BR112020018818A2 - composições compreendendo cepas bacterianas - Google Patents

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Aurélie Pascale Patricia COUTURIER-MAILLARD
Margaret Inkster DELDAY
Marsilio ADRIANI
Maria CHRISTOFI
Amy Beth HOLT
Suaad AHMED
Anna ETTORRE
Imke Elisabeth MULDER
Philip Cowie
Emma RAFTIS
Emma Elizabeth Clare HENNESSY
Delphine Louise Claudette Laute-Caly
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Abstract

“composições compreendendo cepas bacterianas”. a presente invenção refere-se a composições que compreendem cepas bacterianas para estimular o sistema imunológico e tratar e prevenir doenças.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPO- SIÇÕES COMPREENDENDO CEPAS BACTERIANAS”.
CAMPO TÉCNICO
[001] Esta invenção está no campo de composições compreendendo cepas bacterianas isoladas do trato digestivo de mamíferos e o uso de tais composições no tratamento de doenças, em particular, na estimulação do sistema imunológico no tratamento de doenças.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] O intestino humano é considerado estéril in utero, mas é exposto a uma ampla variedade de micróbios maternos e ambientais imediatamente após o nascimento. A partir daí, ocorre um período dinâmico de colonização e sucessão microbiana, que é influenciado por fatores como modo de distribuição, ambiente, dieta e genótipo do hospedeiro, os quais impactam na composição da microbiota intestinal, particularmente no início da vida. Posteriormente, a microbiota se estabiliza e se torna semelhante a um tipo adulto [1]. A microbiota intestinal humana contém mais de 500-1000 filotipos diferentes pertencentes essencialmente a duas divisões bacterianas principais, os Bacteroidetes e os Firmicutes [2]. As relações simbióticas bem- sucedidas que surgem da colonização bacteriana do intestino humano produziram uma ampla variedade de funções metabólicas, estruturais, protetoras e outras funções benéficas. As atividades metabólicas aprimoradas do intestino colonizado garantem que componentes alimentares outrora indigeríveis sejam degradados com a liberação de subprodutos, fornecendo uma importante fonte de nutrientes para o hospedeiro. Da mesma forma, a importância imunológica da microbiota intestinal é bem reconhecida e exemplificada em animais livres de germes que têm um sistema imunológico debilitado que é funcionalmente reconstituído após a introdução de bactérias comensais
[1-, [4], 5].
[003] Mudanças dramáticas na composição da microbiota foram documentadas em distúrbios gastrointestinais, como a doença inflamatória intestinal (DII). Por exemplo, os níveis da bactéria Clostridium do agrupamento XIVa são reduzidos em pacientes com IBD, enquanto o número de E. coli aumenta, sugerindo uma mudança no equilíbrio de simbiontes e patobiontes dentro do intestino [3-, [4], [5], [6]. Curiosamente, esta disbiose microbiana também está associada a desequilíbrios nas populações de células T efetoras.
[004] Em reconhecimento do efeito positivo potencial que certas cepas bacterianas podem ter no intestino do animal, várias cepas foram propostas para uso no tratamento de várias doenças (ver, por exemplo, [2-, [9], [10], [11]). Além disso, certas cepas, incluindo principalmente as de Lactobacillus e Bifidobacterium foram propostas para uso no tratamento de várias doenças inflamatórias e autoimunológicas que não estão diretamente ligadas ao intestino (consultar [8] and [2] para análise). Foi sugerido que certas cepas de Streptococcus e Veillonella e, em menor extensão, cepas de Enterococcus e Lactobaccillus têm efeitos imunomoduladores, com efeitos variáveis em diferentes citocinas in vitro, sugerindo que os dados obtidos in vitro com cepas individuais são improváveis de representar adequadamente respostas imunológicas para misturas de comunidades da microbiota intestinal in vivo [88]. Entretanto, a relação entre diferentes doenças e diferentes cepas bacterianas e os efeitos precisos de cepas bacterianas específicas no intestino e a um nível sistêmico e em quaisquer tipos específicos de doenças são mal caracterizados.
[005] Existe uma necessidade na técnica por novos métodos de tratamento de doenças. Existe também uma necessidade de que os potenciais efeitos das bactérias intestinais sejam caracterizados, de modo que novas terapias que usem bactérias intestinais possam ser desenvolvidas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Os inventores desenvolveram novas composições compreendendo uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum que pode ser usada na estimulação do sistema imunológico e no tratamento e prevenção de doenças. Os inventores identificaram que tais cepas da espécie Enterococcus gallinarum podem ativar potentemente o sistema imunológico e podem tratar o câncer, o que indica que eles também podem tratar outras doenças onde a ativação do sistema imunológico pode ser útil.
[007] A invenção portanto fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, para uso na estimulação do sistema imunológico em um sujeito.
[008] Em outros aspectos, a invenção fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, para uso no tratamento, prevenção ou retardamento da imunossenescência.
[009] Em outros aspectos, a invenção fornece uma composição compreendendo uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, para uso como um adjuvante de vacina.
[010] Em outros aspectos, a invenção fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, para uso no aprimoramento de uma terapia celular, tal como CAR-T.
[011] Preferencialmente, a bactéria usada na invenção é a cepa depositada sob o número de acesso 42488 em NCIMB.
[012] Em outras modalidades preferenciais, a bactéria usada na invenção é a cepa depositada sob o número de acesso 42761 em NCIMB.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[013] Figura 1A: Modelo de camundongo com câncer de mama - mudanças no volume do tumor após a indução do tumor e uma tabela indicando a significância estatística entre cada dois tratamentos em cada ponto de tempo.
[014] Figura 1B: Painel superior: Área de necrose em tumores EMT6 (não tratado n = 6, Veículo n = 6, MRx0518 n = 8). Painel inferior: porcentagem de células em divisão em tumores EMT6. P = 0,019 (não tratado n = 4, número total de células contadas = 37201, veículo n = 6, número total de células contadas = 64297, MRx0518 n = 6, número total de células contadas = 33539).
[015] Figura 1C: Modelo de camundongo com câncer de mama - células imunológicas infiltradas. Os gráficos de dispersão representam contagens de células de diferentes marcadores imunológicos de animais individuais de cada grupo de tratamento.
[016] Figura 1D: Modelo de camundongo com câncer de mama - produção de citocinas em lisados tumorais. As colunas representam a média pg/mL de proteína total de cada grupo de tratamento. * p <0,05 entre os grupos usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett.
[017] Figura 1E: Modelo de camundongo com câncer de mama - produção de citocinas no plasma sanguíneo. As colunas representam a média pg/mL de cada grupo de tratamento (+/- SEM).
[018] Figura 1F: Imagens representativas de criosseções do íleo de camundongos trados com veículo, MRx0518 e CTLA-4 imunomarcados com anticorpos contra CD8α (painéis inferiores) e contrapigmentados com DAPI (painéis superiores).
[019] Figura 1G: Gráfico quantificando subconjuntos de estudo em animais com mais de 3 células CD8α+ por campo retiradas da região de cripta de íleo de camundongos tratados com veículo, MRx0518 ou anti-CTLA-4.
[020] Figura 2: Modelo de camundongo de câncer no pulmão – mudanças no volume do tumor após a indução do tumor e uma tabela indicando a significância estatística entre cada um dos dois tratamentos em cada ponto no tempo.
[021] Figura 3A: Modelo de camundongo de câncer no fígado – peso do fígado.
[022] Figura 3B: Modelo de camundongo de câncer no rim – mudanças no volume do tumor após a indução do tumor e uma tabela indicando a significância estatística entre cada um dos dois tratamentos em cada ponto no tempo.
[023] Figura 4A: Níveis de citocinas (pg / mLmL) em células dendríticas imaturas (sem bactérias).
[024] Figura 4B: Níveis de citocinas (pg/mLmL) em células dendríticas imaturas após a adição de LPS.
[025] Figura 4C: Níveis de citocinas (pg/mLmL) em células dendríticas imaturas após a adição de MRx0518MRx0518.
[026] Figura 4D: Níveis de citocinas (pg/mLmL) em células dendríticas imaturas após a adição de MRx0518MRx0518 e LPS.
[027] Figura 5A: Níveis de citocinas em células THP-1 (sem bactérias).
[028] Figura 5B: Níveis de citocinas em células THP-1 após adição de sedimento bacteriano.
[029] Figura 5C: Níveis de citocinas em células THP-1 após a adição de MRx0518MRx0518 sozinho ou em combinação com LPS.
[030] Figuras 6 e 7: Resposta imunoestimuladora – TNFα
[031] Figura 8: Resposta imunoestimuladora – IL-12p70
[032] Figura 9: Resposta imunomoduladora – IL-10
[033] Figura 10: Resposta imunoestimuladora – IL-8
[034] Figura 11: Resposta imunoestimuladora – IL-23
[035] Figura 12: Resposta imunoestimuladora – IL-1β
[036] Figura 13: Resposta imunoestimuladora – IL-6
[037] Figura 14: Mecanismo de ação – ativação de NFκB
[038] Figura 15: Mecanismo de ação – ativação de TLR5
[039] Figura 16A: Uma representação esquemática do esquema de tratamento dos diferentes grupos usados no Exemplo 8 descrito abaixo.
[040] Figura 16B: Volume médio do tumor em camundongos com um tumor formado por células EMT-6. Os camundongos não foram tratados ou foram tratados com um veículo YCFA (veículo), bactérias MRx0518 em meio YCFA (MRx0518), um anticorpo anti-CTLA-4 e meio YCFA (Anti-CTLA-4) ou uma combinação de MRx0518 e o anticorpo anti-CTLA-4. A tabela fornecida indica a significância estatística entre cada dois tratamentos em cada ponto no tempo.
[041] Figura 17: Modelo de camundongo com câncer de mama – volume do tumor.
[042] Figura 18: Perfil de API 50 CHL de MRx0554.
[043] Figura 19: Mecanismo de ação - ativação de TLR9 por MRx0518 (MRx0518LV), MRx0518 morto por calor (MRx0518HK) e sobrenadante de cultura MRx0518 (MRx0518SN) em linhagens de células repórter HEK-Blue ™ hTLR9. ODN2006 foi usado como um controle positivo e o meio YCFA foi incluído como um controle negativo para MRx0518SN. O gráfico de barras representa uma média de pelo menos três réplicas biológicas. A análise estatística foi realizada usando GraphPad Prism (análise ANOVA de um fator comum seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey). As diferenças estatisticamente significativas com o controle relevante são mostradas nos gráficos como **** (p <0,0001).
[044] Figuras 20A-B: Indução de diferenciação de células T em uma população de (A) células T auxiliares e (B) Linfócitos T citotóxicos (CTL), usando MRx0518 (HK 518) morto por calor, sobrenadante de cultura MRx0518 ou meio RPMI, sem adição de citocinas (sem citocinas). * = p≤ 0,05; ** = p≤ 0,01; *** = p≤ 0,001; **** = p≤ 0,0001.
[045] Figuras 21A-D: Produção de citocinas in vitro por (A) células PBMC; (B) Esplenócitos; ou (C) células THP-1; que foram tratados com meio YCFA + ("Veículo") ou sobrenadante bacteriano livre de células de MRx0518 ("MRx0518"). A Figura 21D mostra a alteração dobrada na expressão de citocinas após o tratamento de células CaCo- 2 com bactérias vivas ("MRx0518") em relação às células não tratadas.
[046] Figura 21E: Produção de citocinas in vitro por esplenócitos (N = 3), de células que não foram tratadas ("não tratadas"), tratadas com meio em branco YCFA ("10% de YCFA") ou tratadas com sobrenadante bacteriano livre de células MRx0518 (“10% de MRx0518”).
[047] Figura 21F: Viabilidade de esplenócitos extraídos de camundongos (N = 4) como medida por um ensaio de MTT. As células foram não tratadas ("não tratadas"), tratadas com meio em branco YCFA ("10% de YCFA") ou tratadas com sobrenadante bacteriano livre de células MRx0518 ("10% de MRx0518").
[048] Figuras 22A-D: ativação do promotor NF-κB em (A) células HEK-Blue ™ -hNOD2; (B) células HEK-Blue ™ -hTLR4; (C) células HEK-Blue ™ -hTLR9 ou (D) células HEK-Blue ™ -hTLR5. As células foram não tratadas, tratadas com meio YCFA (“YCFA”), tratadas com MRx0518 (“MRx0518”) ou tratadas com controles positivos.
[049] Figura 23: Mapa de calor que representa a análise NanoString do microambiente do tumor EMT6 após o tratamento com veículo YCFA (“Veículo”) ou MRx0518 (“MRx0518”).
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO Cepas bacterianas
[050] As composições da invenção compreendem uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum. Os exemplos demonstram que as bactérias deste gênero são úteis para estimular o sistema imunológico e para tratar doenças.
[051] Enterococcus gallinarum forma células cocóides, principalmente em pares ou em cadeias curtas. É móvel e as colônias no ágar sangue ou ágar nutriente são circulares e lisas. Enterococcus gallinarum reage com antissoros do grupo D de Lancefield. A cepa do tipo Enterococcus gallinarum é F87/276 = PB21 = ATCC 49573 = CCUG 18658 = CIP 103013 = JCM 8728 = LMG 13129 = NBRC 100675 = NCIMB 702313 (anteriormente NCDO 2313) = NCTC 12359 [10]. O número de acesso do GenBank para uma sequência do gene de 16S rRNA de Enterococcus gallinarum é AF039900 (divulgado neste documento como SEQ ID NO: 1). Uma cepa exemplificativa de Enterococcus gallinarum é descrita em [Erro! Indicador não definido.].
[052] A bactéria Enterococcus gallinarum, depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, foi testada nos Exemplos e também é referida neste documento como cepa MRx0518. As referências a MRx0518 e MRx0518 são usadas alternadamente. Uma sequência de 16S rRNA para a cepa MRx0518 que foi testada é fornecida na SEQ ID NO: 2. A cepa MRx0518 foi depositada na autoridade depositária internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia) pela 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escócia) em 16 de novembro de 2015 como “Enterococcus sp” e recebeu o número de acesso NCIMB 42488.
[053] O genoma da cepa MRx0518 compreende um cromossomo e um plasmídeo. Uma sequência cromossômica para a cepa MRx0518 é fornecida na SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520. Uma sequência de plasmídeo para a cepa MRx0518 é fornecida na SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520. Essas sequências foram geradas na plataforma PacBio RS II.
[054] A bactéria Enterococcus gallinarum, depositada sob o número de acesso NCIMB 42761, foi também testada nos Exemplos e também é referida neste documento como cepa MRx0554. As referências a MRx0554 e MRx0554 são usadas indistintamente. A cepa MRx0554 foi depositada junto da autoridade internacional de depósitos NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia) pela 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escócia) em 22 de maio de 2017 como “Enterococcus gallinarum MRx0554” e recebeu o número de acesso NCIMB 42761. A sequência do genoma desta bactéria é divulgada neste documento como SEQ ID NO: 2 OF WO2018/215782. A sequência do genoma foi montada a partir de múltiplos contíguos. Ns na sequência representam lacunas entre os contíguos. "N" pode representar um nucleotídeo A, G, C ou T. Uma sequência do gene de 16S rRNA para a cepa MRx0554 é fornecida na SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 representa a sequência de comprimento total presente na montagem, em vez de um consenso dos cinco genes 16S presentes em MRx0554.
[055] As cepas bacterianas intimamente relacionadas às cepas testadas nos exemplos também devem ser eficazes para simular o sistema imunológico. Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem uma sequência do gene de 16S rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou 2. Preferencialmente, a identidade de sequência é para SEQ ID NO: 2. Preferencialmente, a cepa bacteriana para uso na invenção tem a sequência do gene de 16S rRNA representada por SEQ ID NO:
2. Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem uma sequência do gene de 16S rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 3.
[056] As cepas bacterianas que são biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso 42488 também devem ser eficazes para estimular o sistema imunológico. Um biótipo é uma cepa estreitamente relacionada que tem as mesmas características ou características fisiológicas e bioquímicas muito semelhantes.
[057] As cepas que são biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 e que são adequadas para uso na invenção podem ser identificadas sequenciando outras sequências nucleotídicas para a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488. Por exemplo, substancialmente todo o genoma pode ser sequenciado e uma cepa de biótipo para uso na invenção pode ter pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência em pelo menos 80% de todo o seu genoma (por exemplo, em pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou em todo o seu genoma). Por exemplo, em algumas modalidades, uma cepa de biótipo tem pelo menos 98% de identidade de sequência através de pelo menos 98% do seu genoma ou pelo menos 99% de identidade de sequência através de 99% do seu genoma. Outras sequências adequadas para uso na identificação de cepas de biótipo podem incluir hsp60 ou sequências repetitivas como BOX, ERIC, (GTG)5 ou REP ou [11] [3]. As cepas de biótipo podem ter sequências com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB
42488. Em algumas modalidades, uma cepa de biótipo tem uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente da cepa MRx0518 depositada como NCIMB 42488 e compreende uma sequência do gene de 16S rRNA que é pelo menos 99% idêntica (por exemplo, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% idêntica) à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, uma cepa de biótipo tem uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente da cepa MRx0518 depositada como NCIMB 42488 e tem a sequência de 16S rRNA de SEQ ID NO: 2.
[058] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520. Em modalidades preferenciais, a cepa bacteriana para uso na invenção possui um cromossomo com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência) com SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520 em pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) da SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520. Por exemplo, a cepa bacteriana para uso na invenção pode ter um cromossomo com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 80% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 90% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 100% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 70% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 80% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 90% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 100% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 70% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 80% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 90% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 95% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 100% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 90% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% identidade com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 95% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 98% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520 através de 100% de SEQ ID NO:3 OF WO2017/085520.
[059] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520. Em modalidades preferenciais, a cepa bacteriana para uso na invenção possui um plasmídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência) com SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520 em pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) da SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520. Por exemplo, a cepa bacteriana para uso na invenção pode ter um plasmídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 70% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 80% de SEQ ID NO:4 OF
WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 90% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 100% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 70% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 80% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 90% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 100% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 70% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 80% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 90% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520 através de 100% de SEQ ID NO:4 OF WO2017/085520.
[060] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520 e um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520.
[061] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520, por exemplo, conforme descrito acima, e uma sequência de 16S rRNA com identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 1 ou 2, por exemplo, conforme descrito acima, preferencialmente com uma sequência de 16S rRNA que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 2, mais preferencialmente que compreende a sequência de 16S rRNA de SEQ ID NO: 2 e, opcionalmente, compreende um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520, conforme descrito acima.
[062] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520, por exemplo, conforme descrito acima, e opcionalmente compreende um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520, conforme descrito acima, e é eficaz para estimular o sistema imunológico.
[063] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520, por exemplo, conforme descrito acima, e uma sequência de 16S rRNA com identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 ou 2, por exemplo, conforme descrito acima, e opcionalmente compreende um plasmídeo com identidade de sequência para SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520, conforme descrito acima, e é eficaz para estimular o sistema imunológico.
[064] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem uma sequência de 16S rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16S rRNA representada pela SEQ ID NO: 2 (por exemplo, que compreende a sequência de 16S rRNA da SEQ ID NO: 2) e um cromossomo com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520 em pelo menos 90% de SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520 e, opcionalmente, compreende um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520, conforme descrito acima, e que é eficaz para estimular o sistema imunológico.
[065] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem uma sequência de 16S rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência do gene de 16S rRNA representada por SEQ ID NO: 2 (por exemplo, que compreende a sequência de 16S rRNA da SEQ ID NO: 2) e um cromossomo com pelo menos 98% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520 em pelo menos 98% (por exemplo, em pelo menos 99% ou pelo menos 99,5%) da SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520 e, opcionalmente, compreende um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 OF WO2017 / 085520, conforme descrito acima, e que é eficaz para estimular o sistema imunológico.
[066] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção é um Enterococcus gallinarum e tem uma sequência de 16S rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16S rRNA representada por SEQ ID NO: 2 (por exemplo, que compreende a sequência de 16S rRNA da SEQ ID NO: 2) e um cromossomo com pelo menos 98% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520 em pelo menos 98% (por exemplo, em pelo menos 99% ou pelo menos 99,5%) de SEQ ID NO: 3 OF WO2017/085520 e, opcionalmente, compreende um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 OF WO2017/085520, conforme descrito acima, e que é eficaz para estimular o sistema imunológico.
