包括活化T細胞受體介導之信號傳導(Schenk等人,2011)、促進腸Th17細胞分化(Atarashi等人,2008)及藉由活化NLRP3炎性體誘導促炎性介體IL-1β之分泌(Karmarkar等人,2016)。因此,作為細胞外ATP生產者之細菌菌株適用於在本發明方法之情形中刺激免疫系統。
在一些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株包含以下三個基因中之一或多者:可移動元件蛋白質;木糖ABC轉運子-通透酶組分;及FIG00632333:假定蛋白質。舉例而言,在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株包含編碼以下之基因:可移動元件蛋白質及木糖ABC轉運子-通透酶組分;可移動元件蛋白質及FIG00632333:假定蛋白質;木糖ABC轉運子-通透酶組分及FIG00632333:假定蛋白質;或可移動元件蛋白質,木糖ABC轉運子-通透酶組分,及FIG00632333:假定蛋白質。
本發明之尤其較佳菌株為以登錄號NCIMB 42488寄存之鶉雞腸球菌菌株。此為在實施例中測試且顯示有效治療疾病之例示性MRx0518菌株。根據一些實施方案,本發明提供作為本發明之一部分之細菌組成物,其包含以登錄號NCIMB 42488寄存之鶉雞腸球菌菌株或其衍生物之細胞。以登錄號NCIMB 42488寄存之菌株之衍生物可為子系菌株(子代)或自原始菌株培養(次選殖)之菌株。
本發明中包含之組成物之菌株之衍生物可例如在基因層面上經修飾,而不會消除生物活性。特別地,本發明之衍生菌株為治療活性的。衍生菌株將具有與原始NCIMB 42488菌株可比之免疫調節活性。特別地,當可藉由使 用實施例中所述之培養及投藥方案鑑別時,衍生菌株將引出對癌症疾病模型之可比作用。NCIMB 42488菌株之衍生物一般將為NCIMB 42488菌株之生物型。
提及以登錄號NCIMB 42488寄存之鶉雞腸球菌菌株之細胞涵蓋具有與以登錄號NCIMB 42488寄存之菌株相同之安全性及治療功效特徵之任何細胞,且此等細胞由本發明涵蓋。因此,在一些實施方案中,提及以登錄號NCIMB 42488寄存之鶉雞腸球菌菌株之細胞僅係指以NCIMB 42488寄存之MRx0518菌株且並不係指不以NCIMB 42488寄存之細菌菌株。在一些實施方案中,提及以登錄號NCIMB 42488寄存之鶉雞腸球菌菌株之細胞係指具有與以登錄號NCIMB 42488寄存之菌株相同之安全性及治療功效特徵,但並非以NCIMB 42488寄存之菌株的細胞。
亦預期作為以登錄號42761寄存之細菌之生物型的細菌菌株有效刺激免疫系統。生物型為具有相同或極其類似之生理及生物化學特徵之密切相關菌株。
作為以登錄號NCIMB 42761寄存之細菌之生物型且適合用於本發明中之菌株可藉由對以登錄號NCIMB 42761寄存之細菌之其他核苷酸序列進行定序來鑑別。舉例而言,可對實質上全基因體進行定序且用於本發明中之生物型菌株跨越至少80%之其全基因體(例如跨越至少85%、90%、95%或99%,或跨越其全基因體)可具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性。舉例而言,在一些實施方案中,生物型菌株跨越至少98%之其基因體具有至少98%之序列一致性,或跨越99%之其基因體具有至少99%之序列一致性。用於鑑別生物型菌株之其他適合序列可包括hsp60或重複序列,諸如BOX、ERIC、(GTG)5或REP或[19]。生物型菌株可具有與以登錄號NCIMB 42761寄存之細菌之相應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列。在一些實施方案中,生物型菌株具有與以NCIMB 42761 寄存之菌株MRx0554之相應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列。在一些實施方案中,生物型菌株具有與以NCIMB 42761寄存之菌株MRx0554之相應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列且具有與SEQ ID NO:3至少99%一致(例如至少99.5%或至少99.9%一致)之16S rRNA基因序列。在一些實施方案中,生物型菌株具有與以NCIMB 42761寄存之菌株MRx0554之相應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列且具有SEQ ID NO:3之16S rRNA基因序列。
或者,作為以登錄號NCIMB 42761寄存之細菌之生物型且適合用於本發明中之菌株可藉由使用登錄號NCIMB 42761寄存物及限制片段分析及/或PCR分析,例如藉由使用螢光擴增片段長度多形性(FAFLP)及重複DNA元件(rep)-PCR指紋分析或蛋白質分型或部分16S或23s rDNA定序來鑑別。
在某些實施方案中,作為以登錄號NCIMB 42761寄存之細菌之生物型且適合用於本發明中之菌株為如下菌株:當藉由擴增核糖體DNA限制分析(ARDRA)進行分析時,例如當使用Sau3AI限制酶(對於例示性方法及導則,參見例如[20])時,該等菌株提供與以登錄號NCIMB 42761寄存之細菌相同之模式。或者,生物型菌株經鑑別為具有與以登錄號NCIMB 42761寄存之細菌相同之碳水化合物醱酵模式之菌株。在一些實施方案中,碳水化合物醱酵模式係使用API 50 CHL面板(bioMérieux)確定。在一些實施方案中,本發明中所用之細菌菌株為:(iii)對以下至少一者(例如至少2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者、16者、17者或全部)之醱酵呈陽性:L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、柳苷、D-纖維雙糖、D-麥芽糖、蔗糖、D- 海藻糖、龍膽雙糖、D-塔格糖及葡萄糖酸鉀;及/或(iv)以下至少一者(例如至少2者、3者、4者或全部)之醱酵之中間物:D-甘露糖醇、甲基-αD-葡萄哌喃糖苷、D-乳糖、澱粉及L-海藻糖;較佳如藉由API 50 CHL分析(較佳使用來自bioMérieux之API 50 CHL面板)確定。
在一些實施方案中,本發明中所用之細菌菌株為:(i)對以下至少一者(例如至少2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者、16者、17者、18者或全部)之醱酵呈陽性:L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、柳苷、D-纖維雙糖、D-麥芽糖、D-蔗糖(蔗糖)、D-海藻糖、龍膽雙糖、D-塔格糖及葡萄糖酸鉀;(ii)以下至少一者(例如至少2者、3者、4者、5者或全部)之醱酵之中間物:D-甘露糖醇、甲基-αD-葡萄哌喃糖苷、D-乳糖、D-棉子糖、安米松(amidon)(澱粉)及D-松二糖;及/或(iii)對以下至少一者(例如至少2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者、16者、17者、18者、19者、20者、21者、22者、23者或全部)之醱酵呈陰性:甘油、赤藻糖醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、D-福壽糖醇、甲基-βD-木哌喃糖苷、L-山梨糖、L-鼠李糖、甜醇、肌醇、D-山梨糖醇、甲基-αD-甘露哌喃糖苷、D-蜜二糖、菊糖、D-松三糖、糖原、木糖醇、D-來蘇糖、D-海藻糖、L-海藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、2-酮基葡萄糖酸鉀及5-酮基葡萄糖酸鉀;較佳如藉由API 50 CHL分析(較佳使用來自bioMérieux之API 50 CHL面板,且較佳使用實施例10中所述之條件)確定。
適用於本發明之組成物及方法中之其他鶉雞腸球菌菌株,諸如以登 錄號NCIMB 42761寄存之細菌之生物型可使用任何適當方法或策略鑑別,包括實施例中所述之檢定。舉例而言,用於本發明中之菌株可藉由在厭氧YCFA中培養及/或將細菌投予II型膠原蛋白誘發之關節炎小鼠模型,接著評估細胞激素水準來鑑別。特別地,與以登錄號NCIMB 42761寄存之細菌具有類似生長模式、代謝類型及/或表面抗原之細菌菌株可適用於本發明中。適用之菌株將具有與NCIMB 42761菌株可比之免疫調節活性。特別地,生物型菌株將引出與實施例中所示之作用可比的對癌症疾病模型之作用,該等作用可藉由使用實施例中所述之培養及投藥方案鑑別。
本發明之菌株之衍生物可例如在基因層面上經修飾,而不會消除生物活性。特別地,本發明之衍生菌株為治療活性的。衍生菌株將具有與原始NCIMB 42761菌株可比之免疫調節活性。特別地,衍生菌株將引出與實施例中所示之作用可比的對癌症疾病模型之作用,該等作用可藉由使用實施例中所述之培養及投藥方案鑑別。NCIMB 42761菌株之衍生物一般將為NCIMB 42761菌株之生物型。
提及以登錄號NCIMB 42761寄存之鶉雞腸球菌菌株之細胞涵蓋具有與以登錄號NCIMB 42761寄存之菌株相同之安全性及治療功效特徵之任何細胞,且此等細胞由本發明涵蓋。因此,在一些實施方案中,提及以登錄號NCIMB 42761寄存之鶉雞腸球菌菌株之細胞僅係指以NCIMB 42761寄存之MRx0554菌株且並不係指不以NCIMB 42761寄存之細菌菌株。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有序列一致性之基因體。在一些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有跨越至少60%(例如跨越至少65%、70%、75%、80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少90%之序列一致性(例如至少 92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性)之基因體。舉例而言,用於本發明中之細菌菌株可具有如下基因體:跨越70%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少90%之序列一致性,或跨越80%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少90%之序列一致性,或跨越90%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少90%之序列一致性,或跨越100%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少90%之序列一致性,或跨越70%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少95%之序列一致性,或跨越80%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少95%之序列一致性,或跨越90%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少95%之序列一致性,或跨越100%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少95%之序列一致性,或跨越70%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少98%之序列一致性,或跨越80%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少98%之序列一致性,或跨越90%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少98%之序列一致性,或跨越95%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少98%之一致性,或跨越100%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少98%之序列一致性,或跨越90%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少99.5%之序列一致性,或跨越95%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少99.5%之一致性,或跨越98%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少99.5%之一致性,或跨越 100%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少99.5%之序列一致性。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所述與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有序列一致性之基因體,及例如如上文所述與SEQ ID NO:1或3具有序列一致性之16S rRNA基因序列,較佳具有與SEQ ID NO:3至少99%一致之16S rRNA基因序列,更佳包含SEQ ID NO:3之16S rRNA基因序列。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所述與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有序列一致性之基因體,且有效刺激免疫系統。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有例如如上文所述與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有序列一致性之基因體,及例如如上文所述與SEQ ID NO:1或3具有序列一致性之16S rRNA基因序列,且有效刺激免疫系統。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株具有與由SEQ ID NO:3代表之16S rRNA基因序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16S rRNA基因序列(例如包含SEQ ID NO:3之16S基因rRNA序列)及跨越至少90%之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少95%之序列一致性的基因體,且該細菌菌株有效刺激免疫系統。
