KR20200134255A - 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 박테리아 균주로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 질환의 치료에서 이러한 조성물의 용도를 제공한다.

Description

조성물
본 발명은 박테리아 균주로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 질환의 치료에서의 이러한 조성물의 용도 분야에 대한 것이다.
인간 내장은 자궁내에서는 멸균상태인 것으로 여겨지지만, 출생 직후 매우 다양한 모체 및 환경 미생물에 노출된다. 이후, 미생물 집락 및 갱신의 동적 기간이 진행되며, 이는 출산 방식, 환경, 식이 및 숙주 유전형과 같은 요인에 의해 영향받고, 이들 모두가 장 미생물총의 조성에, 특히 초기 수명 동안 영향을 미친다. 이후, 미생물총이 안정화되고 성인과 유사해진다[1]. 인간 장 미생물총은 본질적으로 2개의 주요 박테리아 문에 속하는 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 퍼미쿠테스(Firmicutes)에 속하는 500~1000개를 초과하는 상이한 계통형을 포함한다[2]. 인간 장의 박테리아 집락으로부터 발생하는 성공적인 공생 관계는 매우 다양한 대사, 구조, 보호 및 다른 유익한 기능을 산출하였다. 집락화된 장의 증강된 대사 활성은 다른 경우 소화 불가능한 식이 성분이 부산물을 방출하며 분해되어 숙주에 대해 중요한 영양원을 제공할 것을 보장한다. 유사하게, 장 미생물총의 면역학적 중요성은 잘 인식되어 있으며 공생 박테리아의 도입 후 기능적으로 재구성되는 손상된 면역계를 갖는 무균 동물에서 예시된다[3~5].
미생물 집락 자체에 의해 영향받는[6~7] 분비성 내장 IgA의 생산과 뚜렷이 대비되어, T 세포 발생 및 분화는 특정 공생 미생물에 의한 집락을 필요로 하는 것으로 보인다. 클로스트리듐 종, 특히 포자-형성 절편화 필라멘트성 박테리아(SFB)는 내장 및 결장 Th1, Th17 및 Treg의 분화 및 성숙을 위한 강력한 자극인 것으로 나타난다[8~9]. 보다 최근 연구에서는 클로스트리듐 클러스터 IV 및 XIVa 그리고 변경된 섀들러 총(Altered Schaedler Flora, ASF)을 포함하는 다른 장 박테리아가 Treg의 새로운 생성을 유도할 수 있는 반면, 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)의 단독 집락은 Treg의 증식 촉진에 의해 무균 마우스에서 Th1/Th2 불균형을 교정할 수 있음을 실증하였다[5][10~11]. 이들 데이터는 다른 체류 장 박테리아의 중요한 면역-조절 효과를 추론한다. 명확하게, T 세포 분화 경로 상에서 공생 박테리아의 효과는 가변적이며 이전에 가정된 바와 같이 특정 박테리아와 연관된 것으로 확인된 TLR 리간드 어레이에 의해 영향받을 수 있다[12]. 예를 들어, SFB가 T 세포 반응에 영향을 미치는 기전은 정확히 알려져 있지 않지만, 플라겔린 유전자의 존재를 확인한 최근 게놈 연구는 TLR5-플라겔린 상호작용을 통해 매개되는 선천성 반응이 역할을 담당할 수 있음을 제시한다[13~14].
플라겔린은 박테리아 편모의 기본 성분 중 하나이다. 편모는 박테리아에 운동성을 제공하고 감각 기관으로 작용할 수 있는, 속눈썹과 유사한 부속물이다. 박테리아 플라겔린의 구조 및 조성은 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 및 대장균(E. coli)과 같은 모델 유기체에서 철저히 연구되었다. 살모넬라 타이피무리움 및 대장균의 플라겔린은 TLR5 수용체를 통해 면역계를 활성화하며, 이는 다양한 전염증성 및 면역 반응 유전자의 활성화를 야기한다[15]. 살모넬라 타이피무리움 플라겔린과 같은 TLR5 작용제가 항암제로 작용할 수 있음이 제시되었다[16]. 비브리오 불니피피쿠스(Vibrio vulnifificus) 플라겔린을 발현하도록 조작된 살모넬라 타이피무리움도 항암제로 작용하는 것으로 제안되었다[17]. 또한, 살모넬라 타이피무리움, 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 및 시겔라 다이센테리애(Shigella dysenteriae)로부터의 플라겔린 펩타이드는 유전적으로 변형된 내장 박테리아에 의해 발현되는 경우, 장티푸스, 콜레라 및 이질과 같은 감염성 질환에 대한 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있음이 제시되었다[18]. 그러나, 다른 박테리아 종으로부터의 플라겔린은 잘 특성규명되지 않은 채 남아있고 이러한 다른 플라겔린은 상이한 효과 또는 용도를 가질 수 있다.
염증성 대장 질환(IBD)과 같은 위장관 장애에서 미생물총 조성의 극적인 변화가 보고되었다. 예를 들어, IBD 환자에서는 클로스트리듐 클러스터 XIVa 박테리아의 수준이 감소되는 반면, 대장균의 수가 증가되어, 장 내 공생체 및 유해균 균형의 이동을 제시한다[19~22]. 흥미롭게도, 이러한 미생물 세균조성이상은 또한 T 효과기 세포 집단의 불균형과 연관된다.
특정 박테리아 균주가 동물 장에 대해 가질 수 있는 잠재적인 긍정적 효과를 인식하여, 다양한 균주가 다양한 질환의 치료에서의 사용하기 위해 제안되었다(예를 들어, [23~26] 참고). 또한, 대부분 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 균주를 포함하는 특정 균주가 내장과 직접 연관되지 않은 다양한 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서 사용하기 위해 제안되었다(리뷰를 위해 [27] 및 [28] 참고). 그러나, 상이한 질환 및 상이한 박테리아 균주 간 상관관계, 그리고 장에 대한 및 전신 수준에서의 그리고 임의의 특정 유형의 질환에 대한 특정 박테리아 균주의 정확한 효과는 잘 특성규명되어 있지 않다. 예를 들어, 특정 엔테로코커스(Enterococcus)종은 암 유도에 시사되었다[29].
특정 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 베일로넬라(Veillonella) 균주, 그리고 더 적은 정도로, 엔테로코커스 및 박토바실러스 균주가 시험관내에서 상이한 사이토카인에 대해 다양한 효과를 가지며, 면역조절 효과를 갖는 것으로 제시되었다. 그러나, 상이한 질환 및 상이한 박테리아 균주 간 상관관계, 및 장에 대한 및 전신 수준에서의 그리고 임의의 특정 유형의 질환에 대한 특정 박테리아 균주의 정확한 효과는 잘 특성규명되어 있지 않다.
새로운 질환 치료 방법에 대한 필요성이 당분야에 존재한다. 또한 새로운 치료법이 개발될 수 있도록 장 박테리아의 잠재적 효과가 특성규명될 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명자들은 질환을 치료하고 예방하기 위한 새로운 치료법을 개발하였다. 특히, 본 발명자들은 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 치료법에서 유용함을 확인하였다. 실시예에서 실증된 바와 같이, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 널리 알려진 TLR5 작용제 살모넬라 타이피무리움 플라겔린에 비해 유의미하게 더 높은 수준으로 TLR5 반응을 강력히 활성화할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 치료법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum) 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 추가 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 NCIMB에 기탁된 균주로부터 유래된다. 바람직한 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 서열 번호 1이다. 실시예는 균주 MRx0518(기탁 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 균주)로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 다른 엔테로코커스 갈리나룸 균주로부터의 플라겔린 폴리펩타이드에 비해 TLR5 반응을 더 강력히 활성화할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 균주 NCIMB 42488로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 치료법에서 사용하기 위해 특히 효과적이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 단량체 형태이며, 이는 폴리펩타이드가 TLR5 수용체와 보다 효과적으로 결합할 수 있도록 한다.
실시예는 균주 NCIMB 42488로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 TLR5 반응을 활성화하는 데 특히 효과적임을 나타낸다. 균주 NCIMB 42488로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 D3 도메인을 함유하지 않을 수 있고 본 발명자들은 상이한 플라겔린 폴리펩타이드 간 대부분의 서열 변이가 D2~D3 영역에서 관찰됨을 주지하였다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 D3 도메인을 함유하지 않는 엔테로코커스 속 또는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 박테리아 편모 어셈블리의 일부이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 박테리아 편모 어셈블리를 제공한다. 바람직한 구현예에서 박테리아 편모 어셈블리는 단백질 FliL 및 FlaG를 함유한다. FliL 및 FlaG 단백질은 MRx0518의 박테리아 편모 어셈블리에 존재한다. 실시예는 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 TLR5 반응을 활성화하는 데 특히 효과적임을 나타낸다.
본 발명은 또한 치료법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 치료법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩한다. 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 치료법에서 사용하기 위한 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 치료법에서 사용하기 위한, 엔테로코커스 속으로부터의 재조합 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 치료법에서 사용하기 위한, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 또한 제공하며, 여기서 숙주 세포는 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
살모넬라 타이피무리움 플라겔린에 의한 TLR5의 활성화는 세포 증식 및 종양 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다[48]. 엔테로코커스 갈리나룸 균주를 포함하는 조성물은 암을 치료하고 예방하는 데 효과적이다[50]. 본 발명자들은 놀랍게도 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 반응을 자극할 수 있음을 나타내고, 이는 엔테로코커스 균주의 항암 활성에 기여할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 엔테로코커스 속, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 재조합 플라겔린 폴리펩타이드가 치료법에서 유용하며 특히 암을 치료하고 예방하는 데 효과적임을 나타내었다.
바람직한 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 면역원성 종양 및/또는 고형 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 재조합 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 폐암, 유방암, 간암 또는 결장암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 엔테로코커스 속으로부터의 재조합 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 특히 암 치료에서 종양 크기를 감소시키거나 종양 성장을 예방하는 데 효과적일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 주사에 의해, 바람직하게는 피하 또는 대안적으로 정맥내, 또는 복강내 투여된다.
특정 구현예에서, 예를 들어 조성물이 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 경우, 본 발명의 조성물은 경구 투여를 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
또한, 본 발명은 엔테로코커스 속 박테리아 균주로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 엔테로코커스 속 박테리아 균주로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 면역계를 자극하고 질환을 치료하고 예방하는 데 사용될 수 있는, 엔테로코커스 속으로부터의, 바람직하게는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 새로운 조성물을 개발하였다. 본 발명자들은 이러한 조성물이 면역계를 강력히 활성화할 수 있고 암을 치료할 수 있음을 확인하였고, 이는 이들이 면역계의 활성화가 유용할 수 있는 다른 질환을 또한 치료할 수 있음을 시사한다.
따라서 본 발명은 대상체에서 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 면역 노화를 치료하거나, 예방하거나, 지연하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 백신 아주반트로 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 CAR-T와 같은 세포 치료법을 증강시키는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
도 1: 플라겔린의 구조 및 편모 필라멘트의 단면도 및 상면도. 편모 필라멘트는 단일 단백질 플라겔린으로 이루어진다. TLR5 인식 영역은 D1 도메인에 있고 플라겔린이 편모 필라멘트에서 중합되면 접근 불가능하다. 이미지는 참고문헌[30]의 것이다.
도 2: 엔테로코커스 갈리나룸 종 및 모델 유기체 살모넬라 타이피무리움으로부터의 24개의 플라겔린 폴리펩타이드의 단백질 서열 정렬. 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드에 대한 D0, D1 및 D2 도메인 및 예측된 TLR5 결합 부위는 강조표시된다.
도 3: 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드와 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 23개의 플라겔린 폴리펩타이드의 단백질 서열 정렬. 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드에 대한 D0, D1 및 D2 도메인 및 예측된 TLR5 결합 부위는 강조표시된다.
도 4: 편모 어셈블리의 KEGG 경로 다이어그램. 회색으로 강조표시된 유전자가 종에 존재한다.
도 5: 예측된 MRx0518 플라겔린(FliCMRx0518) 단백질 구조와 알려진 살모넬라 타이피무리움 플라겔린 단백질 구조의 비교. 살모넬라 타이피무리움 플라겔린 단백질 구조는 참고문헌[30]의 것이다.
도 6: TLR5 리포터 세포의 MRx0518 활성화.
도 7: TLR5 리포터 세포의 균주 특이적 활성화.
도 8: 트립신-처리 후 MRx0518 및 DSM100110로부터의 CFS의 TLR5 반응.
도 9: a) 대장균에서 재조합 플라겔린 단백질의 제조를 위한 클로닝 전략; b) SDS-PAGE 겔 상에서 정제된 재조합 플라겔린 단백질, FlaAMRx0518 및 FlaADSM100110의 품질 평가.
도 10: FlaAMRx0518, FlaADSM100110 그리고 MRx0518 및 DSM100110으로부터의 CFS를 이용한 TLR5 활성화 비교.
도 11: MRx0518 flaA - 돌연변이체의 표현형 특성규명.
도 12: MRx0518 flaA - 돌연변이체 CFS를 이용한 TLR5 활성화.
도 13: flaA 돌연변이 전략.
도 14: MRx0518의 전자 현미경 측정.
도 15: MRx0518 및 DSM 100110으로부터의 재조합 플라겔린 단백질에 의한 쥣과 TLR5의 활성화. 데이터는 3개의 독립적 반복물을 대표한다.
도 16: CLUTAL OMEGA v2.1 다중 서열 정렬 소프트웨어를 사용하여 수행된 MRx0518 및 DSM 100110으로부터의 플라겔린 단백질의 서열 정렬.
도 17: 운동성 엔테로코커스 갈리나룸 및 엔테로코커스 카셀리플라부스(E. casseliflavus) 균주에 의한 인간 TLR5의 활성화. 데이터는 3개의 생물학적 반복물의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 유의성은 원-웨이 ANOVA 테스트에 의해 평가하였다 - "a"는 p < 0.0001을 표시한다.
도 18: MRx0518에 의한 NF-κB의 활성화.
도 19: 사이토카인의 첨가 없이(no cyto) MRx518로부터의 상청액 및 대조군으로 RPMI 배지를 사용한 (A) T-헬퍼 세포 및 (B) 세포독성 T 림프구(CTL) 집단에서의 T-세포 분화 유도.
도 20: 대안적인 flaA 돌연변이 전략.
플라겔린
박테리아 편모의 주성분인 플라겔린은 포유류, 곤충, 및 식물을 포함하는 다양한 유기체에서 숙주 방어를 자극한다. 박테리아 플라겔린의 구조 및 조성은 살모넬라 타이피무리움 및 대장균과 같은 모델 유기체에서 철저히 연구되었다. 그러나, 엔테로코커스 속, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린을 설명하는 이용 가능한 데이터는 매우 제한되어 있다.
플라겔린은 단량체 단백질로 존재할 수 있거나 중합되어 편모 필라멘트를 형성할 수 있다. 살모넬라에서의 박테리아 편모 필라멘트는 대략 20,000개의 플라겔린 단백질 단위로 이루어진다. 편모 필라멘트는 완전 어셈블리된 박테리아 편모의 일부를 형성한다.
플라겔린 단백질은 일반적으로 3~4개 도메인(D0, D1, D2 및 D3)을 함유하며, D0 및 D1 도메인은 N- 및 C-말단으로부터의 폴드로 구성된다[31]. 편모 필라멘트 어셈블리 동안, D0 및 D1 도메인은 편모 필라멘트 내에 묻히고 D2 및/또는 D3 도메인이 밖을 향한다(도 1).
보존된 도메인 D1 내의 아미노산 모티프가 TLR5 인식 및 상호작용을 위해 요구되는 것으로 나타났다[32~33]. D0 도메인은 또한 TLR5 신호전달에 영향을 미치는 것으로 나타났다[34]. TLR5 인식 부위는 일반적으로 편모 필라멘트에서 접근 불가능하다. 필라멘트로 조립된 경우 TLR5 결합 부위가 접근 불가능하므로, 플라겔린은 그 단량체 형태로 TLR5와 더 효과적으로 상호작용한다[30]. 플라겔린 단백질의 중심 영역은 서열 가변성을 나타내며 널리 연구되지 않았으나 단백질의 항원성 및 면역원성 영역인 것으로 여겨진다.
D0 및 D1 도메인은 고도로 보존된 반면, D2 및 D3 도메인은 보다 가변적이다[35]. 도 2는 엔테로코커스 속 플라겔린 단백질과 널리 연구된 살모넬라 타이피무리움으로부터의 편모 단백질의 서열 정렬이다. 살모넬라 타이피무리움으로부터의 플라겔린 단백질 및 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 단백질 간 대부분의 서열 변이는 중심 영역(D2~D3 도메인) 내에 있다. 상이한 엔테로코커스 갈리나룸 균주 간, 예를 들어 균주 MRx0518 및 DSM100110으로부터의 플라겔린 단백질 간 대부분의 서열 변이도 상기 영역에서 관찰된다(도 3).
편모 필라멘트는 박테리아 편모의 성분이다. 박테리아 편모 어셈블리에 관여되는 것으로 알려진 유전자를 도 4에 요약한다. 회색으로 음영처리된 것들은 엔테로코커스 갈리나룸에 존재한다. 플라겔린 단백질은 FliC에 의해 인코딩되며, 이는 또한 FlaA로 본원에서 상호 교환적으로 언급된다.
본 발명은 치료법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 치료법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 치료법에서 사용하기 위한 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 반응을 활성화할 수 있음을 실증하며, 이는 플라겔린 폴리펩타이드가 치료법에서 유용할 수 있고, 특히 암을 치료하는 데 유용할 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 반응을 유도할 수 있음을 실증하며, 이는 암을 치료하고 예방하는 데 유용하다. 특히, 실시예는 엔테로코커스 갈리나룸 종, 특히 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 매우 높은 TLR5 반응을 생성함을 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 치료법에서, 특히 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한, 엔테로코커스 갈리나룸 종 또는 엔테로코커스 카셀리플라부스 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 엔테로코커스 카셀리플라부스 종으로부터 유래된다. 가장 바람직한 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터 유래된다.
균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 실시예에서 평가되었다. MRx0518은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 박테리아 균주이다. 균주 MRx0518은 "엔테로코커스 종"으로 2015년 11월 16일에 4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 국제 기탁 당국 NCIMB, Ltd.(Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고 접근 번호 NCIMB 42488을 수여받았다.
특정 구현예에서, 본 발명은 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드, 및 치료법에서, 특히 암을 치료하거나 예방하는 데 있어서 이러한 폴리펩타이드의 용도를 제공한다. 실시예는 이러한 플라겔린 폴리펩타이드가 특히 효과적임을 나타낸다. 특히, 본 발명은 서열 번호 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 서열 번호 1을 포함하거나 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 서열 번호 2와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 서열 번호 2를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 실시예는 또한 이러한 폴리펩타이드가 유용함을 실증한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 3~42 중 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 서열 번호 3~16 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터 유래된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 플라겔린은, 예를 들어 적어도 10-2, 적어도 10-3, 적어도 10-4, 적어도 10-5, 적어도 10-6, 적어도 10-7, 적어도 10-8, 적어도 10-9, 적어도 10-10, 또는 적어도 10-11의 KD 값으로, TLR5에 결합한다. TLR5에 대한 결합은 전기화학적 임피던스 분광측정(EIS), 주사 전기화학적 현미경측정(SECM)[36], 또는 재조합 TLR5 단백질을 사용하는 원상태 PAGE 및 겔-여과 크로마토그래피[37]를 포함하는, 당분야에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 4개 도메인, D0, D1, D2 및 D3을 함유할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 D3 도메인을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 3개 도메인, D0, D1, D2로 구성된다. 엔테로코커스 갈리나룸 플라겔린 폴리펩타이드에서 D0, D1 및 D2 도메인의 위치를 도 3에 나타낸다. 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드(FliCMRx0518)의 예측된 형태를 도 5에 나타낸다. FliCMRx0518의 예측된 구조는 공개적으로 이용 가능한 구조와의 상동성에 기반하여 단백질 구조를 예측하는 Phyre2 도구를 사용하여 생성되었고[38] 그래픽은 UCSF Chimera 패키지로 생성되었다[39]. 예측된 D3 도메인의 부재는 살모넬라 타이피무리움 SL1344(GenBank 접근 번호 CBW17983)로부터의 플라겔린 폴리펩타이드에 비해 단백질 구조의 입체형태 변화를 야기한다. 예측된 D3 도메인의 부재는 TLR5 인식 부위가 더 노출되도록 야기할 수 있고, 이는 플라겔린 폴리펩타이드가 TLR5 반응을 활성화하는 능력 증가를 야기한다. 예측된 D3 도메인의 부재는 또한 플라겔린 폴리펩타이드가 편모 필라멘트로 중합하는 능력에 영향을 미칠 수 있다. 플라겔린 폴리펩타이드는 단량체 형태로 TLR5 반응을 더 효과적으로 활성화하며, 이에 따라 플라겔린 폴리펩타이드의 중합 예방 또는 감소가 유익하다.
본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 D1 도메인을 함유할 수 있고, 이는 TLR5 인식 및 상호작용을 위해 요구될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1에서의 잔기 43~164 및 273~317과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 D1 도메인을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 D1 도메인에 TLR5 인식 부위를 갖는 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드에서 TLR 인식 부위는 서열 번호 1에서 위치 87~96 및 290~295에 배치된다. 바람직한 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드의 TLR5 인식 부위는 서열 번호 1에서 잔기 87~96 및 290~295와 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일성을 갖는다. 바람직한 추가 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 서열 번호 1에서 잔기 87~96 및 290~295의 TLR5 인식 부위를 포함한다.
본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 또한 D0 도메인을 함유할 수 있고, 이는 TLR5 신호전달에 영향을 미칠 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1에서 잔기 2~32 및 234~358과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일성을 갖는 D0 도메인을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 또한 D2 도메인을 함유할 수 있다. 살모넬라 타이피무리움 및 엔테로코커스 속으로부터의 편모 폴리펩타이드 간 대부분의 서열 변이는 중심 영역(D2~D3 도메인) 내에 존재한다. 실시예는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 살모넬라 타이피무리움으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드에 비해 더 낮은 투여량으로 더 강력한 TLR5 반응을 생성할 수 있음을 나타낸다. D2 또는 D3 도메인에서의 서열 변이는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 TLR5 반응을 활성화하는 능력 증가에 기여할 수 있다. 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 또한 D0 도메인을 함유하며, 이는 TLR5 신호전달에 영향을 미칠 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1에서 잔기 165~272와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일성을 갖는 D2 도메인을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다.
플라겔린 폴리펩타이드는 단량체로 또는 편모 필라멘트로서 중합된 형태로 존재할 수 있다. 상기 필라멘트는 박테리아 편모의 일부이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 편모 필라멘트로 배열된다. 본 발명은 또한 편모 필라멘트로 배열되지 않은 플라겔린 폴리펩타이드에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 그 단량체 형태로 있다. 플라겔린 폴리펩타이드의 단량체 형태는 이것이 TLR5와 더 강력하게 상호작용할 수 있으므로 유리하다. 구현예에서, 본 발명의 플라겔린은 글리코실화되지 않아, 그 흘림 및 단량체 형태로의 탈응집을 보조한다.