[067] Alternativamente, as cepas que são biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 e que são adequadas para uso na invenção podem ser identificadas usando o número de acesso NCIMB 42488 e análise de fragmentos de restrição e depósito e/ou análise de PCR, por exemplo, usando fluorescente polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (FAFLP) e impressão digital repetitiva do elemento de DNA (rep)-PCR ou perfil de proteínas ou sequenciamento parcial de 16S ou 23s rDNA. Em modalidades preferenciais, tais técnicas podem ser usadas para identificar outras cepas de Enterococcus gallinarum.
[068] Em certas modalidades, as cepas que são biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 e que são adequadas para uso na invenção são cepas que fornecem o mesmo padrão da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 quando analisadas por análise de restrição de DNA ribossômica amplificada (ARDRA), por exemplo, ao usar a enzima de restrição Sau3AI (para obter exemplos de métodos e orientações, por exemplo,
[12]). Alternativamente, as cepas de biótipo são identificadas como cepas que possuem os mesmos padrões de fermentação de carboidratos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB
42488. Em algumas modalidades, o padrão de fermentação de carboidratos é determinado usando o painel API 50 CHL (bioMérieux). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na invenção é: (i) positivo para a fermentação de pelo menos um de (por exem- plo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou todos): L-arabinose, D-ribose, D-xilose, D-galactose, D-glicose, D-fru- tose, D-manose, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina, salicina, D- celobiose, D-maltose, sacarose, D-trealose, gentiobiose, D-tagatose e gluconato de potássio; e/ou (ii) intermediário para a fermentação de pelo menos um de (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4 ou todos): D-manitol, Metil-αD-glicopirano- sídeo, D-lactose, amido e L-fucose; preferencialmente conforme determinado pela análise de API 50 CHL
(preferencialmente usando o painel API 50 CHL da bioMérieux).
[069] Outras cepas de Enterococcus gallinarum que são úteis nas composições e métodos da invenção, tais como biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, podem ser identificadas usando qualquer método ou estratégia apropriada, incluindo os ensaios descritos nos exemplos. Por exemplo, as cepas para uso na invenção podem ser identificadas avaliando seus efeitos nos níveis de citocinas, conforme realizado nos exemplos. Particularmente, as cepas bacterianas que têm padrões de crescimento, tipo metabólico e/ou antígenos de superfície semelhantes à bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 podem ser úteis na invenção. Uma cepa útil terá atividade moduladora imunológica comparável à cepa NCIMB 42488. Particularmente, uma cepa de biótipo irá induzir efeitos comparáveis nos modelos de doenças cancerígenas aos efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultura e administração descritos nos Exemplos. De acordo com algumas modalidades, uma cepa de biótipo que pode ser usada na invenção é uma cepa que é capaz de provocar efeitos comparáveis nos modelos de doenças cancerígenas mostrados nos Exemplos quando administrada no método da invenção.
[070] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na invenção é: (i) Positivo para pelo menos um de (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos): fermentação de manose, descarboxilase do ácido glutâmico, arginina arilamidase, fenilalanina arilamidase, ácido pi- roglutâmico arilamidase, tirosina arilamidase, histidina arilamidase e se- rina arilamidase; e/ou (ii) Intermediário para pelo menos um de (por exemplo, pelo me- nos 2 ou todos): β-galactosidase-6-fosfato, β-glucosidase e N-acetil-β- glucosaminidase; e/ou
(iii) Negativo para pelo menos um de (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou todos): Fermentação de Rafinose, Prolina arilamidase, Leucil glicina arilamidase, Leucina arilamidase, Alanina arilamidase, Gli- cina arilamidase e Glutamil glutâmico arilamidase, preferencialmente conforme determinado por um ensaio de metabo- lismo de carboidratos, aminoácidos e nitrato e, opcionalmente, um en- saio de atividade de fosfatase alcalina, mais preferencialmente con- forme determinado por análise Rapid ID 32A (preferencialmente usando o sistema Rapid ID 32A da bioMérieux).
[071] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na invenção é: (i) Negativo para pelo menos um de (por exemplo, pelo menos 2, 3 ou todos os 4) glicina arilamidase, fermentação de rafinose, prolina arilamidase e leucina arilamidase, por exemplo, conforme determinado por um ensaio de metabolismo de carboidratos, aminoácidos e nitratos, preferencialmente conforme determinado pela análise Rapid ID 32A (preferencialmente usando o sistema Rapid ID 32A da bioMérieux); e/ou (ii) Positivo intermediário para a fermentação de L-fucose, pre- ferencialmente conforme determinado pela análise API 50 CHL (prefe- rencialmente usando o painel API 50 CHL da bioMérieux).
[072] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na invenção é um produtor de ATP extracelular, por exemplo, um que produz 6-6,7 ng/μl (por exemplo, 6,1-6,6 ng/μl ou 6,2-6,5 ng/μl ou 6,33 ± 0,10 ng/μl) de ATP conforme medido usando o kit de ensaio de ATP (Sigma-Aldrich, MAK190). O ATP extracelular bacteriano pode ter efeitos pleiotrópicos, incluindo a ativação da sinalização mediada por receptor de células T (Schenk et al., 2011), promoção da diferenciação de células Th17 intestinais (Atarashi et al., 2008) e indução da secreção do mediador pró-inflamatório IL-1β ativando o inflamassoma de NLRP3 (Karmarkar et al., 2016). Consequentemente, uma cepa bacteriana que é produtora de ATP extracelular é útil para estimular o sistema imunológico no contexto do método da invenção.
[073] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais dos seguintes três genes: Proteína de elemento móvel; Transportador de Xilose ABC, componente de permease; e FIG00632333: proteína hipotética. Por exemplo, em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende genes que codificam a proteína do elemento móvel e o transportador Xilose ABC, componente de permease; Proteína do elemento móvel e FIG00632333: proteína hipotética; Transportador ABC de xilose, componente de permease e FIG00632333: proteína hipotética; ou proteína de elemento móvel, transportador Xilose ABC, componente de permease e FIG00632333: proteína hipotética.
[074] Uma cepa particularmente preferencial da invenção é a cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB
42488. Esta é a cepa MRx0518 exemplificativa testada nos exemplos e que se mostrou eficaz no tratamento de doenças. A invenção fornece, de acordo com algumas modalidades, uma composição bacteriana como parte da invenção, compreendendo uma célula da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, ou um derivado do mesmo. Um derivado da cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 pode ser uma cepa filha (descendência) ou uma cepa cultivada (subclonada) a partir do original.
[075] Um derivado de uma cepa da composição compreendida na invenção pode ser modificado, por exemplo, a nível genético, sem ablação da atividade biológica. Particularmente, uma cepa derivada da invenção é terapeuticamente ativa. Uma cepa derivada terá atividade moduladora imunológica comparável à cepa NCIMB 42488 original. Particularmente, uma cepa derivada irá induzir efeitos comparáveis nos modelos de doenças cancerígenas, que podem ser identificados usando os protocolos de cultura e administração descritos nos Exemplos. Um derivado da cepa NCIMB 42488 será geralmente um biótipo da cepa NCIMB 42488.
[076] As referências às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 englobam quaisquer células que tenham as mesmas características de segurança e eficácia terapêutica que as cepas depositadas sob o número de acesso NCIMB 42488 e essas células são englobadas pela invenção. Portanto, em algumas modalidades, a referência às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 se refere apenas à cepa MRx0518 depositada sob a NCIMB 42488 e não se refere a uma cepa bacteriana que não foi depositada sob a NCIMB 42488. Em algumas modalidades, a referência a células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 se refere a células que têm as mesmas características de segurança e eficácia terapêutica que as cepas depositadas sob o número de acesso NCIMB 42488, mas que não são a cepa depositada sob NCIMB 42488.
[077] As cepas bacterianas que são biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso 42761 também devem ser eficazes para estimular o sistema imunológico. Um biótipo é uma cepa estreitamente relacionada que tem as mesmas características ou características fisiológicas e bioquímicas muito semelhantes.
[078] As cepas que são biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42761 e que são adequadas para uso na invenção podem ser identificadas sequenciando outras sequências nucleotídicas para a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42761. Por exemplo, substancialmente todo o genoma pode ser sequenciado e uma cepa de biótipo para uso na invenção pode ter pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência em pelo menos 80% de todo o seu genoma (por exemplo, em pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% ou em todo o seu genoma). Por exemplo, em algumas modalidades, uma cepa de biótipo tem pelo menos 98% de identidade de sequência através de pelo menos 98% do seu genoma ou pelo menos 99% de identidade de sequência através de 99% do seu genoma. Outras sequências adequadas para uso na identificação de cepas de biótipo podem incluir hsp60 ou sequências repetitivas como BOX, ERIC, (GTG)5 ou REP ou [1]. As cepas de biótipo podem ter sequências com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB
42761. Em algumas modalidades, uma cepa de biótipo tem uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente da cepa MRx0554 depositada como NCIMB 42761. Em algumas modalidades, uma cepa de biótipo tem uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente da cepa MRx0554 depositada como NCIMB 42761 e tem uma sequência do gene de 16S rRNA que é pelo menos 99% idêntica (por exemplo, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% idêntica) à SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, uma cepa de biótipo tem uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente da cepa MRx0554 depositada como NCIMB 42761 e tem a sequência de 16S rRNA de SEQ ID NO: 3.
[079] Alternativamente, as cepas que são biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42761 e que são adequadas para uso na invenção podem ser identificadas usando o número de acesso NCIMB 42761 e análise de fragmentos de restrição e depósito e/ou análise de PCR, por exemplo, usando fluorescente polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (FAFLP) e impressão digital repetitiva do elemento de DNA (rep)-PCR ou perfil de proteínas ou sequenciamento parcial de 16S ou 23s rDNA.
[080] Em certas modalidades, as cepas que são biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42761 e que são adequadas para uso na invenção são cepas que fornecem o mesmo padrão da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42761 quando analisadas por análise de restrição de DNA ribossômica amplificada (ARDRA), por exemplo, ao usar a enzima de restrição Sau3AI (para obter exemplos de métodos e orientações, por exemplo,
[14]). Alternativamente, as cepas de biótipo são identificadas como cepas que possuem os mesmos padrões de fermentação de carboidratos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB
42761. Em algumas modalidades, o padrão de fermentação de carboidratos é determinado usando o painel API 50 CHL (bioMérieux). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na invenção é: (iii) positivo para a fermentação de pelo menos um de (por exem- plo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou todos): L-arabinose, D-ribose, D-xilose, D-galactose, D-glicose, D-fru- tose, D-manose, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina, salicina, D- celobiose, D-maltose, sacarose, D-trealose, gentiobiose, D-tagatose e gluconato de potássio; e/ou (iv) intermediário para a fermentação de pelo menos um de (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4 ou todos): D-manitol, Metil-αD-glicopirano- sídeo, D-lactose, amido e L-fucose; preferencialmente conforme determinado pela análise de API 50 CHL (preferencialmente usando o painel API 50 CHL da bioMérieux).
[081] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na invenção é:
(i) positivo para a fermentação de pelo menos um de (por exem- plo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou todos): L-arabinose, D-ribose, D-xilose, D-galactose, D-glicose, D-fru- tose, D-manose, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina, esculina, salicina, D-celobiose, D-maltose, D-sacarose (sacarose), D-trealose, gentiobiose, D-tagatose e gluconato de potássio; (ii) intermediário para a fermentação de pelo menos um de (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5 ou todos): D-manitol, Metil-αD-glicopira- nosídeo, D-lactose, D-rafinose, amidon (amido) e D-turanose; e/ou (iii) negativo para a fermentação de pelo menos um de (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou todos de): glicerol, eritritol, D-arabinose, L- xilose, D-adonitol, metil-βD-xilopranosídeo, L-sorbose, L-ramnose, dul- citol, inositol, D-sorbitol, Metil- αD-manopiranosídeo, D-melibiose, inu- lina, D-melezitose, glicogênio, xilitol, D-lixose, D-fucose, L-fucose, D- arabitol, L-arabitol, 2-cetogluconato de potássio e 5-cetogluconato de potássio; preferencialmente conforme determinado pela análise API 50 CHL (preferencialmente usando o painel API 50 CHL da bioMérieux, e preferencialmente usando as condições descritas no Exemplo 10).
[082] Outras cepas de Enterococcus gallinarum que são úteis nas composições e métodos da invenção, tais como biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42761, podem ser identificadas usando qualquer método ou estratégia apropriada, incluindo os ensaios descritos nos exemplos. Por exemplo, a cepa para uso na invenção pode ser identificada por cultura em YCFA anaeróbico e/ou administrando a bactéria ao modelo de camundongo com artrite induzida por colágeno tipo II e então avaliando os níveis de citocinas. Particularmente, as cepas bacterianas que têm padrões de crescimento, tipo metabólico e/ou antígenos de superfície semelhantes à bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42761 podem ser úteis na invenção. Uma cepa útil terá atividade moduladora imunológica comparável à cepa NCIMB 42761. Particularmente, uma cepa de biótipo irá induzir efeitos comparáveis nos modelos de doenças cancerígenas aos efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultura e administração descritos nos Exemplos.
[083] Um derivado de uma cepa da invenção pode ser modificado, por exemplo, a nível genético, sem ablação da atividade biológica. Particularmente, uma cepa derivada da invenção é terapeuticamente ativa. Uma cepa derivada terá atividade moduladora imunológica comparável à cepa NCIMB 42761 original. Particularmente, uma cepa derivada irá induzir efeitos comparáveis nos modelos de doenças cancerígenas aos efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultura e administração descritos nos Exemplos. Um derivado da cepa NCIMB 42761 será geralmente um biótipo da cepa NCIMB 42761.
[084] As referências às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42761 englobam quaisquer células que tenham as mesmas características de segurança e eficácia terapêutica que as cepas depositadas sob o número de acesso NCIMB 42761 e essas células são englobadas pela invenção. Portanto, em algumas modalidades, a referência às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42761 se refere apenas à cepa MRx0554 depositada sob a NCIMB 42761 e não se refere a uma cepa bacteriana que não foi depositada sob a NCIMB 42761.
[085] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção possui um genoma com identidade de sequência para a SEQ ID NO: 2 OF WO2018/215782. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção possui um genoma com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sequência identidade) à SEQ ID NO: 2 WO2018/215782 através de pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) da SEQ ID NO: 2 OF WO2018/215782. Por exemplo, a cepa bacteriana para uso na invenção pode ter um genoma com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 70% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 80% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 90% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 100% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 70% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 80% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 90% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 100% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 70% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 80% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 90% da
SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 98% de identidade através de 95% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 100% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 90% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 99,5% de identidade através de 95% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 99,5% de identidade através de 98% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782, ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782 através de 100% da SEQ ID NO:2 OF WO2018/215782.
[086] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um genoma com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 OF WO2018/215782, por exemplo, conforme descrito acima, e uma sequência do gene de 16S rRNA com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 3, por exemplo, conforme descrito acima, preferencialmente com uma sequência do gene de 16S rRNA que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 3, mais preferencialmente que compreende a sequência do gene de 16S rRNA da SEQ ID NO: 3.
[087] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um genoma com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 OF WO2018/215782, por exemplo, conforme descrito acima, e é eficaz para estimular o sistema imunológico.
[088] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem um genoma com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 OF WO2018/215782, por exemplo, conforme descrito acima, e uma sequência do gene de 16S rRNA com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 3, por exemplo, conforme descrito acima, e é eficaz para estimular o sistema imunológico.
[089] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção tem uma sequência do gene de 16S rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência do gene de 16S rRNA representada pela SEQ ID NO: 3 (por exemplo, que compreende a sequência de 16S rRNA da SEQ ID NO: 3) e um genoma com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 OF WO2018 / 215782 em pelo menos 90% da SEQ ID NO: 2 OF WO2018/215782, e que é eficaz para estimular o sistema imunológico.
[090] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção é um Enterococcus gallinarum e tem uma sequência do gene de 16S rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência do gene de 16S rRNA representada pela SEQ ID NO: 3 (por exemplo, que compreende a sequência do gene de 16S rRNA da SEQ ID NO: 3) e um genoma com pelo menos 98% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência) para SEQ ID NO: 2 OF WO2018/215782 em pelo menos 98% (por exemplo, em pelo menos 99% ou pelo menos 99,5%) de SEQ ID NO: 2 OF WO2018/215782, e que é eficaz para estimular o sistema imunológico.
[091] Nas modalidades preferidas, as cepas bacterianas nas composições da invenção são viáveis e capazes de colonizar parcial ou totalmente o intestino.
[092] Em aspectos alternativos de cada modalidade da invenção, a cepa bacteriana na composição da invenção é da espécie Enterococcus caselliflavus. Enterococcus caselliflavus é altamente semelhante a Enterococcus gallinarum e também é flagelado. Usos terapêuticos Estimulação do sistema imune
[093] Os exemplos mostram que a administração das composições da invenção pode levar à estimulação imunológica. Uma vez que a administração das composições da invenção mostrou ter um efeito imunoestimulador, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças, em particular doenças caracterizadas por ativação imunológica reduzida e doenças tratáveis por uma resposta imunológica aumentada. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na estimulação do sistema imune. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças, estimulando o sistema imune. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na promoção de uma resposta imune.
[094] As composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por um aumento na porcentagem de Tregs em uma população de células. Em uma modalidade, as composições da invenção podem ser úteis para o tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por um aumento na porcentagem de Tregs em uma população de células. Em uma modalidade, as composições da invenção podem ser úteis para o tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por um aumento na porcentagem de células CD4+CD25+CD127- em uma população de células. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças, diminuindo a porcentagem de Tregs em populações de células. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na redução da supressão da resposta imune por Tregs. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimulação da resposta imune pela redução seletiva de Tregs. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso em imunoestimulação, em que as composições da invenção reduzem o número ou a porcentagem de Tregs.
[095] As composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição na razão de células
CD8/Treg e/ou CD8/Treg ativadas. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas pela diminuição na razão de células CD8/Treg. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas pela diminuição na razão de células CD8/Treg ativadas. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimulação da resposta imune, aumentando a razão de células CD8/Treg. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimulação da resposta imune, aumentando a razão de células CD8/Treg ativadas.
[096] As composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição no número ou porcentagem de células B. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas pela diminuição no número ou porcentagem de células B. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas pela diminuição no número ou porcentagem de células CD19+CD3-. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças pelo aumento do número ou porcentagem de células B em populações de células, em que o aumento no número ou porcentagem de células B resulta em estimulação imune. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimulação da resposta imune, aumentando o número ou porcentagem de células B.
[097] As composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição no número ou porcentagem de células CD8 T citotóxicas. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas pela diminuição no número ou porcentagem de células T citotóxicas CD8. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças pelo aumento do número ou porcentagem de células T citotóxicas CD8 em populações de células, em que o aumento no número ou porcentagem de células T citotóxicas CD8 resulta em estimulação imune. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimulação da resposta imunológica, aumentando o número ou porcentagem de células CD8 T citotóxicas.
[098] As composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição no número ou porcentagem de células CD8+ ativadas. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas pela diminuição no número ou porcentagem de células CD8+ ativadas. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças pelo aumento do número ou porcentagem de células CD8+ ativadas em populações de células, em que o aumento no número ou porcentagem de células CD8+ ativadas resulta em estimulação imune. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimulação da resposta imunológica, aumentando o número ou porcentagem de células CD8+ ativadas.
[099] Os exemplos mostram que a administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão de moléculas pró-inflamatórias, tais como citocinas pró-inflamatórias. Exemplos de moléculas pró-inflamatórias que mostram um aumento nos níveis de expressão após a administração de composições da invenção incluem IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL-1 e IL-6. Uma vez que a administração das composições da invenção mostrou aumentar a expressão de moléculas pró-inflamatórias, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão de moléculas pró-inflamatórias, tais como citocinas pró-inflamatórias. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de moléculas pró-inflamatórias, em particular doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de pró-citocinas inflamatórias. Em uma modalidade particular, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de IL- 8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL-1 e/ou IL-6. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-23, TNF-α, IL- 1 e/ou IL-6. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na promoção da resposta imunológica, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL-1 e/ou IL-
6.
