ES2908826T3 - Composiciones de flagelina de entrecoccus para su uso en terapia - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en terapia.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de flagelina de entrecoccus para su uso en terapia

CAMPO TÉCNICO

Esta invención pertenece al campo de las composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina de cepas bacterianas y al uso de tales composiciones en el tratamiento de enfermedades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se cree que el intestino humano es estéril en el útero, pero está expuesto a una gran variedad de microbios maternos y ambientales inmediatamente después del nacimiento. A partir de entonces, se produce un período dinámico de colonización y sucesión microbiana, que está influenciado por factores como el modo de parto, el medio ambiente, la dieta y el genotipo del huésped, todos los cuales impactan sobre la composición de la microbiota intestinal, particularmente durante los primeros años de vida. Posteriormente, la microbiota se estabiliza y se vuelve adulta [1]. La microbiota intestinal humana contiene más de 500-1000 filotipos diferentes que pertenecen esencialmente a dos grandes divisiones bacterianas, Bacteroidetes y Firmicutes [2]. Las relaciones simbióticas con éxito que surgen de la colonización bacteriana del intestino humano han producido una amplia variedad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras funciones beneficiosas. Las actividades metabólicas mejoradas del intestino colonizado aseguran que los componentes dietéticos que de otro modo no serían digeribles se degraden con la liberación de subproductos que proporcionan una importante fuente de nutrientes para el huésped. De manera similar, la importancia inmunológica de la microbiota intestinal está bien reconocida y se ejemplifica en animales libres de gérmenes que tienen un sistema inmunitario deteriorado que se reconstituye funcionalmente después de la introducción de bacterias comensales [3-5].

En marcado contraste con la producción de IgA intestinal secretora, que está influenciada por la colonización microbiana per se [6-7], el desarrollo y la diferenciación de las células T parecen requerir la colonización por microorganismos comensales específicos. Las especies de Clostridium, y en particular las bacterias filamentosas segmentadas formadoras de esporas (SFB), parecen ser un potente estímulo para la diferenciación y maduración de Th1, Th17 y Tregs intestinales y colónicos [8-9]. Estudios más recientes han demostrado que otras bacterias intestinales, incluyendo las de Clostridium clústeres IV y XIVa y Flora de Schaedler Alterada (ASF), pueden inducir la generación de novo de Tregs, mientras que la monocolonización con Bacteroides fragilis puede corregir el desequilibrio Th1/Th2 en ratones libres de gérmenes promoviendo la expansión de Tregs [5][10-11]. Estos datos infieren importantes efectos inmunorreguladores de otras bacterias intestinales residentes. Claramente, los efectos de las bacterias comensales sobre las vías de diferenciación de las células T son variables y, como se postuló anteriormente, pueden estar influenciados por la variedad de ligandos de TLR que se encuentran asociados con bacterias específicas [12]. Por ejemplo, actualmente se desconoce el mecanismo por el cual SFB influye en las respuestas de las células T, pero estudios recientes del genoma que confirman la presencia de genes de flagelina sugieren que las respuestas innatas mediadas por interacciones de TLR5-flagelina pueden desempeñar un papel [13-14].

La flagelina es uno de los principales componentes del flagelo bacteriano. El flagelo es un apéndice con forma de látigo que proporciona motilidad a la bacteria y puede actuar como un orgánulo sensorial. La estructura y composición de la flagelina bacteriana se ha estudiado exhaustivamente en organismos modelo, como Salmonella typhimurium y E. coli. La flagelina de Salmonella typhimurium y E. coli activan el sistema inmunitario a través del receptor TLR5, lo que lleva a la activación de una variedad de genes proinflamatorios y de respuesta inmunitaria [15]. Se ha sugerido que los agonistas de TLR5, como la flagelina de Salmonella typhimurium, pueden actuar como agentes anticancerígenos [16]. También se ha propuesto que la Salmonella typhimurium modificada para expresar flagelina de Vibrio vulnifificus actúa como un agente anticancerígeno [17]. Además, se ha sugerido que los péptidos de flagelina de Salmonella typhimurium, Vibrio cholera y Shigella dysenteriae pueden usarse para producir vacunas contra enfermedades infecciosas como la fiebre tifoidea, el cólera y la disentería cuando se expresan en bacterias intestinales que han sido modificadas genéticamente [18]. Sin embargo, la flagelina de otras especies de bacterias siguen estando pobremente caracterizadas y tales otras flagelinas pueden tener diferentes efectos o usos.

Se han documentado cambios drásticos en la composición de la microbiota en trastornos gastrointestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). Por ejemplo, los niveles de bacterias del clúster XIVa de Clostridium se reducen en pacientes con IBD, mientras que aumenta el número de E. coli, lo que sugiere un cambio en el equilibrio de simbiontes y patobiontes dentro del intestino [19-22]. Curiosamente, esta disbiosis microbiana también se asocia con desequilibrios en las poblaciones de células T efectoras.

En reconocimiento del efecto positivo potencial que ciertas cepas bacterianas pueden tener sobre el intestino animal, se han propuesto varias cepas para su uso en el tratamiento de varias enfermedades (ver, por ejemplo, [23-26]). Además, se han propuesto ciertas cepas, incluyendo principalmente las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium, para su uso en el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias y autoinmunes que no están directamente relacionadas con los intestinos (ver [27] y [28] para revisiones). Sin embargo, la relación entre diferentes enfermedades y diferentes cepas bacterianas, y los efectos precisos de cepas bacterianas particulares sobre el intestino y a un nivel sistémico y en cualquier tipo particular de enfermedad, están pobremente caracterizados. Por ejemplo, ciertas especies de Enterococcus se han implicado en causar cáncer [29].

Se ha sugerido que ciertas cepas de Streptococcus y Veillonella, y en menor medida, cepas de Enterococcus y Lactobaccillus tienen efectos inmunomoduladores, con efectos variables sobre diferentes citoquinas in vitro. Sin embargo, la relación entre diferentes enfermedades y diferentes cepas bacterianas, y los efectos precisos de cepas bacterianas particulares sobre el intestino y a nivel sistémico y en cualquier tipo particular de enfermedad, están pobremente caracterizados.

La JP2017/506212 divulga vacunas comestibles a base de algas. La WO2009/130618 divulga vacunas de polipéptidos de flagelina. La WO2017/085520 divulga composiciones que comprenden cepas bacterianas. Lorena Román et al. analizan el efecto del probiótico Enterococcus gallinarum L-1 sobre los parámetros inmunes innatos de especies destacadas para la acuicultura marina. Hay una necesidad en la técnica para nuevos métodos de tratamiento de enfermedades. También hay una necesidad para caracterizar los efectos potenciales de las bacterias intestinales para poder desarrollar nuevas terapias.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Los inventores han desarrollado nuevas terapias para tratar y prevenir enfermedades. En particular, los inventores han identificado que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son útiles en terapia. Como se demuestra en los ejemplos, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden activar fuertemente las respuestas de TLR5 a niveles significativamente más altos que el agonista de TLR5 bien conocido flagelina de Salmonella. typhimurium.

En realizaciones preferidas, la invención proporciona polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en terapia. En realizaciones preferidas adicionales, el polipéptido de flagelina es de la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 42488. En realizaciones preferidas, el polipéptido de flagelina es la SEQ ID NO:1. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina de la cepa MRx0518 (la cepa depositada con el número de registro NCIMB 42488) pueden activar más fuertemente una respuesta de TLR5 en comparación con los polipéptidos de flagelina de otras cepas de Enterococcus gallinarum. Por tanto, los polipéptidos de flagelina de la cepa NCIMB 42488 son particularmente eficaces para su uso en terapia.

En realizaciones preferidas, el polipéptido de flagelina está en forma monomérica, lo que permite que el polipéptido se una de manera más eficaz con un receptor TLR5.

Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina de la cepa NCIMB 42488 son particularmente eficaces para activar una respuesta de TLR5. Los polipéptidos de flagelina de la cepa NCIMB 42488 pueden no contener un dominio D3 y los inventores han observado que la mayor parte de la variación de secuencia entre diferentes polipéptidos de flagelina se observa en la región D2-D3. En realizaciones preferidas, la invención proporciona polipéptidos de flagelina del género Enterococcus o de la especie Enterococcus gallinarum que no contienen un dominio D3.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina es parte de un ensamblaje flagelar bacteriano. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un ensamblaje flagelar bacteriano que comprende un polipéptido de flagelina como se describe en la presente. En realizaciones preferidas, el ensamblaje flagelar bacteriano contiene las proteínas FliL y FlaG. Las proteínas FliL y FlaG están presentes en el ensamblaje flagelar bacteriano de MRx0518. Los ejemplos muestran que el polipéptido de flagelina de MRx0518 es particularmente eficaz para activar una respuesta de TLR5.

La invención proporciona un fragmento de un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en terapia, en donde el fragmento comprende los aminoácidos 87-96, 165-272 y 290-295 de la SEQ ID NO: 1. La invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de flagelina como se describe en la presente para su uso en terapia.

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un fragmento de un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, en donde el fragmento a) comprende los aminoácidos 87-96, 165-272 y 290-295 de la SEQ ID NO: 1 y uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables; o b) comprende los aminoácidos 2-32, 87-96, 165-272, 234-358, 290-295 de la SEQ ID NO: 1 y uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

La invención también proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina del género Enterococcus para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en terapia. En realizaciones preferidas, la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518 para su uso en terapia.

En otras realizaciones, la invención proporciona una célula huésped que expresa un polipéptido de flagelina recombinante del género Enterococcus, para su uso en terapia. En otras realizaciones, la invención también proporciona una célula huésped que comprende una secuencia de polinucleótidos recombinantes que codifica un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en terapia. En otras realizaciones, la invención proporciona un vector o un plásmido que comprende una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la invención.

La invención proporciona composiciones para su uso en terapia en donde la composición comprende polipéptidos de flagelina como se describe en la presente. La invención también proporciona composiciones que comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina como se describe en la presente para su uso en terapia. La invención también proporciona una célula huésped que expresa un polipéptido de flagelina como se describe en la presente para su uso en terapia. Además, la invención también proporciona composiciones para su uso en terapia en donde la composición comprende una célula huésped, en donde la célula huésped comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención.

Se sabe que la activación de TLR5 por la flagelina de S. typhimurium suprime la proliferación celular y el crecimiento tumoral [48]. Las composiciones que comprenden cepas de Enterococcus gallinarum son eficaces para tratar y prevenir el cáncer [50]. Los inventores han demostrado sorprendentemente que los polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum son capaces de estimular una fuerte respuesta de TLR5, lo que puede contribuir a la actividad anticancerígena de las cepas de Enterococcus. Por tanto, los inventores han demostrado que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus, y en particular de la especie Enterococcus gallinarum, son útiles en terapia y particularmente eficaces en el tratamiento y prevención del cáncer.

En realizaciones preferidas, las composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son para su uso en el tratamiento de tumores inmunogénicos y/o tumores sólidos. En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de hígado o cáncer de colon. Las composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden ser particularmente eficaces para reducir el tamaño del tumor o prevenir el crecimiento tumoral en el tratamiento del cáncer.

En realizaciones preferidas, la composición para su uso en la invención se administra por inyección, preferiblemente por vía subcutánea o alternativamente por vía intravenosa o intraperitoneal.

En ciertas realizaciones, por ejemplo cuando la composición comprende una célula huésped de la invención, la composición para su uso en la invención es para administración oral. En ciertas realizaciones, la composición para su uso en la invención comprende uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

Los inventores han desarrollado nuevas composiciones que comprenden un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, preferiblemente de la especie Enterococcus gallinarum que pueden usarse para estimular el sistema inmunitario y tratar y prevenir enfermedades. Los inventores han identificado que tales composiciones pueden activar potentemente el sistema inmunitario y pueden tratar el cáncer, lo que indica que también pueden tratar otras enfermedades en las que puede ser útil la activación del sistema inmunitario.

Por lo tanto, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en la estimulación del sistema inmunitario en el sujeto.

En aspectos adicionales, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en el tratamiento, la prevención o el retraso de la inmunosenescencia.

En aspectos adicionales, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso como adyuvante de vacunas.

En aspectos adicionales, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en la potenciación de una terapia celular, como CAR-T.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: La estructura de la flagelina y las vistas en sección transversal y superior del filamento flagelar. El filamento flagelar está compuesto por una sola proteína, la flagelina. La región de reconocimiento de TLR5 está en el dominio D1 y no es accesible cuando la flagelina se polimeriza en el filamento flagelar. La imagen es de la referencia [30].

Figura 2 : Alineación de secuencias de proteínas de 24 polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum y el organismo modelo S. typhimurium. Se resaltan los dominios D0, D1 y D2 y los sitios de unión de TLR5 predichos para el polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518.

Figura 3 : Alineación de secuencias de proteínas de polipéptidos de flagelina de la cepa MRx0518 con 23 polipéptidos de flagelina de la especie E. gallinarum. Se resaltan los dominios D0, D1 y D2 y los sitios de unión de TLR5 predichos para el polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518.

Figura 4 : Diagrama de rutas KEGG del ensamblaje flagelar. Los genes resaltados en gris están presentes en la especie.

Figura 5: Comparación de la estructura proteica de flagelina MRx0518 predicha (FIÍCmrx0518) con la estructura proteica de flagelina de S. typhimurium conocida. La estructura proteica de flagelina de S. typhimurium es de la referencia [30].

Figura 6 : Activación de MRx0518 de células informadoras de TLR5.