특정 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 박테리아 편모의 일부이다. 특정 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ 및 FliS로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 함유하는 박테리아 편모의 일부이다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 편모 어셈블리는 FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ 및 FliS를 함유한다. 특정 구현예에서, 박테리아 편모 어셈블리는 단백질 FliL 및 FlaG를 함유한다. FliL은 편모 기저체-연관 단백질로, 화학주성 동안 편모의 회전 방향을 제어하고, FlaG는 FlaF와 함께 플라겔린 어셈블리를 조절한다. FliL 및 FlaG 단백질은 MRx0518에 존재한다. 실시예는 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 또 다른 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드에 비해 더 강력한 TLR5 반응을 활성화할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현될 수도 있고, 또는 엔테로코커스 세포로부터 단리될 수도 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 엔테로코커스 세포에 부착되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 박테리아 세포가 실질적으로 없는 조성물 중에 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 열 처리되었고, 선택적으로 변성되었다. 실시예는 이러한 플라겔린 폴리펩타이드가 여전히 강력히 효과적임을 실증한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 80℃까지 열-안정하며, 예를 들어 40분 동안 80℃까지의 가열 후 활성을 유지할 수 있다. 특정 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 트립신에 의해 소화된다. 다시 말하면, 특정 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 트립신 절단 부위를 함유한다. MRX518 플라겔린은 36개의 트립신 절단 부위를 함유할 것으로 예측된다.
본 발명에 따른 플라겔린 폴리펩타이드가 플라겔린 폴리펩타이드로 간주되기 위해 일반 플라겔린 폴리펩타이드와 같이 기능할 필요는 없다. 본 발명에 따른 플라겔린 폴리펩타이드는 특정 활성을 제거하는 돌연변이 또는 결실을 함유할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 TLR5 작용제이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 편모 필라멘트로 중합할 수 없다. 다른 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 박테리아 편모 어셈블리의 일부를 형성할 수 없다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 플라겔린 폴리펩타이드가 아니다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드는 상술된 바와 같이 서열 번호 1과 서열 동일성을 갖거나, 서열 번호 1을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명은 또한 치료법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 조성물은 치료법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 치료법에서 사용하기 위한 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 모든 구현예의 대안적 양태에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 엔테로코커스 카셀리플라부스 종의 플라겔린 폴리펩타이드이다. 엔테로코커스 카셀리플라부스는 엔테로코커스 갈리나룸과 매우 유사하며 역시 편모를 갖는다.
단편
실시예에서 평가된 것들과 서열 동일성을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드도 치료법에서 유용할 것으로 예상되며 이전 섹션에 나타낸 바와 같이 본 발명에 의해 포괄된다. 또한, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드의 단편도 유용할 것으로 예상된다.
바람직하게는, 임의의 단편은 적어도 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300 또는 350개 아미노산 길이이다.
바람직한 단편은 서열 번호 1의 아미노산의 하기 신장부: 2~32, 87~96, 165~272, 234~358, 290~295 중 하나 이상을 포함하거나, 상기 단편 중 하나와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
바람직한 단편은 서열 번호 1의 아미노산 165~272와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 단편은 서열 번호 1의 아미노산 87~96, 165~272 또는 290~295와, 또는 바람직하게는 서열 번호 1의 아미노산 87~96, 165~272 및 290~295와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 단편은 보통 (i) 서열 번호 1과 적어도 w% 서열 동일성을 가질 것이고/것이거나 (ii)　서열 번호 1로부터 적어도 x개의 인접한 아미노산 단편을 포함할 것이다. w의 값은 적어도 85(예로 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 이상)이다. x의 값은 적어도 7(예로 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300)이며 단편에는 보통 서열 번호 1로부터의 에피토프가 포함될 것이다. 단편은 보통 TLR5에 결합할 수 있을 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 다른 단편은 보통 (i) 서열 번호 2와 적어도 w% 서열 동일성을 가질 것이고/것이거나 (ii)　서열 번호 2로부터 적어도 x개의 인접한 아미노산 단편을 포함할 것이다. w의 값은 적어도 85(예로 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 이상)이다. x의 값은 적어도 7(예로 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300)이며 단편에는 보통 서열 번호 2로부터의 에피토프가 포함될 것이다. 단편은 보통 TLR5에 결합할 수 있을 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 다른 단편은 보통 (i) 서열 번호 3~42 중 하나와 적어도 w% 서열 동일성을 가질 것이고/것이거나 (ii)　서열 번호 3~42 중 하나로부터 적어도 x개의 인접한 아미노산 단편을 포함할 것이다. w의 값은 적어도 85(예로 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 이상)이다. x의 값은 적어도 7(예로 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300)이며 단편에는 보통 서열 번호 3~42 중 하나로부터의 에피토프가 포함될 것이다. 단편은 보통 TLR5에 결합할 수 있을 것이다.
융합물
본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 융합물도 치료법에서 유용할 것으로 예상된다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 치료법에서 사용하기 위한, 특히 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 상술된 바와 같은 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 융합 파트너에는 표적화 모이어티 및 반감기를 연장하기 위한 모이어티가 포함된다. 특정 구현예에서 본 발명은 상술된 바와 같은 플라겔린 폴리펩타이드 및 Fc 영역, 트랜스페린, 알부민, 재조합 PEG, 단독아미노산 중합체, 프롤린-알라닌-세린 중합체, 엘라스틴-유사 펩타이드, 또는 카복시-말단 펩타이드[CTP; 융모성 성선자극호르몬(CG) b-사슬의 펩타이드]로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 또한 이의 특징 및 치료적 유용성을 개선하기 위해 비-폴리펩타이드 모이어티에 융합되거나 콘주게이션될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 PEG 또는 히알루론산에 공유 연결된 상술된 바와 같은 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는, 예를 들어, 백신으로 사용하기 위해, 항원에 융합되거나 콘주게이션될 수 있다. 본 발명의 플라겔린에 매우 근접한 항원 제시는 이의 면역자극 활성을 최대화하고 항원에 대해 생성된 보호 면역 반응을 추가 증강시킬 수 있다. 또한, 항원 및 본 발명의 플라겔린을 포함하는 치료제의 제조 및 전달은 이들이 융합되거나 콘주게이션되는 경우 더 효율적이고 효과적일 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 플라겔린 폴리펩타이드 및 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 항원에 콘주게이션된 상술된 바와 같은 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 융합물 및 콘주게이트에 포함시키기 위해 바람직한 항원은 병원체 항원 및 종양 항원이다. 항원은 병원체에 대한 감염에 대해 보호하거나 종양을 공격하는 데 효과적일 항원에 특이적인 면역 반응을 유발할 것이다. 항원은, 예를 들어, 펩타이드 또는 다당류일 수 있다. 본 발명의 융합물 및 콘주게이트와 함께 사용하기 위한 예시적인 항원에는 바이러스 표면 단백질과 같은 바이러스 항원; 단백질 및/또는 당류 항원과 같은 박테리아 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원이 포함된다. 본 발명의 융합물 및 콘주게이트과 함께 사용하기 위한 추가 항원에는 당단백질 및 리포글리칸 항원, 고세균 항원, 흑색종 항원 E(MAGE), 암배아 항원(CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn(STn), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 윌름 종양 유전자(WT1), CA-125, 전립샘-특이적 항원(PSA), 엡스타인-바 바이러스 항원, 신생물항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우(Tau), PCSK9 및 습관성 성분, 예컨대 니코틴, 알코올 또는 오피에이트가 포함된다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드에는 플라겔린 및 항원 간 링커 서열이 포함될 수 있다. 바람직한 링커 서열에는 (Gly4)n 모티프(들), (Gly4Ser)n 모티프(들), 및 Ser(Gly4Ser)n 모티프(들)를 포함하는 펩타이드가 포함된다. 링커 서열은 1~50, 1~30, 1~20, 5~20, 5~10 또는 10~20개 아미노산 길이일 수 있다. 링커 서열은 플라겔린 및 융합 파트너, 예를 들어 항원이 이의 역할을 수행할 수 있도록, 그리고 예를 들어 면역계가 접근할 수 있도록 할 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 플라겔린 폴리펩타이드, 링커 서열, 및 병원체로부터 유래되는 항원, 또는 종양 항원과 같은 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 다당류 항원과 같은 비-폴리펩타이드 모이어티에 콘주게이션되는 경우 특히 유용할 수 있다. 적합한 콘주게이션 방법에는 카보디이미드, 하이드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-하이드록시숙신이미드, S--NHS, EDC, CDAP 또는 TSTU를 사용하는 단계가 포함된다.
폴리뉴클레오타이드
본 발명은 또한 치료법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 치료법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩한다. 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 치료법에서 사용하기 위한 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩한다. 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 반응을 활성화할 수 있음을 실증하여, 이러한 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 치료법에서 유용할 수 있고, 특히 암을 치료하는 데 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 반응을 유도할 수 있음을 실증하며, 이는 암을 치료하고 예방하는 데 유용하다. 특히, 실시예는 엔테로코커스 갈리나룸 종, 특히 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 매우 큰 TLR5 반응을 일으킴을 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 치료법에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1, 또는 서열 번호 1과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 인코딩한다. 바람직한 추가 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 나타낸 특정 D0, D1 및/또는 D2 서열을 갖는 플라겔린을 인코딩하며, 이는 실시예에서 유용한 것으로 나타난다.
다른 구현예에서, 치료법에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2, 또는 서열 번호 2와 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 인코딩한다. 바람직한 추가 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 나타낸 특정 D0, D1 및/또는 D2 서열을 갖는 플라겔린을 인코딩하며, 이는 실시예에서 유용한 것으로 나타난다.
다른 구현예에서, 치료법에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 3~42 중 하나, 또는 서열 번호 3~42 중 하나와 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 인코딩한다. 바람직한 추가 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 나타낸 특정 D0, D1 및/또는 D2 서열을 갖는 플라겔린을 인코딩하며, 이는 실시예에서 유용한 것으로 나타난다.
본 발명에 따른 핵산은 다양한 형태(예로 단일 가닥, 이중 가닥, 벡터 등)를 취할 수 있다. 본 발명의 핵산은 원형 또는 분기형일 수 있지만, 일반적으로 선형일 것이다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"에는 단일-가닥 및 이중-가닥 뉴클레오타이드 중합체가 모두 포함된다. 핵산을 이루는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 어느 한 유형의 뉴클레오타이드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형에는 변형에는 브로모우리딘 및 이노신 유도체와 같은 염기 변형, 2',3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오타이드간 결합 변형이 포함된다.
핵산은 여러 방식으로, 예로 전체적으로 또는 부분적으로 화학적 합성(예로 DNA의 포스포르아미다이트 합성)에 의해, 뉴클레아제(예로 제한 효소)를 사용하는 더 긴 핵산의 소화에 의해, 더 짧은 핵산 또는 뉴클레오타이드의 연결에 의해(예로 리가제 또는 중합효소를 사용하여), 게놈 또는 cDNA 라이브러리 등으로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 핵산은 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드와 같은 적어도 하나의 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 핵산은 재조합 형태, 즉 자연에서 발생하지 않는 형태일 것이다. 예를 들어, 핵산은 적어도 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열에 부가하여 하나 이상의 이종성 핵산 서열(예로 또 다른 항원 및/또는 프로모터 또는 내부 리보솜 진입 부위와 같은 제어 서열을 인코딩하는 서열)을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 본 발명의 핵산은 상기 논의된 바와 같은 플라겔린 폴리펩타이드 및 병원체 항원 또는 종양 항원과 같은 항원을 인코딩한다. 선택적으로, 핵산은 링커 서열을 또한 인코딩한다.
숙주 세포
본 발명은 또한 치료법에서 사용하기 위한, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 실시예는 본 발명의 엔테로코커스 플라겔린을 발현하는 MRx0518과 같은 엔테로코커스 균주가 TLR5를 활성화할 수 있고 따라서 강력한 치료 효과를 가질 수 있음을 실증한다. 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포는 치료 조성물에 포함시키기 위한 플라겔린 폴리펩타이드를 제조하는 데 유용할 수 있거나, 이러한 숙주 세포는 환자에 투여하는 데 유용할 수 있고, 여기서 이들이 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하여 직접적 치료 효과를 발휘한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 재조합적으로 발현한다. 다시 말하면, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 엔테로코커스 속이 아니거나, 엔테로코커스 갈리나룸 종이 아니거나, 균주 MRx0518이 아니다. 바람직한 구현예에서, 재조합 엔테로코커스 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하기 위한 숙주 세포는 대장균이다.
예를 들어 숙주 세포가 환자에 투여하기 위한 것인 대안적인 구현예에서, 숙주 세포는 락토바실러스 또는 비피도박테리움 균주와 같은 프로바이오틱 균주이다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 벡터를 포함하며, 여기서 벡터는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아 편모 어셈블리 유전자 FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ 및 FliS 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 폴리펩타이드 FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ 및 FliS 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 발현한다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 FliL 및 FlaG를 포함하는 박테리아 편모 어셈블리를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 폴리펩타이드 FliL 및 FlaG를 발현한다.
바람직하게는, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하는 임의의 세포, 특히 환자에 투여하기 위한 임의의 세포는 플라겔린 폴리펩타이드를 흘리는 데 효과적이다. 실시예는 이러한 세포가 더 강력한 TLR5 반응을 유도할 수 있음을 실증한다. 플라겔린은 그 단량체 단위의 누출을 통해, 편모 어셈블리 동안 "능동적으로" 흘려질 수 있다. 그러나 대부분의 경우, 단량체 플라겔린은 탈착된 편모의 수동적 분해로부터 생성된다. 편모 탈착은 기계적 여과 후 또는 자발적 공정으로서 일어날 수 있다. 일부 박테리아 종에서, 플라겔린은 글리코실화되어 필라멘트 안정성을 증강시키고, 예를 들어 슈바넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis)에서의, 제어되지 않는 흘림을 예방한다[40]. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포에 의해 발현되는 플라겔린은 글리코실화되지 않아서, 그 흘림 및 단량체 형태로의 탈응집을 보조한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드 및/또는 박테리아 편모 어셈블리는 숙주 세포로부터 쉽게 흘려진다.
플라겔린 폴리펩타이드 및/또는 편모 어셈블리의 흘림 용이성은 i) 본 발명의 플라겔린을 발현하는 세포 및 ii) 본 발명의 플라겔린과 동일한 박테리아 종에 속하는 동일하거나 상이한 균주로부터 유래되는 참조 플라겔린을 발현하는 하나 이상의(예로 1, 2, 3, 4, 5, 10 또는 10개 이상의) 세포를 a) 각 세포의 1% 접종물을 사용하여 18시간 동안 정지상에서, 이어서 b) 정지상으로부터의 세포의 10% 접종물을 3시간 동안 성장시키는 후기-로그 상에서 별도 성장시켜 결정될 수 있다. 그 후 본 발명의 플라겔린을 발현하는 세포 및 참조 플라겔린을 발현하는 세포의 10 ㎖ 배양을 실온에서 5분 동안 5000xg에서 원심분리하여 박테리아 펠렛을 제거할 수 있다. 이어서 생성 상청액을 멸균 조건 하에 여과할 수 있다(0.22 um). 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드 및/또는 박테리아 편모 어셈블리가 우수한 흘림체(shedder)인 구현예에서, 본 발명의 플라겔린을 발현하는 세포로부터 유래되는 상청액 중 플라겔린 단백질의 농도는 참조 플라겔린을 발현하는 세포로부터 유래되는 상청액 중 플라겔린 단백질의 농도보다 높을(예로 1.5X 이상 높을, 2X 이상 높을, 3X 이상 높을, 4X 이상 높을, 5X 이상 높을, 7X 이상 높을 또는 10X 이상 높을) 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 화학적 또는 분리적 손상을 필요로 하는 그 환경 내로 플라겔린 폴리펩타이드 및/또는 편모 어셈블리를 방출한다. 바람직한 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드의 발현에 적합한 조건 하에서의 본 발명의 숙주 세포의 배양은 세포로부터 그 환경 내로 플라겔린 폴리펩타이드의 방출을 유도한다. 실시예는 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하는 세포가 더 강력한 TLR5 반응을 유도함을 실증한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 박테리아 편모 어셈블리의 우수한 흘림체이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 박테리아 편모 필라멘트의 우수한 흘림체이며, 특히 플라겔린 폴리펩타이드의 우수한 흘림체이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아 편모 어셈블리는 단량체 플라겔린을 능동적으로 흘린다. 특정 구현예에서, 본 발명의 편모 필라멘트는 단량체 플라겔린을 능동적으로 흘린다. 단량체 플라겔린은 TLR5 반응을 유도하는 데 더 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드 또는 편모 어셈블리를 발현하는 세포를 배양하는 단계 및 세포 표면으로부터 별도의 플라겔린 폴리펩타이드 또는 편모 어셈블리를 제거하기 위한 임의의 단계를 수행하지 않고, 상기 플라겔린 폴리펩타이드 또는 편모 어셈블리를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드 또는 편모 어셈블리를 수득하는 방법을 제공한다.
편모(또는 플라겔린) 흘림 공정은 현재 특정 하위세트 유전자의 발현과 연관되어 있지 않으며, 환경 조건에 크게 영향받을 수 있다. 그러나, 여러 유전자가 편모 편모 강직성 및 안정성에 관여되는 것으로 나타났다. 예를 들어 살모넬라에서, fliF 및 fliL 돌연변이체는 점성 배지에서 성장시킨 경우 편모를 보다 쉽게 흘리는 것으로 나타났다[41,42]. 두 경우 모두에서, 편모는 원위 막대 근처에서 파단된다[43]. 따라서, 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 fliF 및/또는 fliL을 발현하지 않는다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 fliL을 발현하지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 열 처리되었다. 실시예는 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하는 세포가 열 처리 후에도 여전히 강력하게 효과적임을 실증한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 80℃까지 열처리되며, 예를 들어 40분 동안 80℃까지의 가열 후 활성을 유지할 수 있다.
본 발명은 플라겔린 폴리펩타이드의 제조를 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 이렇게 제조된 플라겔린 폴리펩타이드를 회수하는 단계에 의한, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 추가로 하나 이상의 항원을 발현한다. 일반적으로 항원은 재조합적으로 발현될 것이며 숙주 세포에 이종성일 것이다. 항원은 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드와 함께 발현되는 융합 폴리펩타이드의 일부일 수도 있고, 또는 숙주 세포가 플라겔린 및 상이한 개방 해독틀로부터의 항원을 별도로 발현할 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드 및 이종성 항원을 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 예시적인 항원에는 바이러스 표면 단백질과 같은 바이러스 항원; 단백질 및/또는 당류 항원과 같은 박테리아 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원이 포함된다. 본 발명의 플라겔린과 함께 숙주 세포에서 발현하기 위한 추가 항원에는 당단백질 및 리포글리칸 항원, 고세균 항원, 흑색종 항원 E(MAGE), 암배아 항원(CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn(STn), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 윌름 종양 유전자(WT1), CA-125, 전립샘-특이적 항원(PSA), 엡스타인-바 바이러스 항원, 신생물항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9 및 습관성 성분, 예를 들어 니코틴, 알코올 또는 오피에이트가 포함된다.
벡터, 플라스미드 및 다른 핵산
본 발명의 핵산은 벡터의 일부, 즉 하나 이상의 세포 유형의 형질도입/전달감염을 위해 설계된 핵산 작제물의 일부일 수 있다. 벡터는, 예를 들어, 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위해 설계된 "발현 벡터", 또는 재조합 바이러스 또는 바이러스-유사 입자의 제조를 유도하도록 설계된 "바이러스 벡터"일 수 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 핵산의 서열 또는 화학적 구조는 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 자연-발생 서열 대비 변형될 수 있다. 핵산 분자의 서열은, 예로 핵산의 발현 또는 복제 유효성을 증가시키기 위해, 또는 추가 안정성 또는 분해에 대한 내성을 제공하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자의 서열은 포유류(예로 인간) 세포와 같은 요망되는 숙주에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 사용에 관한 이러한 변형은 번역 유효성 및 핵산의 반감기를 증가시킬 수 있다. 폴리 A 꼬리(예로, 약 30개 이상의 아데노신 잔기 꼬리)가 그 반감기를 증가시키기 위해 RNA의 3' 말단에 부착될 수 있다. RNA의 5' 말단은 구조 m7G (5') ppp (5') N(캡 0 구조)을 갖는 변형된 리보뉴클레오타이드 또는 이의 유도체로 캡핑될 수 있고, 이는 RNA 합성 동안 도입될 수 있거나 RNA 전사 후 효소적으로 (예로, N7-모노메틸화 캡 0 구조의 작제를 촉매하는, mRNA 트리포스파타제, 구아닐릴-트랜스퍼라제 및 구아닌-7-메틸트랜스퍼라제로 구성되는 백시니아 바이러스 캡핑 효소(VCE)를 사용하여) 조작될 수 있다. 캡 0 구조는 RNA 분자의 안정성 및 번역 유효성 유지에서 중요한 역할을 담당한다. RNA 분자의 5' 캡은 캡 1 구조(m7Gppp [m2'-O] N)의 생성을 유도하는 2'-O-메틸트랜스퍼라제에 의해 추가 변형될 수 있고, 이는 번역 유효성을 추가 증가시킬 수 있다.
핵산은 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "뉴클레오타이드 유사체" 또는 "변형된 뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드의 질소성 염기(예로, 시토신(C), 티민(T) 또는 우라실(U)), 아데닌(A) 또는 구아닌(G)) 내에 또는 상에 하나 이상의 화학적 변형(예로, 치환)을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 뉴클레오타이드 유사체는 뉴클레오사이드의 당 모이어티(예로, 리보스, 데옥시리보스, 변형된 리보스, 변형된 데옥시리보스, 6원 당 유사체, 또는 개방쇄 당 유사체) 또는 포스페이트 내에 또는 상에 추가 화학적 변형을 함유할 수 있다. 뉴클레오타이드 및 변형된 뉴클레오타이드 그리고 뉴클레오사이드의 제조는 당분야에, 예로 US 특허 번호 4373071, 4458066, 4500707, 4668777, 4973679, 5047524, 5132418, 5153319, 5262530, 5700642에서 잘 알려져 있고, 여러 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드가 상업적으로 이용 가능하다.
본 발명은 플라겔린 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 추가로 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 상기 언급된 임의의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 추가로 상기 언급된 임의의 벡터가 도입된 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 발명은 플라겔린 폴리펩타이드의 제조를 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 이렇게 제조된 플라겔린 폴리펩타이드를 회수하는 단계에 의해 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 본원에서 개시되는 조성물은 핵산-기반 치료제일 수 있다.
