JP2021518129A - 組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、細菌株由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物、及び疾患の処置におけるそのような組成物の使用を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、細菌株由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物、及び疾患の処置におけるそのような組成物の使用の分野に属する。
ヒトの腸は、子宮内では無菌であると考えられているが、出生直後に母体及び環境の様々な微生物に曝露される。その後、微生物のコロニー形成及び継承の動的な期間が生じる。これは、送達形態、環境、食事、及び宿主の遺伝子型などの要素に影響され、これらの要素のすべてが、特に幼年期に腸内細菌叢の組成に影響を与える。その後、細菌叢は安定化し、成人のようになる[1]。ヒトの腸内細菌叢は、細菌の2つの主要な門であるBacteroidetes及びFirmicutesに本質的に属する500〜1000種を超える様々な系統型を含む[2]。ヒトの腸における細菌のコロニー形成から生じる相利共生関係の成功は、多種多様な代謝機能、構造的機能、保護機能、及び他の有益な機能をもたらしている。コロニー形成された腸の代謝活性の増強により、さもなければ難消化性の食物成分が、宿主に重要な栄養源を提供する副産物の放出によって確実に分解されるようになる。同様に、腸内細菌叢の免疫学的重要性は十分に認識されており、共生細菌の導入後に機能的に再構成される障害のある免疫系を有する無菌動物で例示されている[3〜5]。
微生物のコロニー形成自体の影響を受ける腸管分泌型IgAの生成[6〜7]とは著しく対照的に、T細胞の発生及び分化は、特定の共生微生物によるコロニー形成を必要とするようである。Clostridium種、特に胞子形成セグメント細菌(SFB)は、腸及び結腸のTh1、Th17、及びTregの分化及び成熟のための強力な刺激となるようである[8〜9]。より近年の研究では、ClostridiumクラスターIV及びXIVaならびにAltered Schaedler Flora(ASF)のものを含む他の腸内細菌は、Tregの新規生成を誘導することができ、一方で、Bacteroides fragilisの単一コロニー形成は、Tregの増殖を促進することによって無菌マウスにおけるTh1/Th2の不均衡を補正できることが示されている[5][10〜11]。これらのデータは、他の常在腸内細菌の重要な免疫調節効果を暗示する。明らかに、共生細菌がT細胞分化経路に及ぼす影響は様々であり、以前に仮定されていたように、特定の細菌に関連して見出された一連のTLRリガンドに影響される可能性がある[12]。例えば、SFBがT細胞応答に影響を与えるメカニズムは現在不明であるが、フラジェリン遺伝子の存在を裏付ける近年のゲノム研究は、TLR5−フラジェリン相互作用によって媒介される先天性応答が関与し得ると示唆している[13〜14]。
フラジェリンは、細菌の鞭毛の主成分のうちの1つである。鞭毛は、細菌に運動性を与え、感覚オルガネラとして機能し得る睫毛のような付属器である。細菌のフラジェリンの構造及び組成は、Salmonella typhimurium及びE.coliなどのモデル生物で包括的に研究されてきた。Salmonella typhimurium及びE.coliのフラジェリンは、TLR5受容体を介して免疫系を活性化し、様々な炎症誘発性遺伝子及び免疫応答遺伝子の活性化をもたらす[15]。Salmonella typhimuriumフラジェリンなどのTLR5アゴニストは、抗がん剤として作用し得ることが示唆されている[16]。Vibrio vulnifificusフラジェリンを発現するように操作されたSalmonella typhimuriumも抗がん剤として作用することが提唱されている[17]。さらに、Salmonella typhimurium、Vibrio cholera及びShigella dysenteriaeに由来するフラジェリンペプチドは、遺伝子改変されている腸内細菌によって発現させると、腸チフス、コレラ、及び赤痢などの感染性疾患に対するワクチンを生成するために使用することができると示唆されている[18]。しかしながら、他の種の細菌に由来するフラジェリンは、未だ十分に特性評価されておらず、そのような他のフラジェリンは、異なる効果または用途を有する可能性がある。
炎症性腸疾患(IBD)などの胃腸障害では、細菌叢組成の劇的な変化が記録されている。例えば、IBD患者では、E.coliの数が増大する一方でClostridiumクラスターXIVa細菌のレベルが低下し、腸内の共生生物と病原性共生生物とのバランスの変化を示唆している[19〜22]。興味深いことに、この微生物のディスバイオシスは、Tエフェクター細胞集団の不均衡とも関連している。
ある特定の細菌株が動物の腸に及ぼし得る好影響の可能性が認識され、様々な疾患の処置に使用するための様々な菌株が提案されている(例えば、[23〜26]を参照されたい)。また、Lactobacillus及びBifidobacterium菌株を主に含むある特定の菌株を、腸に直接関係しない様々な炎症性疾患及び自己免疫疾患の処置に使用することが提案されている(総説については[27]及び[28]を参照されたい)。しかしながら、様々な疾患と様々な細菌株との間の関係、そして特定の細菌株が腸及び全身レベルにおいて、また任意の特定のタイプの疾患に及ぼす正確な影響は、十分に特性評価されていない。例えば、ある特定のEnterococcus種は、がんの発生に関与するとされている[29]。
ある特定のStreptococcus及びVeillonella菌株、そして比較的程度は低いがEnterococcus及びLactobaccillus菌株は、インビトロで様々なサイトカインに対して効果の異なる免疫調節効果を有することが示唆されている。しかしながら、様々な疾患と様々な細菌株との間の関係、そして特定の細菌株が腸及び全身レベルにおいて、また任意の特定のタイプの疾患に及ぼす正確な影響は、十分に特性評価されていない。
当技術分野では、疾患を処置する新しい方法が必要である。また、新しい療法を開発できるように腸内細菌の潜在的な影響の特性評価を行う必要もある。
本発明者らは、疾患を処置及び防止するための新しい療法を開発した。特に、本発明者らは、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが治療に有用であることを特定した。実施例で示されるように、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、周知のTLR5アゴニストであるSalmonella.typhimuriumフラジェリンよりも著しく高いレベルでTLR5応答を強力に活性化することができる。
好ましい実施形態では、本発明は、治療に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。さらに好ましい実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、受託番号NCIMB 42488でNCIMBに寄託された菌株に由来する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは配列番号1である。実施例は、菌株MRx0518(受託番号NCIMB 42488で寄託された菌株)に由来するフラジェリンポリペプチドが、他のEnterococcus gallinarum菌株に由来するフラジェリンポリペプチドと比較してより強力にTLR5応答を活性化し得ることを示す。したがって、菌株NCIMB 42488由来のフラジェリンポリペプチドは、治療に使用するのに特に有効である。
好ましい実施形態では、本発明のフラジェリンポリペプチドは単量体型であり、これにより、ポリペプチドがTLR5受容体とより効果的に結合することが可能になる。
実施例は、菌株NCIMB 42488由来のフラジェリンポリペプチドが、TLR5応答を活性化するのに特に有効であることを示す。菌株NCIMB 42488由来のフラジェリンポリペプチドはD3ドメインを含まない場合があり、本発明者らは、異なるフラジェリンポリペプチド間の配列多様性の大部分がD2−D3領域で観察されることに気付いた。好ましい実施形態では、本発明は、D3ドメインを含まないEnterococcus属またはEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、細菌鞭毛アセンブリ(bacterial flagellar assembly)の一部である。ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドを含む細菌鞭毛アセンブリを提供する。好ましい実施形態では、細菌鞭毛アセンブリは、タンパク質FliL及びFlaGを含む。FliL及びFlaGタンパク質は、MRx0518の細菌鞭毛アセンブリに存在する。実施例は、MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドが、TLR5応答を活性化するのに特に有効であることを示す。
本発明はまた、治療に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、治療に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドをコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、治療に使用するための、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドをコードする。
他の実施形態では、本発明は、治療に使用するための、Enterococcus属由来の組換えフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。他の実施形態では、本発明はまた、治療に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。
本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。さらに、本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を含む組成物を提供する。
S.typhimuriumフラジェリンによるTLR5の活性化は、細胞増殖及び腫瘍成長を抑制することが知られている[48]。Enterococcus gallinarum菌株を含む組成物は、がんの処置及び防止に有効である[50]。本発明者らは、驚くべきことに、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドが、Enterococcus菌株の抗がん活性に寄与し得る強力なTLR5応答を刺激できることを示した。したがって、本発明者らは、Enterococcus属、特にEnterococcus gallinarum種のフラジェリンポリペプチドが治療に有用であり、特にがんの処置及び防止に有効であることを示した。
好ましい実施形態では、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、免疫原性腫瘍及び/または固形腫瘍の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、肺癌、乳癌、肝臓癌、または結腸癌(colon cancer)を処置または防止する方法において使用するためのものである。Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、がんの処置において腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の防止に特に有効であり得る。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、注射により、好ましくは皮下に、あるいは静脈内または腹腔内に投与される。
ある特定の実施形態において、例えば組成物が本発明の宿主細胞を含む場合、本発明の組成物は経口投与用である。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、1または2以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。
さらに、本発明は、Enterococcus属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患を処置する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、Enterococcus属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを処置または防止する方法を提供する。
本発明者らは、免疫系の刺激ならびに疾患の処置及び防止に使用することのできる、Enterococcus属由来、好ましくはEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む新しい組成物を開発した。本発明者らは、そのような組成物が免疫系を強力に活性化することができ、がんを処置することができることを特定した。これは、そのような組成物が、免疫系の活性化が有用であり得る他の疾患を処置することもできる可能性があることを示している。
したがって、本発明は、対象の免疫系を刺激するのに使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、免疫老化(immunosenescence)の処置、防止、または遅延に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとして使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、CAR−Tなどの細胞療法を増強する(enhancing)のに使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
フラジェリンの構造ならびに鞭毛フィラメントの断面図及び上面図。鞭毛フィラメントは、単一のタンパク質であるフラジェリンから構成されている。TLR5認識領域はD1ドメインにあり、鞭毛フィラメントでフラジェリンが重合している場合はアクセスできない。画像の出典は参考文献[30]である。 フラジェリンの構造ならびに鞭毛フィラメントの断面図及び上面図。鞭毛フィラメントは、単一のタンパク質であるフラジェリンから構成されている。TLR5認識領域はD1ドメインにあり、鞭毛フィラメントでフラジェリンが重合している場合はアクセスできない。画像の出典は参考文献[30]である。 フラジェリンの構造ならびに鞭毛フィラメントの断面図及び上面図。鞭毛フィラメントは、単一のタンパク質であるフラジェリンから構成されている。TLR5認識領域はD1ドメインにあり、鞭毛フィラメントでフラジェリンが重合している場合はアクセスできない。画像の出典は参考文献[30]である。 Enterococcus gallinarum種及びモデル生物のS.typhimuriumに由来する24種のフラジェリンポリペプチドのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 Enterococcus gallinarum種及びモデル生物のS.typhimuriumに由来する24種のフラジェリンポリペプチドのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 Enterococcus gallinarum種及びモデル生物のS.typhimuriumに由来する24種のフラジェリンポリペプチドのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドと、E.gallinarum種の23種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株MRx0518のフラジェリンポリペプチドのD0、D1及びD2ドメイン、ならびに予測されるTLR5結合部位が強調表示されている。 鞭毛アセンブリのKEGG経路図。灰色で強調表示された遺伝子はその種に存在する。 予測されるMRx0518フラジェリン(FliCMRx0518)のタンパク質構造と、既知のS.typhimuriumフラジェリンのタンパク質構造との比較。S.typhimuriumフラジェリンタンパク質構造の出典は、参考文献[30]である。 予測されるMRx0518フラジェリン(FliCMRx0518)のタンパク質構造と、既知のS.typhimuriumフラジェリンのタンパク質構造との比較。S.typhimuriumフラジェリンタンパク質構造の出典は、参考文献[30]である。 TLR5レポーター細胞のMRx0518活性化。 TLR5レポーター細胞の菌株特異的活性化。 トリプシン処理後のMRx0518及びDSM100110のCFSによるTLR5応答。 E.coliで組換えフラジェリンタンパク質を生成するためのクローニング戦略。 SDS−PAGEゲルにおける精製された組換えフラジェリンタンパク質のFlaAMRx0518及びFlaADSM100110の品質評価。 FlaAMRx0518、FlaADSM100110、ならびにMRx0518及びDSM100110のCFSによるTLR5活性化の比較。 MRx0518flaA変異体の表現型特性評価。 MRx0518flaA変異体CFSによるTLR5活性化。 flaA変異戦略。 MRx0518の電子顕微鏡観察。 MRx0518及びDSM 100110の組換えフラジェリンタンパク質によるマウスTLR5の活性化。データは3つの独立した反復試験の代表である。 CLUTAL OMEGA v2.1の複数配列アライメントソフトウェアを使用して行った、MRx0518及びDSM 100110のフラジェリンタンパク質の配列アライメント。 運動性E.gallinarum及びE.casseliflavus菌株によるヒトTLR5の活性化。データは、3つの生物学的反復試験の平均及び標準偏差を表す。有意性は一元配置分散分析検定によって評価した。「a」はp<0.0001を示す。 MRx0518によるNF−κBの活性化。 サイトカインを添加していない(サイトカインなし)対照としてのMRx518及びRPMI培地の上清を使用した、(A)Tヘルパー細胞及び(B)細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の集団におけるT細胞分化の誘導。 代替的なflaA変異戦略。
フラジェリン
細菌鞭毛の主成分であるフラジェリンは、哺乳動物、昆虫、及び植物を含む様々な生物において宿主防御を刺激する。細菌のフラジェリンの構造及び組成は、S.typhimurium及びE.coliなどのモデル生物で包括的に研究されてきた。しかしながら、Enterococcus属、特にEnterococcus gallinarum種に由来するフラジェリンについて説明する入手可能なデータは非常に限られている。
フラジェリンは、単量体タンパク質として存在する場合もあれば、または重合して鞭毛フィラメントを形成している場合もある。Salmonellaの細菌鞭毛フィラメントは、およそ20,000個のフラジェリンタンパク質単位から構成されている。鞭毛フィラメントは、完全にアセンブルされた細菌鞭毛の一部を形成する。
フラジェリンタンパク質は通常、3〜4個のドメイン(D0、D1、D2、及びD3)を含み、D0及びD1ドメインはN末端及びC末端の折り重ねからなる[31]。鞭毛フィラメントのアセンブリ中、D0及びD1ドメインが鞭毛フィラメント内に埋め込まれ、D2及び/またはD3ドメインが外を向く(図1)。
保存されたドメインD1内のアミノ酸モチーフは、TLR5の認識及び相互作用に必要であることが示されている[32〜33]。D0ドメインは、TLR5シグナル伝達に影響を与えることも示されている[34]。TLR5認識部位は、通常、鞭毛フィラメントにおいてアクセスできない。フラジェリンは、単量体型である場合にTLR5とより効果的に相互作用する。これは、フィラメントにアセンブルされるとTLR5結合部位がアクセスできなくなるためである[30]。フラジェリンタンパク質の中央領域は配列の多様性を示し、広く研究されてはいないが、タンパク質の抗原性かつ免疫原性の領域であると考えられている。
D0及びD1ドメインは高度に保存されているが、D2及びD3ドメインはより可変性が高い[35]。図2は、Enterococcus属由来のフラジェリンタンパク質と、広く研究されているS.typhimurium由来の鞭毛タンパク質との配列アライメントである。S.typhimurium由来のフラジェリンタンパク質とEnterococcus属由来のフラジェリンタンパク質との間の配列多様性の大部分は、中央領域(D2−D3ドメイン)に存在する。異なるEnterococcus gallinarum菌株間(例えば菌株MRx0518及びDSM100110のフラジェリンタンパク質間)の配列多様性の大部分も、この領域で観察される(図3)。
鞭毛フィラメントは、細菌鞭毛の成分である。細菌鞭毛アセンブリに関与することが知られている遺伝子を図4にまとめる。灰色の影が付いたものは、Enterococcus gallinarumに存在するものである。フラジェリンタンパク質は、本明細書では交換可能にFlaAとも呼ばれるFliCによってコードされる。
本発明は、治療に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、治療に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、治療に使用するための、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なTLR5応答を活性化し得ることを示し、これは、フラジェリンポリペプチドが治療に有用、特にがんの処置に有用であり得ることを示す。
本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが、がんの処置及び防止に有用である強力なTLR5応答を誘導できることを示す。特に、実施例は、Enterococcus gallinarum種、特に菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドが、非常に高いTLR5応答を生成することを示す。
好ましい実施形態では、本発明は、治療に使用するための、特にがんの処置または防止のための、Enterococcus gallinarum種またはEnterococcus casseliflavus種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、Enterococcus casseliflavus種に由来する。最も好ましい実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、Enterococcus gallinarum種に由来する。
実施例では、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを試験した。MRx0518は、受託番号NCIMB 42488で寄託されたEnterococcus gallinarum細菌の菌株である。菌株MRx0518は、国際寄託機関NCIMB,Ltd.(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)に、4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)により、2015年11月16日に「Enterococcus sp」として寄託され、受託番号NCIMB 42488を割り当てられた。
ある特定の実施形態において、本発明は、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドと少なくとも75%の配列同一性をもつフラジェリンポリペプチド、及び治療における、特にがんの処置または防止におけるそのようなポリペプチドの使用を提供する。実施例は、そのようなフラジェリンポリペプチドが特に有効であることを示す。特に、本発明は、配列番号1と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の配列同一性をもつ配列を有するフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明のフラジェリンポリペプチドは、配列番号1を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、配列番号2と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の配列同一性をもつ配列を有する。本発明のフラジェリンポリペプチドは、配列番号2を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。実施例はまた、そのようなポリペプチドが有用であることを示す。
ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号3〜42のうちの1つと少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の配列同一性をもつフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、配列番号3〜16のうちの1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の配列同一性をもつ配列を有する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、Enterococcus gallinarum種に由来する。
好ましい実施形態では、本発明のフラジェリンは、TLR5に、例えば少なくとも10−2、少なくとも10−3、少なくとも10−4、少なくとも10−5、少なくとも10−6、少なくとも10−7、少なくとも10−8、少なくとも10−9、少なくとも10−10、または少なくとも10−11のK値で結合する。TLR5への結合は、電気化学的インピーダンス分光法(EIS)、走査型電気化学顕微鏡法(SECM)[36]、または組換えTLR5タンパク質を使用した未変性PAGE及びゲル濾過クロマトグラフィー分析[37]を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって測定することができる。
本発明のフラジェリンポリペプチドは、D0、D1、D2、及びD3の4つのドメインを含み得る。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、D3ドメインを含まない。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、D0、D1、D2の3つのドメインからなる。図3には、E.gallinarumフラジェリンポリペプチドにおけるD0、D1及びD2ドメインの位置を示す。図5には、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチド(FliCMRx0518)の予測される形状を示す。FliCMRx0518の予測される構造は、公的に利用可能な構造との相同性に基づいてタンパク質構造を予測するPhyre2ツール[38]を使用して生成し、グラフィックは、UCSF Chimeraパッケージ[39]を用いて生成した。予測されるD3ドメインの欠如は、S.typhimurium SL1344(GenBank受託番号CBW17983)由来のフラジェリンポリペプチドと比較したタンパク質構造の立体構造変化をもたらす。予測されるD3ドメインの欠如は、TLR5認識部位の露出が増えることにつながる場合があり、これは、TLR5応答を活性化するフラジェリンポリペプチドの能力の増大につながる。予測されるD3ドメインの欠如は、フラジェリンポリペプチドが重合して鞭毛フィラメントになる能力に影響を及ぼす可能性もある。フラジェリンポリペプチドは、単量体型においてTLR5応答をより効果的に活性化するため、フラジェリンポリペプチドの重合の防止または低減が有益である。
本発明のフラジェリンポリペプチドは、TLR5の認識及び相互作用に必要とされ得るD1ドメインを含み得る。ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号1の残基43〜164及び273〜317と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の配列同一性を有するD1ドメインを含むフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、D1ドメインにTLR5認識部位を有するフラジェリンポリペプチドを提供する。Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドにおけるTLR認識部位は、配列番号1の87〜96位及び290〜295位に位置する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドのTLR5認識部位は、配列番号1の残基87〜96及び290〜295と少なくとも99%、99.5%、または99.9%の同一性を有する。さらに好ましい実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、配列番号1の残基87〜96及び290〜295のTLR5認識部位を含む。
本発明のフラジェリンポリペプチドは、TLR5シグナル伝達に影響を及ぼし得るD0ドメインを含んでもよい。ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号1の残基2〜32及び234〜358と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の同一性を有するD0ドメインを含むフラジェリンポリペプチドを提供する。