在某些實施方案中,用於本發明中之細菌菌株為鶉雞腸球菌且具有與由SEQ ID NO:3代表之16S rRNA基因序列至少99%、99.5%或99.9%一致之16S rRNA基因序列(例如包含SEQ ID NO:3之16S rRNA基因序列)及跨越至少98%(例如跨越至少99%或至少99.5%)之WO2018/215782之SEQ ID NO:2與WO2018/215782之SEQ ID NO:2具有至少98%之序列一致性(例如至少99%或至 少99.5%之序列一致性)之基因體,且該細菌菌株有效刺激免疫系統。
在較佳實施方案中,本發明之組成物中之細菌菌株為有活力的且能夠部分或全部定殖於腸。
在本發明之每個實施方案之替代性態樣中,本發明之組成物中之細菌菌株屬於酪黃腸球菌(Enterococcus caselliflavus)菌種。酪黃腸球菌高度類似於鶉雞腸球菌且亦有鞭毛。
治療用途
刺激免疫系統
實施例顯示本發明之組成物之投藥可引起免疫刺激。因為顯示本發明之組成物之投藥具有免疫刺激作用,所以本發明之組成物可適用於治療疾病,尤其為由降低之免疫活化特徵化之疾病及由增加之免疫反應可治療之疾病。在某些實施方案中,本發明之組成物用於刺激免疫系統。在某些實施方案中,本發明之組成物用於藉由刺激免疫系統來治療疾病。在某些實施方案中,本發明之組成物用於促進免疫反應。
本發明之組成物可適用於治療由細胞群體中Treg之百分比增加特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物可適用於治療或預防由細胞群體中Treg之百分比增加特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物可適用於治療或預防由細胞群體中CD4+CD25+CD127-細胞之百分比增加特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由降低細胞群體中Treg之百分比來治療或預防疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於減少Treg對免疫反應之抑制。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由Treg之選擇性降低來刺激免疫反應。在一個實施方案中,本發明之組成物用於免疫刺激,其中本發明之組成物減少Treg之數目或百分比。
本發明之組成物可適用於治療由CD8/Treg及/或經活化之CD8/Treg 細胞之比率降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由CD8/Treg細胞之比率降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由經活化之CD8/Treg細胞之比率降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加CD8/Treg細胞之比率來刺激免疫反應。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加經活化之CD8/Treg細胞之比率來刺激免疫反應。
本發明之組成物可適用於治療由B細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由B細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由CD19+CD3-細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加細胞群體中B細胞之數目或百分比來治療或預防疾病,其中B細胞之數目或百分比的增加引起免疫刺激。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加B細胞之數目或百分比來刺激免疫反應。
本發明之組成物可適用於治療由CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加細胞群體中CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比來治療或預防疾病,其中CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比的增加引起免疫刺激。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比來刺激免疫反應。
本發明之組成物可適用於治療由CD8+經活化細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由CD8+經活化細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加細胞群體中CD8+經活化細胞之數目或百分比來治療或預防 疾病,其中CD8+經活化細胞之數目或百分比的增加引起免疫刺激。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加CD8+經活化細胞之數目或百分比來刺激免疫反應。
實施例顯示本發明之組成物之投藥可使得諸如促炎性細胞激素之促炎性分子之表現增加。在投予本發明之組成物後顯示表現水準增加之促炎性分子之實例包括IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β及IL-6。因為顯示本發明之組成物之投藥增加促炎性分子之表現,所以本發明之組成物可適用於治療由諸如促炎性細胞激素之促炎性分子之表現降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由促炎性分子之表現及/或活性降低特徵化之疾病,尤其為由促炎性細胞激素之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在特定實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β及/或IL-6之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加IL-23、TNF-α、IL-1β及/或IL-6之表現及/或活性來治療或預防疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β及/或IL-6之表現及/或活性來促進免疫反應。
實施例亦顯示本發明之組成物之投藥可使得IL-1β之表現增加。IL-1β為促炎性細胞激素[21]。IL-1β之產生及分泌由炎性體調控,該炎性體為與發炎反應之活化相關聯之蛋白質複合物[22]。因為顯示本發明之組成物之投藥增加IL-1β之表現,所以本發明之組成物可適用於治療由IL-1β之表現降低特徵化之疾病。在特定實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由IL-1β之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加IL-1β之表現及/或活性來治療或預防疾病。
實施例亦顯示本發明之組成物之投藥可使得IL-23之表現增加。IL-23已與發炎相關聯[23、24]。IL-23在免疫反應中所提出之功能包括促進CD4+ 記憶T細胞之增殖及促進由樹突狀細胞(DC)分泌IFN-γ[25]。因為顯示本發明之組成物之投藥增加IL-23之表現,所以本發明之組成物可適用於治療由IL-23之表現降低特徵化之疾病。在特定實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由IL-23之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加IL-23之表現及/或活性來治療或預防疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加IL-23之表現及/或活性來促進免疫反應。
實施例顯示本發明之組成物之投藥可使得腫瘤壞死因子α(TNF-α)之表現增加。TNF-α為已知涉及於各種信號傳導路徑中以促進細胞死亡之促炎性細胞激素。TNF-α藉由結合至其同族受體TNFR-1來起始凋亡,此舉引起凋亡路徑中之裂解事件級聯[26]。TNF-α亦可經由RIP激酶依賴性機制來觸發壞死[27]。因為本發明之組成物之投藥顯示TNF-α表現增加,所以本發明之組成物可適用於治療疾病,尤其用於治療或預防由TNF-α之表現降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療由降低之TNF-α表現特徵化之疾病。在特定實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由TNF-α之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物可適用於藉由增加TNF-α之表現及/或活性來治療或預防疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加TNF-α之表現及/或活性來促進免疫反應。
實施例亦顯示本發明之組成物之投藥可使得IL-6之表現增加。IL-6為促炎性細胞激素,其在發炎期間產生,且促進初始CD4+ T細胞分化及CD8+ T細胞分化成細胞毒性T細胞[28]。因為顯示本發明之組成物之投藥增加IL-6之表現,所以本發明之組成物可適用於治療由IL-6之表現降低特徵化之疾病。在特定實施方案中,本發明之組成物用於治療或預防由IL-6之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加IL-6之表現及/或活性來治療或預防疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增 加IL-6之表現及/或活性來促進免疫反應。
Bettelli等人[29]報導IL-6抑制Treg之擴張。因為實施例顯示本發明之組成物增加IL-6之表現,所以本發明之組成物可藉由增加IL-6之表現來選擇性地減少Treg之數目或百分比。在一個實施方案中,本發明之組成物藉由增加IL-6之表現用於免疫刺激。在另一個實施方案中,本發明之組成物藉由減少Treg之數目或百分比用於免疫刺激。
在一些實施方案中,根據本發明刺激免疫系統包含TLR5活化或TLR5活化之上調。在一些實施方案中,根據本發明刺激免疫系統包含TLR9活化或TLR9活化之上調。在一些實施方案中,根據本發明刺激免疫系統包含TLR5及TLR9活化或TLR9及TLR5活化之上調。在一些實施方案中,根據本發明刺激免疫系統包含誘導及/或上調諸如(但不限於)T輔助細胞及T細胞毒性細胞之T細胞的分化。
TLR信號傳導路徑以轉錄因子核因子-κB(NF-κB)之活化為終點。NF-κB控制一批炎性細胞激素基因(包括TNF-α)之表現。免疫刺激引起例如TLR5二聚,隨後募集MyD88且活化蛋白激酶,包括IRAK1、IRAK2、IRAK4及IRAK-M。此等激酶之活化促成促炎性細胞激素NF-κB之核定位[30]。
如實施例中所證實,本發明之組成物使得NF-κB之表現增加。因為本發明之組成物之投藥增加促炎性細胞激素NF-κB之表現,所以本發明之組成物可適用於刺激免疫反應。另外,本發明之組成物可適用於治療疾病,尤其為由降低之免疫活化特徵化之疾病及/或由增加之免疫反應可治療之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物藉由增加NF-κB之水準及/或活性而用作免疫刺激劑。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加NF-κB之水準及/或活性來治療由降低之免疫活化特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加NF-κB之水準及/或活性來治療由增加之免疫反應可治療之疾病。
特別地,本發明之組成物可適用於治療由NF-κB之表現及/或活化降低特徵化之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療由NF-κB之表現及/或活化降低特徵化之疾病。
NF-κB之活化對於引出先天性免疫反應及後續適應性免疫反應之發展為重要的。因此,TLR之促效劑,諸如本發明之組成物,可能適用作佐劑以藉由促進先天性與適應性免疫反應來治療感染性疾病、過敏及腫瘤[30]。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療感染性疾病、過敏及/或腫瘤。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加NF-κB之水準及/或活性來治療感染性疾病、過敏及/或腫瘤。
實施例亦證實本發明之組成物促進T輔助細胞及細胞毒性T淋巴細胞之分化。因此,在某些實施方案中,本發明之組成物用於刺激T輔助細胞及/或細胞毒性T淋巴細胞之分化。
在某些實施方案中,有待由本發明之組成物治療之疾病不為癌症。
用作疫苗佐劑
實施例顯示本發明之組成物之投藥可使得腫瘤壞死因子α(TNF-α)之表現增加。已知TNF-α對於疫苗反應為重要的。舉例而言,已顯示TNF-α在老年人群之流感疫苗接種中為有效疫苗反應所需要[31]。因為顯示本發明之組成物之投藥增加TNF-α表現,所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物藉由增加TNF-α之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物在流感療法中用作疫苗佐劑。在某些實施方案中,本發明之組成物用於增強針對抗原之免疫反應。在某些實施方案中,本發明提供一種有待與抗原組合投予之組成物。在某些實施方案中,本發明之組成物用於在即將疫苗接種之前或在疫苗接種之後即刻投予患者。