핵산은, 예를 들어, RNA(즉 RNA-기반 치료제) 또는 DNA(즉, 플라스미드 DNA 치료제와 같은 DNA-기반 치료제)일 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산-기반 치료제는 RNA-기반 치료제이다. 특정 구현예에서, RNA-기반 치료제는 자가-복제 RNA 분자를 포함한다. 자가-복제 RNA 분자는 알파바이러스-유래 RNA 레플리콘일 수 있다.
자가-복제 RNA 분자는 당분야에 잘 알려져 있으며, 예로, 알파바이러스로부터 유래되는 복제 요소를 사용하고, 구조 바이러스 단백질을 관심 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여 제조될 수 있다. 자가-복제 RNA 분자는 전형적으로 세포로의 전달 후 직접 번역될 수 있는 + 가닥 분자이며, 상기 번역은 전달된 RNA로부터 안티센스 및 센스 전사체를 모두 제조하는 RNA-의존적 RNA 폴리머라제를 제공한다. 따라서 전달된 RNA는 여러 딸 RNA의 제조를 야기한다. 이들 딸 RNA뿐만 아니라 동일선상의 게놈하위 전사체는 스스로 번역되어 인코딩되는 항원(즉 플라겔린 폴리펩타이드)의 원 위치 발현을 제공할 수도 있고, 또는 전사되어 항원의 원 위치 발현을 제공하도록 번역되는 전달된 RNA와 동일한 센스를 갖는 추가 전사체를 제공할 수도 있다. 상기 서열 전사의 전반적 결과는 도입된 레플리콘 RNA의 수에 있어서의 엄청난 증폭이며 이에 따라 인코딩된 항원이 세포의 주요 폴리펩타이드 산물이 된다.
상기 방식으로 자가-복제를 달성하기 위한 하나의 적합한 시스템은 알파바이러스-기반 레플리콘을 사용하는 것이다. 이들 레플리콘은 세포로의 전달 후 레플리카제(또는 레플리카제-전사효소)의 번역을 야기하는 + 가닥 RNA이다. 레플리카제는 자가 절단되어 + 가닥 전달 RNA의 게놈 - 가닥 카피를 생성하는 복제 복합체를 제공하는 폴리단백질로 번역된다. 이들 - 가닥 전사체는 스스로 전사되어 + 가닥 모체 RNA의 추가 카피를 제공할 수 있고 또한 항원을 인코딩하는 게놈하위 전사체를 제공할 수 있다. 따라서 게놈하위 전사체의 번역은 감염된 세포에 의한 항원의 원 위치 발현을 야기한다. 적합한 알파바이러스 레플리콘은 신드비스 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 등으로부터의 레플리카제를 사용할 수 있다. 돌연변이체 또는 야생형 바이러스 서열이 사용될 수 있고, 예로 VEEV의 약독화된 TC83 돌연변이체가 레플리콘에서 사용되었다.
특정 구현예에서, 본원에서 기재되는 자가-복제 RNA 분자는 (i) 자가-복제 RNA 분자로부터 RNA를 전사할 수 있는 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 및 (ii) 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩한다. 폴리머라제는 예로 하나 이상의 알파바이러스 단백질 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4를 포함하는, 알파바이러스 레플리카제일 수 있다.
핵산-기반 치료제는 바이러스 또는 비-바이러스 전달 시스템을 포함할 수 있다. 전달 시스템(본원에서 전달 비히클로도 언급됨)은 인코딩되는 플라겔린 폴리펩타이드의 면역원성을 증강시키는 아주반트 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 리포좀, 무독성 생분해성 중합체 마이크로입자 또는 바이러스 레플리콘 입자(VRP) 중에 캡슐화되거나, 양이온성 수중유 에멀젼 입자와 복합체화될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산-기반 치료제는 양이온성 나노-에멀젼(CNE) 전달 시스템 또는 지질 나노입자(LNP) 전달 시스템을 포함한다. 대안적으로, 핵산-기반 치료제는 바이러스 레플리콘 입자를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산-기반 치료제는 네이키드 RNA(예로 mRNA)와 같은 네이키드 핵산을 포함할 수 있지만, LNP를 통한 전달이 바람직하다.
특정 구현예에서, 핵산-기반 치료제는 양이온성 나노-에멀젼(CNE) 전달 시스템을 포함한다. CNE 전달 시스템 및 이의 제조 방법은 당분야에 기재되어 있다. CNE 전달 시스템에서, 항원을 인코딩하는 핵산 분자(예로 RNA)는 양이온성 수중유 에멀젼 입자와 복합체화된다. 양이온성 수중유 에멀젼은 세포에 RNA 분자와 같은 음으로 하전된 분자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 에멀젼 입자는 오일 코어 및 양이온성 지질을 포함한다. 양이온성 지질은 음으로 하전된 분자와 상호작용하여 분자를 에멀젼 입자에 부착할 수 있다. 유용한 CNE의 추가 상세사항이 당분야에서 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명의 핵산-기반 치료제에서, 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 RNA 분자는 양이온성 수중유 에멀젼 입자와 복합체화될 수 있다. 입자는 전형적으로 25C에서 액상으로 있는 오일 코어(예로 식물 오일 또는 스쿠알렌), 양이온성 지질(예로 인지질) 및, 선택적으로 계면활성제(예로 소르비탄 트리올레에이트, 폴리소르베이트 80)를 포함한다; 폴리에틸렌 글리콜도 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, CNE는 스쿠알렌 및 양이온성 지질, 예컨대 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판(DOTAP)을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 전달 시스템은 CNE와 같은 비-바이러스 전달 시스템이며, 핵산-기반 치료제는 자가-복제 RNA(mRNA)를 포함한다. 이는 체액성 및 세포성 면역 반응을 유발하는 데 특히 효과적일 수 있다. 장점에는 제한 항-벡터 면역 반응의 부재 및 게놈 통합의 위험 부재가 또한 포함된다.
LNP 전달 시스템 및 무독성 생분해성 중합체 마이크로입자, 및 이의 제조 방법은 당분야에 기재되어 있다. LNP는 핵산 분자(예로 RNA)가 캡슐화될 수 있는 비-비리온 리포좀 입자이다. 입자에는 일부 외부 RNA가(예로 입자 표면 상에) 포함될 수 있지만, 적어도 RNA의 절반(그리고 이상적으로는 그 전부)은 캡슐화된다. 리포좀 입자는, 예를 들어, 포화 또는 불포화일 수 있는 쯔비터이온성, 양이온성 및 음이온성 지질, 예를 들어 DSPC(쯔비터이온성, 포화), DlinDMA(양이온성, 불포화), 및/또는 DMG(음이온성, 포화)의 혼합물로 형성될 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 바람직한 LNP에는 선택적으로 적어도 하나의 양이온성 지질(예컨대 DOTAP, DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA 등)과의 조합으로, 리포좀을 형성할 수 있는 양쪽성 지질이 포함된다. DSPC, DlinDMA, PEG-DMG 및 콜레스테롤의 혼합물이 특히 효과적이다. 다른 유용한 LNP는 당분야에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, LNP는 RV01 리포좀이다.
NF-κB
TLR 신호전달 경로는 전사 인자인 핵 인자-카파B(NF-κB)의 활성화로 완결된다. NF-κB는 TNF-α를 포함하는, 염증성 사이토카인 유전자 어레이의 발현을 제어한다. 플라겔린은 TLR5의 이량체화를 유도하며, 이후 MyD88를 모집하고 IRAK1, IRAK2, IRAK4 및 IRAK-M을 포함하는 단백질 키나제를 활성화한다. 이들 키나제의 활성화는 전염증성 사이토카인인 NF-κB의 핵 편재를 야기한다[44].
실시예에 실증된 바와 같이(도 18), 본 발명의 조성물은 NF-κB의 발현 증가를 야기한다. 본 발명의 조성물의 투여가 전염증성 사이토카인 NF-κB의 발현을 증가시키므로, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 자극하는 데 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 질환, 특히 감소된 면역 활성화를 특징으로 하는 질환 및/또는 증가된 면역 반응에 의해 치료 가능한 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 면역 자극제로서 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 수준 및/또는 활성 증가에 의해 감소된 면역 활성화를 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 수준 및/또는 활성 증가에 의해 증가된 면역 반응에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
특히, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 발현 및/또는 활성화 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 발현 및/또는 활성화 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
NF-κB의 활성화는 선천성 면역 반응 및 적응 면역 반응의 후속 발생을 유발하기 위해 중요하다. 따라서, TLR의 작용제, 예컨대 플라겔린은 선천성 및 적응 면역 반응을 모두 촉진하여 감염성 질환, 알러지 및 종양을 치료하기 위한 아주반트로서 유용할 수 있다[44]. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감염성 질환, 알러지 및/또는 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 감염성 질환, 알러지 및/또는 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
암 치료
Toll-유사 수용체(TLR)는 선천성 및 적응 면역계 모두에서 핵심 역할을 담당하는 선천성 면역 세포 상에서 주로 발현되는 막-결합 수용체이다. TLR은 특정 미생물 병원체-연관 분자 패턴(PAMP)에 반응한다. TLR은 박테리아 세포벽 성분을 감지하며 TLR5는 박테리아 플라겔린을 인식하는 것으로 알려져 있다. 플라겔린은 상피 세포, 내피 세포, 대식구, 수지상 세포(DC) 및 T 세포를 포함하는 다양한 인간 세포의 표면 상에서 발현되는 수용체 단백질인 TLR5에 대해 유일하게 알려진 리간드이다[45~47]. 박테리아 플라겔린에 의한 TLR5의 활성화는 다양한 전염증성 및 면역 반응 유전자의 활성화를 야기한다[15].
살모넬라 타이피무리움 플라겔린에 의한 TLR5의 활성화는 세포 증식 및 종양 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다[48]. 비브리오 불니피쿠스 플라겔린 B(FlaB)를 분비하도록 조작된 살모넬라 타이피무리움 균주는 TLR4 및 TLR5 신호전달 경로의 2단계 활성화를 통해, 마우스 모델에서 종양 성장 및 저이를 효과적으로 억제하고 생존을 연장하는 것으로 나타났다[49]. 다른 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드의 암을 치료하기 위한 유효성은 알려져 있지 않다. TLR5 반응을 활성화하는 화합물의 능력 검정은 화합물이 암을 치료하는 데 효과적일 수 있음을 나타낸다.
엔테로코커스 갈리나룸 균주, 특히 균주 MRx0518을 포함하는 조성물은 암을 치료하고 예방하는 데 효과적이다[50]. 본 발명자들은 놀랍게도 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 반응을 자극할 수 있음을 나타내었고, 이는 엔테로코커스 균주의 항암 활성에 기여할 수 있다. 엔테로코커스 갈리나룸으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 살모넬라 타이피무리움으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드와 큰 서열 비유사성을 갖는다. 실시예는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 살모넬라 타이피무리움으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드보다 강력한 TLR5 반응을 일으킬 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 엔테로코커스 속, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 치료법에서 유용하며, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 효과적임을 나타내었다.
TLR5는 유방암, 결장직장암 및 위암을 포함하는 여러 상이한 암에 의해 발현되는 것으로 나타났다. 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 반응을 일으킬 수 있음을 나타낸다. 따라서, 특정 구현예에서 본 발명은 유방암, 결장직장암 또는 위암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 유방암, 결장직장암 또는 위암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 유방암, 결장직장암 또는 위암에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 유방암을 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 결장직장암을 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 위암을 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 TLR5 연관된 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한, 균주 MRx0518로부터의, 특히 서열 번호 1을 갖는, 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 또한 제공하며, 여기서 숙주 세포는 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물로의 치료는 종양 크기 감소 또는 종양 성장 감소를 유도한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 종양 크기를 감소시키거나 종양 성장을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 종양 크기 또는 성장을 감소시키기 위해 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 고형 종양을 갖는 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 혈관신생을 감소시키거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 면역계 또는 염증계에 효과를 가질 수 있고, 이는 혈관신생에서 중추적 역할을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전이를 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 유방암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 참고문헌[50]은 엔테로코커스 균주가 유방암에 대해 강력한 효과를 가짐을 실증하며, 이에 따라 본 출원에서의 데이터에 따라, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 유방암에 대해 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 유방암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 유방암종이다. 바람직한 구현예에서 암은 IV기 유방암이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 폐암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 참고문헌[50]은 엔테로코커스 균주가 폐암에 대해 강력한 효과를 가짐을 실증하며, 이에 따라 본 출원에서의 데이터에 따라, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 폐암에 대해 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 폐암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 폐암종이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 간암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 참고문헌[50]은 엔테로코커스 균주가 간암에 대해 강력한 효과를 가짐을 실증하며, 이에 따라 본 출원에서의 데이터에 따라, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 간암에 대해 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 간암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 간암종(간세포암종)이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 결장직장암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 참고문헌[50]은 엔테로코커스 균주가 결장직장암에 대해 강력한 효과를 가짐을 실증하며, 이에 따라 본 출원에서의 데이터에 따라, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 결장직장암에 대해 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 결장직장암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 결장직장 선암종이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 결장암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 참고문헌[50]은 엔테로코커스 균주가 결장암에 대해 강력한 효과를 가짐을 실증하며, 이에 따라 본 출원에서의 데이터에 따라, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 결장암에 대해 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 결장암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 결장 선암종이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 직장암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 참고문헌[50]은 엔테로코커스 균주가 직장암에 대해 강력한 효과를 가짐을 실증하며, 이에 따라 본 출원에서의 데이터에 따라, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 직장암에 대해 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 직장암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 직장 선암종이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 직장암을 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 위암종은 높은 수준의 TLR5를 발현하며 플라겔린으로의 치료는 강력한 항종양 활성을 유발하는 것으로 나타났다[51]. 실시예는 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 반응을 일으킬 수 있음을 나타내고, 이에 따라 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 위암에 대해 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 위암 선암종이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 위암을 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 주조직 적합성 복합체 클래스 II-제한 P10 펩타이드와 조합된 살모넬라 타이피무리움으로부터의 플라겔린은 쥣과 흑색종 모델에서 폐 전이 수를 감소시키는 것으로 나타났다[52]. 실시예는 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드가 살모넬라 타이피무리움보다 강력한 TLR5 반응을 일으킬 수 있음을 나타내고, 이에 따라 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 흑색종에 대해 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 흑색종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 흑색종을 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경모세포종을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 살모넬라 타이피무리움 플라겔린에 의한 TLR5의 활성화는 세포 증식 및 종양 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다[53]. 실시예는 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드가 살모넬라 타이피무리움보다 강력한 TLR5 반응을 일으킬 수 있음을 나타내고, 이에 따라 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 신경모세포종에 대해 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경모세포종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 혈관신생을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 신경모세포종을 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 암은 내장의 암이다. 일부 구현예에서, 암은 내장이 아닌 신체 부분의 암이다. 일부 구현예에서, 암은 내장의 암이 아니다. 일부 구현예에서, 암은 결장직장암이 아니다. 일부 구현예에서, 암은 소장의 암이 아니다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방은 내장 이외의 부위에서 일어난다.　일부 구현예에서, 치료 또는 예방은 내장에서 그리고 또한 내장 이외의 부위에서 일어난다.
TLR5의 발현이 다발성 골수종[54] 및 급성 골수 백혈병[55]을 포함하는 혈액암 세포주에서 검출되었다. 본 발명자들은 실시예에서 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 반응을 활성화하는 데 특히 효과적임을 실증하였다. 따라서 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 혈액암, 예컨대 TLR5를 발현하는, 다발성 골수종 및 급성 골수 백혈병을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서 본 발명은 혈액 종양, 예컨대 다발성 골수종, 급성 및 만성 백혈병, 예컨대 급성 골수 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 급성 단핵구 백혈병, 림프종, 예컨대 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종, 및 골수형성이상 증후군을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 급성 골수 백혈병을 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서 본 발명을 다발성 공수종을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 급성 골수 백혈병을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 다발성 공수종의 치료에서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
다양한 TLR 작용제가 매우 다양한 종양 모델 어레이 및 임상 시험에서 평가되었다[56]. 예를 들어, TLR5 작용제 CBLB502는 T 및 B 세포 림프종의 마우스 모델에서 종양 제거를 촉진하는 것으로 나타났다[57]. TLR5 작용제 엔톨리모드(약리학적으로 최적화된 플라겔린 유도체)의 전신 투여는 마우스 모델에서 결장직장 세포의 간 전이를 억제하였다. 간은 TLR5 작용제 엔톨리모드의 투여 후 가장 강력한 TLR5 활성화 반응을 나타낸다[58]. 본 발명자들은 실시예에서 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 작용제로 작용함을 실증하였다. 따라서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 T 및 B 세포 림프종, 결장직장암 및 간암을 치료하거나 예방하는 데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 T 및 B 세포 림프종을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 T 및 B 세포 림프종을 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전이를 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전이 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 진행된 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 전이를 치료하거나, 감소시키거나, 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전이 성장을 감소시키거나 예방할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 전이를 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 전이 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 진행된 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 암종을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.
비브리오 불니피쿠스 플라겔린 B(FlaB)는 TLR4 및 TLR5 신호전달 경로의 2단계 활성화를 통해 종양 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 TLR4 및 TLR5 신호전달 경로를 활성화할 수 있다. 다른 구현예에서 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 TLR5 신호전달 경로만을 활성화한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드는 NFκB 신호전달 경로를 활성화할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 TLR9 신호전달 경로를 활성화할 수 있다. 참고문헌[59]은 플라겔린 및 TLR9 작용제 CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오타이드 간 상승작용이 종양 억제를 야기함을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 TLR5 및 TLR9 신호전달 경로를 활성화할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하거나 CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오타이드와 조합되어 투여된다.
암에 대한 본 발명의 조성물의 치료 효과는 전염증성 기전에 의해 매개될 수 있다. 플라겔린에 의한 TLR5의 활성화는 전염증성 신호 캐스케이드를 개시한다. 참고문헌[59]은 살모넬라 타이피무리움 플라겔린과 고도 면역원성 종양의 상호작용이 Th1 반응 및 Treg의 억제를 유도하여, 종양 성장의 억제를 유도함을 나타낸다. 대조적으로, 약한 면역원성 종양의 성장 속도는 플라겔린 투여에 의해 영향받지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드 및 조성물은 면역원성 종양, 특히 고도 면역원성 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 염증을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 Th1 염증을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. Th1 세포는 IFNγ를 생산하며 강력한 항암 효과를 갖는다[60]. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 초기 단계 암, 예컨대 전이되지 않은 암, 또는 0기 또는 1기 암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 염증 촉진은 초기 단계 암에 대해 더 효과적일 수 있다[60].
참고문헌[59]은 종양 이식 후 플라겔린의 투여가 항원성 종양의 성장을 유의미하게 억제하였음을 나타낸다. 종양 성장에 대한 플라겔린의 상이한 효과는 유도되는 면역 반응과 관련된다. 이식 후 플라겔린 투여는 증가된 IFN-γ:IL-4 비 및 감소된 CD4+CD25+ T 조절 세포 빈도와 연관되었다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드 및 조성물은 IFN-γ:IL-4 비를 증가시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드 및 조성물은 CD4+CD25+ T 조절 세포의 빈도를 감소시킨다. 다른 구현예에서, 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드 및 조성물은 IFN-γ:IL-4 비를 감소시키지 않고 CD4+CD25+ T 세포 빈도를 증가시키지 않는다. 염증은 암-억제 효과를 가질 수 있고[60] 전염증성 사이토카인, 예컨대 TNFα가 암 치료법으로 연구되고 있다[61]. TNF와 같은 유전자의 상향조절은 본 발명의 조성물이 유사한 기전을 통해 암을 치료하기 위해 유용할 수 있음을 시사할 수 있다. CXCR3 리간드(CXCL9, CXCL10) 및 IFNγ-유도성 유전자(IL-32)의 상향조절은 본 발명의 조성물이 IFNγ-유형 반응을 유발함을 시사할 수 있다. IFNγ는 살종양 활성을 자극할 수 있는 강력한 대식구-활성화 인자이며[62], 예를 들어 CXCL9 및 CXCL10도 항암 효과를 갖는다[63~65].