本発明のフラジェリンポリペプチドはまた、D2ドメインを含み得る。S.typhimurium及びEnterococcus属の鞭毛ポリペプチド間の配列多様性の大部分は、中央領域(D2−D3ドメイン)に存在する。実施例は、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドが、S.typhimurium由来のフラジェリンポリペプチドと比較して低い投与量で、より強力なTLR5応答を生成できることを示す。D2またはD3ドメインの配列多様性は、TLR5応答を活性化するEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドの能力の増大に寄与し得る。本発明のフラジェリンポリペプチドはまた、TLR5シグナル伝達に影響を及ぼし得るD0ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号1の残基165〜272と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の同一性を有するD2ドメインを含むフラジェリンポリペプチドを提供する。
フラジェリンポリペプチドは、単量体として存在してもよいし、または鞭毛フィラメントとして重合した形態で存在してもよい。このフィラメントは、細菌鞭毛の一部である。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、鞭毛フィラメント状に配されている。本発明は、鞭毛フィラメント状に配されていないフラジェリンポリペプチドにも関する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、その単量体型である。単量体型のフラジェリンポリペプチドは、TLR5とより強力に相互作用することができるため有利である。諸実施形態において、本発明のフラジェリンは、単量体型になるための脱落及び脱凝集を助けるために、グリコシル化されていない。
ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、細菌鞭毛の一部である。ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ、及びFliSから選択される1または2以上のタンパク質を含む細菌鞭毛の一部である。好ましい実施形態では、細菌鞭毛アセンブリは、FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ、及びFliSを含む。ある特定の実施形態において、細菌鞭毛アセンブリは、タンパク質FliL及びFlaGを含む。FliLは、遊走中の鞭毛の回転方向を制御する鞭毛基底小体関連タンパク質であり、FlaGは、FlaFとともにフラジェリンアセンブリを調節する。FliL及びFlaGタンパク質は、MRx0518に存在する。実施例は、MRx0518のフラジェリンポリペプチドが、別のEnterococcus gallinarum種のフラジェリンポリペプチドと比較して、より強力なTLR5応答を活性化し得ることを示す。
本発明のフラジェリンポリペプチドは、組換え発現されてもよいし、またはEnterococcus細胞から単離されてもよい。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、Enterococcus細胞に結合していない。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、細菌細胞を実質的に含まない組成物中にある。
ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、熱処理され、場合により変性されている。実施例は、そのようなフラジェリンポリペプチドが依然として強力に有効であることを示す。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、80℃まで熱安定性があり、例えば、80℃まで、例えば40分間加熱した後、活性を維持することができる。ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、トリプシンによって消化される。言い換えると、ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、トリプシン切断部位を含む。MRX518フラジェリンは、36個のトリプシン切断部位を含むと予測される。
本発明に係るフラジェリンポリペプチドは、フラジェリンポリペプチドと見なされるために、通常のフラジェリンポリペプチドとして機能する必要はない。本発明に係るフラジェリンポリペプチドは、ある特定の活性を除去する変異または欠失を含み得る。概して、本発明のフラジェリンポリペプチドは、TLR5アゴニストである。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、重合して鞭毛フィラメントになることができない。他の実施形態では、本発明のフラジェリンポリペプチドは、細菌鞭毛アセンブリの一部を形成することができない。
ある特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、フラジェリンポリペプチドではない。好ましい実施形態では、このポリペプチドは、上述のように、配列番号1との配列同一性を有するか、または配列番号1を含むか、もしくはそれからなる。
本発明はまた、治療に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本組成物は、治療に使用するためのEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、本組成物は、治療に使用するための菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを含む。
本発明のすべての実施形態の代替的な態様では、本発明のフラジェリンポリペプチドは、Enterococcus caselliflavus種のものである。Enterococcus caselliflavusは、Enterococcus gallinarumと非常によく似ており、有鞭毛性でもある。
断片
実施例で試験したものとの配列同一性を有するフラジェリンポリペプチドも、治療に有用であると予想され、前のセクションで述べたように、本発明に包含される。さらに、本発明のフラジェリンポリペプチドの断片もまた有用であると予想される。
好ましくは、いずれの断片も、少なくとも7、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、または350アミノ酸長である。
好ましい断片は、配列番号1のアミノ酸2〜32、87〜96、165〜272、234〜358、290〜295の区間(stretch)のうちの1または2以上を含むか、または該断片のうちの1つと少なくとも90%、92%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性をもつ配列を含む。
好ましい断片は、配列番号1のアミノ酸165〜272と少なくとも90%、92%、95%、98%、または99%の配列同一性をもつ配列を含む。さらに好ましい断片は、配列番号1のアミノ酸87〜96、165〜272、もしくは290〜295と、または好ましくは配列番号1のアミノ酸87〜96、165〜272、及び290〜295と、少なくとも90%、92%、95%、98%、または99%の配列同一性をもつ配列を含む。
本発明に係る使用のための断片は、通常、(i)配列番号1と少なくともw%の配列同一性を有し、及び/または(ii)配列番号1の少なくともx個の連続したアミノ酸の断片を含む。wの値は、少なくとも85(例えば86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100以上)である。xの値は、少なくとも7(例えば8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300)であり、この断片は通常、配列番号1のエピトープを含む。この断片は通常、TLR5に結合することができる。
本発明に係る使用のための他の断片は、通常、(i)配列番号2と少なくともw%の配列同一性を有し、及び/または(ii)配列番号2の少なくともx個の連続したアミノ酸の断片を含む。wの値は、少なくとも85(例えば86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100以上)である。xの値は、少なくとも7(例えば8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300)であり、この断片は通常、配列番号2のエピトープを含む。この断片は通常、TLR5に結合することができる。
本発明に係る使用のための他の断片は、通常、(i)配列番号3〜42のうちの1つと少なくともw%の配列同一性を有し、及び/または(ii)配列番号3〜42のうちの1つの少なくともx個の連続したアミノ酸の断片を含む。wの値は、少なくとも85(例えば86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100以上)である。xの値は、少なくとも7(例えば8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300)であり、この断片は通常、配列番号3〜42のうちの1つのエピトープを含む。この断片は通常、TLR5に結合することができる。
融合物
本発明のフラジェリンポリペプチドを含む融合物も、治療に有用であると予想される。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、場合により治療に使用され、特にがんの処置に使用される、上述のフラジェリンポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。好ましい融合パートナーには、標的化部分及び半減期を延長することを意図した部分が含まれる。ある特定の実施形態において、本発明は、上述のフラジェリンポリペプチドと、Fc領域、トランスフェリン、アルブミン、組換えPEG、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン−アラニン−セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはカルボキシ末端ペプチド[CTP;絨毛性ゴナドトロピン(CG)b鎖のもの]からなる群から選択されるポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドを提供する。
本発明のフラジェリンポリペプチドは、その特徴及び治療有用性を向上させるために、非ポリペプチド部分に融合またはコンジュゲートしていてもよい。例えば、ある特定の実施形態において、本発明は、PEGまたはヒアルロン酸に共有結合した上述のフラジェリンポリペプチドを提供する。
本発明のフラジェリンポリペプチドは、例えば、ワクチンとして使用するために、抗原に融合またはコンジュゲートしていてもよい。本発明のフラジェリンに近接して抗原を提示することにより、それらの免疫刺激(immunostimulatory)活性が最大化し、抗原に対して発生する防御免疫応答がさらに増強し得る。さらに、抗原及び本発明のフラジェリンを含む治療薬の製造及び送達は、それらが融合またはコンジュゲートしている場合、より効率的かつ効果的であり得る。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、上述のフラジェリンポリペプチド及び抗原を含む融合ポリペプチドを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、抗原にコンジュゲートした上述のフラジェリンポリペプチドを提供する。
本発明の融合物及びコンジュゲートに含めるための好ましい抗原は、病原体抗原及び腫瘍抗原である。抗原は、病原体による感染から保護したり、腫瘍を攻撃したりするのに有効な、抗原に特異的な免疫応答を誘発する。抗原は、例えば、ペプチドまたは多糖であり得る。本発明の融合物及びコンジュゲートで使用するための例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原、タンパク質及び/または糖類抗原などの細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、ならびに腫瘍抗原が含まれる。本発明の融合物及びコンジュゲートで使用するためのさらなる抗原には、糖タンパク質及びリポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原E(MAGE)、癌胎児抗原(CEA)、MUC−1、HER2、シアリル−Tn(STn)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ウィルムス腫瘍遺伝子(WT1)、CA−125、前立腺特異抗原(PSA)、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Tau、PCSK9、ならびに習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、またはアヘン剤が含まれる。
本発明の融合ポリペプチドは、フラジェリンと抗原との間にリンカー配列を含み得る。好ましいリンカー配列には、(Gly4)nモチーフ(複数可)、(Gly4Ser)nモチーフ(複数可)、及びSer(Gly4Ser)nモチーフ(複数可)を含むペプチドが含まれる。リンカー配列は、1〜50、1〜30、1〜20、5〜20、5〜10、または10〜20アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、フラジェリン及び融合パートナー(例えば抗原)がそれぞれの役割を果たし、例えば免疫系によってアクセスされることを可能にする。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、上述のフラジェリンポリペプチド、リンカー配列、及び病原体に由来する抗原または腫瘍抗原などの抗原を含む融合ポリペプチドを提供する。
本発明のフラジェリンポリペプチドは、多糖抗原などの非ポリペプチド部分にコンジュゲートした場合に特に有用であり得る。好適なコンジュゲーション方法としては、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p−ニトロ安息香酸、N−ヒドロキシスクシンイミド、S−NHS、EDC、CDAP、またはTSTUの使用が挙げられる。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、治療に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、治療に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドをコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、治療に使用するための、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドをコードする。実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なTLR5応答を活性化し得ることを示す。したがって、そのようなフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、治療に有用、特にがんの処置に有用であり得る。
本発明はまた、がんを処置または防止する方法において使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが、がんの処置及び防止に有用である強力なTLR5応答を誘導できることを示す。特に、実施例は、Enterococcus gallinarum種、特に菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドが、非常に高いTLR5応答を生成することを示す。
好ましい実施形態では、治療に使用するための本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1、または配列番号1と75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくは99.9%の配列同一性をもつポリペプチド配列をコードする。さらに好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、有用であることが実施例において示される上述の特定のD0、D1及び/またはD2配列を含むフラジェリンをコードする。
他の実施形態では、治療に使用するための本発明のポリヌクレオチドは、配列番号2、または配列番号2と75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくは99.9%の配列同一性をもつポリペプチド配列をコードする。さらに好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、有用であることが実施例において示される上述の特定のD0、D1及び/またはD2配列を含むフラジェリンをコードする。
他の実施形態では、治療に使用するための本発明のポリヌクレオチドは、配列番号3〜42のうちの1つ、または配列番号3〜42のうちの1つと75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくは99.9%の配列同一性をもつポリペプチド配列をコードする。さらに好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、有用であることが実施例において示される上述の特定のD0、D1及び/またはD2配列を含むフラジェリンをコードする。
本発明に係る核酸は、様々な形態(例えば、一本鎖、二本鎖、ベクターなど)をとることができる。本発明の核酸は、環状であっても分枝状であってもよいが、概して線状である。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、一本鎖及び二本鎖の両方のヌクレオチドポリマーを含む。核酸を構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型であり得る。該修飾には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、2’,3’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、及びホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾が含まれる。
核酸は、例えば、全体的または部分的な化学合成(例えばDNAのホスホラミダイト合成)、ヌクレアーゼ(例えば制限酵素)を使用したより長い核酸の消化、より短い核酸またはヌクレオチドの結合(例えばリガーゼまたはポリメラーゼを使用したもの)、ゲノムまたはcDNAライブラリーからなど、多くの方法で調製することができる。
本発明の核酸は、少なくとも1つの本発明のポリペプチド、例えば本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする配列を含む。典型的には、本発明の核酸は、組換え形態、すなわち自然には発生しない形態である。例えば、核酸は、少なくともフラジェリンポリペプチドをコードする配列に加えて、1または2以上の異種核酸配列(例えば、別の抗原をコードする配列及び/またはプロモーターもしくは配列内リボソーム進入部位などの制御配列)を含み得る。そのような実施形態では、本発明の核酸は、上述のフラジェリンポリペプチドと、病原体抗原または腫瘍抗原などの抗原とをコードする。場合により、核酸はまた、リンカー配列をコードする。
宿主細胞
本発明はまた、治療に使用するための、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。実施例は、本発明のEnterococcusフラジェリンを発現する、MRx0518などのEnterococcus菌株が、TLR5を活性化することができ、したがって強力な治療効果を有し得ることを示す。本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞は、治療用組成物に含めるためのフラジェリンポリペプチドを生成するために有用であり得るか、またはそのような宿主細胞は、フラジェリンポリペプチドを発現して直接的な治療効果を発揮するように患者に投与するために有用であり得る。
好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、本発明のフラジェリンポリペプチドを組換えにより発現する。言い換えると、本発明の宿主細胞は、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、Enterococcus属のものではないか、Enterococcus gallinarum種のものではないか、または菌株MRx0518のものではない。好ましい実施形態では、組換えEnterococcusフラジェリンポリペプチドを発現するための宿主細胞は、E.coliである。
例えば宿主細胞が患者に投与するためのものである代替的な実施形態では、宿主細胞は、LactobacillusまたはBifidobacterium菌株などの生菌株である。
ある特定の実施形態において、宿主細胞は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、宿主細胞は、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。
ある特定の実施形態において、宿主細胞は、細菌鞭毛アセンブリ遺伝子FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ、及びFliSのうちの1または2以上、好ましくはすべてをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、ポリペプチドFliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ、及びFliSのうちの1または2以上、好ましくはすべてを発現する。好ましい実施形態では、宿主細胞は、FliL及びFlaGを含む細菌鞭毛アセンブリをコードするポリヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、ポリペプチドFliL及びFlaGを発現する。
好ましくは、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する任意の細胞、特に患者に投与するための任意の細胞は、フラジェリンポリペプチドを脱落させるのに有効である。実施例は、そのような細胞がより強力なTLR5応答を誘導することを示す。フラジェリンは、その単量体単位の漏出を通じて鞭毛のアセンブリ中に「能動的に」脱落し得る。しかしながら、ほとんどの場合、単量体のフラジェリンは、解離した鞭毛の受動的分解から生じる。鞭毛の解離は、機械的ひずみの後に、または自発的なプロセスとして発生し得る。いくつかの細菌種では、例えばShewanella oneidensisにおいて、フラジェリンは、フィラメントの安定性を増強し、無制御の脱落を防止するようにグリコシル化されている[40]。好ましい実施形態では、宿主細胞によって発現されるフラジェリンは、単量体型になるための脱落及び脱凝集を助けるために、グリコシル化されていない。
ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチド及び/または細菌鞭毛アセンブリは、宿主細胞から容易に脱落する。
フラジェリンポリペプチド及び/または鞭毛アセンブリの脱落の容易さは、i)本発明のフラジェリンを発現する細胞と、ii)本発明のフラジェリンと同じ細菌種に属する同じまたは異なる菌株に由来する参照フラジェリンを発現する1または2以上の(例えば1、2、3、4、5、10種の、または10種を超える)細胞とを、別々に、a)定常期で18時間にわたり、それぞれの細胞の1%接種材料を使用して増殖させ、次に、b)後期対数期で定常期の細胞の10%接種材料を3時間増殖させることにより、決定することができる。次に、本発明のフラジェリンを発現する細胞、及び参照フラジェリンを発現する細胞の10ml培養物を、5000×gで5分間にわたり、室温で遠心分離して、細菌ペレットを除去することができる。次に、得られた上清を無菌条件下で濾過することができる(0.22um)。本発明のフラジェリンポリペプチド及び/または細菌鞭毛アセンブリの脱落が良好である実施形態では、本発明のフラジェリンを発現する細胞から得られる上清中のフラジェリンタンパク質の濃度は、参照フラジェリンを発現する細胞から得られる上清中のフラジェリンタンパク質の濃度より高くなる(例えば1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、7倍以上、または10倍以上)。
好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、フラジェリンポリペプチド及び/または鞭毛アセンブリを環境に放出し、これには化学的または物理的破壊が必要である。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドの発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養すると、フラジェリンポリペプチドが細胞から環境に放出される。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する細胞が、より強力なTLR5応答を誘導することを示す。他の実施形態では、本発明の宿主細胞は、細菌鞭毛アセンブリを良好に脱落させる。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、細菌鞭毛フィラメントを良好に脱落させ、特にフラジェリンポリペプチドを良好に脱落させる。ある特定の実施形態において、本発明の細菌鞭毛アセンブリは、単量体のフラジェリンを能動的に脱落させる。ある特定の実施形態において、本発明の鞭毛フィラメントは、単量体のフラジェリンを能動的に脱落させる。単量体のフラジェリンは、TLR5応答を誘導するのにより有効である。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドまたは鞭毛アセンブリを発現する細胞を培養することと、該フラジェリンポリペプチドまたは鞭毛アセンブリを培養することとを含み、別々のフラジェリンポリペプチドまたは鞭毛アセンブリを細胞表面から除去するためのいかなるステップも行うことなく、本発明のフラジェリンポリペプチドまたは鞭毛アセンブリを得る方法を提供する。
現在、鞭毛(またはフラジェリン)の脱落のプロセスは、特定のサブセット遺伝子の発現とは関連付けられておらず、環境条件に大きく影響される可能性が高い。しかしながら、いくつかの遺伝子は、鞭毛の剛性及び安定性に関与することが示されている。例えば、Salmonellaにおいて、fliF及びfliL変異体は、粘性培地で増殖させると鞭毛をより容易に脱落させることが示されている[41、42]。いずれの場合も、鞭毛は遠位のロッド付近で壊れた[43]。したがって、好ましい実施形態において、宿主細胞はfliF及び/またはfliLを発現しない。他の実施形態では、宿主細胞はfliLを発現する。
ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、熱処理されている。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する細胞が、熱処理後も依然として強力に有効であることを示す。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、80℃まで熱安定性があり、例えば、80℃まで、例えば40分間加熱した後、活性を維持することができる。
本発明はさらに、フラジェリンポリペプチドの生成を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、そのように生成されたフラジェリンポリペプチドを回収することにより、本発明のフラジェリンポリペプチドを生成する方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、1または2以上の抗原をさらに発現する。概して、この抗原は、組換えにより発現され、宿主細胞に対して異種である。抗原は、本発明のフラジェリンポリペプチドとともに発現される融合ポリペプチドの一部であってもよいし、または宿主細胞は、異なるオープンリーディングフレームからフラジェリン及び抗原を別々に発現してもよい。したがって、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチド及び異種抗原を発現する宿主細胞を提供する。本発明で使用される例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原、タンパク質及び/または糖類抗原などの細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、ならびに腫瘍抗原が含まれる。宿主細胞において本発明のフラジェリンとともに発現させるさらなる抗原には、糖タンパク質及びリポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原E(MAGE)、癌胎児抗原(CEA)、MUC−1、HER2、シアリル−Tn(STn)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ウィルムス腫瘍遺伝子(WT1)、CA−125、前立腺特異抗原(PSA)、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Tau、PCSK9、ならびに習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、またはアヘン剤が含まれる。
ベクター、プラスミド、及び他の核酸
本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、1または2以上の細胞型の形質導入/トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部であり得る。ベクターは、例えば、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現のために設計された「発現ベクター」、または組換えウイルスもしくはウイルス様粒子の生成をもたらすように設計された「ウイルスベクター」であり得る。