鶉雞腸球菌及尤其菌株MRx0518有鞭毛且鞭毛蛋白可為TLR5促效劑。TLR促效劑跨越一系列抗原類型正開發作為疫苗佐劑,尤其在老年人群中[32]。又,實施例中之資料確認MRx0518鞭毛蛋白為TLR5促效劑。因此,本發明之組成物可適用作疫苗佐劑,尤其用於投予可能具有降低之免疫系統活性之老年患者(例如超過40歲、50歲、60歲、70歲或80歲)之疫苗。TLR5信號傳導亦在年齡相關之先天性免疫反應中起關鍵作用[33]。在某些實施方案中,組成物用於增強先天性免疫反應。儘管TLR5促效劑正開發作為疫苗佐劑,但此等全部來自已知病原體及/或為合成的。相比之下,本發明之組成物包含共生細菌。
實施例亦顯示本發明之組成物之投藥可使得IL-6之表現增加。增加之IL-6表現已與許多疾病之疫苗反應相關聯。舉例而言,在向成人投予流感疫苗之後IL-6由CD14+CD16-炎性單核細胞產生[34],且較高水準之IL-6與達成對流感疫苗之疫苗反應相關聯[35]。此外,IL-6在注射AS03佐劑系統之後產生[36],且在投予結核疫苗之後顯示小鼠中IL-6之下調降低輔助T細胞反應[37]。因為顯示本發明之組成物之投藥增加IL-6表現,所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物藉由增加IL-6之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物在結核療法中用作疫苗佐劑。
此外,已顯示IL-6及TNF-α表現與治療性HIV疫苗[Huang等人]、結核疫苗及披衣菌疫苗[38]之功效相關。Su等人[39]顯示IL-6或TNF-α與FMDV DNA疫苗之共同接種使得CD4+及CD8+ T細胞對IFN-γ之表現增加、CD4+ T細胞中IL-4之表現更高及抗原特異性細胞毒性反應更高。因為顯示本發明之組成物之投藥增加IL-6及TNF-α表現,所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物藉由增加TNF-α之水準及/或活性可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物藉由增加IL-6之水準及/或活性可 適用作疫苗佐劑。在特定實施方案中,本發明之組成物藉由增加TNF-α及IL-6之水準及/或活性可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物在HIV療法中用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物在披衣菌療法中用作疫苗佐劑。
實施例亦顯示本發明之組成物之投藥可使得IL-1β之表現增加。Li等人[40]顯示佐劑氫氧化鋁活化IL-1β之分泌,且表明IL-β本身可充當佐劑。因為顯示本發明之組成物之投藥增加IL-1β表現,所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。實施例顯示本發明之組成物之投藥可增加CD8+ T細胞與Treg之比率。已顯示佐劑刺激CD8+ T細胞[41],且因為顯示本發明之組成物之投藥增加CD8+ T細胞與Treg之比率,所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物用作疫苗佐劑。在一個實施方案中,本發明之組成物藉由增加CD8+ T細胞與Treg之比率而用作疫苗佐劑。
實施例亦顯示本發明之組成物之投藥可使得CXCR3配位體CXCL9及CXCL10之表現或水準增加。諸如ASO3、CpG、GLA-SE、αGalCer之已知佐劑全部增加CXCL9及10[42、43],表明本發明之組成物作為佐劑將有效。又,CXCL9及10與IFNγ/Th1反應相關聯且促進抗體反應[44]。在某些實施方案中,本發明之組成物用於促進針對抗原,尤其病原性或癌症抗原之抗體反應。又,在接受所研究之瘧疾疫苗之自願者中CXCL9相比IFN-γ為疫苗誘導之T細胞反應之更敏感量度[45]。在某些實施方案中,本發明之組成物用於促進針對抗原,尤其病原性或癌症抗原之T細胞反應。在一個實施方案中,本發明之組成物藉由增加CXCL9及CXCL10之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。在某些實施方案中,組成物用於保護免受瘧疾侵害。
實施例亦顯示本發明之組成物之投藥可使得IL-12p70之表現或水準增加。此作用已與疫苗佐劑效率相關聯且已提議IL-12作為佐劑本身[46],表明 本發明之組成物作為佐劑將有效。在一個實施方案中,本發明之組成物藉由增加IL-12p70之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。
在一些實施方案中,當用作疫苗佐劑時,本發明之組成物將單獨投予以為已獨立地投予患者之抗原提供佐劑作用。在某些實施方案中,經口投予本發明之組成物,而非經腸注射抗原。
本發明之組成物可用於增強對任何有用抗原之免疫反應。用於本發明之例示性抗原包括:病毒抗原,諸如病毒表面蛋白;細菌抗原,諸如蛋白質及/或醣抗原;真菌抗原;寄生蟲抗原;及腫瘤抗原。本發明尤其適用於對抗以下之疫苗:流感病毒、HIV、鉤蟲、B型肝炎病毒、單純疱疹病毒、狂犬病、呼吸道融合性病毒、細胞巨大病毒、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、披衣菌、SARS冠狀病毒、水痘帶狀疱疹病毒、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、艾司坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus)、人類乳突狀瘤病毒等。用於本發明之其他抗原包括醣蛋白及脂聚醣抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸化Tn(STn)、人端粒酶反轉錄酶(hTERT)、威爾姆斯瘤基因(Wilms tumour gene)(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾司坦-巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、類澱粉蛋白β、Tau、PCSK9及成癮性物質,例如菸鹼、酒精或鴉片劑。
用於本發明之較佳抗原包括病原體抗原及腫瘤抗原。抗原將引出對該抗原具特異性之免疫反應,其將有效保護免受病原體感染或攻擊腫瘤。抗原可為例如肽或多醣。
本發明亦提供以下之用途:(i)抗原之水性製劑;及(ii)包含鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株之組成物,其用於製造用以提高患者中之免疫反應之藥物。
藉由此等方法及用途提高之免疫反應一般將包括抗體反應,較佳為 保護性抗體反應。
在一些實施方案中,鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株經工程改造以呈現抗原。在本發明之細菌菌株上呈現抗原可使免疫刺激活性達到最大且進一步增強針對抗原產生之保護性免疫反應。另外,製造及遞送包含抗原及本發明之細菌之治療劑可比獨立地製造及投予抗原及包含細菌菌株之組成物中之每一者的方式更有效率且有效。因此,在一些實施方案中,本發明提供一種包含鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株之組成物,該細菌菌株例如在其細胞表面上呈現抗原。在一些實施方案中,包含呈現抗原之細菌菌株之組成物用作疫苗抗原。在一些實施方案中,抗原來源於HIV、鉤蟲、B型肝炎病毒、單純疱疹病毒、狂犬病、呼吸道融合性病毒、細胞巨大病毒、金黃色葡萄球菌、披衣菌、SARS冠狀病毒、水痘帶狀疱疹病毒、肺炎鏈球菌、腦膜炎雙球菌、結核分枝桿菌、炭疽桿菌、艾司坦-巴爾病毒或人類乳突狀瘤病毒。在一些實施方案中,抗原為醣蛋白抗原、脂聚醣抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸化Tn(STn)、人端粒酶反轉錄酶(hTERT)、威爾姆斯瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾司坦-巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、類澱粉蛋白β、Tau、PCSK9或成癮性物質,諸如酒精、鴉片劑及其類似物。
在一些實施方案中,本發明之細菌表現一或多種抗原。一般而言,抗原將經重組表現且將對本發明之細菌為異源的。因此,本發明提供一種表現異源抗原之鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株。抗原可為與對細菌同源之一或多種多肽一起表現之融合多肽之一部分。在一些實施方案中,細菌表現呈非融合多肽之抗原。在一些實施方案中,本發明提供一種包含鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株之細胞之組成物,其中該細胞表現異源抗原。在一些實施方案中,組成物用作疫苗。在一些實施方案中,本發明提供一種鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株之細胞,其中該細胞表現異源抗原。在一些實施方案中,細胞用作疫苗。
用於本發明之例示性抗原包括:病毒抗原,諸如病毒表面蛋白;細菌抗原,諸如蛋白質及/或醣抗原;真菌抗原;寄生蟲抗原;及腫瘤抗原。用於在鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株中表現之其他抗原包括醣蛋白及脂聚醣抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸化Tn(STn)、人端粒酶反轉錄酶(hTERT)、威爾姆斯瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾司坦-巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、類澱粉蛋白β、Tau、PCSK9及成癮性物質,例如菸鹼、酒精、鴉片劑或其類似物。
本發明亦可適用於增強對疫苗之反應,該等疫苗對抗非傳染性疾病,諸如高膽固醇(例如經由PCSK9抗原)。
本發明亦可適用於增強對疫苗之反應,該等疫苗對抗成癮性物質,例如菸鹼、酒精或鴉片劑。
細胞療法
嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法
實施例亦顯示本發明之組成物之投藥可使得IL-6之表現增加。增加之IL-6表現已與對慢性淋巴細胞白血病之CD19 CAR-T療法之反應相關。血清IL-6之增加與CAR-T細胞擴張相關聯,而IL-6之抑制與CAR-T細胞增殖之抑制相關聯[47]。因為顯示本發明之組成物之投藥增加IL-6表現,所以本發明之組成物可適用於細胞療法,尤其CAR-T細胞療法。在一個實施方案中,本發明之組成物用於細胞療法中。在一個實施方案中,本發明之組成物用於CAR-T細胞療法中。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療慢性淋巴細胞白血病。
已顯示Treg之選擇性耗盡增強細胞毒性淋巴細胞之功效[48]。CAR-T細胞為細胞毒性淋巴細胞之子組,且因此據信Treg之選擇性耗盡在CAR-T細胞療法中有效。因為顯示本發明之組成物之投藥使Treg耗盡,所以本發明之組成物可適用於細胞療法,尤其CAR-T細胞療法。
因此,本發明之組成物可適用於細胞療法,尤其增強對細胞療法之反應。
間質幹細胞(MSC)療法
已報導間質幹細胞(MSC)療法具有免疫刺激特性。當MSC經LPS處理時,MSC上調促炎性細胞激素IL-6及IL-8,此引起增加之B細胞增殖[49]。因此,因為顯示本發明之組成物增加IL-6之表現,所以其可適用於與MSC細胞療法組合。
幹細胞移植療法
已報導在幹細胞移植療法中替代使用未分化幹細胞,在移植之前使幹細胞在一定程度上分化可為有益的。舉例而言,Heng等人[50]報導幹細胞之心肌源性分化藉由具有較高移入效率、增強之肌細胞再生及增加之心功能恢復可為有益的。因為本發明之組成物之投藥起始未分化神經母細胞瘤細胞中之神經元分化,所以本發明之組成物可適用於幹細胞移植療法中之幹細胞分化。
造血幹細胞移植
造血幹細胞移植為通常來源於骨髓、外周血或臍帶血之多能造血幹細胞之移植。已顯示在同種異體造血幹細胞移植之前腸道經腸球菌(鶉雞腸球菌及酪黃腸球菌)定殖由於非復發死亡率降低而使患者之2年存活率顯著提高[51]。因此,實施例中所示之免疫調節作用可適用於造血幹細胞移植療法。在某些實施方案中,本發明之組成物可適用於提高造血幹細胞移植之後及尤其同種異體造血幹細胞移植之後的存活率。
本發明之組成物可適用於與同種異體造血幹細胞移植組合。本發明之組成物可有效加強對同種異體造血幹細胞移植之成功患者反應。在某些實施方案中,在造血幹細胞移植之前投予本發明之組成物。在某些實施方案中,本發明之組成物用於投予計劃接受造血幹細胞移植之患者。在某些實施方案中, 在造血幹細胞移植之後投予本發明之組成物。在某些實施方案中,本發明之組成物用於投予已接受造血幹細胞移植之患者。
免疫衰老