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 제2 항암제의 효과를 증강시키기 위해 염증을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 암의 치료 또는 예방은 하나 이상의 사이토카인의 발현 수준 증가를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 암의 치료 또는 예방은 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 중 하나 이상, 예를 들어, IL-1β 및 IL-6, IL-1β 및 TNF-α, IL-6 및 TNF-α 또는 모든 3개의 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 수준 증가를 포함한다. 임의의 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 수준 증가는 암의 치료에서 유효성을 시사하는 것으로 알려져 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 이전에 화학치료법을 수여받은 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 화학치료법 치료를 관용하지 않은 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 이러한 환자를 위해 특히 적합할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 재발을 예방하기 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 장기 투여에 적합할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 암의 진행을 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비-소세포 폐암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 소세포 폐암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 편평상피세포 암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 선암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 샘 종양, 유암종 종양, 또는 분화되지 않은 암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 간모세포종, 쓸개관암종, 쓸개세포 낭선암종 또는 바이러스 감염으로 유도되는 간암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 침습적 도관 암종, 원 위치 도관 암종 또는 침습적 소엽 암종을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
추가 구현예에서, 본 발명의 조성물은 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병, 부신피질암종, 기저-세포암종, 담관암, 방광암, 뼈 종양, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 교종, 뇌 종양, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 교종, 뇌실막종, 수모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 유방암, 기관지선종/유암종, 버키트 림프종, 유암종 종양, 경부암, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 뇌실막종, 식도암, 어윙 육종, 안내 흑색종, 망막모세포종, 담낭암, 위암, 위장관 유암종 종양, 위장관 간질 종양(GIST), 생식 세포 종양, 교종, 아동 시각 경로 및 시상하부, 호지킨 림프종, 흑색종, 섬 세포 암종, 카포시 육종, 신장 세포암, 후두암, 백혈병, 림프종, 중피종, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 입인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상샘암, 인두암, 뇌하수체 선종, 혈장 세포 신생물, 전립샘암, 신장 세포 암종, 망막모세포종, 육종, 정소암, 갑상샘암, 또는 자궁암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 추가 치료제와 조합되어 사용되는 경우 특히 효과적일 수 있다. 본 발명의 조성물의 면역-조절 효과는 보다 직접적인 항암제와 조합되는 경우 효과적일 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 엔테로코커스 속(또는 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하거나 발현하는 숙주 세포)으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드 및 항암제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서 항암제는 면역 체크포인트 억제제, 표적화된 항체 면역치료법, CAR-T 세포 치료법, 종양용해 바이러스, 또는 세포증식억제 약물이다. 바람직하게는 항암제는 키트루다(Keytruda)(펨브롤리주맙, Merck)이다. 바람직한 추가 구현예에서, 조성물은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 항암제를 포함한다: 예르보이(Yervoy)(이필리무맙, BMS); 옵디보(Opdivo)(니볼루맙, BMS); MEDI4736(AZ/MedImmune); MPDL3280A(Roche/Genentech); 트레멜리무맙(Tremelimumab)(AZ/MedImmune); CT-011(피딜리주맙, CureTech); BMS-986015(리릴루맙, BMS); MEDI0680(AZ/MedImmune); MSB-0010718C(Merck); PF-05082566(Pfizer); MEDI6469(AZ/MedImmune); BMS-986016(BMS); BMS-663513(우렐루맙, BMS); IMP321(Prima Biomed); LAG525(Novartis); ARGX-110(arGEN-X); PF-05082466(Pfizer); CDX-1127(바르릴루맙; CellDex Therapeutics); TRX-518(GITR Inc.); MK-4166(Merck); JTX-2011(Jounce Therapeutics); ARGX-115(arGEN-X); NLG-9189(인독시모드, NewLink Genetics); INCB024360(Incyte); IPH2201(Innate Immotherapeutics/AZ); NLG-919(NewLink Genetics); 항-비스타(anti-VISTA)(JnJ); 에파카도스타트(Epacadostat)(INCB24360, Incyte); F001287(Flexus/BMS); CP 870893(펜실베니아 대학); MGA271(Macrogenix); 에막투주맙(Emactuzumab)(Roche/Genentech); 갈루니세르팁(Galunisertib)(Eli Lilly); 울로쿠플루맙(Ulocuplumab)(BMS); BKT140/BL8040(Biokine Therapeutics); 바비툭시맙(Bavituximab)(Peregrine Pharmaceuticals); CC 90002(Celgene); 852A(Pfizer); VTX-2337(VentiRx Pharmaceuticals); IMO-2055(Hybridon, Idera Pharmaceuticals); LY2157299(Eli Lilly); EW-7197(이화여자대학교, 한국); 베무라페닙(Vemurafenib)(Plexxikon); 다브라페닙(Dabrafenib)(Genentech/GSK); BMS-777607(BMS); BLZ945(Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre); 유니툭신(Unituxin)(디누툭시맙, United Therapeutics Corporation); 블린사이토(Blincyto)(블리나투모맙, Amgen); 시람자(Cyramza)(라무시루맙, Eli Lilly); 가지바(Gazyva)(오비누투주맙, Roche/Biogen); 카드실라(Kadcyla)(아도-트라스투주맙 엠탄신, Roche/Genentech); 페르제타(Perjeta)(퍼투주맙, Roche/Genentech); 아드세트리스(Adcetris)(브렌툭시맙 베도틴, Takeda/Millennium); 아르제라(Arzerra)(오파투무맙, GSK); 벡티빅스(Vectibix)(파니투무맙, Amgen); 아바스틴(Avastin)(베바시주맙, Roche/Genentech); 에르비툭스(Erbitux)(세툭시맙, BMS/Merck); 벡사르(Bexxar)(토시투모맙-I131, GSK); 제발린(Zevalin)(이브리투모맙 티욱세탄, Biogen); 캄파트(Campath)(알렘투주맙, Bayer); 밀로타르그(Mylotarg)(젬투주맙 오조가미신, Pfizer); 허셉틴(Herceptin)(트라스투주맙, Roche/Genentech); 리툭산(Rituxan)(리툭시맙, Genentech/Biogen); 볼록식시맙(Abbvie); 엔바투주맙(Enavatuzumab)(Abbvie); ABT-414(Abbvie); 엘로투주맙(Elotuzumab)(Abbvie/BMS); ALX-0141(Ablynx); 오자랄리주맙(Ozaralizumab)(Ablynx); 악티맙(Actimab)-C(Actinium); 악티맙(Actimab)-P(Actinium); 밀라투주맙-독스(Milatuzumab-dox)(Actinium); 에맙(Emab)-SN-38(Actinium); 납투몬맙 에스타페나톡스(Naptumonmab estafenatox)(Active Biotech); AFM13(Affimed); AFM11(Affimed); AGS-16C3F(Agensys); AGS-16M8F(Agensys); AGS-22ME(Agensys); AGS-15ME(Agensys); GS-67E(Agensys); ALXN6000(사말리주맙, Alexion); ALT-836(Altor Bioscience); ALT-801(Altor Bioscience); ALT-803(Altor Bioscience); AMG780(Amgen); AMG 228(Amgen); AMG820(Amgen); AMG172(Amgen); AMG595(Amgen); AMG110(Amgen); AMG232(아데카투무맙, Amgen); AMG211(Amgen/MedImmune); BAY20-10112(Amgen/Bayer); 릴로투무맙(Rilotumumab)(Amgen); 데노수맙(Denosumab)(Amgen); AMP-514(Amgen); MEDI575(AZ/MedImmune); MEDI3617(AZ/MedImmune); MEDI6383(AZ/MedImmune); MEDI551(AZ/MedImmune); 목세투모맙 파수도톡스(Moxetumomab pasudotox)(AZ/MedImmune); MEDI565(AZ/MedImmune); MEDI0639(AZ/MedImmune); MEDI0680(AZ/MedImmune); MEDI562(AZ/MedImmune); AV-380(AVEO); AV203(AVEO); AV299(AVEO); BAY79-4620(Bayer); 아네투맙 라브탄신(Anetumab ravtansine)(Bayer); 반틱투맙(Bayer); BAY94-9343(Bayer); 시브로투주맙(Sibrotuzumab)(Boehringer Ingleheim); BI-836845(Boehringer Ingleheim); B-701(BioClin); BIIB015(Biogen); 오비누투주맙(Obinutuzumab)(Biogen/Genentech); BI-505(Bioinvent); BI-1206(Bioinvent); TB-403(Bioinvent); BT-062(Biotest) BIL-010t(Biosceptre); MDX-1203(BMS); MDX-1204(BMS); 네시투무맙(Necitumumab)(BMS); CAN-4(Cantargia AB); CDX-011(Celldex); CDX1401(Celldex); CDX301(Celldex); U3-1565(Daiichi Sankyo); 파트리투맙(Daiichi Sankyo); 티가투주맙(Daiichi Sankyo); 니모투주맙(Daiichi Sankyo); DS-8895(Daiichi Sankyo); DS-8873(Daiichi Sankyo); DS-5573(Daiichi Sankyo); MORab-004(Eisai); MORab-009(Eisai); MORab-003(Eisai); MORab-066(Eisai); LY3012207(Eli Lilly); LY2875358(Eli Lilly); LY2812176(Eli Lilly); LY3012217(Eli Lilly); LY2495655(Eli Lilly); LY3012212(Eli Lilly); LY3012211(Eli Lilly); LY3009806(Eli Lilly); 식수투무맙(Eli Lilly); 플란보투맙(Flanvotumab)(Eli Lilly); IMC-TR1(Eli Lilly); 라무시루맙(Ramucirumab)(Eli Lilly); 타발루맙(Tabalumab)(Eli Lilly); 자놀리무맙(Zanolimumab)(Emergent Biosolution); FG-3019(FibroGen); FPA008(Five Prime Therapeutics); FP-1039(Five Prime Therapeutics); FPA144(Five Prime Therapeutics); 카투막소맙(Fresenius Biotech); IMAB362(Ganymed); IMAB027(Ganymed); IIuMax-CD74(Genmab); HuMax-TFADC(Genmab); GS-5745(Gilead); GS-6624(Gilead); OMP-21M18(뎀시주맙, GSK); 마파투무맙(GSK); IMGN289(ImmunoGen); IMGN901(ImmunoGen); IMGN853(ImmunoGen); IMGN529(ImmunoGen); IMMU-130(Immunomedics); 밀라투주맙-독스(Immunomedics); IMMU-115(Immunomedics); IMMU-132(Immunomedics); IMMU-106(Immunomedics); IMMU-102(Immunomedics); 에프라투주맙(Epratuzumab)(Immunomedics); 클리바투주맙(Clivatuzumab)(Immunomedics); IPH41(Innate Immunotherapeutics); 다라투무맙(Daratumumab)(Janssen/Genmab); CNTO-95(Intetumumab, Janssen); CNTO-328(실툭시맙, Janssen); KB004(KaloBios); 모가물리주맙(Kyowa Hakko Kirrin); KW-2871(에크로멕시맙, Life Science); 소넵시주맙(Sonepcizumab)(Lpath); 마르게툭시맙(Margetuximab)(Macrogenics); 에노블리투주맙(Enoblituzumab)(Macrogenics); MGD006(Macrogenics); MGF007(Macrogenics); MK-0646(달로투주맙, Merck); MK-3475(Merck); Sym004(Symphogen/Merck Serono); DI17E6(Merck Serono); MOR208(Morphosys); MOR202(Morphosys); Xmab5574(Morphosys); BPC-1C(엔시툭시맙, Precision Biologics); TAS266(Novartis); LFA102(Novartis); BHQ880(Novartis/Morphosys); QGE031(Novartis); HCD122(루카투무맙, Novartis); LJM716(Novartis); AT355(Novartis); OMP-21M18(뎀시주맙, OncoMed); OMP52M51(Oncomed/GSK); OMP-59R5(Oncomed/GSK); 반틱투맙(Oncomed/Bayer); CMC-544(이노투주맙 오조가미신, Pfizer); PF-03446962(Pfizer); PF-04856884(Pfizer); PSMA-ADC(Progenics); REGN1400(Regeneron); REGN910(네스바쿠맙, Regeneron/Sanofi); REGN421(에노티쿠맙, Regeneron/Sanofi); RG7221, RG7356, RG7155, RG7444, RG7116, RG7458, RG7598, RG7599, RG7600, RG7636, RG7450, RG7593, RG7596, DCDS3410A, RG7414(파르사투주맙), RG7160(임가투주맙), RG7159(오빈투주맙), RG7686, RG3638(오나르투주맙), RG7597(Roche/Genentech); SAR307746(Sanofi); SAR566658(Sanofi); SAR650984(Sanofi); SAR153192(Sanofi); SAR3419(Sanofi); SAR256212(Sanofi), SGN-LIV1A(린투주맙, Seattle Genetics); SGN-CD33A(Seattle Genetics); SGN-75(보르세투주맙 마포도틴, Seattle Genetics); SGN-19A(Seattle Genetics) SGN-CD70A(Seattle Genetics); SEA-CD40(Seattle Genetics); 이브리투모맙 티욱세탄(Spectrum); MLN0264(Takeda); 가니투맙(Takeda/Amgen); CEP-37250(Teva); TB-403(Thrombogenic); VB4-845(Viventia); Xmab2512(Xencor); Xmab5574(Xencor); 니모투주맙(YM Biosciences); 카를루맙(Carlumab)(Janssen); NY-ESO TCR(Adaptimmune); MAGE-A-10 TCR(Adaptimmune); CTL019(Novartis); JCAR015(Juno Therapeutics); KTE-C19 CAR(Kite Pharma); UCART19(Cellectis); BPX-401(Bellicum Pharmaceuticals); BPX-601(Bellicum Pharmaceuticals); ATTCK20(Unum Therapeutics); CAR-NKG2D(Celyad); Onyx-015(Onyx Pharmaceuticals); H101(Shanghai Sunwaybio); DNX-2401(DNAtrix); VCN-01(VCN Biosciences); 콜로(Colo)-Ad1(PsiOxus Therapeutics); 프로스타탁(ProstAtak)(Advantagene); 온코스(Oncos)-102(Oncos Therapeutics); CG0070(Cold Geneys); 펙사-백(Pexa-vac)(JX-594, Jennerex Biotherapeutics); GL-ONC1(Genelux); T-VEC(Amgen); G207(Medigene); HF10(Takara Bio); SEPREHVIR(HSV1716, Virttu Biologics); 오리엔엑스010(OrienX010)(OrienGene Biotechnology); 레올라이신(Reolysin)(Oncolytics Biotech); SVV-001(Neotropix); 카카탁(Cacatak)(CVA21, Viralytics); 알림타(Alimta)(Eli Lilly), 시스플라틴, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 폴린산, 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 지카디아(Zykadia)(Novartis), 타핀라르(Tafinlar)(GSK), 잘코리(Xalkori)(Pfizer), 이레사(Iressa)(AZ), 길로트리프(Gilotrif)(Boehringer Ingelheim), 타르세바(Tarceva)(Astellas Pharma), 할라벤(Halaven)(Eisai Pharma), 벨리파립(Veliparib)(Abbvie), AZD9291(AZ), 알렉티닙(Alectinib)(Chugai), LDK378(Novartis), 게네테스핍(Genetespib)(Synta Pharma), 테르겐푸마투셀(Tergenpumatucel)-L(NewLink Genetics), GV1001(Kael-GemVax), 티반티닙(Tivantinib)(ArQule); 시토산(Cytoxan)(BMS); 온코빈(Oncovin)(Eli Lilly); 아드리아마이신(Adriamycin)(Pfizer); 젬자르(Gemzar)(Eli Lilly); 젤로다(Xeloda)(Roche); 익셈프라(Ixempra)(BMS); 아브락산(Abraxane)(Celgene); 트렐스타(Trelstar)(Debiopharm); 탁소테어(Taxotere)(Sanofi); 넥사바르(Nexavar)(Bayer); IMMU-132(Immunomedics); E7449(Eisai); 써모독스(Thermodox)(Celsion); 코메트리크(Cometriq)(Exellxis); 론서프(Lonsurf)(Taiho Pharmaceuticals); 캄프토사르(Camptosar)(Pfizer); UFT(Taiho Pharmaceuticals); 및 TS-1(Taiho Pharmaceuticals).
바람직한 추가 구현예에서, 플라겔린 폴리펩타이드는 CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오타이드와의 조합으로(동시적으로 또는 순차적으로) 투여되며, 이는 다른 플라겔린과 함께 유용한 효과를 나타내었다[59].
일부 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 본 발명의 조성물에서 유일한 치료 활성제(들)이다.
독성 화학물질, 병원체 또는 방사선 노출에 대한 보호
특정 구현예에서, 본 발명은 독성 화학물질, 병원체 또는 방사선 노출과 연관된 증상을 예방하거나 치료하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드, 바람직하게는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드, 바람직하게는 균주 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명의 플라겔린은 독성 화학물질, 병원체 또는 방사선 노출 위험에 처한 대상체, 또는 독성 화학물질, 병원체 또는 방사선에 최근 노출된 대상체, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5시간 전에 노출된 대상체에 투여될 수 있다.
화학물질, 병원체, 또는 방사선에 대한 인간 집단의 갑작스런 노출은 상당한 이환율을 일으킬 가능성을 갖는다. 인간 집단을 보호하기 위한 하나의 전략은 선천성 숙주 방어 경로, 특히 세포보호 및/또는 항균 유전자 발현을 신속히 유도하는 경로를 활성화하는 것이다. 상기 분야에서의 여러 작업은 TLR4 작용제 LPS/내독소에 초점을 맞춰왔으나, LPS 투여는 패혈증 또는 중증 폐 손상을 포함하는 중증 염증성 병리를 야기할 수 있다. 또한, LPS는 상피 세포의 불량한 자극인자이며, 이는 병원체 또는 화학적 감작과 상호작용하는 첫 번째 세포이다.
플라겔린은 포유류, 곤충, 및 식물을 포함하는 다양한 유기체에서 숙주 방어를 자극한다. LPS와 대조적으로, 플라겔린은 상피 세포에서 선천성 면역 신호전달 경로의 강력한 활성화제이지만 일반적으로 조혈 세포, 예컨대 대식구 및 수지상 세포의 불량한 활성화제인 것으로 관찰되었다. 살모넬라 타이피무리움 플라겔린은 LPS와 연관된 유해 효과를 매개하는, 상당한 수준의 TNF-α와 같은 "마스터" 전염증성 사이토카인을 자극하지 않는 것으로 관찰되었다. 살모넬라 타이피무리움 플라겔린은 마우스에서 TLR5 매개된 선천성 면역을 활성화하여 화학물질, 병원체 또는 방사선 노출에 대해 마우스를 보호하는 것으로 관찰되었다[66].
살모넬라 타이피무리움 플라겔린의 투여는 TLR5를 필요로 하는 기전을 통해 방사선 노출에 대해 보호하는 것으로 나타났다[66]. 최적 보호는 플라겔린이 방사선 2시간 전에 예방적으로 투여되었을 때 관찰되었지만, 플라겔린이 조사 후 4 시간까지 투여되는 경우 여전히 상당한 정도의 보호가 관찰되었다. 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 살모넬라 타이피무리움보다 강력한 TLR5 반응을 자극할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 엔테로코커스 속, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 방사선보호제로서 유용할 수 있음을 나타내었다.
본 발명은 방사선보호제로서 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 방사선보호제로서 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 방사선보호제로서 사용하기 위한, 균주 MRx0518로부터의, 특히 서열 번호 1의 서열을 갖는, 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다.
TLR5 작용제 엔톨리모드로의 치료도 모든 3개 주요 유형의 방사선감수성 조직: 조혈, 위장관 및 피부에서 방사선-유도 손상을 감소시키는 것으로 나타났다. 이는 또한 두부경부 방사선의 마우스 모델에서 방사선-유도 상피 손상을 경감시키는 것으로 나타났다[67]. 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 강력한 TLR5 작용제로 작용함을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 엔테로코커스 속, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 방사선-유도 손상을 감소시키는 데 유용할 수 있음을 나타내었다. 특정 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 조혈, 위장관 또는 피부 조직에서 방사선-유도 손상을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 방사선-유도 상피 손상을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 방사선-유도 손상을 감소시키는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 경구로, 방사선치료법 전에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 경구로, 방사선치료법 직후 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 최근 방사선치료법을 거친, 또는 방사선치료법을 거치기로 일정이 잡힌 환자에 투여하기 위한 것이다.
바람직한 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 방사선 노출 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 방사선 노출 후에, 바람직하게는 노출 후 4시간 이내에 투여된다.
박테리아 감염 치료
살모넬라 타이피무리움 플라겔린의 투여는 박테리아 감염에 대한 면역 반응을 자극하는 것으로 나타났다. 참고문헌[68]은 항생제와 살모넬라 타이피무리움 플라겔린의 예방적 비강내 투여가 호흡기 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 박테리아에 대해 마우스를 보호함을 나타내지만, 참고문헌[66]은 살모넬라 타이피무리움로의 감염 2시간 전 살모넬라 타이피무리움 플라겔린의 경구 투여가 사망율을 감소시켰음을 나타낸다. 플라겔린은 TLR5 선천성 면역 반응을 활성화하여 이들 반응을 유도하였다. 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 살모넬라 타이피무리움보다 강력한 TLR5 반응을 자극할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 엔테로코커스 속, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 박테리아 감염의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있음을 나타내었다.
본 발명은 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 균주 MRx0518로부터의, 특히 서열 번호 1의 서열을 갖는, 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다.
특정 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 박테리아 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 항생제와 조합되어 사용된다. 특정 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 박테리아 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 조성물에서 유일한 치료제로 사용된다.
백신 아주반트
미생물 성분은 면역원성이 불량한 백신의 면역 반응을 증강시키기 위한 아주반트로 사용될 수 있다. 플라겔린은 박테리아, 바이러스 및 기생충 감염에 대한 백신에서 아주반트로 작용하는 것으로 나타났으나, 대부분의 이들 연구는 살모넬라 타이피무리움 및 비브리오 불니피쿠스로부터의 플라겔린을 사용하였다[15]. 백신 아주반트로 작용하는, 특히 엔테로코커스 속의, 다른 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드의 유효성은 알려지지 않았다.
플라겔린은 TLR5 수용체를 통해 선천성 면역 반응을 자극하여 아주반트로 작용한다. 본 발명자들은 놀랍게도 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 살모넬라 타이피무리움보다 강력한 TLR5 반응을 자극할 수 있음을 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 엔테로코커스 속, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 백신 아주반트로 유용할 수 있음을 나타내었다. 백신 아주반트로서의 플라겔린 폴리펩타이드의 용도는, 플라겔린 폴리펩타이드가, 예를 들어, 일반적으로 별도 항원에 대한 면역 반응을 증강시켜, 감염성 제제에 대한 보호를 제공하거나 감염성 제제에 의한 감염을 예방하기 위해 사용됨을 의미한다.
본 발명은 백신 아주반트로 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 백신 아주반트로 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 백신 아주반트로 사용하기 위한 균주 MRx0518로부터의, 특히 서열 번호 1의 서열을 갖는, 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한 아주반트로서 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 백신 조성물은 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 치료받거나 예방될 박테리아 병원체는 예르시니아 페스티스(Y. pestis), 테타누스(tetanus), 스트렙토코커스 뉴모니애, 대장균 또는 M. 투베르쿨로시스(tuberculosis)이다. 특정 구현예에서, 백신 조성물은 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 치료받거나 예방될 바이러스 병원체는 인플루엔자, HIV, 광견병 또는 수족구 바이러스이다. 특정 구현예에서, 백신 조성물은 기생충 감염을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 기생충은 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모디움 요엘리이(Plasmodium yoelii) 또는 아이메리아 테넬라(Eimeria tenella)이다. 임의의 상기 구현예에서, 조성물은 관련 병원체로부터의 적어도 하나의 항원을 포함한다. 바람직한 상기 구현예에서, 조성물은 관련 병원체로부터의 적어도 하나의 항원에 융합되거나 콘주게이션된 본 발명의 플라겔린을 제공한다. 이러한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 플라겔린, 선택적 링커, 및 병원체 또는 기생충으로부터의 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
점막 경로를 통한 투여는 매력적인 백신 투여 경로이다. 플라겔린은 점막 경로에 의해 투여되는 제제에 직면하는 첫 번째 주요 세포 유형인, 상피 세포에서의 선천성 면역 신호전달 경로의 강력한 활성화제이다. 살모넬라 타이피무리움 및 비브리오 불니피쿠스 플라겔린 단백질은 인플루엔자, 웨스트 나일 바이러스, 대장균, 예르시니아 페스티스, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), C. 제주니(jejuni), 스트렙토코커스 속 및 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)에 대한 점막 백신에서 강력한 아주반트 활성을 나타내었다[15]. 점막 백신 아주반트로서 작용하는 다른 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드의 유효성은 알려져 있지 않다.
플라겔린은 TLR5 수용체를 통해 선천성 면역 반응을 자극하여 아주반트로 작용한다. 본 발명자들은 놀랍게도 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 살모넬라 타이피무리움보다 강력한 TLR5 반응을 자극할 수 있음을 나타내었다. 따라서, 본 발명은 점막 백신 아주반트로 사용하기 위한 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 구현예에서 본 발명은 점막 백신 아주반트로 사용하기 위한 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 점막 백신 아주반트로 사용하기 위한 균주 MRx0518로부터의, 특히 서열 번호 1의 서열을 갖는, 플라겔린 폴리펩타이드를 제공한다.
특정 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 점막 백신에서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 감염은 대장균, 예르시니아 페스티스, 클로스트리듐 테타니, C. 제주니, 스트렙토코커스 속 또는 플라스모디움 팔시파룸이다. 특정 구현예에서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 점막 백신에서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 바이러스 감염은 인플루엔자 또는 웨스트 나일 바이러스이다.