Figura 7 : Activación específica de cepa de células informadoras de TLR5.

Figura 8 : respuesta de TLR5 de CFS de MRx0518 y DSM100110 después del tratamiento con tripsina.

Figura 9 : a) Estrategia de clonación para la producción de proteínas de flagelina recombinantes en E.coli; b) Evaluación de la calidad de las proteínas de flagelina recombinantes purificadas, FlaAMRx0518 y FlaADSM100110 en un gel SDS-PAGE.

Figura 10: Comparación de la activación de TLR5 con FlaAMRx0518, FlaADSM100110 y CFS de MRx0518 y DSM100110.

Figura 11: Caracterización fenotípica de MRx0518 flaA- mutante.

Figura 12: Activación de TLR5 con MRx0518 flaA- CFS mutante.

Figura 13: estrategia de mutación de flaA.

Figura 14: Microscopía electrónica de MRx0518.

Figura 15: Activación de TLR5 murino por proteínas de flagelina recombinantes de MRx0518 y DSM 100110. Los datos son representativos de tres réplicas independientes.

Figura 16: Una alineación de secuencias de proteínas de flagelina de MRx0518 y DSM 100110 realizada usando el software de alineación de secuencias múltiples CLUTAL OMEGA v2.1.

Figura 17: Activación de TLR5 humano por cepas móviles de E. gallinarum y E. casseliflavus. Los datos representan la media y la desviación estándar de 3 réplicas biológicas. La significancia se evaluó mediante la prueba ANOVA unidireccional - "a" denota p < 0,0001.

Figura 18: Activación de NF-^kB por MRx0518.

Figura 19: Inducción de la diferenciación de células T en una población de (A) células T auxiliares y (B) linfocitos T citotóxicos (CTL) usando sobrenadante de MRx518 y RPMI medial como control, sin adición de citoquinas (sin cito).

Figura 20: Una estrategia de mutación de flaA alternativa.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

Flagelina

La flagelina, un componente principal de los flagelos bacterianos, estimula la defensa del huésped en una variedad de organismos, incluyendo mamíferos, insectos y plantas. La estructura y composición de la flagelina bacteriana se ha estudiado exhaustivamente en organismos modelo como S. typhimurium y E. coli. Sin embargo, hay muy pocos datos disponibles que describan la flagelina del género Enterococcus y, en particular, de la especie Enterococcus gallinarum.

La flagelina puede existir o como una proteína monomérica o puede polimerizarse para formar un filamento de flagelo. Los filamentos del flagelo bacterianos en Salmonella se componen de aproximadamente 20.000 unidades de proteína flagelina. Los filamentos de flagelo forman parte de un flagelo bacteriano completamente ensamblado.

Las proteínas de flagelina generalmente contienen 3-4 dominios (D0, D1, D2 y D3), con los dominios D0 y D1 consistiendo de un pliegue de los extremos N- y C-terminales [31]. Durante el ensamblaje del filamento del flagelo, los dominios D0 y D1 están enterrados dentro del filamento del flagelo con los dominios D2 y/o D3 orientados hacia afuera (Figura 1).

Se ha demostrado que los motivos de aminoácidos dentro del dominio conservado D1 son necesarios para el reconocimiento y la interacción de TLR5 [32-33]. También se ha demostrado que el dominio D0 afecta la señalización de TLR5 [34]. El sitio de reconocimiento de TLR5 generalmente no es accesible en el filamento flagelar. La flagelina interactúa más eficazmente con TLR5 en su forma monomérica, ya que los sitios de unión de TLR5 no son accesibles cuando se ensamblan en un filamento [30]. La región central de la proteína flagelina presenta variabilidad de secuencia y no se ha estudiado exhaustivamente, pero se considera que es una región antigénica e inmunogénica de la proteína.

Los dominios D0 y D1 están altamente conservados, mientras que los dominios D2 y D3 son más variables [35]. La Figura 2 es una alineación de secuencias de proteínas de flagelina del género Enterococcus con la proteína de flagelo exhaustivamente estudiada de S. typhimurium. La mayor parte de la variación de secuencia entre la proteína flagelina de S. typhimurium y las proteínas flagelina del género Enterococcus se encuentra dentro de la región central (dominio D2-D3). La mayor parte de la variación de secuencia entre diferentes cepas de Enterococcus gallinarum también se observa en esta región, por ejemplo, entre proteínas de flagelina de las cepas MRx0518 y DSM100110 (Figura 3).

El filamento del flagelo es un componente del flagelo bacteriano. Los genes que se sabe que están implicados en el ensamblaje flagelar bacteriano se resumen en la Figura 4. Los sombreados en gris están presentes en Enterococcus gallinarum. Las proteínas de flagelina están codificadas por FliC, a la que también se hace referencia indistintamente en la presente como FlaA.

La invención proporciona un polipéptido de flagelina del género Enterococcus para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en terapia. En realizaciones preferidas, la invención proporciona un polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518 para su uso en terapia. Los ejemplos demuestran que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden activar una fuerte respuesta de TLR5, lo que muestra que los polipéptidos de flagelina pueden ser útiles en terapia y, en particular, útiles en el tratamiento del cáncer.

La invención proporciona un polipéptido de flagelina del género Enterococcus para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer. En realizaciones preferidas, la invención proporciona un polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518 para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer. Los ejemplos demuestran que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son capaces de inducir fuertes respuestas de TLR5, lo que es útil para tratar y prevenir el cáncer. En particular, los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarumy especialmente la cepa MRx0518 producen una respuesta de TLR5 muy alta.

En realizaciones preferidas, la invención proporciona un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum o de la especie Enterococcus casseliflavus, para su uso en terapia, en particular para tratar o prevenir el cáncer. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina es de la especie Enterococcus casseliflavus. En las realizaciones más preferidas, el polipéptido de flagelina es de la especie Enterococcus gallinarum.

En los ejemplos se probaron los polipéptidos de flagelina de la cepa MRx0518. La MRx0518 es una cepa de la bacteria Enterococcus gallinarum depositada con el número de registro NCIMB 42488. La cepa MRx0518 fue depositada ante la autoridad internacional de depósito NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escocia) el 16 de noviembre de 2015 como "Enterococcus sp” y se le asignó el número de registro NCIMB 42488.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido de flagelina con por lo menos un 75% de identidad de secuencia con el polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518 para su uso en terapia y, en particular, en el tratamiento o la prevención del cáncer. Los ejemplos muestran que tales polipéptidos de flagelina son especialmente eficaces. En particular, el polipéptido de flagelina que tiene una secuencia con por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1. Preferiblemente, el polipéptido de flagelina para su uso en la invención comprende o consiste de la SEQ ID NO:1. En otras realizaciones, el polipéptido de flagelina tiene una secuencia con por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. El polipéptido de flagelina para su uso en la invención puede comprender o consistir de la SEQ ID NO:2. Los ejemplos también demuestran que tales polipéptidos son útiles.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina tiene por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO:3-42. En realizaciones preferidas, el polipéptido de flagelina tiene una secuencia con por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 3-16. En realizaciones preferidas, el polipéptido de flagelina es de la especie Enterococcus gallinarum.

En realizaciones preferidas, la flagelina para su uso en la invención se une a TLR5, por ejemplo, con un valor de Kd de por lo menos 10-2, por lo menos 10-3, por lo menos 10-4, por lo menos 10-5, por lo menos 10-6, por lo menos 10-7, por lo menos 10-8, por lo menos 10-9, por lo menos 10-10 o por lo menos 10-11. La unión a TLR5 puede medirse mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica, incluyendo la espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS), la microscopia electroquímica de barrido (SECM) [36] o los análisis de cromatografía de filtración en gel y PAGE nativa usando una proteína de TLR5 recombinante [37].

Los polipéptidos de flagelina para su uso en la invención pueden contener cuatro dominios, D0, D1, D2 y D3. En realizaciones preferidas, el polipéptido de flagelina no comprende un dominio D3. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina para su uso en la invención consiste de tres dominios, D0, D1, D2. La localización de los dominios D0, D1 y D2 en el polipéptido de flagelina de E. gallinarum se muestran en la Figura 3. La forma predicha del polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518 (FIÍCmrx0518) se muestra en la Figura 5. La estructura predicha de FIÍC^mrx0518 se generó usando la herramienta Phyre2 que predice la estructura de la proteína en base a la homología con estructuras disponibles públicamente [38] y el gráfico se generó con el paquete UCSF Chimera [39]. La falta prevista del dominio D3 lleva a un cambio de conformación en la estructura de la proteína en comparación con el polipéptido de flagelina de S. typhimuriumSL1344 (N° de registro GenBank CBW17983). La falta predicha de un dominio D3 puede llevar a que el sitio de reconocimiento de TLR5 esté más expuesto, lo que lleva a un aumento en la capacidad del polipéptido de flagelina para activar una respuesta de TLR5. La falta predicha de un dominio D3 también puede afectar la capacidad del polipéptido de flagelina de polimerizarse en un filamento de flagelo. El polipéptido de flagelina activa las respuestas de TLR5 más eficazmente en la forma monomérica, por lo tanto es beneficioso prevenir o reducir la polimerización de los polipéptidos de flagelina.

Los polipéptidos de flagelina para su uso en la invención pueden contener un dominio D1, que puede ser necesario para el reconocimiento y la interacción de TLR5. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina con un dominio D1 tiene por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con los residuos 43-164 y 273-317 en la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina tiene un sitio de reconocimiento de TLR5 en el dominio D1. El sitio de reconocimiento de TLR en polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum se localiza en la posición 87-96 y 290-295 en la SEQ ID NO:1. En realizaciones preferidas, el sitio de reconocimiento de TLR5 del polipéptido de flagelina tiene por lo menos un 99%, 99,5% o 99,9% de identidad con los residuos 87-96 y 290-295 en la SEQ ID NO:1. En realizaciones preferidas adicionales, el polipéptido de flagelina comprende el sitio de reconocimiento de TLR5 de los residuos 87-96 y 290-295 en la SEQ ID NO:1.

El polipéptido de flagelina para su uso en la invención también puede contener un dominio D0, que puede afectar a la señalización de TLR5. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina con un dominio D0 tiene por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad con los residuos 2-32 y 234-358 en la ^s E^q ID NO:1.

El polipéptido de flagelina para su uso en la invención también puede contener un dominio D2. La mayor parte de la variación de secuencia entre los polipéptidos de flagelos de S. typhimurium y el género Enterococcus se encuentran dentro de la región central (dominio D2-D3). Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum son capaces de producir una respuesta de TLR5 más fuerte a una dosificación más baja en comparación con el polipéptido de flagelina de S. typhimurium. La variación de secuencia en el dominio D2 o D3 puede contribuir a una capacidad aumentada de los polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para activar una respuesta de TLR5. El polipéptido de flagelina también contiene un dominio D0, que puede afectar a la señalización de TLR5. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina con un dominio D2 tiene por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad con los residuos 165-272 en la SEQ ID NO:1.

El polipéptido de flagelina puede existir como monómero o en forma polimerizada como filamento de flagelo. Este filamento es parte del flagelo bacteriano. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina está dispuesto en un filamento de flagelo. La invención también se refiere a polipéptidos de flagelina para su uso en terapia no dispuestos en filamento de flagelo. En realizaciones preferidas, el polipéptido de flagelina está en su forma monomérica. La forma monomérica del polipéptido de flagelina es ventajosa ya que puede interactuar más fuertemente con TLR5. En realizaciones, la flagelina no está glicosilada, para ayudar a su desprendimiento y desagregación en la forma monomérica.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina es parte de un flagelo bacteriano. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina es parte de un flagelo bacteriano que contiene una o más proteínas seleccionadas de FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ y FliS. En realizaciones preferidas, el ensamblaje flagelar bacteriano contiene FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ y FliS. En ciertas realizaciones, el ensamblaje flagelar bacteriano contiene las proteínas FliL y FlaG. FliL es una proteína asociada al cuerpo basal flagelar, que controla la dirección rotacional de los flagelos durante la quimiotaxis y FlaG regula el ensamblaje de flagelina junto con FlaF. Las proteínas FliL y FlaG están presentes en MRx0518. Los ejemplos muestran que el polipéptido de flagelina de MRx0518 puede activar una respuesta de TLR5 más fuerte en comparación con el polipéptido de flagelina de otra especie de Enterococcus gallinarum.

Los polipéptidos de flagelina pueden expresarse recombinantemente o pueden aislarse de células de Enterococcus. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina no está unido a una célula de Enterococcus. En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina está en una composición que está sustancialmente libre de células bacterianas.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina se han tratado con calor y, opcionalmente, desnaturalizado. Los ejemplos demuestran que tales polipéptidos de flagelina siguen siendo potentemente eficaces. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina son termoestables a 80° C, por ejemplo, pueden mantener la actividad después del calentamiento a 80° C durante, por ejemplo, 40 min. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina son digeridos por la tripsina. En otras palabras, en ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina contienen sitios de escisión de tripsina. Se predice que la flagelina de MRX518 contiene 36 sitios de escisión de tripsina.

Un polipéptido de flagelina para su uso de acuerdo con la invención no tiene que funcionar como un polipéptido de flagelina normal para ser considerado un polipéptido de flagelina. Un polipéptido de flagelina para su uso de acuerdo con la invención puede contener mutaciones o deleciones que anulan ciertas actividades. Generalmente, un polipéptido de flagelina para su uso en la invención es un agonista de TLR5. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina no pueden polimerizarse en un filamento de flagelo. En otras realizaciones, los polipéptidos de flagelina no pueden formar parte del ensamblaje flagelar bacteriano.