あるいは、またはさらに、フラジェリンポリペプチドをコードする天然に存在する配列と比較して、核酸の配列または化学構造を修飾してもよい。核酸分子の配列は、例えば、核酸の発現もしくは複製の効力を増大させるために、または分解に対するさらなる安定性もしくは耐性をもたらすために修飾され得る。例えば、核酸分子の配列は、哺乳動物(例えばヒト)細胞などの所望の宿主における発現のためにコドン最適化され得る。コドン使用頻度に関し、そのような修飾は、核酸の翻訳効力及び半減期を増大させる可能性がある。ポリAテール(例えば、約30個以上のアデノシン残基のもの)を、RNAの3’末端に結合させて、その半減期を増大させることができる。m7G(5’)ppp(5’)Nの構造(キャップ0構造)を有する修飾されたリボヌクレオチドまたはその誘導体で、RNAの5’末端をキャッピングしてもよい。この構造は、RNA合成中に組み込むこともできるし、またはRNA転写後に(例えば、N7−モノメチル化キャップ0構造の構築を触媒するmRNAトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、及びグアニン−7−メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素(VCE)を使用することによって)酵素的に操作することもできる。キャップ0構造は、RNA分子の安定性及び翻訳効力を維持する上で重要な役割を果たす。RNA分子の5’キャップは、2’−O−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾されてもよく、これにより、キャップ1構造(m7Gppp[m2’−O]N)が生成され、効力がさらに増大し得る。
核酸は、1または2以上のヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド類似体」または「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの窒素含有塩基(例えば、シトシン(C)、チミン(T)もしくはウラシル(U))、アデニン(A)、またはグアニン(G))の中または上に1または2以上の化学修飾(例えば置換)を含むヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオシドの糖部分(例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、6員糖類似体、もしくは開鎖糖類似体)、またはリン酸の中または上にさらなる化学修飾を含むことができる。ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドならびにヌクレオシドの調製は、当技術分野において、例えば米国特許第4373071号、同第4458066号、同第4500707号、同第4668777号、同第4973679号、同第5047524号、同第5132418号、同第5153319号、同第5262530号、同第5700642号から周知であり、多くの修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドが市販されている。
本発明はさらに、フラジェリンポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子のうちのいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、上述のベクターのうちのいずれかが導入されている宿主細胞を提供する。本発明はさらに、フラジェリンポリペプチドの生成を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、そのように生成されたフラジェリンポリペプチドを回収することにより、本発明のフラジェリンポリペプチドを生成する方法を提供する。
フラジェリンポリペプチドをコードする核酸配列を含む、本明細書に開示される組成物は、核酸ベースの治療薬であり得る。
核酸は、例えば、RNA(すなわち、RNAベースの治療薬)であってもよいし、またはDNA(すなわち、プラスミドDNA治療薬などのDNAベースの治療薬)であってもよい。ある特定の実施形態において、核酸ベースの治療薬は、RNAベースの治療薬である。ある特定の実施形態において、RNAベースの治療薬は、自己複製RNA分子を含む。自己複製RNA分子は、アルファウイルス由来のRNAレプリコンであり得る。
自己複製RNA分子は当技術分野で周知であり、例えば、アルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で構造ウイルスタンパク質を置換することによって生成することができる。自己複製RNA分子は、典型的には、細胞への送達後に直接翻訳され得るプラス(+)鎖分子であり、この翻訳はRNA依存性RNAポリメラーゼをもたらし、これが次に、送達されたRNAからアンチセンス及びセンスの両方の転写物を生成する。したがって、送達されたRNAは、複数の娘RNAの生成をもたらす。これらの娘RNA、ならびに共線的な(collinear)サブゲノムの転写物は、コードされた抗原(すなわちフラジェリンポリペプチド)のインサイチュ発現をもたらすように、それら自体が翻訳されてもよいし、または、抗原のインサイチュ発現をもたらすように翻訳される送達されたRNAと同じセンスのさらなる転写物をもたらすように転写されてもよい。この一連の転写の全体的な結果は、導入されたレプリコンRNAの数が大きく増幅されるため、コードされた抗原が細胞の主要なポリペプチド産物になることである。
このようにして自己複製を達成するための好適なシステムの1つは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。これらのレプリコンは、細胞への送達後にレプリカーゼ(またはレプリカーゼ転写酵素)の翻訳をもたらすプラス鎖RNAである。レプリカーゼがポリタンパク質として翻訳され、これが自己切断することで、送達されたプラス鎖RNAのゲノムのマイナス(−)鎖コピーを作出する複製複合体がもたらされる。これらのマイナス鎖転写物自体を転写して、プラス鎖の親RNAのさらなるコピーをもたらし、抗原をコードするサブゲノムの転写物をもたらすこともできる。したがって、サブゲノムの転写物の翻訳は、感染細胞による抗原のインサイチュ発現をもたらす。好適なアルファウイルスレプリコンは、Sindbisウイルス、Semliki森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。レプリコンには、変異型または野生型のウイルス配列を使用することができ、例えば、VEEVの弱毒化TC83変異体が使用されている。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される自己複製RNA分子は、(i)自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼ、及び(ii)フラジェリンポリペプチドをコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3、及びnsP4のうちの1または2以上を含む、アルファウイルスレプリカーゼであり得る。
核酸ベースの治療薬は、ウイルス性または非ウイルス性の送達系を含み得る。送達系(本明細書では送達ビヒクルともいう)は、コードされたフラジェリンポリペプチドの免疫原性を増強するアジュバント効果を有し得る。例えば、核酸分子は、リポソーム、非毒性の生分解性ポリマー微粒子もしくはウイルスレプリコン粒子(VRP)にカプセル封入されるか、またはカチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合され得る。いくつかの実施形態では、核酸ベースの治療薬は、カチオン性ナノエマルジョン(CNE)送達系または脂質ナノ粒子(LNP)送達系を含む。あるいは、核酸ベースの治療薬は、ウイルスレプリコン粒子を含んでもよい。他の実施形態では、核酸ベースの治療薬は、ネイキッドRNA(例えばmRNA)などのネイキッド核酸を含んでもよいが、LNPを介した送達が好ましい。
ある特定の実施形態において、核酸ベースの治療薬は、カチオン性ナノエマルジョン(CNE)送達系を含む。CNE送達系及びそれらの調製方法は、当技術分野で説明されている。CNE送達系では、抗原をコードする核酸分子(例えばRNA)を、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合させる。カチオン性水中油型エマルジョンは、RNA分子などの負に帯電した分子を細胞に送達するために使用することができる。エマルジョン粒子は、油性コア及びカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に帯電した分子と相互作用することにより、分子をエマルジョン粒子に固定することができる。有用なCNEのさらなる詳細は、当技術分野に見出すことができる。
したがって、本発明の核酸ベースの治療薬において、フラジェリンポリペプチドをコードするRNA分子は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合させることができる。粒子は典型的に、25Cで液相である油性コア(例えば、植物油またはスクアレン)と、カチオン性脂質(例えばリン脂質)と、場合により、界面活性剤(例えば、トリオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート80)とを含み、ポリエチレングリコールを含めることもできる。いくつかの実施形態では、CNEは、スクアレンと、1,2−ジオレオイルオキシ−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)などのカチオン性脂質とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、送達系は、CNEなどの非ウイルス性送達系であり、核酸ベースの治療薬は、自己複製RNA(mRNA)を含む。これは、体液性及び細胞性の免疫応答を誘発するのに特に有効であり得る。利点には、限定的な抗ベクター免疫応答がないこと、及びゲノムの組み込みのリスクがないことも含まれる。
LNP送達系及び非毒性の生分解性ポリマー微粒子、ならびにそれらの調製方法は、当技術分野で説明されている。LNPは、ビリオンではないリポソーム粒子で、核酸分子(例えばRNA)をカプセル封入することができるものである。粒子は何らかの外部RNAを(例えば粒子の表面上に)含むことができるが、RNAの少なくとも半分(理想的にはそのすべて)がカプセル封入される。リポソーム粒子は、例えば、飽和または不飽和であり得る双性イオン性、カチオン性、及びアニオン性脂質、例えば、DSPC(双性イオン性、飽和)、DlinDMA(カチオン性、不飽和)、及び/またはDMG(アニオン性、飽和)の混合物から形成され得る。本発明で使用される好ましいLNPには、場合により少なくとも1種のカチオン性脂質(例えばDOTAP、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMAなど)と組み合わせてリポソームを形成することができる両親媒性脂質が含まれる。DSPC、DlinDMA、PEG−DMG、及びコレステロールの混合物が特に有効である。他の有用なLNPが当技術分野で開示されている。いくつかの実施形態では、LNPはRV01リポソームである。
NF−κB
TLRシグナル伝達経路は、最終的に、転写因子の核内因子カッパB(NF−kB)の活性化をもたらす。NF−kBは、TNF−αを含む数々の炎症性サイトカイン遺伝子の発現を制御する。フラジェリンはTLR5の二量体化を誘導し、これがその後、MyD88を動員し、IRAK1、IRAK2、IRAK4、及びIRAK−Mを含むプロテインキナーゼを活性化する。これらのキナーゼの活性化は、炎症性サイトカインであるNF−kBの核局在化をもたらす[44]。
実施例(図18)において示されるように、本発明の組成物は、NF−κBの発現の増大をもたらす。本発明の組成物の投与は、炎症性サイトカインであるNF−κBの発現を増大させるため、本発明の組成物は、免疫応答を刺激するのに有用であり得る。さらに、本発明の組成物は、疾患、特に免疫活性化の低減を特徴とする疾患、及び/または免疫応答の増大によって処置可能な疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、NF−κBのレベル及び/または活性を上昇させることにより、免疫刺激剤として使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、NF−κBのレベル及び/または活性を上昇させることにより、免疫活性化の低減を特徴とする疾患を処置するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、NF−κBのレベル及び/または活性を上昇させることにより、免疫応答の増大によって処置可能な疾患を処置するのに使用するためのものである。
特に、本発明の組成物は、NF−κBの発現及び/または活性化の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、NF−κBの発現及び/または活性化の減少を特徴とする疾患を処置するのに使用するためのものである。
NF−kBの活性化は、自然免疫応答を誘発し、その後、適応免疫応答を発生させるために重要である。したがって、フラジェリンなどのTLRのアゴニストは、自然免疫応答と適応免疫応答との両方を促進することにより、感染性疾患、アレルギー、及び腫瘍を処置するためのアジュバントとして有用である可能性が高い[44]。一実施形態において、本発明の組成物は、感染性疾患、アレルギー、及び/または腫瘍を処置するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、NF−κBのレベル及び/または活性を上昇させることにより、感染性疾患、アレルギー、及び/または腫瘍を処置するのに使用するためのものである。
がんの処置
Toll様受容体(TLR)は、主に自然免疫細胞で発現し、自然免疫系と適応免疫系との両方で重要な役割を果たす膜結合型受容体である。TLRは、特定の微生物の病原体関連分子パターン(PAMP)に応答する。TLRは細菌の細胞壁成分を感知し、TLR5は、細菌のフラジェリンを認識することが公知である。フラジェリンは、上皮細胞、内皮細胞、マクロファージ、樹状細胞(DC)、及びT細胞を含む様々なヒト細胞の表面で発現する受容体タンパク質であるTLR5の唯一の既知のリガンドである[45〜47]。細菌フラジェリンによるTLR5の活性化は、様々な炎症誘発性遺伝子及び免疫応答遺伝子の活性化をもたらす[15]。
S.typhimuriumフラジェリンによるTLR5の活性化は、細胞増殖及び腫瘍成長を抑制することが知られている[48]。Vibrio vulnificusフラジェリンB(FlaB)を分泌するように操作されたS.typhimurium菌株は、マウスモデルにおいて腫瘍成長及び転移を効果的に抑制することが示されており、TLR4及びTLR5シグナル伝達経路の2ステップの活性化によって生存期間を延長させた[49]。他の種に由来するフラジェリンポリペプチドががんを処置する効力は未知である。化合物がTLR5応答を活性化する能力をアッセイすることにより、その化合物ががんの処置に有効であり得るかが示される。
Enterococcus gallinarum菌株、特に菌株MRx0518を含む組成物は、がんの処置及び防止に有効である[50]。本発明者らは、驚くべきことに、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドが、Enterococcus菌株の抗がん活性に寄与し得る強力なTLR5応答を刺激できることを示した。Enterococcus gallinarumのフラジェリンポリペプチドは、S.typhimuriumのフラジェリンポリペプチドと、配列に大きな相違点がある。実施例は、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドが、S.typhimurium由来のフラジェリンポリペプチドよりも強力なTLR5応答を生成できることを示す。したがって、本発明者らは、Enterococcus属、特にEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドが治療に有用であり、特にがんの処置及び防止に有効であることを示した。
TLR5は、乳癌、結腸直腸癌、及び胃癌を含むいくつかの異なるがんで発現することが示されている。実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なTLR5応答を生成できることを示す。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、乳癌、結腸直腸癌、または胃癌の処置または防止に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、乳癌、結腸直腸癌、または胃癌の処置または防止に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、乳癌、結腸直腸癌、または胃癌における、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、乳癌の処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、結腸直腸癌の処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、胃癌の処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、TLR5関連癌の処置または防止に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
本発明は、がんの処置または防止に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明はまた、がんの処置または防止に使用するための、Enterococcus gallinarum種のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、がんの処置または防止に使用するための、特に配列番号1の配列を有する、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。さらに、本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物による処置は、腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の低減をもたらす。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の低減に使用するためのものである。本発明の組成物は、腫瘍のサイズまたは成長を低減させるのに有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、固形腫瘍を有する患者の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、がんの処置において血管新生を低減または防止するのに使用するためのものである。本発明の組成物は、血管新生において中心的な役割を果たす免疫系または炎症系に影響を及ぼし得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、転移の防止に使用するためのものである。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、乳癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献[50]は、Enterococcus菌株が乳癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、乳癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、乳癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは乳癌である。好ましい実施形態では、がんはステージIV乳癌である。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、肺癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献[50]は、Enterococcus菌株が肺癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、肺癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、肺癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは肺癌である。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、肝臓癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献[50]は、Enterococcus菌株が肝臓癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、肝臓癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、肝臓癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは肝細胞腫(肝細胞癌)である。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、結腸直腸癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献[50]は、Enterococcus菌株が結腸直腸癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、結腸直腸癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、結腸直腸癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは結腸直腸腺癌である。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、結腸癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献[50]は、Enterococcus菌株が結腸癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、結腸癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、結腸癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは結腸腺癌である。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、直腸癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献[50]は、Enterococcus菌株が直腸癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、直腸癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、直腸癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは直腸腺癌である。好ましい実施形態では、本発明は、直腸癌の処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、胃癌の処置または防止に使用するためのものである。胃癌は高レベルのTLR5を発現し、フラジェリンによる処置は強力な抗腫瘍活性を誘発することが示されている[51]。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドが強力なTLR5応答を生成できることを示しており、したがって本発明のフラジェリンポリペプチドは、胃癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、胃癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは胃腺癌である。好ましい実施形態では、本発明は、胃癌の処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、メラノーマの処置または防止に使用するためのものである。S.typhimuriumのフラジェリンは、主要組織適合抗原クラスII制限P10ペプチドと組み合わせると、マウスメラノーマモデルで肺転移の数を低減させることが示されている[52]。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドがS.typhimuriumよりも強力なTLR5応答を生成できることを示しており、したがって本発明のフラジェリンポリペプチドは、メラノーマに対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、メラノーマの処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、メラノーマの処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、神経芽腫の処置または防止に使用するためのものである。S.typhimuriumフラジェリンによるTLR5の活性化は、細胞増殖及び腫瘍成長を抑制することが知られている[53]。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドがS.typhimuriumよりも強力なTLR5応答を生成できることを示しており、したがって本発明のフラジェリンポリペプチドは、神経芽腫に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、神経芽腫の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、神経芽腫の処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、がんは、腸のがんである。いくつかの実施形態では、がんは、腸ではない身体の一部のがんである。いくつかの実施形態では、がんは、腸癌ではない。いくつかの実施形態では、がんは、結腸直腸癌ではない。いくつかの実施形態では、がんは、小腸癌ではない。いくつかの実施形態では、処置または防止は、腸以外の部位で起こる。いくつかの実施形態では、処置または防止は、腸でも、また腸以外の部位でも起こる。
TLR5の発現は、多発性骨髄腫[54]及び急性骨髄性白血病[55]を含む血液癌細胞株において検出されている。本発明者らは、実施例において、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なTLR5応答を活性化するのに特に有効であることを示した。したがって、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、TLR5を発現する多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病などの血液癌の処置または防止に有用であり得る。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、及び急性単球性白血病などの急性及び慢性の白血病、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、ならびに骨髄異形成症候群などの血液学的悪性疾患の処置または防止に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、急性骨髄性白血病の処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、多発性骨髄腫の処置または防止に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、急性骨髄性白血病の処置または防止に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫の処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
幅広い腫瘍モデル及び臨床試験において様々なTLRアゴニストが試験されている[56]。例えば、TLR5アゴニストCBLB502は、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫のマウスモデルにおいて腫瘍クリアランスを促進することが示されている[57]。TLR5アゴニストであるエントリモド(薬理学的に最適化されたフラジェリン誘導体)の全身投与は、マウスモデルにおいて結腸直腸細胞の肝転移を抑制した。肝臓は、TLR5アゴニストであるエントリモドの投与後に最も強力なTLR5活性化応答を示す[58]。本発明者らは、実施例において、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なTLR5アゴニストとして作用することを示した。したがって、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫、結腸直腸癌ならびに肝臓癌の処置または防止に特に有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫の処置または防止に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫の処置に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明の組成物は、転移の処置または防止に有用であり得る。他の実施形態では、本発明の組成物は、転移癌の処置に有用であり得る。他の実施形態では、本発明の組成物は、進行癌の処置に有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明は、転移の処置、低減、または防止に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、転移増殖を減少または防止し得る。好ましい実施形態では、本発明は、転移の処置または防止に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、転移癌の処置または防止に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、進行癌の処置または防止に使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、癌腫の処置または防止に使用するためのものである。