본 발명의 조성물의 투여는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 발현 증가를 야기할 수 있다. TNF-α는 백신 반응에 중요한 것으로 알려져 있다. 예를 들어, TNF-α는 고령 집단의 독감 백신접종에서 효율적인 백신 반응을 위해 요구되는 것으로 나타났다[69]. 본 발명의 조성물의 투여는 TNF-α 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 치료법에서 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 항원과 조합되어 투여될 조성물을 제공한다. 본 발명의 이러한 구현예에서, 본 발명의 플라겔린은 항원에 융합되거나 콘주게이션될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신접종 바로 전에 또는 후에 환자에게 투여하기 위한 것이다.
엔테로코커스 갈리나룸, 특히 균주 MRX518은 편모를 가지며 플라겔린은 TLR5 작용제일 수 있다. TLR 작용제는 다양한 항원 유형에 걸쳐, 특히 고령 집단에서 백신 아주반트로 개발되고 있다[70]. 또한, MRX518은 TLR5 작용제이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 특히 감소된 면역계 활성을 가질 수 있는 고령 환자(예로 40, 50, 60, 70 또는 80세 이상)에 투여되는 백신을 위한, 백신 아주반트로 유용할 수 있다. TLR5 신호전달도 연령-연관 선천성 면역 반응에서 핵심 역할을 담당한다[71]. 특정 구현예에서, 조성물은 선천성 면역 반응을 증강시키는 데 사용하기 위한 것이다. TLR5 작용제가 백신 아주반트로 개발되고 있으나, 이들은 모두 알려진 병원체로부터 유래되고/되거나 합성이다. 대조적으로, 본 발명의 조성물은 공생 박테리아를 포함한다.
본 발명의 조성물의 투여는 IL-6의 발현 증가를 야기할 수 있다. 증가된 Il-6 발현은 여러 질환에 대한 백신 반응과 연관되었다. 예를 들어, IL-6은 성인에 인플루엔자 백신이 투여된 후 CD14+CD16- 염증성 단핵구에 의해 생산되었고[72], 더 높은 수준의 IL-6이 인플루엔자 백신에 대한 백신 반응의 달성과 연관되었다[73]. 또한, IL-6은 AS03 아주반트 시스템의 주사 후 생산되었고[74] 마우스에서 IL-6의 하향조절이 결핵 백신의 투여 후 헬퍼 T 세포 반응을 감소시키는 것으로 나타났다[75]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-6 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 결핵 치료법에서 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다.
또한, IL-6 및 TNF-α 발현은 치료용 HIV 백신[Huang et al] 결핵 백신 및 클라미디아 백신[76]의 유효성과 관련된 것으로 나타났다. Su 등[77]은 FMDV DNA 백신과 IL-6 또는 TNF-α의 공동-접종이 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 증가된 IFN-γ 발현, CD4+ T 세포에서의 더 큰 IL-4 발현 및 더 큰 항원-특이적 세포독성 반응을 유도함을 나타내었다. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-6 및 TNF-α 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 아주반트로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 아주반트로 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α 및 IL-6의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 아주반트로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 HIV 치료법에서 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 클라미디아 치료법에서 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물의 투여는 IL-1β의 발현 증가를 야기할 수 있다. Li 등[78]은 아주반트 알루미늄 하이드록사이드가 IL-1β의 분비를 활성화함을 나타내었고, IL-1β 자체가 아주반트로서 작용할 수 있음을 제시하였다. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 유용할 수 있다. 실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 CD8+ T 세포 대 Treg의 비를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 아주반트는 CD8+ T 세포를 자극하는 것으로 나타났고[79] 본 발명의 조성물의 투여가 CD8+ T 세포 대 Treg의 비를 증가시키는 것으로 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8+ T 세포 대 Treg의 비를 증가시켜 백신 아주반트로 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물의 투여는 CXCR3 리간드 CXCL9 및 CXCL10의 발현 또는 수준 증가를 야기할 수 있다. ASO3, CpG, GLA-SE, αGalCer과 같은 알려진 아주반트는 모두 CXCL9 및 10을 증가시키며[80,81], 이는 본 발명의 조성물이 아주반트로 효과적일 것임을 제시한다. 또한, CXCL9 및 10은 IFNγ/Th1 반응과 연관되고 항체 반응을 촉진한다[82]. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원, 특히 병원체 또는 암 항원에 대한 항체 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 또한, CXCL9는 연구되는 말라리아 백신을 수여받는 자원자들에서 백신 유도 T-세포 반응의 IFN-γ보다 더 민감한 척도이다[83]. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원, 특히 병원체 또는 암 항원에 대한 T-세포 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CXCL9 및 CXCL10의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 아주반트로서 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 조성물은 말라리아에 대해 보호하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물의 투여는 IL-12p70의 발현 또는 수준 증가를 야기할 수 있다. 상기 효과는 백신 아주반트 효율과 연관되었고 IL-12는 자체가 아주반트로 제안되었으며[84], 이는 본 발명의 조성물이 아주반트로서 효과적일 것임을 제시한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70의 발현 또는 수준을 증가시켜 백신 아주반트로서 사용하기 위한 것이다.
일반적으로, 백신 아주반트로 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 환자에 별도 투여된 항원에 대해 아주반트 효과를 제공하기 위해 이들 자체가 투여될 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여되는 반면, 항원은 비경구 주사된다. 대안적인 구현예에서, 본 발명의 플라겔린은 항원에 융합되거나 콘주게이션될 수 있다.
본 발명의 조성물은 임의의 유용한 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 예시적인 항원에는 바이러스 표면 단백질과 같은 바이러스 항원; 단백질 및/또는 당류 항원과 같은 박테리아 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원이 포함된다. 본 발명은 인플루엔자 바이러스, HIV, 십이지장충, B형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 광견병, 호흡기 융합 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 스타필로코커스 아우레우스, 클라미디아, SARS 코로나바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 나이세리아 메닌지티디스, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 바실러스 안트라시스, 엡스타인 바 바이러스, 인간 유두종바이러스 등에 대한 백신을 위해 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 플라겔린은 하나 이상의 이들 항원에 융합되거나 콘주게이션된다.
본 발명의 플라겔린과 함께 사용하기 위한 추가 항원에는 당단백질 및 리포글리칸 항원이 포함된다. 특정 구현예에서, 항원은 고세균 항원이다. 예시적 종양-연관 항원에는 흑색종 항원 E(MAGE), 암배아 항원(CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn(STn), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 윌름 종양 유전자(WT1), CA-125, 전립샘-특이적 항원(PSA), 엡스타인-바 바이러스 항원, 신생물항원 및 종양단백질이 포함된다.
본 발명의 플라겔린은 또한 의사소통-불가능 질환, 예컨대 알츠하이머 질환 및 다른 신경변성 장애에 대한 백신에 대해 반응을 증강시키는 데 유용할 수 있고, 이 경우 본 발명과 함께 사용하기 위한 항원은 아밀로이드-베타 또는 타우일 수 있다. 의사소통-불가능 질환에 대한 이러한 다른 항원에는 (상승된 콜레스테롤에 대한 치료를 위한) PCSK9가 포함된다. 본 발명의 플라겔린은 또한 습관성 성분, 예를 들어 니코틴, 알코올 또는 오피에이트에 대한 백신에 대해 반응을 증강시키는 데 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 환자에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조에서 (i) 항원의 수성 제조물; 및 (ii) 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
이들 방법 및 사용에 의해 일어난 면역 반응에는 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호 항체 반응이 포함될 것이다.
면역계 자극
본 발명의 조성물은 면역 자극을 야기할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 면역자극 효과를 가질 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 질환, 특히 감소된 면역 활성화를 특징으로 하는 질환 및 증가된 면역 반응에 의해 치료 가능한 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극하여 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 세포 집단에서 Treg의 백분율 증가를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 Treg의 백분율 증가를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 CD4+CD25+CD127- 세포의 백분율 증가를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 Treg의 백분율을 감소시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg에 의해 면역 반응의 억제를 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg의 선택적 감소에 의해 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역자극에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 본 발명의 조성물은 Treg의 수 또는 백분율을 감소시킨다.
본 발명의 조성물은 CD8/Treg의 비 및/또는 활성화된 CD8/Treg 세포의 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 세포의 비 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 활성화된 CD8/Treg 세포의 비 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 세포의 비를 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 활성화된 CD8/Treg 세포의 비를 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 B 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD19+CD3- 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 B 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 여기서 B 세포의 수 또는 백분율 증가는 면역 자극을 유도한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 여기서 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율 증가는 면역 자극을 유도한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 CD8+ 활성화된 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8+ 활성화된 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 CD8+ 활성화된 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 여기서 CD8+ 활성화된 세포의 수 및 백분율의 증가는 면역 자극을 유도한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8+ 활성화된 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물의 투여는 전염증성 분자, 예컨대 전염증성 사이토카인의 발현 증가를 야기할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여 시 발현 수준의 증가를 나타낼 수 있는 전염증성 분자의 예에는 IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL-1β, 및 IL-6이 포함된다. 본 발명의 조성물의 투여는 전염증성 분자의 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 전염증성 분자, 예컨대 전염증성 사이토카인의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전염증성 분자의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환, 특히 전염증성 사이토카인의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL-1β,- 및/또는 IL-6의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23, TNF-α, IL-1β, 및/또는 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL-1β, 및/또는 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물의 투여는 IL-1β의 발현 증가를 야기할 수 있다. IL-1β는 전염증성 사이토카인이다[85]. IL-1β의 생산 및 분비는 염증성 반응의 활성화와 연관되는 단백질 복합체인 인플라좀에 의해 조절된다[86]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-1β의 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물의 투여는 IL-23의 발현 증가를 야기할 수 있다. IL-23은 염증과 연관되었다[87,88]. 면역 반응에서 IL-23의 제안된 기능에는 CD4+ 메모리 T 세포의 증식 촉진 및 수지상 세포(DC)에 의한 IFN-γ의 분비 촉진이 포함된다[89]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-23의 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물의 투여는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 발현 증가를 야기할 수 있다. TNF-α는 세포사를 촉진하는 다양한 신호전달 경로에 관여되는 것으로 알려져 있는 전염증성 사이토카인이다. TNF-α는 그 인지체 수용체, TNFR-1에 결합하여 아폽토시스를 개시하고, 이는 아폽토시스 경로에서 절단 이벤트 캐스케이드를 야기한다[90]. TNF-α는 또한 RIP 키나제-의존적 기전을 통해 괴사를 유발할 수 있다[91]. 본 발명의 조성물의 투여는 TNF-α 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 질환의 치료에서 유용할 수 있고, 특히 TNF-α에 의한 발현 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 TNF-α 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물의 투여는 IL-6의 발현 증가를 야기할 수 있다. IL-6은 염증 동안 생산되고, 나이브 CD4+ T 세포의 분화 및 CD8+ T 세포의 세포독성 T 세포로의 분화를 촉진하는 전염증성 사이토카인이다[92]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-6의 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
Bettelli 등[93]은 IL-6이 Treg의 생산을 억제함을 보고하였다. 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현을 증가시켜 Treg의 수 또는 백분율을 선택적으로 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현을 증가시켜 면역자극에서 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg의 수 또는 백분율을 감소시켜 면역자극에서 사용하기 위한 것이다.
실시예는 또한 본 발명의 조성물이 T-헬퍼 세포 및 세포독성 T 림프구의 분화를 촉진함을 실증한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 T-헬퍼 세포 및/또는 세포독성 T 림프구의 분화를 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
세포 치료법
키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T) 치료법
본 발명의 조성물의 투여는 IL-6의 발현 증가를 야기할 수 있다. 증가된 Il-6 발현은 만성 림프구 백혈병의 CD19 CAR-T 치료법에 대한 반응과 관련되었다. 혈청 IL-6의 증가는 CAR-T 세포 증식과 연관된 반면, IL-6의 억제는 CAR-T 세포 증식의 억제와 연관되었다[94]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-6 발현을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 세포 치료법, 특히 CAR-T 세포 치료법에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 치료법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CAR-T 세포 치료법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 만성 림프구 백혈병의 치료에서 사용하기 위한 것이다.
Treg의 선택적 고갈은 세포독성 림프구의 유효성을 증강시키는 것으로 나타났다[95]. CAR-T 세포는 세포독성 림프구의 하위세트이며, 이에 따라 Treg의 선택적 고갈은 CAR-T 세포 치료법에서 효과적인 것으로 여겨진다. 본 발명의 조성물의 투여는 Treg를 고갈시킬 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 세포 치료법, 특히 CAR-T 세포 치료법에서 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 세포 치료법에서, 특히 세포 치료법에 대한 반응을 증강시키는 데 유용할 수 있다.
중간엽 줄기 세포(MSC) 치료법
중간엽 줄기 세포(MSC) 치료법은 면역자극 특성을 갖는 것으로 보고되었다. MSC가 LPS로 처리되는 경우, 이들은 증가된 B 세포 증식을 유도하는 전염증성 사이토카인 IL-6 및 IL-8을 상향조절한다[96]. 따라서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현을 증가시킬 수 있으므로, 이들은 MSC 세포 치료법과 조합되어 유용할 수 있다.
줄기 세포 이식 치료법
줄기 세포 이식 치료법에서 분화되지 않은 줄기 세포를 사용하는 대신, 이식 전에 어느 정도 줄기 세포를 분화시키는 것이 유익할 수 있음이 보고되었다. 예를 들어, Heng 등[97]은 줄기 세포의 심근 분화가 더 높은 그래프팅 효율, 근육세포의 증강된 재생 및 심장 기능의 증가된 복원을 가져서 유익할 수 있음을 보고하였다. 본 발명의 조성물의 투여는 분화되지 않은 신경모세포종 세포에서 신경 분화를 개시할 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 줄기 세포 이식 치료법에서 줄기 세포 분화를 위해 유용할 수 있다.
조혈 줄기 세포 이식
조혈 줄기 세포 이식은 보통 골수, 말초혈, 또는 제대혈로부터 유래되는, 다능성 조혈 줄기 세포의 이식이다. 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 전 엔테로코커스(엔테로코커스 갈리나룸 및 엔테로코커스 카셀리플라부스)로의 장 집락은 감소된 비재발 사망율로 인해 유의미하게 개선된 환자의 2년 생존율을 야기하는 것으로 나타났다[98]. 따라서, 실시예에서 나타난 면역조절 효과는 조혈 줄기 세포 이식 치료법에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식 후, 특히 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 후 생존을 개선하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 동종이형 조혈 줄기 세포 이식과 조합되어 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동종이형 조혈 줄기 세포 이식에 대해 성공적인 환자 반응을 부양하는 데 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식 전에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식을 수여받을 일정이 잡힌 환자에 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식 후에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식을 수여받은 환자에 투여하기 위한 것이다.
면역노화
Fulop 등[99]은 Treg 세포수 증가 및 B 세포수 감소가 적응 면역계에서 노화와 연관됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하거나 지연하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포수 증가를 특징으로 하는 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포수 감소를 특징으로 하는 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포수 증가 및 B 세포수 감소를 특징으로 하는 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포를 감소시켜 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포수를 증가시켜 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포수를 감소시키고 B 세포수를 증가시켜 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화에 의해 유도되는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 지연하고/하거나 예방하여 노화-관련 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
또한, 백신 아주반트가 면역노화를 극복할 수 있음이 제안되었다[100]. 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 사용하기 위해 적합하므로, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하거나 지연하기 위해 유용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로서 면역노화를 지연하고/하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로서 사용하기 위한 것이며, 여기서 조성물은 면역노화를 지연하고/하거나 예방한다.
면역노화와 연관된 질환에는 심혈관 질환, 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환, 암, 2형 진성 당뇨병[101] 및 자가면역 장애[102]가 포함된다.
투여 방식
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주사에 의해, 바람직하게는 피하 또는 대안적으로 정맥내, 또는 복강내 투여된다. 주사에 의해 투여되기 적합한 조성물에 관한 추가 상세사항은 다음 섹션에서 제공된다. 대안적인 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관에 투여되기 위한 것이다. 면역계는 위장관에서 박테리아 및 박테리아 단백질의 존재에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 조성물은 경구 투여되지만, 이들은 직장, 비강내, 또는 협측 또는 설하 경로를 통해 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 폼, 스프레이 또는 겔로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 좌약, 예컨대 직장 좌약으로, 예를 들어 테오브로마 오일(코코아 버터), 합성 경질 지방(예로 서포시르, 휘테폴), 글리세로-젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 비누 글리세린 조성물 형태로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 코위 튜브, 입위 튜브, 위 튜브, 공장조루술 튜브(J 튜브), 경피 내시경 위절개술(PEG)과 같은 튜브, 또는 위, 공장에 대한 접근을 제공하는 흉벽 포트 및 다른 적합한 접근 포트와 같은 포트를 통해 위장관에 투여된다.
본 발명의 조성물은 1회 투여될 수도 있고, 또는 치료 요법의 일환으로 순차적으로 투여될 수도 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 매일 투여되기 위한 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 치료에는 환자의 장 미생물총 평가가 수반된다.
본 발명의 조성물은 암으로 진단받았거나 암의 위험이 있는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 조성물은 또한 건강한 환자에서 암의 발생을 예방하기 위한 예방적 조치로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비정상 장 미생물총을 갖는 것으로 확인된 환자에 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 엔테로코커스 속, 특히 엔테로코커스 갈리나룸의 집락이 감소되었거나 없을 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 인간의 치료를 위한 것이지만, 이들은 가금, 돼지, 고양이, 개, 고양이, 말 또는 토끼와 같은 단위 포유류를 포함하는 동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물의 성장 및 수행능력을 증강시키기 위해 유용할 수 있다. 동물에 투여되는 경우, 경구 급식이 사용될 수 있다.
조성물
일반적으로, 본 발명의 조성물은 엔테로코커스 속으로부터의, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 플라겔린의 내장으로의 전달을 가능하게 하기 위해 캡슐화된다. 캡슐화는, 예를 들어 pH 변화에 의해 유발될 수 있는, 압력, 효소 활성, 또는 물리적 붕해와 같은 화학적 또는 물리적 자극으로의 파열을 통해, 표적 위치에서의 전달 시까지 조성물을 분해로부터 보호한다. 임의의 적절한 캡슐화 방법이 사용될 수 있다. 예시적 캡슐화 기법에는 다공성 매트릭스 내의 포획, 고체 담체 표면 상의 부착 또는 흡착, 응결에 의한 또는 가교제로의 자가-응집, 및 마이크로다공성 막 또는 마이크로캡슐로의 기계적 봉쇄가 포함된다.
따라서 조성물은 약학적으로 허용 가능할 수 있다. 이들에는 보통 플라겔린 폴리펩타이드(또는 핵산)에 부가한 성분이 포함될 것이며, 예로 이들에는 전형적으로 하나 이상의 약학 담체(들) 및/또는 부형제(들)가 포함된다.
조성물은 수성 형태로 인간에 투여될 수 있다. 그러나 이러한 구현예에서, 투여 전에, 조성물은 비수성 형태로 있었을 수 있다. 예를 들어, 일부 치료제는 수성 형태로 제조된 후 또한 수성 형태로 충전되고 배포되고 투여되지만, 다른 치료제는 제조 동안 동결건조되고 사용 시 수성 형태로 재구성된다. 따라서 본 발명의 조성물은 예컨대 동결건조된 제형으로, 건조될 수 있다.
조성물에는 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제가 포함될 수 있다. 그러나, 치료제에 수은성 물질이 실질적으로 없는(즉 5 ㎍/ml 미만인), 예로 티오메르살이 없는 것이 바람직하다. 수은을 함유하지 않는 치료제가 보다 전형적이다. 보존제가 없는 치료제가 특히 선호된다.
열 안정성을 개선하기 위해, 조성물에는 온도 보호제가 포함될 수 있다. 이러한 제제의 추가 상세사항이 아래에 제공된다.
긴장성을 제어하기 위해, 나트륨 염과 같은 생리적 염을 포함하는 것이 전형적이다. 나트륨 클로라이드(NaCl)가 일반적으로 사용되며, 이는 1 내지 20 mg/ml, 예로 약 10±2 mg/ml NaCl로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염에는 칼륨 클로라이드, 칼륨 2수소 포스페이트, 2나트륨 포스페이트 탈수화물, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드 등이 포함된다.
조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 보다 종종 240~360 mOsm/kg의 삼투압을 가질 것이며, 전형적으로 290~310 mOsm/kg의 범위에 속할 것이다.
조성물에는 하나 이상의 완충액이 포함될 수 있다. 전형적인 완충액에는 포스페이트 완충액; 트리스 완충액; 보레이트 완충액; 숙시네이트 완충액; (특히 알루미늄 하이드록사이드 아주반트를 함유하는) 히스티딘 완충액; 또는 시트레이트 완충액이 포함된다. 완충액은 전형적으로 5~20 mM 범위로 포함될 것이다.
조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 보다 전형적으로 6.0 내지 8.0, 예로 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다.
조성물은 전형적으로 멸균성이다. 조성물은 또한 전형적으로 비-발열성, 예로 용량 당 1 EU(내독소 단위, 표준 척도) 미만, 예를 들어 용량 당 0.1 EU 미만을 함유할 것이다. 조성물은 종종 글루텐을 함유하지 않는다.
조성물에는 단회 투여용 물질이 포함될 수도 있고, 또는 다회 투여용 물질이 포함될 수도 있다(즉, '다용량' 키트). 보존제의 도입은 다용량 배열에서 전형적이다. 다용량 조성물에서 보존제의 도입에 대한 대안으로서(또는 이에 부가하여), 조성물은 물질 제거용 무균 어댑터를 갖는 용기에 함유될 수 있다.
인간 단백질 치료제는 전형적으로 약 0.5 ml의 투여량 부피로 투여되지만, 어린이에게는 절반 용량(즉 약 0.25 ml)이 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 면역조절제를 포함할 수 있다. 종종, 하나 이상의 면역조절제에는 하나 이상의 아주반트가 포함된다. 아주반트에는 아래에서 추가 논의되는, TH1 아주반트 및/또는 TH2 아주반트가 포함될 수 있다.
조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사제로 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다(예로 동결건조된 조성물 또는 분무-냉동 건조된 조성물). 조성물은 국소 투여를 위해, 예로 연고, 크림 또는 분말로 제조될 수 있다. 조성물은 경구 투여를 위해, 예로 정제 또는 캡슐로, 스프레이로, 또는 시럽으로(선택적으로 풍미첨가되어) 제조될 수 있다. 조성물은 폐 투여를 위해, 예로 흡입제로서, 미세 분말 또는 스프레이를 사용하여 제조될 수 있다. 조성물은 좌약 또는 페사리로 제조될 수 있다. 조성물은 비강, 귀 또는 눈 투여를 위해, 예로 점적제로 제조될 수 있다. 조성물은 조합된 조성물이 포유류로의 투여 직전에 재구성되도록 설계된, 키트 형태일 수 있다. 이러한 키트는 액체 형태의 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 동결건조된 항원을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물에 존재하는 본 발명의 플라겔린은 하나 이상의 항원에 융합되거나 콘주게이션될 수 있다.