Fulop等人[52]鑑別Treg細胞數目之增加及B細胞數目之減少與適應性免疫系統之老化相關聯。因此,本發明之組成物可用於預防或延遲免疫衰老。在一個實施方案中,本發明之組成物用於預防免疫衰老。在另一個實施方案中,本發明之組成物用於延遲由Treg細胞數目之增加特徵化之免疫衰老。在另一個實施方案中,本發明之組成物用於延遲由B細胞數目之減少特徵化之免疫衰老。在另一個實施方案中,本發明之組成物用於延遲由Treg細胞數目之增加及B細胞數目之減少特徵化之免疫衰老。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由減少Treg細胞數目來延遲免疫衰老。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由增加B細胞數目來延遲免疫衰老。在另一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由減少Treg細胞數目及增加B細胞數目來延遲免疫衰老。在一個實施方案中,本發明之組成物用於治療由免疫衰老引起之疾病。在一個實施方案中,本發明之組成物用於藉由延遲及/或預防免疫衰老來治療老化相關疾病。
此外,已提議疫苗佐劑可攻克免疫衰老[53]。因為本發明之組成物適合用作疫苗佐劑,所以本發明之組成物可適用於預防或延遲免疫衰老。在另一個實施方案中,本發明之組成物作為疫苗佐劑用於延遲及/或預防免疫衰老。在另一個實施方案中,本發明之組成物用作疫苗佐劑,其中組成物延遲及/或預防免疫衰老。
與免疫衰老相關聯之疾病包括心血管疾病、癌症、2型糖尿病[54]及自體免疫病症[55]。
投藥模式
較佳地,本發明之組成物有待投予胃腸道以能夠向腸遞送本發明之 細菌菌株及/或使本發明之細菌菌株在腸中部分或全部定殖。一般而言,本發明之組成物經口(包括舌下)投予,但其可經直腸或鼻內投予。
在某些實施方案中,本發明之組成物可作為泡沫劑、作為噴霧劑或凝膠投予。
在某些實施方案中,本發明之組成物可作為栓劑,諸如直腸栓劑投予,例如以可可油(可可脂)、合成硬脂肪(例如蘇博瑞(suppocire)、威特索(witepsol))、甘油明膠、聚乙二醇或皂甘油組成物之形式。
在某些實施方案中,將本發明之組成物經由管,諸如鼻胃管、口胃管、胃管、空腸造口管(J管)、經皮內鏡胃造瘺(PEG)或口,諸如可進入胃、空腸之胸壁口及其他適合之進入口投予胃腸道。
本發明之組成物可一次性投予,或其可作為治療方案之一部分依序投予。在某些實施方案中,本發明之組成物有待每日投予。
在本發明之某些實施方案中,根據本發明之治療伴隨患者之腸道微生物區之評估。若未達成本發明之菌株之遞送及/或部分或全部定殖以致未觀測到功效,則可重複治療;或若遞送及/或部分或全部定殖為成功的且觀測到功效,則可停止治療。
在某些實施方案中,可將本發明之組成物投予妊娠動物,例如哺乳動物,諸如人類,以降低其孩童在子宮內及/或在出生後發展疾病之可能性。
可將本發明之組成物投予已診斷出患有由降低之免疫活性介導之疾病或病狀或已鑑別為處於由降低之免疫活性介導之疾病或病狀之風險下的患者。亦可作為預防措施投予組成物以預防健康患者中由降低之免疫活性介導之疾病或病狀的發展。
可將本發明之組成物投予已診斷出缺乏免疫活性或已鑑別為處於缺乏免疫活性之風險下之患者。舉例而言,患者可具有減少之或不存在腸球菌及 尤其鶉雞腸球菌之定殖。
本發明之組成物可作為食物產品,諸如營養補充劑投予。
一般而言,本發明之組成物用於治療人類,不過其可用於治療動物,包括單胃哺乳動物,諸如家禽、豬、貓、犬、馬或兔。本發明之組成物可適用於增強動物之生長及效能。若投予動物,則可使用經口管飼。
組成物
一般而言,本發明之組成物包含細菌。在本發明之較佳實施方案中,組成物以冷凍乾燥形式調配。舉例而言,本發明之組成物可包含顆粒或明膠膠囊,例如硬明膠膠囊,其包含本發明之細菌菌株。
較佳地,本發明之組成物包含凍乾細菌。細菌之凍乾為充分確立之程序且相關導則在例如參考文獻[56、57、58]中可用。
或者,本發明之組成物可包含活的活性細菌培養物。
在較佳實施方案中,本發明之組成物經囊封以能夠將細菌菌株遞送至腸。囊封保護組成物免於降解直至遞送於目標位置處,該降解係經由例如用化學或物理刺激(諸如壓力)、酶促活性或可由pH值變化觸發之物理崩解而破壞。可使用任何適當囊封方法。例示性囊封技術包括截留於多孔基質內、附著或吸附於固體載體表面上、藉由絮凝或用交聯劑自聚集及機械容納於微孔膜或微膠囊中。關於可適用於製備本發明之組成物之囊封的導則在例如參考文獻[59]及[60]中可用。
組成物可經口投予且可呈錠劑、膠囊或粉末形式。經囊封之產品為較佳的,此係因為腸球菌為厭氧菌。其他成分(諸如維生素C)可作為去氧劑及益生元基質包括在內以改善遞送及/或部分或全部定殖及活體內存活。或者,本發明之益生菌組成物可作為食物或營養產品,諸如基於乳奶或乳清之醱酵乳產品,或作為醫藥產品經口投予。
組成物可調配成益生菌。
本發明之組成物包括治療有效量之本發明之細菌菌株。細菌菌株之治療有效量足以對患者發揮有益作用。細菌菌株之治療有效量可足以遞送至患者之腸及/或在腸中部分或全部定殖。
用於例如成年人之細菌之適合日劑量可為約1×103個至約1×1011個菌落形成單位(CFU);例如約1×107至約1×1010CFU;在另一個實例中約1×106至約1×1010CFU;在另一個實例中約1×107至約1×1011CFU;在另一個實例中約1×108至約1×1010CFU;在另一個實例中約1×108至約1×1011CFU。
在某些實施方案中,細菌之劑量為至少109個細胞/天,諸如至少1010個、至少1011個或至少1012個細胞/天。
在某些實施方案中,組成物含有細菌菌株,其量以組成物重量計為約1×106至約1×1011CFU/g;例如約1×108至約1×1010CFU/g。劑量可為例如1g、3g、5g及10g。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其中細菌菌株之量以組成物重量計為每克約1×103個至約1×1011個菌落形成單位。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其中該組成物以介於500mg與1000mg之間、介於600mg與900mg之間、介於700mg與800mg之間、介於500mg與750mg之間或介於750mg與1000mg之間的劑量投予。在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其中醫藥組成物中之凍乾細菌以介於500mg與1000mg之間、介於600mg與900mg之間、介於700mg與800mg之間、介於500mg與750mg之間或介於750mg與1000mg之間的劑量投予。
典型地,益生菌,諸如本發明之組成物,視情況與至少一種適合之益生元化合物組合。益生元化合物通常為不可消化之碳水化合物,諸如寡醣或 多醣,或在上消化道中不降解或吸收之糖醇。已知益生元包括商業產品,諸如菊糖及反式半乳寡醣。
在某些實施方案中,本發明之益生菌組成物包括益生元化合物,其量以組成物總重量計為約1重量%至約30重量%(例如5重量%至20重量%)。碳水化合物可選自由以下組成之群組:果寡醣(或FOS)、短鏈果寡醣、菊糖、異麥芽寡醣、果膠、木寡醣(或XOS)、殼寡醣(或COS)、β-聚葡萄糖、阿拉伯膠改質及抗性澱粉、聚右旋糖、D-塔格糖、阿拉伯膠纖維、刺槐豆、燕麥及柑橘纖維。在一個態樣中,益生元為短鏈果寡醣(為簡單起見,在下文中示為FOSs-c.c);該等FOSs-c.c.為不可消化之碳水化合物,一般藉由甜菜糖轉化獲得且包括鍵結三個葡萄糖分子之蔗糖分子。
本發明之組成物可包含醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。此等適合之賦形劑之實例可見於參考文獻[61]中。用於治療用途之可接受之載劑或稀釋劑在醫藥技術中為熟知的且描述於例如參考文獻[62]中。適合載劑之實例包括乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇、山梨糖醇及其類似物。適合稀釋劑之實例包括乙醇、甘油及水。醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑之選擇可鑒於預期投藥途徑及標準醫藥慣例來選擇。醫藥組成物可包含以下作為載劑、賦形劑或稀釋劑或除此以外亦包含以下:任何適合之黏合劑、潤滑劑、懸浮劑、包覆劑、增溶劑。適合黏合劑之實例包括澱粉;明膠;天然糖,諸如葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β-乳糖、玉米甜味劑;天然及合成膠,諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉;羧甲基纖維素;及聚乙二醇。適合潤滑劑之實例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉及其類似物。防腐劑、穩定劑、染料及甚至調味劑可在醫藥組成物中提供。防腐劑之實例包括苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸酯。亦可使用抗氧化劑及懸浮劑。
本發明之組成物可調配成食物產品。舉例而言,食物產品除本發明 之治療作用以外亦可提供營養效益,諸如在營養補充劑中。類似地,食物產品可經調配以增強本發明之組成物之口味或藉由更類似於常見食品項目而非醫藥組成物使組成物對消費而言更具吸引力。在某些實施方案中,本發明之組成物調配成基於乳奶之產品。術語「基於乳奶之產品」意指具有變化之脂肪含量的任何液體或半固體基於乳奶或基於乳清之產品。基於乳奶之產品可為例如乳牛之乳奶、山羊之乳奶、綿羊之乳奶、脫脂乳奶、全脂乳奶、在無任何加工下自乳粉及乳清重組之乳奶,或經加工產品,諸如酸酪乳、凝化乳奶、凝乳、酸乳、全脂酸乳、酪乳及其他酸乳產品。另一個重要群組包括乳奶飲料,諸如乳清飲料、醱酵乳奶、濃縮乳奶、嬰幼兒乳奶;調味乳奶、冰淇淋;含乳奶食物,諸如糖果。
在某些實施方案中,本發明之組成物含有單一細菌菌株或菌種並且不含任何其他細菌菌株或菌種。此等組成物可僅包含微量或生物學上無關量之其他細菌菌株或菌種。此等組成物可為實質上不含生物體之其他菌種之培養物。
根據本發明使用之組成物可能需要或可能不需要行銷核可。
在一些情況下,凍乾細菌菌株在投藥之前復原。在一些情況下,復原係藉由使用本文所述之稀釋劑。
本發明之組成物可包含醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
在某些實施方案中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含:本發明之細菌菌株;及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑;其中當投予有需要之個體時該細菌菌株之量足以治療病症。
在某些實施方案中,本發明提供醫藥組成物,其包含:本發明之細菌菌株;及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑;其中該細菌菌株之量足以治療或預防疾病或病狀。
在某些實施方案中,本發明提供醫藥組成物,其包含:本發明之細 菌菌株;及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑;其中該細菌菌株之量足以治療或預防疾病或病狀。
在某些實施方案中,本發明提供醫藥組成物,其包含:本發明之細菌菌株;及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑;其中該細菌菌株之量足以治療或預防疾病或病狀。
在某些實施方案中,本發明提供醫藥組成物,其包含:本發明之細菌菌株;及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑;其中該細菌菌株之量足以治療或預防由諸如IL-1β、TNF-α、MIP-3α、IL-23或IL-6之促炎性細胞激素介導之疾病或病狀。在較佳實施方案中,本發明提供醫藥組成物,其包含:本發明之細菌菌株;及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑;其中該細菌菌株之量足以治療或預防由TNF-α介導之疾病或病狀。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其中細菌菌株之量以組成物重量計為每克約1×103個至約1×1011個菌落形成單位。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其中該組成物以1g、3g、5g或10g之劑量投予。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其中該組成物係藉由選自由經口、經直腸、皮下、經鼻、經頰及舌下組成之群組的方法投予。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其包含選自由乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇及山梨糖醇組成之群組的載劑。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其包含選自由乙醇、甘油及水組成之群組的稀釋劑。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其包含選自由以下組成之群組的賦形劑:澱粉、明膠、葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β- 乳糖、玉米甜味劑、阿拉伯膠、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉及氯化鈉。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其進一步包含防腐劑、抗氧化劑及穩定劑中之至少一者。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其包含選自由苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸酯組成之群組的防腐劑。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其中該細菌菌株為凍乾的。
在某些實施方案中,本發明提供上述醫藥組成物,其中當組成物在約4℃或約25℃下儲存於密封容器中且容器置於具有50%相對濕度之氛圍中時,如以菌落形成單位量測之至少80%之細菌菌株在至少約1個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年之時段後仍保留。