Vibrio vulnificusフラジェリンB(FlaB)は、TLR4及びTLR5シグナル伝達経路の2ステップの活性化によって腫瘍成長を効果的に抑制することが示されている。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、TLR4及びTLR5シグナル伝達経路を活性化することができる。他の実施形態では、本発明のフラジェリンポリペプチドは、TLR5シグナル伝達経路のみを活性化する。
ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、NFκBシグナル伝達経路を活性化することができる。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、TLR9シグナル伝達経路を活性化することができる。参考文献[59]は、フラジェリンとTLR9アゴニストのCpG含有オリゴデオキシヌクレオチドとの間の相乗効果が腫瘍抑制につながることを示す。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、TLR5及びTLR9シグナル伝達経路を活性化することができる。ある特定のそのような実施形態では、本発明の組成物は、CpG含有オリゴデオキシヌクレオチドを含むか、またはCpG含有オリゴデオキシヌクレオチドと組み合わせて投与される。
がんに対する本発明の組成物の治療効果は、炎症誘発性メカニズムによって媒介され得る。フラジェリンによるTLR5の活性化は、炎症誘発性シグナルカスケードを開始する。参考文献[59]は、S.typhimuriumフラジェリンと高免疫原性腫瘍との相互作用がTh1応答及びTregの抑制を誘導し、腫瘍成長の阻害をもたらすことを示す。対照的に、低免疫原性腫瘍の成長率は、フラジェリン投与の影響を受けなかった。したがって、ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチド及び組成物は、免疫原性腫瘍、特に高免疫原性腫瘍の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、がんの処置において炎症を促進するのに使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、がんの処置においてTh1炎症を促進するのに使用するためのものである。Th1細胞はIFNγを生成し、強力な抗がん作用を有する[60]。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、転移していないがん、またはステージ0もしくはステージ1のがんなど、初期がんの処置に使用するためのものである。炎症の促進は、初期がんに対してより有効であり得る[60]。
参考文献[59]は、腫瘍移植後のフラジェリンの投与が抗原性腫瘍の成長を著しく阻害したことを示す。腫瘍成長に対するフラジェリンの様々な効果は、誘導される免疫応答と相関する。移植後のフラジェリン投与は、IFN−γ:IL−4比の増大及びCD4+CD25+調節性T細胞の発生頻度の減少と関連した。したがって、ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチド及び組成物は、IFN−γ:IL−4比を増大させる。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチド及び組成物は、CD4+CD25+調節性T細胞の発生頻度を減少させる。他の実施形態では、本発明のフラジェリンポリペプチド及び組成物は、IFN−γ:IL−4比を減少させず、CD4+CD25+T細胞発生頻度を増大させない。炎症はがん抑制作用を有する可能性があり[60]、TNFαなどの炎症性サイトカインは、がん療法として研究されている[61]。TNFなどの遺伝子の上方制御は、本発明の組成物が同様のメカニズムを介してがんを処置するのに有用であり得ることを示し得る。CXCR3リガンド(CXCL9、CXCL10)及びIFNγ誘導性遺伝子(IL−32)の上方制御は、本発明の組成物がIFNγ型応答を誘発することを示し得る。IFNγは、殺腫瘍活性を刺激することができる強力なマクロファージ活性化因子であり[62]、例えばCXCL9及びCXCL10も、抗がん作用を有する[63〜65]。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、炎症を促進して第2の抗がん剤の効果を増強するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、がんの処置または防止は、1または2以上のサイトカインの発現レベルを上昇させることを含む。例えば、ある特定の実施形態において、がんの処置または防止は、IL−1β、IL−6、及びTNF−αのうちの1または2以上、例えば、IL−1β及びIL−6、IL−1β及びTNF−α、IL−6及びTNF−α、またはIL−1β、IL−6、及びTNF−αの3つすべての発現レベルを上昇させることを含む。IL−1β、IL−6、及びTNF−αのうちのいずれかの発現レベルの上昇は、がんの処置における効力を示すことが知られている。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、以前に化学療法を受けた患者を処置するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法処置に耐容性を示さなかった患者を処置するのに使用するためのものである。本発明の組成物は、そのような患者に特に好適であり得る。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、再発を防止するためのものである。本発明の組成物は、長期投与に好適であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、がんの進行の防止に使用するためのものである。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、非小細胞肺癌の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、小細胞肺癌の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、扁平上皮癌の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、腺癌の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、腺管腫瘍、カルチノイド腫瘍、または未分化癌の処置に使用するためのものである。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウイルス感染に起因する肝芽腫、胆管細胞癌、胆管細胞嚢胞腺癌、または肝臓癌の処置に使用するためのものである。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、または浸潤性小葉癌の処置に使用するためのものである。
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼球内メラノーマ、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞性腫瘍、小児における視覚路及び視床下部のグリオーマ、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌、白血病、リンパ腫、中皮腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、咽頭癌、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍、前立腺癌、腎細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌の処置または防止に使用するためのものである。
本発明の組成物は、さらなる治療剤と組み合わせて使用した場合に特に有効であり得る。本発明の組成物の免疫調節効果は、より直接的な抗がん剤と組み合わせると有効であり得る。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチド(またはコーディングポリヌクレオチドもしくは発現宿主細胞)と、抗がん剤とを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤、標的化抗体免疫療法、CAR−T細胞療法、腫瘍溶解性ウイルス、または細胞増殖抑制薬である。好ましくは、抗がん剤はKeytruda(ペムブロリズマブ、Merck)である。さらに好ましい実施形態において、本組成物は、Yervoy(イピリムマブ、BMS)、Opdivo(ニボルマブ、BMS)、MEDI4736(AZ/MedImmune)、MPDL3280A(Roche/Genentech)、トレメリムマブ(AZ/MedImmune)、CT−011(ピディリズマブ、CureTech)、BMS−986015(リリルマブ、BMS)、MEDI0680(AZ/MedImmune)、MSB−0010718C(Merck)、PF−05082566(Pfizer)、MEDI6469(AZ/MedImmune)、BMS−986016(BMS)、BMS−663513(ウレルマブ、BMS)、IMP321(Prima Biomed)、LAG525(Novartis)、ARGX−110(arGEN−X)、PF−05082466(Pfizer)、CDX−1127(バルリルマブ、CellDex Therapeutics)、TRX−518(GITR Inc.)、MK−4166(Merck)、JTX−2011(Jounce Therapeutics)、ARGX−115(arGEN−X)、NLG−9189(インドキシモド、NewLink Genetics)、INCB024360(Incyte)、IPH2201(Innate Immotherapeutics/AZ)、NLG−919(NewLink Genetics)、抗VISTA(JnJ)、エパカドスタット(INCB24360、Incyte)、F001287(Flexus/BMS)、CP 870893(University of Pennsylvania)、MGA271(Macrogenix)、エマクツヅマブ(Roche/Genentech)、ガルニセルチブ(Eli Lilly)、ウロクプルマブ(BMS)、BKT140/BL8040(Biokine Therapeutics)、バビツキシマブ(Peregrine Pharmaceuticals)、CC 90002(Celgene)、852A(Pfizer)、VTX−2337(VentiRx Pharmaceuticals)、IMO−2055(Hybridon、Idera Pharmaceuticals)、LY2157299(Eli Lilly)、EW−7197(Ewha Women’s University,Korea)、ベムラフェニブ(Plexxikon)、ダブラフェニブ(Genentech/GSK)、BMS−777607(BMS)、BLZ945(Memorial Sloan−Kettering Cancer Centre)、Unituxin(ジヌツキシマブ、United Therapeutics Corporation)、Blincyto(ブリナツモマブ、Amgen)、Cyramza(ラムシルマブ、Eli Lilly)、Gazyva(オビヌツズマブ、Roche/Biogen)、Kadcyla(アド−トラスツズマブエムタンシン、Roche/Genentech)、Perjeta(ペルツズマブ、Roche/Genentech)、Adcetris(ブレンツキシマブベドチン、Takeda/Millennium)、Arzerra(オファツムマブ、GSK)、Vectibix(パニツムマブ、Amgen)、Avastin(ベバシズマブ、Roche/Genentech)、Erbitux(セツキシマブ、BMS/Merck)、Bexxar(トシツモマブ−I131、GSK)、Zevalin(イブリツモマブチウキセタン、Biogen)、Campath(アレムツズマブ、Bayer)、Mylotarg(ゲムツズマブオゾガマイシン、Pfizer)、Herceptin(トラスツズマブ、Roche/Genentech)、Rituxan(リツキシマブ、Genentech/Biogen)、ボロシキシマブ(Abbvie)、エナバツズマブ(Abbvie)、ABT−414(Abbvie)、エロツズマブ(Abbvie/BMS)、ALX−0141(Ablynx)、オザラリズマブ(Ozaralizumab)(Ablynx)、Actimab−C(Actinium)、Actimab−P(Actinium)、ミラツズマブ−dox(Actinium)、Emab−SN−38(Actinium)、ナプツモマブエスタフェナトクス(Active Biotech)、AFM13(Affimed)、AFM11(Affimed)、AGS−16C3F(Agensys)、AGS−16M8F(Agensys)、AGS−22ME(Agensys)、AGS−15ME(Agensys)、GS−67E(Agensys)、ALXN6000(サマリズマブ、Alexion)、ALT−836(Altor Bioscience)、ALT−801(Altor Bioscience)、ALT−803(Altor Bioscience)、AMG780(Amgen)、AMG228(Amgen)、AMG820(Amgen)、AMG172(Amgen)、AMG595(Amgen)、AMG110(Amgen)、AMG232(アデカツムマブ、Amgen)、AMG211(Amgen/MedImmune)、BAY20−10112(Amgen/Bayer)、リロツムマブ(Amgen)、デノスマブ(Amgen)、AMP−514(Amgen)、MEDI575(AZ/MedImmune)、MEDI3617(AZ/MedImmune)、MEDI6383(AZ/MedImmune)、MEDI551(AZ/MedImmune)、モキセツモマブパスードトクス(AZ/MedImmune)、MEDI565(AZ/MedImmune)、MEDI0639(AZ/MedImmune)、MEDI0680(AZ/MedImmune)、MEDI562(AZ/MedImmune)、AV−380(AVEO)、AV203(AVEO)、AV299(AVEO)、BAY79−4620(Bayer)、アネツマブラブタンシン(Bayer)、バンチクツマブ(Bayer)、BAY94−9343(Bayer)、シブロツズマブ(Sibrotuzumab)(Boehringer Ingleheim)、BI−836845(Boehringer Ingleheim)、B−701(BioClin)、BIIB015(Biogen)、オビヌツズマブ(Biogen/Genentech)、BI−505(Bioinvent)、BI−1206(Bioinvent)、TB−403(Bioinvent)、BT−062(Biotest)BIL−010t(Biosceptre)、MDX−1203(BMS)、MDX−1204(BMS)、ネシツムマブ(BMS)、CAN−4(Cantargia AB)、CDX−011(Celldex)、CDX1401(Celldex)、CDX301(Celldex)、U3−1565(Daiichi Sankyo)、パトリツマブ(Daiichi Sankyo)、ティガツズマブ(Daiichi Sankyo)、ニモツズマブ(Daiichi Sankyo)、DS−8895(Daiichi Sankyo)、DS−8873(Daiichi Sankyo)、DS−5573(Daiichi Sankyo)、MORab−004(Eisai)、MORab−009(Eisai)、MORab−003(Eisai)、MORab−066(Eisai)、LY3012207(Eli Lilly)、LY2875358(Eli Lilly)、LY2812176(Eli Lilly)、LY3012217(Eli Lilly)、LY2495655(Eli Lilly)、LY3012212(Eli Lilly)、LY3012211(Eli Lilly)、LY3009806(Eli Lilly)、シズツムマブ(Eli Lilly)、フランボツマブ(Eli Lilly)、IMC−TR1(Eli Lilly)、ラムシルマブ(Eli Lilly)、タバルマブ(Eli Lilly)、ザノリムマブ(Emergent Biosolution)、FG−3019(FibroGen)、FPA008(Five Prime Therapeutics)、FP−1039(Five Prime Therapeutics)、FPA144(Five Prime Therapeutics)、カツマキソマブ(Fresenius Biotech)、IMAB362(Ganymed)、IMAB027(Ganymed)、HuMax−CD74(Genmab)、HuMax−TFADC(Genmab)、GS−5745(Gilead)、GS−6624(Gilead)、OMP−21M18(デミシズマブ、GSK)、マパツズマブ(GSK)、IMGN289(ImmunoGen)、IMGN901(ImmunoGen)、IMGN853(ImmunoGen)、IMGN529(ImmunoGen)、IMMU−130(Immunomedics)、ミラツズマブ−dox(Immunomedics)、IMMU−115(Immunomedics)、IMMU−132(Immunomedics)、IMMU−106(Immunomedics)、IMMU−102(Immunomedics)、エプラツズマブ(Immunomedics)、クリバツズマブ(Immunomedics)、IPH41(Innate Immunotherapeutics)、ダラツムマブ(Janssen/Genmab)、CNTO−95(インテツムマブ、Janssen)、CNTO−328(シルツキシマブ、Janssen)、KB004(KaloBios)、モガムリズマブ(Kyowa Hakko Kirrin)、KW−2871(エクロメキシマブ、Life Science)、ソネプシズマブ(Sonepcizumab)(Lpath)、マルジェツキシマブ(Macrogenics)、エノブリツズマブ(Macrogenics)、MGD006(Macrogenics)、MGF007(Macrogenics)、MK−0646(ダロツズマブ、Merck)、MK−3475(Merck)、Sym004(Symphogen/Merck Serono)、DI17E6(Merck Serono)、MOR208(Morphosys)、MOR202(Morphosys)、Xmab5574(Morphosys)、BPC−1C(エンシツキシマブ、Precision Biologics)、TAS266(Novartis)、LFA102(Novartis)、BHQ880(Novartis/Morphosys)、QGE031(Novartis)、HCD122(ルカツムマブ、Novartis)、LJM716(Novartis)、AT355(Novartis)、OMP−21M18(デミシズマブ、OncoMed)、OMP52M51(Oncomed/GSK)、OMP−59R5(Oncomed/GSK)、バンチクツマブ(Oncomed/Bayer)、CMC−544(イノツズマブオゾガマイシン、Pfizer)、PF−03446962(Pfizer)、PF−04856884(Pfizer)、PSMA−ADC(Progenics)、REGN1400(Regene
ron)、REGN910(ネスバクマブ、Regeneron/Sanofi)、REGN421(エノチクマブ、Regeneron/Sanofi)、RG7221、RG7356、RG7155、RG7444、RG7116、RG7458、RG7598、RG7599、RG7600、RG7636、RG7450、RG7593、RG7596、DCDS3410A、RG7414(パルサツズマブ(parsatuzumab))、RG7160(イムガツズマブ)、RG7159(オビンツズマブ(obintuzumab))、RG7686、RG3638(オナルツズマブ)、RG7597(Roche/Genentech)、SAR307746(Sanofi)、SAR566658(Sanofi)、SAR650984(Sanofi)、SAR153192(Sanofi)、SAR3419(Sanofi)、SAR256212(Sanofi)、SGN−LIV1A(リンツズマブ、Seattle Genetics)、SGN−CD33A(Seattle Genetics)、SGN−75(ボルセツズマブマホドチン、Seattle Genetics)、SGN−19A(Seattle Genetics)SGN−CD70A(Seattle Genetics)、SEA−CD40(Seattle Genetics)、イブリツモマブチウキセタン(Spectrum)、MLN0264(Takeda)、ガニツマブ(Takeda/Amgen)、CEP−37250(Teva)、TB−403(Thrombogenic)、VB4−845(Viventia)、Xmab2512(Xencor)、Xmab5574(Xencor)、ニモツズマブ(YM Biosciences)、カルルマブ(Janssen)、NY−ESO TCR(Adaptimmune)、MAGE−A−10 TCR(Adaptimmune)、CTL019(Novartis)、JCAR015(Juno Therapeutics)、KTE−C19 CAR(Kite Pharma)、UCART19(Cellectis)、BPX−401(Bellicum Pharmaceuticals)、BPX−601(Bellicum Pharmaceuticals)、ATTCK20(Unum Therapeutics)、CAR−NKG2D(Celyad)、Onyx−015(Onyx Pharmaceuticals)、H101(Shanghai Sunwaybio)、DNX−2401(DNAtrix)、VCN−01(VCN Biosciences)、Colo−Ad1(PsiOxus Therapeutics)、ProstAtak(Advantagene)、Oncos−102(Oncos Therapeutics)、CG0070(Cold Genesys)、Pexa−vac(JX−594、Jennerex Biotherapeutics)、GL−ONC1(Genelux)、T−VEC(Amgen)、G207(Medigene)、HF10(Takara Bio)、SEPREHVIR(HSV1716、Virttu Biologics)、OrienX010(OrienGene Biotechnology)、Reolysin(Oncolytics Biotech)、SVV−001(Neotropix)、Cacatak(CVA21、Viralytics)、Alimta(Eli Lilly)、シスプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、フォリン酸、メトトレキサート、シクロホスファミド、5−フルオロウラシル、Zykadia(Novartis)、Tafinlar(GSK)、Xalkori(Pfizer)、Iressa(AZ)、Gilotrif(Boehringer Ingelheim)、Tarceva(Astellas Pharma)、Halaven(Eisai Pharma)、ベリパリブ(Abbvie)、AZD9291(AZ)、アレクチニブ(Chugai)、LDK378(Novartis)、ゲネテスピブ(Genetespib)(Synta Pharma)、テルゲンプマツセル−L(NewLink Genetics)、GV1001(Kael−GemVax)、チバンチニブ(ArQule)、Cytoxan(BMS)、Oncovin(Eli Lilly)、Adriamycin(Pfizer)、Gemzar(Eli Lilly)、Xeloda(Roche)、Ixempra(BMS)、Abraxane(Celgene)、Trelstar(Debiopharm)、Taxotere(Sanofi)、Nexavar(Bayer)、IMMU−132(Immunomedics)、E7449(Eisai)、Thermodox(Celsion)、Cometriq(Exellxis)、Lonsurf(Taiho Pharmaceuticals)、Camptosar(Pfizer)、UFT(Taiho Pharmaceuticals)、及びTS−1(Taiho Pharmaceuticals)からなる群から選択される抗がん剤を含む。
さらに好ましい実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、他のフラジェリンとの有用な効果を示している[59]、CpG含有オリゴデオキシヌクレオチドと組み合わせて(同時または連続的に)投与される。
いくつかの実施形態では、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、本発明の組成物における唯一の治療活性剤(複数可)である。
有毒な化学物質、病原体または放射線への曝露からの保護
ある特定の実施形態において、本発明は、有毒な化学物質、病原体または放射線への曝露に関連する症状の防止または処置に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチド、好ましくはEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチド、好ましくは菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明のフラジェリンは、有毒な化学物質、病原体もしくは放射線への曝露のリスクがある対象、または有毒な化学物質、病原体もしくは放射線に最近曝露された対象、例えば1、2、3、4、または5時間前に曝露された対象に投与することができる。
化学物質、病原体、または放射線にヒト集団が突然曝露されると、かなりの病的状態が生じる可能性がある。ヒト集団を保護するための戦略の1つは、生来の宿主防御経路、特に細胞保護遺伝子及び/または抗菌遺伝子の発現を急速に誘導するものを活性化することである。この領域における多くの研究はTLR4アゴニストのLPS/エンドトキシンに焦点を当ててきたが、LPSの投与は、敗血症または重度の肺傷害を含む重度の炎症性病態を引き起こす可能性がある。さらに、LPSは、病原体または化学物質の負荷と相互作用する最初の細胞である上皮細胞を十分に刺激することができない。
フラジェリンは、哺乳動物、昆虫、及び植物を含む様々な生物において宿主防御を刺激する。LPSとは対照的に、フラジェリンは、上皮細胞における自然免疫シグナル伝達経路の強力な活性化因子であるが、概して、マクロファージ及び樹状細胞などの造血細胞の活性化因子としては不十分であることが観察されている。S.typhimuriumフラジェリンは、LPSに関連する有害作用を媒介するTNF−αなどの「マスター」炎症性サイトカインを有意なレベルで刺激しないことが観察されている。S.typhimuriumフラジェリンは、マウスのTLR5媒介性自然免疫を活性化し、化学物質、病原体または放射線への曝露からマウスを保護することが観察されている[66]。
S.typhimuriumフラジェリンの投与は、TLR5を必要とするメカニズムを介して放射線曝露から保護することが示されている[66]。照射の2時間前にフラジェリンを予防的に投与した場合に最適な保護が観察されたが、照射の4時間後までにフラジェリンを投与した場合にも依然として有意な程度の保護が観察された。実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドがS.typhimuriumよりも強力なTLR5応答を刺激できることを示す。したがって、本発明者らは、Enterococcus属、特にEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドが放射線防護剤として有用であり得ることを示した。
本発明は、放射線防護剤として使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明はまた、放射線防護剤として使用するための、Enterococcus gallinarum種のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、放射線防護剤として使用するための、特に配列番号1の配列を有する、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
TLR5アゴニストのエントリモドによる処置も、放射線感受性組織の3つの主要なタイプである造血組織、消化器系組織、及び皮膚組織のすべてにおいて、放射線誘発性損傷を低減させることが示されている。また、頭頸部照射のマウスモデルにおいて放射線誘発性の上皮損傷を軽減することも示されている[67]。実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なTLR5アゴニストとして作用することを示す。したがって、本発明者らは、Enterococcus属、特にEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドが、放射線誘発性損傷を低減させるのに有用であり得ることを示した。ある特定の実施形態において、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、造血組織、消化器系組織、または皮膚組織における放射線誘発性損傷を低減させるのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、放射線誘発性の上皮損傷を低減させるのに使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、放射線誘発性損傷を低減させるのに使用するため、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、放射線療法の前に、好ましくは経口的に投与され得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、放射線療法の後に、好ましくは経口的に投与され得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、放射線療法を最近受けた患者、または放射線療法を受ける予定である患者に投与される。