[100] Os exemplos também mostram que administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão de IL-1. IL-1 é uma citocina pró-inflamatória [15]. A produção e secreção de IL-1 são reguladas pelo inflamassoma, um complexo proteico que está associado à ativação da resposta inflamatória [16]. Uma vez que a administração das composições da invenção mostrou aumentar a expressão de IL-1, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão de IL-1. Em uma modalidade particular, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de IL- 1. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-1.
[101] Os exemplos também mostram que administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão de IL-23. A IL-23 foi associada à inflamação [17, 18]. As funções propostas da IL-23 na resposta imune incluem a promoção da proliferação de células T de memória CD4+ e a promoção da secreção de IFN-γ pelas células dendríticas (DCs) [19]. Uma vez que a administração das composições da invenção mostrou aumentar a expressão de IL-23, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão de IL-23. Em uma modalidade particular, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de IL-23. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-23. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na promoção da resposta imunológica, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-
23.
[102] Os exemplos mostram que a administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão do Fator de Necrose de tumor alfa (TNF-α). O TNF-α é uma citocina pró- inflamatória conhecida por estar envolvida em várias vias de sinalização para promover a morte celular. O TNF-α inicia a apoptose ligando-se ao seu receptor cognato, TNFR-1, que leva a uma cascata de eventos de clivagem na via apoptótica [20]. O TNF-α também pode desencadear a necrose por meio de um mecanismo dependente da RIP quinase [21]. Uma vez que a administração das composições da invenção mostra um aumento na expressão de TNF-α, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças, em particular para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão de TNF-α. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças caracterizadas por expressão diminuída de TNF-α. Em uma modalidade particular, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de TNF-α. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de TNF-α. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na promoção da resposta imunológica, aumentando a expressão e/ou atividade de TNF-α.
[103] Os exemplos também mostram que administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão de IL-6. IL-6 é uma citocina pró-inflamatória que é produzida durante a inflamação e promove a diferenciação de células T CD4+ virgens e a diferenciação de células T CD8+ em células T citotóxicas [22]. Uma vez que a administração das composições da invenção mostrou aumentar a expressão de IL-6, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão de IL-6. Em uma modalidade particular, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de IL-
6. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-6. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na promoção da resposta imunológica, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-6.
[104] Bettelli et al. [23] relataram que IL-6 inibe a expansão de Tregs. Uma vez que os exemplos mostram que as composições da invenção aumentam a expressão de IL-6, as composições da invenção podem diminuir seletivamente o número ou a porcentagem de Tregs ao aumentar a expressão de IL-6. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso em imunoestimulação, aumentando a expressão de IL-6. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso em imunoestimulação, diminuindo o número ou porcentagem de Tregs.
[105] Em algumas modalidades, a estimulação do sistema imunológico de acordo com a presente invenção compreende a ativação de TLR5 ou a regulação positiva da ativação de TLR5. Em algumas modalidades, estimular o sistema imunológico de acordo com a presente invenção compreende a ativação de TLR9 ou a regulação positiva da ativação de TLR9. Em algumas modalidades, a estimulação do sistema imunológico de acordo com a presente invenção compreende a ativação de TLR5 e TLR9 ou regulação positiva da ativação de TLR9 e TLR5. Em algumas modalidades, a estimulação do sistema imunológico de acordo com a presente invenção compreende a indução e/ou a regulação positiva da diferenciação de células T, tais como, mas não se limitando a, células T auxiliares e células T citotóxicas.
[106] As vias de sinalização de TLR culminam na ativação do fator de transcrição fator nuclear-kappaB (NF-κB). O NF-κB controla a expressão de uma série de genes de citocinas inflamatórias, incluindo TNF-α. A estimulação imunológica causa, por exemplo, adimerização de TLR5, que subsequentemente recruta MyD88 e ativa as proteínas quinases, incluindo IRAK1, IRAK2, IRAK4 e IRAK-M. A ativação dessas quinases leva à localização nuclear de NF-κB, que é uma citocina pró- inflamatória [24].
[107] Conforme demonstrado em um dos exemplos, as composições da invenção levam a um aumento na expressão de NF- κB. Uma vez que a administração das composições da invenção aumenta a expressão da citocina pró-inflamatória NF-κB, as composições da invenção podem ser úteis na estimulação da resposta imunológica. Além disso, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças, em particular doenças caracterizadas por ativação imunológica reduzida e/ou doenças tratáveis por uma resposta imunológica aumentada. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um estimulador imunológico, aumentando o nível e/ou atividade de NF-κB. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças caracterizadas por ativação imunológica reduzida pelo aumento do nível e/ou atividade de NF-κB. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças tratáveis por uma resposta imunológica aumentada, aumentando o nível e/ou atividade de NF-κB.
[108] Em particular, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou ativação de NF-κB. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou ativação de NF- κB.
[109] A ativação do NF-κB é importante para induzir respostas imunológicas inatas e o subsequente desenvolvimento de respostas imunológicas adaptativas. Portanto, agonistas de TLRs, tais como composições da invenção, são provavelmente úteis como adjuvantes para tratar doenças infecciosas, alergias e tumores, promovendo respostas imunológicas inatas e adaptativas [Erro! Indicador não definido.]. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças infecciosas, alergias e/ou tumores. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças infecciosas, alergias e/ou tumores, aumentando o nível e/ou atividade de NF-κB.
[110] Os exemplos também demonstram que as composições da invenção promovem a diferenciação de células T auxiliares e linfócitos
T citotóxicos. Portanto, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na estimulação da diferenciação de células T auxiliares e/ou linfócitos T citotóxicos.
[111] Em certas modalidades, a doença a ser tratada pelas composições da invenção não é câncer. Uso como um adjuvante de vacina
[112] Os exemplos mostram que a administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão do Fator de Necrose de tumor alfa (TNF-α). O TNF-α é conhecido por ser importante para as respostas às vacinas. Por exemplo, o TNF-α mostrou ser necessário para uma resposta vacinal eficiente na vacinação contra a gripe da população idosa [25]. Uma vez que a administração das composições da invenção mostraram aumentar a expressão de TNF-α, as composições da invenção podem ser úteis como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de TNF-α. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina na terapia contra influenza. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no aumento de uma resposta imunológica contra um antígeno. Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição a ser administrada em combinação com um antígeno. Em certas modalidades, as composições da invenção são para administração a um paciente logo antes ou após a vacinação.
[113] Enterococcus gallinarum e em particular a cepa MRX0518 são flagelados e as flagelinas podem ser agonistas de TLR5. Os agonistas de TLR estão em desenvolvimento como adjuvantes de vacina em uma variedade de tipos de antígenos, particularmente na população idosa [26]. Além disso, os dados nos exemplos confirmam que a flagelina MRx0518 é um agonista de TLR5. Portanto, as composições da invenção podem ser úteis como adjuvantes de vacinas, em particular para vacinas administradas a pacientes idosos (por exemplo, mais de 40, 50, 60, 70 ou 80 anos de idade), que podem ter atividade do sistema imunológico reduzida. A sinalização de TLR5 também desempenha um papel fundamental nas respostas imunológicas inatas associadas à idade [27]. Em certas modalidades, as composições são para uso no aumento de uma resposta imunológica inata. Embora os agonistas de TLR5 estejam em desenvolvimento como adjuvantes de vacinas, todos são de patógenos conhecidos e/ou sintéticos. Em contraste, as composições da invenção compreendem bactérias comensais.
[114] Os exemplos também mostram que administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão de IL-6. A expressão aumentada de IL-6 tem sido associada a respostas vacinais para muitas doenças. Por exemplo, a IL-6 foi produzida por monócitos inflamatórios CD14 + CD16- depois que adultos receberam uma vacina contra influenza [28], e níveis mais elevados de IL-6 foram associados com a obtenção de uma resposta vacinal a uma vacina contra influenza [29]. Além disso, IL-6 foi produzido após a injeção do sistema adjuvante AS03 [30] e a regulação negativa de IL-6 em camundongos mostrou reduzir a resposta de células T auxiliares após a administração de uma vacina contra tuberculose [31]. Uma vez que a administração das composições da invenção mostraram aumentar a expressão de IL-6, as composições da invenção podem ser úteis como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de IL-6. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina na terapia contra tuberculose.
[115] Além disso, foi mostrado que a expressão de IL-6 e TNF-α está correlacionada com a eficácia de uma vacina terapêutica contra o HIV [Huang et al], uma vacina contra a tuberculose e uma vacina contra a clamídia [32]. Su et al. [33] mostraram que a co-inoculação de IL-6 ou TNF-α com a vacina de DNA FMDV resultou em aumento da expressão de IFN-γ por células T CD4+ e CD8+, maior expressão de IL-4 em células T CD4+ e maior específico de antígeno resposta citotóxica. Uma vez que a administração das composições da invenção mostraram aumentar a expressão de IL-6 e TNF-α, as composições da invenção podem ser úteis como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade, as composições da invenção podem ser para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de TNF-α. Em uma modalidade, as composições da invenção podem ser para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de IL-6. Em uma modalidade particular, as composições da invenção podem ser para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de TNF-α e IL-6. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina na terapia contra HIV. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina na terapia contra clamídia.
[116] Os exemplos também mostram que administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão de IL-1. Li et al. [34] mostraram que o hidróxido de alumínio adjuvante ativou a secreção de IL-1 e sugeriram que a própria IL-1 pode atuar como adjuvante. Uma vez que a administração das composições da invenção mostraram aumentar a expressão de IL-1, as composições da invenção podem ser úteis como um adjuvante de vacina. Os exemplos mostram que a administração das composições da invenção pode aumentar a razão de células T CD8+ para Tregs. Foi mostrado que os adjuvantes estimulam as células T CD8+ [35] e uma vez que a administração das composições da invenção mostrou aumentar a razão de células T CD8+ para Tregs, as composições da invenção podem ser úteis como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, aumentando a razão de células T CD8+ para Tregs.
[117] Os exemplos também mostram que a administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão ou nos níveis dos ligantes CXCR3 CXCL9 e CXCL10. Adjuvantes conhecidos como ASO3, CpG, GLA-SE, αGalCer aumentam CXCL9 e 10 [36, 37], o que sugere que as composições da invenção serão eficazes como adjuvantes. Além disso, CXCL9 e 10 estão associados a respostas de IFNγ/Th1 e promovem respostas de anticorpos [38]. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na promoção de uma resposta de anticorpos contra um antígeno, em particular um antígeno patogênico ou de câncer. Além disso, CXCL9 é uma medida mais sensível do que IFN-γ de respostas de células T induzidas por vacina em voluntários que receberam vacinas contra a malária investigadas [39]. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na promoção de uma resposta de células T contra um antígeno, em particular, um antígeno patogênico ou de câncer. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de CXCL9 e CXCL10. Em certas modalidades, as composições são para uso na proteção contra a malária.
[118] Os exemplos também mostram que administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão ou nos níveis de IL-12p70. Este efeito foi associado à eficiência do adjuvante de vacina e a IL-12 foi proposta como um adjuvante em si
[40], o que sugere que as composições da invenção serão eficazes como adjuvantes. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de IL-12p70.
[119] Em algumas modalidades, quando usado como um adjuvante de vacina, as composições da invenção serão administradas por conta própria para fornecer um efeito adjuvante para um antígeno que foi administrado separadamente ao paciente. Em certas modalidades, a composição da invenção é administrada por via oral, enquanto o antígeno é injetado por via parentérica.
[120] As composições da invenção podem ser usadas para aprimorar uma resposta imunológica a qualquer antígeno útil. Antígenos exemplificativos para uso com a invenção incluem: antígenos virais, tais como proteínas de superfície viral; antígenos bacterianos, tais como antígenos de proteína e/ou sacarídeo; antígenos fúngicos; antígenos parasitas; e antígenos de tumor. A invenção é particularmente útil para vacinas contra o vírus influenza, HIV, ancilostomíase, vírus da hepatite B, vírus herpes simplex, raiva, vírus sincicial respiratório, citomegalovírus, Staphylococcus aureus, clamídia, coronavírus SARS, vírus varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, vírus Epstein Barr, papilomavírus humano, etc. Outros antígenos para uso com a invenção incluem antígenos de glicoproteína e lipoglicano, antígenos de archaea, antígeno de melanoma E (MAGE), antígeno carcinoembrionário (CEA), MUC-1, HER2, sialil-Tn (STn), transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT), gene do tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno específico da próstata (PSA), antígenos do vírus Epstein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, beta-amiloide, Tau, PCSK9 e substâncias formadoras de hábitos, por exemplo, nicotina,
álcool ou opiáceos.
[121] Os antígenos preferidos para uso com a invenção incluem antígenos de patógenos e antígenos de tumor. Um antígeno desencadeará uma resposta imunológica específica para o antígeno que será eficaz para proteger contra a infecção com o patógeno ou atacar o tumor. Os antígenos podem ser, por exemplo, peptídeos ou polissacarídeos.
[122] A invenção também fornece o uso de: (i) uma preparação aquosa de um antígeno; e (ii) uma composição compreendendo uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, na fabricação de um medicamento para aumentar uma resposta imunológica em um paciente.
[123] A resposta imunológica gerada por esses métodos e usos geralmente incluirá uma resposta de anticorpos, de preferência uma resposta de anticorpos protetores.
[124] Em algumas modalidades, uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum é modificada para apresentar um antígeno. A apresentação de um antígeno na cepa bacteriana da invenção pode maximizar as atividades imunoestimulatórias e aumentar ainda mais a resposta imunológica protetora gerada contra o antígeno. Além disso, a fabricação e distribuição de produtos terapêuticos compreendendo um antígeno e uma bactéria da invenção pode ser mais eficiente e eficaz desta forma do que quando cada um dos antígenos e a composição que compreende a cepa bacteriana são fabricados e administrados separadamente. Portanto, em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum que apresenta um antígeno, por exemplo, em sua superfície celular. Em algumas modalidades, a composição que compreende a cepa bacteriana que apresenta um antígeno é para uso como um antígeno de vacina. Em algumas modalidades, o antígeno é derivado de HIV, ancilostomíase, vírus da hepatite B, vírus herpes simplex, raiva, vírus sincicial respiratório, citomegalovírus, Staphylococcus aureus, clamídia, SARS coronavírus, vírus varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, vírus Epstein Barr ou papilomavírus humano. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno de glicoproteína, antígeno de lipoglicano, antígeno de archaea, antígeno de melanoma E (MAGE), antígeno carcinoembriônico (CEA), MUC-1, HER2, sialil-Tn (STn), transcriptase reversa de telomerase humana (hTERT), Gene do tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno específico da próstata (PSA), antígenos do vírus Epstein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, beta-amiloide, Tau, PCSK9 ou uma substância formadora de hábito, como álcool, opiáceos e semelhantes.
[125] Em algumas modalidades, as bactérias da invenção expressam um ou mais antígenos. Geralmente, o antígeno será expresso de forma recombinante e será heterólogo para as bactérias da invenção. Portanto, a invenção fornece uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum que expressa um antígeno heterólogo. O antígeno pode ser parte de um polipeptídeo de fusão expresso com um ou mais polipeptídeos homólogos à bactéria. Em algumas modalidades, as bactérias expressam o antígeno como um polipeptídeo de não fusão. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição que compreende uma célula de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, em que a célula expressa um antígeno heterólogo. Em algumas modalidades, a composição é para uso como vacina. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma célula de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, em que a célula expressa um antígeno heterólogo. Em algumas modalidades, a célula é para uso como vacina.
[126] Antígenos exemplificativos para uso com a invenção incluem: antígenos virais, tais como proteínas de superfície viral; antígenos bacterianos, tais como antígenos de proteína e/ou sacarídeo; antígenos fúngicos; antígenos parasitas; e antígenos de tumor. Outros antígenos para expressão numa cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum incluem antígenos de glicoproteína e lipoglicano, antígenos de archaea, antígeno de melanoma E (MAGE), antígeno carcinoembrionário (CEA), MUC-1, HER2, sialil-Tn (STn), telomerase reversa humana transcriptase (hTERT), gene do tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno específico da próstata (PSA), antígenos do vírus Epstein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, beta-amiloide, Tau, PCSK9 e substâncias formadoras de hábito, por exemplo, nicotina, álcool, opiáceos ou semelhantes.
[127] A invenção também pode ser útil para aprimorar a resposta a vacinas contra doenças não transmissíveis, como colesterol elevado (por exemplo, através do antígeno PCSK9).
[128] A invenção também podem ser úteis para aprimorar a resposta a vacinas contra substâncias que formam hábitos, por exemplo, nicotina, álcool ou opiáceos. Terapias Celulares Terapia de Célula T Receptora de Antígeno Quimérico (CAR-T)
[129] Os exemplos também mostram que administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão de IL-6. A expressão aumentada de IL-6 foi correlacionada com a resposta à terapia CD19 CAR-T de leucemia linfocitária crônica. Um aumento na IL-6 sérica foi associado à expansão das células CAR-T, enquanto a inibição da IL-6 foi associada à inibição da proliferação das células CAR- T [41]. Uma vez que a administração das composições da invenção mostrou aumentar a expressão de IL-6, as composições da invenção podem ser úteis na terapia celular, em particular na terapia com células
CAR-T. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso em terapia celular. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na terapia com células CAR-T. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de leucemia linfocitária crônica.
[130] Foi demonstrado que a depleção seletiva de Tregs aumenta a eficácia dos linfócitos citotóxicos [42]. As células CAR-T são um subconjunto de linfócitos citotóxicos e, portanto, acredita-se que a depleção seletiva de Tregs seja eficaz na terapia com células CAR-T. Uma vez que a administração das composições da invenção mostrou esgotar Tregs, as composições da invenção podem ser úteis na terapia celular, em particular na terapia com células CAR-T.
[131] Portanto, as composições da invenção podem ser úteis em terapia celular, em particular no aumento da resposta a uma terapia celular. Terapia de células mesenquimais (MSC)
[132] Foi relatado que a terapia com células-tronco mesenquimais (MSC) tem propriedades imunoestimulatórias. Quando as MSCs são tratadas com LPS, elas regulam positivamente as citocinas pró- inflamatórias IL-6 e IL-8, que causam aumento da proliferação de células B [43]. Portanto, uma vez que as composições da invenção mostraram aumentar a expressão de IL-6, elas podem ser úteis em combinação com terapia com células MSC. Terapia de Transplante de Células-tronco
[133] Foi relatado que, em vez de usar células-tronco indiferenciadas na terapia de transplante de células-tronco, pode ser benéfico diferenciar as células-tronco até certo ponto antes do transplante. Por exemplo, Heng et al. [44] relataram que a diferenciação cardiomiogênica de células-tronco pode ser benéfica por ter uma maior eficiência de enxerto, regeneração aprimorada de miócitos e restauração aumentada da função cardíaca. Uma vez que a administração das composições da invenção iniciou a diferenciação neuronal em células de neuroblastoma indiferenciadas, as composições da invenção podem ser úteis para a diferenciação de células-tronco na terapia de transplante de células-tronco. Transplante de Células-tronco Hematopoiéticas
[134] O transplante de células tronco hematopoiéticas é o transplante de células tronco hematopoiéticas multipotentes, geralmente derivadas de medula óssea, sangue periférico ou sangue do cordão umbilical. A colonização do intestino com Enterococci (Enterococcus gallinarum e Enterococcus casseliflavus) antes do transplante de células-tronco hematopoéticas alogênicas demonstrou levar a uma melhora significativa na sobrevivência de 2 anos dos pacientes devido à diminuição da mortalidade não recidivante [45]. Portanto, o efeito imunomodulador mostrado nos exemplos pode ser útil na terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas. Em certas modalidades, as composições da invenção podem ser úteis para melhorar a sobrevivência após o transplante de células-tronco hematopoiéticas e, em particular, após o transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas.