En realizaciones preferidas, los polipéptidos tienen identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, como se ha expuesto anteriormente, o comprenden o consisten de la SEQ ID NO: 1.

La invención también proporciona composiciones que comprenden un polipéptido de flagelina del género Enterococcus para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la composición comprende un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en terapia. En realizaciones preferidas, la composición comprende un polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518 para su uso en terapia.

En aspectos alternativos de cada realización de la invención, el polipéptido de flagelina es de la especie Enterococcus caselliflavus. Enterococcus caselliflavus es muy similar a Enterococcus gallinarum y también está flagelado.

Fragmentos

Se espera que los polipéptidos de flagelina con identidad de secuencia con los probados en los ejemplos también sean útiles en la terapia y están abarcados por la invención, como se expone en la sección anterior.

La invención también proporciona fragmentos de un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en terapia, en donde el fragmento comprende los aminoácidos 87-96, 165-272 y 290-295 de la SEQ ID NO:1.

Preferiblemente, cualquier fragmento tiene una longitud de por lo menos 200, 250, 300 o 350 aminoácidos. Los fragmentos preferidos comprenden uno o más de los siguientes tramos de aminoácidos de la SEQ ID NO:1: 2-32, 87-96, 165-272, 234-358, 290-295.

Un fragmento para su uso de acuerdo con la invención habitualmente (i) tendrá por lo menos un w % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y/o (ii) comprenderá un fragmento de por lo menos x aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. El valor de w es por lo menos 85 (por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o más). El valor de x es por lo menos 7 (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300) y el fragmento incluirá habitualmente un epítopo de la SEQ ID NO: 1. El fragmento habitualmente podrá unirse a TLR5.

Otros fragmentos para su uso de acuerdo con la invención habitualmente (i) tendrán por lo menos un w % en peso de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y/o (ii) comprenderán un fragmento de por lo menos x aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2. El valor de w es por lo menos 85 (por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o más). El valor de x es por lo menos 7 (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300) y el fragmento habitualmente incluirá un epítopo de la SEQ ID NO: 2. El fragmento habitualmente podrá unirse a TLR5.

Otros fragmentos para su uso de acuerdo con la invención habitualmente (i) tendrán por lo menos un w % de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 3-42 y/o (ii) comprenderán un fragmento de por lo menos x aminoácidos contiguos de una de las SEQ ID NO: 3-42. El valor de w es por lo menos 85 (por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o más). El valor de x es por lo menos 7 (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300) y el fragmento habitualmente incluirá un epítopo de una de las SEQ ID NO: 3-42. El fragmento habitualmente podrá unirse a TLR5.

Fusiones

También se espera que las fusiones que comprenden los polipéptidos de flagelina como se describe en la presente sean útiles en terapia. Por lo tanto, la invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de flagelina como se ha descrito anteriormente para su uso en terapia y, en particular, para su uso en el tratamiento del cáncer. Los compañeros de fusión preferidos incluyen fracciones de direccionamiento y fracciones destinadas a prolongar la vida media. En ciertas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende un polipéptido de flagelina como se ha descrito anteriormente y un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de una región Fc, transferrina, albúmina, PEG recombinante, un polímero de homoaminoácido, un polímero de prolina-alanina-serina, un péptido de tipo elastina, o péptido carboxi-terminal [CTP; de la cadena b de gonadotropina coriónica (CG)].

Los polipéptidos de flagelina para su uso en la invención también pueden fusionarse o conjugarse con fracciones no polipeptídicas para mejorar sus características y utilidad terapéutica. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina como se ha descrito anteriormente están enlazados covalentemente a PEG o ácido hialurónico.

Los polipéptidos de flagelina para su uso en la invención pueden fusionarse o conjugarse con un antígeno, por ejemplo, para su uso como vacuna. La presentación de un antígeno en estrecha proximidad de la flagelina puede maximizar sus actividades inmunoestimuladoras y mejorar aún más la respuesta inmunitaria protectora generada contra el antígeno. Además, la fabricación y administración de agentes terapéuticos que comprenden un antígeno y una flagelina como se describe en la presente puede ser más eficiente y eficaz cuando se fusionan o conjugan. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende un polipéptido de flagelina como se ha descrito anteriormente y un antígeno. En realizaciones adicionales, la invención proporciona un polipéptido de flagelina como se ha descrito anteriormente conjugado con un antígeno.

Los antígenos preferidos para incluir en las fusiones y conjugados para su uso en la invención son antígenos patogénicos y antígenos tumorales. Un antígeno provocará una respuesta inmunitaria específica para el antígeno que será eficaz para proteger contra la infección por el patógeno o atacar el tumor. Los antígenos pueden ser, por ejemplo, péptidos o polisacáridos. Ejemplos de antígenos para su uso con las fusiones y conjugados para su uso en la invención incluyen: antígenos virales como proteínas de superficie viral; antígenos bacterianos como antígenos proteicos y/o sacáridos; antígenos fúngicos; antígenos parasitarios; y antígenos tumorales. Antígenos adicionales para su uso con las fusiones y conjugados para su uso en la invención incluyen antígenos de glicoproteínas y lipoglicanos, antígenos de arqueas, antígeno E de melanoma (MAGE), antígeno carcinoembrionario (CEA), MUC-1, HER2, sialil-Tn (STn), transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT), gen del tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno específico de la próstata (PSA), antígenos del virus de Epstein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, amiloide-beta, Tau, PCSK9 y sustancias formadoras de hábito, para ejemplo, nicotina, alcohol u opiáceos.

Los polipéptidos de fusión para su uso en la invención pueden incluir una secuencia conectora entre la flagelina y el antígeno. Las secuencias conectoras preferidas incluyen péptidos que comprenden motivo(s) (Gly4)n, motivo(s) (Gly4Ser)n y motivo(s) Ser(Gly4Ser)n. Las secuencias conectoras pueden tener 1-50, 1-30, 1-20, 5-20, 5­ 10 o 10-20 aminoácidos de longitud. Las secuencias conectoras permitirán que la flagelina y la pareja de fusión, por ejemplo el antígeno, realicen sus funciones y, por ejemplo, el sistema inmunitario pueda acceder a ellas. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de flagelina como se ha descrito anteriormente, una secuencia conectora y un antígeno, como un antígeno derivado de un patógeno o un antígeno tumoral para su uso en terapia.

Los polipéptidos de flagelina para su uso en la invención pueden ser particularmente útiles cuando se conjugan con fracciones no polipeptídicas como antígenos de polisacáridos. Los métodos de conjugación adecuados incluyen el uso de carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, Nhidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, CDAP o TSTU.

Polinucleótidos

La invención también proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina del género Enterococcus para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en terapia. En realizaciones preferidas, la secuencia de polinucleótidos codifica un polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518 para su uso en terapia. Los ejemplos demuestran que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden activar una fuerte respuesta de TLR5, por lo que los polinucleótidos que codifican tales polipéptidos de flagelina pueden ser útiles en terapia y, en particular, útiles en el tratamiento del cáncer.

La invención también proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina del género Enterococcus para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518 para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer. Los ejemplos demuestran que el polipéptido de flagelina del género Enterococcus son capaces de inducir fuertes respuestas de TLR5, lo que es útil en el tratamiento y prevención del cáncer. En particular, los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum y especialmente la cepa MRx0518 producen una respuesta de TLR5 muy alta.

En realizaciones preferidas, el polinucleótido de la invención para su uso en terapia codifica la SEQ ID NO: 1, o una secuencia polipeptídica con un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1. En realizaciones preferidas adicionales, el polinucleótido puede codificar una flagelina con las secuencias D0, D1 y/o D2 particulares expuestas anteriormente, que en los ejemplos se muestra que son útiles.

En otras realizaciones, el polinucleótido de la invención para su uso en terapia codifica la SEQ ID NO:2, o una secuencia polipeptídica con un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. En realizaciones preferidas adicionales, el polinucleótido puede codificar una flagelina con las secuencias D0, D1 y/o D2 particulares expuestas anteriormente, que en los ejemplos se muestra que son útiles.

En otras realizaciones, el polinucleótido de la invención para su uso en terapia codifica una de las SEQ ID NO: 3-42, o una secuencia polipeptídica con un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 3-42. En realizaciones preferidas adicionales, el polinucleótido puede codificar una flagelina con las secuencias D0, D1 y/o D2 particulares expuestas anteriormente, que en los ejemplos se muestra que son útiles.

Los ácidos nucleicos para su uso en la invención pueden adoptar varias formas (por ejemplo, de cadena sencilla, de cadena doble, vectores, etc.). Los ácidos nucleicos para su uso en la invención pueden ser circulares o ramificados, pero generalmente serán lineales.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" incluye polímeros de nucleótidos tanto de cadena sencilla como de cadena doble. Los nucleótidos que comprenden el ácido nucleico pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Tales modificaciones incluyen modificaciones de bases como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa como 2',3'-didesoxirribosa y modificaciones de enlaces internucleotídicos como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato.

Los ácidos nucleicos pueden prepararse de muchas maneras, por ejemplo, mediante síntesis química (por ejemplo, síntesis de ADN con fosforamidita) total o parcialmente, digiriendo ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), uniendo ácidos nucleicos o nucleótidos más cortos (por ejemplo, usando ligasas o polimerasas), de bibliotecas genómicas o de ADNc, etc.

Los ácidos nucleicos para su uso en la invención comprenden una secuencia que codifica por lo menos un polipéptido de flagelina polipeptídica como se describe en la presente. Típicamente, los ácidos nucleicos estarán en forma recombinante, es decir, una forma que no se produce en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una o más secuencias de ácidos nucleicos heterólogas (por ejemplo, una secuencia que codifica otro antígeno y/o una secuencia de control como un promotor o un sitio de entrada interno al ribosoma) además de la secuencia que codifica por lo menos el polipéptido de flagelina. En tales realizaciones, el ácido nucleico codifica un polipéptido de flagelina como se ha analizado anteriormente y un antígeno, como un antígeno patogénico o un antígeno tumoral. Opcionalmente, el ácido nucleico también codifica una secuencia conectora.

Células huésped

La invención también proporciona células huésped que expresan un polipéptido de flagelina como se describe en la presente para su uso en terapia. Los ejemplos demuestran que las cepas de Enterococcus como MRx0518, que expresan flagelina de Enterococcus, pueden activar TLR5 y, por lo tanto, pueden tener potentes efectos terapéuticos. Las células huésped que expresan polipéptidos de flagelina pueden ser útiles para producir polipéptido de flagelina para su inclusión en una composición terapéutica, o tales células huésped pueden ser útiles para administrarlas a un paciente, en donde expresan el polipéptido de flagelina para ejercer un efecto terapéutico directo.

En realizaciones preferidas, la célula huésped para su uso en la invención expresa el polipéptido de flagelina como se describe en la presente recombinantemente. En otras palabras, la célula huésped comprende una secuencia de polinucleótidos heteróloga que codifica el polipéptido de flagelina como se describe en la presente. En ciertas realizaciones, la célula huésped no es del género Enterococcus, no es de la especie Enterococcus gallinarum o no es de la cepa MRx0518. En realizaciones preferidas, la célula huésped para expresar polipéptidos de flagelina de Enterococcus recombinantes es E. coli.

En realizaciones alternativas, en donde, por ejemplo, la célula huésped se administra a un paciente, la célula huésped es una cepa probiótica, como una cepa de Lactobacillus o Bifidobacterium.

En ciertas realizaciones, la célula huésped comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina del género Enterococcus. En ciertas realizaciones, la célula huésped comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum. En realizaciones preferidas, la célula huésped comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518. En ciertas realizaciones, la célula huésped comprende un vector, en donde el vector comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina del género Enterococcus.

En ciertas realizaciones, la célula huésped comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más, preferiblemente todos, los genes de ensamblaje flagelar bacteriano FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ y FliS. En ciertas realizaciones, la célula huésped expresa uno o más, preferiblemente todos, los polipéptidos FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ y FliS. En realizaciones preferidas, la célula huésped comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un ensamblaje flagelar bacteriano que comprende FliL y FlaG. En realizaciones preferidas, la célula huésped expresa los polipéptidos FliL y FlaG.

Preferiblemente, cualquier célula que exprese un polipéptido de flagelina como se describe en la presente, y en particular cualquier célula para su administración a un paciente, es eficaz para desprender el polipéptido de flagelina. Los ejemplos demuestran que tales células inducen una respuesta de TLR5 más fuerte. La flagelina puede desprenderse "activamente" durante el ensamblaje del flagelo, a través de la fuga de sus unidades monoméricas. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la flagelina monomérica surge de la degradación pasiva de flagelos desprendidos. El desprendimiento flagelar puede producirse después de una tensión mecánica o como un proceso voluntario. En algunas especies bacterianas, la flagelina está glicosilada para mejorar la estabilidad de los filamentos y evitar el desprendimiento descontrolado, por ejemplo, en Shewanella oneidensis.[40]. En realizaciones preferidas, la flagelina expresada por la célula huésped no está glicosilada, para ayudar a su desprendimiento y desagregación en la forma monomérica.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de flagelina y/o el ensamblaje flagelar bacteriano como se describe en la presente se desprenda fácilmente de una célula huésped.