好ましい実施形態では、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、照射曝露の前に投与される。他の実施形態では、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、放射線曝露の後、好ましくは曝露後4時間以内に投与される。
細菌感染の処置
S.typhimuriumフラジェリンの投与は、細菌感染に対する免疫応答を刺激することが示されている。参考文献[68]は、S.typhimuriumフラジェリンを抗生物質とともに予防的に鼻腔内投与するとマウスの呼吸器がStreptococcus pneumoniae菌から保護されることを示し、参考文献[66]は、S.typhimuriumによる感染の2時間前にS.typhimuriumフラジェリンを経口投与すると死亡率が低減したことを示す。フラジェリンは、TLR5自然免疫応答を活性化することにより、これらの応答を誘導した。実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドがS.typhimuriumよりも強力なTLR5応答を刺激できることを示す。したがって、本発明者らは、Enterococcus属、特にEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドが、細菌感染の処置または防止に有用であり得ることを示した。
本発明は、細菌感染の処置または防止に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明はまた、細菌感染の処置または防止に使用するための、Enterococcus gallinarum種のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、細菌感染の処置または防止に使用するための、特に配列番号1の配列を有する、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
ある特定の実施形態において、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、細菌感染の処置に使用するための抗生物質と組み合わせて使用される。ある特定の実施形態において、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、細菌感染の処置に使用するための組成物における唯一の治療剤として使用される。
ワクチンアジュバント
微生物成分は、低免疫原性ワクチンの免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用することができる。フラジェリンは、細菌、ウイルス、及び寄生虫の感染のためのワクチンにおけるアジュバントとして作用することが示されているが、これらの研究のほとんどは、S.typhimurium及びVibrio vulnificusのフラジェリンを使用するものであった[15]。他の種、特にEnterococcus spp.に由来するフラジェリンポリペプチドがワクチンアジュバントとして作用する効力は未知である。
フラジェリンは、TLR5受容体を介して自然免疫応答を刺激することにより、アジュバントとして作用する。本発明者らは、驚くべきことに、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドがS.typhimuriumよりも強力なTLR5応答を刺激できることを示した。したがって、本発明者らは、Enterococcus属、特にEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドが、ワクチンアジュバントとして有用であり得ることを示した。ワクチンアジュバントとしてのフラジェリンポリペプチドの使用は、フラジェリンポリペプチドが、概して、別々の抗原に対する免疫応答を増強することにより、例えば、感染因子からの保護を提供するため、または感染因子による感染を防止するために使用されることを意味する。
本発明は、ワクチンアジュバントとして使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明はまた、ワクチンアジュバントとして使用するための、Enterococcus gallinarum種のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、ワクチンアジュバントとして使用するための、特に配列番号1の配列を有する、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをアジュバントとして含むワクチン組成物を提供する。ある特定の実施形態において、ワクチン組成物は、細菌感染の処置または防止に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、処置または防止される細菌性病原体は、Y.pestis、tetanus、Streptococcus pneumoniae、Escherichia coli、またはM.tuberculosisである。ある特定の実施形態において、ワクチン組成物は、ウイルス感染の処置または防止に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、処置または防止されるウイルス病原体は、インフルエンザ、HIV、狂犬病、または口蹄疫ウイルスである。ある特定の実施形態において、ワクチン組成物は、寄生虫感染の処置または防止に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、寄生虫は、Plasmodium vivax、Plasmodium yoelii、またはEimeria tenellaである。そのような任意の実施形態において、本組成物は、関連する病原体に由来する少なくとも1つの抗原を含む。そのような好ましい実施形態において、本組成物は、関連する病原体に由来する少なくとも1つの抗原に融合またはコンジュゲートした本発明のフラジェリンを含む。そのような実施形態では、本発明は、本発明のフラジェリンと、任意選択のリンカーと、病原体または寄生虫由来の抗原とを含む、融合ポリペプチドを提供する。
粘膜経路による投与は、魅力的なワクチン投与経路である。フラジェリンは、上皮細胞における自然免疫シグナル伝達経路の強力な活性化因子であり、上皮細胞は、粘膜経路によって投与される薬剤に最初に遭遇する最初の主要な細胞型である。S.typhimurium及びVibrio vulnificusのフラジェリンタンパク質は、インフルエンザ、西ナイルウイルス、Escherichia coli、Yersinia pestis、Clostridium tetani、C.jejuni、Streptococcus spp.、及びPlasmodium falciparumに対する粘膜ワクチンにおいて強力なアジュバント活性を示している[15]。他の種に由来するフラジェリンポリペプチドが粘膜ワクチンアジュバントとして作用する効力は未知である。
フラジェリンは、TLR5受容体を介して自然免疫応答を刺激することにより、アジュバントとして作用する。本発明者らは、驚くべきことに、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドがS.typhimuriumよりも強力なTLR5応答を刺激できることを示した。したがって、本発明は、粘膜ワクチンアジュバントとして使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、粘膜ワクチンアジュバントとして使用するための、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、粘膜ワクチンアジュバントとして使用するための、特に配列番号1の配列を有する、菌株MRx0518由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
ある特定の実施形態において、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、細菌感染の処置または防止に使用するための粘膜ワクチンに使用するためのものである。好ましい実施形態では、細菌感染は、Escherichia coli、Yersinia pestis、Clostridium tetani、C.jejuni、Streptococcus spp.、またはPlasmodium falciparumである。ある特定の実施形態において、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、ウイルス感染の処置または防止に使用するための粘膜ワクチンに使用するためのものである。好ましい実施形態では、ウイルス感染はインフルエンザまたは西ナイルウイルスである。
本発明の組成物の投与は、腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)の発現の増大をもたらし得る。TNF−αは、ワクチン応答に重要であることが知られている。例えば、TNF−αは、高齢者集団のインフルエンザワクチン接種における効率的なワクチン応答に必要であることが示されている[69]。本発明の組成物の投与はTNF−α発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、TNF−αのレベル及び/または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、インフルエンザ治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答を増強するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明は、抗原と組み合わせて投与される組成物を提供する。本発明のそのような実施形態において、本発明のフラジェリンは、抗原に融合またはコンジュゲートしていてもよい。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワクチン接種の直前または直後に患者に投与するためのものである。
Enterococcus gallinarum、特に菌株MRX518は有鞭毛性であり、フラジェリンはTLR5アゴニストであり得る。TLRアゴニストは、特に高齢者集団において、様々な抗原タイプに対するワクチンアジュバントとして開発中である[70]。また、MRX518はTLR5アゴニストである。したがって、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして、特に免疫系の活性が低減している場合がある高齢患者(例えば、40、50、60、70または80歳超)に投与されるワクチンのために有用であり得る。TLR5シグナル伝達は、年齢に関連した自然免疫応答においても重要な役割を果たす[71]。ある特定の実施形態において、本組成物は、自然免疫応答を増強するのに使用するためのものである。TLR5アゴニストはワクチンアジュバントとして開発中であるが、これらはすべて既知の病原体に由来し、及び/または合成である。対照的に、本発明の組成物は、共生細菌を含む。
本発明の組成物の投与は、IL−6の発現の増大をもたらし得る。Il−6の発現の増大は、多くの疾患でワクチン応答に関連付けられてきた。例えば、成人にインフルエンザワクチンを投与した後、IL−6がCD14+CD16−炎症性単球によって生成され[72]、より高いレベルのIL−6は、インフルエンザワクチンに対するワクチン応答の達成に関連付けられた[73]。さらに、AS03アジュバント系の注射後にIl−6が生成され[74]、結核ワクチンの投与後には、マウスにおけるIL−6の下方制御がヘルパーT細胞応答を低減させることが示された[75]。本発明の組成物の投与はIL−6発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−6のレベル及び/または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、結核治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
さらに、IL−6及びTNF−αの発現は、治療用HIVワクチン[Huang et al]、結核ワクチン及びクラミジアワクチンの効力と相関することが示されている[76]。Suら[77]は、IL−6またはTNF−αをFMDV DNAワクチンと同時接種すると、CD4+及びCD8+T細胞によるIFN−γ発現が増大し、CD4+T細胞におけるIL−4の発現が高まり、抗原特異的細胞傷害性応答が高まったことを示した。本発明の組成物の投与はIL−6及びTNF−αの発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、TNF−αのレベル及び/または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−6のレベル及び/または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、TNF−α及びIL−6のレベル及び/または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、HIV治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、クラミジア治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
本発明の組成物の投与は、IL−1βの発現の増大をもたらし得る。Liら[78]は、アジュバントの水酸化アルミニウムがIL−1βの分泌を活性化したことを示し、IL−β自体がアジュバントとして作用し得ることを示唆した。本発明の組成物の投与はIL−1β発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。実施例は、本発明の組成物の投与が、CD8+T細胞のTregに対する比を増大させ得ることを示す。アジュバントはCD8+T細胞を刺激することが示されており[79]、本発明の組成物の投与はCD8+T細胞のTregに対する比を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、CD8+T細胞のTregに対する比を増大させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
本発明の組成物の投与は、CXCR3リガンドのCXCL9及びCXCL10の発現またはレベルの上昇をもたらし得る。ASO3、CpG、GLA−SE、αGalCerなどの既知のアジュバントはすべて、CXCL9及び10を増大させ[80、81]、これは、本発明の組成物がアジュバントとして有効であることを示唆している。また、CXCL9及び10は、IFNγ/Th1応答に関連し、抗体応答を促進する[82]。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原、特に病原性抗原またはがん抗原に対する抗体応答を促進するのに使用するためのものである。また、CXCL9は、治験薬のマラリアワクチンを受けたボランティアにおいて、IFN−γよりも感度の高いワクチン誘発性T細胞応答の指標である[83]。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原、特に病原性抗原またはがん抗原に対するT細胞応答を促進するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、CXCL9及びCXCL10のレベル及び/または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本組成物は、マラリアからの保護に使用するためのものである。
本発明の組成物の投与は、IL−12p70の発現またはレベルの上昇をもたらし得る。この効果はワクチンアジュバントの効率に関連付けられており、IL−12自体がアジュバントとして提案されている[84]。これは、本発明の組成物がアジュバントとして有効であることを示唆している。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−12p70のレベル及び/または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
概して、ワクチンアジュバントとして使用する場合、本発明の組成物は、患者に別々に投与された抗原に対するアジュバント効果をもたらすために単独で投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は経口投与され、抗原は非経口的に注射される。代替的な実施形態では、本発明のフラジェリンは、抗原に融合またはコンジュゲートしていてもよい。
本発明の組成物は、任意の有用な抗原に対する免疫応答を増強するために使用され得る。本発明で使用される例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原、タンパク質及び/または糖類抗原などの細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、ならびに腫瘍抗原が含まれる。本発明は、インフルエンザウイルス、HIV、鉤虫、B型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、Staphylococcus aureus、クラミジア、SARSコロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Streptococcus pneumoniae、Neisseria meningitidis、Mycobacterium tuberculosis、Bacillus anthracis、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルスなどに対するワクチンに特に有用である。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンは、これらの抗原のうちの1または2以上に融合またはコンジュゲートしている。
本発明のフラジェリンとともに使用されるさらなる抗原には、糖タンパク質及びリポグリカン抗原が含まれる。ある特定の実施形態において、抗原は古細菌抗原である。例示的な腫瘍関連抗原には、メラノーマ抗原E(MAGE)、癌胎児抗原(CEA)、MUC−1、HER2、シアリル−Tn(STn)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、ウィルムス腫瘍遺伝子(WT1)、CA−125、前立腺特異抗原(PSA)、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、及び腫瘍性タンパク質が含まれる。
本発明のフラジェリンはまた、アルツハイマー病及び他の神経変性障害などの非伝染性疾患に対するワクチンへの応答を増強するために有用であり得、この場合、本発明で使用する抗原はアミロイドベータまたはTauであり得る。非伝染性疾患に対する他のかかる抗原としては、PCSK9(コレステロール上昇の処置用)が挙げられる。本発明のフラジェリンはまた、習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、またはアヘン剤に対するワクチンへの応答を増強するために有用であり得る。
本発明はまた、患者の免疫応答を高めるための薬物の製造における、(i)抗原の水性調製物、及び(ii)Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物の使用を提供する。
これらの方法及び使用によって高められる免疫応答には、概して、抗体応答、好ましくは防御抗体応答が含まれる。
免疫系の刺激
本発明の組成物は、免疫刺激をもたらし得る。本発明の組成物の投与は免疫刺激効果を有し得るため、本発明の組成物は、疾患、特に免疫活性化の低減を特徴とする疾患、及び免疫応答の増大によって処置可能な疾患の処置に有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激することにより、疾患を処置するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
本発明の組成物は、細胞集団におけるTregのパーセンテージの増大を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるTregのパーセンテージの増大を特徴とする疾患を処置または防止するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるCD4+CD25+CD127−細胞のパーセンテージの増大を特徴とする疾患を処置または防止するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるTregのパーセンテージを減少させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Tregによる免疫応答の抑制を低減させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Tregの選択的低減によって免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫刺激に使用するためのものであり、本発明の組成物は、Tregの数またはパーセンテージを低減させる。
本発明の組成物は、CD8/Treg及び/または活性化CD8/Treg細胞の比の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、CD8/Treg細胞の比の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、活性化CD8/Treg細胞の比の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、CD8/Treg細胞の比を増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、活性化CD8/Treg細胞の比を増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
本発明の組成物は、B細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、B細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、CD19+CD3−細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるB細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものであり、B細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、B細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
本発明の組成物は、CD8 T細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、CD8 T細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるCD8 T細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものであり、CD8 T細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、CD8 T細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
本発明の組成物は、CD8+活性化細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、CD8+活性化細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるCD8+活性化細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものであり、CD8+活性化細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、CD8+活性化細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
本発明の組成物の投与は、炎症性サイトカインなどの炎症誘発性分子の発現の増大をもたらし得る。本発明の組成物を投与すると発現レベルの上昇を示し得る炎症誘発性分子の例としては、IL−8、IL−12p70、IL−23、TNF−α、IL−1β、及びIL−6が挙げられる。本発明の組成物の投与は炎症誘発性分子の発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、炎症性サイトカインなどの炎症誘発性分子の発現の減少を投与する疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、炎症誘発性分子の発現及び/または活性の減少を特徴とする疾患、特に炎症性サイトカインの発現及び/または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、IL−8、IL−12p70、IL−23、TNF−α、IL−1β、及び/またはIL−6の発現及び/または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−23、TNF−α、IL−1β、及び/またはIL−6の発現及び/または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−8、IL−12p70、IL−23、TNF−α、IL−1β、及び/またはIL−6の発現及び/または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
本発明の組成物の投与は、IL−1βの発現の増大をもたらし得る。IL−1βは炎症性サイトカインである[85]。IL−1βの生成及び分泌は、炎症応答の活性化に関連するタンパク質複合体であるインフラマソームによって調節される[86]。本発明の組成物の投与はIL−1βの発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、IL−1βの発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、IL−1βの発現及び/または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−1βの発現及び/または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。
本発明の組成物の投与は、IL−23の発現の増大をもたらし得る。IL−23は、炎症に関係付けられている[87、88]。免疫応答において提唱されているIL−23の機能には、CD4+メモリーT細胞の増殖の促進、及び樹状細胞(DC)によるIFN−γの分泌の促進が含まれる[89]。本発明の組成物の投与はIL−23の発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、IL−23の発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、IL−23の発現及び/または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−23の発現及び/または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−23の発現及び/または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
本発明の組成物の投与は、腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)の発現の増大をもたらし得る。TNF−αは、細胞死を促進する様々なシグナル伝達経路に関与することが知られている炎症性サイトカインである。TNF−αは、その同族受容体であるTNFR−1に結合することによりアポトーシスを開始し、アポトーシス経路における一連の切断事象を引き起こす[90]。TNF−αは、RIPキナーゼ依存性メカニズムを介して壊死を誘発することもできる[91]。本発明の組成物の投与はTNF−α発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、疾患の処置、特にTNF−αの発現の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、TNF−α発現の減少を特徴とする疾患の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、TNF−αの発現及び/または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、TNF−αの発現及び/または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、TNF−αの発現及び/または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
本発明の組成物の投与は、IL−6の発現の増大をもたらし得る。IL−6は、炎症時に生成され、ナイーブCD4+T細胞の分化、及びCD8+T細胞の細胞傷害性T細胞への分化を促進する炎症性サイトカインである[9]。本発明の組成物の投与はIL−6の発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、IL−6の発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、IL−6の発現及び/または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−6の発現及び/または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−6の発現及び/または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