[135] As composições da invenção podem ser úteis em combinação com o transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas. As composições da invenção podem ter efeito no aumento da resposta bem-sucedida do paciente ao transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas. Em certas modalidades, as composições da invenção são administradas antes do transplante de células-tronco hematopoiéticas. Em certas modalidades, as composições da invenção são para administração a um paciente programado para receber o transplante de células-tronco hematopoiéticas. Em certas modalidades, as composições da invenção são administradas após o transplante de células-tronco hematopoiéticas. Em certas modalidades, as composições da invenção são para administração a um paciente que recebeu o transplante de células-tronco hematopoiéticas. Imunossenescência
[136] Fulop et al. [46] identificaram que um aumento no número de células Treg e uma diminuição no número de células B estão associados ao envelhecimento no sistema imunológico adaptativo. Portanto, as composições da invenção podem ser usadas para prevenir ou retardar a imunossenescência. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na prevenção da imunossenescência. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso no retardo da imunossenescência caracterizada por um aumento no número de células Treg. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso no retardo da imunossenescência caracterizada por uma diminuição no número de células B. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso no retardo da imunossenescência caracterizada por um aumento no número de células Treg e uma diminuição no número de células B. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no retardo da imunossenescência, diminuindo o número de células Treg. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no retardo da imunossenescência pelo aumento do número de células B. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso no retardo da imunossenescência, diminuindo o número de células Treg e aumentando o número de células B. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças causadas por imunossenescência. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças relacionadas ao envelhecimento, retardo e/ou prevenindo a imunossenescência.
[137] Além disso, foi proposto que os adjuvantes de vacina podem superar a imunossenescência [47]. Uma vez que as composições da invenção são adequadas para uso como um adjuvante de vacina, as composições da invenção podem ser úteis para prevenir ou retardar a imunossenescência. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso no retardo e/ou prevenção da imunossenescência como um adjuvante de vacina. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, em que as composições retardam e/ou evitam a imunossenescência.
[138] As doenças que estão associadas à imunossenescência incluem doenças cardiovasculares, câncer, diabetes mellitus tipo 2 [48] e distúrbios autoimunes [49]. Modos de administração
[139] Preferencialmente, as composições da invenção devem ser administradas no trato gastrointestinal para permitir a transmissão para e/ou a colonização parcial ou total do intestino com a cepa bacteriana da invenção. Geralmente, as composições da invenção são administradas por via oral (incluindo sublingual), mas podem ser administradas por via retal ou intranasal.
[140] Em certas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas como uma espuma, como um spray ou um gel.
[141] Em certas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas como um supositório, tal como um supositório retal, por exemplo na forma de um óleo de teobroma (manteiga de cacau), gordura dura sintética (por exemplo, suppocire, witepsol), glicerolatina, polietilenoglicol ou composição de glicerina de sabão.
[142] Em certas modalidades, a composição da invenção é liberada no trato gastrointestinal através de um tubo, tal como um tubo nasogástrico, tubo orogástrico, tubo gástrico, tubo de jejunostomia (tubo
J), gastronomia endoscópica percutânea (PEG), ou uma porta, tal como uma porta de parede torácica que fornece acesso ao estômago, jejuno e outras portas de acesso adequadas.
[143] As composições da invenção podem ser administradas uma vez, ou podem ser administradas sequencialmente como parte de um regime de tratamento. Em certas modalidades, as composições da invenção devem ser administradas diariamente.
[144] Em certas modalidades da invenção, o tratamento de acordo com a invenção é acompanhado por avaliação da microbiota intestinal do paciente. O tratamento pode ser repetido se a distribuição e/ou colonização parcial ou total com a cepa da invenção não for alcançada, de modo que a eficácia não seja observada, ou o tratamento pode ser interrompido se a distribuição e/ou colonização parcial ou total for bem- sucedida e se for observada eficácia.
[145] Em certas modalidades, a composição da invenção pode ser administrada em um animal gestante, por exemplo, um mamífero tal como um ser humano para reduzir a probabilidade de se desenvolver uma doença em seu filho in utero e/ou após o nascimento.
[146] As composições da invenção podem ser administradas a um paciente que foi diagnosticado com uma doença ou condição mediada pela atividade imunológica reduzida, ou que foi identificado como estando em risco de uma doença ou condição mediada pela atividade imunológica reduzida. As composições também podem ser administradas como uma medida profilática para prevenir o desenvolvimento de doenças ou condições mediadas pela atividade imunológica reduzida em um paciente saudável.
[147] As composições da invenção podem ser administradas a um paciente que foi diagnosticado com atividade imunológica deficiente ou que foi identificado como estando em risco de atividade imunológica deficiente. Por exemplo, o paciente pode ter colonização reduzida ou ausente por Enterococcus, e em particular Enterococcus gallinarum.
[148] As composições da invenção podem ser administradas como um produto alimentício, tal como um suplemento nutricional.
[149] Geralmente, as composições da invenção são para o tratamento de humanos, embora possam ser usadas para tratar animais incluindo mamíferos monogástricos tais como aves domésticas, porcos, gatos, cães, cavalos ou coelhos. As composições da invenção podem ser úteis para melhorar o crescimento e desempenho dos animais. Se liberada a animais, a gavagem oral pode ser usada. Composições
[150] Geralmente, a composição da invenção compreende bactérias. Nas modalidades preferidas da invenção, a composição é formulada sob a forma liofilizada. Por exemplo, a composição da invenção pode compreender grânulos ou cápsulas de gelatina, por exemplo, cápsulas de gelatina duras, compreendendo uma cepa bacteriana da invenção.
[151] Preferencialmente, a composição da invenção compreende bactérias liofilizadas. A liofilização de bactérias é um procedimento bem estabelecido e orientações relevantes estão disponíveis, por exemplo, nas referências [50, 51, 52].
[152] Alternativamente, a composição da invenção pode compreender uma cultura bacteriana ativa e viva.
[153] Em modalidades preferidas, a composição da invenção é encapsulada para permitir a transmissão da cepa bacteriana ao intestino. A encapsulação protege a composição da degradação até sua distribuição no local alvo através, por exemplo, da ruptura com estímulos químicos ou físicos tais como pressão, atividade enzimática ou desintegração física, que podem ser desencadeados por mudanças no pH. Qualquer método de encapsulação apropriado pode ser usado. Exemplos de técnicas de encapsulação incluem aprisionamento dentro de uma matriz porosa, ligação ou adsorção em superfícies carreadoras sólidas, autoagregação por floculação ou com agentes de reticulação e contenção mecânica atrás de uma membrana microporosa ou uma microcápsula. As orientações sobre encapsulação que podem ser úteis para preparar as composições da invenção estão disponíveis, por exemplo, nas referências [53] e [54].
[154] A composição pode ser administrada oralmente e pode estar sob a forma de um comprimido, cápsula ou pó. Produtos encapsulados são preferidos porque Enterococcus são anaeróbios. Outros ingredientes (como vitamina C, por exemplo), podem ser incluídos como eliminadores de oxigênio e substratos prebióticos para melhorar a distribuição e/ou colonização e sobrevivência parcial ou total in vivo. Alternativamente, a composição probiótica da invenção pode ser administrada oralmente como um produto alimentício ou nutricional, tal como leite ou produto lácteo fermentado à base de soro de leite, ou tal como um produto farmacêutico.
[155] A composição pode ser formulada como um probiótico.
[156] Uma composição da invenção inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana da invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana é suficiente para exercer um efeito benéfico sobre um paciente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana pode ser suficiente para resultar na distribuição e/ou colonização parcial ou total do intestino do paciente.
[157] Uma dose diária adequada da bactéria, por exemplo para um humano adulto, pode ser de cerca de 1 x 103 a cerca de 1 x 1011unidades formadoras de colônias (CFU); por exemplo, de cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 1010 CFU; em outro exemplo, de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 1010 CFU; em outro exemplo, de cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 1011 CFU; em outro exemplo, de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x
1010 CFU; em outro exemplo, de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1011 CFU.
[158] Em certas modalidades, a dose da bactéria é de pelo menos de 109 células por dia, como pelo menos 1010, pelo menos 1011, ou pelo menos 1012 células por dia.
[159] Em certas modalidades, a composição contém a cepa bacteriana em uma quantidade de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 1011 CFU/g, em relação ao peso da composição; por exemplo, de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1010 CFU/g. A dose pode ser, por exemplo, de 1 g, 3g, 5g e 10g.
[160] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a quantidade da cepa bacteriana é de cerca de 1 × 103 a cerca de 1 × 1011 unidades formadores de colônia por grama em relação ao peso da composição.
[161] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada em uma dose de entre 500 mg e 1000 mg, entre 600 mg e 900 mg, entre 700 mg e 800 mg, entre 500 mg e 750 mg ou entre 750 mg e 1000 mg. Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a bactéria liofilizada na composição farmacêutica é administrada em uma dose entre 500 mg e 1000 mg, entre 600 mg e 900 mg, entre 700 mg e 800 mg, entre 500 mg e 750 mg ou entre 750 mg e 1000 mg.
[162] Tipicamente, um probiótico, tal como a composição da invenção, é opcionalmente combinado com pelo menos um composto prebiótico adequado. Um composto prebiótico é geralmente um carboidrato não digerível, como um oligo- ou polissacarídeo, ou um álcool de açúcar, que não é degradado ou absorvido no trato digestivo superior. Os prebióticos conhecidos incluem produtos comerciais tais como inulina e trans-galacto-oligossacarídeos.
[163] Em certas modalidades, a composição probiótica da presente invenção inclui um composto prebiótico em uma quantidade de cerca de 1 a cerca de 30% por peso, em relação à composição de peso total (por exemplo, de 5 a 20% por peso). Os carboidratos podem ser selecionados dentre o grupo que consiste em: frutooligossacarídeos (ou FOS), frutooligossacarídeos de cadeia curta, inulina, isomalto- oligossacarídeos, pectinas, xilooligossacarídeos (ou XOS), oligossacarídeos de quitosana (ou COS), beta-glucanos, amidos de goma arábica modificada e resistente, polidextrose, D-tagatose, fibras de acácia, alfarroba, aveia e fibras de citrinos. Em um aspecto, os prebióticos são os fruto-oligossacarídeos de cadeia curta (para simplicidade, mostrado abaixo como FOSs-cc); os referidos FOSs-cc não são carboidratos digeríveis, geralmente obtidos pela conversão do açúcar de beterraba e a inclusão de uma molécula de sacarose à qual três moléculas de glicose estão ligadas.
[164] As composições da invenção podem compreender excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tais excipientes adequados podem ser encontrados na referência [55]. Os carreadores ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, na referência [56]. Os exemplos de carreadores adequados incluem lactose, amido, glicose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e semelhantes. Exemplos de diluentes adequados incluem etanol, glicerol e água. A escolha do carreador, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser selecionada em relação à via de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como, ou em adição, o carreador, excipiente ou diluente quaisquer ligantes, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de revestimento e agentes solubilizantes adequados. Exemplos de ligantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais tais como glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, edulcorantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tais como acácia, tragacanto ou alginato de sódio, carboximetilcelulose e polietilenoglicol. Exemplos de lubrificantes adequados incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Conservantes, estabilizantes, corantes e mesmo agentes aromatizantes podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Exemplos de conservantes incluem benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p- hidroxibenzoico. Antioxidantes e agentes de suspensão também podem ser usados.
[165] As composições da invenção podem ser formuladas como um produto alimentício. Por exemplo, um produto alimentício pode fornecer um benefício nutricional para além do efeito terapêutico da invenção, tal como num suplemento nutricional. De um modo semelhante, um produto alimentício pode ser formulado para melhorar o sabor da composição da invenção ou para tornar a composição mais atrativa para o consumo ao torná-la mais semelhante a um artigo alimentício comum, em vez de uma composição farmacêutica. Em certas modalidades, a composição da invenção é formulada como um produto à base de leite. O termo "produto à base de leite" significa qualquer produto à base de leite ou soro de leite líquido ou semissólido com um teor de gordura variável. O produto à base de leite pode ser, por exemplo, leite de vaca, leite de cabra, leite de ovelha, leite desnatado, leite integral, leite reconstituído a partir de leite em pó e soro de leite sem qualquer processamento, ou um produto processado, como iogurte, leite coalhado, coalhada, leite azedo, leite integral azedo, leitelho e outros produtos lácteos azedos. Outro grupo importante inclui bebidas lácteas, como bebidas de soro de leite, leites fermentados, leites condensados, leites infantis ou para bebês; leites aromatizados, sorvetes; alimentos contendo leite, como doces.
[166] Em certas modalidades, as composições da invenção contêm uma única cepa ou espécie bacteriana e não contêm quaisquer outras cepas ou espécies bacterianas. Tais composições podem compreender apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de outras cepas ou espécies bacterianas. Tais composições podem ser uma cultura que é substancialmente livre de outras espécies de organismos.
[167] As composições para uso de acordo com a invenção podem ou não requerer aprovação comercial.
[168] Em alguns casos, a cepa bacteriana liofilizada é reconstituída antes da administração. Em alguns casos, a reconstituição é feita através de um diluente descrito neste documento.
[169] As composições da invenção podem compreender excipientes, diluentes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.
[170] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar um distúrbio quando administrado a um sujeito em necessidade desta.
[171] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição.
[172] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição.
[173] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição.
[174] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição mediada por citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1, TNF-α, MIP-3α, IL-23 ou IL-6. Numa modalidade preferida, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição mediada por TNF-α.
[175] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a quantidade da cepa bacteriana é de cerca de 1 × 103 a cerca de 1 × 1011 unidades formadores de colônia por grama em relação ao peso da composição.
[176] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada numa dose de 1 g, 3 g, 5 g ou 10 g.
[177] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada por um método selecionado dentre o grupo que consiste em oral, retal, subcutânea, nasal, bucal e sublingual.
[178] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um carreador selecionado dentre o grupo que consiste em lactose, amido, glicose, metilcelulose,
estearato de magnésio, manitol e sorbitol.
[179] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um diluente selecionado dentre o grupo que consiste em etanol, glicerol e água.
[180] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um excipiente selecionado dentre o grupo que consiste em amido, gelatina, glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, edulcorante de milho, acácia, tragacanto, alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietilenoglicol, oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio e cloreto de sódio.
[181] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo ainda pelo menos um dentre um conservante, um antioxidante e um estabilizador.
[182] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um conservante selecionado dentre o grupo que consiste em benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico.
[183] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a referida cepa bacteriana é liofilizada.
[184] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que quando a composição é armazenada num recipiente vedado a cerca de 4°C ou cerca de 25°C e o recipiente é colocado numa atmosfera com a umidade relativa a 50%, pelo menos 80% da cepa bacteriana medida em unidades formadoras de colônias permanece após um período de pelo menos cerca de: 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos. Métodos de cultura
[185] As cepas bacterianas para utilização na presente invenção podem ser cultivadas utilizando-se técnicas convencionais de microbiologia, como detalhado, por exemplo, nas referências [57, 58, 59].
[186] O meio sólido ou líquido utilizado para a cultura pode ser, por exemplo, meio de ágar YCFA ou meio YCFA. O meio YCFA pode incluir (por 100mL, valores aproximados): Casitone (1,0 g), extrato de levedura (0,25 g), NaHCO3 (0,4 g), cisteína (0,1 g), K2HPO4 (0,045 g), KH2PO4 (0,045 g), NaCl (0,09 g), (NH4)2SO4 (0,09 g), MgSO4 · 7H2O (0,009 g), CaCl2 (0,009 g), resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 μg), cobalamina (1 μg), ácido p-aminobenzoico (3 μg), ácido fólico (5 μg), e piridoxamina (15 μg). Cepas bacterianas para serem usadas em composições de vacinas
[187] Os inventores identificaram que as cepas bacterianas da invenção são úteis para o tratamento ou prevenção de doenças ou condições associadas à redução da atividade imune. É provável que isto seja um resultado do efeito que as cepas bacterianas da invenção têm no sistema imunológico do hospedeiro. Portanto, as composições da invenção também podem ser úteis para prevenir doenças ou condições, quando administradas como composições de vacina. Em certas tais modalidades, as cepas bacterianas da invenção podem ser mortas, inativadas ou atenuadas. Em certas tais modalidades, as composições podem compreender um adjuvante de vacina. Em certas modalidades, as composições são para administração via injeção, tal como através de injeção subcutânea. Geral
[188] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, biologia molecular, imunologia e farmacologia, dentro da perícia na técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Veja, por exemplo, as referências [60] e [61, 68, 69, 70, 71, 72, 73], etc.
[189] O termo “compreendendo” engloba “incluindo” bem como
“consistindo”, por exemplo, uma composição “compreendendo” X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemploX + Y.
[190] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x é opcional e significa, por exemplo, x+10%.
[191] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.
[192] Referências a uma identidade de sequência percentual entre duas sequências nucleotídicas significa que, quando alinhadas, essa porcentagem de nucleotídeos é a mesma na comparação das duas sequências. Este alinhamento e a porcentagem de homologia ou de identidade de sequência podem ser determinadas utilizando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo os descritos na seção
7.7.18 da ref. [62]. Um alinhamento preferencial é determinado pelo algoritmo de pesquisa de homologia da Smith-Waterman, utilizando uma pesquisa de lacuna afim com uma penalidade para lacuna de abertura de 12 e uma penalidade para lacuna de extensão de 2, matriz de BLOSUM de 62. O algoritmo de pesquisa de homologia de Smith- Waterman é divulgado na ref. [63].
[193] A menos que especificamente indicado, um processo ou método compreendendo inúmeras etapas pode compreender etapas adicionais no início ou no fim do método, ou pode compreender etapas intervenientes adicionais. Além disso, as etapas podem ser combinadas, omitidas ou executadas em uma ordem alternativa, se apropriado.
[194] Várias modalidades da invenção são descritas neste documento. Será apreciado que as características especificadas em cada modalidade podem ser combinadas com outras características especificadas, para fornecer outras modalidades. Em particular, as modalidades destacadas neste documento como sendo adequadas, típicas ou preferidas, podem ser combinadas umas com as outras (exceto quando forem mutuamente exclusivas).
MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Exemplo 1 - Eficácia de inóculos bacterianos em modelos de cân- cer de camundongo Sumário
[195] Este estudo testou a eficácia de composições compreendendo cepas bacterianas de acordo com a invenção em quatro modelos de tumor. Materiais
[196] Substância de teste - Cepa bacteriana nºMRx0518.
[197] Substância de referência - Anticorpo anti-CTLA-4 (clone: 9H10, catálogo: BE0131, isotipo: Hamster Sírio IgG1, Bioxcell).
[198] Veículos de substâncias de teste e referência - Meio de cultura bacteriana (extrato de levedura, casitona, meio de ácido graxo (YCFA)). Cada dia de injeção em camundongos, o anticorpo foi diluído com PBS (ref: BE14-516F, Lonza, França).
[199] Doses de tratamento - Bactéria: 2x108 em 200 µL. O anti- CTLA-4 foi injetado a 10 mg/kg/inj. O anti-CTLA-4 foi administrado em um volume de dose de 10 mL/kg/adm (ou seja, para um camundongo pesando 20 g, 200 µL da substância de teste serão administrados) de acordo com o peso corporal mais recente dos camundongos.
[200] Vias de administração - O inóculo bacteriano foi administrado por gavagem oral (per os, PO) por meio de uma cânula. As cânulas eram descontaminadas todos os dias. Anti-CTLA-4 foi injetado na cavidade peritoneal de camundongos (intraperitonealmente, IP).
[201] Condições de cultura da cepa bacteriana - As condições de cultura para a cepa bacteriana foram as seguintes:  Pipetar 10 mL de YCFA (a partir dos frascos de laboratório de E&O de 10 mL) para tubos Hungate  Vedar os tubos e enxaguar com CO2 usando uma entrada de seringa e sistema de exaustão  Autoclavar os tubos Hungate  Quando resfriados, inocular os tubos Hungate com 1 mL dos estoques de glicerol  Colocar os tubos em uma incubadora estática a 37°C por cerca de 16 horas.  No dia seguinte, tomar 1 mL desta subcultura e inocular 10 mL de YCFA (tubos Hungate pré-aquecidos novamente, todos em du- plicata)  Colocá-los em uma incubadora estática a 37°C durante 5 a 6h Linhagens celulares de câncer e condições de cultura -
[202] As linhagens celulares que foram utilizadas são detalhadas na tabela abaixo: Linhagem Cepa de ca- Tipo Origem celular mundongo Carcinoma de BALB/c EMT-6 ATCC mama Carcinoma pul- C57BL/6 LL/2 (LLC1) ATCC CRL1642 monar Carcinoma he- C57BL/6 IPSEN INNO- Hepa1-6 patocelular VATION Adenocarcinoma BALB/c
RENCA ATCC renal
[203] A linhagem celular EMT-6 foi estabelecida a partir de um carcinoma mamário murino transplantável que surgiu em um camundongo BALB/cCRGL após o implante de um nódulo alveolar mamário hiperplásico [64].