培養方法
用於本發明中之細菌菌株可使用如例如參考文獻[63、64、65]中詳述之標準微生物學技術來培養。
用於培養之固體或液體培養基可為YCFA瓊脂或YCFA培養基。YCFA培養基可包括(每100mL,近似值):酪腖(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、NaHCO3(0.4g)、半胱胺酸(0.1g)、K2HPO4(0.045g)、KH2PO4(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH4)2SO4(0.09g)、MgSO4.7H2O(0.009g)、CaCl2(0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯化血紅素(1mg)、生物素(1μg)、鈷胺素(1μg)、對胺基苯甲酸(3μg)、葉酸(5μg)及吡哆胺(15μg)。
用於疫苗組成物中之細菌菌株
本發明者已鑑別本發明之細菌菌株適用於治療或預防與降低免疫活性相關聯之疾病或病狀。此可能為本發明之細菌菌株對宿主免疫系統所具有之 作用的結果。因此,本發明之組成物當作為疫苗組成物投予時亦可適用於預防疾病或病狀。在某些此類實施方案中,本發明之細菌菌株可經殺滅、滅活或減弱。在某些此類實施方案中,組成物可包含疫苗佐劑。在某些實施方案中,組成物用於經由注射,諸如經由皮下注射投予。
通則
除非另有指示,否則本發明之實踐將採用在此項技術之技能範圍內之化學、生物化學、分子生物學、免疫學及藥理學之習用方法。此等技術在文獻中全面解釋。參見例如參考文獻[66]及[67、68、69、70、71、72、73]等。
術語「包含」涵蓋「包括」以及「組成」,例如「包含」X之組成物可排他地由X組成或可包括額外事物,例如X+Y。
關於數值x之術語「約」為視情況存在的且意指例如x±10%。
字詞「實質上」不排除「完全」,例如「實質上不含」Y之組成物可完全不含Y。必要時,字詞「實質上」可自本發明之定義省略。
提及兩個核苷酸序列之間的百分比序列一致性意指當比對時,彼百分比之核苷酸在比較兩個序列中為相同的。此比對及百分比同源性或序列一致性可使用此項技術中已知之軟體程式確定,例如參考文獻[74]之章節7.7.18中所述之彼等。較佳比對係藉由史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜尋演算法使用空位開放罰分12及空位擴展罰分2、BLOSUM矩陣62進行仿射空位搜尋來確定。史密斯-沃特曼同源性搜尋演算法在參考文獻[75]中揭示。
除非另有規定,否則包含眾多步驟之製程或方法可在方法開始或結束時包含額外步驟,或可包含額外中間步驟。又,適當時,步驟可組合、省略或以替代性次序進行。
本文描述本發明之各種實施方案。應瞭解,各實施方案中指定之特徵可與其他指定特徵組合,以提供其他實施方案。特別地,本文中突出強調為 適合、典型或較佳之實施方案可彼此組合(除非該等實施方案相互排斥)。
實施本發明之方式 實施例1-細菌接種體在小鼠癌症模型中之功效
概述
本研究測試根據本發明之包含細菌菌株之組成物在四個腫瘤模型中之功效。
材料
測試物質-細菌菌株#MRx0518。
參考物質-抗CTLA-4抗體(純系:9H10,目錄號:BE0131,同型:敘利亞倉鼠IgG1,Bioxcell)。
測試及參考物質媒劑-細菌培養基(酵母提取物、酪腖、脂肪酸培養基(YCFA))。在向小鼠注射之每一天,用PBS(參考:BE14-516F,Lonza,France)稀釋抗體。
處理劑量-細菌:2×108個,於200μL中。以每次注射10mg/kg來注射抗CTLA-4。根據小鼠之最新體重,以每次投藥10mL/kg之劑量體積投予抗CTLA-4(即,對於一隻重20g之小鼠,將投予200μL測試物質)。
投藥途徑-藉由經口管飼(口服,PO)經由套管投予細菌接種體。每天對套管進行消毒。將抗CTLA-4注射至小鼠之腹腔中(腹膜內,IP)。
細菌菌株之培養條件-細菌菌株之培養條件如下:
˙將10mL YCFA(來自經製備之10mL E&O實驗室瓶)吸移至亨蓋特管(Hungate tube)中
˙將管密封且使用注射器輸入及排出系統用CO2吹掃
˙高壓蒸煮亨蓋特管
˙當冷卻時,用1mL甘油儲備液接種亨蓋特管
˙將管置於靜態37℃培育箱中約16小時
˙次日,獲取1mL此繼代培養物且接種10mL YCFA(再次用預升溫之經吹掃亨蓋特管,全部一式兩份)
˙將其置於靜態37℃培育箱中5至6小時
癌細胞系及培養條件-
所使用之細胞系在下表中詳述:
Figure 108109417-A0202-12-0044-1
EMT-6細胞系係自在植入增生性乳腺肺泡結節之後在BALB/cCRGL小鼠中產生之可移植鼠類乳腺癌建立[76]。
LL/2(LLC1)細胞系係自帶有由植入原發性路易斯肺癌(primary Lewis lung carcinoma)產生之腫瘤之C57BL/6小鼠的肺建立[77]。
Hepa 1-6細胞系為在C57/L小鼠中產生之BW7756小鼠肝腫瘤之衍生物[78]。
細胞培養條件-在37℃下在加濕氛圍(5% CO2、95%空氣)中使所有細胞系生長為單層。培養基及補充物在下表中指示:
Figure 108109417-A0202-12-0044-2
對於實驗使用,在不含鈣或鎂之漢克氏培養基(Hanks' medium)(參 考:BE10-543F,Lonza)中藉由用胰蛋白酶-維耳新(versene)(參考:BE17-161E,Lonza)處理5分鐘使黏附性腫瘤細胞自培養瓶脫離,且藉由添加完全培養基中和。在血球計中對細胞進行計數且將藉由0.25%錐蟲藍排除檢定來評估其活力。
動物使用-
重量及年齡匹配之健康雌性BALB/C(BALB/cByJ)小鼠獲自CHARLES RIVER用於EMT6及RENCA模型實驗。
重量及年齡匹配之健康雌性C57BL/6(C57BLl6J)小鼠獲自CHARLES RIVER(L'Arbresles)用於LL/2(LLC1)及Hepa1-6模型實驗。
根據FELASA準則將動物維持在SPF健康狀態中,且遵循根據法國及歐洲法規(French and European Regulations)及實驗室動物照護與使用NRC指南(NRC Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)之動物圈養及實驗程序[79、80]。在以下受控環境條件下將動物維持在圈養室中:溫度:22±2℃,濕度55±10%,光週期(12小時光照/12小時黑暗),HEPA過濾空氣,每小時15次空氣交換而無再循環。動物圍欄提供有無菌及足夠之空間,其中底墊材料、食物及水、環境及社會化富集(分組圈養)如下所述:在通風框架中之900cm2籠(參考:綠色,Tecniplast)、Epicea底墊(SAFE)、10kGy照射膳食(A04-10,SAFE)、用於免疫感受態囓齒動物之完全食物-R/M-H擠出物、來自水瓶之水。
實驗設計及處理
抗腫瘤活性,EMT6模型
處理時程-首次給藥之起點視為D0。在D0時,使用Vivo manager®軟體(Biosystemes,Couternon,France)將非移入之小鼠根據其個別體重隨機分至9/8隻之組中。在D0時,小鼠接受媒劑(培養基)或細菌菌株。在D14時,如下文所述向所有小鼠移入EMT-6腫瘤細胞。在D24時,來自陽性對照組之小鼠接受抗CTLA-4抗體處理。
處理時程在下表中概述:
Figure 108109417-A0202-12-0046-3
如下文所述進行動物監測。
在動物中誘發EMT6腫瘤-在D14時,藉由將含1×106個EMT-6細胞之200μL RPMI 1640皮下注射至小鼠之右側腹中來誘發腫瘤。
安樂死-當各小鼠到達如下文所述之人道終點時或在給藥開始後最多6週之後,使各小鼠安樂死。
抗腫瘤活性,LL/2(LLC1)模型
處理時程-首次給藥之起點視為D0。在D0時,使用Vivo manager®軟體(Biosystemes,Couternon,France)將非移入之小鼠根據其個別體重隨機分至9/8隻之7個組中。在D0時,小鼠接受媒劑(培養基)或細菌菌株。在D14時,如下文所述向所有小鼠移入LL/2腫瘤細胞。在D27時,來自陽性對照組之小鼠接受抗CTLA-4抗體處理。
處理時程在下表中概述:
Figure 108109417-A0202-12-0046-4
如下文所述進行動物監測。
在動物中誘發LL/2(LLC1)腫瘤-在D14時,藉由將含1×106個LL/2(LLC1)細胞之200μL RPMI 1640皮下注射至小鼠之右側腹中來誘發腫瘤。
安樂死-當各小鼠到達如下文所述之人道終點時或在給藥開始後最多6週之後,使各小鼠安樂死。
抗腫瘤活性,Hepa1-6模型
處理時程-首次給藥之起點視為D0。在D0時,使用Vivo manager®軟體(Biosystemes,Couternon,France)將非移入之小鼠根據其個別體重隨機分至9隻之7個組中。在D0時,小鼠接受媒劑(培養基)或細菌菌株。在D14時,如下文所述向所有小鼠移入Hepa 1-6腫瘤細胞。在D16時,來自陽性對照組之小鼠接受抗CTLA-4抗體處理。
處理時程在下表中概述:
Figure 108109417-A0202-12-0047-5
如下文所述進行動物監測。
藉由脾內注射在動物中正位誘發Hepa 1-6腫瘤細胞-在D0時,經由脾內注射將含一百萬(1×106)個Hepa 1-6腫瘤細胞之50μL RPMI 1640培養基移植至小鼠中。簡言之,製造小的左肋緣下側腹切口且使脾外露。使脾暴露於無菌紗布墊上,且在目視控制下用27號針注射細胞懸浮液。在細胞接種之後,將脾切除。
安樂死-當各小鼠到達如下文章節中所述之人道終點時或在給藥開始後最多6週之後,使各小鼠安樂死。
在安樂死時評定腫瘤負荷-在終止時間處,收集肝且稱重。
抗腫瘤活性,RENCA模型
處理時程-首次給藥之起點視為D0。在D0時,將非移入之小鼠根 據其個別體重隨機分至12隻小鼠之組中。在D0時,小鼠接受媒劑(培養基)或細菌菌株(2×108個,於100μL中,PO)。在D14時,如下文所述向所有小鼠移入皮下注射至左後側腹中之RENCA腫瘤細胞。自D17起始抗CTLA-4(純系9D9,10mg/kg,IP)及抗PDL1(純系10F.9G2,10mg/kg,IP)處理。
處理時程在下表中概述:
Figure 108109417-A0202-12-0048-6
如下文所述進行動物監測。
在D14時(細菌給藥/預處理2週之後),將含5×105個活細胞之100μL PBS皮下注射至各小鼠之左後側腹(已用醫用酒精殺菌)中,每隻小鼠1個注射器及針。在細胞植入前一天將植入部位剃毛。
安樂死-當各小鼠到達如下文章節中所述之人道終點時或在給藥開始後最多6週之後,使各小鼠安樂死。
在安樂死時評定腫瘤負荷-在終止時間處,收集腫瘤且評定其體積。
動物監測
臨床監測-每週2至3次用測徑器量測腫瘤之長度及寬度且由此公式[81]估算腫瘤之體積:
Figure 108109417-A0202-12-0048-7
人道終點[82]:疼痛、折磨或痛苦之徵象:疼痛姿勢、疼痛面罩、行為;腫瘤超過正常體重之10%,但不超過2000mm3;腫瘤干擾移動或營養;腫 瘤潰爛或組織侵蝕;連續3天保持20%之體重損失;不良身體狀況、消瘦、惡病質、脫水;長時間缺乏對外部刺激之自主反應;快速勉力呼吸、貧血、顯著出血;神經徵象:轉圈、抽搐、麻痹;體溫持續下降;腹脹。
麻醉-異氟烷氣體麻醉用於所有程序:手術或腫瘤接種、靜脈內注射、血液收集。克他明(Ketamine)及甲苯噻嗪(Xylazine)麻醉用於立體定位手術程序。
止痛-卡洛芬(carprofen)或多模式卡洛芬/丁丙諾啡(buprenorphine)止痛方案針對手術程序之嚴重性加以改適。為所有疼痛程序提供非藥理照護。另外,在主治獸醫之建議下提供不干擾研究(主題處理)之藥理照護。
安樂死-藉由過劑量氣體麻醉(異氟烷)繼之以頸椎脫位或放血進行動物之安樂死。
結果
抗腫瘤活性,EMT6模型
結果示於圖1A中。用本發明之細菌菌株處理使得腫瘤體積相對於兩個陰性對照明顯減小。正如預期,陽性對照亦使得腫瘤體積減小。
為進一步闡明MRx0518在同系腫瘤模型中傳遞其治療作用之機制,在同系EMT6腫瘤模型研究上進行離體分析。儘管腫瘤體積為臨床前腫瘤學研究中之主要量度,但腫瘤常常由主動分裂之腫瘤細胞與壞死核心一起組成。為研究MRx0518處理是否對EMT6腫瘤內發現之壞死程度具有影響,將來自中腹部腫瘤區之石蠟切片用蘇木精及曙紅染色。鼠類EMT6乳癌模型之MRx0518處理顯示增加腫瘤內壞死之橫剖面積之傾向(圖1B,上圖)。為研究MRx0518處理是否對腫瘤內之分裂細胞具有影響,將來自中腹部腫瘤區之石蠟切片用增殖蛋白Ki67與DAPI對比染色劑一起染色,以估算EMT6腫瘤內分裂之細胞百分比。鼠類EMT6乳癌模型之MRx0518處理顯著降低腫瘤內所見之分 裂細胞之百分比(圖1B,下圖,P=0.019)。
免疫細胞群體
經由腫瘤之流動式細胞量測術進行腫瘤微環境之進一步研究,以研究MRx0518細菌菌株具有調控免疫系統以誘導抗腫瘤作用之能力的假設。將自不同處理組切除之腫瘤切成片。使一片經受流動式細胞量測術分析。為評估存在於腫瘤內之T淋巴細胞之相對百分比,使用以下標誌物:CD45、CD3、CD4、CD8、CD25及FoxP3。
圖1C中呈現之初步流動式細胞量測術資料(且由下文所述之資料進一步支持,呈現於圖23中)顯示當分別與媒劑或對照動物相比時,腫瘤中淋巴細胞之相對百分比在MRx0518與抗CTLA-4處理組中均略微降低。同樣地,CD4+細胞之相對百分比似乎在MRx0518及抗CTLA-4處理動物中降低,而CD8+細胞之相對百分比在兩個組中遵循相反趨勢,儘管量級不同。當與MRx0518處理動物中之略微降低相比時,CD4+FoxP3+細胞之相對百分比在抗CTLA-4處理組中更低;然而,CD4+CD25+細胞之相對百分比的降低僅在抗CTLA-4處理組中顯而易見。CD8+/FoxP3+比率在抗CTLA-4處理組中比在MRx0518動物中顯示更大增加。此處呈現之此等資料支持抗CTLA-4抗體藉由減少調控性T細胞(Treg)之細胞數目或減弱其在腫瘤組織中之抑制活性而靶向調控性T細胞,同時表明MRx0518之不同作用模式。