Bettelliら[93]は、IL−6がTregの生成を阻害すると報告した。本発明の組成物はIL−6の発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、IL−6の発現を増大させることにより、Tregの数またはパーセンテージを選択的に減少させ得る。一実施形態において、本発明の組成物は、IL−6の発現を増大させることにより、免疫刺激に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Tregの数またはパーセンテージを減少させることにより、免疫刺激に使用するためのものである。
実施例はまた、本発明の組成物がTヘルパー細胞及び細胞傷害性Tリンパ球の分化を促進することも示す。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、Tヘルパー細胞及び/または細胞傷害性Tリンパ球の分化を刺激するのに使用するためのものである。
細胞療法
キメラ抗原受容体T細胞(CAR−T)療法
本発明の組成物の投与は、IL−6の発現の増大をもたらし得る。Il−6発現の増大は、慢性リンパ球性白血病のCD19 CAR−T療法に対する応答と相関付けられている。血清IL−6の増大はCAR−T細胞の増殖と関連付けられ、一方、IL−6の阻害はCAR−T細胞増殖の阻害と関連付けられた[94]。本発明の組成物の投与はIL−6発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、細胞療法、特にCAR−T細胞療法において有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、CAR−T細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、慢性リンパ球性白血病の処置に使用するためのものである。
Tregの選択的枯渇は、細胞傷害性リンパ球の効力を増強することが示されている[95]。CAR−T細胞は細胞傷害性リンパ球のサブセットであり、したがって、Tregの選択的枯渇はCAR−T細胞療法において有効であると考えられている。本発明の組成物の投与はTregを枯渇させ得るため、本発明の組成物は、細胞療法、特にCAR−T細胞療法において有用であり得る。
したがって、本発明の組成物は、細胞療法において、特に細胞療法に対する応答を増強するのに有用であり得る。
間葉系幹細胞(MSC)療法
間葉系幹細胞(MSC)療法には免疫刺激特性があることが報告されている。MSCをLPSで処理すると、炎症性サイトカインのIL−6及びIL−8が上方制御され、B細胞増殖の増大がもたらされる[96]。したがって、本発明の組成物はIL−6の発現を増大させ得るため、本組成物はMSC細胞療法との組み合わせにおいて有用であり得る。
幹細胞移植療法
幹細胞移植療法において未分化幹細胞を使用する代わりに、移植前に幹細胞をある程度まで分化させることが有益であり得ることが報告されている。例えば、Hengら[97]は、幹細胞の心筋形成分化が、比較的高い生着効率、筋細胞の再生の増強、及び心臓機能の回復の増大をもたらすことにより有益であり得ることを報告した。本発明の組成物の投与は、未分化神経芽腫細胞のニューロン分化を開始し得るため、本発明の組成物は、幹細胞移植療法における幹細胞分化に有用であり得る。
造血幹細胞移植
造血幹細胞移植は、通常は骨髄、末梢血、または臍帯血に由来する多能性造血幹細胞の移植である。同種造血幹細胞移植前にEnterococci(Enterococcus gallinarum及びEnterococcus casseliflavus)が腸にコロニー形成すると、無再発死亡率が減少するため、患者の2年生存率が著しく向上することが示されている[9]。したがって、実施例において示される免疫調節効果は、造血幹細胞移植療法において有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植後、特に同種造血幹細胞移植後の生存率を向上させるのに有用であり得る。
本発明の組成物は、同種造血幹細胞移植との組み合わせにおいて有用であり得る。本発明の組成物は、同種造血幹細胞移植に対する患者の応答成功を後押しするのに効果的であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植の前に投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植を受ける予定である患者に投与するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植の後に投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植を受けた患者に投与するためのものである。
免疫老化
Fulopら[99]は、Treg細胞数の増大及びB細胞数の減少が適応免疫系の老化に関連していることを特定した。したがって、本発明の組成物は、免疫老化を防止または遅延させるために使用され得る。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化の防止に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Treg細胞数の増大を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、B細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Treg細胞数の増大及びB細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Treg細胞数を減少させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、B細胞数を増大させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Treg細胞数を増大させ、B細胞数を減少させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化に起因する疾患の処置に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化を遅延させること及び/または防止することにより、老化関連疾患の処置に使用するためのものである。
さらに、ワクチンアジュバントが免疫老化を克服し得ることが提唱されている[100]。本発明の組成物はワクチンアジュバントとして使用するのに好適であるため、本発明の組成物は、免疫老化を防止または遅延させるのに有用であり得る。別の実施形態では、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして免疫老化を遅延させること及び/または防止することに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものであり、本組成物は、免疫老化を遅延させ、及び/または防止する。
免疫老化に関連する疾患としては、循環器疾患、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性疾患、がん、真性糖尿病2型[101]、ならびに自己免疫障害[102]が挙げられる。
投与形態
好ましくは、本発明の組成物は、注射により、好ましくは皮下に、あるいは静脈内または腹腔内に投与される。注射による投与に好適な組成物に関するさらなる詳細は、次のセクションに提示する。代替的な実施形態では、本発明の組成物は、消化管に投与される。免疫系は、消化管における細菌及び細菌タンパク質の存在によって調節されることが知られている。本発明の組成物は経口投与されるが、直腸内、鼻腔内、または頬側もしくは舌下経路を介して投与してもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、泡状物、スプレーまたはゲルとして投与してもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えばカカオ油(カカオバター)、合成硬質脂肪(例えばsuppocire、witepsol)、グリセロゼラチン、ポリエチレングリコール、またはセッケングリセリン組成物の形態における肛門坐剤などの坐剤として投与してもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、経鼻胃管、経口胃管、胃管、空腸瘻管(Jチューブ)、経皮内視鏡的胃瘻造設術(PEG)などの管、または胃、空腸、及び他の好適なアクセスポートへのアクセスを提供する胸壁ポートなどのポートを介して、消化管に投与される。
本発明の組成物は、1回投与されてもよいし、または処置レジメンの一部として連続的に投与されてもよい。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は連日投与される。
本発明のある特定の実施形態では、本発明に係る処置は、患者の腸内細菌叢の評価を伴う。
本発明の組成物は、がんと診断された患者、またはがんのリスクがあると特定された患者に投与され得る。本組成物はまた、健康な患者におけるがんの発生を防止するための予防手段として投与されてもよい。
本発明の組成物は、異常な腸内細菌叢を有すると特定された患者に投与され得る。例えば、患者において、Enterococcus spp、特にEnterococcus gallinarumのコロニー形成が低減しているか、または存在しない場合がある。
概して、本発明の組成物はヒトの処置のためのものであるが、家禽、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、またはウサギなどの単胃哺乳動物を含む動物を処置するのに使用してもよい。本発明の組成物は、動物の成長及び能力を増強するために有用であり得る。動物に投与する場合は、強制経口投与を使用してもよい。
組成物
概して、本発明の組成物は、Enterococcus属由来、特にEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドを含む。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、腸へのフラジェリンの送達を可能にするようにカプセル封入されている。カプセル封入は、例えば、pHの変化によって誘発され得る圧力、酵素活性、または物理的崩壊などの化学的または物理的な刺激による破裂によって標的位置で送達されるまで、組成物を分解から保護する。任意の適切なカプセル封入方法を使用してよい。例示的なカプセル封入技術には、多孔性マトリックスへの封入、固体担体表面への結合または吸着、凝結または架橋剤による自己凝集、及び微孔性膜またはマイクロカプセルへの機械的封じ込めが含まれる。
したがって、組成物は薬学的に許容され得る。組成物は通常、フラジェリンポリペプチド(または核酸)以外の成分を含む。例えば、組成物は典型的に、1または2以上の薬学的担体(複数可)及び/または賦形剤(複数可)を含む。
組成物は、水性形態でヒトに投与され得る。しかしながら、そのような実施形態では、投与前に、組成物は非水性形態であってもよい。例えば、いくつかの治療薬は水性形態で製造され、次に充填及び分配ならびに投与も水性形態で行われるが、他の治療薬は、製造中に凍結乾燥され、使用時に水性形態に再構成される。したがって、本発明の組成物は、凍結乾燥製剤のように乾燥していてもよい。
本組成物は、チオメルサールまたは2−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかしながら、治療薬は水銀物質を実質的に含まない(すなわち5μg/ml未満)、例えばチオメルサール不含であることが好ましい。水銀を含まない治療薬がより典型的である。保存剤不含の治療薬が特に好ましい。
熱安定性を向上させるために、組成物に温度保護剤を含めてもよい。そのような薬剤のさらなる詳細を以下に提示する。
張性を制御するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含めることが一般的である。塩化ナトリウム(NaCl)が一般的に使用され、1〜20mg/ml、例えば約10±2mg/mlのNaCl濃度で存在し得る。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
組成物は概して、200mOsm/kg〜400mOsm/kg、より多くの場合では240〜360mOsm/kg、より典型的には290〜310mOsm/kgの範囲内の浸透圧を有する。
組成物は、1または2以上の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液(特に水酸化アルミニウムのアジュバントを含むもの)、またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は典型的に5〜20mMの範囲で含まれる。
組成物のpHは概して、5.0〜8.1、より典型的には6.0〜8.0、例えば6.5〜7.5、または7.0〜7.8である。
本組成物は典型的には無菌である。本組成物は、典型的には非発熱性でもあり、例えば1用量当たり<1EU(エンドトキシン単位、標準規格)、例えば1用量当たり<0.1EUを含む。本組成物は、多くの場合グルテンを含まない。
本組成物は、単回投与用の材料を含んでもよいし、または複数回投与用の材料を含んでもよい(すなわち「複数用量」キット)。保存剤の含有は、複数用量の構成では典型的である。複数用量組成物に保存剤を含めることの代替として(またはそれに加えて)、本組成物は、材料を取り出すための無菌アダプターを有する容器に収容されてもよい。
ヒトタンパク質治療薬は、典型的には約0.5mlの投与量で投与されるが、小児には半分の用量(すなわち約0.25ml)を投与してもよい。
本発明の組成物はまた、1または2以上の免疫調節剤を含み得る。多くの場合、免疫調節剤のうちの1または2以上は、1または2以上のアジュバントを含む。アジュバントは、以下にさらに記載するTH1アジュバント及び/またはTH2アジュバントを含み得る。
本組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され得る。注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに好適な固体形態(例えば凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物)を調製することもできる。本組成物は、局所投与用に、例えば軟膏、クリーム、または粉末として調製してもよい。本組成物は、経口投与用に、例えば錠剤もしくはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップ(場合により風味付けされる)として調製してもよい。本組成物は、肺投与用に、例えば微粉またはスプレーを使用した吸入剤として調製してもよい。本組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製してもよい。本組成物は、鼻、耳、または眼への投与用に、例えば点滴薬として調製してもよい。本組成物は、合わさった組成物が哺乳動物への投与の直前に再構成されるように設計されたキットの形態であってもよい。そのようなキットは、液体形態の1または2以上の抗原、及び1または2以上の凍結乾燥された抗原を含み得る。ある特定の実施形態において、組成物中に存在する本発明のフラジェリンは、1または2以上の抗原に融合またはコンジュゲートしていてもよい。
組成物が使用前に即座に調製され(例えば、成分が凍結乾燥形態で提供される場合)、キットとして提供される場合、このキットは2つのバイアルを含んでもよいし、または、注射前にバイアルの内容物を再活性化するためにシリンジの内容物が使用されるような1つの充填済みシリンジ及び1つのバイアルを含んでもよい。
治療薬として使用される組成物は、免疫学的有効量のポリペプチドまたはコーディング核酸のほかに、必要に応じて任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、単回投与または一連の投与の一部としてのその量の個体への投与が、処置または防止に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康及び体調、年齢、処置される個体の分類学的グループ(例えば非ヒト霊長類、霊長類など)、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、治療医師による医学的状況の評価、ならびに他の関連要因に応じて異なる。この量は、通例の試験によって決定され得る比較的広い範囲に含まれると予想される。2つ以上の抗原が組成物に含まれる場合、2つの抗原は、互いに同じ用量で存在してもよいし、または異なる用量で存在してもよい。
上述のように、組成物は温度保護剤を含んでもよく、この成分は、アジュバント添加組成物(特にアルミニウム塩などのミネラルアジュバントを含むもの)において特に有用であり得る。参考文献103に記載されているように、凝固点を下げるために、例えば凝固点を0℃未満に下げるために、液体の温度保護剤を水性ワクチン組成物に添加してもよい。したがって、本組成物は、熱的破壊を阻害するために、0℃未満だがその凝固点を超える温度で保管され得る。また温度保護剤は、凍結及び解凍後の凝集または沈降から無機塩アジュバントを保護しながら組成物を凍結することを可能にし、例えば40℃を超える高温で組成物を保護することもできる。出発時の水性ワクチン及び液体の温度保護剤は、液体の温度保護剤が最終混合物の1〜80体積%を形成するように混合され得る。好適な温度保護剤は、ヒトに投与するのに安全であり、水に容易に混和/溶解する必要があり、組成物中の他の成分(例えば抗原及びアジュバント)を損傷してはならない。例としては、グリセリン、プロピレングリコール、及び/またはポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。好適なPEGは、200〜20,000Daの範囲の平均分子量を有し得る。一実施形態において、ポリエチレングリコールは、約300Daの平均分子量を有し得る(「PEG−300」)。
本発明は、(i)1または2以上のフラジェリンポリペプチド(複数可)と、(ii)温度保護剤とを含む組成物を提供する。この組成物は、(i)1または2以上の抗原(複数可)を含む水性組成物を、(ii)温度保護剤と混合することによって形成することができる。次にこの混合物を、例えば0℃未満、0〜20℃、20〜35℃、35〜55℃、またはそれ以上で保管してもよい。これは液体形態で保管してもよいし、または凍結形態で保管してもよい。この混合物を凍結乾燥してもよい。この組成物は、代替的に、(i)1または2以上の抗原(複数可)を含む乾燥組成物を、(ii)温度保護剤を含む液体組成物と混合することによって形成してもよい。したがって、成分(ii)は、成分(i)を再構成するために使用され得る。
この組成物は経口投与されてもよく、錠剤、カプセル、または粉末の形態であってもよい。インビボの送達及び/または部分的もしくは全体的なコロニー形成及び生存率を向上させるための脱酸素剤及びプレバイオティクス基質として、他の成分(例えばビタミンCなど)を含めてもよい。
本発明の組成物は、治療有効量の本発明のフラジェリンポリペプチドを含む。フラジェリンポリペプチドの治療有効量は、患者に有益な効果を及ぼすのに十分である。
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体を含み得る。そのような好適な賦形剤の例は、参考文献[104]に見出すことができる。治療用途に許容される担体または希釈剤は製薬分野において周知であり、例えば参考文献[105]に記載されている。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な薬務との関連で選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、もしくは希釈剤として、またはそれに加えて、任意の好適な結合剤(複数可)、滑沢剤(複数可)、懸濁化剤(複数可)、コーティング剤(複数可)、可溶化剤(複数可)を含み得る。好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、天然及び合成のガム、例えばアカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。好適な滑沢剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。保存剤、安定剤、色素、及びさらには香味料を医薬組成物中に供給してもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びp−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁化剤を使用してもよい。
いくつかの実施形態では、本組成物は、がんの処置または防止に使用するためのEnterococcus属由来の2種以上のフラジェリンポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、本組成物は、配列番号1を有するフラジェリンポリペプチドと、Enterococcus属由来の少なくとも1種のさらなるフラジェリンポリペプチドとを含む。ある特定の実施形態において、本組成物は、配列番号1を有するフラジェリンポリペプチドと、Enterococcus gallinarum種由来の少なくとも1種のフラジェリンポリペプチドとを含む。ある特定の実施形態において、本組成物は、配列番号1を有するフラジェリンポリペプチドと、配列番号2〜42からなる群から選択される少なくとも1種のフラジェリンポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、本組成物は、Enterococcus属由来、特にEnterococcus gallinarum種由来の少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40または45種のフラジェリンポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ種に由来する50種未満のフラジェリンポリペプチド(例えば45、40、35、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4または3種未満の菌株)を含み、場合により、いずれかの他の種に由来するフラジェリンポリペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ種に由来する1〜40、1〜30、1〜20、1〜19、1〜18、1〜15、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、2〜50、2〜40、2〜30、2〜20、2〜15、2〜10、2〜5、6〜30、6〜15、16〜25、または31〜50種のフラジェリンポリペプチドを含み、場合により、いずれかの他の種に由来するフラジェリンポリペプチドを含まない。
本発明の組成物が2種以上のフラジェリンポリペプチドを含むいくつかの実施形態では、個々のフラジェリンポリペプチドは、別々の投与、同時投与、または連続的投与のためのものであってよい。例えば、本組成物がフラジェリンポリペプチドのすべてを含んでもよいし、またはフラジェリンポリペプチドが別々に保管され、別々に、同時に、もしくは連続的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、2種以上のフラジェリンポリペプチドは別々に保管されるが、使用前にひとつに混合される。
本発明に従って使用するための組成物は、販売承認を必要とする場合と必要としない場合がある。
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明で使用されるフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在する。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明で使用されるフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、乳癌である。好ましい実施形態では、がんは乳癌である。好ましい実施形態では、がんはステージIV乳癌である。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明で使用されるフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、肺癌である。好ましい実施形態では、がんは肺癌である。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明で使用されるフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、肝臓癌である。好ましい実施形態では、がんは肝細胞腫(肝細胞癌)である。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、結腸癌である。好ましい実施形態では、がんは結腸直腸腺癌である。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、癌腫である。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、非免疫原性癌である。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、免疫原性癌である。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮癌、腺癌、腺管腫瘍、カルチノイド腫瘍、未分化癌からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、ウイルス感染に起因する肝芽腫、胆管細胞癌、胆管細胞嚢胞腺癌、または肝臓癌からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、または浸潤性小葉癌からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼球内メラノーマ、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞性腫瘍、小児における視覚路及び視床下部のグリオーマ、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌、白血病、リンパ腫、中皮腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、咽頭癌、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍、前立腺癌、腎細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌からなる群から選択される。
核酸(例えば核酸ベースの治療薬)の用量は、100μg以下、例えば10〜100μg、例えば約10μg、25μg、50μg、75μg、または100μgの核酸を有し得るが、例えば1μg以下/用量、100ng以下/用量、10ng以下/用量、1ng以下/用量などを使用したはるかに低いレベルでも発現を見ることができる。同様に、タンパク質抗原の用量は、100μg以下、例えば10〜100μg、例えば約10μg、25μg、50μg、75μg、または100μgのタンパク質を有し得る。ポリペプチドは、約0.1〜10mg/kg体重の用量で投与されてもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、単回投与で、またはより好ましくは反復投与で投与することができる。好ましくは、反復投与は、約2、5、10、7、10、または15日毎に投与される。ある特定の実施形態において、本発明は、100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、または500mg/kg(対象の体重)の用量で投与される、上記の医薬組成物を提供する。好適な単位用量には、1mg、2mg、5mg、10mg、20mg、30mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1000mg、100〜500mg、500〜1000mg、200〜400mg、500〜750mg、750〜1000mgが含まれる。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の宿主細胞を含む、上記の医薬組成物を提供する。例えば成人の場合の宿主細胞の好適な一日用量は、約1×10〜約1×1011コロニー形成単位(CFU)、例えば、約1×10〜約1×1010CFU、別の例では約1×10〜約1×1010CFUであり得る。
ある特定の実施形態において、本組成物は、組成物の重量に対して約1×10〜約1×1011CFU/g、例えば、約1×10〜約1×1010CFU/gの量の宿主細胞を含む。用量は、例えば、1g、3g、5g、及び10gであり得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、生きた宿主細胞と死滅した宿主細胞との混合物を含む。
ある特定の実施形態において、本発明は、経口、直腸内、皮下、経鼻、頬側、舌下、皮下、静脈内、及び筋肉内からなる群から選択される方法で投与される、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、及びソルビトールからなる群から選択される担体を含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、エタノール、グリセロール、及び水からなる群から選択される希釈剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び塩化ナトリウムからなる群から選択される賦形剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、保存剤、抗酸化剤、及び安定剤のうちの少なくとも1つをさらに含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びp−ヒドロキシ安息香酸のエステルからなる群から選択される保存剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、上記の医薬組成物であって、約4℃または約25℃の密封容器に組成物を保管し、容器を相対湿度50%の雰囲気に置いた場合、少なくとも約1か月、3か月、6か月、1年、1.5年、2年、2.5年、または3年の期間が経過した後に、コロニー形成単位で測定した細菌株の少なくとも80%が残る、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載される組成物を含む密封容器で提供される。いくつかの実施形態では、密封容器は小袋またはボトルである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載される組成物を含むシリンジで提供される。