La facilidad de desprendimiento de polipéptidos de flagelina y/o ensamblajes flagelares puede determinarse cultivando por separado i) células que expresan la flagelina como se describe en la presente y ii) una o más células (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10 o más de 10) que expresan flagelinas de referencia derivadas de las mismas cepas o unas diferentes pertenecientes a la misma especie bacteriana que la flagelina como se describe en la presente a) en una fase estacionaria durante 18 horas usando un inóculo al 1% de las células respectivas, luego b) una fase registro tardío en la que se cultiva durante 3 horas un inóculo al 10% de células de la fase estacionaria. Cultivos de 10 ml de las células que expresan la flagelina como se describe en la presente y de las células que expresan flagelinas de referencia pueden centrifugarse a 5000xg durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar el sedimento bacteriano. Los sobrenadantes resultantes pueden filtrarse (0,22um) en condiciones estériles. En las realizaciones en las que el polipéptido de flagelina y/o el ensamblaje flagelar bacteriano como se describe en la presente es un buen desprendedor, la concentración de la proteína flagelina en el sobrenadante derivado de las células que expresan la flagelina como se describe en la presente será mayor (por ejemplo, 1,5X o mayor, 2X o mayor, 3X o mayor, 4X o mayor, 5X o mayor, 7X o mayor o 10X o mayor) que la concentración de proteína flagelina en el sobrenadante o sobrenadantes derivados de las células que expresan flagelinas de referencia.

En realizaciones preferidas, la célula huésped para su uso en la invención libera polipéptidos de flagelina y/o ensamblajes flagelares en su entorno, lo que requiere una alteración química o física. En realizaciones preferidas, el cultivo de una célula huésped para su uso en la invención en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de flagelina da como resultado que el polipéptido de flagelina se libere de la célula a su entorno. Los ejemplos demuestran que las células que expresan polipéptidos de flagelina como se describe en la presente inducen una respuesta de TLR5 más fuerte. En otras realizaciones, las células huésped para su uso en la invención son buenas liberadoras del ensamblaje flagelar bacteriano. En ciertas realizaciones, las células huésped son buenas liberadoras de filamentos de flagelos bacterianos y, en particular, buenas liberadoras de polipéptidos de flagelina. En ciertas realizaciones, el ensamblaje flagelar bacteriano como se describe en la presente desprende activamente flagelina monomérica. En ciertas realizaciones, el filamento de flagelo, como se describe en la presente, desprende activamente flagelina monomérica. La flagelina monomérica es más eficaz para inducir respuestas de TLR5.

En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un método para obtener un polipéptido de flagelina o ensamblaje flagelar como se describe en la presente que comprende cultivar una célula que expresa un polipéptido de flagelina o ensamblaje flagelar como se describe en la presente y cultivar dicho polipéptido de flagelina o ensamblaje flagelar, sin realizar ningún paso para eliminar el polipéptido de flagelina o ensamblaje flagelar separado de la superficie celular.

El proceso de desprendimiento de flagelos (o flagelina) actualmente no está asociado con la expresión de un subconjunto específico de genes y es probable que esté fuertemente influenciado por condiciones ambientales. Sin embargo, se ha demostrado que una serie de genes están implicados en la rigidez y estabilidad de los flagelos. Por ejemplo, en Salmonella, se ha demostrado que los mutantes fliF y fliL desprende flagelos más fácilmente cuando se cultivan en medios viscosos [41,42]. En ambos casos, los flagelos se rompieron cerca de la varilla distal [43]. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, la célula huésped no expresa fliF y/o fliL. En otras realizaciones, la célula huésped expresa fliL.

En ciertas realizaciones, las células huésped para su uso en la invención han sido tratadas con calor. Los ejemplos demuestran que las células que expresan polipéptidos de flagelina como se describe en la presente siguen siendo potentemente eficaces después del tratamiento térmico. En ciertas realizaciones, las células huésped para su uso en la invención son termoestables a 80° C, por ejemplo, pueden mantener la actividad después del calentamiento a 80° C durante, por ejemplo, 40 minutos.

La divulgación proporciona además métodos para producir los polipéptidos de flagelina como se describe en la presente cultivando las células huésped en condiciones que permitan la producción de los polipéptidos de flagelina y la recuperación de los polipéptidos de flagelina producidos de este modo.

En ciertas realizaciones, las células huésped para su uso en la invención expresan adicionalmente uno o más antígenos. Generalmente, el antígeno se expresará recombinantemente y será heterólogo con respecto a la célula huésped. El antígeno puede ser parte de un polipéptido de fusión expresado con el polipéptido de flagelina como se describe en la presente, o la célula huésped puede expresar por separado la flagelina y el antígeno desde diferentes marcos de lectura abiertos. Por lo tanto, la invención proporciona una célula huésped que expresa un polipéptido de flagelina como se describe en la presente y un antígeno heterólogo para su uso en terapia. Los antígenos ejemplares para su uso con la invención incluyen: antígenos virales, como proteínas de superficie virales; antígenos bacterianos, como antígenos proteicos y/o sacáridos; antígenos fúngicos; antígenos parasitarios; y antígenos tumorales. Antígenos adicionales para su expresión en un una células huésped con una flaglina para su uso en la invención incluyen antígenos de glicoproteínas y lipoglicanos, antígenos de arqueas, antígeno E de melanoma (MAGE), antígeno carcinoembrionario (CEA), MUC-1, HER2, sialil-Tn (STn), transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT), gen del tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno específico de la próstata (PSA), antígenos del virus de Epstein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, amiloide-beta, Tau, PCSK9 y sustancias formadoras de hábito, para ejemplo, nicotina, alcohol u opiáceos.

Vectores, plásmidos y otros ácidos nucleicos

El ácido nucleico para su uso en la invención puede ser parte de un vector, es decir, parte de un constructo de ácidos nucleicos diseñado para la transducción/transfección de uno o más tipos de células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, "vectores de expresión" que están diseñados para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula huésped, o "vectores virales" que están diseñados para dar como resultado la producción de un virus recombinante o una partícula similar a un virus.

Alternativa o adicionalmente, la secuencia o estructura química del ácido nucleico puede modificarse en comparación con una secuencia de origen natural que codifica un polipéptido de flagelina. La secuencia de la molécula de ácido nucleico puede modificarse, por ejemplo, para aumentar la eficacia de la expresión o replicación del ácido nucleico, o para proporcionar estabilidad adicional o resistencia a la degradación. Por ejemplo, la secuencia de la molécula de ácido nucleico puede optimizarse con codones para la expresión en un huésped deseado, como una célula de mamífero (por ejemplo, humana). Tal modificación con respecto al uso de codones puede aumentar la eficacia de la traducción y la vida media del ácido nucleico. Puede unirse una cola poli A (por ejemplo, de aproximadamente 30 residuos de adenosina o más) al extremo 3' del ARN para aumentar su vida media. El extremo 5’ del ARN puede protegerse con un ribonucleótido modificado con la estructura m7G (5') ppp (5') N (estructura caperuza 0) o un derivado del mismo, que puede incorporarse durante la síntesis del ARN o puede modificarse enzimáticamente después de la transcripción del ARN (por ejemplo, mediante el uso de la Enzima de Protección del Virus Vaccinia (VCE) que consiste de ARNm trifosfatasa, guanilil-transferasa y guanina-7-metiltransferasa, que cataliza la construcción de estructuras de caperuza 0 N7-monometiladas). La estructura de aperuza 0 desempeña un papel importante en el mantenimiento de la estabilidad y la eficacia de traducción de la molécula de ARN. La caperuza 5' de la molécula de ARN puede modificarse adicionalmente mediante una 2'-O-metiltransferasa que da como resultado la generación de una estructura de caperuza 1 (m7Gppp [m2'-O] N), que puede aumentar aún más la eficacia de la traducción.

Los ácidos nucleicos pueden comprender uno o más análogos de nucleótidos o nucleótidos modificados. Como se usa en la presente, "análogo de nucleótido" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que contiene una o más modificaciones químicas (por ejemplo, sustituciones) en o sobre la base nitrogenada del nucleósido (por ejemplo, citosina (C), timina (T) o uracilo (U)), adenina (A) o guanina (G)). Un análogo de nucleótido puede contener modificaciones químicas adicionales en o sobre la fracción de azúcar del nucleósido (por ejemplo, ribosa, desoxirribosa, ribosa modificada, desoxirribosa modificada, análogo de azúcar de seis miembros o análogo de azúcar de cadena abierta), o el fosfato. La preparación de nucleótidos y nucleótidos y nucleósidos modificados es bien conocida en la técnica, por ejemplos de las Patentes de Estados Unidos Números 4373071, 4458066, 4500707, 4668777, 4973679, 5047524, 5132418, 5153319, 5262530, 5700642, y están disponibles comercialmente muchos nucleósidos modificados y nucleótidos modificados.

La invención proporciona además vectores de expresión recombinantes capaces de expresar un polipéptido de flagelina. Por ejemplo, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente.

La invención proporciona además células huésped en las que se han introducido cualquiera de los vectores mencionados anteriormente. La divulgación proporciona además métodos para producir los polipéptidos de flagelina como se describe en la presente mediante el cultivo de las células huésped en condiciones que permitan la producción de los polipéptidos de flagelina y la recuperación de los polipéptidos de flagelina producidos de este modo.

Una composición como se divulga en la presente que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de flagelina puede ser un agente terapéutico a base de ácidos nucleicos.

El ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ARN (es decir, un agente terapéutico basado en ARN) o ADN (es decir, un agente terapéutico basado en ^a Dⁿ , como un agente terapéutico basado en ADN plasmídico). En ciertas realizaciones, el agente terapéutico a base de ácidos nucleicos es un agente terapéutico basado en ARN. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico basado en ARN comprende una molécula de ARN autorreplicante. La molécula de ARN autorreplicante puede ser un replicón de ARN derivado de un alfavirus.

Las moléculas de ARN autorreplicantes son bien conocidas en la técnica y pueden producirse usando elementos de replicación derivados de, por ejemplo, alfavirus, y sustituyendo las proteínas virales estructurales con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de interés. Una molécula de ARN autorreplicante es típicamente una molécula de cadena que puede traducirse directamente después de la administración a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que luego produce transcripciones tanto antisentido como sentido a partir del ARN administrado. Por tanto, el ARN administrado lleva a la producción de múltiples ARN hijos. Estos ARN hijos, así como las transcripciones subgenómicas colineales, pueden traducirse ellos mismos para proporcionar expresión in situ de un antígeno codificado (es decir, un polipéptido de flagelina), o puede transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido que el ARN administrado que se traducen para proporcionar expresión in situ del antígeno. El resultado general de esta secuencia de transcripciones es una gran amplificación en el número de ARN de replicones introducidos y, por lo tanto, el antígeno codificado se convierte en un producto polipeptídico principal de las células.

Un sistema adecuado para lograr la autorreplicación de esta manera es usar un replicón basado en alfavirus. Estos replicones son ARN de cadena que llevan a la traducción de una replicasa (o replicasatranscriptasa) después de la administración a una célula. La replicasa se traduce como una poliproteína que se autoescinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de cadena -genómicas del ARN administrado de cadena . Estos transcritos de cadena - pueden transcribirse ellos mismos para dar copias adicionales del ARN original de cadena y también para dar un transcrito subgenómico que codifica el antígeno. La traducción del transcrito subgenómico lleva por tanto a la expresión in situ del antígeno por parte de la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus Sindbis, un virus del bosque Semliki, un virus de la encefalitis equina del este, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc. Pueden usarse secuencias de virus mutantes o de tipo salvaje, por ejemplo, en replicones se ha usado el muíante TC83 atenuado de VEEV.

En ciertas realizaciones, la molécula de ARN autorreplicante descrita en la presente codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN autorreplicante y (ii) un polipéptido de flagelina. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende una o más de las proteínas nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4 de alfavirus.

El agente terapéutico a base de ácidos nucleicos puede comprender un sistema de administración viral o no viral. El sistema de administración (al que también se hace referencia en la presente como vehículo de administración) puede tener efectos adyuvantes que mejoran la inmunogenicidad del polipéptido de flagelina codificado. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede encapsularse en liposomas, micropartículas poliméricas biodegradables no tóxicas o partículas de replicón viral (VRP), o formar complejos con partículas de una emulsión catiónica de aceite en agua. En algunas realizaciones, el agente terapéutico a base de ácidos nucleicos comprende un sistema de administración de nanoemulsión catiónica (CNE) o un sistema de administración de nanopartículas lipídicas (LNP). Alternativamente, el agente terapéutico a base de ácidos nucleicos puede comprender partículas de replicones virales. En otras realizaciones, el agente terapéutico a base de ácidos nucleicos puede comprender un ácido nucleico desnudo, como ARN desnudo (por ejemplo, ARNm), pero se prefiere la administración a través de LNP.

En ciertas realizaciones, el agente terapéutico a base de ácidos nucleicos comprende un sistema de administración de nanoemulsión catiónica (CNE). Los sistemas de administración de CNE y los métodos para su preparación se describen en la técnica. En un sistema de administración de CNE, la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ARN) que codifica el antígeno forma un complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua. Las emulsiones catiónicas de aceite en agua pueden usarse para administrar moléculas cargadas negativamente, como una molécula de ARN, a las células. Las partículas de emulsión comprenden un núcleo de aceite y un lípido catiónico. El lípido catiónico puede interactuar con la molécula cargada negativamente anclando de este modo la molécula a las partículas de la emulsión. En la técnica pueden encontrase detalles adicionales de CNE útiles.