使用腫瘤組織之NanoString分析進行腫瘤微環境之額外研究,以研究MRx0518細菌菌株是否具有調控免疫系統以在EMT6模型中誘導抗腫瘤作用之能力。收集自媒劑及MRx0518處理組切除之腫瘤。使用TRIzol試劑(ThermoFisher)自腫瘤組織提取RNA,繼而使用包括DNase I處理(Qiagen)之RNeasy微型套組(Qiagen)淨化。RNA接著用於使用PanCancer Mouse IO 360面板進行Nanostring分析。先前顯示作為各種細胞群體之特徵之基因用於量測此等 群體之豐度:
Figure 108109417-A0202-12-0051-8
使用由NanoString分析提供之線性細胞類型分數計算各細胞群體之Z分數(圖23,熱圖)。
NanoString資料顯示當與媒劑處理動物相比時,B細胞、CD45、T細胞、細胞毒性及NK細胞之豐度在MRx0518處理組之腫瘤組織中增加(圖23)。此處呈現之資料支持MRx0518藉由增加腫瘤微環境中之白血球,尤其NK細胞、T細胞及細胞毒性細胞而具有免疫刺激作用之假設。
細胞激素產生
另一腫瘤片與血漿樣品一起用於總蛋白質提取及後續細胞激素分析。藉由MagPix技術分析腫瘤微環境中IL-10、CXCL1、CXCL2、CXCL10、IL-1β、IL-17A、GM-CSF、TNF-α、IL-12p70及IFN-γ之蛋白質水準。儘管IL-17A及GM-CSF低於偵測水準,但所有其他標誌物均以合理之水準表現(圖1D)。對於IFN-γ在媒劑與抗CTLA-4組之間觀測到顯著差異。在MRx0518處理之後與對照處理相比,IL-10及IL-12p70免疫標誌物之產生似乎減少。
亦評估相同動物之血漿中之細胞激素水準。藉由MagPix技術分析IL-23、IL-6、IL-10、VEGF、CXCL1、CXCL2、CXCL10、IL-2、IL-1β、IL-17A、GM-CSF、TNF-α、IL-12p70及IFN-γ之蛋白質水準。總體上,在腫瘤誘發之前 或在研究結束時在動物血漿中偵測到極少細胞激素產生(圖1E)。偵測到實質性水準之VEGF及CXCL10,同時偵測到低水準之IL-23、IL-6、IL-10、CXCL1及CXCL2。在樣品中未偵測到IL-2、IL-1b、IL-17A、GM-CSF、TNF-α、IL-12p70及IFN-γ。第0天,MRx0518顯著增加IL-6產生。MRx0518亦似乎增加IL-23產生。第22天,VEGF及CXCL10在抗CLTA-4組中顯著下調。類似於免疫細胞群體所示之結果,在MRx0518與抗CTLA-4之間腫瘤及血漿中之細胞激素產生之差異表明其各自以不同且潛在互補之機制起作用。
CD8α陽性細胞在迴腸中之定位
在低溫恆溫器(CM 1950 Leica)中切割10μm迴腸冷凍切片,採集至聚L離胺酸載片上。接著將切片經空氣乾燥1小時,在冰冷甲醇中固定10分鐘,在PBS中洗滌,在含10% BSA之PBS(pH 7.2)中阻斷,隨後與初級抗體(大鼠抗小鼠CD8α抗體,Sigma-Aldrich,Millipore)一起培育隔夜。
次日早晨,在PBS中洗滌載片且在室溫下用二級抗體山羊抗大鼠抗體Alexa488(Molecular Probe,Invitrogen)染色1小時。在另一個洗滌步驟之後,將載片用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)(Sigma-Aldrich,Millipore)對比染色且在Vectashield(Vector Laboratories)中封固。使用配備有水銀蒸氣燈、適當濾光片及×20複消色差物鏡之Zeiss Axioscope顯微鏡檢視載片並成像。展示由來自媒劑、MRx0518及抗CTLA4動物之載片獲得之影像的實例(圖1F-上圖:DAPI染色,下圖:CD8α染色)。
自20隻動物檢查視場且使用手動曝光時間成像。所分析之動物及視場之數目示於下表中:
Figure 108109417-A0202-12-0052-9
如下對影像記分:具有
Figure 108109417-A0202-12-0053-93
3個陽性細胞之視場記為0,而具有更多
Figure 108109417-A0202-12-0053-96
3個細胞之視場記為1。展示此分析之結果(圖1G)。
用抗CD8α染色之迴腸冷凍切片顯示與媒劑組相比,更高數目之CD8α陽性細胞定位於來自經MRx0518及抗CTLA-4處理之動物之隱窩區組織中。
此觀測與作為免疫反應之一部分在感染或炎性微環境之情況下存在於腸中之CD8+ T細胞一致。
抗腫瘤活性,LL/2(LLC1)模型
結果示於圖2中。用本發明之細菌菌株處理使得腫瘤體積相對於兩個陰性對照明顯減小。
抗腫瘤活性,Hepa1-6模型
結果示於圖3A中。未經處理之陰性對照似乎不如預期,此係因為此組中之肝重量低於其他組。然而,媒劑陰性對照與陽性對照組均似乎正如預期,此係因為經單獨媒劑處理之小鼠比經抗CTLA4抗體處理之小鼠具有更大之肝,反映媒劑陰性對照組中之腫瘤負荷更大。用本發明之細菌菌株處理使得肝重量(且因此腫瘤負荷)相對於媒劑陰性對照組中之小鼠明顯降低。
抗腫瘤活性,RENCA模型
結果示於圖3B中。用MRx0518單一療法處理使測試/對照之腫瘤體積與媒劑處理組相比減小51%(第18天)。太平洋紫杉醇及抗CTLA-4+抗PDL-1顯示在D18及D22時與未經處理組及媒劑組相比,腫瘤尺寸(幾乎)完全減小。
此等資料指示菌株MRx0518可適用於治療或預防與降低之免疫系統活性相關聯之其他疾病。
實施例2-PCR基因分析
在PCR基因分析中研究細菌MRx0518之純培養物。實驗有兩個分 支:1)將MRx0518與人結腸細胞(CaCo2)共同培養以研究細菌對宿主之作用,及2)將MRx0518與經IL1刺激之CaCo2細胞共同培養以模擬在炎性環境中細菌之作用。經由基因表現分析評定在兩種情形中之作用。結果如下所示:
Figure 108109417-A0202-12-0054-10
此等資料似乎顯示兩個基因表現標識-CXCR1/2配位體(CXCL3、 CXCL2、CXCL1、IL-8),其與促炎性細胞遷移相關聯;及CXCR3配位體(CXCL9、CXCL10),其更特異性地指示IFN-γ型反應,亦由IFN-γ可誘導性IL-32支持。此等資料表明本發明之組成物適用於刺激免疫系統。
實施例3-穩定性測試
在25℃或4℃下將含有至少一種本文所述之細菌菌株之本文所述之組成物儲存於密封容器中,且將容器置於具有30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%或95%相對濕度之氛圍中。1個月、2個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年後,如以藉由標準方案確定之菌落形成單位量測之至少50%、60%、70%、80%或90%之細菌菌株應保留。
實施例4-在未成熟樹突狀細胞中與MRx0518+LPS相比由MRx0518誘導之細胞激素產生
概述
本研究測試單獨及與脂多醣(LPS)組合之細菌菌株MRx0518對未成熟樹突狀細胞中之細胞激素產生之作用。
自外周血單核細胞(PBMC)分離單核細胞群體。隨後使單核細胞分化成未成熟樹突狀細胞。將未成熟樹突狀細胞以200,000個細胞/孔塗盤,且與107/mL最終濃度之MRx0518一起培育,視情況添加100ng/mL最終濃度之LPS。陰性對照涉及將細胞與單獨RPMI培養基一起培育,且陽性對照將細胞與100ng/mL最終濃度之LPS一起培育。接著分析細胞之細胞激素含量。
結果
此等實驗之結果在圖4a至圖4d中可見。單獨MRx0518之添加使得細胞激素IL-6及TNF-α之水準與陰性對照相比有實質性增加(圖4a及圖4c)。LPS之添加(陽性對照)使得IL-6及TNF-α之水準與陰性對照相比增加,但IL-1β並不增加(圖4b)。MRx0518與LPS之組合使得所產生之IL-1β之水準協同增加(圖4d)。
結論
MRx0518具有誘導未成熟樹突狀細胞中更高IL-6及TNF-α細胞激素產生之能力。LPS與MRx0518之組合可增加未成熟樹突狀細胞中細胞激素IL-1β之水準。此等資料指示單獨或與LPS組合之MRx0518可增加炎性細胞激素IL-1β、IL-6及TNF-α,此促進發炎。
實施例5-在THP-1細胞中與MRx0518+LPS相比由MRx0518誘導之細胞激素產生
概述
本研究測試單獨及與LPS組合之細菌菌株MRx0518對THP-1細胞中之細胞激素產生之作用,THP-1細胞為單核細胞及巨噬細胞之模型細胞系。
使THF-1細胞分化至M0培養基中與5ng/mL佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA)一起持續48小時。隨後將此等細胞與108/mL最終濃度之MRx0518一起培育,同時添加或不添加100ng/mL最終濃度之LPS。接著洗去細菌且將細胞在正常生長條件下培育24小時。接著使細胞快速離心且分析所得上清液之細胞激素含量。
結果
此等實驗之結果在圖5a至圖5c中可見。在無LPS之情況下MRx0518之添加使得IL-1β、IL-6及TNF-α之細胞激素水準與無細菌及細菌沈積物對照相比增加。LPS及MRx0518之添加使得細胞激素之產生協同增加。
結論
MRx0518具有誘導THP-1細胞中之細胞激素產生之能力,該細胞激素產生可在LPS添加下協同增加。此等資料指示單獨或與LPS組合之MRx0518可增加炎性細胞激素IL-1β、IL-6及TNF-α,此促進發炎。
實施例6-細胞激素分析
引言
本發明者力圖進一步分析本發明之組成物之免疫刺激作用。本發明者分析在用MRx0518處理後來自THP-1巨噬細胞及來源於單核細胞之樹突狀細胞之特定細胞激素之表現。巨噬細胞及樹突狀細胞為先天性免疫系統之關鍵組分,充當先天性免疫系統與適應性免疫系統之間的信使且存在於腸道中,在此其釋放多種細胞激素以調節免疫反應。
分析先天性免疫反應中涉及之細胞激素(TNF-α、IL-12及IL-10)且亦分析適應性免疫細胞之募集及活化中涉及之細胞激素(IL-8、IL-23、IL-1β及IL-6)。
方法
細菌菌株
MRx0518
LPS用作陽性對照
結果
結果示於圖6至圖13中。MRx0518誘導源自THP-1之巨噬細胞及來源於單核細胞之DC中之強且具特徵性之免疫刺激型態。先天性免疫反應中涉及之細胞激素(TNF-α、IL-12及IL-10)在DC與巨噬細胞中由MRx0518顯著誘導。MRx0518誘導巨噬細胞與DC中之IL-8之極強且顯著之誘導。MRX0581誘導IL-23及IL-6之強且顯著之誘導。MRx0518亦誘導IL-1β。
論述
此等資料顯示MRx0518具有免疫刺激特性,且可為用於免疫刺激之有效組成物。
實施例7-作用機制
進行進一步實驗以特徵化MRx0518刺激免疫系統之作用機制。選擇 TLR5信號傳導報導體檢定且資料呈現於圖14及圖15中。MRx0518上清液為TLR5及NF-κB之最強效活化劑。又,用各種細胞溶解酶處理上清液且發現胰蛋白酶消除大部分活性。
實施例8-MRx0518在與CTLA-4抑制劑之治療性組合中之輔助免疫刺激活性
概述
本研究比較MRx0518、CTLA-4抑制劑及MRx0518與CTLA-4抑制劑之治療性組合在帶有EMT-6腫瘤細胞之小鼠中之抗腫瘤活性。
材料
測試及參考物質-細菌菌株#MRx0518;抗CTLA4抗體(參考:BE0131,Bioxcell;純系:9H10;反應性:小鼠;同型:倉鼠IgG1;儲存條件:+4℃)。
測試及參考物質媒劑-使MRx0518細菌在細菌培養基(酵母提取物、酪腖、脂肪酸培養基(YCFA))中生長且作為甘油儲備液保持於-80℃下。根據研究方案向動物給予細菌。在向小鼠注射之每一天,用PBS(參考:BE14-516F,Lonza,France)稀釋抗CTLA-4抗體。
處理劑量-細菌:2×108個,於200μL中。根據小鼠之最新體重,以10毫克/公斤體重投予抗CTLA4抗體。
投藥途徑-藉由經口管飼(口服,PO)經由飼管以每次注射200μL之體積投予細菌組成物。將抗CTLA-4抗體以針對小鼠之最新個別體重調整之10mL/kg體積注射至小鼠之腹腔中(腹膜內,IP)。
癌細胞系及培養條件-本研究中所用之細胞系為獲自ATCC(美國菌種保存中心(American Type Culture Collection),Manassas,Virginia,USA)之EMT-6細胞系。EMT-6細胞系係自在植入增生性乳腺肺泡結節之後在BALB/cCRGL小鼠中產生之可移植鼠類乳腺癌建立。
在37℃下在加濕氛圍(5% CO2、95%空氣)中使腫瘤細胞生長為單層。培養基為含有2mM L-麩醯胺(參考:BE12-702F,Lonza,Verviers,Belgium)且補充有10%胎牛血清(參考:3302,Lonza)之RPMI 1640。EMT-6腫瘤細胞黏附至塑膠瓶。對於實驗使用,在不含鈣或鎂之漢克氏培養基(參考:BE10-543F,Lonza)中藉由用胰蛋白酶-維耳新(參考:BE02-007E,Lonza)處理5分鐘使腫瘤細胞自培養瓶脫離,且藉由添加完全培養基中和。對細胞進行計數且藉由0.25%錐蟲藍排除檢定來評估其活力。
動物使用-5至7週齡之健康雌性BALB/C(BALB/cByJ)小鼠獲自CHARLES RIVER(L'Arbresles)且根據FELASA準則維持在SPF健康狀態中。根據法國及歐洲法規及實驗室動物照護與使用NRC指南實現動物圈養及實驗程序。在以下受控環境條件下在圈養室中每籠維持3至4隻動物:溫度:22±2℃,濕度55±10%,光週期(12小時光照/12小時黑暗),HEPA過濾空氣,每小時15次空氣交換而無再循環。動物圍欄提供有無菌及足夠之空間,其中底墊材料、食物及水、環境及社會化富集(分組圈養)如下所述:頂置過濾器聚碳酸酯歐標III或IV型籠、玉米穗軸底墊(參考:LAB COB 12,SERLAB,France)、25kGy照射膳食(Ssniff® Soest,Germany)、用於免疫感受態囓齒動物之完全食物-R/M-H擠出物、經0.2μm過濾之無菌水及環境富集(SIZZLE-dri kraft-D20004 SERLAB,France)。動物用RFID轉發器個別地鑑別且各籠用特定代碼標記。在第2批及第3批馴化一週後或在第1批馴化三週後開始處理動物。
實驗設計及處理