本発明の組成物は、いくつかの実施形態では、医薬製剤として提供されてもよい。例えば、本組成物は、錠剤またはカプセルとして提供され得る。いくつかの実施形態では、カプセルはゼラチンカプセル(「ゲルキャップ」)である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は経口投与される。経口投与は、化合物が消化管に入るような嚥下、及び/または化合物が口から直接的に血流に入る頬側、経舌、もしくは舌下投与を含み得る。
経口投与に好適な医薬製剤としては、固体プラグ、固体微粒子、半固体及び液体(多相または分散系を含む)、例えば錠剤、多粒子もしくはナノ粒子、液体(例えば水溶液)、エマルジョン、または粉末を含む軟カプセルまたは硬カプセル、ロゼンジ(液体充填型を含む)、咀嚼薬、ゲル、高速分散剤形、フィルム、オビュール(ovules)、スプレー、ならびに頬側/粘膜付着性パッチが挙げられる。
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、腸溶性製剤、すなわち本発明の組成物を経口投与によって腸に送達するのに好適な胃耐性製剤(例えば、胃のpHに耐性がある)である。腸溶性製剤は、細菌または組成物の別の成分が酸感受性である場合、例えば胃条件下で分解しやすい場合に特に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、腸溶性製剤は腸溶コーティングを含む。いくつかの実施形態では、製剤は腸溶コーティングされた剤形である。例えば、製剤は、腸溶コーティングされた錠剤または腸溶コーティングされたカプセルなどであり得る。腸溶コーティングは、従来の腸溶コーティング、例えば、経口送達用の錠剤、カプセルなどのための従来のコーティングであってよい。製剤は、フィルムコーティング、例えば、腸溶性ポリマー、例えば酸不溶性ポリマーの薄膜層を含み得る。
いくつかの実施形態では、腸溶性製剤は、腸溶コーティングを必要とせずに、本質的に腸溶性、例えば、胃耐性である。したがって、いくつかの実施形態では、製剤は、腸溶コーティングを含まない腸溶性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、熱ゲル化材料から作製されたカプセルである。いくつかの実施形態では、熱ゲル化材料は、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)などのセルロース材料である。いくつかの実施形態では、カプセルは、いかなるフィルム形成ポリマーも含まないシェルを含む。いくつかの実施形態では、カプセルはシェルを含み、シェルはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含み、いかなるフィルム形成ポリマーも含まない(例えば[106]を参照されたい)。いくつかの実施形態では、製剤は、本質的に腸溶性のカプセル(例えば、CapsugelのVcaps(登録商標))である。
いくつかの実施形態では、製剤は軟カプセルである。軟カプセルは、カプセルシェルに存在する、例えばグリセロール、ソルビトール、マルチトール、及びポリエチレングリコールなどの軟化剤の添加により、一定の弾性及び柔軟性を有し得るカプセルである。軟カプセルは、例えば、ゼラチンまたはデンプンに基づいて生成することができる。ゼラチンベースの軟カプセルは、様々な供給元から市販されている。例えば、経口または直腸内などの投与方法に応じて、軟カプセルは様々な形状を有することができ、例えば、円形、楕円形、長方形、または魚雷型であってよい。軟カプセルは、例えば、Schererプロセス、Accogelプロセス、または液滴もしくは発泡プロセスなどの従来のプロセスによって生成することができる。
概説
本発明の実践には、特記なき限り、当業者が備えている技能の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学、及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、参考文献[107]及び[108〜114]などを参照されたい。
「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」ならびに「からなる(consisting)」を包含する。例えば、X「を含む」組成物は、Xだけからなる場合もあれば、何らかの追加要素を含む、例えばX+Yである場合もある。
数値xに関する「約」という用語は任意であり、例えば、x±10%を意味する。
「実質的に」という用語は「完全に」を除外しない。例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という用語は本発明の定義から省略されてもよい。
「Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチド」という用語には、免疫刺激特性を呈する、例えばTLR5応答を効果的に活性化することができる、野生型フラジェリンポリペプチド及び変異型フラジェリンポリペプチドが包含される。「フラジェリンポリペプチド」という用語には、免疫刺激特性を呈する、例えばTLR5応答を効果的に活性化することができる、野生型フラジェリンポリペプチド及び変異型フラジェリンポリペプチドの断片も包含される。
2つのタンパク質配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アライメントしたとき、そのパーセンテージのアミノ酸残基が2つの配列の比較において同じであることを意味する。このアライメント及び相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献[115]に記載されているものを使用して決定することができる。好ましい方法は、タンパク質配列のMUSCLEアライメントを使用し、Geneious(78.02%のペアワイズ同一性)、Blossom62スコア行列、閾値=1を用いて行うことができる。
2つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アライメントしたとき、そのパーセンテージのヌクレオチドが2つの配列の比較において同じであることを意味する。このアライメント及び相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献[116]のセクション7.7.18に記載されているものを使用して決定することができる。好ましいアライメントは、ギャップオープンペナルティが12、ギャップ延長ペナルティが2、BLOSUM行列が62のアフィンギャップ検索を使用したSmith−Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定される。Smith−Waterman相同性検索アルゴリズムは、参考文献[117]に開示されている。
一般に、特に指定しない限り(例えば断片に関して)、配列同一性は、クエリ配列の長さではなく、参照配列(例えば配列番号1)の長さにわたって計算される。したがって、短くて無関係な配列は、本発明の配列に対して高い配列同一性を有するとは見なされない。
特に明記しない限り、多数のステップを含むプロセスまたは方法は、方法の最初もしくは最後に追加のステップを含んでもよいし、または途中に追加のステップを含んでもよい。また、必要に応じて、ステップを組み合わせたり、省略したり、または代替的な順序で行ったりしてもよい。
本明細書では、本発明の様々な実施形態を記載している。各実施形態で規定した特徴を他の規定の特徴と組み合わせて、さらなる実施形態をもたらすことができることは理解されよう。特に、本明細書で好適、典型的、または好ましいと強調された実施形態は、互いに組み合わせることができる(それらが相互排他的である場合を除く)。
実施例1−MRx0518によるTLR5レポーター細胞の活性化
要旨
この試験では、TLR5レポーター細胞を活性化する細菌株MRx0518の効力を調べた。
TLR5活性化アッセイ
HEK−Blue TLR5細胞は、ヒトTLR5遺伝子及び誘導性SEAP(分泌型胚性アルカリホスファターゼ)レポーター遺伝子をコトランスフェクトしたHEK293細胞である。SEAP遺伝子は、5つのNF−κB及びAP−1結合部位に融合したIFN−βミニマルプロモーターの制御下に置かれている。TLR5リガンドでの刺激によりNF−κB及びAP−1が活性化され、これによりSEAPの生成が誘導される。したがって、アルカリホスファターゼのレベルはTLR5活性に関連する。
・材料
レポーター細胞株:HEK−Blue hTLR5(Invivogen、hkb−htlr5)
細胞増殖培地:10%(v/v)のFBS(Sigma、F9665)、4mMのL−グルタミン(Sigma、G7513)、100U/mlのペニシリン及び100ug/mlのストレプトマイシン(Sigma、P4333)、100ug/mlのNormocin(Invivogen、ant−nr−1)、ならびに選択的抗生物質のブラストサイジン(30ug/ml、Invivogen、ant−bl−05)及びゼオシン(100ug/ml、Invivogen、ant−zn−1)を補充したDMEM(Sigma、D6171)
抗生物質不含培地:10%(v/v)のFBS及び4mMのL−グルタミンを補充したDMEM
・細菌の増殖条件
細菌の増殖条件:すべてのEnterococcus gallinarum MRx0518培養物は、酵母抽出物−カゼイン加水分解物−脂肪酸(YCFA)ブロス(E&O Laboratories,UK)において、嫌気条件下にて37℃で増殖させた。
定常期MRx0518細胞:菌株MRx0518の16〜18時間の培養物は、ワーキング細胞バンクとして−80℃で凍結保管したMRx0518細胞の1%接種材料を使用し、上述の条件下で増殖させた。
後期対数期MRx0518細胞:菌株MRx0518の3時間(約)の培養物は、定常期MRx0518細胞の10%接種材料を使用して、上述の条件下で増殖させた。
・手順
TLR5活性化アッセイは、10:1(3×10細菌)または100:1(3×10細菌)の2つの投与量で以下の処理を用いて行った:
− 生きたMRx0518細菌
− MRx0518加熱死菌
− MRx0518のCFS
陽性対照は、20ng/ml及び5ng/mlの濃度で超高純度FLA−STを用いて行った。陰性対照は、レポーター細胞以外によるアルカリホスファターゼの生成を制御するため、レポーター細胞を含まない抗生物質不含培地を用いて行った。YCFA及び水を用いて、2つのさらなる対照を行った。すべての処理について、3つの反復試験を行った。
・MRx0518の生菌及び無細胞上清(CFS)の調製
生菌処理物及びCFS処理物の両方を、後期対数期MRx0518細胞の培養物10mlから、細胞を室温で5000×gにて5分間遠心分離した後に調製した。細菌ペレットをPBS(Sigma、D8537)で1回洗浄し、1.4×10CFU/ml(2倍希釈)及び1.4×10CFU/ml(20倍希釈)の推定密度まで抗生物質不含培地に再懸濁した。細菌上清を収集し、無菌条件下で濾過し(0.22um)、HO(Sigma、W3500)を使用して10倍及び20倍に希釈して、上記に概説した細菌懸濁液の同等物を得た。CFSには、上清に脱落したMRx0518の鞭毛が含まれる。
・加熱死(HK)細胞の調製
後期対数期MRx0518細胞の培養物10mlを80℃で40分間インキュベートすることにより、HK細胞を別に生成した。遠心分離(上述の条件)に続いて、培養上清を廃棄し、細胞ペレットをPBS(Sigma、D8537)で1回洗浄し、1.4×10CFU/ml(2倍希釈)及び1.4×10CFU/ml(20倍希釈)の推定密度まで抗生物質不含培地に再懸濁した。調製したら、すべての処理物を使用まで氷上で保管した。すべての生細胞及び加熱死MRx0518細胞の調製物について、1ml当たりの生存細胞数を決定した。
・陽性対照の調製
TLR5の既知のアゴニストであるS.typhimuriumフラジェリン(超高純度、Invitrogenの超高純度FLA−ST、tlrl−epsitfla)を、HO中200ng/mlまたは50ng/mlで調製した。
・TLR5アッセイ条件
20μlの適切な処理物(細菌細胞、無細胞上清、陽性対照リガンド、組換えフラジェリン、陰性対照、例えばYCFA、抗生物質不含培地、HO、PBS)を、96ウェル細胞培養プレート(Sigma、CLS3596)に二連または三連で播種した。180μlのレポーター細胞懸濁液を各ウェルに加え、200ulの最終体積及びHEK−blue TLR5細胞3×10の最終濃度とした。アッセイは37℃、5%COで22時間インキュベートした。
インキュベーション後、新しい96ウェルプレートで20μlのアッセイを180μlのQuantiblue(Invivogen、rep−qb1)基質に加え、37℃、5%COで2時間インキュベートした。Quantiblueを含むプレートを、マイクロプレートリーダー(Bio−Rad、iMark)で、655nmの光学密度で測定して画像化した。技術的反復試験の結果を平均し、その後、独立した実験を平均して、最終的なグラフのデータを得た。
結論
生きたMRx0518及び熱失活したMRx0518による処理は、中等度及び高いレベルのTLR5応答をもたらした。これらのデータは、MRx0518菌株がTLR5応答を誘導できること、及びこの応答が熱失活によって消失しないことを示す。これらのデータは、Enterococcus属由来のフラジェリン、特にMRx0518フラジェリンがTLR5応答を誘発できること、及びこのフラジェリンに熱安定性があることを示唆している。
最も高いレベルのTLR5活性は、MRx0518−CFSによる処理後に観察され、既知のTLR5アゴニストであるFLA−STよりもさらに高かった(図6)。CFSには、上清に脱落したMRx0518の鞭毛が含まれる。これらのデータは、Enterococcus属由来、特にMRx0518由来のフラジェリンが非常に強力なTLR5応答を生成するため、治療において、特にがんの処置において有用であり得ることを示す。これらのデータはまた、MRx0518がそのフラジェリンを上清に脱落させるのに有効であることを示す。
実施例2−CFSによるTLR5活性化はMRx0518で特に強力である
要旨
この試験では、CFSを使用したTLR5活性化が菌株間で異なるかどうかを調べた。MRx0518及びDSM100110はいずれも有鞭毛性のEnterococcus gallinarum菌株である。これら両方の菌株のCFSがTLR5応答をもたらすかどうかを観察するために試験を行った。
TLR5活性化アッセイ
実施例1に記載したようなTLR5アッセイを行った。
・手順
TLR5活性化アッセイは、10:1及び100:1の2つの投与量で以下の処理を用いて行った:
− MRx0518−CFS
− DSM100110−CFS
抗生物質不含培地、YCFA、及び水を用い、3つの陰性対照を行った。陽性対照は、超高純度のFLA−STを20ng/mlの濃度で用いて行った。すべての処理について、3つの反復試験を行った。
結論
MRx0518−CFSは、高いTLR5応答を刺激することができた。DSM100110−CFSも、MRx0518−CFSと比べて低かったものの、100:1のMOIでTLR5応答を生成した。これらのデータは、両方の菌株の上清が免疫刺激応答を誘発したが、これは菌株によって異なることを示す。菌株MRx0518及びDSM100110はいずれも有鞭毛性のEnterococcus gallinarum菌株であるため、これらのデータは驚くべきものである。MRx0518−CFSがDSM100110−CFSと比較して高いTLR5応答を生成するのは、おそらく、MRx0518がそのフラジェリンを上清に脱落させる能力が他のEnterococcus gallinarum菌株と比較して向上しているからであると考えられ、このため、MRx0518は治療に特に有用であり得る。
これらのデータは、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドが、がん、特にTLR5に関連する乳癌、結腸直腸癌、及び胃癌などのがんの処置または防止に使用するために有効であり得ることを示唆している。
実施例3−トリプシン処理後のTLR5活性化
要旨
この試験では、TLR5のMRx0518−CFSによる活性化がトリプシン依存性であるかどうかを調べた。
TLR5活性化アッセイ
実施例1に記載したようなTLR5アッセイを行った。
・手順
TLR5活性化アッセイは、10:1及び100:1の2つの投与量で、以下の処理を単独またはトリプシンとの組み合わせで用いて行った:
− MRx0518−CFS
− DSM100110−CFS
− YCFA
すべての処理について、3つの反復試験を行った。
CFSを、500μg/mlのトリプシン(0.22umのフィルターにかけたもの、Sigma、T3924)により、または模擬消化対照として同等量のトリプシンビヒクル(ハンクス平衡塩類溶液、Fisher Scientific、1175129)により、37℃、5%CO2で1時間にわたって消化した。インキュベーション後、トリプシン活性を阻害するために、CFSの消化試料及び模擬消化試料にFBSを補充し、最終濃度を10%(v/v)とした。
抗生物質不含培地、HBSS、及び水を用い、3つの陰性対照を行った。陽性対照は、超高純度のFLA−STを20ng/mlの濃度で用いて行った。
結論
MRx0518−CFSによるTLR5の活性化は、トリプシンによる処理によって無効になった(図8)。これらのデータは、TLR5応答がMRx0518−CFS中のタンパク質によって活性化されることを示す。トリプシンでこれらのタンパク質を分解すると、TLR5応答が無効になる。MRx0518フラジェリンタンパク質(FlaAMRx0518)は36個のトリプシン切断部位を含み、そのうちのいくつかはTLR5相互作用ドメイン内に位置している。
実施例4−精製されたフラジェリンタンパク質によるTLR5活性化
要旨
この試験では、精製されたMRx0518及びDSM100110フラジェリンの刺激プロファイルを調べた。
組換えフラジェリンタンパク質の生成
クローニング戦略の概略は、図9aに示してある。制限酵素消化を使用し、MRx0518及びDSM100110フラジェリンの全長遺伝子を組換え発現構築物pQE−30(N末端6xHisタグを有する)にクローニングして、pQE−30−FlaAMRx0518及びpQE−30−FlaADSM100110構築物を生成した。当技術分野で周知のコロニーPCR、制限酵素消化、及びDNAシーケンシング技術を使用して、陽性コロニーを特定した。
組換えフラジェリンタンパク質であるFlaAMRx0518及びFlaADSM100110をE.coli細胞で発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー及びイミダゾール溶出を使用して精製した後、エンドトキシン除去を行った(以下の表を参照されたい)。これにより、エンドトキシンレベルが最低限に抑えられた高純度の調製物が得られる。タンパク質のサイズ及び純度は、SDS−PAGEゲルを使用して確認した(図9b)。
Figure 2021518129
精製された組換えFlaAMRx0518及びFlaADSM100110タンパク質に対する用量応答
実施例1に記載したようなTLR5アッセイを行った。
・手順
TLR5活性化アッセイは、以下の処理を用いて行った:
・5、1、0.2、0.04及び0.008ng/mlの濃度の組換え精製FlaAMRx0518
・5、1、0.2、0.04及び0.008ng/mlの濃度の組換え精製FlaADSM100110
陰性対照は、FLAビヒクルを5ng/mlの濃度で用いて行い、陽性対照は、超高純度のFLA−STを20ng/mlの濃度で用いて行った。各処理について、3つの反復試験を行った。
結論
組換えFlaAMRx0518及びFlaADSM100110はいずれも、TLR5応答を活性化することができる。図10は、実施例3及び4に記載した処理を用いた、組換えFlaAMRx0518及びFlaADSM100110の様々な投与量によるTLR5活性化を比較する。5ng/mlの濃度において、両方の組換えフラジェリンタンパク質が、より高い濃度(20ng/ml)で使用された周知のTLR5アゴニストFLA−STが生成するものよりも高いTLR5応答を生成することができる。これらのデータは、Enterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドがS.typhimuriumよりもTLR5応答を活性化するのに有効であることを示す。S.typhimuriumのフラジェリンポリペプチドは、TLR5活性化によって腫瘍成長を抑制することが知られている。したがって、これらのデータは、Enterococcus gallinarum由来のフラジェリンポリペプチドが、S.typhimurium由来のフラジェリンポリペプチドよりも、がんの処置または防止に有効であることを示唆している。
FlaAMRx0518及びFlaADSM100110は、異なる免疫刺激プロファイルを有する。1ng/ml及び0.2ng/mlの濃度において、FlaAMRx0518は、FlaADSM100110よりもおよそ5倍強力なTLR5応答を生成する。MRx0518とDSM100110とは、関連性の高い菌株である。いずれも有鞭毛性のEnterococcus gallinarum菌株であるが、異なる免疫刺激プロファイルを有する本質的に異なるフラジェリンを発現する。FlaAMRx0518が強力なTLR5活性化因子であるという驚くべき所見は、このフラジェリンポリペプチドが、がんの処置または防止に特に有効であることを示している。
これらの実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドがTLR5のアゴニストであることを示している。TLR5アゴニストは、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫の処置に関係付けられてきた。したがって、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドは、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫の処置または防止に特に有効であり得る。
TLR5の活性化は、放射線による組織損傷を改善することが示されている。実施例は、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドがTLR5応答の強力な活性化因子であることを示す。したがって、Enterococcus属、特にEnterococcus gallinarum種由来のフラジェリンポリペプチドは、放射線による組織損傷を改善するのに特に有効であり得る。
実施例5−MRx0518 flaA変異体の生成
要旨
MRx0518の挿入変異体を作出し、フラジェリン遺伝子を破壊した。
実験条件
flaAの内部断片をベクターpORI19(repA)にクローニングした。得られたベクターのflaAMRx0518int−pORI19をMRx0518に形質転換し、相同組換えを使用してインサートを細菌ゲノムに組み込んだ(図13参照)。
PCRを使用し、em遺伝子の存在について陽性コロニーをスクリーニングし、さらにシーケンシングを使用して確認した。運動性アッセイを使用した変異体の表現型分析でも、挿入変異体MRx0518flaAを確認した。インサートには、pORI19ベクターのエリスロマイシン耐性が含まれる。図11は、MRx0518flaA変異体が、野生型と比較して、20μg/mlのエリスロマイシンを補充したBBL運動性寒天において非運動性であることを示す。
実施例6−MRx0518変異体ではTLR5の活性化が消失する
要旨
MRx0518flaA変異体のCFSがTLR5応答を活性化する能力について調べた。
TLR5活性化アッセイ
実施例1に記載したようなTLR5アッセイを行った。
・手順
TLR5活性化アッセイは、10:1及び100:1の2つの投与量で以下の処理を用いて行った:
− MRx0518−CFS
− MRx0518flaA−CFS
陽性対照は、超高純度のFLA−STを5ng/ml及び20ng/mlの濃度で用いて行った。陰性対照は、10:1及び100:1の2つの投与量でYFCAを用いて行った。すべての処理について、3つの反復試験を行った。
結論
TLR5応答を刺激するMRx0518−CFSの能力は、MRx0518flaA変異体では消失した(図12)。これらのデータは、フラジェリンポリペプチドがMRx0518−CFSによるTLR5応答の活性化に不可欠であることを示す。
実施例7−MRx0518の特性評価
要旨
サイズ、フィンブリア/鞭毛/線毛の存在もしくは非存在、または細胞外マトリックスの存在といった細菌の形態学的特徴は、運動性と付着性の両方に影響を与えるため、細菌の特性評価において重要である。
従来の光学顕微鏡法で可能なものよりも高い解像度及び倍率において細菌構造を可視化できるようにするため、電子顕微鏡レベル(走査及び透過)でMRx0518培養物を検査した。
方法論
・透過型電子顕微鏡法
指数増殖期のMRx0518細菌培養物のアリコートを、嫌気性フードから密封したEppendorfに直接受けた。培養物を、作りたての氷冷2.5%グルタルアルデヒド、0.1Mカコジル酸ナトリウム、pH7.2で固定した。Eppendorfを数回穏やかに反転させた後、氷上に置き、3〜5分間放置して固定した。固定後、細菌を手短に遠心分離してペレット化し、milli純水中に再懸濁した。ガラスピペットを使用して、1滴の固定培養液をFormvarコーティングした300メッシュCuグリッドに適用した。細菌をおよそ1〜2分間にわたって沈殿及び吸着させ、Whatman No3濾紙を使用してグリッドから過剰な溶液を除去した。10μlの2%酢酸ウラニルをグリッドに数秒間適用し、上記の濾紙を使用して毛管作用により除去した。グリッドを完全に乾燥させてから、Philips CM100 TEMで様々なkVにおいて検査した。
・走査型電子顕微鏡法
上記と同じ培養物から、アリコートをSEM分析のために採取した。細菌は上記のように固定したが、ペレット化はしなかった。SPI PORE FILTER(直径25mm、孔径0.2um)を0.01%のポリリジンで前処理した直後に、Luer−Lokシリンジを使用して、固定された細菌をフィルター上に押し出した。その後、1mlのmilli純水をフィルターに穏やかに押し込んだ。フィルターは所定のサイズにカットし、一連のエタノール溶液(50%、70%、90%、及び3×100%)で脱水した。次にフィルターを漸増濃度のヘキサメチルジシラザン(エタノール中HMDS 25%、50%、75%)に連続的に浸し、最終的な脱水ステップは100% HMDSを使用して実施した。これを一晩蒸発させた。フィルターを臨界点乾燥させ、10nmのパラジウムゴールドでコーティングした後、Zeiss EVO MA10走査型電子顕微鏡で検査した。
結論
電子顕微鏡レベルにおける両方の可視化方法により、MRx0518に鞭毛があることが示された(図14)。TEM分析とSEM分析の両方で、MRx0518に鞭毛(白い実線の矢印)があることが示された。細胞サイズは1〜2μmの範囲であった。外膜小胞の存在は、MRx0518のSEM画像でのみ明らかであった。SEM画像は、外膜小胞のようなもの(白い破線の矢印)を示している。
実施例8−Enterococcus gallinarum菌株MRx0518及びDSM 100110由来の組換えフラジェリンタンパク質によるマウスTLR5の活性化
要旨
MRx0518はヒト試料から単離された細菌株であり、一方、DSM 100110はマウス由来である。Enterococcus gallinarum菌株のMRx0518及びDSM 100110に由来する組換えフラジェリンタンパク質がマウスTLR5を活性化する能力について調べた。
方法論
組換え精製MRx0518(FliCMRx0518)及びDSM 100110(FliCDSM100110)を実施例4に記載したように生成した。
実施例1に記載したようなTLR5アッセイを行った。TLR5活性化アッセイは、以下の処理を用いて行った:
−5、1、0.2、0.04及び0.008ng/mlの濃度の組換え精製FliCMRx0518
−5、1、0.2、0.04及び0.008ng/mlの濃度の組換え精製FliCDSM100110
3つの独立した反復試験を行った。
結論
FliCMRx0518及びFliCDSM100110の両方がマウスTLR5を活性化し、いずれの用量においてもFliCMRx0518とFliCDSM100110との間で活性化レベルに差はなかった(図15)。この効果は、FliCMRx0518及びFliCDSM100110によるヒトTLR5の活性化について観察された結果とは異なる。実施例4、図10に示すように、FliCMRx0518は、1ng/ml及びそれ以下の濃度において、FliCDSM100110よりも高いレベルまでヒトTLR5を刺激することができる。いずれかの特定の理論に束縛されるものではないが、異なるEnterococcus gallinarum菌株に由来する組換えフラジェリンタンパク質によるヒトTLR5及びマウスTLR5の活性化プロファイルの差は、FliCMRx0518とFliCDSM100110との間の配列の違い、ならびにヒトTLR5とマウスTLR5との間の結合部位のばらつきに起因する可能性がある。
図3に示すように、本発明者らは、異なるフラジェリンポリペプチド間の配列多様性の大部分がD2−D3領域で観察されることに気付いた。FliCMRx0518とFliCDSM100110との配列アライメントは、D2−D3ドメインにおいて大きな多様性を示す(図16)。アライメントは、CLUTAL OMEGA v1.2.4の複数配列アライメントソフトウェアを使用して行った。
実施例9−ヒト由来の運動性E.gallinarum及びE.casseliflavus菌株の免疫刺激能力
要旨
ヒト由来の運動性E.gallinarum及びE.casseliflavus菌株がインビトロでヒトTLR5を活性化する能力について評価した。
方法論
・試験した細菌株
Figure 2021518129