조성물이 사용 전에 외부 제조되어야 하고(예로, 성분이 동결건조된 형태로 제공되고) 키트로 제공되는 경우, 키트는 2개의 바이알을 포함할 수도 있고, 하나의 충전-준비된 주사기 및 하나의 바이알을 포함할 수도 있고, 주사기의 내용물이 주사 전에 바이알의 내용물을 재활성화하기 위해 사용된다.
치료제로 사용되는 조성물은 면역학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 인코딩 핵산뿐만 아니라 필요에 따라 임의의 다른 성분을 포함한다. '면역학적 유효량'이란, 단회 용량 또는 시리즈의 일환으로서, 개체에 대한 그 양의 투여가 치료 또는 예방에 효과적임을 의미한다. 상기 양은 치료받는 개체의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료받는 개체의 분류군(예로 비-인간 영장류, 영장류 등), 개체의 면역계가 항체를 합성하는 능력, 요망되는 보호 범위, 백신의 제형, 의학적 상태에 대한 치료의의 평가, 및 기타 관련 요인에 따라 변한다. 그 양은 일상적 실험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것임이 예상된다. 하나를 초과하는 항원이 조성물에 포함되는 경우, 2개의 항원은 서로 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 제공될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 조성물에는 온도 보호제가 포함될 수 있고, 상기 성분은 아주반트 처리된 조성물(특히, 알루미늄 염과 같은 미네랄 아주반트를 함유하는 조성물)에서 특히 유용할 수 있다. 참고문헌[103]에 기재된 바와 같이, 액체 온도 보호제는 그 동결점을 낮추기 위해, 예로 동결점을 0℃ 미만으로 감소시키기 위해 수성 백신 조성물에 첨가될 수 있다. 따라서, 조성물은 0℃ 미만으로 보관될 수 있지만, 그 열 파괴를 억제하기 위해 그 동결점 초과에서 보관할 수 있다. 온도 보호제는 또한 냉동 및 해동 후 응집 및 침강에 대해 미네랄 염 아주반트를 보호하면서 조성물의 냉동을 허용하고, 또한 승온, 예로 40℃ 초과에서 조성물을 보호할 수 있다. 원료 수성 백신 및 액체 온도 보호제는 액체 온도 보호제가 최종 혼합물의 1~80부피%를 형성하도록 혼합될 수 있다. 적합한 온도 보호제는 인간 투여를 위해 안전하고, 수중에서 쉽게 혼화성/가용성이어야 하며, 조성물 중 다른 성분(예로 항원 및 아주반트)을 손상시키지 않아야 한다. 예에는 글리세린, 프로필렌 글리콜, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 적합한 PEG는 200~20,000 Da 범위의 평균 분자량을 가질 수 있다. 하나의 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 Da의 평균 분자량을 가질 수 있다('PEG-300').
본 발명은 (i) 하나 이상의 플라겔린 폴리펩타이드(들); 및 (ii) 온도 보호제를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 (i) 하나 이상의 항원(들)을 포함하는 수성 조성물을, (ii) 온도 보호제와 혼합하여 형성될 수 있다. 이어서 혼합물은 예로 0℃ 미만, 0~20℃, 20~35℃, 35~55℃ 이상에서 보관될 수 있다. 이는 액체 또는 냉동 형태로 보관될 수 있다. 혼합물은 동결건조될 수 있다. 조성물은 대안적으로 (i) 하나 이상의 항원(들)을 포함하는 건조된 조성물을, (ii) 온도 보호제를 포함하는 액체 조성물과 혼합하여 형성될 수 있다. 따라서 성분 (ii)가 성분 (i)을 재구성하기 위해 사용될 수 있다.
조성물은 경구 투여될 수 있고 정제, 캡슐 또는 분말의 형태일 수 있다. 다른 성분(예컨대 비타민 C)이 전달 및/또는 생체내 부분적 또는 전체 집락 및 생존을 개선하기 위해 프리바이오틱 기질 및 산소 스캐빈저로서 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물에는 치료 유효량의 본 발명의 플라겔린 폴리펩타이드가 포함된다. 치료 유효량의 플라겔린 폴리펩타이드는 환자 상에서 유익한 효과를 발휘하는 데 충분하다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 적합한 부형제의 예는 참고문헌[104]에서 확인될 수 있다. 치료 용도를 위해 허용 가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 참고문헌[105]에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예에는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 소르비톨 등이 포함된다. 적합한 희석제의 예에는 에탄올, 글리세롤 및 물이 포함된다. 약학 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도되는 투여 경로 및 표준 약학 실시에 관해 선택될 수 있다. 약학 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 이에 부가하여, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예에는 전분, 젤라틴, 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제와 같은 천연당, 아카시아, 트래거캔스 또는 나트륨 알기네이트와 같은 천연 및 합성 검, 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 적합한 윤활제의 예에는 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드 등이 포함된다. 보존제, 안정화제, 염료 그리고 심지어 풍미제가 약학 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예에는 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르가 포함된다. 항산화제 및 현탁화제도 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 하나를 초과하는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 서열 번호 1을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 추가의 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 서열 번호 1을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 서열 번호 1을 갖는 플라겔린 폴리펩타이드 및 서열 번호 2~42로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 45개의 엔테로코커스 속으로부터의, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종(예로 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 미만 균주)으로부터의 50개 미만의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하며, 선택적으로, 임의의 다른 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종으로부터의 1~40, 1~30, 1~20, 1~19, 1~18, 1~15, 1~10, 1~9, 1~8, 1~7, 1~6, 1~5, 1~4, 1~3, 1~2, 2~50, 2~40, 2~30, 2~20, 2~15, 2~10, 2~5, 6~30, 6~15, 16~25, 또는 31~50개 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하며, 선택적으로, 임의의 다른 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 함유하지 않는다.
본 발명의 조성물이 하나를 초과하는 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 일부 구현예에서, 개별 플라겔린 폴리펩타이드는 별도의, 동시적 또는 순차적 투여를 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 모든 플라겔린 폴리펩타이드를 포함할 수도 있고, 또는 플라겔린 폴리펩타이드가 별도로 보관되고 별도로, 동시적으로 또는 순차적으로 투여될 수도 있다. 일부 구현예에서, 하나를 초과하는 플라겔린 폴리펩타이드는 별도 보관되지만 사용 전에 함께 혼합된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 시판 승인을 필요로 할 수도 있고 필요로 하지 않을 수도 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 유방암이다. 바람직한 구현예에서 암은 유방암종이다. 바람직한 구현예에서 암은 IV기 유방암이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 폐암이다. 바람직한 구현예에서 암은 폐암종이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 간암이다. 바람직한 구현예에서 암은 간암(간세포암종)이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 결장암이다. 바람직한 구현예에서 암은 결장직장 선암종이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 암종이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 비-면역원성 암이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 면역원성 암이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 비-소세포 폐암종, 소세포 폐암종, 편평상피세포 암종, 선암종, 샘 종양, 유암종 종양 분화되지 않은 암종으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 간모세포종, 쓸개관암종, 쓸개세포 낭선암종 또는 바이러스 감염으로 유도되는 간암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 침습적 도관 암종, 원 위치 도관 암종 또는 침습적 소엽 암종으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용되는 플라겔린 폴리펩타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 플라겔린 폴리펩타이드는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이고; 장애는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병, 부신피질암종, 기저-세포암종, 담관암, 방광암, 뼈 종양, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 교종, 뇌 종양, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 교종, 뇌실막종, 수모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 유방암, 기관지선종/유암종, 버키트 림프종, 유암종 종양, 경부암, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 뇌실막종, 식도암, 어윙 육종, 안내 흑색종, 망막모세포종, 담낭암, 위암, 위장관 유암종 종양, 위장관 간질 종양(GIST), 생식 세포 종양, 교종, 아동 시각 경로 및 시상하부, 호지킨 림프종, 흑색종, 섬 세포 암종, 카포시 육종, 신장 세포암, 후두암, 백혈병, 림프종, 중피종, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 입인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상샘암, 인두암, 뇌하수체 선종, 혈장 세포 신생물, 전립샘암, 신장 세포 암종, 망막모세포종, 육종, 정소암, 갑상샘암, 또는 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
핵산(예로 핵산-기반 치료제)의 용량은 100 ㎍ 이하의 핵산; 예로 10~100 ㎍, 예컨대 약 10 ㎍, 25 ㎍, 50 ㎍, 75 ㎍ 또는 100 ㎍을 가질 수 있지만, 발현은 훨씬 더 낮은 수준으로; 예로 1 ㎍/용량 이하, 100 ng/용량 이하, 10 ng/용량 이하, 1 ng/용량 이하 등을 사용하여 나타날 수 있다. 유사하게, 단백질 항원의 용량은 100 ㎍ 이하의 단백질; 예로 10~100 ㎍, 예컨대 약 10 ㎍, 25 ㎍, 50 ㎍, 75 ㎍ 또는 100 ㎍을 가질 수 있다. 폴리펩타이드는 약 0.1~10 mg/체중kg의 용량으로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 단회 용량으로 또는 보다 바람직하게는 반복 용량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 반복 용량은 약 2, 5, 10, 7, 10 또는 15일마다 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 대상체에 100 ㎍/체중kg, 200 ㎍/체중kg, 300 ㎍/체중kg, 400 ㎍/체중kg, 500 ㎍/체중kg, 1 mg/체중kg, 2 mg/체중kg, 5 mg/체중kg, 10 mg/체중kg, 20 mg/체중kg, 30 mg/체중kg, 50 mg/체중kg, 100 mg/체중kg, 200 mg/체중kg 또는 500 mg/체중kg의 용량으로 투여된다. 적합한 단위 용량에는 1 mg, 2 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 1000 mg, 100~500 mg, 500~1000 mg, 200~400 mg, 5-00~750 mg, 750~1000 mg이 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다. 예를 들어 성인 인간에 대한, 숙주 세포의 적합한 1일 용량은 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 콜로니 형성 단위(CFU); 예를 들어, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010 CFU일 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 조성물의 중량에 대해 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/g; 예를 들어, 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU/g의 양으로 숙주 세포를 함유한다. 용량은, 예를 들어, 1 g, 3 g, 5 g, 및 10 g일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 살아있는 숙주 세포 및 사멸된 숙주 세포의 혼합물을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 경구, 직장, 피하, 비강, 협측, 설하, 피하, 정맥내, 및 근육내로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 투여된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨 및 소르비톨로 구성되는 군으로부터 선택되는 담체를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 에탄올, 글리세롤 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 희석제를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 전분, 젤라틴, 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래거캔스, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 부형제를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 보존제, 항산화제 및 안정화제 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르로 구성되는 군으로부터 선택되는 보존제를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물이 약 4℃ 또는 약 25℃에서 밀봉된 용기에 보관되고 용기가 50% 상대 습도를 갖는 분위기에 배치되는 경우, 콜로니 형성 단위로 측정되는 적어도 80%의 박테리아 균주가 적어도 약 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 1.5년, 2년, 2.5년 또는 3년의 기간 후 유지된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에서 기재되는 조성물을 포함하는 밀봉된 용기에 제공된다. 일부 구현예에서, 밀봉된 용기는 사체트 또는 병이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에서 기재되는 조성물을 포함하는 주사기에 제공된다.
본 발명의 조성물은, 일부 구현예에서, 약학 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 정제 또는 캡슐로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 캡슐은 젤라틴 캡슐("젤-캡")이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여된다. 경구 투여에는 연하가 관여되어 화합물이 위장관으로 들어가고/가거나 화합물이 입으로부터 직접 혈류로 들어가는 협측, 혀, 또는 설하 투여가 관여될 수 있다.
경구 투여에 적합한 약학 제형에는 고체 플러그, 고체 마이크로미립자, 반-고체 및 액체(다중상 또는 분산계 포함), 예컨대 정제; 다중- 또는 나노-미립자를 함유하는 연질 또는 경질 캡슐, 액체(예로 수용액), 에멀젼 또는 분말; 로젠지(액체-충전 포함); 츄; 겔; 신속 분산 투여형; 필름; 소란; 스프레이; 및 볼/점막접착성 패치가 포함된다.
일부 구현예에서 약학 제형은 장용성 제형, 즉, 본 발명의 조성물의 경구 투여에 의한 내장으로의 전달에 적합한 위-내성 제형(예를 들어, 위 pH 내성)이다. 장용성 제형은 박테리아 또는 조성물의 또 다른 성분이 산-민감성인, 예로 위 조건 하에 분해되기 쉬운 경우 특히 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 장용성 제형은 장용성 코팅을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 장용성-코팅 투여형이다. 예를 들어, 제형은 장용성-코팅 정제 또는 장용성-코팅 캡슐 등일 수 있다. 장용성 코팅은 통상적인 장용성 코팅, 예를 들어, 경구 전달용 정제, 캡슐 등을 위한 통상적 코팅일 수 있다. 제형은 필름 코팅, 예를 들어, 장용성 중합체, 예로 산-불용성 중합체의 박막층을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 장용성 제형은 내재적으로 장용성으로, 예를 들어, 장용성 코팅이 필요 없는 위-내성이다. 따라서, 일부 구현예에서, 제형은 장용성 코팅을 포함하지 않는 장용성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 열겔화 물질로부터 제조된 캡슐이다. 일부 구현예에서, 열겔화 물질은 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC)와 같은 셀룰로스계 물질이다. 일부 구현예에서, 캡슐은 임의의 필름 형성 중합체를 함유하지 않는 셸을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐은 셸을 포함하며 셸은 하이드록시프로필메틸셀룰로스를 포함하고 임의의 필름 형성 중합체를 포함하지 않는다(예로 [106] 참고). 일부 구현예에서, 제형은 내재적으로 장용성인 캡슐(예를 들어, Capsugel의 VCaps®)이다.
일부 구현예에서, 제형은 연질 캡슐이다. 연질 캡슐은 캡슐 셸에 존재하는 글리세롤, 소르비톨, 말티톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 연화제의 첨가로 인해 특정 탄성 및 연성을 가질 수 있는 캡슐이다. 연질 캡슐은, 예를 들어, 젤라틴 또는 전분이 기반하여 제조될 수 있다. 젤라틴-기반 연질 캡슐은 다양한 공급업체로부터 상업적으로 이용 가능하다. 경구 또는 직장과 같은 투여 방법에 따라, 연질 캡슐은 다양한 형태를 가질 수 있고, 이들은, 예를 들어, 원형, 타원형, 장방형 또는 어뢰형일 수 있다. 연질 캡슐은 Scherer 공정, Accogel 공정 또는 액적 또는 취입 공정과 같은 통상적 공정에 의해 제조될 수 있다.
일반사항
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당분야의 기술 수준 내의 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 통상적 방법을 채택할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예로, 참고문헌[107] 및 [108~114] 등을 참고한다.
용어 "포함하는"은 "포함되는"뿐만 아니라 "구성되는"을 포괄하며, 예로 X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 구성될 수도 있고 일부 추가부분, 예로 X + Y가 포함될 수도 있다.
수치값 x에 관해 용어 "약"이란 선택적이며, 예를 들어, x±10%를 의미한다.
용어 "실질적으로"에는 "완전히"가 배제되지 않으며, 예로 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.
용어 "엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드"는 면역자극 특성을 나타내는, 예를 들어 TLR5 반응을 효과적으로 활성화할 수 있는 야생형 플라겔린 폴리펩타이드 및 돌연변이된 플라겔린 폴리펩타이드를 포괄한다. 용어 "플라겔린 폴리펩타이드"는 또한 면역자극 특성을 나타내는, 예를 들어 TLR5 반응을 효과적으로 활성화할 수 있는 야생형 플라겔린 폴리펩타이드 및 돌연변이된 플라겔린 폴리펩타이드의 단편을 포괄한다.
2개의 단백질 서열 간 서열 동일성 백분율에 대한 언급은, 정렬되는 경우, 해당 백분율의 아미노산 잔기가 2개 서열의 비교에서 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 상동성% 또는 서열 동일성%는 당분야에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 참고문헌[115]에 기재된 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 방법은 단백질 서열의 MUSCLE 정렬을 사용하며, Geneious(78.02% 페어식 동일성), Blossom62 스코어 매트릭스, 역치=1로 수행될 수 있다.
2개의 뉴클레오타이드 서열 간 서열 동일성 백분율에 대한 언급은, 정렬되는 경우, 해당 백분율의 뉴클레오타이드가 2개 서열의 비교에서 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 상동성% 또는 서열 동일성%는 당분야에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 참고문헌[116]의 섹션 7.7.18에 기재된 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 갭 개방 페널티 12 및 갭 연장 페널티 2, BLOSUM 매트릭스 62로 affine 갭 검색을 사용하여 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 참고문헌[117]에 개시되어 있다.
일반적으로, (예를 들어 단편에 관해) 달리 명시되지 않는 한, 서열 동일성은 쿼리 서열의 길이에 걸쳐서가 아니라 참조 서열(예를 들어 서열 번호 1)의 길이에 걸쳐 계산된다. 따라서, 짧고 관련되지 않은 서열은 본 발명의 서열과 높은 서열 동일성을 갖는 것으로 간주되지 않는다.
구체적으로 언급되지 않는 한, 여러 단계를 포함하는 공정 또는 방법은 방법의 시작 또는 종료 시 추가 단계를 포함할 수도 있고, 또는 추가적인 개재 단계를 포함할 수도 있다. 또한, 단계는 적절한 경우 조합되거나, 생략되거나, 대안적인 순서로 수행될 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예가 본원에 기재된다. 각각의 구현예에서 명시되는 특징이 다른 특정된 특징과 조합되어 추가 구현예를 제공할 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 본원에서 적합하거나, 전형적이거나, 바람직한 것으로 강조되는 구현예는 (서로 상호 배타적인 경우를 제외하고) 서로 조합될 수 있다.
발명을 수행하기 위한 양태
실시예 1 - MRx0518에 의한 TLR5 리포터 세포의 활성화
요약
본 연구는 TLR5 리포터 세포를 활성화하는 박테리아 균주 MRx0518의 유효성을 평가하였다.
TLR5 활성화 검정
HEK-Blue TLR5 세포는 인간 TLR5 유전자 및 유도성 SEAP(분비된 배아 알칼리성 포스파타제) 리포터 유전자로 공동-전달감염된 HEK293 세포이다. SEAP 유전자는 5개의 NF-κB 및 AP-1-결합 부위에 융합된 IFN-β 최소 프로모터의 제어 하에 배치된다. TLR5 리간드로의 자극은 SEAP의 생산을 유도하는 NF-κB 및 AP-1을 활성화한다. 따라서 알칼리성 포스파타제의 수준은 TLR5 활성과 관련된다.
· 물질
리포터 세포주: HEK-Blue hTLR5(Invivogen, hkb-htlr5)
세포 성장 배지: 10%(v/v) FBS(Sigma, F9665), 4 mM L-글루타민(Sigma, G7513), 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신(Sigma, P4333), 100 ug/ml 노르모신(Invivogen, ant-nr-1) 및 선택적 항생제 블라스티시딘(30 ug/ml, Invivogen, ant-bl-05) 및 제오신(100 ug/ml, Invivogen, ant-zn-1)이 보충된 DMEM(Sigma, D6171)
항생제-비함유 배지: 10%(v/v) FBS 및 4 mM L-글루타민이 보충된 DMEM
· 박테리아 성장 조건
박테리아 성장 조건: 모든 엔테로코커스 갈리나룸 MRx0518 배양을 혐기성 조건 하에 37℃에서 효모 추출물-카제인 가수분해물-지방산(YCFA) 배양액(E&O Laboratories, UK) 중에 성장시켰다.
정지상 MRx0518 세포: 균주 MRx0518의 16~18시간 배양을 -80℃에서의 작업 세포 은행으로 냉동 보관된 MRx0518 세포의 1% 접종물을 사용하여 상술된 조건 하에 성장시켰다.
후기-로그상 MRx0518 세포: 균주 MRx0518의 (대략) 3시간 배양을 정지상 MRx0518 세포의 10% 접종물을 사용하여 상술된 조건 하에 성장시켰다.
· 절차
TLR5 활성화 검정을 2개 투여량 - 10:1(3x105 박테리아) 또는 100:1(3x106 박테리아)로 하기 처리로 수행하였다:
- 살아있는 MRx0518 박테리아
- 열 사멸된 MRx0518 박테리아
- MRx0518로부터의 CFS
양성 대조군은 20 ng/ml 및 5 ng/ml 농도의 초순수 FLA-ST로 수행하였다 음성 대조군은 리포터 세포 이외의 세포에 의한 알칼리성 포스파타제의 생산을 제어하기 위해 리포터 세포를 함유하지 않는 항생제-비함유 배지로 수행하였다. 2개의 추가 대조군은 YCFA 및 물로 수행하였다. 모든 처리에 대해 3개 반복물로 수행하였다.
· 살아있는 및 세포-비함유 상청액(CFS) MRx0518의 제조
살아있는 및 CFS 처리는 모두 실온에서 5분 동안 5000xg에서 세포의 원심분리 후 후기-로그상 MRx0518 세포의 하나의 10 ml 배양으로부터 제조하였다. 박테리아 펠렛을 PBS(Sigma, D8537) 중에 1회 세척하고 추정 밀도 1.4x108 CFU/ml(2배 희석) 및 1.4x107 CFU/ml(20배 희석)로 항생제-비함유 배지 중에 재현탁하였다. 박테리아 상청액을 수집하고, 멸균 조건 하에 여과하고(0.22 um) H2O(Sigma, W3500)를 사용해서 10배 및 20배 희석하여 상기 개략된 박테리아 현탁액에 대한 당량을 제공하였다. CFS는 상청액 내로 흘린 MRx0518 편모를 함유한다.
· 열 사멸된(HK) 세포의 제조
별도로, 40분 동안 80℃에서 후기-로그상 MRx0518 세포의 10 ml 배양을 인큐베이션하여 HK 세포를 생성하였다. 원심분리(상술된 조건) 후, 배양 상청액을 폐기하고 세포 펠렛을 PBS(Sigma, D8537) 중에 1회 세척하고 추정 밀도 1.4x108 CFU/ml(2배 희석) 및 1.4x107 CFU/ml(20배 희석)로 항생제-비함유 배지 중에 재현탁하였다. 제조되면, 모든 처리를 사용 전에 얼음 상에 보관하였다. 모든 살아있는 및 열-사멸 MRx0518 세포 제조물에 대해 ml 당 생활성 세포수를 결정하였다.
· 양성 대조군의 제조
TLR5의 알려진 작용제인 살모넬라 타이피무리움 플라겔린(초순수, Invitrogen, tlrl-epsitfla의 FLA-ST ultrapure)을 H2O 중 200 ng/ml 또는 50 ng/ml로 제조하였다.