第-14天(D-14),使用Vivo Manager®軟體(Biosystemes,Couternon,France)將非移入之小鼠根據其個別體重隨機分至30隻動物之3個組及10隻動物之2個組中。將小鼠分成每個處理組10隻動物之3個批次(第1批:第1組、第2組及第3組之10隻動物;第2批:第1組、第2組及第3組之10隻動物;及 第3批:第1組至第5組之10隻動物),自研究起點D-14或D0具有不同終止點。
在終止時,歸因於終止及FACS分析時程將第3批分成2個組群;此等時程錯開1天:D24/D25。因此,動物之每個組群具有每個處理組5隻動物(來自第1籠之4隻動物及來自第2籠之1隻動物)。基於倫理標準,若腫瘤體積大於1500mm3,則有待在D24及D25處死之動物的選擇係基於腫瘤體積而非籠。實驗設計描繪於圖16A中且概述如下:
1)第1批(第1組、第2組及第3組)在D0開始處理且在D14進行挑選(10隻動物構成第1組至第3組)。此等不接受腫瘤細胞且組成基線組。
2)第2批(第1組、第2組及第3組)在D-14開始處理且在D7進行挑選(10隻動物構成第1組至第3組)。
3)第3批(第1組至第5組)在D-14開始處理且在D24/25進行挑選(10隻動物構成第1組至第5組)。抗CTLA-4之處理在D10開始。
第0天(D0),藉由將含1×106個EMT-6細胞之200μL RPMI 1640皮下注射至右側腹中向第2批及第3批之所有小鼠(分別在第7天及第24/25天終止)移入EMT-6腫瘤細胞(來自第1批之30隻小鼠,在D14處死,不接受腫瘤注射)。根據以下處理時程組處理小鼠(TW×2=每週兩次):
Figure 108109417-A0202-12-0060-11
Figure 108109417-A0202-12-0061-12
動物監測
每天記錄動物之活力及行為。每週兩次量測體重。每週兩次用測徑器量測腫瘤之長度及寬度且由以下公式估算腫瘤之體積:
Figure 108109417-A0202-12-0061-13
依據測試物質對經處理動物相對於對照動物之腫瘤體積之影響來評估處理功效。使用Vivo Manager®軟體(Biosystemes,Couternon,France)確定抗腫瘤功效之以下評定標準。第1組至第5組之平均腫瘤體積描繪於圖16B中。在整個研究過程中,觀測所有組中腫瘤生長之進展,例外為MRx0518+抗CTLA-4處理組,其中腫瘤生長之衰退在腫瘤誘發後第14天出現。在腫瘤誘發後第21天及第24天,MRx0518+抗CTLA-4處理與媒劑處理組相比顯著降低腫瘤生長。MRx0518與抗CTLA-4之組合處理最有效地降低帶有皮下移植之EMT6腫瘤之BALB/c小鼠中之腫瘤生長。此等資料證實MRx0518具有免疫刺激作用。
實施例9-細菌接種體在小鼠癌症模型中之功效
概述
本研究測試根據本發明之包含細菌菌株之組成物在腫瘤模型中之功效。
材料
測試物質-細菌菌株#MRx0554。
參考物質-抗CTLA-4抗體(純系:9H10,目錄號:BE0131,同型:敘利亞倉鼠IgG1,Bioxcell)。
測試及參考物質媒劑-細菌培養基(酵母提取物、酪腖、脂肪酸培養基(YCFA))。在向小鼠注射之每一天,用PBS(參考:BE14-516F,Lonza,France) 稀釋抗體。
處理劑量-細菌:2×108個,於200μL YCFA中。以每次注射10mg/kg來注射抗CTLA-4。根據小鼠之最新體重,以每次投藥10mL/kg之劑量體積投予抗CTLA-4(即,對於一隻重20g之小鼠,將投予200μL測試物質)。
投藥途徑-藉由經口管飼(口服,PO)經由套管投予細菌接種體。每天對套管進行消毒。將抗CTLA-4注射至小鼠之腹腔中(腹膜內,IP)。
細菌菌株之培養條件-細菌菌株之培養條件如下:
˙將10mL YCFA(來自經製備之10mL E&O實驗室瓶)吸移至亨蓋特管中
˙將管密封且使用注射器輸入及排出系統用CO2吹掃
˙高壓蒸煮亨蓋特管
˙當冷卻時,用1mL甘油儲備液接種亨蓋特管
˙將管置於靜態37℃培育箱中約16小時
˙次日,獲取1mL此繼代培養物且接種10mL YCFA(再次用預升溫之經吹掃亨蓋特管,全部一式兩份)
˙將其置於靜態37℃培育箱中5至6小時
癌細胞系及培養條件-
所使用之細胞系在下表中詳述:
Figure 108109417-A0202-12-0062-97
EMT-6細胞系係自在植入增生性乳腺肺泡結節之後在BALB/cCRGL小鼠中產生之可移植鼠類乳腺癌建立[83]。
細胞培養條件-在37℃下在加濕氛圍(5% CO2、95%空氣)中使所有細胞系生長為單層。培養基及補充物在下表中指示:
Figure 108109417-A0202-12-0062-15
對於實驗使用,在不含鈣或鎂之漢克氏培養基(參考:BE10-543F,Lonza)中藉由用胰蛋白酶-維耳新(參考:BE17-161E,Lonza)處理5分鐘使黏附性腫瘤細胞自培養瓶脫離,且藉由添加完全培養基中和。在血球計中對細胞進行計數且將藉由0.25%錐蟲藍排除檢定來評估其活力。
動物使用-
重量及年齡匹配之健康雌性BALB/C(BALB/cByJ)小鼠獲自CHARLES RIVER(L'Arbresles)用於EMT6模型實驗。
根據FELASA準則將動物維持在SPF健康狀態中,且遵循根據法國及歐洲法規及實驗室動物照護與使用NRC指南之動物圈養及實驗程序[84、85]。在以下受控環境條件下將動物維持在圈養室中:溫度:22±2℃,濕度55±10%,光週期(12小時光照/12小時黑暗),HEPA過濾空氣,每小時15次空氣交換而無再循環。動物圍欄提供有無菌及足夠之空間,其中底墊材料、食物及水、環境及社會化富集(分組圈養)如下所述:在通風框架中之900cm2籠(參考:綠色,Tecniplast)、Epicea底墊(SAFE)、10kGy照射膳食(A04-10,SAFE)、用於免疫感受態囓齒動物之完全食物-R/M-H擠出物、來自水瓶之水。
實驗設計及處理
抗腫瘤活性,EMT6模型
處理時程-首次給藥之起點視為D0。在D0時,使用Vivo manager®軟體(Biosystemes,Couternon,France)將非移入之小鼠根據其個別體重隨機分至8至9隻之組中。在D0時,小鼠接受媒劑(培養基)或細菌菌株。在D14時,如下文所述向所有小鼠移入EMT-6腫瘤細胞。在D24時,來自陽性對照組之小鼠接受抗CTLA-4抗體處理。
處理時程在下表中概述:
Figure 108109417-A0202-12-0063-98
Figure 108109417-A0202-12-0064-17
如下文所述進行動物監測。
在動物中誘發EMT6腫瘤-在D14時,藉由將含1×106個EMT-6細胞之200μL RPMI 1640皮下注射至小鼠之右側腹中來誘發腫瘤。
安樂死-當各小鼠到達如下文所述之人道終點時或在給藥開始後最多6週之後,使各小鼠安樂死。
動物監測
臨床監測-每週兩次用測徑器量測腫瘤之長度及寬度且由此公式[86]估算腫瘤之體積:
Figure 108109417-A0202-12-0064-18
人道終點[87]:疼痛、折磨或痛苦之徵象:疼痛姿勢、疼痛面罩、行為;腫瘤超過正常體重之10%,但不超過2000mm3;腫瘤干擾移動或營養;腫瘤潰爛或組織侵蝕;連續3天保持20%之體重損失;不良身體狀況、消瘦、惡病質、脫水;長時間缺乏對外部刺激之自主反應;快速勉力呼吸、貧血、顯著出血;神經徵象:轉圈、抽搐、麻痹;體溫持續下降;腹脹。
麻醉-異氟烷氣體麻醉用於所有程序:手術或腫瘤接種、靜脈內注射、血液收集。克他明及甲苯噻嗪麻醉用於立體定位手術程序。
止痛-卡洛芬或多模式卡洛芬/丁丙諾啡止痛方案針對手術程序之嚴重性加以改適。為所有疼痛程序提供非藥理照護。另外,在主治獸醫之建議下提供不干擾研究(主題處理)之藥理照護。
安樂死-藉由過劑量氣體麻醉(異氟烷)繼之以頸椎脫位或放血進行 動物之安樂死。
結果
抗腫瘤活性,EMT6模型
結果示於圖17中。用本發明之細菌菌株處理使得腫瘤體積相對於兩個陰性對照明顯減小。正如預期,陽性對照亦使得腫瘤體積減小。
此等資料指示菌株MRx0554可適用於治療或預防與降低之免疫系統活性相關聯之其他疾病。
實施例10-碳水化合物代謝之分析-MRx0554之API 50 CHL分析
分析型態指數(API)測試系統由含有檢定細菌菌種之酶促活性之微型化生物化學測試之條帶組成。此等測試常規用於新穎菌株之特徵化。進行API50 CHL測試以檢查MRx0554中之碳水化合物代謝。按照製造商之說明書,在37℃下在厭氧工作站中將細菌在10mL YCFA培養液中培養16至18小時。在10mL API CHL培養基中稀釋此培養物以達到大致等效於McFarland第2號標準之密度,且使用110μl此混合物接種一組API 50 CH測試條帶上之各凹孔。在37℃下在厭氧工作站中將測試條帶在加濕培育箱中培育48小時,此後記錄各凹孔之顏色且指定陰性、中度陽性、陽性或可疑之值。
使用API 50 CHL分析,MRx0554測試對L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、柳苷、D-纖維雙糖、D-麥芽糖、D-蔗糖(蔗糖)、D-海藻糖、龍膽雙糖、D-塔格糖及葡萄糖酸鉀之醱酵呈陽性(圖18)。對於D-甘露糖醇、甲基α-D-葡萄哌喃糖苷、D-乳糖、D-棉子糖、安米松(澱粉)及D-松二糖觀測到中間反應。
實施例11-TLR9活化
為進一步闡明MRx0518刺激免疫系統之機制,使用HEK-BlueTM人 類TLR9報導細胞(InvivoGen,San Diego,CA,USA)測試MRx0518對TLR9活化之作用。
維持細胞系及細菌菌株
使HEK-BlueTM人類TLR9報導細胞(InvivoGen,San Diego,CA,USA)在補充有10%(v/v)胎牛血清(FBS)、4mM L-麩醯胺、4.5mg/mL葡萄糖、100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素、100μg/mL NormocinTM(InvivoGen)、10μg/mL殺稻瘟菌素(InvivoGen)及100μg/mL澤欣(zeocin)(InvivoGen)之DMEM生長至90%密度。將細胞維持在37℃及5% CO2下。對於檢定,將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(Sigma-Aldrich,Gillingham,England,UK)洗滌一次且以450,000個細胞/毫升之密度再懸浮於不含抗生素之生長培養基中。除非另有規定,否則所有試劑均由Sigma Aldrich供應。常規地在37℃下在厭氧櫃(Don Whitley Scientific,Shipley,England,UK)中在酵母提取物、酪腖、脂肪酸培養基(YCFA,E&O Laboratories,Bonnybridge,Scotland,UK)中培養鶉雞腸球菌(E.gallinarum)MRx0518。
TLR9報導體檢定
檢查以下組成物誘導TLR9活化之能力:
1. MRx0518之活部分(MRx0518LV)-使晚對數期細菌培養物在室溫下以5,000×g離心5分鐘以產生細菌部分。將成團細菌在PBS中洗滌一次且再懸浮於不含抗生素之細胞培養基中達到適當稀釋度。
2. MRx0518上清液部分(MRx0518SN)-收集培養物上清液且經0.22μm孔徑過濾器過濾且在水中稀釋。
3. MRx0518之熱殺滅部分(MRx0518HK)-在80℃下使細菌培養物熱滅活40分鐘且如上文所述製備活部分。
以100:1之感染複數(MOI)使用MRx0518LV及MRx0518HK。100:1 MOI等效體積用於MRx0518SN。合成性CpG寡核苷酸ODN2006(InvivoGen)以5μM濃度用作檢定陽性對照。YCFA用作陰性對照。藉由塗盤確定活細胞計數。
在37℃下在5% CO2氛圍中將HEK-BlueTM人類TLR9報導細胞與上述處理物一起培育22小時。按照製造商之建議,使用QUANTI-BlueTM(InvivoGen)使檢定顯色2小時。圖19中描繪之結果為來自至少三個獨立實驗之平均值。使用普通單因子ANOVA及塔基氏多重比較檢驗確定統計顯著性。
結果證實活部分及上清液部分能夠活化TLR9。
實施例12-T細胞分化
在試管內對外周血單核細胞(PBMC,Stemcell,目錄號:70025)探索MRx0518誘導T細胞分化之能力。簡言之,將PBMC以400,000/孔塗於用抗CD3(Ebioscience,抗CD3單株抗體(OKT3純系),功能級,目錄號16-0037-81)塗盤之96孔盤中之每孔50μl cRPMI培養基中(cRPMI含有RPMI 1640(+L-Glut,21875-034)2mM最終濃度儲備液200mM;10% HI FBS(Gibco life technologies,10082-147);50μm巰基乙醇(Gibco life technologies,21985-023);及1%青黴素/鏈黴素(P4333,10mg/mL))。接著將熱殺滅MRx0518(藉由在80℃下培育30分鐘製備,此後將培養物用PBS洗滌且再懸浮於適當細胞培養基中且藉由塗盤確認活菌計數)添加至各孔中(4,000,000,於100微升/孔中)。
在37℃培育箱中3天後,移出細胞且再懸浮於含有PMA(Sigma,目錄號P8139)、離子黴素(Ionomycin)(Sigma,目錄號I3909)及GolgiSTOP(BD,目錄號554724)之培養基中持續5小時。PMA儲備液為含1mg/mL之DMSO,將其進一步稀釋成100μg/mL(各樣品需要含50ng/mL之cRPMI),離子黴素儲備液為含1mM之DMSO(使用含1μM之cRPMI),且GolgiStop濃度以4μl/6mL使用。使上清液穿過0.22μm過濾器且在共同培養基中適當稀釋。
接著使細胞經受流動式細胞量測術染色:
在洗滌之後,在室溫下於黑暗中將細胞與活力染料(來自Miltenyi biotec之Viobility 405/520可固定染料,1微升/樣品)+人類Fc嵌段(目錄號564219,1微升/樣品)一起在PBS中培育10分鐘。接著在室溫下於黑暗中將表面抗體(各2μl)直接添加至孔中持續10分鐘-CD3-APC-Vio 770(Miltenyi,目錄號130-113-136)、CD4-VioBlue(Miltenyi,目錄號130-114-534)及CD25-VioBright FITC(Miltenyi,目錄號130-113-283)。接著將細胞在PBS中洗滌兩次且在室溫下以300g快速離心5分鐘。