Por tanto, en un agente terapéutico a base de ácidos nucleicos para su uso en la invención, una molécula de ARN que codifica un polipéptido de flagelina puede formar un complejo con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua. Las partículas típicamente comprenden un núcleo de aceite (por ejemplo, un aceite vegetal o escualeno) que está en fase líquida a 25° C, un lípido catiónico (por ejemplo, fosfolípido) y, opcionalmente, un surfactante (por ejemplo, trioleato de sorbitán, polisorbato 80); también puede incluirse polietilenglicol. En algunas realizaciones, el CNE comprende escualeno y un lípido catiónico, como 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP). En algunas realizaciones preferidas, el sistema de administración es un sistema de administración no viral, como CNE, y el agente terapéutico a base de ácidos nucleicos comprende un ARN autorreplicante (ARNm). Esto puede ser particularmente eficaz para provocar respuestas inmunitarias humorales y celulares. Las ventajas también incluyen la ausencia de una respuesta inmunitaria anti-vector limitante y una falta de riesgo de integración genómica.

Los sistemas de administración de LNP y las micropartículas poliméricas biodegradables no tóxicas y los métodos para su preparación se describen en la técnica. Los LNP son partículas de liposomas que no son viriones en los que puede encapsularse una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ARN). Las partículas pueden incluir algo de ARN externo (por ejemplo, en la superficie de las partículas), pero por lo menos la mitad del ARN (e idealmente todo) está encapsulado. Las partículas liposomales pueden, por ejemplo, estar formadas por una mezcla de lípidos zwitteriónicos, catiónicos y aniónicos que pueden ser saturados o insaturados, por ejemplo; DSPC (zwitteriónico, saturado), DlinDMA (catiónico, insaturado) y/o DMG (aniónico, saturado). Los LNP preferidos para su uso con la invención incluyen un lípido anfifílico que puede formar liposomas, opcionalmente en combinación con por lo menos un lípido catiónico (como DOTAP, DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, etc.). Una mezcla de D^s P^c , DlinDMA, PEG-DMG y colesterol es particularmente eficaz. En la técnica se describen otros LNP útiles. En algunas realizaciones, los LNP son liposomas RV01.

NF-^k B

Las vías de señalización de TLR culminan en la activación del factor nuclear kappaB (NF-kB) del factor de transcripción. NF-kB controla la expresión de una serie de genes de citoquinas inflamatorias, incluyendo el TNF-a. La flagelina induce la dimerización de TLR5, que posteriormente recluta MyD88 y activa las proteínas quinasas, incluyendo IRAK1, IRAK2, IRAK4 e IRAK-M. La activación de estas quinasas lleva a la localización nuclear de NF-kB, que es una citoquina proinflamatoria [44].

Como se demuestra en los ejemplos (Figura 18), las composiciones para su uso en la invención llevan a un aumento en la expresión de NF-^kB. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención aumenta la expresión de la citoquina proinflamatoria NF-^kB, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para estimular la respuesta inmunitaria. Además, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, en particular enfermedades caracterizadas por activación inmunitaria reducida y/o enfermedades que pueden tratarse por una respuesta inmunitaria aumentada. En una realización, las composiciones de la invención se usan como inmunoestimulandores aumentando el nivel y/o la actividad de NF-^kB. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una activación inmunitaria reducida aumentando el nivel y/o la actividad de NF-^kB. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades que pueden tratarse medir una respuesta inmunitaria aumentada aumentando el nivel y/o actividad de NF-^kB.

En particular, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o activación de NF-^kB. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o activación de NF-^kB.

La activación de NF-kB es importante para provocar respuestas inmunitarias innatas y el posterior desarrollo de respuestas inmunitarias adaptativas. Por tanto, es probable que los agonistas de los TLR, como la flagelina, sean útiles como adyuvantes para tratar enfermedades infecciosas, alergias y tumores al promover respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas [44]. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas, alergias y/o tumores. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas, alergias y/o tumores aumentando el nivel y/o la actividad de NF-^kB.

Tratamiento del cáncer

Los receptores tipo Toll (TLR) son receptores unidos a la membrana que se expresan principalmente en las células inmunitarias innatas que desempeñan funciones clave tanto en el sistema inmunitario innato como en el adaptativo. Los TLR responden a patrones moleculares asociados a patógenos microbianos específicos (PAMP). Los TLR detectan los componentes de la pared celular bacteriana y se sabe que TLR5 reconoce la flagelina bacteriana. La flagelina es el único ligando conocido para TLR5, una proteína receptora expresada en la superficie de una variedad de células humanas, incluyendo las células epiteliales, las células endoteliales, los macrófagos, las células dendríticas (DC) y las células T [45-47]. La activación de TLR5 por flagelina bacteriana lleva a la activación de una variedad de genes proinflamatorios y de respuesta inmunitaria [15].

Se sabe que la activación de TLR5 por la flagelina de S. typhimurium suprime la proliferación celular y el crecimiento tumoral [48]. Se ha demostrado que una cepa de S. typhimurium diseñada para secretar flagelina B (FlaB) de Vibrio vulnificus suprime eficazmente el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos de ratones y prolonga la supervivencia, a través de una activación en dos pasos de las vías de señalización de TLR4 y TLR5 [49]. Se desconoce la eficacia de los polipéptidos de flagelina de otras especies para tratar el cáncer. El ensayo de la capacidad de un compuesto para activar una respuesta de TLR5 muestra que el compuesto puede ser eficaz para tratar el cáncer.

Las composiciones que comprenden cepas de Enterococcus gallinarum, y en particular la cepa MRx0518, son eficaces para tratar y prevenir el cáncer [50]. Los inventores han demostrado sorprendentemente que los polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum son capaces de estimular una fuerte respuesta de TLR5, lo que puede contribuir a la actividad anticancerígena de las cepas de Enterococcus. Los polipéptidos de flagelina de Enterococcus gallinarum tienen una gran disimilitud de secuencia con los polipéptidos de flagelina de S. typhimurium. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarumson capaces de producir una respuesta de TLR5 más fuerte que los polipéptidos de flagelina de S. typhimurium. Por tanto, los inventores han demostrado que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus, y en particular de la especie Enterococcus gallinarum, son útiles en terapia y particularmente eficaces en el tratamiento y prevención del cáncer.

Se ha demostrado que TLR5 se expresa en varios cánceres diferentes, incluyendo el cáncer de mama, colorrectal y gástrico. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden producir una fuerte respuesta de TLR5. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la invención proporciona polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de mama, cáncer colorrectal o cáncer gástrico. En ciertas realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de mama, colorrectal o gástrico. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el cáncer de mama, colorrectal o gástrico. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum, para su uso en el tratamiento del cáncer de mama. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum, para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en el tratamiento del cáncer gástrico.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres asociados con TLR5.

La invención proporciona polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer. La invención también proporciona polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer. Más preferiblemente, la invención proporciona polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518, en particular con la secuencia SEQ ID NO: 1, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer.

La invención también proporciona composiciones que comprenden los polipéptidos de flagelina descritos en la presente para su uso en terapia. La invención también proporciona composiciones que comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina como se describe en la presente para su uso en terapia. La invención también proporciona una célula huésped que expresa un polipéptido de flagelina como se describe en la presente para su uso en terapia. Además, la invención también proporciona composiciones que comprenden una célula huésped, en donde la célula huésped comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina como se describe en la presente para su uso en terapia.

En ciertas realizaciones, el tratamiento con las composiciones para su uso en la invención da como resultado una reducción del tamaño del tumor o una reducción del crecimiento del tumor. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor o reducción del crecimiento del tumor. Las composiciones para su uso en la invención pueden ser eficaces para reducir el tamaño o el crecimiento del tumor. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de pacientes con tumores sólidos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso para reducir o prevenir la angiogénesis en el tratamiento del cáncer. Las composiciones para su uso en la invención pueden tener un efecto sobre los sistemas inmunitario o inflamatorio, que tienen funciones centrales en la angiogénesis. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención de la metástasis.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de mama. La referencia [50] demuestra que las cepas de Enterococcus tienen un potente efecto contra el cáncer de mama, por lo que siguiendo los datos de la presente solicitud, los polipéptidos de flagelina descritos en la presente pueden ser particularmente eficaces contra el cáncer de mama. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de mama. En realizaciones preferidas, el cáncer es carcinoma mamario. En realizaciones preferidas, el cáncer es cáncer de mama en estadio IV.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de pulmón. La referencia [50] demuestra que las cepas de Enterococcus tienen un potente efecto contra el cáncer de pulmón, por lo que siguiendo los datos de la presente solicitud, los polipéptidos de flagelina descritos en la presente pueden ser particularmente eficaces contra el cáncer de pulmón. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de pulmón. En realizaciones preferidas, el cáncer es carcinoma de pulmón.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de hígado. La referencia [50] demuestra que las cepas de Enterococcus tienen un potente efecto contra el cáncer de hígado, por lo que siguiendo los datos de la presente solicitud, los polipéptidos de flagelina descritos en la presente pueden ser particularmente eficaces contra el cáncer de hígado. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de hígado. En realizaciones preferidas, el cáncer es un hepatoma (carcinoma hepatocelular).

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer colorrectal. La referencia [50] demuestra que las cepas de Enterococcus tienen un potente efecto contra el cáncer colorrectal, por lo que siguiendo los datos de la presente solicitud, los polipéptidos de flagelina descritos en la presente pueden ser particularmente eficaces contra el cáncer colorrectal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer colorrectal. En realizaciones preferidas, el cáncer es adenocarcinoma colorrectal.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de colon. La referencia [50] demuestra que las cepas de Enterococcus tienen un potente efecto contra el cáncer de colon, por lo que siguiendo los datos de la presente solicitud, los polipéptidos de flagelina descritos en la presente pueden ser particularmente eficaces contra el cáncer de colon. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de colon. En realizaciones preferidas, el cáncer es adenocarcinoma de colon.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de recto. La referencia [50] demuestra que las cepas de Enterococcus tienen un potente efecto contra el cáncer de recto, por lo que siguiendo los datos de la presente solicitud, los polipéptidos de flagelina descritos en la presente pueden ser particularmente eficaces contra el cáncer de recto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de recto. En realizaciones preferidas, el cáncer es adenocarcinoma rectal. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum, para su uso en el tratamiento del cáncer de recto.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer gástrico. Se ha demostrado que los carcinomas gástricos expresan altos niveles de TLR5 y que el tratamiento con flagelina provoca una potente actividad antitumoral [51]. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina descritos en la presente pueden producir una fuerte respuesta de TLR5, por lo tanto, los polipéptidos de flagelina como se describen en la presente pueden ser particularmente eficaces contra el cáncer gástrico. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer gástrico. En realizaciones preferidas, el cáncer es adenocarcinoma gástrico. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum, para su uso en el tratamiento del cáncer gástrico.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma. Se ha demostrado que la flagelina de S. typhimurium, en combinación con el péptido P10 restringido del complejo principal de histocompatibilidad de clase II, reduce el número de metástasis pulmonares en un modelo de melanoma murino [52]. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina como se describe en la presente pueden producir una respuesta de TLR5 más fuerte que S. typhimurium, por lo tanto, los polipéptidos de flagelina como se describen en la presente pueden ser particularmente eficaces contra el melanoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del melanoma. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum, para su uso en el tratamiento del melanoma.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del neuroblastoma. Se sabe que la activación de TLR5 por la flagelina de S. typhimurium suprime la proliferación celular y el crecimiento tumoral [53]. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina como se describe en la presente pueden producir una respuesta de TLR5 más fuerte que S. typhimurium, por lo tanto los polipéptidos de flagelina pueden ser particularmente eficaces contra el neuroblastoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del neuroblastoma. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en el tratamiento de neuroblastoma.

En algunas realizaciones, el cáncer es del intestino. En algunas realizaciones, el cáncer es de una parte del cuerpo que no es el intestino. En algunas realizaciones, el cáncer no es cáncer del intestino. En algunas realizaciones, el cáncer no es cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, el cáncer no es cáncer del intestino delgado. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención se producen en un sitio distinto del intestino. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención se producen en el intestino y también en un sitio distinto del intestino.

Se ha detectado la expresión de TLR5 en líneas celulares de cáncer hematológico, incluyendo el mieloma múltiple [54] y la leucemia mieloide aguda [55]. Los inventores han demostrado en los ejemplos que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son particularmente eficaces para activar una fuerte respuesta de TLR5. Por lo tanto, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden ser útiles por lo tanto para tratar o prevenir cánceres hematológicos, como el mieloma múltiple y la leucemia mieloide aguda, que expresan TLR5. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades malignas hematológicas, como mieloma múltiple, leucemias agudas y crónicas como leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia monocítica aguda, linfomas, como linfomas de Hodgkin y linfomas no Hodgkin, y síndromes mielodisplásicos. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum, para su uso en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento o la prevención del mieloma múltiple. En ciertas realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento o la prevención de la leucemia mieloide aguda. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum, para su uso en el tratamiento del mieloma múltiple.

Se han probado varios agonistas de TLR en una amplia variedad de modelos tumorales y ensayos clínicos [56]. Por ejemplo, se ha demostrado que el agonista de TLR5 CBLB502 promueve la depuración tumoral en modelos de ratones con linfomas de células T y B [57]. La administración sistémica del agonista de TLR5 entolimod (un derivado de flagelina farmacológicamente optimizado) suprimió la metástasis hepática de células colorrectales en modelos de ratones. El hígado muestra la respuesta de activación de TLR5 más fuerte después de la administración del agonista de TLR5 entolimod [58]. Los inventores han demostrado en los ejemplos que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus actúan como fuertes agonistas de TLR5. Por lo tanto, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden ser particularmente eficaces en el tratamiento o la prevención de linfomas de células T y B, cáncer colorrectal y de hígado. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de linfomas de células T y B. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum, para su uso en el tratamiento de linfomas de células T y B.