· TLR5 검정 조건
20 ㎕의 적절한 처리(박테리아 세포, 세포-비함유 상청액, 양성 대조군 리간드, 재조합 플라겔린, 음성 대조군, 예로 YCFA, 항생제-비함유 배지, H2O, PBS)를 96웰 세포 배양 플레이트(Sigma, CLS3596)에서 2개씩 또는 3개씩 플레이트 접종하였다. 180 ㎕의 리포터 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하여 최종 부피 200 ul 및 최종 농도 3x104의 HEK-blue TLR5 세포를 얻었다. 검정을 22 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 20 ㎕의 검정을 새로운 96웰 플레이트에서 180 ㎕의 Quantiblue(Invivogen, rep-qb1) 기질에 첨가하고 2 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. Quantiblue-함유 플레이트를 655 nm 광학 밀도 판독을 취해 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad, iMark) 상에서 조영하였다. 결과를 기술적 반복물로부터 평균낸 후 독립 실험을 평균내어 최종 그래프에 대한 데이터를 제공하였다.
결론
살아있는 및 열 불활성화된 MRx0518로의 처리는 중간 수준 및 고수준의 TLR5 반응을 야기하였다. 이들 데이터는 MRx0518 균주가 TLR5 반응을 유도할 수 있고 상기 반응이 열 불활성화에 의해 제거되지 않음을 나타낸다. 이들 데이터는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린, 특히 MRx0518 플라겔린이 TLR5 반응을 유발할 수 있고 플라겔린은 열 안정함을 제시한다.
가장 높은 수준의 TLR5 활성은 MRx0518-CFS로의 처리 후에 관찰되었고 알려진 TLR5 작용제 FLA-ST보다도 높았다(도 6). CFS는 상청액 내로 흘린 MRx0518 편모를 함유한다. 이들 데이터는 엔테로코커스 속, 특히 MRx0518로부터의 플라겔린이 매우 강력한 TLR5 반응을 생성하며, 이에 따라 치료법에서, 특히 암 치료에서 유용할 수 있음을 나타낸다. 이들 데이터는 또한 MRx0518이 상청액 내로 그 플라겔린을 흘리는 데 효과적임을 나타낸다.
실시예 2 - CFS에 의한 TLR5 활성화가 MRx0518에 있어서 특히 강력함
요약
본 연구는 CFS를 사용한 TLR5 활성화가 균주 간에 다른지를 평가하였다. MRx0518 및 DSM100110은 둘 다 편모를 가진 엔테로코커스 갈리나룸 균주이다. 이들 두 균주로부터의 CFS가 TLR5 반응을 야기하는지를 관찰하기 위해 연구를 수행하였다.
TLR5 활성화 검정
실시예 1에 기재된 바와 같이 TLR5 검정을 수행하였다.
· 절차
TLR5 활성화 검정을 2개 투여량 - 10:1 및 100:1로 하기 처리로 수행하였다:
- MRx0518-CFS
- DSM100110-CFS
3개의 음성 대조군은 항생제-비함유 배지, YCFA 및 물로 수행하였다. 양성 대조군은 20 ng/ml 농도의 초순수 FLA-ST로 수행하였다. 모든 처리에 대해 3개 반복물로 수행하였다.
결론
MRx0518-CFS는 높은 TLR5 반응을 자극할 수 있었다. DSM100110-CFS도 100:1의 MOI로 TLR5 반응을 일으켰으나, 이는 MRx0518-CFS에 비해 감소되었다. 이들 데이터는 두 균주로부터의 상청액이 모두 면역자극 반응을 유발했으나, 이는 균주별로 다르다는 것을 나타낸다. 균주 MRx0518 및 DSM100110이 둘 다 편모를 가진 엔테로코커스 갈리나룸 균주였으므로 이들 데이터는 놀라운 것이다. 아마도 MRx0518이 다른 엔테로코커스 갈리나룸 균주에 비해 상청액 내로 그 플라겐린을 흘리는 개선된 능력을 가지므로, MRx0518-CFS는 DSM100110-CFS에 비해 더 높은 TLR5 반응을 일으키며, 이는 이것을 치료법에서 특히 유용하게 만든다.
이들 데이터는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 암, 특히 유방암, 결장직장암 및 위암과 같이 TLR5와 연관된 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위해 효과적일 수 있음을 제시한다.
실시예 3 - 트립신 처리 후 TLR5 활성화
요약
본 연구는 TLR5의 MRx0518-CFS 활성화가 트립신-의존적인지를 평가하였다.
TLR5 활성화 검정
실시예 1에 기재된 바와 같이 TLR5 검정을 수행하였다.
· 절차
TLR5 활성화 검정을 단독으로 또는 트립신과의 조합으로 2개 투여량 - 10:1 또는 100:1로 하기 처리로 수행하였다:
- MRx0518-CFS
- DSM100110-CFS
- YCFA
모든 처리에 대해 3개 반복물로 수행하였다.
CFS를 500 ㎍/ml 트립신(0.22 um 여과됨, Sigma, T3924), 또는 모의 소화 대조군으로 동등 부피의 트립신 비히클(행크 균형 염 용액, Fisher Scientific, 1175129)을 37℃, 5% CO2에서 1 hr 동안 소화시켰다. 인큐베이션 후 소화된 및 모의 소화된 CFS 샘플에 FBS를 10%(v/v)의 최종 농도로 보충하여 트립신 활성을 억제하였다.
3개의 음성 대조군은 항생제-비함유 배지, HBSS 및 물로 수행하였다. 양성 대조군은 20 ng/ml 농도의 초순수 FLA-ST로 수행하였다.
결론
MRx0518-CFS에 의한 TLR5 활성화는 트립신으로의 처리에 의해 폐지되었다(도 8). 이들 데이터는 TLR5 반응이 MRx0518-CFS에서 단백질에 의해 활성화됨을 나타낸다. 트립신에 의한 이들 단백질의 분해는 TLR5 반응을 폐지한다. MRx0518 플라겔린 단백질(FlaAMRx0518)은 36개의 트립신 절단 부위를 함유하며, 그 중 일부는 TLR5 상호작용 도메인에 배치되어 있다.
실시예 4 - 정제된 플라겔린 단백질로의 TLR5 활성화
요약
본 연구는 정제된 MRx0518 및 DSM100110 플라겔린의 자극 프로필을 평가하였다.
재조합 플라겔린 단백질의 제조
클로닝 전략의 개요를 도 9a에 나타낸다. MRx0518 및 DSM100110 플라겔린에 대한 전장 유전자를 제한 효소 소화를 사용하여 재조합 발현 작제물 pQE-30(N-말단 6xHis 태그를 가짐) 내로 클로닝하여 pQE-30-FlaAMRx0518 및 pQE-30-FlaADSM100110 작제물을 생성하였다. 양성 대조군은 당분야에 잘 알려져 있는 콜로니 PCR, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석 기법을 사용해서 확인하였다.
재조합 플라겔린 단백질, FlaAMRx0518 및 FlaADSM100110을 대장균에서 발현하고 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 및 이미다졸 용출을 사용해서 정제한 후 내독소를 제거하였다(아래의 표 참고). 이로써 최소 내독소 수준을 갖는 고순도 제조물을 생성한다. 단백질의 크기 및 순도는 SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인하였다(도 9b).
Figure pct00001
정제된 재조합 FlaA MRx0518 및 FlaA DSM100110 단백질에 대한 용량 반응
실시예 1에 기재된 바와 같이 TLR5 검정을 수행하였다.
· 절차
TLR5 활성화 검정을 하기 처리로 수행하였다:
· 5, 1, 0.2, 0.04 및 0.008 ng/ml 농도의 정제된 재조합 FlaAMRx0518
· 5, 1, 0.2, 0.04 및 0.008 ng/ml 농도의 정제된 재조합 FlaADSM100110
음성 대조군은 5 ng/ml 농도의 FLA 비히클로 수행하였고 양성 대조군은 20 ng/ml 농도의 초순수 FLA-ST로 수행하였다. 각각의 처리에 대해 3개 반복물로 수행하였다.
결론
재조합 FlaAMRx0518 및 FlaADSM100110은 모두 TLR5 반응을 활성화할 수 있다. 도 10은 실시예 3 및 4에 기재된 처리로 상이한 투여량의 재조합 FlaAMRx0518 및 FlaADSM100110으로의 TLR5 활성화를 비교한다. 5 ng/ml 농도에서, 두 재조합 플라겔린 단백질은 모두 더 높은 농도(20 ng/ml)로 사용되는 잘 알려진 TLR5 작용제 FLA-ST에 의해 일어난 것보다 높은 TLR5 반응을 일으킬 수 있다. 이들 데이터는 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 살모넬라 타이피무리움에서보다 TLR5 반응을 활성화하는 데 더 효과적임을 나타낸다. 살모넬라 타이피무리움으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 TLR5 활성화를 통해 종양 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이들 데이터는 엔테로코커스 갈리나룸으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 암을 치료하거나 예방하는 데 있어서 살모넬라 타이피무리움으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드보다 더 효과적임을 제시한다.
FlaAMRx0518 및 FlaADSM100110은 상이한 면역자극 프로필을 갖는다. 1 ng/ml 및 0.2 ng/ml의 농도에서 FlaAMRx0518은 FlaADSM100110보다 대략 5배 더 강력한 TLR5 반응을 일으킨다. MRx0518 및 DSM100110은 둘 다 매우 관련된 균주이다. 둘 다 편모를 가진 엔테로코커스 갈리나룸 균주지만, 이들은 상이한 면역자극 프로필을 갖는 기본적으로 상이한 플라겔린을 발현한다. FlaAMRx0518이 강력한 TLR5 활성화제라는 놀라운 발견은 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 암을 치료하거나 예방하는 데 특히 효과적임을 나타낸다.
이들 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 TLR5에 대한 작용제임을 실증한다. TLR5 작용제는 T 및 B 세포 림프종의 치료에 시사되었다. 따라서, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 T 및 B 세포 림프종을 치료하거나 예방하는 데 특히 효과적일 수 있다.
TLR5 활성화는 방사선 유도된 조직 손상을 완화하는 것으로 나타났다. 실시예는 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드가 TLR5 반응의 강력한 활성화제임을 나타낸다. 따라서, 엔테로코커스 속, 특히 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드는 방사선 유도된 조직 손상을 완화하는 데 특히 효과적일 수 있다.
실시예 5 - MRx0518 flaA - 돌연변이체의 제조
요약
플라겔린 유전자가 손상된 MRx0518의 삽입 돌연변이체를 생성하였다.
실험 조건
flaA의 내부 단편을 벡터 pORI19(repA -) 내로 클로닝하였다. 생성된 벡터 flaA MRx0518int-pORI19를 MRx0518 내로 형질전환시켰고 삽입물은 상동 재조합을 사용하여 박테리아 게놈 내로 통합되었다(도 13 참고).
양성 콜로니를 em 유전자의 존재에 대해 PCR을 사용하여 스크리닝하고 서열분석을 사용하여 추가 확인하였다. 운동성 검정을 사용하는 돌연변이체의 표현형 분석으로 삽입 돌연변이체 MRx0518 flaA -를 또한 확인하였다. 삽입물은 pORI19 벡터로부터의 에리트로마이신 내성을 함유한다. 도 11은 MRx0518 flaA - 돌연변이체가 20 ㎍/ml 에리트로마이신이 보충된 BBL 운동성 한천 상에서 야생형에 비해 비-운동성임을 나타낸다.
실시예 6 - TLR5의 활성화가 MRx0518 돌연변이체에서 제거됨
요약
MRx0518 flaA - 돌연변이체로부터의 CFS의 TLR5 반응을 활성화하는 능력을 평가하였다.
TLR5 활성화 검정
실시예 1에 기재된 바와 같이 TLR5 검정을 수행하였다.
· 절차
TLR5 활성화 검정을 2개의 투여량 - 10:1 및 100:1으로 하기 처리로 수행하였다:
- MRx0518-CFS
- MRx0518 flaA - -CFS
양성 대조군은 5 ng/ml 및 20 ng/ml 농도의 FLA-ST로 수행하였다. 음성 대조군은 2개 투여량 10:1 및 100:1으로 YFCA로 수행하였다. 모든 처리에 대해 3개 반복물로 수행하였다.
결론
MRx0518-CFS가 TLR5 반응을 자극하는 능력이 MRx0518 flaA - 돌연변이체에서 제거되었다(도 12). 이들 데이터는 플라겔린 폴리펩타이드가 MRx0518-CFS에 의한 TLR5 반응의 활성화에 필수적임을 나타낸다.
실시예 7 - MRx0518의 특성규명
요약
크기, 섬모/편모/털의 존재 또는 부재, 또는 세포외 기질의 존재와 같은 박테리아 형태는 운동성 및 부착성 모두에 영향을 미치며 이에 따라 박테리아의 특성규명에서 중요하다.
MRx0518 배양을 통상적인 광학 현미경 방법에 의해 허용되는 것보다 높은 해상도 및 배율로 박테리아 구조 가시화를 허용하는 (주사 및 투과) 전자 현미경 수준에서 검사하였다.
방법
· 투과 전자 현미경
지수상 MRx0518 박테리아 배양의 분취물을 밀봉된 에펜도르프에 혐기성 후드로부터 직접 받았다. 배양을 신선 제조된 빙냉 2.5% 글루타르알데하이드 0.1 M Na 카코딜레이트 pH 7.2 중에 고정하였다. 에펜도르프를 매우 여러 번 뒤집은 뒤 얼음 상에 배치하여 3~5분 동안 고정되도록 두었다. 고정 후 박테리아를 짧게 원심분리하여 펠렛화한 후 밀리(milli) 순수(pure water)에 재현탁하였다. 유리 피펫을 사용하여 1방울의 고정된 배양을 Formvar 코팅된 300메쉬 Cu 그리드 상에 적용하였다. 박테리아가 침강하여 대략 1~2분 동안 흡착되도록 하고 과량의 용액을 Whatman No 3 여과지를 사용하여 그리드에서 제거하였다. 10 ㎕ 2% 우라닐 아세테이트를 수 초 동안 그리드에 적용하고 상기와 같이 여과지를 사용해서 모세관 작용에 의해 제거하였다. 그리드가 완전 건조되도록 한 후 다양한 kV로 Philips CM100 TEM에서 검사하였다.
· 주사 전자 현미경
상기와 동일한 배양의 분취물을 SEM 분석을 위해 취했다. 박테리아를 상기와 같이 고정시켰으나 펠렛화하지 않았다. SPI PORE FILTER(25 mm 지름, 0.2 um 포어 크기)를 0.01% 폴리-라이신으로 사전 처리한 직후 고정된 박테리아를 필터 상에서 Luer-Lok 주사기를 사용해서 밀어내었다. 이어서 필터를 통해 1 ml 밀리 순수를 부드럽게 밀어내었다. 필터를 크기에 맞춰 자르고 일련의 에탄올 용액(50%, 70% 90% 및 3x 100%)을 통해 탈수시켰다. 그 후 필터를 증가하는 농도의 헥사메틸디실라잔(에탄올 중 HMDS 25%, 50%, 75%)을 통해 순차적으로 침지시키고, 최종 탈수 단계는 100% HMDS로 수행하였다. 이것이 하룻밤 동안 증발하도록 두었다. 필터를 임계점 건조하고 10 nm 금 팔라듐으로 코팅한 후 Zeiss EVO MA10 주사 전자 현미경에서 검사하였다.
결론
전자 현미경 수준에서의 가시화 방법은 모두 MRx0518이 편모를 가짐을 나타내었다(도 14). TEM 및 SEM 분석은 모두 MRx0518이 편모를 가짐을 나타내었다(흰색 실선 화살표). 세포 크기는 1~2 ㎛ 범위였다. 외부 막 소포체의 존재는 MRx0518의 SEM 이미지에서만 뚜렷하였다. SEM 이미지는 외부 막 소포체로 보이는 것을 나타낸다(흰색 점선 화살표).
실시예 8 - 엔테로코커스 갈리나룸 균주 MRx0518 및 DSM 100110으로부터의 재조합 플라겔린 단백질에 의한 쥣과 TLR5의 활성화
요약
MRx0518은 인간 샘플로부터 단리된 박테리아 균주인 반면, DSM 100110은 쥣과 기원이다. 엔테로코커스 갈리나룸 균주 MRx0518 및 DSM 100110으로부터의 재조합 플라겔린 단백질이 쥣과 TLR5를 활성화하는 능력을 평가하였다.
방법
정제된 재조합 MRx0518(FliCMRx0518) 및 DSM 100110(FliCDSM100110)을 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같은 TLR5 검정을 수행하였다. TLR5 활성화 검정을 하기 처리로 수행하였다:
- 5, 1, 0.2, 0.04 및 0.008 ng/ml 농도의 정제된 재조합 FliCMRx0518
- 5, 1, 0.2, 0.04 및 0.008 ng/ml 농도의 정제된 재조합 FliCDSM100110
3개의 독립적 반복물로 수행하였다.
결론
FliCMRx0518 및 FliCDSM100110는 둘 다 쥣과 TLR5를 활성화하였고 어느 용량에서도 FliCMRx0518 및 FliCDSM100110 간 활성화 수준에 차이가 없었다(도 15). 상기 효과는 FliCMRx0518 및 FliCDSM100110에 의한 인간 TLR5의 활성화에 대해 관찰된 결과와 상이하다. 실시예 4, 도 10에 나타낸 바와 같이, FliCMRx0518은 1 ng/ml 이하의 농도에서 FliCDSM100110보다 높은 수준까지 인간 TLR5를 자극할 수 있다. 임의의 특정 이론에 구애받지 않고, 상이한 엔테로코커스 갈리나룸 균주로부터의 재조합 플라겔린 단백질에 의한 인간 및 쥣과 TLR5의 상이한 활성화 프로필은 FliCMRx0518 및 FliCDSM100110 간 서열 차이뿐만 아니라 인간 및 쥣과 TLR5 간 결합 부위 변동성에 기인할 수 있다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상이한 플라겔린 폴리펩타이드 간 대부분의 서열 변이가 D2~D3 영역에서 관찰됨을 주목하였다. FliCMRx0518 및 FliCDSM100110의 서열 정렬은 D2~D3 도메인에서 큰 변이를 나타낸다(도 16). 정렬은 CLUTAL OMEGA v1.2.4 다중 서열 정렬 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
실시예 9 - 인간으로부터 유래된 운동성 엔테로코커스 갈리나룸 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 균주의 면역자극능
요약
인간으로부터 유래된 운동성 엔테로코커스 갈리나룸 및 엔테로코커스 카셀리플라부스가 인간 TLR5를 시험관내 활성화하는 능력을 평가하였다.
방법
· 평가된 박테리아 균주
Figure pct00002
MRX 및 평가 균주는 4D Pharma 배양 수집으로부터의 4명의 공여체 중 1명으로부터 단리하였다(공여체 번호 F00, F14, F19 및 F22).
· TLR5 검정 조건
박테리아 균주는 이들이 정지 성장상에 도달할 때까지 YCFA 배양액(E&O Laboratories, Bonnybridge, Scotland, UK) 중에 배양하였다. 세포 및 상청액을 5분 동안 5,000 x g에서 원심분리에 의해 분리하였다. 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 통과시키고 수중 희석하였다.
HEK-Blue™-hTLR5 세포(InvivoGen, San Diego, CA, USA)를 90% 밀도까지 10% FBS, 4 mM L-글루타민, 4.5 mg/ml 글루코스, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/ml Normocin™(InvivoGen), 30 ㎍/ml 블라스토시딘(InvivoGen) 및 100 ㎍/ml 제오신(InvivoGen)이 보충된 DMEM 중에서 일상적으로 배양하였다. 세포주를 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 모든 시약은 달리 언급되지 않는 한 Sigma-Aldrich(Gillingham, England, UK)에서 공급받았다.
공동-배양을 위해, 90% 밀도까지 성장시킨 세포를 인산염-완충 식염수(PBS)(Sigma-Aldrich)로 1회 세척하고 140,000 세포/ml의 밀도로 항생제 없이 성장 배지 중에 재현탁하였다. 상청액을 100:1의 다중 감염도(MOI) 당량으로 세포에 첨가하였다. 검정 양성 대조군인 살모넬라 타이피무리움 플라겔린(FLA-ST)(InvivoGen)은 20 ng/ml로 사용하였다. 세포를 22 h 동안 5% CO2 분위기에서 37℃에서 상청액과 인큐베이션하였다. QUANTI-Blue™(InvivoGen)를 첨가하고, 플레이트를 2 h 더 인큐베이션하여 655 nm에서의 광학 밀도를 기록하였다. 모든 균주에 대해 3개의 독립적 생물학적 반복물로 수행하였다.
도 18에서의 데이터는 3개의 독립적 반복물을 나타낸다.
결론
평가된 엔테로코커스 갈리나룸 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 균주의 모든 상청액은 미처리 대조군에 비해 TLR5 반응을 강력히 활성화할 수 있었다. 평가된 3개의 엔테로코커스 카셀리플라부스 균주 중, 평가 6은 TLR5 반응을 강력히 활성화하는 것으로 확인된 반면, 평가 5 및 DSM25781은 덜 강력한 TLR5 반응을 유발한다.
실시예 10 - MRx518에 의한 NF-κB의 활성화
박테리아 균주 MRx0518이 NF-κB를 활성화하는 능력을 연구하였다. 결과를 도 18에 나타낸다. MRx0518 상청액은 NF-κB의 가장 강력한 활성화제였다. NF-κB의 활성화는 트립신으로의 처리 후 제거되었다.
이들 데이터는 엔테로코커스 속, 특히 MRx0518로부터의 플라겔린이 매우 강력한 NF-κB 반응을 일으키며, 이에 따라 치료법에서 유용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 11 - T 세포 분화
MRx0518이 T-세포 분화를 유도하는 능력을 말초혈 단핵 세포(PBMC, Stemcell, Cat:70025)에서 시험관내 탐색하였다.
방법
PBMC를 웰 당 50 ㎕ cRPMI 배지(cRPMI는 RPMI 1640(+L-Glut, 21875-034) 2 mM 최종 농도, 스톡 200 mM.; 10% HI FBS(Gibco life technologies, 10082-147); 50 μM 메르캅토에탄올(Gibco life technologies, 21985-023); 및 1% pen/strep(P4333, 10 mg/ml)을 함유함) 중 400,000/웰로 항-CD3(Ebioscience, CD3 모노클로날 항체(OKT3 클론), 기능 등급, cat. No. 16-0037-81)과 함께 96-웰 플레이트에 플레이트 접종하였다. 이어서 MRx518 상청액을 각각의 웰에, 4,000,000개씩 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 통과시키고 공동-배양에서 적절히 희석하였다.
37℃ 인큐베이터에서 3일 후, 세포를 제거하고 5시간 동안 PMA-(Sigma, Cat no. P8139), 이오노마이신(Ionomycin)(Sigma, Cat no. I3909) 및 GolgiSTOP(BD, Cat no 554724)을 함유하는 배지 중에 재현탁하였다. PMA 스톡은 DMSO 중 1 mg/ml이었고 이를 100 ug/ml로 추가 희석하였고(각각의 샘플은 cRPMI 중 50 ng/ml로 요구됨), 이오노마이신 스톡은 DMSO 중 1 mM이었고(cRPMI 중 1 μM을 사용함) GolgiStop 농도는 4 ㎕/6 ml로 사용하였다.