[204] A linhagem celular LL/2 (LLC1) foi estabelecida a partir do pulmão de um camundongo C57BL/6 com um tumor resultante de uma implantação de carcinoma primário de pulmão de Lewis [65].
[205] A linhagem celular Hepa 1-6 é um derivado do hepatoma de camundongo BW7756 que surgiu em um camundongo C57/L [66].
[206] Condições de cultura de células - Todas as linhagens celulares foram cultivadas como monocamada a 37°C em uma atmosfera umidificada (CO2 a 5%, ar a 95%). O meio de cultura e o suplemento são indicados na tabela abaixo: Linhagem Meios de cultura Suplemento celular RPMI 1640 contendo L- soro fetal bovino a 10% (ref: EMT6 glutamina a 2mM (ref: nº 3302, Lonza) BE12-702F, Lonza) RPMI 1640 contendo L- LL/2 soro fetal bovino a 10% (ref: glutamina a 2mM (ref: (LLC1) nº 3302, Lonza) BE12-702F, Lonza) soro fetal bovino a 10% (ref: nº 3302, Lonza) DMEM (ref: 11960-044, Hepa1-6 2mM L-Glutamina Gibco) penicilina-estreptomicina (Sigma G-6784) soro fetal bovino a 10%, 2mM RENCA DMEM de L-glutamina, 1ug/mL de puromicina
[207] Para uso experimental, as células de tumor aderentes foram destacadas do frasco de cultura por um tratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (ref: BE17-161E, Lonza), em meio de Hanks sem cálcio ou magnésio (ref: BE10-543F, Lonza) e neutralizado pela adição de meio de cultura completo. As células foram contadas em hemocitômetro e sua viabilidade será avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano a 0,25%. Uso de animais -
[208] Camundongos fêmeas BALB/C (BALB/cByJ) saudáveis, de peso e idade correspondentes, foram obtidos a partir de CHARLES RIVER para as experiências dos modelos EMT6 e RENCA.
[209] Camundongos fêmeas saudáveis C57BL/6 (C57BLl6J), de peso e idade correspondentes, foram obtidos de CHARLES RIVER (L'Arbresles) para os experimentos modelo LL/2(LLC1) e Hepa1-6.
[210] Os animais foram mantidos em estado de saúde SPF, de acordo com as diretrizes da FELASA, e o alojamento dos animais e os procedimentos experimentais de acordo com os regulamentos franceses e europeus e o Guia NRC para o cuidado e uso de animais de laboratório [68, 68]. Os animais foram mantidos em alojamentos em condições ambientais controladas: Temperatura: 22±2°C, Umidade 55±10%, Fotoperíodo (12h claro/12h escuro), Ar filtrado HEPA, 15 trocas de ar por hora sem recirculação. Os recintos dos animais foram fornecidos com espaço estéril e adequado com material de leito, comida e água, enriquecimento ambiental e social (alojamento coletivo) conforme descrito: gaiolas de 900 cm2 (ref: verde, Tecniplast) em racks ventilados, cama Epicea (SAFE), 10 kGy Dieta irradiada (A04-10, SAFE), Alimento completo para roedores imunocompetentes Extrudado -R/M-H, água de garrafas de água. Delineamento experimental e tratamentos Atividade antitumoral, modelo EMT6
[211] Esquema de tratamento - O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em grupos de 9/8 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, França). No D0, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxertados com células de tumor EMT-6 conforme descrito abaixo. No D24, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpos anti-CTLA-4.
[212] O esquema de tratamento está resumido na tabela abaixo: Nº de Esquema de Grupo Tratamento Dose Via Animais Tratamento 1 8 Não tratadas - - - 2 8 Veículo (meio) - PO Q1Dx42 Cepa bacteri- 2x108 3 9 ana nº1 PO Q1Dx42 bactérias (MRx0518) 4 8 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP TWx2
[213] O monitoramento dos animais foi realizado conforme descrito a seguir.
[214] Indução de tumores EMT6 em animais - No D14, os tumores foram induzidos por injeção subcutânea de 1x106 células EMT-6 em 200 µL de RPMI 1640 no flanco direito de camundongos.
[215] Eutanásia - Cada camundongo foi sacrificado quando atingiu um desfecho humano, conforme descrito abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o início da dosagem. Atividade antitumoral, modelo LL/2 (LLC1)
[216] Esquema de tratamento - O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 grupos de 9/8 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, França). No D0, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxertados com células de tumor LL/2 conforme descrito abaixo. No D27, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpos anti-CTLA-4.
[217] O esquema de tratamento está resumido na tabela abaixo: Esquema Nº de Grupo Tratamento Dose Via de Trata- Animais mento 1 8 Não tratadas - - - 2 9 Veículo (meio) - PO Q1Dx42 Cepa bacteri- 2x108 bac- 3 9 ana nº1 PO Q1Dx42 térias (MRx0518) 4 8 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP TWx2
[218] O monitoramento dos animais foi realizado conforme descrito a seguir.
[219] Indução de tumores LL/2 (LLC1) em animais - No D14, os tumores foram induzidos por injeção subcutânea de 1x106 células LL/2 (LLC1) em 200 µL RPMI 1640 no flanco direito dos camundongos.
[220] Eutanásia - Cada camundongo foi sacrificado quando atingiu um desfecho humano, conforme descrito abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o início da dosagem. Atividade antitumoral, modelo Hepa1-6
[221] Esquema de tratamento - O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 grupos de 9 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, França). No D0, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxertados com células de tumor Hepa 1-6 conforme descrito abaixo. No D16, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpos anti-CTLA-4.
[222] O esquema de tratamento está resumido na tabela abaixo: Nº de Esquema de Grupo Tratamento Dose Via Animais Tratamento 1 9 Não tratadas - - - 2 9 Veículo (meio) - PO Q1Dx42 Cepa bacteri- 2x108 bac- 6 9 ana nº4 PO Q1Dx42 térias (MRx0518) 7 9 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP TWx2
[223] O monitoramento dos animais foi realizado conforme descrito a seguir.
[224] Indução ortotópica de células de tumor Hepa 1-6 em animais por injeção intraesplênica - Em D0, um milhão (1x106) de células de tumor Hepa 1-6 em 50 µL de meio RPMI 1640 foram transplantadas via injeção intra-esplênica em camundongos. Resumidamente, uma pequena incisão no flanco subcostal esquerdo foi feita e o baço foi exteriorizado. O baço foi exposto em gaze estéril e injetado sob controle visual com a suspensão de células com agulha de calibre 27. Após a inoculação das células, o baço foi excisado.
[225] Eutanásia - Cada camundongo foi sacrificado quando atingiu um desfecho humano, conforme descrito na seção abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o início da dosagem.
[226] Avaliação da carga de tumor na eutanásia - No momento da interrupção, os fígados foram coletados e pesados. Atividade antitumoral, modelo RENCA
[227] Esquema de tratamento - O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em grupos de 12 camundongos. No D0, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana (2x108 em 100 µL, PO). Em D14, todos os camundongos foram enxertados com células de tumor RENCA injetadas SC no flanco traseiro esquerdo conforme descrito abaixo. O tratamento com anti-CTLA-4 (clone 9D9, 10 mg/kg, IP) e anti-PDL1 (clone 10F.9G2, 10 mg/kg, IP) foi iniciado a partir de D17.
[228] O esquema de tratamento está resumido na tabela abaixo: Nº de Esquema de Grupo Tratamento Dose Via Animais Tratamento 1 12 Não tratadas - - - 2 12 Veículo (meio) - PO QD Cepa bacteri- 2x108 bac- 3 12 PO QD ana (MRx0518) térias Q4D (a cada 4 12 Paclitaxel 15 mg/kg IP quatro dias) BIW (duas vezes por Anti-CTLA4 + 10 mg/kg + 5 12 IP semana) Anti-PDL1 10 mg/kg A partir do dia 3
[229] O monitoramento dos animais foi realizado conforme descrito a seguir.
[230] No D14 (após 2 semanas de dosagem/pré-tratamento bacteriano), 5x105 células viáveis em 100 µL de PBS foram injetadas por via subcutânea no flanco traseiro esquerdo de cada camundongo (que foi esterilizado com espírito cirúrgico), 1 seringa e agulha por camundongo. Os sítios de implantação foram raspados no dia anterior à implantação das células.
[231] Eutanásia - Cada camundongo foi sacrificado quando atingiu um desfecho humano, conforme descrito na seção abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o início da dosagem.
[232] Avaliação da carga de tumor na eutanásia - No momento do término, os tumores foram coletados e seu volume avaliado. Monitoramento animal
[233] Monitoramento clínico - O comprimento e a largura do tumor foram medidos 2-3 vezes por semana com compassos de calibre e o volume do tumor foi estimado por esta fórmula [69]:  compriment o 2 largura Volume do tumor  2
[234] Desfechos humanos [70]: Sinais de dor, sofrimento ou angústia: postura da dor, máscara facial da dor, comportamento; Tumor superior a 10% do peso corporal normal, mas não superior a 2.000 mm3; Tumores que interferem na deambulação ou nutrição; Tumor ulcerado ou erosão do tecido; 20% de perda de peso corporal remanescente por 3 dias consecutivos; Má condição corporal, emagrecimento, caquexia, desidratação; Ausência prolongada de respostas voluntárias a estímulos externos; Respiração difícil entrecortada, anemia, sangramento significativo; Sinais neurológicos: movimentos circulares, convulsão, paralisia; Diminuição sustentada da temperatura corporal; Distensão abdominal.
[235] Anestesia - A anestesia com gás isoflurano foi usada para todos os procedimentos: cirurgia ou inoculação do tumor, injeções iv, coleta de sangue. Anestesia com cetamina e xilazina foi usada para procedimento cirúrgico de estereotaxia.
[236] Analgesia - O protocolo de analgesia com carprofeno ou carprofeno/buprenorfina multimodal foi adaptado à gravidade do procedimento cirúrgico. Cuidado não farmacológico foi fornecido para todos os procedimentos dolorosos. Além disso, os cuidados farmacológicos que não interferiram nos estudos (tratamento tópico) foram fornecidos por recomendação do veterinário responsável.
[237] Eutanásia - A eutanásia dos animais foi realizada por sobredosagem de anestesia com gás (Isoflurano) seguida de luxação cervical ou exsanguinação. Resultados Atividade antitumoral, modelo EMT6
[238] Os resultados são mostrados na Figura 1A. O tratamento com a cepa bacteriana da invenção levou a uma redução clara no volume do tumor em relação a ambos os controles negativos. O controle positivo também levou à redução do volume do tumor, como seria de se esperar.
[239] Para elucidar ainda mais os mecanismos pelos quais MRx0518 transmite seus efeitos terapêuticos em modelos de tumor singênico, a análise ex vivo foi realizada nos estudos de modelo de tumor EMT6 singênico. Embora o volume do tumor seja a medição primária em estudos de oncologia pré-clínica, os tumores geralmente consistem em células de tumor em divisão ativa junto com um núcleo necrótico. Para investigar se o tratamento com MRx0518 teve influência no grau de necrose encontrado nos tumores EMT6, as seções de parafina da região do ventre médio dos tumores foram coradas com hematoxilina e eosina. O tratamento com MRx0518 de um modelo de carcinoma de mama EMT6 murino mostrou uma tendência para aumentar a área de seção transversal de necrose dentro do tumor (Figura 1B, painel superior). Para investigar se o tratamento com MRx0518 teve influência nas células em divisão dentro do tumor, seções de parafina da região do ventre médio dos tumores foram coradas com a proteína de proliferação Ki67, junto com a contra- coloração DAPI, para estimar a porcentagem de células que se dividem dentro do tumor EMT6. O tratamento com MRx0518 de um modelo de carcinoma de mama EMT6 de murino diminuiu significativamente a porcentagem de células em divisão observada dentro do tumor (Figura 1B, painel inferior, P = 0,019). Populações de células imunológicas
[240] Uma investigação mais aprofundada do microambiente de tumor foi realizada por meio de citometria de fluxo do tumor, para investigar a hipótese de que a cepa bacteriana MRx0518 tem a capacidade de regular o sistema imunológico para induzir um efeito antitumoral. Os tumores excisados dos diferentes grupos de tratamento foram cortados em pedaços. Uma das peças foi submetida à análise de citometria de fluxo. Para avaliar a porcentagem relativa de linfócitos T, presentes dentro dos tumores, foram usados os seguintes marcadores: CD45, CD3, CD4, CD8, CD25 e FoxP3.
[241] Os dados preliminares de citometria de fluxo apresentados na Figura 1C (e ainda suportados pelos dados descritos abaixo, apresentados na Figura 23) mostram que a porcentagem relativa de linfócitos em tumores foi ligeiramente diminuída em ambos os grupos tratados com MRx0518 e anti-CTLA-4, quando comparados, respectivamente, com veículos ou animais de controle. Da mesma forma, a porcentagem relativa de células CD4+ pareceu estar diminuída em animais tratados com MRx0518 e anti-CTLA-4, enquanto a porcentagem relativa de células CD8+ seguiu uma tendência oposta em ambos os grupos, embora com magnitude diferente. A porcentagem relativa de células CD4+FoxP3+ foi menor no grupo tratado com anti- CTLA-4 quando comparada à ligeira diminuição nos animais tratados com MRx0518; entretanto, a redução na porcentagem relativa de células CD4+CD25+ foi perceptível apenas no grupo tratado com anti- CTLA-4. A razão CD8+/FoxP3+ mostrou um aumento maior no grupo tratado com anti-CTLA-4 do que nos animais MRx0518. Esses dados apresentados aqui suportam a hipótese de que o anticorpo anti-CTLA-4 tem como alvo as células T regulatórias (Tregs), reduzindo seu número de células ou atenuando sua atividade supressora no tecido de tumor, enquanto sugere um modo de ação diferente para MRx0518.
[242] A investigação adicional do microambiente de tumor foi realizada usando análise NanoString dos tecidos de tumor, para investigar se a cepa bacteriana MRx0518 tem a capacidade de regular o sistema imunológico para induzir um efeito antitumoral no modelo EMT6. Os tumores excisados do veículo e dos grupos tratados com MRx0518 foram coletados. O RNA foi extraído do tecido de tumor usando o reagente TRIzol (ThermoFisher), seguido de uma limpeza usando o kit RNeasy Mini (Qiagen), incluindo um tratamento com DNase I (Qiagen). O RNA foi então usado para análise de Nanostring usando o painel PanCancer Mouse IO 360. Genes anteriormente mostrados como característicos de várias populações de células foram usados para medir a abundância dessas populações: Tipo de célula Genes marcadores Células NK CD56dim Il21r, Kir3dl1, Kir3dl2 CD8 Exaurida Cd244, Eomes, Lag3, Ptger4 DC Ccl2, Cd209e, Hsd11b1 Ctsw, Gzma, Gzmb, Klrb1, Klrd1, Klrk1, Células citotóxicas Nkg7, Prf1 Macrófagos Cd163, Cd68, Cd84, Ms4a4a Células T Cd3d, Cd3e, Cd3g, Cd6, Sh2d1a, Trat1 Mastócitos Cpa3, Hdc, Ms4a2 Neutrófilos Ceacam3, Csf3r, Fcgr4, Fpr1 Blk, Cd19, Fcrlb, Ms4a1, Pnoc, Spib, Tcl1, Células B Tnfrsf17 Células NK Ncr1, Xcl1 CD45 Ptprc
[243] Os escores Z para cada população de células foram calculados usando os escores de tipo de célula linear fornecidos pela análise NanoString (Figura 23, mapa de calor).
[244] Os dados de NanoString mostram que a abundância de células B, CD45, células T, citotóxicas e células NK foram aumentadas no tecido de tumor do grupo tratado com MRx0518 em comparação com os animais tratados com veículo (Figura 23). Os dados aqui apresentados suportam a hipótese de que MRx0518 tem um efeito imunoestimulador ao aumentar os leucócitos, em particular as células NK, as células T e as células citotóxicas no microambiente de tumor. Produção de citocina
[245] Uma peça de tumor adicional foi usada para extração de proteína total e subsequente análise de citocinas, juntamente com amostras de plasma. Os níveis de proteína de IL-10, CXCL1, CXCL2, CXCL10, IL-1ß, IL-17A, GM-CSF, TNF-, IL-12p70 e IFN-γ no microambiente de tumor foram analisados pela tecnologia MagPix. Enquanto IL-17A e GM-CSF estavam abaixo dos níveis de detecção, todos os outros marcadores foram expressos em níveis razoáveis (Figura 1D). Uma diferença significativa foi observada entre o veículo e o grupo anti-CTLA-4 para IFN-γ. A produção dos marcadores imunológicos IL-10 e IL-12p70 pareceu reduzida após o tratamento com MRx0518 em comparação com os tratamentos de controle.
[246] Os níveis de citocinas também foram avaliados no plasma sanguíneo dos mesmos animais. Os níveis de proteína de IL-23, IL-6, IL-10, VEGF, CXCL1, CXCL2, CXCL10, IL-2, IL-1β, IL-17A, GM-CSF, TNF-, IL-12p70 e IFN-γ foram analisados pela tecnologia MagPix. No geral, foi detectada pouca produção de citocina no plasma sanguíneo de animais, antes da indução do tumor ou no final do estudo (Figura 1E). VEGF e CXCL10 foram detectados em níveis substanciais, enquanto IL- 23, IL-6, IL-10, CXCL1 e CXCL2 foram detectados em níveis baixos. IL- 2, IL-1b, IL-17A, GM-CSF, TNF-, IL-12p70 e IFN-γ não foram detectados nas amostras. MRx0518 aumentou significativamente a produção de IL-6 no Dia 0. MRx0518 também pareceu aumentar a produção de IL-23. VEGF e CXCL10 foram significativamente regulados negativamente no grupo anti-CLTA-4 no Dia 22. Da mesma forma que os resultados apresentados para as populações de células imunes, as diferenças na produção de citocinas no tumor e no plasma, entre MRx0518 e ant-CTLA-4, sugerem que cada uma delas atua em um mecanismo distinto e potencialmente complementar. Localização de células positivas CD8α no íleo
[247] Criosseções de 10 µm do íleo foram cortadas em criostato (CM 1950 Leica), coletadas em lâminas de poli-L lisina. As seções foram então secas ao ar durante 1 hora, fixadas durante 10 minutos em metanol gelado, lavadas em PBS, bloqueadas em BSA a 10% em PBS a pH 7,2 antes de serem incubadas durante a noite com o anticorpo primário (anticorpo rato-anti-camundongo-CD8α, Sigma-Aldrich, Millipore).
[248] Na manhã seguinte, as lâminas foram lavadas em PBS e coradas com um anticorpo secundário: anticorpo cabra-anti-rato- Alexa488 (Molecular Probe, Invitrogen) durante 1 hora em temperatura ambiente. Após outra etapa de lavagem, as lâminas foram contrastadas com dicloridrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma-Aldrich, Millipore) e montadas em Vectashield (Vector Laboratories). As lâminas foram visualizadas e fotografadas usando um microscópio axioscópio Zeiss equipado com uma lâmpada de vapor de mercúrio, filtros apropriados e uma objetiva apocromática x20. Exemplos de imagens obtidas a partir de lâminas do veículo, MRx0518 e animais anti-CTLA4 são mostrados (Figura 1F - painéis superiores: coloração DAPI, painéis inferiores: coloração CD8α).
[249] Os campos de visão foram examinados em 20 animais e fotografados usando o tempo de exposição manual. O número de animais e campos analisados são mostrados na tabela a seguir: Grupo Número de campos analisados Número de camundongos Veículo 53 5 MRx0518 70 7 Anti-CTLA4 71 8
[250] As imagens foram pontuadas da seguinte forma: os campos com ≤ 3 células positivas foram pontuados como 0, enquanto os campos com mais ≥ 3 células foram pontuados como 1. Os resultados desta análise são apresentados (Figura 1G).
[251] As criosseções do íleo coradas com anti-CD8α mostraram um maior número de células positivas para CD8α localizadas nos tecidos da região da cripta de animais tratados com MRx0518 e anti- CTLA-4 em comparação com o grupo de veículo.