接著使用eBioscience FoxP3轉錄因子染色緩衝液固定並滲透細胞(目錄號00-5523)。在eBioscience方案之後,使用1份濃縮溶液及3份稀釋液製備滲透/固定緩衝液。在室溫下將細胞固定1小時,接著在1×滲透洗滌液中洗滌兩次且在室溫下以300g快速離心5分鐘。將以下細胞內染色或轉錄因子抗體添加至含樣品之滲透洗滌液(1×)中在室溫下於黑暗中持續45分鐘或在冰箱中隔夜(至多18小時),繼而使用滲透洗滌液(300μl)洗滌抗體兩次且再懸浮於PBS(250μl)中以在細胞計數器上擷取:
Figure 108109417-A0202-12-0068-19
˙抗IFNγ-PE Vio770人類抗體(Miltenyi,目錄號130-114-025)
˙抗IL10-PE人類抗體(Miltenyi,目錄號130-112-728)
˙抗IL17a-APC人類抗體(Miltenyi,目錄號130-099-202)
˙抗RORyt-PE人類抗體(Miltenyi,目錄號130-103-837)
˙抗Tbet-APC人類抗體(Miltenyi,目錄號130-098-655)
˙抗Foxp3單株抗體(236A/E7),PE-Cy7(ebioscience),目錄號25-4777-41
如圖20A至圖20B中可見,MRx0518(SP 518)及熱殺滅MRx0518(HK 518)之兩種上清液均能夠分別誘導T輔助細胞及細胞毒性T細胞分化,甚至在不存在誘導分化之細胞激素(無細胞激素)之情況下。
實施例13-MRx0518誘導之細胞激素標識
自C57BL/6小鼠分離脾細胞且以900,000個細胞/孔之密度塗於96孔盤中之補充有10% FBS、2mM L-麩醯胺、100U/mL青黴素/鏈黴素(Sigma-Aldrich)及55μM β-巰基乙醇(Gibco)之RPMI1640中。用不同濃度之空白培養基(YCFA+)或來自靜止期之細菌上清液處理細胞72小時。在各時間點之後收集無細胞上清液且儲存於-80℃下用於細胞激素分析。使用多重procartaplex MO Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg 17plex套組(Invitrogen)量測細胞激素。如圖21F中所描繪,使用MTT檢定(Millipore)量測未經處理之脾細胞或經10% YCFA培養基或10% MRx0518細菌上清液處理之脾細胞的細胞增殖。
將活的生長中之MRx0518細菌與人類腸上皮細胞系CaCo-2及與人類單核細胞/巨噬細胞細胞系THP-1一起培育至多2小時。即刻(CaCo-2)或再培育24小時後(THP-1)分析宿主反應。
冷凍之健康人類PBMC購自Stem Cells Technologies(Cambridge UK)。將細胞解凍且在37℃下在CO2培育箱中在完全生長培養基(含10% FBS、55μM β-巰基乙醇、2mM L-麩醯胺及100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素之RPMI 1640)中靜置隔夜。對於實驗,將細胞以750,000個細胞/孔之密度塗於48孔盤中,且在完全生長培養基中在存在或不存在1ng/mL LPS之情況下用10%細菌上清液處理。將細胞培養基添加至未經處理之孔中。使細胞靜置72小時,此後收集無細胞上清液,且在4℃下以10,000g快速離心3分鐘。將樣品儲存於-80℃下用於細胞激素分析。遵循製造商之建議(Thermo Fischer Scientific),使用ProcartaPlex多重免疫檢定進行細胞激素定量。簡言之,將50μl無細胞共同培養 物上清液用於使用具有xPONENT軟體(Luminex,Austin,TX,USA)之MAGPIX® MILLIPLEX®系統(Merck)進行細胞激素定量。使用MILLIPLEX®分析師軟體(Merck)分析資料,使用5參數羅吉斯曲線(5-parameter logistic curve)及背景扣除以將平均螢光強度轉換為pg/mL值。
資料在圖21A至圖21D中表示為10個生物重複實驗(PBMC)或三個生物重複實驗(脾細胞)之兩個技術重複實驗之平均值,且展示在用YCFA空白培養基(「媒劑」)或MRx0518細菌/MRx0518無細胞細菌上清液(「MRx0518」)處理之後,(A)PBMC,(B)脾細胞,(C)THP-1細胞,及(D)Caco-2細胞中之細胞激素產生。圖21E描繪關於自脾細胞(N=3),即,自未經處理(「未經處理」)、經YCFA空白培養基(「10% YCFA」)處理或經MRx0518無細胞細菌上清液(「10% MRx0518」)處理之細胞之細胞激素分泌的額外資料。
如圖21A至圖21D中可見,如由細胞激素產生之增加顯而易見,用MRx0518細菌之上清液處理不同細胞引起免疫刺激。
實施例14-NF-κB活化
在共同表現NF-κB可誘導性分泌胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)報導基因與人類NOD2基因、TLR4、TLR9或TLR5基因之HEK293細胞(分別為HEK-BlueTM-hNOD2、HEK-BlueTM-hTLR5、HEK-BlueTM-hTLR9及HEK-BlueTM-hTLR4細胞,由InvivoGen,San Diego,CA,USA提供)中測試NF-κB啟動子之活化。
簡言之,在補充有10%(v/v)熱滅活FBS、4mM L-麩醯胺、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、100μg/ml諾莫欣(normocin)、1×HEK-Blue選擇培養基之DMEM 4.5g/L D-葡萄糖中維持HEK-TLR4細胞;對於HEK-TLR5及HEK-TLR9,除使用2mM L-麩醯胺之外使用相同培養基。對於兩個細胞系使用分別30μg/ml及10μg/ml殺稻瘟菌素及100μg/ml澤欣培養基將HEK-TLR5及 HEK-TLR9選擇至培養物中。
對於實驗,用PBS洗滌細胞,在PBS中離解且在生長培養基中收集。對於HEK-TLR4及HEK-TLR5以25,000個細胞/孔、對於HEK-TLR9以80,000個細胞/孔及對於HEK-NOD2以50,000個細胞/孔之密度將細胞塗於96孔盤中。
為評定細胞對其配位體之反應性,用1ng/ml LPS(HEK-TLR4)、1ng/μl來自鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)之超純鞭毛蛋白(HEK-TLR5)、1μM ODN2006 CPG(HEK-TLR9陽性對照)或1μM ODN2006 GPC(HEK-TLR9陰性對照)、1ng/ml L18-MDP處理細胞,且在37℃下在CO2培育箱中培育。處理在37℃及5% CO2下進行22小時,此後根據製造商之說明書使用QUANTI-blue溶液進行來自細胞培養物上清液之分泌胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)活性之偵測。簡言之,收集20μl細胞培養基,且藉由與200μl QUANTI-Blue偵測培養基混合來分析SEAP之存在。在37℃下培育2小時(HEK-TLR4及HEK-TLR5)或4小時(HEK-TLR9及HEK-NOD2)之後,在微量盤讀取器(iMark microplate,Bio-Rad)上在655nm下量測光密度。
如圖22A至圖22D(展示來自三個獨立實驗之平均技術重複實驗之結果)中可見,在未經處理(「未經處理」)、經YCFA+培養基(「YCFA」)處理或經MRx0518(「MRx0518」)處理之細胞中量測NF-κB啟動子活化。使用以下陽性對照(1ng)-L18-MDP(對於HEK-BlueTM-hNOD2細胞,圖22A);脂多醣LPS(對於HEK-BlueTM-hTLR4,圖22B);CPG或negC(對於HEK-BlueTM-hTLR9,圖22C);或來自鼠傷寒沙氏桿菌(S.typhimurium)之重組鞭毛蛋白FLA(對於HEK-BlueTM-hTLR5,圖22D)。在37℃下在5% CO2氛圍中將細胞與各種處理物一起培育22小時。為量測NF-κB啟動子活化(N=3),將QUANTI-BlueTM(InvivoGen)與細胞上清液混合,將盤培育2小時,且在655nm下量測光密度。
序列
SEQ ID NO:1(鶉雞腸球菌16S rRNA基因-AF039900)
Figure 108109417-A0202-12-0072-20
SEQ ID NO:2(鶉雞腸球菌菌株MRx0518之共同16S rRNA序列)
Figure 108109417-A0202-12-0073-21
SEQ ID NO:3(鶉雞腸球菌菌株MRx0554之16S rRNA基因)
Figure 108109417-A0202-12-0073-22
Figure 108109417-A0202-12-0074-23
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<120> 包含細菌菌株之組成物
<130> P075147WO
<140> 2019-03-19
<160> 3
<170> SeqWin2010,版本1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 鶉雞腸球菌
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<210> 2
<211> 1444
<212> DNA
<213> 鶉雞腸球菌菌株MRX518
<400> 2
Figure 108109417-A0202-12-0078-25
<210> 3
<211> 1506
<212> DNA
<213> 鶉雞腸球菌
<400> 3
Figure 108109417-A0202-12-0078-26
Figure 108109417-A0202-12-0079-27

Claims (21)

  1. 一種包含鶉雞腸球菌( Enterococcus gallinarum)菌種之細菌菌株之組成物,其用於刺激個體中之免疫系統。
  2. 如申請專利範圍第1項之供使用之組成物,其用於治療、預防或延遲免疫衰老。
  3. 如申請專利範圍第1項之供使用之組成物,其用作疫苗佐劑。
  4. 如申請專利範圍第1項之供使用之組成物,其用於增強細胞療法,諸如CAR-T。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之組成物,其用於增加IL-12p70、IL-8、IL-1β、IL-6、IL-23及/或TNF-α之表現水準及/或活性。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項之組成物,其用於增加NF-κB之水準及/或活性。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之組成物,其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO:2至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA基因序列或其中該細菌菌株具有由SEQ ID NO:2代表之16s rRNA基因序列。
  8. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之組成物,其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO:3至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA基因序列或其中該細菌菌株具有由SEQ ID NO:3代表之16s rRNA基因序列。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之組成物,其中該細菌菌株為以登錄號42488寄存於NCIMB之菌株。
  10. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之組成物,其中該細菌菌株為以登錄號42761寄存於NCIMB之菌株。
  11. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之組成物,其中該組成物係用於經口投藥。
  12. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之組成物,其中該組成物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
  13. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之組成物,其中該細菌菌株為凍乾的。
  14. 一種包含如前述申請專利範圍中任一項之組成物之食物產品,其用於如前述申請專利範圍中任一項之用途。
  15. 一種治療或預防與降低之免疫刺激相關聯之疾病或病狀之方法,其包含將包含鶉雞腸球菌菌種之細菌菌株之組成物投予有需要之患者。
  16. 一種包含如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所定義之細菌菌株之細胞的組成物,其中該細胞表現一或多種異源抗原。
  17. 如申請專利範圍第16項之組成物,其中該細胞呈現該一或多種異源抗原。
  18. 如申請專利範圍第16項或第17項之組成物,其用作疫苗。
  19. 一種如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所定義之細菌菌株之細胞,其中該細胞表現一或多種異源抗原。
  20. 如申請專利範圍第19項之細胞,其中該細胞呈現該一或多種異源抗原。
  21. 如申請專利範圍第19項或第20項之細胞,其用作疫苗。
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