En otras realizaciones, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir la metástasis. En otras realizaciones, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer metastásico. En otras realizaciones, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer avanzado. En ciertas realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento, reducción o prevención de metástasis. En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención pueden disminuir o prevenir el crecimiento metastásico. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en el tratamiento o prevención de metástasis. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer metastásico. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer avanzado.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del carcinoma.

Se ha demostrado que la flagelina B (FlaB) de Vibrio vulnificus suprime eficazmente el crecimiento tumoral a través de una activación en dos pasos de las vías de señalización de TLR4 y TLR5. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina pueden activar las vías de señalización de TLR4 y TLR5. En otras realizaciones, los polipéptidos de flagelina solo activan la vía de señalización de TLR5.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina pueden activar las vías de señalización de NTkB. En ciertas realizaciones, las células huésped para su uso en la invención pueden activar las vías de señalización de TLR9. La referencia [59] muestra que la sinergia entre la flagelina y los oligodesoxinucleótidos que contienen CpG agonista de TLR9 lleva a la supresión tumoral. En ciertas realizaciones, las células huésped para su uso en la invención pueden activar las vías de señalización de TLR5 y TLR9. En ciertas de tales realizaciones, la composición para su uso en la invención comprende oligodesoxinucleótidos que contienen CpG o se administra en combinación con oligodesoxinucleótidos que contienen CpG.

Los efectos terapéuticos de las composiciones para su uso en la invención sobre el cáncer pueden estar mediados por un mecanismo proinflamatorio. La activación de TLR5 por flagelina inicia una cascada de señales proinflamatorias. La referencia [59] muestra que la interacción de flagelina de S. typhimurium con tumores altamente inmunogénicos induce una respuesta de Th 1 y supresión de Tregs, lo que da como resultado la inhibición del crecimiento tumoral. Por el contrario, la tasa de crecimiento de los tumores débilmente inmunogénicos no se vio afectada por la administración de flagelina. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina y las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de tumores inmunogénicos, en particular tumores altamente inmunogénicos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la inflamación en el tratamiento del cáncer. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la inflamación de Th1 en el tratamiento del cáncer. Las células Th1 producen IFNy y tienen potentes efectos anticancerígenos [60]. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un cáncer en etapa temprana, como un cáncer que no ha hecho metástasis, o un cáncer en estadio 0 o estadio 1. Promover la inflamación puede ser más eficaz contra los cánceres en etapa temprana [60].

La referencia [59] muestra que la administración de flagelina después de trasplante de tumor inhibió significativamente el crecimiento de tumores antigénicos. Los diferentes efectos de la flagelina sobre el crecimiento tumoral se correlacionan con la respuesta inmunitaria que se induce. La administración de flagelina después del trasplante se asoció con un aumento de la relación IFN-y:IL-4 y una disminución de la frecuencia de células T reguladoras CD4+CD25+. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina y las composiciones para su uso en la invención aumentan la relación IFN-y:IL-4. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina y las composiciones para su uso en la invención disminuyen la frecuencia de células T reguladoras CD4+CD25+. En otras realizaciones, los polipéptidos de flagelina y las composiciones para su uso en la invención no disminuyen la relación IFN-^y:IL-4 y aumentan la frecuencia de células T CD4+CD25+. La inflamación puede tener un efecto supresor del cáncer [60] y se están investigando las citoquinas proinflamatorias, como TNFa, como terapias contra el cáncer [61]. La regulación por incremento de genes como el TNF puede indicar que las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para tratar el cáncer a través de un mecanismo similar. La regulación por incremento de ligandos de CXCR3 (CXCL9, CXCL10) y genes inducibles por IFN^y (IL-32) puede indicar que las composiciones para su uso en la invención provocan una respuesta de tipo IFNy. El IFNy es un potente factor activador de macrófagos que puede estimular la actividad tumoricida [62], y CXCL9 y CXCL10, por ejemplo, también tienen efectos anticancerígenos [63-65].

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la inflamación para mejorar el efecto de un segundo agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, el tratamiento o prevención del cáncer comprende aumentar el nivel de expresión de una o más citoquinas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el tratamiento o prevención del cáncer comprende aumentar el nivel de expresión de uno o más de IL-1 p, IL-6 y TNF-a, por ejemplo, IL-1 p e IL-6, IL-1 p y TNF-a, IL-6 y TNF-a o los tres de ⁱL-1 p, IL-6 y TNF-a. Se sabe que los aumentos en los niveles de expresión de cualquiera de IL-1 p, IL-6 y TNF-a son indicativos de eficacia en el tratamiento del cáncer.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un paciente que ha recibido anteriormente quimioterapia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un paciente que no ha tolerado un tratamiento de quimioterapia. Las composiciones para su uso en la invención pueden ser particularmente adecuadas para tales pacientes.

En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención son para prevenir la recaída. Las composiciones para su uso en la invención pueden ser adecuadas para la administración a largo plazo. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención de la progresión del cáncer.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de carcinoma de pulmón de células no pequeñas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del carcinoma de pulmón de células pequeñas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del carcinoma de células escamosas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de adenocarcinoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de tumores glandulares, tumores carcinoides o carcinomas indiferenciados.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de hepatoblastoma, colangiocarcinoma, cistoadenocarcinoma colangiocelular o cáncer de hígado resultante de una infección viral.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de carcinoma ductal invasivo, carcinoma ductal in situ o carcinoma lobulillar invasivo.

En realizaciones adicionales, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de la leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, carcinoma de células basales, cáncer de conducto biliar, cáncer de vejiga, tumor óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales, glioma, vía visual infantil e hipotalámico, linfoma de Hodgkin, melanoma, carcinoma de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de células renales, cáncer de laringe, leucemias, linfomas, mesotelioma, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, cáncer de faringe, adenoma pituitario, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, sarcoma, cáncer testicular, cáncer de tiroides o cáncer de útero.

Las composiciones para su uso en la invención pueden ser particularmente eficaces cuando se usan en combinación con agentes terapéuticos adicionales. Los efectos inmunomoduladores de las composiciones para su uso en la invención pueden ser eficaces cuando se combinan con agentes anticancerígenos más directos. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de flagelina del género Enterococcus (o polinucleótido codificante o célula huésped de expresión) y un agente anticancerígeno. En realizaciones preferidas, el agente anticancerígeno es un inhibidor del punto de control inmunitario, una inmunoterapia con anticuerpos dirigidos, una terapia con células CAR-T, un virus oncolítico o un fármaco citostático. Preferiblemente, el agente anticancerígeno es Keytruda (pembrolizumab, Merck). En realizaciones preferidas adicionales, la composición comprende un agente anticancerígeno seleccionado del grupo que consiste de: Yervoy (ipilimumab, BMS); Opdivo (nivolumab, BMS); MEDI4736 (AZ/MedImmune); MPDL3280A (Roche/Genentech); Tremelimumab (AZ/MedImmune); CT-011 (pidilizumab, CureTech); BMS-986015 (lirilumab, BMS); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MSB-0010718C (Merck); PF-05082566 (Pfizer); MEDI6469 (AZ/MedImmune); BMS-986016 (BMS); BMS-663513 (urelumab, BMS); IMP321 (Prima Biomed); LAG525 (Novartis); ARGX-110 (arGEN-X); PF-05082466 (Pfizer); CDX-1127 (varlilumab; CellDex Therapeutics); TRX-518 (GITR Inc.); MK-4166 (Merck); JTX-2011 (Jounce Therapeutics); ARGX-115 (arGEN-X); NLG-9189 (indoximod, NewLink Genetics); INCB024360 (Incyte); IPH2201 (Innate Immotherapeutics/AZ); NLG-919 (NewLink Genetics); anti-VISTA (JnJ); Epacadostat (INCB24360, Incyte); F001287 (Flexus/BMS); CP 870893 (University of Pennsylvania); MGA271 (Macrogenix); Emactuzumab (Roche/Genentech); Galunisertib (Eli Lilly); Ulocuplumab (BMS); BKT140/BL8040 (Biokine Therapeutics); Bavituximab (Peregrine Pharmaceuticals); c C 90002 (Celgene); 852A (Pfizer); VTX-2337 (VentiRx Pharmaceuticals); IMO-2055 (Hybridon, Idera Pharmaceuticals); LY2157299 (Eli Lilly); Ew -7197 (Ewha Women's University, Korea); Vemurafenib (Plexxikon); Dabrafenib (Genentech/GSK); BMS-777607 (BMS); BLZ945 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre); Unituxin (dinutuximab, United Therapeutics Corporation); Blincyto (blinatumomab, Amgen); Cyramza (ramucirumab, Eli Lilly); Gazyva (obinutuzumab, Roche/Biogen); Kadcyla (ado-trastuzumab emtansina, Roche/Genentech); Perjeta (pertuzumab, Roche/Genentech); Adcetris (brentuximab vedotin, Takeda/Millennium); Arzerra (ofatumumab, GSK); Vectibix (panitumumab, Amgen); Avastin (bevacizumab, Roche/Genentech); Erbitux (cetuximab, BMS/Merck); Bexxar (tositumomab-I131, GSK); Zevalin (ibritumomab tiuxetan, Biogen); Campath (alemtuzumab, Bayer); Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin, Pfizer); Herceptin (trastuzumab, Roche/Genentech); Rituxan (rituximab, Genentech/Biogen); volociximab (Abbvie); Enavatuzumab (Abbvie); ABT-414 (Abbvie); Elotuzumab (Abbvie/BMS); ALX-0141 (Ablynx); Ozaralizumab (Ablynx); Actimab-C (Actinium); Actimab-P (Actinium); Milatuzumab-dox (Actinium); Emab-SN-38 (Actinium); Naptumonmab estafenatox (Active Biotech); AFM13 (Affimed); AFM11 (Affimed); AGS-16C3F (Agensys); AGS-16M8F (Agensys); AGS-22ME (Agensys); AGS-15ME (Agensys); GS-67E (Agensys); ALXN6000 (samalizumab, Alexion); ALT-836 (Altor Bioscience); AlT-801 (Altor Bioscience); ALT-803 (Altor Bioscience); AMG780 (Amgen); AMG 228 (Amgen); AMG820 (Amgen); AMG172 (Amgen); AMG595 (Amgen); AMG110 (Amgen); AMG232 (adecatumumab, Amgen); AMG211 (Amgen/MedImmune); BAY20-10112 (Amgen/Bayer); Rilotumumab (Amgen); Denosumab (Amgen); AMP-514 (Amgen); MEDI575 (AZ/MedImmune); MEDI3617 (AZ/MedImmune); MEDI6383 (AZ/MedImmune); MEDI551 (AZ/MedImmune); Moxetumomab pasudotox (AZ/MedImmune); MEDI565 (AZ/MedImmune); MEDI0639 (AZ/MedImmune); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MEDI562 (AZ/MedImmune); AV-380 (Av EO); AV203 (AVEO); AV299 (AVEO); BAY79-4620 (Bayer); Anetumab ravtansina (Bayer); vantictumab (Bayer); BAY94-9343 (Bayer); Sibrotuzumab (Boehringer Ingleheim); BI-836845 (Boehringer Ingleheim); B-701 (BioClin); BIIB015 (Biogen); Obinutuzumab (Biogen/Genentech); BI-505 (Bioinvent); BI-1206 (Bioinvent); TB-403 (Bioinvent); BT-062 (Biotest) BIL-010t (Biosceptre); MDX-1203 (BMS); MDX-1204 (BMS); Necitumumab (BMS); CAN-4 (Cantargia a B); CDX-011 (Celldex); CDX1401 (Celldex); CDX301 (Celldex); U3-1565 (Daiichi Sankyo); patritumab (Daiichi Sankyo); tigatuzumab (Daiichi Sankyo); nimotuzumab (Daiichi Sankyo); DS-8895 (Daiichi Sankyo); DS-8873 (Daiichi Sankyo); DS-5573 (Daiichi Sankyo); MORab-004 (Eisai); MORab-009 (Eisai); MORab-003 (Eisai); MORab-066 (Eisai); LY3012207 (Eli Lilly); LY2875358 (Eli Lilly); LY2812176 (Eli Lilly); LY3012217(Eli Lilly); LY2495655 (Eli Lilly); LY3012212 (Eli Lilly); LY3012211 (Eli Lilly); LY3009806 (Eli Lilly); cixutumumab (Eli Lilly); Flanvotumab (Eli Lilly); IMC-TR1 (Eli Lilly); Ramucirumab (Eli Lilly); Tabalumab (Eli Lilly); Zanolimumab (Emergent Biosolution); Fg -3019 (FibroGen); FPA008 (Five Prime Therapeutics); FP-1039 (Five Prime Therapeutics); FPA144 (Five Prime Therapeutics); catumaxomab (Fresenius Biotech); IMAB362 (Ganymed); IMAB027 (Ganymed); HuMax-CD74 (Genmab); HuMax-TFADC (Genmab); GS-5745 (Gilead); GS-6624 (Gilead); OMP-21M18 (demcizumab, GSK); mapatumumab (GSK); IMGN289 (ImmunoGen); IMGN901 (ImmunoGen); IMGN853 (ImmunoGen); IMGN529 (ImmunoGen); IMMU-130 (Immunomedics); milatuzumab-dox (Immunomedics); IMMU-115 (Immunomedics); IMMU-132 (Immunomedics); IMMU-106 (Immunomedics); IMMU-102 (Immunomedics); Epratuzumab (Immunomedics); Clivatuzumab (Immunomedics); IPH41 (Innate Immunotherapeutics); Daratumumab (Janssen/Genmab); CNTO-95 (Intetumumab, Janssen); CNTO-328 (siltuximab, Janssen); KB004 (KaloBios); mogamulizumab (Kyowa Hakko Kirrin); KW-2871 (ecromeximab, Life Science); Sonepcizumab (Lpath); Margetuximab (Macrogenics); Enoblituzumab (Macrogenics); MGD006 (Macrogenics); MGF007 (Macrogenics); ^m K-0646 (dalotuzumab, Merck); MK-3475 (Merck); Sym004 (Symphogen/Merck Serono); DI17E6 (Merck Serono); MOR208 (Morphosys); MOR202 (Morphosys); Xmab5574 (Morphosys); BPC-1C (ensituximab, Precision Biologics); TAS266 (Novartis); ^l F^a 102 (Novartis); BHQ880 (Novartis/Morphosys); QGE031 (Novartis); HCD122 (lucatumumab, Novartis); LJM716 (Novartis); AT355 (Novartis); OMP-21M18 (Demcizumab, OncoMed); OMP52M51 (Oncomed/GSK); OMP-59R5 (Oncomed/GSK); vantictumab (Oncomed/Bayer); CMC-544 (inotuzumab ozogamicin, Pfizer); PF-03446962 (Pfizer); PF-04856884 (Pfizer); PSMA-A^dC (Progenics); REGN1400 (Regeneron); REGN910 (nesvacumab, Regeneron/Sanofi); REGN421 (enoticumab, Regeneron/Sanofi); RG7221, RG7356, RG7155, RG7444, RG7116, RG7458, RG7598, RG7599, RG7600, RG7636, RG7450, RG7593, RG7596, DCDS3410A, RG7414 (parsatuzumab), RG7160 (imgatuzumab), RG7159 (obintuzumab), RG7686, RG3638 (onartuzumab), RG7597 (Roche/Genentech); SAR307746 (Sanofi); SAR566658 (Sanofi); SAR650984 (Sanofi); SAR153192 (Sanofi); SAR3419 (Sanofi); SAR256212 (Sanofi), SGN-LIV1A (lintuzumab, Seattle Genetics); SGN-CD33A (Seattle Genetics); Sg N-75 (vorsetuzumab mafodotin, Seattle Genetics); SGN-19A (Seattle Genetics) SGN-CD70A (Seattle Genetics); SEA-CD40 (Seattle Genetics); ibritumomab tiuxetan (Spectrum); MLN0264 (Takeda); ganitumab (Takeda/Amgen); CEP-37250 (Teva); TB-403 (Thrombogenic); VB4-845 (Viventia); Xmab2512 (Xencor); Xmab5574 (Xencor); nimotuzumab (YM Biosciences); Carlumab (Janssen); NY-ESO TCR (Adaptimmune); MAGE-A-10 TCR (Adaptimmune); CTL019 (Novartis); JCAR015 (Juno Therapeutics); KTE-C19 CAR (Kite Pharma); UCART19 (Cellectis); b Px -401 (Bellicum Pharmaceuticals); BPX-601 (Bellicum Pharmaceuticals); ATTCK20 (Unum Therapeutics); CAR-NKG2D (Celyad); Onyx-015 (Onyx Pharmaceuticals); H101 (Shanghai Sunwaybio); DⁿX-2401 (DNAtrix); ^v Cⁿ -01 (VCN Biosciences); Colo-Adl (PsiOxus Therapeutics); ProstAtak (Advantagene); Oncos-102 (Oncos Therapeutics); CG0070 (Cold Genesys); Pexa-vac (JX-594, Jennerex Biotherapeutics); GL-ONC1 (Genelux); T-VEC (Amgen); ^g 207 (Medigene); HF10 (Takara Bio); SEPREHVIR (HSV1716, Virttu Biologics); OrienX010 (OnenGene Biotechnology); Reolysin (Oncolytics Biotech); SVV-001 (Neotropix); Cacatak (CVA21, Viralytics); Alimta (Eli Lilly), cisplatin, oxaliplatin, irinotecan, folinic acid, methotrexate, cyclophosphamide, 5-fluorouracil, Zykadia (Novartis), Tafinlar (GSK), Xalkori (Pfizer), Iressa (AZ), Gilotrif (Boehringer Ingelheim), Tarceva (Astellas Pharma), Halaven (Eisai Pharma), Veliparib (Abbvie), AZD9291 (AZ), Alectinib (Chugai), LDK378 (Novartis), Genetespib (Synta Pharma), Tergenpumatucel-L (NewLink Genetics), GV1001 (Kael-GemVax), Tivantinib (ArQule); Cytoxan (BMS); Oncovin (Eli Lilly); Adriamycin (Pfizer); Gemzar (Eli Lilly); Xeloda (Roche); Ixempra (BMS); Abraxane (Celgene); Trelstar (Debiopharm); Taxotere (Sanofi); Nexavar (Bayer); IMMU-132 (Immunomedics); E7449 (Eisai); Thermodox (Celsion); Cometriq (Exellxis); Lonsurf (Taiho Pharmaceuticals); Camptosar (Pfizer); UFT (Taiho Pharmaceuticals); y TS-1 (Taiho Pharmaceuticals).