[252] Essa observação está de acordo com a presença de células T CD8+ no intestino em caso de infecção ou microambiente inflamatório, como parte da resposta imunológica. Atividade antitumoral, modelo LL/2 (LLC1)
[253] Os resultados são mostrados na Figura 2. O tratamento com a cepa bacteriana da invenção levou a uma redução clara no volume do tumor em relação a ambos os controles negativos. Atividade antitumoral, modelo Hepa1-6
[254] Os resultados são mostrados na Figura 3A. O controle negativo não tratado não aparece como seria de se esperar, porque o peso do fígado foi menor neste grupo do que nos outros grupos. No entanto, o controle negativo do veículo e os grupos de controle positivo aparecem como seria de se esperar, porque os camundongos tratados com veículo sozinho tinham fígados maiores do que os camundongos tratados com anticorpos anti-CTLA4, refletindo uma carga de tumor maior no grupo de controle negativo do veículo. O tratamento com a cepa bacteriana da invenção levou a uma redução clara no peso do fígado (e, portanto, carga do tumor) em relação aos camundongos no grupo de controle negativo do veículo. Atividade antitumoral, modelo RENCA
[255] Os resultados são mostrados na Figura 3B. O tratamento com monoterapia MRx0518 reduziu o volume do tumor com Teste/Controle de 51% (dia 18) em comparação com os grupos tratados com veículo. Paclitaxel e anti-CTLA-4 + anti-PDL-1 mostraram uma redução (quase) completa no tamanho do tumor em D18 e D22 em comparação com os grupos não tratado e com veículo.
[256] Estes dados indicam que a cepa MRx0518 pode ser útil para o tratamento ou prevenção de outras doenças associadas à redução da atividade do sistema imunológico. Exemplo 2 - análise do gene PCR
[257] Uma cultura pura da bactéria MRx0518 foi estudada em uma análise genética por PCR. Havia dois braços para o experimento: 1) MRx0518 foi co-cultivado com células do cólon humano (CaCo2) para investigar os efeitos da bactéria no hospedeiro, e 2) MRx0518 foi co- cultivado em células CaCo2 que foram estimuladas com IL1 para imitar o efeito da bactéria em um ambiente inflamatório. Os efeitos em ambos os cenários foram avaliados por meio de análise de expressão gênica. Os resultados são apresentados abaixo: Gene Fold change Função CXCL3 28412,73 Ligante CXCR2, CXCL2 135,42 Ligante CXCR2, 90% de homologia com CXCL1. CXCL9 34,76 Ligante CXCR3, principalmente conhe- cido como quimioatraente de células Th1 (induzível por IFN-g) IL8 31,81 Citocina, quimioatraente (especialmente neutrófilos), muitos receptores, incluindo CXCR1 e CXCR2/ CXCL1 16,48 O ligante CXCR2 estimula a proliferação celular, bem como a migração, a superex- pressão é neuroprotetora em EAE. CD40 14,33 Molécula coestimuladora, via de ativação de DC dependente de células T.
TNF 13,50 Citocina pró-inflamatória principal IL17C 12,18 Promove a resposta antibacteriana do epitélio, sinérgica com IL-22, CXCL10 10,66 Homologia próxima com CXCL9, pensar também no ligante CXCR3? HSPA1B 10,19 Proteína de choque térmico NFKBIA 8,87 Sinalização NFB; PI3K JUN 7,61 Resposta antibacteriana; Sinalização GPCR. TNFAIP3 6,63 Sinalização de TNF DUSP1 6,36 Fosfatase anti-inflamatória, inativa MA- PKs JUNB 5,36 Fator de transcrição, sinalização JAK-
STAT BIRC3 4,86 Junções aderentes, junções apertadas DUSP2 4,59 Anti-inflamatório, inativa MAPK. IL32 4,29 Citocina pró-inflamatória, induzida por IFN-g, IL-18 DUSP5 3,12 Anti-inflamatório, inativa MAPK. FOS 3,03 Fatores de transcrição, sinalização TLR, fazem parte do AP-1 GADD45 2,89 Crescimento e proliferação celular
B CLDN4 2,61 Junções apertadas ADM 2,57 Sinalização de NFB KLF10 2,49 Parada celular, sinalização de TGF-b. DEFB4A -2,34 Peptídeo Antimicrobiano APBA1 -2,53 Sinalização IGFBP1 -2,72 Via de sinalização
IL28B -2,73 IFN-lambda, defesa imunológica antiviral, IL10 -3,38 Citocina anti-inflamatória NR4A1 -5,57 Receptor nuclear, anti-inflamatório, regu- lador da proliferação de células T. Dife- renciação de células T helper NOD2 -14,98 PRR, ativador do inflamassoma, promove autofagia INOS -26,88 Pró-inflamatório, gerador de óxido nítrico
[258] Esses dados parecem mostrar duas assinaturas de expressão gênica - ligantes CXCR1/2 (CXCL3, CXCL2, CXCL1, IL-8), que estão associados à migração de células pró-inflamatórias, e ligantes CXCR3 (CXCL9, CXCL10), que são mais especificamente indicativos de respostas do tipo IFN-γ, também suportadas por IL-32, que é induzível por IFN-γ. Estes dados sugerem que as composições da invenção são úteis para estimular o sistema imunológico. Exemplo 3 - Teste de estabilidade
[259] Uma composição descrita neste documento contendo pelo menos uma cepa bacteriana descrita neste documento é armazenada em um recipiente vedado a 25◦C ou 4◦C e o recipiente é colocado em uma atmosfera com 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% de umidade relativa. Após 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da cepa bacteriana deve permanecer conforme medida, em unidades de formação de colônias determinadas por protocolos padrão. Exemplo 4 - produção de citocinas em células dendríticas imaturas induzidas por MRx0518 em comparação com MRx0518 + LPS Sumário
[260] Este estudo testou o efeito da cepa bacteriana MRx0518 sozinha e em combinação com lipopolissacarídeo (LPS) na produção de citocinas em células dendríticas imaturas.
[261] Uma população de monócitos foi isolada de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). As células de monócitos foram posteriormente diferenciadas em células dendríticas imaturas. As células dendríticas imaturas foram semeadas a 200.000 células/poço e incubadas com MRx0518 a uma concentração final de 107/mL, com a adição opcional de LPS a uma concentração final de 100ng/mL. O controle negativo envolveu a incubação das células com meio RPMI sozinho e os controles positivos incubaram as células com LPS a uma concentração final de 100ng/mL. O conteúdo de citocinas das células foi então analisado. Resultados
[262] Os resultados dessas experiências podem ser vistos nas Figuras 4a-d. A adição de MRx0518 sozinho leva a um aumento substancial no nível de citocinas IL-6 e TNF- em comparação com o controle negativo (Figura 4a e c). A adição de LPS (controle positivo) leva a um aumento no nível de IL-6 e TNF- em relação ao controle negativo, mas não de IL-1 (Figura 4b). Uma combinação de MRx0518 e LPS levou a um aumento sinérgico no nível de IL-1 produzido (Figura 4d). Conclusão
[263] MRx0518 tem a capacidade de induzir maior produção de citocinas IL-6 e TNF- em células dendríticas imaturas. A combinação LPS e MRx0518 pode aumentar os níveis de citocinas IL-1 em células dendríticas imaturas. Esses dados indicam que MRx0518 sozinho ou em combinação com LPS pode aumentar as citocinas inflamatórias IL- 1, IL-6 e TNF-, que promovem a inflamação. Exemplo 5 - produção de citocinas em células THP-1 induzida por MRx0518 em comparação com MRx0518 + LPS Sumário
[264] Este estudo testou o efeito da cepa bacteriana MRx0518 sozinha e em combinação com LPS na produção de citocinas em células THP-1, uma linhagem celular modelo para monócitos e macrófagos.
[265] As células THF-1 foram diferenciadas em meio M0 durante 48h com 5ng/mL de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA). Essas células foram subsequentemente incubadas com MRx0518 a uma concentração final de 108/mL, com ou sem a adição de LPS a uma concentração final de 100ng/mL. As bactérias foram então removidas e as células incubadas em condições normais de cultivo durante 24 horas. As células foram então centrifugadas e o sobrenadante resultante foi analisado quanto ao conteúdo de citocinas. Resultados
[266] Os resultados dessas experiências podem ser vistos nas Figuras 5a-c. A adição de MRx0518 sem LPS leva a um aumento nos níveis de citocinas de IL-1, IL-6 e TNF- em comparação com os controles sem bactérias e com sedimentos bacterianos. A adição de LPS e MRx0518 leva a um aumento sinérgico na produção de citocinas. Conclusão
[267] MRx0518 tem a capacidade de induzir a produção de citocinas em células THP-1, que pode ser aumentada sinergicamente com a adição de LPS. Esses dados indicam que MRx0518 sozinho ou em combinação com LPS pode aumentar as citocinas inflamatórias IL- 1, IL-6 e TNF-, que promovem a inflamação. Exemplo 6 - Análise de citocinas Introdução
[268] Os inventores procuraram analisar ainda mais o efeito imunoestimulador das composições da invenção. Os inventores analisaram a expressão de citocinas particulares de macrófagos THP-1 e células dendríticas derivadas de monócitos após tratamento com
MRx0518. Macrófagos e células dendríticas são componentes-chave do sistema imunológico inato, atuam como mensageiros entre os sistemas imunológico inato e adaptativo e são reenviados no intestino, onde liberam uma variedade de citocinas para modular a resposta imunológica.
[269] Foram analisadas citocinas envolvidas na resposta imunológica inata (TNF-α, IL-12 e IL-10) e também citocinas envolvidas no recrutamento e ativação de células imunológicas adaptativas (IL-8, IL-23, IL-1β e IL- 6). Método Cepas bacterianas MRx0518 LPS usado como controle positivo Resultados
[270] Os resultados são mostrados nas Figuras 6-13. MRx0518 induz um perfil imunoestimulador forte e característico em macrófagos derivados de THP-1 e DCs derivados de monócitos. As citocinas envolvidas na resposta imunológica inata (TNF-α, IL-12 e IL-10) são significativamente induzidas por MRx0518 em DCs e macrófagos. MRx0518 induz uma indução muito forte e significativa de IL-8 em macrófagos e DCs. MRX0581 induz uma indução forte e significativa de IL-23 e IL-6. MRx0518 também induziu IL-1β. Discussão
[271] Esses dados mostram que MRx0518 tem propriedades imunoestimuladoras e pode ser uma composição eficaz para imunoestimulação. Exemplo 7 - mecanismo de ação
[272] Outros experimentos foram realizados para caracterizar o mecanismo de ação pelo qual MRx0518 estimula o sistema imunológico. Um ensaio repórter de sinalização TLR5 foi selecionado e os dados são apresentados nas Figuras 14 e 15. O sobrenadante MRx0518 foi o ativador mais potente de TLR5 e NF-κB. Além disso, o sobrenadante foi tratado com várias enzimas líticas e a tripsina revelou anular a maior parte da atividade. Exemplo 8 - atividade imunoestimuladora adjuvante de MRx0518 em uma combinação terapêutica com um inibidor CTLA-4 Sumário
[273] Este estudo comparou a atividade antitumoral de MRx0518, um inibidor de CTLA-4 e combinações terapêuticas de MRx0518 com o inibidor de CTLA-4 em camundongos com células de tumor EMT-6. Materiais
[274] Substâncias de teste e referência - Cepa bacteriana nºMRx0518; Anticorpo anti-CTLA4 (ref: BE0131, Bioxcell; clone: 9H10; reatividade: camundongo; isotipo: Hamster IgG1; condições de armazenamento: +4°C).
[275] Veículos de substâncias de teste e referência - As bactérias MRx0518 foram cultivadas em meio de cultura bacteriana (extrato de levedura, casitona, meio de ácido graxo (YCFA)) e mantidas como estoque de glicerol a -80°C. Os animais foram dosados com a bactéria de acordo com o protocolo do estudo. Os anticorpos anti-CTLA-4 foram diluídos com PBS (ref: BE14-516F, Lonza, França) em cada dia de injeção em camundongos.
[276] Doses de tratamento - Bactéria: 2x108 em 200 µL. Os anticorpos anti CTLA4 foram administrados a 10 mg/kg de peso corporal de acordo com o peso corporal mais recente dos camundongos.
[277] Vias de administração - A composição bacteriana foi administrada por gavagem oral (per os, PO) através de um tubo de gavagem a um volume de 200 µL/inj. Os anticorpos anti CTLA-4 foram injetados na cavidade peritoneal de camundongos (intraperitonealmente, IP) em um volume de 10mL/kg ajustado para o peso corporal individual mais recente dos camundongos.
[278] Linhagem de células cancerosas e condições de cultura - A linhagem de células que foi usada neste estudo é a linhagem de células EMT-6 que foi obtida da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EUA). A linhagem celular EMT-6 foi estabelecida a partir de um carcinoma mamário murino transplantável que surgiu em um camundongo BALB/cCRGL após o implante de um nódulo alveolar mamário hiperplásico.
[279] As células de tumor foram cultivadas como monocamada a 37°C em uma atmosfera úmida (CO2a 5%, ar a 95%). O meio de cultura foi RPMI 1640 contendo 2 mM de L-glutamina (ref: BE12- 702F, Lonza, Verviers, Bélgica) suplementado com soro fetal bovino a 10% (ref: 3302, Lonza). As células e tumor EMT-6 aderem a frascos de plástico. Para uso experimental, as células de tumor foram destacadas do frasco de cultura por um tratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (ref: BE02- 007E, Lonza), em meio de Hanks sem cálcio ou magnésio (ref: BE10- 543F, Lonza) e neutralizado pela adição de meio de cultura completo. As células foram contadas e sua viabilidade foi avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano a 0,25%.
[280] Uso de animais - Camundongos fêmeas BALB/C (BALB/cByJ) saudáveis, de 5 a 7 semanas de idade, foram obtidos da CHARLES RIVER (L'Arbresles) e mantidos em estado de saúde SPF de acordo com as diretrizes da FELASA. O alojamento dos animais e os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os Regulamentos Franceses e Europeus e o Guia do NRC para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os animais foram mantidos 3-4 por gaiola em alojamentos em condições ambientais controladas: Temperatura: 22±2°C, Umidade 55±10%, Fotoperíodo (12h claro/12h escuro), Ar filtrado HEPA, 15 trocas de ar por hora sem recirculação. Os recintos dos animais foram fornecidos com espaço estéril e adequado com material de cama, comida e água, enriquecimento ambiental e social (alojamento coletivo) conforme descrito: Gaiolas de policarbonato de filtro superior Eurostandard Tipo III ou IV, leito de espiga de milho (ref: LAB COB 12, SERLAB, França), 25 kGy Dieta irradiada (Ssniff® Soest, Alemanha), Alimento completo para roedores imunocompetentes - Extrudato R/MH, Estéril, filtrado a 0,2 µm de água e Enriquecimento ambiental (SIZZLE-dri kraft - D20004 SERLAB, França). Os animais são identificados individualmente com transponder RFID e cada gaiola foi carregada com um código específico. O tratamento dos animais começou após uma semana de aclimatação para os lotes 2 e 3, ou após três semanas de aclimatação para o lote 1. Delineamento experimental e tratamentos
[281] No dia -14 (D-14), camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em 3 grupos de 30 animais e 2 grupos de 10 animais usando o software Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, França). Os camundongos foram separados em 3 lotes de 10 animais por grupo de tratamento (lote 1:10 animais dos grupos 1, 2 e 3; lote 2:10 animais dos grupos 1, 2 e 3 e lote 3:10 animais dos grupos 1 a 5) com pontos de terminação diferentes desde o início do estudo: D-14 ou D0.
[282] No término, o lote 3 foi dividido em 2 coortes, devido ao término e aos cronogramas de análises FACS; estes foram escalonados ao longo de 1 dia: D24/D25. Portanto, cada coorte de animais tinha 5 animais por grupo de tratamento (4 animais da gaiola um e um animal da gaiola 2). Com base nos critérios éticos, se o volume do tumor for superior a 1500mm3, a seleção dos animais a serem sacrificados no D24 e D25 é baseada no volume do tumor e não na gaiola. O projeto experimental é representado na Fig. 16A e resumido abaixo: 1) O lote 1 (grupos 1, 2 e 3) iniciou o tratamento no D0 e foi descartado no D14 (10 animais formaram os grupos 1 a 3). Estes não receberam células de tumor e constituíram o grupo de linha de base. 2) O lote 2 (grupos 1, 2 e 3) iniciou o tratamento no D-14 e foi descartado no D7 (10 animais formam os grupos 1 a 3). 3) O lote 3 (grupos 1 a 5) iniciou o tratamento no D-14 e foi eliminado no D24/25 (10 animais dos grupos 1 a 5). O tratamento com Anti CTLA- 4 foi iniciado no D10.
[283] No dia 0 (D0) todos os camundongos dos lotes 2 e 3 (término no dia 7 e 24/25, respectivamente) foram enxertados com células de tumor EMT-6 por uma injeção subcutânea de 1x106 células EMT-6 em 200 µL de RPMI 1640 no flanco direito (os 30 camundongos do lote 1, que foram sacrificados no D14, não receberam a injeção do tumor). Os camundongos foram tratados de acordo com os seguintes grupos de esquema de tratamento (TWx2 = duas vezes por semana): Nº de Esquema de Tra- Grupo Tratamento Dose Via Animais tamento 30 = 10 lote 1 Não tratado (+ 1 - - - 10 lote 2 tumor) 10 lote 3 30 = Diariamente -14 a 10 lote 1 Veículo D0 Diariamente - 2 - PO 10 lote 2 (YCFA) 14 a D7 10 lote 3 Diariamente -14 a D24/25 30 = Diariamente -14 a 10 lote 1 3 MRx0518 2x108 PO D0 Diariamente - 10 lote 2 14 a D7 10 lote 3 Diariamente -14 a
D24/25 TWx2 de D10 Anti-CTLA-4 + IP + YCFA Diaria- 4 10 lote 3 10 mg/kg YCFA PO mente -14 a D24/25 TWx2 de D10 10 mg/kg Anti-CTLA-4 + IP + Bactérias Diaria- 5 10 lote 3 + 2x108 MRx0518 PO mente -14 a bactérias D24/25 Monitoramento animal
[284] A viabilidade e o comportamento dos animais foram registrados diariamente. Os pesos corporais foram medidos duas vezes por semana. O comprimento e a largura do tumor foram medidos duas vezes por semana com compassos de calibre e o volume do tumor foi estimado pela seguinte fórmula: 𝐿𝑎𝑟𝑔𝑢𝑟𝑎2 𝑥 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑜 𝑡𝑢𝑚𝑜𝑟 = 2
[285] A eficácia do tratamento foi avaliada em termos dos efeitos da substância de teste nos volumes de tumor de animais tratados em relação aos animais de controle. Os seguintes critérios de avaliação da eficácia antitumoral foram determinados usando o software Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, França). Os volumes médios do tumor dos grupos 1 a 5 estão representados na Fig. 16B. Ao longo do curso do estudo, uma progressão no crescimento do tumor foi observada em todos os grupos, com exceção do grupo tratado com MRx0518 + Anti-CTLA-4, onde uma regressão do crescimento do tumor ocorreu a partir do dia 14 após a indução do tumor. O tratamento com MRx0518 + anti-CTLA-4 reduziu significativamente o crescimento do tumor em comparação com o grupo tratado com veículo no Dia 21 e Dia 24 após a indução do tumor. O tratamento de combinação de MRx0518 com Anti-
CTLA-4 foi o mais eficaz para reduzir o crescimento do tumor em camundongos BALB/c com tumores EMT6 enxertados subcutaneamente. Esses dados demonstram que MRx0518 tem um efeito imunoestimulador. Exemplo 9 - Eficácia de inóculos bacterianos em modelos de cân- cer de camundongo Sumário
[286] Este estudo testou a eficácia de composições compreendendo cepa bacteriana de acordo com a invenção em um modelo de tumor. Materiais
[287] Substância de teste - Cepa bacteriana nº MRx0554.
[288] Substância de referência - Anticorpo anti-CTLA-4 (clone: 9H10, catálogo: BE0131, isotipo: Hamster Sírio IgG1, Bioxcell).