이어서 세포로 유세포 측정 염색을 거쳤다:
세척 후, 세포를 실온에서 암소에서 10분 동안 PBS 중 Miltenyi biotec의 Viobility 405/520 고정형 염료(Fixable Dye)(1 ㎕/샘플) + 인간 Fc 블록, cat. 564219(1 ㎕/샘플)와 인큐베이션하였다. 이어서 표면 항체(각각 2 ㎕) - CD3-APC-Vio 770(Miltenyi, cat. No. 130-113-136), CD4-VioBlue(Miltenyi, cat. No. 130-114-534) 및 CD25-VioBright FITC(Miltenyi, cat. No. 130-113-283)를 실온에서 암소에서 10분 동안 웰에 직접 첨가하였다. 그 후 세포를 PBS 중에 2회 세척하고 300 g/5분/RT로 침강시켰다.
이어서 eBioscience FoxP3 전사 인자 염색 완충액을 사용하여 세포를 고정하고 투과화하였다(cat. No. 00-5523). eBioscience 프로토콜에 따라, 투과/고정 완충액을 1x 농축물 및 3개 희석제를 사용하여 제조하였다. 세포를 RT에서 1 h 동안 고정한 후 1x Perm 세척액 중 2x 세척하고 300 g/5분/RT로 침강시켰다. 하기 세포내 염색 또는 전사 인자 항체를 45분/암소/RT로 또는 하룻밤 동안(최대 18 h) 냉장고에서 투과 세척액(1x) 중 샘플에 첨가한 후 투과 세척액(300 ㎕)을 사용하여 항체를 2x 세척하고 PBS(250 ㎕) 중에 재현탁하여 세포측정기 상에서 획득하였다:
Figure pct00003
· 항 IFNy-PE Vio770 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-114-025)
· 항 IL10-PE 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-112-728)
· 항 IL17a-APC 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-099-202)
· 항 RoRyt-PE 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-103-837)
· 항 Tbet-APC 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-098-655
· Foxp3 모노클로날 항체(236A/E7), Pe cy7(ebioscience) cat. No. 25-4777-41
결론
도 19에서 알 수 있듯이, MRx518 상청액(SP 518)은 T 헬퍼 세포 및 세포독성 T 세포의 분화를 유도할 수 있다.
실시예 12 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx0518 플라겔린 유전자 삽입 돌연변이체의 생성
본 실시예는 실시예 5 대비 플라겔린 유전자의 불활성화를 위한 대안적 전략을 제공한다. fliC 유전자를 자살 플라스미드 pORI19의 상동성-유도 삽입에 의해 손상시켰다(도 20 참고). fliC 유전자 내의 pORI19의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인하였고 생성된 돌연변이체 균주의 비운동성 표현형을 시험관내 확인하였다.
방법
플라겔린 삽입 돌연변이체를 비-복제성 플라스미드 pORI19(Emr repA- Ori+; 클로닝 벡터[118])를 사용하여 생성하였다. 엔테로코커스 갈리나룸 MRx0518 fliC 유전자의 내부 단편을 프라이머 DC020(서열 번호 43: CCCGGGGGATCCGCGGTAAATGTTGCTAAAGCATCATCG) 및 DC021(서열 번호 44: ACGACGGTCGACCCACAGCATCTTAGGGCGTATGCG)을 사용하여 증폭하고 pORI19 내로 클로닝하였다. 제한 효소 및 Quick 리가제(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 상기 작제물을 화학적 형질전환[118]에 의해 대장균 EC101에서 전파시키고 500 ml 배양으로부터 Genopure Plasmid Maxi 키트(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 DNA를 0.3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2 및 에탄올을 사용하여 20 ㎕까지 농축하였다.
억제-미만 농도의 글리신 중 박테리아 배양을 성장시킨 후 뮤타노라이신 및 라이소자임 처리로 세포벽 펩티도글리칸층을 추가 약화시켜 전기적격 세포를 성공적으로 생성하였다. 엔테로코커스 갈리나룸 MRx0518 전기적격 세포를 제조하기 위한 프로토콜을 개발하고, 이는 이전에 공개된 방법[119]으로부터 적용하였다. 간략하게, 엔테로코커스 갈리나룸 MRx0518을 0.5 M 수크로스 및 3%(w/v) 글리신(Sigma-Aldrich)이 보충된 GM17 배양액 중 18 h 동안 성장시켰다. 이어서 세포를 0.5 M 수크로스 및 10%(v/v) 글리세롤로 2회 세척하고 37℃에서 30분 동안 10 ㎍/ml 라이소자임 및 10 U/ml 뮤타노라이신(Sigma-Aldrich)으로 처리하였다. 이어서 엔테로코커스 갈리나룸 MRx0518 세포를 10 ㎍의 플라스미드 DNA로의 전기천공에 의해 형질전환하고 BHI 배양액 중에 회수한 후 선택적 BHI 한천 상에 플레이트 접종하였다. 양성 콜로니를 프라이머 DC047(서열 번호 45: CCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAACGAG) 및 DC048(서열 번호 46: GATGCAGTTTATGCATCCCTTAAC)을 사용하여 em 유전자의 존재에 대해 스크리닝하였다. 플라스미드 삽입을 프라이머 DC013(서열 번호 47: CCGATAAATAGTAGCAGAGGGAAACC) 및 DC014(서열 번호 48: GGCTGAATATCCATCAGAGCTTCCTC)를 사용하여 PCR 증폭 및 서열분석(GATC Biotech, Konstanz, Germany)에 의해 성공적 형질전환체에 대해 확인하였다.
플라겔린 삽입 돌연변이체의 시험관내 운동성을 0.005%(w/v) 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(BD, Sparks, MD, USA)가 보충된 BBL™ 운동성 평가 배지를 사용하여 평가하였다. 간략하게, 신선 콜로니를 20 ml 평형화된 배지 중에 면봉으로 접종하고 혐기성 조건에서 37℃에서 48 h 동안 인큐베이션하였다. 모든 검정은 3개씩 수행하였다.
서열
서열 번호 1 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx0518로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 2 - 엔테로코커스 갈리나룸 DSM100110으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 3 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx0554로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 4 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx0556으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 5 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx1548로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 6 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx1650으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 7 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx1763으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 8 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx1766으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 9 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx1775로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 10 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx1886으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 11 - 엔테로코커스 갈리나룸 2A8로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 12 - 엔테로코커스 갈리나룸 9402로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 13 - 엔테로코커스 갈리나룸 A6981로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 14 - 엔테로코커스 갈리나룸 MRx1649로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 15 - 엔테로코커스 갈리나룸 EG2로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 16 - 엔테로코커스 갈리나룸 SKF1로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 17 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 DSM 7370으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 18 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 1a6A로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 19 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 3h10B로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 20 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 14-MB-W-14로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 21 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 ATCC12755로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 22 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 DSM4841로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 23 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 DSM20680으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 24 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 EC10으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 25 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 EC20으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 26 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 EC30으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 27 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 F1129로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 28 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 F1129F 46으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 29 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 NBRC 100478로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 30 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 PAVET15로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 31 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 NLAE-zl-G268로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 32 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 NLAE-zl-C414로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 33 - 엔테로코커스 갈리나룸 FDAARGOS-163으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 34 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 MRx0858로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 35 - 엔테로코커스 카셀리플라부스 DSM25781로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 36 - 엔테로코커스 갈리나룸 DSM28564로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 37 - 엔테로코커스 갈리나룸 DSM28565로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 38 - 엔테로코커스 갈리나룸 F1213F 228로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 39 - 엔테로코커스 갈리나룸 DSM20718로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 40 - 엔테로코커스 갈리나룸 DSM20628로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 41 - 엔테로코커스 갈리나룸 NBRC100675로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
서열 번호 42 - 엔테로코커스 갈리나룸 DSM24841로부터의 플라겔린 폴리펩타이드
참고문헌
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
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Ile Asp Thr Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala 225 230 235 240 Thr Ala Gln Lys Thr Tyr Asp Asp Ala Leu Ala Thr Phe Thr Ala Ser 245 250 255 Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Val Glu Asn Asn Pro 260 265 270 Ile Thr Lys Ile Asp Glu Ala Ile Lys Ala Val Ser Ala Gln Arg Ala 275 280 285 Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu 290 295 300 Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp 305 310 315 320 Val Asp Met Ala Gln Glu Met Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu 325 330 335 Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn 340 345 350 Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly 355 360 <210> 34 <211> 360 <212> PRT <213> Enterococcus casseliflavus MRx0858 <400> 34 Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser 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Ala Ile Lys Lys 100 105 110 Glu Tyr Thr Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Asn Thr Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Thr Lys Lys Leu Leu Thr Gly Glu Gly Asp Asp Ala Lys 130 135 140 Ser Phe Thr Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser Val 145 150 155 160 Ser Ile Asn Asn Met Ser Ser Ser Val Leu Lys Val Lys Gly Leu Asp 165 170 175 Leu Thr Gln Ala Phe Asp Thr Ser Asp Val Lys Ala Val Ala Ala Ala 180 185 190 Lys Asp Lys Ala Val Ala Thr Ala Phe Glu Ala Asp Thr Thr Thr Lys 195 200 205 Tyr Ala Glu Asp Gly Thr Val Asp Ala Thr Asp Gly Lys Thr Val Phe 210 215 220 Glu Leu Lys Lys Ala Met Glu Ser Glu Lys Asp Ala Thr Glu Lys Ala 225 230 235 240 Lys Ala Lys Glu Thr Tyr Asp Lys Ala Leu Ala Ile Phe Thr Asp Ser 245 250 255 Asp Glu Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Gly Asp Asn Asn 260 265 270 Pro Ile Thr Lys Ile Asp Glu Ala Ile Lys Val Val Ser Ala Gln Arg 275 280 285 Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn 290 295 300 Leu Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg 305 310 315 320 Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile 325 330 335 Leu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro 340 345 350 Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly 355 360 <210> 36 <211> 361 <212> PRT <213> Enterococcus gallinarum DSM28564 <400> 36 Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser 50 55 60 Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys 100 105 110 Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys 130 135 140 Ala Ser Phe Ile Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser 145 150 155 160 Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu 165 170 175 Lys Leu Glu Glu Ala Lys Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ala Lys Lys Val 180 185 190 Glu Thr Ala Phe Leu Asp Ala Ala Asn Ser Asp Lys Tyr Asp Ala Asp 195 200 205 Gly Lys Ile Asp Ala Ser Ala Gly Lys Thr Ala Ala Glu Leu Lys Asp 210 215 220 Ala Ile Glu Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys 225 230 235 240 Thr Tyr Asp Ala Ala Leu Glu Thr Phe Lys Ala Ser Thr Asn Gly Gln 245 250 255 Thr Ala Ile Ala Thr Ala Lys Thr Glu Val Glu Glu Ala Ser Lys Asn 260 265 270 Ser Thr Val Ser Lys Ile Asp Glu Ala Ile Lys Thr Val Ser Ala Gln 275 280 285 Arg Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn 290 295 300 Asn Leu Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile 305 310 315 320 Arg Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn 325 330 335 Ile Leu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met 340 345 350 Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln 355 360 <210> 37 <211> 361 <212> PRT <213> Enterococcus gallinarum DSM28565 <400> 37 Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser 50 55 60 Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys 100 105 110 Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys 130 135 140 Ala Ser Phe Ile Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser 145 150 155 160 Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu 165 170 175 Lys Leu Glu Glu Ala Lys Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ala Lys Lys Val 180 185 190 Glu Thr Ala Phe Leu Asp Ala Ala Asn Ser Asp Lys Tyr Asp Ala Asp 195 200 205 Gly Lys Ile Asp Ala Ser Ala Gly Lys Thr Ala Ala Glu Leu Lys Asp 210 215 220 Ala Ile Glu Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys 225 230 235 240 Thr Tyr Asp Ala Ala Leu Glu Thr Phe Lys Ala Ser Thr Asn Gly Gln 245 250 255 Thr Ala Ile Ala Thr Ala Lys Thr Glu Val Glu Glu Ala Ser Lys Asn 260 265 270 Ser Thr Val Ser Lys Ile Asp Glu Ala Ile Lys Thr Val Ser Ala Gln 275 280 285 Arg Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn 290 295 300 Asn Leu Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile 305 310 315 320 Arg Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn 325 330 335 Ile Leu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met 340 345 350 Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln 355 360 <210> 38 <211> 358 <212> PRT <213> Enterococcus gallinarum F1213F 228 <400> 38 Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser 50 55 60 Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys 100 105 110 Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys 130 135 140 Ala Ser Phe Ile Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser 145 150 155 160 Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu 165 170 175 Lys Leu Glu Glu Ala Lys Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ala Lys Lys Val 180 185 190 Glu Thr Ala Phe Leu Ala Gly Thr Glu Thr Tyr Asp Ala Asp Gly Lys 195 200 205 Ile Asp Ala Ser Gly Thr Lys Ala Ser Asp Leu Gln Thr Ala Ile Ala 210 215 220 Asn Ala Thr Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Thr Tyr Asp 225 230 235 240 Ala Ala Leu Glu Ser Phe Lys Ala Ser Ala Asn Gly Gln Thr Ala Ile 245 250 255 Ala Thr Ala Lys Thr Glu Val Glu Glu Asp Ala Lys Asn Ser Thr Val 260 265 270 Ser Lys Ile Asp Glu Ala Ile Lys Thr Val Ser Ala Gln Arg Ala Asp 275 280 285 Leu Gly Ala Ala Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly 290 295 300 Thr Thr Gln Glu Asn Leu Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp Val 305 310 315 320 Asp Met Ala Gln Glu Met Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu Ser 325 330 335 Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn Ser 340 345 350 Val Leu Ser Leu Leu Gln 355 <210> 39 <211> 352 <212> PRT <213> Enterococcus gallinarum DSM20718 <400> 39 Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser 50 55 60 Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys 100 105 110 Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys 130 135 140 Ala Ser Phe Ile Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser 145 150 155 160 Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu 165 170 175 Lys Leu Glu Glu Ala Gly Asp Glu Glu Lys Val Thr Asn Lys Ala Phe 180 185 190 Thr Asp Asn Thr Asn Leu Lys Tyr Asp Ala Ala Thr Gly Ala Ile Asp 195 200 205 Asn Ser Gly Ser Thr Gly Lys Thr Ala Thr Glu Leu Lys Asp Ala Ile 210 215 220 Thr Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Ala Tyr 225 230 235 240 Asp Ala Ala Leu Glu Ala Tyr Lys Asn Ser Asp Glu Gly Lys Ala Glu 245 250 255 Leu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ile Asp Asn Ala 260 265 270 Ile Lys Ala Val Ser Ala Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn 275 280 285 Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu 290 295 300 Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met 305 310 315 320 Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met 325 330 335 Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln 340 345 350 <210> 40 <211> 352 <212> PRT <213> Enterococcus gallinarum DSM20628 <400> 40 Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser 50 55 60 Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys 100 105 110 Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys 130 135 140 Ala Ser Phe Ile Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser 145 150 155 160 Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu 165 170 175 Lys Leu Glu Glu Ala Gly Asp Glu Glu Lys Val Thr Asn Lys Ala Phe 180 185 190 Thr Asp Asn Thr Asn Leu Lys Tyr Asp Ala Ala Thr Gly Ala Ile Asp 195 200 205 Asn Ser Gly Ser Thr Gly Lys Thr Ala Thr Glu Leu Lys Asp Ala Ile 210 215 220 Thr Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Ala Tyr 225 230 235 240 Asp Ala Ala Leu Glu Ala Tyr Lys Asn Ser Asp Glu Gly Lys Ala Glu 245 250 255 Leu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ile Asp Asn Ala 260 265 270 Ile Lys Ala Val Ser Ala Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn 275 280 285 Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu 290 295 300 Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met 305 310 315 320 Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met 325 330 335 Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln 340 345 350 <210> 41 <211> 352 <212> PRT <213> Enterococcus gallinarum NBRC100675 <400> 41 Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser 50 55 60 Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys 100 105 110 Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys 130 135 140 Ala Ser Phe Ile Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser 145 150 155 160 Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu 165 170 175 Lys Leu Glu Glu Ala Gly Asp Glu Glu Lys Val Thr Asn Lys Ala Phe 180 185 190 Thr Asp Asn Thr Asn Leu Lys Tyr Asp Ala Ala Thr Gly Ala Ile Asp 195 200 205 Asn Ser Gly Ser Thr Gly Lys Thr Ala Thr Glu Leu Lys Asp Ala Ile 210 215 220 Thr Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Ala Tyr 225 230 235 240 Asp Ala Ala Leu Glu Ala Tyr Lys Asn Ser Asp Glu Gly Lys Ala Glu 245 250 255 Leu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ile Asp Asn Ala 260 265 270 Ile Lys Ala Val Ser Ala Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn 275 280 285 Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu 290 295 300 Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met 305 310 315 320 Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met 325 330 335 Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln 340 345 350 <210> 42 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus gallinarum DSM24841 <400> 42 Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser 50 55 60 Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys 100 105 110 Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys 130 135 140 Ala Ser Phe Ile Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser 145 150 155 160 Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu 165 170 175 Lys Leu Glu Glu Ala Gly Asp Glu Glu Lys Val Thr Asn Lys Ala Phe 180 185 190 Thr Asp Asn Thr Asn Leu Lys Tyr Asp Ala Ala Thr Gly Ala Ile Asp 195 200 205 Asn Ser Gly Ser Thr Gly Lys Thr Ala Thr Glu Leu Lys Asp Ala Ile 210 215 220 Thr Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Ala Tyr 225 230 235 240 Asp Ala Ala Leu Glu Ala Tyr Lys Asn Ser Asp Glu Gly Lys Ala Glu 245 250 255 Leu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ile Asp Asn Ala 260 265 270 Ile Lys Ala Val Ser Ala Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn 275 280 285 Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu 290 295 300 Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met 305 310 315 320 Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met 325 330 335 Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln 340 345 350 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCO20 primer <400> 43 cccgggggat ccgcggtaaa tgttgctaaa gcatcatcg 39 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC021 primer <400> 44 acgacggtcg acccacagca tcttagggcg tatgcg 36 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC047 primer <400> 45 ccaaattaaa gagggttata atgaacgag 29 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC048 primer <400> 46 gatgcagttt atgcatccct taac 24 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC013 primer <400> 47 ccgataaata gtagcagagg gaaacc 26 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> DC014 primer <400> 48 ggctgaatat ccatcagagc ttcctc 26

Claims (51)

  1. 치료법에서 사용하기 위한, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터 유래되는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 접근 번호 NCIMB 42488 하에 NCIMB에서 기탁된 균주로부터 유래되는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 서열 번호 1과 적어도 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 서열 번호 1을 포함하는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 서열 번호 2와 적어도 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 서열 번호 2를 포함하는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 서열 번호 3~42 중 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 서열 번호 3~16 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 D3 도메인을 함유하지 않는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 단량체 형태인, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 서열 번호 1에서 잔기 87~96 및 290~295와 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 TLR5 인식 부위를 함유하는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 박테리아 편모 어셈블리의 일부인, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드.
  14. 치료법에서 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드의 단편으로서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따라 정의되며, 상기 단편이 적어도 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300 또는 350개 아미노산 길이인, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드의 단편.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단편이 서열 번호 1과 적어도 85% 서열 동일성을 갖고/갖거나 (ii) 서열 번호 1과 적어도 7개의 인접한 아미노산 단편을 포함하는, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드의 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체 항원 또는 종양 항원과 같은 항원에 콘주게이션된, 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드의 단편.
  17. 치료법에서 사용하기 위한 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드로서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따라 정의되는, 융합 폴리펩타이드.
  18. 제17항에 있어서, 병원체 항원 또는 종양 항원과 같은 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드.
  19. 서열 번호 1의 아미노산의 하기 신장물: 2~32, 87~96, 165~272, 234~358, 290~295 중 하나 이상을 포함하거나, 상기 단편 중 하나와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호 1에서 아미노산 165~272의 서열과 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드.
  21. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호 1에서 아미노산 87~96, 165~272 및 290~295의 서열과 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극 영역을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 면역자극 영역이 TLR4 또는 TLR5 활성화 영역인 폴리펩타이드.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 플라겔린 폴리펩타이드인 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 박테리아 편모 어셈블리의 일부인, 사용하기 위한 폴리펩타이드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 플라겔린 폴리펩타이드인 폴리펩타이드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 하나 이상의 항원을 추가로 포함하는, 사용하기 위한 폴리펩타이드.
  28. 치료법에서 사용하기 위한, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
  29. 제28항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따라 정의되는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드 서열.
  30. 제29항에 있어서, 상기 인코딩된 폴리펩타이드 서열이 서열 번호 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖거나, 서열 번호 1인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드 서열.
  31. 치료법에서 사용하기 위한, 엔테로코커스 속으로부터의 재조합 플라겔린 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포.
  32. 치료법에서 사용하기 위한, 엔테로코커스 속으로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 플라겔린 폴리펩타이드가 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따라 정의되는, 사용하기 위한 숙주 세포.
  34. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 또는 플라스미드.
  35. 제34항의 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  36. 제35항에 있어서, 병원체 항원 또는 종양 항원과 같은 이종성 항원을 추가로 발현하는 숙주 세포.
  37. 치료법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 플라겔린 폴리펩타이드, 제14항 또는 제15항의 플라겔린 폴리펩타이드의 단편, 제17항 또는 제18항의 융합 폴리펩타이드, 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제31항 내지 제33항 및 제35항 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 제34항의 벡터를 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 사용하기 위한 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 조성물이 면역원성 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 조성물.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 조성물이 폐암, 유방암, 간암 또는 결장암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 사용하기 위한 조성물.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 전이를 예방하거나, 혈관신생을 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 사용하기 위한 조성물.
  42. 제37항에 있어서, 대상체에서 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한, 사용하기 위한 조성물.
  43. 제37항에 있어서, 면역노화를 치료하거나, 예방하거나, 지연하는 데 사용하기 위한, 사용하기 위한 조성물.
  44. 제37항에 있어서, 백신 아주반트로서 사용하기 위한, 사용하기 위한 조성물.
  45. 제37항에 있어서, CAR-T와 같은 세포 치료법을 증강시키는 데 사용하기 위한, 사용하기 위한 조성물.
  46. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 NF-κB의 수준 및/또는 활성을 증가시키는, 사용하기 위한 조성물.
  47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 경구 투여를 위한 것인, 사용하기 위한 조성물.
  48. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 사용하기 위한 조성물.
  49. 질환을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에 엔테로코커스 속 박테리아 균주로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  50. 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에 엔테로코커스 속 박테리아 균주로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 감소된 면역자극과 연관된 질환 또는 상태를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에 엔테로코커스 속 박테리아 균주로부터의 플라겔린 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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