MRX及び試験菌株は、4D Pharmaの培養物コレクションにおける4つのドナー(ドナー番号F00、F14、F19及びF22)のうちの1つから単離した。
・TLR5アッセイ条件
細菌株は、定常増殖期に達するまでYCFAブロス(E&O Laboratories,Bonnybridge,Scotland,UK)で培養した。細胞及び上清を5,000×gで5分間の遠心分離によって分離した。上清を0.22μmフィルターに通し、水で希釈した。
10%のFBS、4mMのL−グルタミン、4.5mg/mlのグルコース、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、100μg/mlのNormocin(商標)(InvivoGen)、30μg/mlのブラストサイジン(InvivoGen)、及び100μg/mlのゼオシン(InvivoGen)を補充したDMEM中で、HEK−Blue(商標)−hTLR5細胞(InvivoGen,San Diego,CA,USA)を、密度90%までルーチン的に培養した。細胞株は37℃及び5%COで培養した。特に明記されていない限り、すべての試薬はSigma−Aldrich,Gillingham,England,UKから供給された。
共培養の場合、密度90%まで増殖させた細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)(Sigma−Aldrich)で1回洗浄し、抗生物質を含まない増殖培地中に140,000細胞/mlの密度で再懸濁した。上清を100:1相当の感染多重度(MOI)で細胞に加えた。アッセイ陽性対照であるSalmonella Typhimuriumフラジェリン(FLA−ST)(InvivoGen)は20ng/mlで使用した。細胞を上清とともに、5%CO雰囲気にて37℃で22時間インキュベートした。QUANTI−Blue(商標)(InvivoGen)を加え、プレートをさらに2時間インキュベートし、655nmでの光学密度を記録した。すべての菌株について、3つの独立した生物学的反復試験を実施した。
図18のデータは、3つの独立した反復試験を表す。
結論
試験したE.gallinarum及びE.casseliflavus菌株の上清はすべて、未処理の対照と比較してTLR5応答を強力に活性化することができた。試験した3つのE.casseliflavus菌株のうち、試験株6はTLR5応答を強力に活性化することが見出されたが、試験株5及びDSM25781は、さほど強力でないTLR5応答を誘発した。
実施例10−MRx518によるNF−κBの活性化
NF−κBを活性化する細菌株MRx0518の能力を調べた。結果を図18に提示する。MRx0518上清がNF−κBの最も強力な活性化因子であった。NF−κBの活性化は、トリプシンによる処理後に消失した。
これらのデータは、Enterococcus属由来、特にMRx0518由来のフラジェリンが非常に強力なNF−κB応答を生成するため、治療に有用であり得ることを示す。
実施例11−T細胞分化
T細胞分化を誘導するMRx0518の能力について、インビトロで末梢血単核細胞(PBMC、Stemcell、カタログ番号70025)を用いて調査した。
方法論
ウェル当たり50μlのcRPMI培地中、400,000/ウェルで、抗CD3(Ebioscience、CD3モノクローナル抗体(OKT3クローン)、機能的グレード、カタログ番号16−0037−81)を播種した96ウェルプレートに、PBMCを播種した(cRPMIは、RPMI 1640(+L−Glut、21875−034)2mM最終濃度ストック200mM、10%のHI FBS(Gibco life technologies、10082−147)、50μmのメルカプトエタノール(Gibco life technologies、21985−023)、及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン(P4333、10mg/ml)を含む)。次に、MRx518上清を、100μl中4,000,000/ウェルで各ウェルに加えた。上清を0.22μmフィルターに通し、共培養で適切に希釈した。
37℃のインキュベータに3日間入れた後、細胞を取り出し、PMA−(Sigma、カタログ番号P8139)、イオノマイシン(Sigma、カタログ番号I3909)、及びGolgiSTOP(BD、カタログ番号554724)を含む培地に5時間再懸濁した。PMAストックはDMSO中1mg/mlであり、これを100ug/mlにさらに希釈し(各試料でcRPMI中50ng/mlが必要であった)、イオノマイシンストックはDMSO中1mMであり(cRPMI中1μMを使用した)、GolgiStop濃度は4μl/6mlで使用した。
次に細胞をフローサイトメトリー染色に供した。
洗浄後、これらの細胞を、PBS中で、Miltenyi biotecのViobility 405/520 Fixable Dye(1μl/試料)とヒトFcブロック(カタログ番号564219)(1μl/試料)とともに、暗所で室温において10分間インキュベートした。次に、CD3−APC−Vio 770(Miltenyi、カタログ番号130−113−136)、CD4−VioBlue(Miltenyi、カタログ番号130−114−534)、及びCD25−VioBright FITC(Miltenyi、カタログ番号130−113−283)の表面抗体(各2μl)を、暗所で室温において、10分間にわたってウェルに直接加えた。次に細胞をPBSで2回洗浄し、300g/5分/室温でスピンダウンした。
次に、eBioscience FoxP3転写因子染色緩衝液(カタログ番号00−5523)を使用して、細胞の固定及び透過処理を行った。eBioscienceのプロトコールに従い、1倍濃縮液及び3倍希釈剤を使用して、透過処理/固定緩衝液を調製した。細胞を室温で1時間固定し、次に1倍の透過洗浄液で2回洗浄し、300g/5分/室温でスピンダウンした。以下の細胞内染色抗体または転写因子抗体を、透過洗浄液(1倍)中の試料に加え、45分/暗所/室温で、または冷蔵庫で一晩(最長18時間)おいた後、透過洗浄液(300μl)を使用して抗体を2回洗浄し、PBS(250μl)に再懸濁して、サイトメーターで取得した。
Figure 2021518129
・抗IFNy−PE Vio770ヒト抗体(Miltenyi、カタログ番号130−114−025)
・抗IL10−PEヒト抗体(Miltenyi、カタログ番号130−112−728)
・抗IL17a−APCヒト抗体(Miltenyi、カタログ番号130−099−202)
・抗RoRyt−PEヒト抗体(Miltenyi、カタログ番号130−103−837)
・抗Tbet−APCヒト抗体(Miltenyi、カタログ番号130−098−655
・Foxp3モノクローナル抗体(236A/E7)、Pe cy7(ebioscience)カタログ番号25−4777−41
結論
図19に見られるように、MRx518上清(SP518)は、Tヘルパー細胞及び細胞傷害性T細胞の分化を誘導することができる。
実施例12−E.gallinarum MRx0518フラジェリン遺伝子挿入変異体の生成
この実施例は、フラジェリン遺伝子を不活性化するための実施例5に対する代替戦略を提示する。fliC遺伝子は、自殺プラスミドpORI19の相同性挿入によって破壊された(図20参照)。fliC遺伝子内へのpORI19の挿入がDNAシーケンシングにより確認され、得られた変異型菌株の非運動性表現型がインビトロで確認された。
方法論
非複製的プラスミドpORI19(Emr repA−Ori+;クローニングベクター[118])を使用し、フラジェリン挿入変異体を作出した。プライマーDC020(配列番号43:CCCGGGGGATCCGCGGTAAATGTTGCTAAAGCATCATCG)及びDC021(配列番号44:ACGACGGTCGACCCACAGCATCTTAGGGCGTATGCG)を使用して、E.gallinarum MRx0518fliC遺伝子の内部断片を増幅し、pORI19にクローニングした。メーカーの説明に従って、制限酵素及びQuick Ligase(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)を使用した。この構築物を化学的形質転換[118]によりE.coli EC101において増殖させ、Genopure Plasmid Maxi Kit(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)を使用して500mlの培養液から単離した。0.3M酢酸ナトリウムpH5.2及びエタノールを使用し、単離したプラスミドDNAを20μlまで濃縮した。
阻害濃度以下のグリシン中で細菌培養物を増殖させた後、ムタノリジン(mutanolysin)及びリゾチームで処理して細胞壁のペプチドグリカン層をさらに弱めることにより、エレクトロコンピテント細胞を生成することに成功した。E.gallinarum MRx0518エレクトロコンピテント細胞を調製するために、以前に公開された方法[119]を応用したプロトコールを開発した。簡潔に述べると、0.5Mのスクロース及び3%(w/v)のグリシン(Sigma−Aldrich)を補充したGM17ブロス中で18時間にわたり、E.gallinarum MRx0518を増殖させた。次に、細胞を0.5Mのスクロース及び10%(v/v)のグリセロールで2回洗浄し、37℃で30分にわたり、10μg/mlのリゾチーム及び10U/mlのムタノリジン(Sigma−Aldrich)で処理した。次に、E.gallinarum MRx0518細胞を10μgのプラスミドDNAの電気穿孔によって形質転換し、BHIブロスに回収した後、選択的BHI寒天に播種した。プライマーDC047(配列番号45:CCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAACGAG)及びDC048(配列番号46:GATGCAGTTTATGCATCCCTTAAC)を使用し、em遺伝子の存在について陽性コロニーをスクリーニングした。プラスミド挿入の成功した形質転換体は、プライマーDC013(配列番号47:CCGATAAATAGTAGCAGAGGGAAACC)及びDC014(配列番号48:GGCTGAATATCCATCAGAGCTTCCTC)を使用したPCR増幅及びシーケンシング(GATC Biotech,Konstanz,Germany)によって確認した。
0.005%(w/v)の2,3,5−トリフェニルテトラゾリウムクロライド(BD,Sparks,MD,USA)を補充したBBL(商標)運動性試験培地を使用し、フラジェリン挿入変異体のインビトロでの運動性を評価した。簡潔に述べると、新鮮なコロニーを20mlの平衡培地に穿刺接種し、嫌気条件下にて37℃で48時間インキュベートした。すべてのアッセイを三連で行った。
配列
配列番号1−Enterococcus gallinarum MRx0518由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号2−Enterococcus gallinarum DSM100110由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号3−Enterococcus gallinarum MRx0554由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号4−Enterococcus gallinarum MRx0556由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号5−Enterococcus gallinarum MRx1548由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号6−Enterococcus gallinarum MRx1650由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号7−Enterococcus gallinarum MRx1763由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号8−Enterococcus gallinarum MRx1766由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号9−Enterococcus gallinarum MRx1775由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号10−Enterococcus gallinarum MRx1886由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号11−Enterococcus gallinarum 2A8由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号12−Enterococcus gallinarum 9402由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号13−Enterococcus gallinarum A6981由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号14−Enterococcus gallinarum MRx1649由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号15−Enterococcus gallinarum EG2由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号16−Enterococcus gallinarum SKF1由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号17−Enterococcus casseliflavus DSM 7370由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号18−Enterococcus casseliflavus 1a6A由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号19−Enterococcus casseliflavus 3h10B由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号20−Enterococcus casseliflavus 14−MB−W−14由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号21−Enterococcus casseliflavus ATCC12755由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号22−Enterococcus casseliflavus DSM4841由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号23−Enterococcus casseliflavus DSM20680由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号24−Enterococcus casseliflavus EC10由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号25−Enterococcus casseliflavus EC20由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号26−Enterococcus casseliflavus EC30由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号27−Enterococcus casseliflavus F1129由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号28−Enterococcus casseliflavus F1129F 46由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号29−Enterococcus casseliflavus NBRC 100478由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号30−Enterococcus casseliflavus PAVET15由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号31−Enterococcus casseliflavus NLAE−zl−G268由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号32−Enterococcus casseliflavus NLAE−zl−C414由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号33−Enterococcus gallinarum FDAARGOS−163由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号34−Enterococcus casseliflavus MRx0858由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号35−Enterococcus casseliflavus DSM25781由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号36−Enterococcus gallinarum DSM28564由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号37−Enterococcus gallinarum DSM28565由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号38−Enterococcus gallinarum F1213F 228由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号39−Enterococcus gallinarum DSM20718由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号40−Enterococcus gallinarum DSM20628由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号41−Enterococcus gallinarum NBRC100675由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号42−Enterococcus gallinarum DSM24841由来のフラジェリンポリペプチド
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Claims (51)

  1. 治療に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチド。
  2. 前記フラジェリンポリペプチドがEnterococcus gallinarum種に由来する、請求項1に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  3. 前記フラジェリンポリペプチドが、受託番号NCIMB 42488でNCIMBに寄託された菌株に由来する、請求項1または請求項2に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  4. 前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号1と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  5. 前記フラジェリンポリペプチドが配列番号1を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  6. 前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号2と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  7. 前記フラジェリンポリペプチドが配列番号2を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  8. 前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号3〜42のうちの1つと少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  9. 前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号3〜16のうちの1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%の配列同一性をもつ配列を有する、請求項8に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  10. 前記フラジェリンポリペプチドが、D3ドメインを含まない、請求項1〜9のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  11. 前記フラジェリンポリペプチドが単量体型である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  12. 前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号1の残基87〜96及び290〜295と少なくとも99%、99.5%、または99.9%同一であるTLR5認識部位を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  13. 前記フラジェリンポリペプチドが細菌鞭毛アセンブリの一部である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  14. 治療に使用するためのフラジェリンポリペプチドの断片であって、前記フラジェリンポリペプチドが、請求項1〜12のいずれか1項に従って定義され、前記断片が、少なくとも7、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、または350アミノ酸長である、前記断片。
  15. 前記断片が、配列番号1と少なくとも85%の配列同一性を有し、及び/または(ii)配列番号1のうちの少なくとも7個の連続したアミノ酸の断片を含む、請求項14に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチドの断片。
  16. 病原体抗原または腫瘍抗原などの抗原にコンジュゲートした、請求項1〜15のいずれか1項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
  17. 治療に使用するためのフラジェリンポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、前記フラジェリンポリペプチドが、請求項1〜15のいずれか1項に従って定義される、前記融合ポリペプチド。
  18. 病原体抗原または腫瘍抗原などの抗原を含む、請求項17に記載の融合ポリペプチド。
  19. 配列番号1のアミノ酸2〜32、87〜96、165〜272、234〜358、290〜295の区間のうちの1もしくは1または2以上を含むか、あるいは前記断片のうちの1つと少なくとも90%、92%、95%、98%、または99%の配列同一性をもつ配列を含む、ポリペプチド。
  20. 前記ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸165〜272の配列と90%、92%、95%、98%、または99%の配列同一性を含む、請求項19に記載のポリペプチド。
  21. 前記ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸87〜96、165〜272、及び290〜295の配列と90%、92%、95%、98%、または99%の配列同一性を含む、請求項19に記載のポリペプチド。
  22. 免疫刺激領域をさらに含む、請求項19〜21のいずれか1項に記載のポリペプチド。
  23. 前記免疫刺激領域が、TLR4またはTLR5活性化領域である、請求項22に記載のポリペプチド。
  24. 前記ポリペプチドがフラジェリンポリペプチドである、請求項19〜23のいずれか1項に記載のポリペプチド。
  25. 前記ポリペプチドが細菌鞭毛アセンブリの一部である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の使用のためのポリペプチド。
  26. 前記ポリペプチドがフラジェリンポリペプチドである、請求項25に記載のポリペプチド。
  27. 前記ポリペプチドが、1または2以上の抗原をさらに含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の使用のためのポリペプチド。
  28. 治療に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
  29. 前記フラジェリンポリペプチドが、請求項2〜27のいずれか1項に従って定義される、請求項28に記載の使用のためのポリヌクレオチド配列。
  30. 前記コードされるポリペプチド配列が、配列番号1と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくは99.9%の配列同一性を有するか、または配列番号1である、請求項29に記載の使用のためのポリヌクレオチド配列。
  31. 治療に使用するための、Enterococcus属由来の組換えフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞。
  32. 治療に使用するための、Enterococcus属由来のフラジェリンポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
  33. 前記フラジェリンポリペプチドが、請求項2〜27のいずれか1項に従って定義される、請求項31または32に記載の使用のための宿主細胞。
  34. 請求項28〜30のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターまたはプラスミド。
  35. 請求項34に記載のベクターまたはプラスミドを含む宿主細胞。
  36. 病原体抗原または腫瘍抗原などの異種抗原をさらに発現する、請求項35に記載の宿主細胞。
  37. 治療に使用するための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のフラジェリンポリペプチド、請求項14または請求項15に記載のフラジェリンポリペプチドの断片、請求項17または18に記載の融合ポリペプチド、請求項19〜27のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項27〜29のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項31〜33及び35のいずれか1項に記載の宿主細胞、または請求項34に記載のベクターを含む、組成物。
  38. がんを処置または防止する方法において使用するための、請求項37に記載の使用のための組成物。
  39. 前記組成物が、免疫原性腫瘍の処置に使用するためのものである、請求項38に記載の使用のための組成物。
  40. 前記組成物が、肺癌、乳癌、肝臓癌、または結腸癌を処置または防止する方法において使用するためのものである、請求項38または39に記載の使用のための組成物。
  41. 前記組成物が、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、転移の防止、または血管新生の防止の方法において使用するためのものである、請求項37〜40のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
  42. 対象の免疫系を刺激するのに使用するための、請求項37に記載の使用のための組成物。
  43. 免疫老化の処置、防止、または遅延に使用するための、請求項37に記載の使用のための組成物。
  44. ワクチンアジュバントとして使用するための、請求項37に記載の使用のための組成物。
  45. CAR−Tなどの細胞療法を増強するのに使用するための、請求項37に記載の使用のための組成物。
  46. 前記組成物が、NF−κBのレベル及び/または活性を上昇させる、請求項37〜44のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
  47. 前記組成物が経口投与用である、請求項37〜46のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
  48. 前記組成物が、1または2以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、請求項37〜46のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
  49. Enterococcus属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患を処置する方法。
  50. Enterococcus属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを処置または防止する方法。
  51. Enterococcus属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、免疫刺激の低減に関連する疾患または状態を処置または防止する方法。
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