[289] Veículos de substâncias de teste e referência - Meio de cultura bacteriana (extrato de levedura, casitona, meio de ácido graxo (YCFA)). Cada dia de injeção em camundongos, o anticorpo foi diluído com PBS (ref: BE14-516F, Lonza, França).
[290] Doses de tratamento - Bactéria: 2x108 em 200 µL de YCFA. O anti-CTLA-4 foi injetado a 10 mg/kg/inj. O anti-CTLA-4 foi administrado em um volume de dose de 10 mL/kg/adm (ou seja, para um camundongo pesando 20 g, 200 µL da substância de teste serão administrados) de acordo com o peso corporal mais recente dos camundongos.
[291] Vias de administração - O inóculo bacteriano foi administrado por gavagem oral (per os, PO) por meio de uma cânula. As cânulas eram descontaminadas todos os dias. Anti-CTLA-4 foi injetado na cavidade peritoneal de camundongos (intraperitonealmente, IP).
[292] Condições de cultura da cepa bacteriana - As condições de cultura para a cepa bacteriana foram as seguintes:  Pipetar 10 mL de YCFA (a partir dos frascos de laboratório de E&O de 10 mL) para tubos Hungate  Vedar os tubos e enxaguar com CO2 usando uma entrada de seringa e sistema de exaustão  Autoclavar os tubos Hungate  Quando resfriados, inocular os tubos Hungate com 1 mL dos estoques de glicerol  Colocar os tubos em uma incubadora estática a 37°C por cerca de 16 horas.  No dia seguinte, tomar 1 mL desta subcultura e inocular 10 mL de YCFA (tubos Hungate pré-aquecidos novamente, todos em du- plicata)  Colocá-los em uma incubadora estática a 37°C durante 5 a 6h Linhagens celulares e condições de cultura -
[293] As linhagens celulares que foram utilizadas são detalhadas na tabela abaixo: Linhagem ce- Cepa de camun- Ori- Tipo lular dongo gem Carcinoma de BALB/c EMT-6 ATCC mama
[294] A linhagem celular EMT-6 foi estabelecida a partir de um carcinoma mamário murino transplantável que surgiu em um camundongo BALB/cCRGL após o implante de um nódulo alveolar mamário hiperplásico [71].
[295] Condições de cultura de células - Todas as linhagens celulares foram cultivadas como monocamada a 37°C em uma atmosfera umidificada (CO2 a 5%, ar a 95%). O meio de cultura e o suplemento são indicados na tabela abaixo:
Linhagem celu- Meios de cultura Suplemento lar RPMI 1640 contendo L-glu- Soro fetal bovino a EMT6 tamina a 2mM (ref: BE12- 10% (ref: nº 3302, 702F, Lonza) Lonza)
[296] Para uso experimental, as células de tumor aderentes foram destacadas do frasco de cultura por um tratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (ref: BE17-161E, Lonza), em meio de Hanks sem cálcio ou magnésio (ref: BE10-543F, Lonza) e neutralizado pela adição de meio de cultura completo. As células foram contadas em hemocitômetro e sua viabilidade será avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano a 0,25%. Uso de animais -
[297] Camundongos fêmeas BALB/C (BALB/cByJ) saudáveis, de peso e idade correspondentes, foram obtidos a partir de CHARLES RIVER (L'Arbresles) para as experiências dos modelos EMT6.
[298] Os animais foram mantidos em estado de saúde SPF, de acordo com as diretrizes da FELASA, e o alojamento dos animais e os procedimentos experimentais de acordo com os regulamentos franceses e europeus e o Guia NRC para o cuidado e uso de animais de laboratório [72, 73]. Os animais foram mantidos em alojamentos em condições ambientais controladas: Temperatura: 22±2°C, Umidade 55±10%, Fotoperíodo (12h claro/12h escuro), Ar filtrado HEPA, 15 trocas de ar por hora sem recirculação. Os recintos dos animais foram fornecidos com espaço estéril e adequado com material de leito, comida e água, enriquecimento ambiental e social (alojamento coletivo) conforme descrito: gaiolas de 900 cm2 (ref: verde, Tecniplast) em racks ventilados, cama Epicea (SAFE), 10 kGy Dieta irradiada (A04-10, SAFE), Alimento completo para roedores imunocompetentes - Extrudado R/MH, água de garrafas de água.
Delineamento experimental e tratamentos Atividade antitumoral, modelo EMT6
[299] Esquema de tratamento - O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em grupos de 8-9 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, França). No D0, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxertados com células de tumor EMT-6 conforme descrito abaixo. No D24, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpos anti-CTLA-4.
[300] O esquema de tratamento está resumido na tabela abaixo: Nº de Esquema de Grupo Tratamento Dose Via Animais Tratamento 1 8 Não tratadas - - - 2 8 Veículo (meio) - PO 38 dias EMT6 2x108 bac- 3 8 MRx0554 PO 38 dias EMT6 térias TWx2, D10, D13, D17 e 4 8 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP D20 para EMT6
[301] O monitoramento dos animais foi realizado conforme descrito a seguir.
[302] Indução de tumores EMT6 em animais - No D14, os tumores foram induzidos por injeção subcutânea de 1x106 células EMT-6 em 200 µL de RPMI 1640 no flanco direito de camundongos.
[303] Eutanásia - Cada camundongo foi sacrificado quando atingiu um desfecho humano, conforme descrito abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o início da dosagem.
Monitoramento animal
[304] Monitoramento clínico - O comprimento e a largura do tumor foram medidos duas vezes por semana com compassos de calibre e o volume do tumor foi estimado por esta fórmula [74]:  compriment o 2 largura Volume de tumor  2
[305] Desfechos humanos [75]: Sinais de dor, sofrimento ou angústia: postura da dor, máscara facial da dor, comportamento; Tumor superior a 10% do peso corporal normal, mas não superior a 2.000 mm3; Tumores que interferem na deambulação ou nutrição; Tumor ulcerado ou erosão do tecido; 20% de perda de peso corporal remanescente por 3 dias consecutivos; Má condição corporal, emagrecimento, caquexia, desidratação; Ausência prolongada de respostas voluntárias a estímulos externos; Respiração difícil entrecortada, anemia, sangramento significativo; Sinais neurológicos: movimentos circulares, convulsão, paralisia; Diminuição sustentada da temperatura corporal; Distensão abdominal.
[306] Anestesia - A anestesia com gás isoflurano foi usada para todos os procedimentos: cirurgia ou inoculação do tumor, injeções iv, coleta de sangue. Anestesia com cetamina e xilazina foi usada para procedimento cirúrgico de estereotaxia.
[307] Analgesia - O protocolo de analgesia com carprofeno ou carprofeno/buprenorfina multimodal foi adaptado à gravidade do procedimento cirúrgico. Cuidado não farmacológico foi fornecido para todos os procedimentos dolorosos. Além disso, os cuidados farmacológicos que não interferiram nos estudos (tratamento tópico) foram fornecidos por recomendação do veterinário responsável.
[308] Eutanásia - A eutanásia dos animais foi realizada por sobredosagem de anestesia com gás (Isoflurano) seguida de luxação cervical ou exsanguinação.
Resultados Atividade antitumoral, modelo EMT6
[309] Os resultados são mostrados na Figura 17. O tratamento com a cepa bacteriana da invenção levou a uma redução clara no volume do tumor em relação a ambos os controles negativos. O controle positivo também levou à redução do volume do tumor, como seria de se esperar.
[310] Estes dados indicam que a cepa MRx0554 pode ser útil para o tratamento ou prevenção de outras doenças associadas à redução da atividade do sistema imunológico. Exemplo 10 - Análise do metabolismo de carboidratos - análise de API 50 CHL de MRx0554
[311] O sistema de teste Índice de Perfil Analítico (API) consiste em tiras que contêm testes bioquímicos miniaturizados que analisam a atividade enzimática em espécies bacterianas. Esses testes são usados rotineiramente na caracterização de novas cepas. O teste API 50 CHL foi realizado para examinar o metabolismo de carboidratos em MRx0554. De acordo com as instruções do fabricante, as bactérias foram cultivadas em 10 mL de caldo YCFA por 16-18 horas a 37°C em uma estação de trabalho anaeróbica. Esta cultura foi diluída em 10 mL de meio API CHL de modo a atingir uma densidade aproximadamente equivalente ao padrão McFarland nº 2, e 110 μl desta mistura foram usados para inocular cada cúpula em um conjunto de tiras de teste API 50 CH. As tiras de teste foram incubadas em uma caixa de incubação umidificada a 37°C em uma estação de trabalho anaeróbica durante 48 horas, após o que a cor de cada cúpula foi registrada e atribuída um valor de negativo, intermediário positivo, positivo ou duvidoso.
[312] Usando a análise API 50 CHL, MRx0554 testou positivo para fermentação de L-arabinose, D-ribose, D-xilose, D-galactose, D-glicose, D-frutose, D-manose, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina,
esculina, salicina, D-celobiose, D-maltose, D-sacarose (sacarose), D- trealose, gentiobiose, D-tagatose e gluconato de potássio (Figura 18). Reações intermediárias foram observadas para D-manitol, metil α-D- glucopiranosídeo, D-lactose, D-rafinose, amidon (amido) e D-turanose. Exemplo 11 - ativação de TLR9
[313] Para elucidar ainda mais o mecanismo pelo qual MRx0518 estimula o sistema imunológico, células repórter TLR9 humano HEK- Blue™ (InvivoGen, San Diego, CA, EUA) foram usadas para testar o efeito de MRx0518 na ativação de TLR9. Manutenção de linhagens celulares e cepas bacterianas
[314] Células repórter TLR9 humano HEK-Blue™ (InvivoGen, San Diego, CA, EUA) foram cultivadas em DMEM suplementado com (v/v) de soro fetal bovino (FBS) a 10%, L-glutamina a 4 mM, glicose a 4,5 mg/mL, penicilina a 100 U/mL, estreptomicina a 100 μg/mL, Normocin™ a 100 μg/mL (InvivoGen), blastocidina a 10 μg/mL (InvivoGen) e zeocina a 100 μg/mL (InvivoGen) a densidade a 90%. As células foram mantidas a 37°C e CO2 a 5%. Para os ensaios, as células foram lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich, Gillingham, Inglaterra, Reino Unido) e ressuspensas em meio de crescimento sem antibiótico a uma densidade de 450.000 células/mL. Todos os reagentes foram fornecidos pela Sigma Aldrich, salvo indicação em contrário. E. gallinarum MRx0518 foi rotineiramente cultivado em extrato de levedura, Casitone, meio de ácidos graxos (YCFA, E&O Laboratories, Bonnybridge, Escócia, Reino Unido) a 37°C em um gabinete anaeróbico (Don Whitley Scientific, Shipley, Inglaterra, Reino Unido). Ensaios TLR9 Repórter
[315] As seguintes composições foram examinadas quanto à sua capacidade de induzir a ativação de TLR9:
1. Fração viva de MRx0518 (MRx0518LV) - Culturas bacteria- nas de fase log tardia foram centrifugadas a 5.000 xg durante 5 min em temperatura ambiente para gerar frações bacterianas. As bactérias se- dimentadas foram lavadas uma vez em PBS e ressuspensas em meio de cultura de células sem antibiótico até a diluição apropriada.
2. Fração do sobrenadante MRx0518 (MRx0518SN) - Os so- brenadantes da cultura foram colhidos e filtrados através de um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm e diluídos em água.
3. Fração morta por calor de MRx0518 (MRx0518HK) - As cul- turas bacterianas foram inativadas por calor durante 40 min a 80°C e preparadas conforme descrito acima para a fração viva.
[316] MRx0518LV e MRx0518HK foram usados em uma multiplicidade de infecções (MOI) de 100:1. Um volume equivalente de MOI 100:1 foi usado para MRx0518SN. O oligonucleotídeo CpG sintético ODN2006 (InvivoGen) foi usado como um controle positivo de ensaio a uma concentração de 5 µM. YCFA foi usado como controle negativo. As contagens de células viáveis foram determinadas por plaqueamento.
[317] Células repórter TLR9 humano HEK-Blue™ foram incubadas com os tratamentos acima por 22 horas a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5%. Os ensaios foram desenvolvidos usando QUANTI-Blue™ (InvivoGen) de acordo com as recomendações do fabricante durante 2 h. Os resultados descritos na Fig. 19 são uma média de pelo menos três experimentos independentes. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de um fator comum e testes de comparações múltiplas de Tukey.
[318] Os resultados demonstram que as frações vivas e sobrenadantes foram capazes de ativar TLR9. Exemplo 12 - Diferenciação de células T
[319] A capacidade de MRx0518 para induzir a diferenciação de células T foi explorada in vitro em células mononucleares de sangue periférico (PBMCs, Stemcell, Cat:70025). Resumidamente, PBMCs foram plaqueados em placas de 96 poços com anti-CD3 (Ebiosciência, anticorpo monoclonal anti-CD3 (clone OKT3), grau funcional, cat. Nº 16- 0037-81) a 400.000/poço em 50 µl de meio cRPMI por poço (cRPMI contém RPMI 1640 (+L-Glut, 21875-034) final 2mM conc. Estoque 200mM.; HI FBS a 10% (Gibco life technologies, 10082-147); mercaptoetanol a 50 µm (Gibco life technologies, 21985-023); e pen/strep a 1% (P4333, 10 mg/ml). MRx0518 morto por calor (preparado por incubação a 80°C durante 30 minutos, após o qual as culturas foram lavadas com PBS e ressuspensas em meio de cultura de células apropriado e contagens viáveis foram confirmadas por plaqueamento) foi então adicionado a cada poço, 4.000.000 em 100 µl/poço.
[320] Após 3 dias em uma incubadora a 37°C, as células foram removidas e ressuspensas em um meio contendo PMA- (Sigma, Cat nº P8139), Ionomycin (Sigma, Cat nº I3909) e GolgiSTOP (BD, Cat nº 554724) durante 5 horas. O estoque de PMA foi de 1 mg/ml em DMSO que foi posteriormente diluído em 100 ug/ml (cada amostra exigiu 50 ng/ml em cRPMI), o estoque de ionomicina foi de 1 mM em DMSO (foi usado 1 µM em cRPMI) e a concentração de GolgiStop foi usada a 4 µl/6 ml. Os sobrenadantes foram passados por um filtro de 0,22 µm e diluídos apropriadamente em meio de co-cultura.
[321] As células foram então submetidas a uma coloração de citometria de fluxo:
[322] Após a lavagem, as células foram incubadas com corante de viabilidade (Corante Fixável Viobility 405/520 de Miltenyi biotec 1 µl/amostra) + bloco Fc humano, cat. 564219 (1 µl/amostra) em PBS durante 10 minutos no escuro à temperatura ambiente. Os anticorpos de superfície (2 µl de cada) foram então adicionados diretamente aos poços durante 10 minutos no escuro à temperatura ambiente - CD3-
APC-Vio 770 (Miltenyi, cat. Nº 130-113-136), CD4-VioBlue (Miltenyi, cat. Nº 130-114-534) e CD25-VioBright FITC (Miltenyi, cat. Nº 130-113-283). As células foram então lavadas duas vezes em PBS e centrifugadas a 300 g/5 min/RT.
[323] O tampão de coloração do fator de transcrição eBioscience FoxP3 foi, então, usado para fixar e permeabilizar as células (cat. Nº 00- 5523). Seguindo o protocolo da eBioscience, um tampão perma- nente/fixo foi preparado usando 1 parte de solução de concentrado e 3 partes de diluente. As células foram fixadas durante 1h à RT e, em seguida, lavadas 2x em 1x lavagem Perm e centrifugadas a 300 g/5 min/RT. A seguinte coloração intracelular ou anticorpos de fator de transcrição foram adicionados às amostras em lavagem permanente (1x) durante 45 min/no escuro/a temperatura ambiente ou na geladeira durante a noite (até 18h), seguido de lavagem dos anticorpos 2x usando lavagem Perm (300 µl) e ressuspensão em PBS (250 µl) para adquirir no citômetro: Marcadores intracelulares Fatores de transcrição 2ul anti-IL10-PE 5,5ul anti-FoxP3-PE-Cy7 2ul anti-IFN-PE Vio770 9ul anti-Tbet-APC 10ul anti-IL17a-APC 9ul anti-RoRyt-PE  Anticorpos humanos anti IFN-PE Vio770 (Miltenyi, cat. Nº 130-114-025)  Anticorpos humanos anti IL10-PE (Miltenyi, cat. Nº 130-112- 728)  Anticorpos humanos anti IL17a-APC (Miltenyi, cat. Nº 130- 099-202)  Anticorpos humanos anti RORyt-PE (Miltenyi, cat. Nº 130- 103-837)  Anticorpos humanos anti Tbet-APC (Miltenyi, cat. Nº 130- 098-655
 Anticorpo monoclonal anti-Foxp3 (236A/E7), PE-Cy7 (ebios- ciência) cat. Nº 25-4777-41
[324] Como pode ser visto na Fig. 20A-B, tanto o sobrenadante de MRx0518 (SP 518) e MRx0518 morto por calor (HK 518) foram capazes de induzir a diferenciação de células T helper e células T citotóxicas, respectivamente, mesmo na ausência de citocinas para induzir a diferenciação (sem cito) Exemplo 13 - Assinatura de citocina induzida por MRx0518
[325] Os esplenócitos foram isolados de camundongos C57BL/6 e plaqueados em placas de 96 poços a uma densidade de 900.000 células/poço em RPMI1640 suplementado com FBS a 10%, L-glutamina a 2mM, Pen/Strep a 100 U/mL (Sigma-Aldrich) e β-mercaptoetanol a 55 μM (Gibco). As células foram tratadas com diferentes concentrações de meio em branco (YCFA+) ou sobrenadante de bactérias da fase estacionária durante 72 horas. Os sobrenadantes livres de células foram coletados após cada ponto de tempo e armazenados a -80⁰C para análise de citocinas. As citocinas foram medidas usando o kit multiplex procartaplex MO Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg 17plex (Invitrogen). A proliferação celular de esplenócitos não tratados ou esplenócitos tratados com meio YCFA a 10% ou sobrenadante de bactérias MRx0518 a 10% foi medida usando ensaio de MTT (Millipore), conforme ilustrado na Fig. 21F.
[326] Bactérias MRx0518 vivas em crescimento foram incubadas por até 2h com a linhagem de células epiteliais intestinais humanas CaCo-2 e com a linhagem de células de monócitos/macrófagos humanos THP-1. A resposta do hospedeiro foi analisada imediatamente (CaCo-2) ou após mais 24h de incubação (THP-1).
[327] PBMCs humanas saudáveis congeladas foram adquiridas da Stem Cells Technologies (Cambridge UK). As células foram descongeladas e deixadas em repouso durante a noite em meio de crescimento total (RPMI 1640 com FBS a 10%, β-mercaptoetanol a 55 μM, L. Glutamina a 2 mM e penicilina a 100 U/mL, estreptomicina a 100 µg/mL) em incubadora de CO2 a 37°C. Para a experiência, as células foram plaqueadas a uma densidade de 750.000 células/poço em placas de 48 poços e tratadas em meio de crescimento completo com sobrenadantes de bactérias a 10% na presença ou ausência de 1 ng/mL de LPS. O meio de cultura de células foi adicionado aos poços não tratados. As células foram deixadas em repouso durante 72 h, depois disso os sobrenadantes livres de células foram coletados e centrifugados durante 3 minutos a 10.000 g a 4°C. As amostras foram armazenadas a -80°C para análise de citocinas. A quantificação de citocinas foi realizada usando um imunoensaio multiplex ProcartaPlex seguindo as recomendações do fabricante (Thermo Fischer Scientific). Resumidamente, 50 µl de sobrenadantes de co-cultura livres de células foram usados para quantificação de citocinas usando um sistema MAGPIX® MILLIPLEX® (Merck) com o software xPONENT (Luminex, Austin, TX, EUA). Os dados foram analisados usando o software analista MILLIPLEX® (Merck) usando uma curva logística de 5 parâmetros e subtração de fundo para converter a intensidade média de fluorescência em valores pg/mL.