En realizaciones preferidas adicionales, los polipéptidos de flagelina se administran en combinación (contemporánea o secuencialmente) con oligodesoxinucleótidos que contienen CpG, que han mostrado efectos útiles con otras flagelinas [59].

En algunas realizaciones, un polipéptido de flagelina del género Enterococcus es el único agente terapéuticamente activo en una composición para su uso en la invención.

Protección contra la exposición a sustancias químicas tóxicas, patógenos o radiación

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, preferiblemente un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum, preferiblemente un polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518, para su uso en la prevención o el tratamiento de los síntomas asociados con la exposición a sustancias químicas tóxicas, patógenos o radiación. La flagelina puede administrarse a sujetos en riesgo de exposición a sustancias químicas tóxicas, patógenos o radiación, o sujetos expuestos recientemente a sustancias químicas tóxicas, patógenos o radiación, por ejemplo, sujetos expuestos 1,2, 3, 4 o 5 horas antes.

La exposición repentina de poblaciones humanas a sustancias químicas, patógenos o radiación tiene el potencial de provocar una morbilidad sustancial. Una estrategia para proteger a las poblaciones humanas es activar las vías de defensa innatas del huésped, en particular aquellas que inducen rápidamente la expresión de genes citoprotectores y/o antimicrobianos. Gran parte del trabajo en esta área se ha centrado en el agonista de TLR4 LPS/endotoxina; sin embargo, la administración de LPS puede llevar a patologías inflamatorias graves, incluyendo sepsis o lesión pulmonar grave. Además, el LPS es un pobre estimulador de las células epiteliales, que son las primeras células que interactúan con el patógeno o el desafío químico.

La flagelina estimula la defensa del huésped en una variedad de organismos, incluyendo mamíferos, insectos y plantas. Al contrario que el LPS, la flagelina es un potente activador de las vías de señalización inmunitarias innatas en las células epiteliales, pero en general se ha observado que es un activador deficiente de las células hematopoyéticas, como los macrófagos y las células dendríticas. Se ha observado que la flagelina de S. typhimurium no estimula niveles significativos de citoquinas proinflamatorias "maestras", como TNF-a, que median los efectos adversos asociados con LPS. Se ha observado que la flagelina de S. typhimurium activa la inmunidad innata mediada por TLR5 en ratones, protegiendo a los ratones contra la exposición a sustancias químicas, patógenos o radiación [66].

Se ha demostrado que la administración de flagelina de S. typhimurium protege contra la exposición a la radiación a través de un mecanismo que requiere TLR5 [66]. Se observó una protección óptima cuando se administró flagelina profilácticamente 2 horas antes de la radiación, pero aún se observaba un grado significativo de protección si la flagelina se administraba hasta 4 h después de la irradiación. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son capaces de estimular una respuesta de TLR5 más fuerte que la de S. typhimurium. Por tanto, los inventores han demostrado que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus, y en particular de la especie Enterococcus gallinarum, pueden ser útiles como agentes radioprotectores.

La invención proporciona polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso como agentes radioprotectores. La invención también proporciona polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso como agentes radioprotectores. Más preferiblemente, la invención proporciona un polipéptido de flagelina de la cepa MRx0518, en particular con la secuencia SEQ ID NO: 1, para su uso como agentes radioprotectores.

También se ha demostrado que el tratamiento con el agonista de TLR5 Entolimod reduce el daño inducido por la radiación en los tres tipos principales de tejidos radiosensibles: hematopoyético, gastrointestinal y cutáneo. También se ha demostrado que mitiga el daño epitelial inducido por la radiación en un modelo de ratón con radiación en la cabeza y el cuello [67]. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus actúan como un potente agonista de TLR5. Por tanto, los inventores han demostrado que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus, y en particular de la especie Enterococcus gallinarum, pueden ser útiles para reducir el daño inducido por radiación. En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son para su uso en la reducción del daño inducido por radiación en tejidos hematopoyéticos, gastrointestinales o de la piel. En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son para su uso en la reducción del daño epitelial inducido por radiación. En una realización preferida, la invención proporciona una composición que comprende polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en la reducción del daño inducido por radiación.

En ciertas realizaciones, la composición puede administrarse, preferiblemente por vía oral, antes de la radioterapia. En ciertas realizaciones, la composición puede administrarse, preferiblemente por vía oral, poco después de la radioterapia. En ciertas realizaciones, las composiciones son para su administración a un paciente que se ha sometido recientemente a radioterapia, o que está programado para someterse a radioterapia.

En realizaciones preferidas, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus se administran antes de la exposición a la irradiación. En otras realizaciones, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus se administran después de la exposición a la radiación, preferiblemente en el plazo de 4 horas después de la exposición.

Tratamiento de infecciones bacterianas

Se ha demostrado que la administración de flagelina de S. typhimurium estimula las respuestas inmunitarias a la infección bacteriana. La referencia [68] muestra que la administración intranasal profiláctica de flagelina de S. typhimurium con un antibiótico protege a los ratones contra la bacteria Streptococcus pneumoniae respiratoria, mientras que la referencia [66] muestra que la administración oral de flagelina de S. typhimurium 2 horas antes de la infección con S. typhimurium redujo la mortalidad. La flagelina indujo estas respuestas activando la respuesta inmunitaria innata de TLR5. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden estimular una respuesta de TLR5 más fuerte que los de S. typhimurium. Por tanto, los inventores han demostrado que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus, y en particular de la especie Enterococcus gallinarum, pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas.

La invención proporciona polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas. La invención también proporciona polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas. Más preferiblemente, la invención proporciona polipéptidos de flagelina de la cepa MRx0518, en particular con la secuencia SEQ ID NO: 1, para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus se usan en combinación con un antibiótico para su uso en el tratamiento de infecciones bacterianas. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus se usan como el único agente terapéutico en una composición para su uso en el tratamiento de infecciones bacterianas.

Adyuvantes de vacunas

Los componentes microbianos pueden usarse como adyuvantes para mejorar las respuestas inmunitarias de las vacunas poco inmunogénicas. Se ha demostrado que la flagelina actúa como adyuvante en vacunas para infecciones bacterianas, virales y parasitarias; sin embargo, la mayoría de estos estudios usaron flagelina de S. typhimurium y Vibrio vulnificus [15]. Se desconoce la eficacia de los polipéptidos de flagelina de otras especies para actuar como adyuvantes de vacunas, y en particular de Enterococcus spp.

La flagelina actúa como adyuvante estimulando la respuesta inmunitaria innata a través del receptor de TLR5. Los inventores han demostrado sorprendentemente que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son capaces de estimular una respuesta de TLR5 más fuerte que los de S. typhimurium. Por tanto, los inventores han demostrado que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus, y en particular de la especie Enterococcus gallinarum, pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. El uso de un polipéptido de flagelina como adyuvante de vacuna significa que el polipéptido de flagelina se usa, por ejemplo, para proporcionar protección contra un agente infeccioso o prevenir la infección por un agente infeccioso, generalmente potenciando la respuesta inmunitaria a un antígeno separado.

La invención proporciona polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso como adyuvantes de vacunas. La invención también proporciona polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso como adyuvantes de vacunas. Más preferiblemente, la invención proporciona polipéptidos de flagelina de la cepa MRx0518, en particular con la secuencia SEQ ID NO: 1, para su uso como adyuvantes de vacunas.

La divulgación también proporciona composiciones de vacunas que comprenden polipéptidos de flagelina como se describe en la presente como adyuvante. En ciertas realizaciones, las composiciones de vacunas son para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas. En ciertas realizaciones, el patógeno bacteriano a tratar o prevenir es Y. pestis, tetanus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli o M. tuberculosis. En ciertas realizaciones, las composiciones de vacunas son para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones virales. En ciertas realizaciones, el patógeno viral a tratar o prevenir es el virus de la gripe, el VIH, la rabia o la fiebre aftosa. En ciertas realizaciones, las composiciones de vacuna son para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones parasitarias. En ciertas realizaciones, el parásito es Plasmodium vivax, Plasmodium yoeliio Eimeria tenella. En cualquiera de tales realizaciones, la composición comprende por lo menos un antígeno del patógeno relevante. En tales realizaciones preferidas, la composición comprende la flagelina como se describe en la presente fusionada o conjugada con por lo menos un antígeno del patógeno relevante. En tales realizaciones, la invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende una flagelina como se describe en la presente, un conector opcional y un antígeno de un patógeno o parásito.