[328] Os dados são expressos nas Figs. 21A-D como uma média de duas réplicas técnicas de 10 réplicas biológicas (PBMC) ou três réplicas biológicas (esplenócitos) e mostram produção de citocinas em (A) PBMC; (B) Esplenócitos; (C) células THP-1; e (D) células Caco-2, após tratamento com meio em branco YCFA ("Veículo") ou bactérias MRx0518/sobrenadante bacteriano livre de células MRx0518 ("MRx0518"). A Fig. 21E representa dados adicionais relacionados à secreção de citocinas de esplenócitos (N = 3), de células que não foram tratadas ("Não tratadas"), tratadas com meio em branco YCFA ("YCFA a 10%") ou tratadas com bactérias livres de células MRx0518 sobrenadante (“MRx0518 a 10%”).
[329] Como pode ser visto nas Figs. 21A-D, o tratamento de diferentes células com um sobrenadante de bactérias MRx0518 resultou em imunoestimulação, conforme evidente por um aumento na produção de citocinas. Exemplo 14 - ativação de NF-κB
[330] A ativação do promotor NF-κB foi testada em células HEK293 que expressam um gene repórter de fosfatase alcalina embrionária segregada induzível por NF-κB (SEAP) com o gene humano NOD2, TLR4, TLR9 ou genes TLR5 (HEK-Blue™ -hNOD2, Células HEK-Blue™ -hTLR5, HEK-Blue™-hTLR9 e HEK-Blue™- hTLR4, respectivamente, por InvivoGen, San Diego, CA, EUA).
[331] Resumidamente, as células HEK-TLR4 foram mantidas em DMEM 4,5g/L D-glicose suplementado com (v/v) FBS a 10% inativado por calor, L-Glutamina a 4mM, penicilina a 100U/ml, estreptomicina a 100 µg/ml, normocina a 100 µg/ml, meio de seleção HEK-Blue 1x; para HEK-TLR5 e HEK-TLR9 o mesmo meio foi usado com exceção do uso de L-Glutamina a 2mM. HEK-TLR5 e HEK-TLR9 foram selecionados usando 30 µg/ml e 10 µg/ml de blasticidina respectivamente e 100 µg/ml de meio de zeocina para ambas as linhagens celulares na cultura.
[332] Para o experimento, as células foram lavadas com PBS, dissociadas em PBS e coletadas em meio de crescimento. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 25.000 células/poço para HEK-TLR4 e HEK-TLR5, 80.000 células/poço para HEK-TLR9 e 50.000 células/poço para HEK-NOD2.
[333] Para avaliar a capacidade de resposta das células aos seus ligantes, as células foram tratadas com LPS a 1 ng/ml (HEK-TLR4), flagelina ultra pura a 1 ng/µl de Salmonella typhimurium (HEK-TLR5), ODN2006 CPG a 1 µM (HEK -TLR9 controle positivo) ou ODN2006 GPC a 1 µM (HEK-TLR9 controle negativo), L18-MDP a 1 ng/ml e incubado em uma incubadora de CO2 a 37°C. Os tratamentos prosseguiram durante 22 h a 37°C e CO2a 5%, após os quais a detecção da atividade da Fosfatase Alcalina Embrionária Secretada (SEAP) a partir do sobrenadante da cultura de células foi realizada usando a solução QUANTI-blue de acordo com as instruções do fabricante. Resumi- damente, 20 µl de meio de cultura foram coletados e analisados quanto à presença de SEAP por mistura com 200 µl de meio de detecção QUANTI-Blue. Após 2h (HEK-TLR4 e HEK-TLR5) ou 4h (HEK-TLR9 e HEK-NOD2) de incubação a 37°C, a densidade óptica foi medida a 655 nm em um leitor de microplaca (microplaca iMark, Bio-Rad).
[334] Como pode ser visto nas Figs. 22A-D (mostrando resultados de réplicas técnicas ponderadas para três experimentos independentes), a ativação do promotor NF-κB foi medida em células que não foram tratadas ("Não tratadas"), tratadas com meio YCFA+ ("YCFA") ou tratadas com MRx0518 ("MRx0518"). Os seguintes controles positivos (1ng) foram usados - L18-MDP (para células HEK- Blue™-hNOD2, Fig. 22A), Lipopolissacarídeo, LPS (para HEK-Blue™- hTLR4, Fig. 22B), CPG ou negC (para HEK-Blue™-hTLR9, Fig. 22C) ou flagelina recombinante de S. typhimurium, FLA (para HEK-Blue™- hTLR5, Fig. 22D). As células foram incubadas com os vários tratamentos a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5% durante 22 h. Para medir a ativação do promotor NF-κB (N = 3), QUANTI-Blue™ (InvivoGen) foi misturado com sobrenadantes celulares, as placas foram incubadas durante 2h e a densidade óptica foi medida a 655 nm. Sequências SEQ ID NO: 1 (gene rRNA de Enterococcus gallinarum 16S - AF039900) 1 taatacatgc aagtcgaacg ctttttcttt caccggagct tgctccaccg aaagaaaaag 61 agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga taaca- cttgg
121 aaacaggtgc taataccgta taacactatt ttccgcatgg aagaaagttg aaagg- cgctt 181 ttgcgtcact gatggatgga cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggct- cacc 241 aaggccacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tga- gacacgg 301 cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatggacgaa ag- tctgaccg 361 agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagagaagaa 421 caaggatgag agtagaacgt tcatcccttg acggtatcta accagaaagc cacgg- ctaac 481 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattggg- cgt 541 aaagcgagcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggg- gagg 601 gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca tgtg- tagcgg 661 tgaaatgcgt agatatatgg aggaacacca gtggcgaagg cggctctctg gtctg- taact 721 gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt ag- tccacgcc 781 gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gcaaacg- cat 841 taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tga- cgggggc 901 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttac- caggtc 961 ttgacatcct ttgaccactc tagagataga gcttcccctt cgggggcaaa gtgaca- ggtg
1021 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgag- cgca 1081 acccttattg ttagttgcca tcatttagtt gggcactcta gcgagactgc cggtga- caaa 1141 ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gcta- cacacg 1201 tgctacaatg ggaagtacaa cgagttgcga agtcgcgagg ctaagctaat ctct- taaagc 1261 ttctctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagccggaat cgctag- taat 1321 cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccg- tcacac 1381 cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tttggagcca gccg- cctaag 1441 gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtg- cggctgg 1501 atcacc SEQ ID NO: 2 (sequência consenso de rRNA 16S para Enterococcus gallinarum cepa MRx0518) TGCTATACATGCAGTCGAACGCTTTTTCTTTCACCGGAGCTTG- CTCCAC-
CGAAAGAAAAAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAAC CTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATAC- CGTATAACACTATTTT- CCGCATGGAAGAAAGTTGAAAGGCGCTTTTGCGTCACTGATGGAT GGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCAC- CAAGGCCACGATGCATAG- CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATG- GACGAAAGTCTGACCGAG- CAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGT TGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAGAACGTTCATCCCTTGA- CGGTATCTAACCAGAAAG- CCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG CAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGG- TTTCTTAAGTCTGATG- TGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA GACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGG- TGAAATGCGTAGATATATG- GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGAC GCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATAC- CCTGGTAGTCCACGCCG- TAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGC TGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCG- CAAGGTTGAAACTCAAAGGA- ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGAC- CACTCTAGAGATAGAGCTT- CCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC- CCTTATTGTTAGTTG- CCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACC GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC- CTGGGCTACACACGTGC- TACAATGGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTA ATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCG- CCTACATGAAGCCGGAA- TCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCC GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACA- CCCGAAGTCGGTGAGG-
TAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTG SEQ ID NO: 3 (gene 16S rRNA para Enterococcus gallinarum cepa MRx0554) 1 taatacatgc aagtcgaacg ctttttcttt caccggagct tgctccaccg aaagaaaaag 61 agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga taaca- cttgg 121 aaacaggtgc taataccgta taacactatt ttccgcatgg aagaaagttg aaagg- cgctt 181 ttgcgtcact gatggatgga cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggct- cacc 241 aaggccacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tga- gacacgg 301 cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatggacgaa ag- tctgaccg 361 agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagagaagaa 421 caaggatgag agtagaacgt tcatcccttg acggtatcta accagaaagc cacgg- ctaac 481 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattggg- cgt 541 aaagcgagcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggg- gagg 601 gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca tgtg- tagcgg 661 tgaaatgcgt agatatatgg aggaacacca gtggcgaagg cggctctctg gtctg- taact 721 gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt ag- tccacgcc
781 gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gcaaacg- cat 841 taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tga- cgggggc 901 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttac- caggtc 961 ttgacatcct ttgaccactc tagagataga gcttcccctt cgggggcaaa gtgaca- ggtg 1021 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgag- cgca 1081 acccttattg ttagttgcca tcatttagtt gggcactcta gcgagactgc cggtga- caaa 1141 ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gcta- cacacg 1201 tgctacaatg ggaagtacaa cgagttgcga agtcgcgagg ctaagctaat ctct- taaagc 1261 ttctctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagccggaat cgctag- taat 1321 cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccg- tcacac 1381 cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tttggagcca gccg- cctaag 1441 gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtg- cggctgg 1501 atcacc
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Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, para uso na estimulação do sistema imunológico em um sujeito.
2. Composição para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento, prevenção ou retardo da imunossenescência.
3. Composição para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para uso como um adjuvante de vacina.
4. Composição para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para uso na potencialização de uma terapia celular, tal como CAR-T.
5. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que é para uso no aumento do nível de expressão e/ou atividade de IL-12p70, IL-8, IL- 1β, IL-6, IL-23 e/ou TNF-α.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizada pelo fato de que é para uso no au- mento do nível e/ou atividade de NF-κB
7. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bac- teriana tem uma sequência do gene de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO:2, ou em que a cepa bacteriana tem a sequência do gene de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO:2.
8. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bac- teriana tem uma sequência do gene de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO:3, ou em que a cepa bacteriana tem a sequência do gene de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO:3.
9. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bac- teriana é a cepa depositada sob o número de acesso 42488 no NCIMB.
10. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bac- teriana é a cepa depositada sob o número de acesso 42761 no NCIMB.
11. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é para administração oral.
12. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a composi- ção compreende um ou mais excipientes ou carreadores farmaceutica- mente aceitáveis.
13. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bac- teriana é liofilizada.
14. Produto alimentício, caracterizado pelo fato de que com- preende a composição como definida em qualquer uma das reivindica- ções precedentes, para uso como definido em qualquer uma das reivin- dicações precedentes.
15. Método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada à imunoestimulação reduzida, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição compre- endendo uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum a um paciente em necessidade.
16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula da cepa bacteriana como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 14, em que a célula expressa um ou mais antígenos heterólogos.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracte- rizada pelo fato de que a célula apresenta o um ou mais antígenos he- terólogos.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que é para uso como uma vacina.
19. Célula da cepa bacteriana, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a célula expressa um ou mais antígenos heterólogos.
20. Célula, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a célula apresenta o um ou mais antígenos heterólogos.
21. Célula, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracte- rizada pelo fato de que é para uso como uma vacina.
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 6/157 Não tratados Veículo MRx0518 1/36
Volume de Tumor Médio (mm3) Dias após Indução de Tumor Dia
Não tratados vs Veículo
Não tratados vs MRx0518 Não tratados vs anti-CTLA-4
Veículo vs MRx0518
Veículo vs anti-CTLA4 MRx0518 vs anti-CTLA4
% da Área de Necrose em Tumores EMT6 % da Área de Necrose
Não tratados Veículo
Tratamento
% de Células em Divisão em Tumores EMT6 % da Área de Necrose
Não tratados Veículo Tratamento
CD45+ (%, tumor) CD45+, CD3+ (%, tumor)
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 8/157 Não tratados Não tratados Veículo Veículo 3/36
CD4+ (%, tumor) CD8+ (%, tumor)
Não tratados Não tratados Veículo Veículo
(continuação) CD4+, FoXP3+ (%, tumor) CD4+, CD25+ (%, tumor)
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 9/157 Não tratados Não tratados Veículo Veículo 4/36
Razão de CD8+/FOXP3+ (%, tumor) Razão de CD8+/FOXP3+ (%, tumor)
Não tratados
Veículo
Razão de % CD8+/% FOXP3+ Não tratados Veículo Razão de CD8+/FOXP3+
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 10/157 Concentração de Citocinas Concentração de Citocinas (pg/mg de proteína total) (pg/mg de proteína total) Não tratados Não tratados
Veículo Veículo
Concentração de Citocinas Concentração de Citocinas (pg/mg de proteína total) (pg/mg de proteína total)
Não tratados Não tratados
Veículo Veículo 5/36
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 11/157 Concentração de Citocinas Concentração de Citocinas (pg/mg de proteína total) (pg/mg de proteína total) Não tratados Não tratados Veículo
Veículo Concentração de Citocinas Concentração de Citocinas (pg/mg de proteína total) (pg/mg de proteína total) (continuação)
Não tratados Não tratados Veículo
Veículo 6/36
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 12/157 Concentração de Citocinas (pg/mg de proteína total) Não tratados Veículo Concentração de Citocinas (pg/mg de proteína total) (continuação)
Não tratados Veículo 7/36
Não tratados Não tratados
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 13/157 Veículo Veículo
Dia 14 Dia 0 Dia 22
Concentração de Citocinas (pg/ml) Dia 14 Dia 0 Dia 22
Concentração de Citocinas (pg/ml) 8/36
Não tratados Não tratados Veículo Veículo
Dia 14 Dia 0 Dia 22 Dia 14 Dia 0 Dia 22
Concentração de Citocinas (pg/ml) Concentração de Citocinas (pg/ml)
(continuação)
Não tratados Não tratados
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 14/157 Veículo Veículo
Concentração de Citocinas (pg/ml) Dia 0 Dia 22
Concentração de Citocinas (pg/ml) Dia 14 Dia 14 Dia 0 Dia 22 9/36
Não tratados Não tratados Veículo Veículo
Concentração de Citocinas (pg/ml) Concentração de Citocinas (pg/ml)
Dia 14 Dia 0 Dia 22 Dia 14 Dia 0 Dia 22
(continuação)
Não tratados Não tratados
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 15/157 Veículo Veículo
Concentração de Citocinas (pg/ml) Dia 14 Dia 0 Dia 22 Dia 14 Dia 0 Dia 22
Concentração de Citocinas (pg/ml) 10/36
Não tratados Não tratados Veículo Veículo
Dia 14 Dia 0 Dia 22 Dia 14 Dia 0 Dia 22
Concentração de Citocinas (pg/ml) Concentração de Citocinas (pg/ml)
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 16/157 Não tratados Não tratados Veículo Veículo 11/36
Dia 14 Concentração de Citocinas (pg/ml) Dia 0 Dia 0 Dia 22 Dia 14 Dia 22
Concentração de Citocinas (pg/ml) (continuação)
Cripta Cripta Cripta Veículo
Porcentagem de vistas em campo mostrando mais do que 3 células CD8α+ na região de cripta
Veículo
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 19/157 Não tratados Veículo 14/36
Volume de Tumor Médio (mm3) Dias após Indução de Tumor
Dia Não tratados vs Veículo Não tratados vs MRx0518 Não tratados vs anti-CTLA-4
Veículo vs MRx0518
Veículo vs anti-CTLA4
MRx0518 vs anti-CTLA4
Pesos dos Fígados (g)
Não Tratados
Veículo
Não tratados
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 21/157 Veículo
Volume de Tumor Médio (mm3) 16/36
Dias após Indução de Tumor
Dia Não tratados vs Veículo
Não tratados vs MRx0518 Não tratados vs Paclitaxel Não tratados vs anti-CTL4/anti-PD-L1 Veículo vs MRx0518 Veículo vs Paclitaxel Veículo vs anti-CTL4/anti-PD-L1 MRx0518 vs Paclitaxel MRx0518 vs anti-CTL4/anti-PD-L1 Paclitaxel vs anti-CTL4/anti-PD-L1
Controle Negativo Controle Positivo
Concentração de Citocinas (pg/ml) Concentração de Citocinas (pg/ml)
Adição de MRX518 Adição de MRX518 e LPS Concentração de Citocinas (pg/ml) Concentração de Citocinas (pg/ml)
Sem LPS
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 23/157 Concentração de Citocinas (pg/ml) (Sem Bactéria) Controle Negativo
Concentração de Citocinas (pg/ml) Controle Negativo (sedimento bacteriano)
Concentração de Citocinas (pg/ml) Adição de MRX518 18/36
Veículo Macrófagos
Não Tratados Não Tratados
Macrófagos
Não Tratados Não Tratados
Macrófagos
Não Tratados Não Tratados
Macrófagos
Não Tratados Não Tratados
Macrófagos
Não Tratados Não Tratados
Macrófagos
Não Tratados Não Tratados
Macrófagos
Não Tratados Não Tratados
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 28/157 23/36
Não Fígado Sobrenadante tratados Destruídas YCFATipsina MR0518Tipsina por calor
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 29/157 24/36
Não Fígado Sobrenadante tratados Destruídas YCFATipsina MR0518Tipsina por calor
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 30/157 Recepção Injeção de tumor no Sacrifício do Lote1 dos animais lote 2 e no lote 3 10 Animais gr1-3 Início da dosagem no lote 1 25/36
Início da dosagem D-14 no lote 2 e no lote 3
Randomização Sacrifício do Lote2 BW Sacrifício do Lote3 10 Animais gr1-3 10 Animais gr1-5 Todos os grupos
Não tratados
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 31/157 Veículo
Volume de Tumor Médio (mm3) 26/36
Dias após Indução de Tumor
Dia
Não tratados vs Veículo
Não tratados vs MRx0518 Não tratados vs anti-CTL4 Não tratados vs MRx0518 + anti-CTL4 Veículo vs MRx0518 Veículo vs anti-CTL4
Veículo vs MRx0518 + anti-CTLA-4 MRx0518 vs anti-CTLA-4
MRx0518 vs MRx0518 + anti-CTLA-4 anti-CTLA-4 vs MRx0518 + anti-CTLA-4
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 32/157 Não tratados
Veículo
Volume de Tumor Médio (mm3) 27/36
Dias após Indução de Tumor
Dia
Não tratados vs Veículo
Não tratados vs MRx0518 Não tratados vs anti-CTL4
Veículo vs MRx0518
Veículo vs anti-CTLA-4 MRx0518 vs anti-CTLA-4
Teste Legenda Controle Negativo Glicerol Intermediário Eritritol Positivo
D-Xilose L-Xilose
Metil-betaD-xilopiranosídeo
D-Glicose D-Frutose D-Manose
L-Ramnose D-Manitol
L-Manitol
Metil-alfaD-Manopiranosídeo Metil-alfaD-Glicopiranosídeo N-Acetilglicosamina Amidalina Arbutina Esculina Salicina D-Celobiose
D-Sacarose D-Trealose Inulina
D-Rafinose Amidon (Amido) Glicose Xilitol
D-Lixose
Gluconato de Potássio 2-KetoGluconato de Potássio 5-KetoGluconato de Potássio
Não tratados
Células T helper % IL10- IFNᵧ (de células CD3+ CD4+) % IL10- IFNᵧ (de células CD4+)
HK 518 (sem citocinas) HK 518 (sem citocinas) SP 518 (sem citocinas) SP 518 (sem citocinas) RPMI (sem citocinas) RPMI (sem citocinas)
Produção de Citocinas PBMC Concentração (pg/mL)
Veículo
Produção de Citocinas de Esplenócitos Concentração (pg/mL)
Veículo
Produção de Citocinas de THP-1 Concentração (pg/mL)
Veículo
Expressão de Citocinas de Caco-2
Secreção de Citocinas de Esplenócitos de Camundongo (N=3)
Petição 870200142905, de 12/11/2020, pág. 37/157 32/36
Não tratados
Esplenócitos de Camundongo em Ensaio MTT N=4 Viabilidade Celular %
Não tratados
Ativação do Promotor NFkB-AP1 em HEKhNOD2 (N=3)
Não tratados
Ativação do Promotor NF-ꞵκ -AP1 em HEKTLR4 N=3
Não tratados
Ativação do Promotor NF-ꞵκ -AP1 em HEKTLR9 N=3
Não tratados
Ativação do Promotor NF-ꞵκ -AP1 em HEKTLR5 N=3
Não tratados
Tipos Celulares Modulados por MRx0518
Células CD56dim NK
CD8 Exauridas
Células Citotóxicas
Macrófagos
Células T
Mastócitos
Neutrófilos
Células B
Células NK
Veículo
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