La administración a través de una vía de mucosa es una vía atractiva de administración de vacunas. La flagelina es un potente activador de las vías de señalización inmunitarias innatas en las células epiteliales, que son el primer tipo de célula importante que encuentra agentes administrados por una vía de mucosa. Se ha demostrado que las proteínas de flagelina de S. typhimurium y Vibrio vulnificus tienen una potente actividad adyuvante en vacunas mucosas contra la gripe, el virus del Nilo Occidental, Escherichia coli, Yersinia pestis, Clostridium tetani, C. jejuni, Streptococcus spp. y Plasmodium falciparum [15]. Se desconoce la eficacia de los polipéptidos de flagelina de otras especies para actuar como adyuvantes de vacunas de mucosa.

La flagelina actúa como adyuvante estimulando la respuesta inmunitaria innata a través del receptor de TLR5. Los inventores han demostrado sorprendentemente que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son capaces de estimular una respuesta de TLR5 más fuerte que los de S. typhimurium. Por tanto, la invención proporciona polipéptidos de flagelina del género Enterococcus para su uso como adyuvante de vacunas de mucosas. En realizaciones preferidas, la invención proporciona polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum para su uso como adyuvantes de vacunas de mucosas. Más preferiblemente, la invención proporciona polipéptidos de flagelina de la cepa MRx0518, en particular con la secuencia SEQ ID NO: 1, para su uso en mucosas como adyuvantes de vacunas.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son para su uso en vacunas de mucosas para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas. En realizaciones preferidas, la infección bacteriana es Escherichia coli, Yersinia pestis, Clostridium tetani, C. jejuni, Streptococcus spp. o Plasmodium falciparum. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son para su uso en vacunas de mucosas para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones virales. En realizaciones preferidas, la infección viral es gripe o el virus del Nilo Occidental.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión del Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a). Se sabe que el TNF-a es importante para las respuestas a las vacunas. Por ejemplo, se ha demostrado que el TNF-a es necesario para una respuesta a vacunas eficaz en una vacunación contra la gripe de la población de edad avanzada [69]. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la expresión de TNF-a, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas en la terapia contra la gripe. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición para administrarla en combinación con un antígeno. En tales realizaciones de la invención, la flagelina para su uso en la invención puede fusionarse o conjugarse con el antígeno. En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención son para su administración a un paciente poco antes o después de la vacunación.

Enterococcus gallinarumy en particular, la cepa MRX518 está flagelada y las flagelinas pueden ser agonistas de TLR5. Los agonistas de TLR están en desarrollo como adyuvantes de vacunas en una variedad de tipos de antígenos, particularmente en la población anciana [70]. Además, MRX518 es un agonista de TLR5. Por lo tanto, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas, en particular para vacunas administradas a pacientes de edad avanzada (por ejemplo, mayores de 40, 50, 60, 70 u 80 años), que pueden tener una actividad del sistema inmunitario reducida. La señalización de TLR5 también desempeña un papel clave en las respuestas inmunitarias innatas asociadas con la edad [71]. En ciertas realizaciones, las composiciones son para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria innata. Aunque los agonistas de TLR5 están en desarrollo como adyuvantes de vacunas, todos ellos son de patógenos conocidos y/o sintéticos. Por el contrario, las composiciones para su uso en la invención comprenden bacterias comensales.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-6. La expresión de 11-6 aumentada se ha asociado con respuestas a vacunas para muchas enfermedades. Por ejemplo, los monocitos inflamatorios CD14+CD16- produjeron IL-6 después de que se administró una vacuna contra la gripe a adultos [72], y los niveles más altos de IL-6 se asociaron con el logro de una respuesta vacunal a una vacuna contra la gripe [73]. Además, se produjo 11-6 después de la inyección del sistema adyuvante AS03 [74] y se demostró que la regulación por disminución de IL-6 en ratones reduce la respuesta de las células T auxiliares después de la administración de una vacuna contra la tuberculosis [75]. Como la administración de las composiciones para el uso en la invención puede aumentar la expresión de IL-6, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas en la terapia de tuberculosis.

Además, se ha demostrado que la expresión de IL-6 y TNF-a se correlaciona con la eficacia de una vacuna terapéutica contra el VIH [Huang et al], una vacuna contra la tuberculosis y una vacuna contra la clamidia [76]. Su et al. [77] mostró que la coinoculación de IL-6 o TNF-a con la vacuna de ADN de FMDV dio como resultado un aumento de la expresión de IFN-y en las células T CD4+ y CD8+, una expresión más alta de IL-4 en las células T CD4+ y una expresión más alta de respuesta citotóxica específica del antígeno. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la expresión de IL-6 y TNF-a, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de TNF-a. En una realización, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de IL-6. En una realización particular, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de TNF-a e IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas en la terapia del VIH. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas en la terapia de clamidia.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-1 p. Li et al .[78] demostraron que el hidróxido de aluminio adyuvante activaba la secreción de IL-1 p y sugirieron que la propia IL-p puede actuar como adyuvante. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la expresión de IL-1 p, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. Los ejemplos muestran que la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la proporción de células T CD8+ a Tregs. Se ha demostrado que los adyuvantes estimulan las células T CD8+ [79] y como se demostró que la administración de las composiciones para su uso en la invención aumenta la proporción de células T CD8+ a Tregs, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas aumentando la proporción de células T CD8+ a Tregs.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión o los niveles de los ligandos de CXCR3 CXCL9 y CXCL10. Los adyuvantes conocidos como ASO3, CpG, GLA-SE, aGalCer aumentan CXCL9 y 10 [80,81], lo que sugiere que las composiciones para su uso en la invención serán eficaces como adyuvantes. Además, CXCL9 y 10 están asociados con respuestas de IFNY/Th1 y promueven respuestas de anticuerpos [82]. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de una respuesta de anticuerpos contra un antígeno, en particular un antígeno patogénico o canceroso. Además, CXCL9 es una medida más sensible que IFN-y de las respuestas de células T inducidas por la vacuna en voluntarios que reciben vacunas contra la malaria investigadas [83]. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de una respuesta de células T contra un antígeno, en particular un antígeno patogénico o canceroso. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de CXCL9 y CXCL10. En ciertas realizaciones, las composiciones son para su uso en la protección contra la malaria.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión o niveles de IL-12p70. Este efecto se ha asociado con la eficacia del adyuvante de vacunas y la IL-12 se ha propuesto como adyuvante en sí misma [84], lo que sugiere que las composiciones para su uso en la invención serán eficaces como adyuvantes. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de IL-12p70.

Generalmente, cuando se usan como adyuvantes de vacunas, las composiciones para su uso en la invención se administrarán solas para proporcionar un efecto adyuvante para un antígeno que se ha administrado por separado al paciente. En ciertas realizaciones, la composición para su uso en la invención se administra por vía oral, mientras que el antígeno se inyecta por vía parenteral. En realizaciones alternativas, la flagelina para su uso en la invención puede fusionarse o conjugarse con el antígeno.

Las composiciones para su uso en la invención pueden usarse para potenciar una respuesta inmunitaria a cualquier antígeno útil. Los antígenos ejemplares para su uso con la invención incluyen: antígenos virales, como proteínas de superficie viral; antígenos bacterianos, como antígenos proteicos y/o sacáridos; antígenos fúngicos; antígenos parasitarios; y antígenos tumorales. La invención es particularmente útil para vacunas contra el virus de la gripe, VIH, anquilostomiasis, virus de la hepatitis B, virus del herpes simple, rabia, virus respiratorio sincitial, citomegalovirus, Staphylococcus aureus, clamidia, coronavirus del SARS, virus de la varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, virus de Epstein Barr, virus del papiloma humano, etc. En ciertas realizaciones, la flagelina para su uso en la invención se fusiona o conjuga con uno o más de estos antígenos.

Antígenos adicionales para su uso con las flagelinas para su uso en la invención incluyen antígenos de glicoproteínas y lipoglicanos. En ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno de arqueas. Los antígenos asociados a tumores ejemplares incluyen antígeno de melanoma E (MAGE), antígeno carcinoembrionario (CEA), MUC-1, HER2, sialil-Tn (STn), transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), gen del tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno prostático específico (PSA), antígenos del virus de Epstein-Barr, neoantígenos y oncoproteínas. Las flagelinas para su uso en la invención también pueden ser útiles para potenciar la respuesta a vacunas contra enfermedades no transmisibles como la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos, en cuyo caso el antígeno para su uso con la invención puede ser amiloide-beta o Tau. Otros de tales antígenos para enfermedades no transmisibles incluyen PCSK9 (para el tratamiento del colesterol elevado). Las flagelinas para su uso en la invención también pueden ser útiles para mejorar la respuesta a las vacunas contra sustancias que crean hábito, por ejemplo, nicotina, alcohol u opiáceos.

La respuesta inmunitaria provocada por estos métodos y usos incluirá generalmente una respuesta de anticuerpos, preferiblemente una respuesta de anticuerpos protectora.

Estimulación del sistema inmunitario

Las composiciones para su uso en la invención pueden llevar a una estimulación inmunitaria. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede tener un efecto inmunoestimulador, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, en particular enfermedades caracterizadas por activación inmunitaria reducida y enfermedades que pueden tratarse mediante una respuesta inmunitaria aumentada. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación del sistema inmunitario. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades mediante la estimulación del sistema inmunitario. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de una respuesta inmunitaria.

Las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por un aumento en el porcentaje de Tregs en una población celular. En una realización, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir enfermedades caracterizadas por un aumento en el porcentaje de Tregs en una población celular. En una realización, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir enfermedades caracterizadas por un aumento en el porcentaje de células CD4+CD25+CD127- en una población celular. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades disminuyendo el porcentaje de Tregs en las poblaciones celulares. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción de la supresión de la respuesta inmunitaria por Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria mediante la reducción selectiva de Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en inmunoestimulación, en donde las composiciones reducen el número o porcentaje de Treg.

Las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la proporción de células CD8/Treg y/o CD8/Treg activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por la disminución de la proporción de células CD8/Treg. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la proporción de células CD8/Treg activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentando la proporción de células CD8/Treg. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentando la proporción de células CD8/Treg activadas.

Las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células B. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células B. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células CD19+CD3-. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando el número o porcentaje de células B en poblaciones celulares, en donde el aumento en el número o porcentaje de células B da como resultado una estimulación inmunitaria. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentando el número o porcentaje de células B.

Las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células T-citotóxicas CD8. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células T citotóxicas CD8. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades aumentando el número o porcentaje de células T citotóxicas CD8 en poblaciones celulares, en donde el aumento en el número o porcentaje de células T citotóxicas CD8 da como resultado una estimulación inmunitaria. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentando el número o porcentaje de células T-citotóxicas CD8.

Las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células CD8+ activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células CD8+ activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando el número o porcentaje de células CD8+ activadas en poblaciones celulares, donde el aumento en el número o porcentaje de células CD8+ activadas da como resultado una estimulación inmunitaria. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentando el número o porcentaje de células CD8+ activadas.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión de moléculas proinflamatorias, como citoquinas proinflamatorias. Los ejemplos de moléculas proinflamatorias que pueden mostrar un aumento en los niveles de expresión tras la administración de composiciones para su uso en la invención incluyen IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-a, IL-1 p e IL-6. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la expresión de moléculas proinflamatorias, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de moléculas proinflamatorias, como citoquinas proinflamatorias. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de moléculas proinflamatorias, en particular enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de citoquinas proinflamatorias. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-a, IL-1 p,-y/o IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-23, TNF-a, IL-1 p y/o IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-a, IL-1 p, y/o IL-6.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-1 p. IL-1 p es una citoquina proinflamatoria [85]. La producción y secreción de IL-1 p está regulada por el inflamasoma, un complejo proteico asociado con la activación de la respuesta inflamatoria [86]. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la expresión de IL-1 p, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de IL-1 p. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-1 p. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-1 p.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-23. La IL-23 se ha relacionado con la inflamación [87,88]. Las funciones propuestas de IL-23 en la respuesta inmunitaria incluyen promover la proliferación de células T de memoria CD4+ y promover la secreción de IFN-y por parte de las células dendríticas (DC) [89]. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la expresión de IL-23, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de IL-23. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-23. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-23. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de IL-23.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión del Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a). El TNF-a es una citoquina proinflamatoria que se sabe que está implicada en varias vías de señalización para promover la muerte celular. TNF-a inicia la apoptosis uniéndose a su receptor afín, TNFR-1, lo que lleva a una cascada de eventos de escisión en la vía apoptótica [90]. TNF-a también puede desencadenar necrosis a través de un mecanismo dependiente de la quinasa RIP [91]. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la expresión de TNF-a, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, en particular para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una expresión disminuida de TNF-a. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de TNF-a. En una realización, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de TNF-a.

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-6. IL-6, una citoquina proinflamatoria que se produce durante la inflamación y promueve la diferenciación de las células T CD4+ vírgenes y la diferenciación de las células T CD8+ en células T citotóxicas [92]. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la expresión de IL-6, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de IL-6. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o la actividad de IL-6.

Bettelli et al. [93] informó que IL-6 inhibe la producción de Tregs. Las composiciones para su uso en la invención pueden aumentar la expresión de IL-6, por lo que las composiciones para su uso en la invención pueden disminuir selectivamente el número o porcentaje de Treg aumentando la expresión de IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en inmunoestimulación aumentando la expresión de IL-6. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en inmunoestimulación disminuyendo el número o porcentaje de Tregs.

Los ejemplos también demuestran que las composiciones para su uso en la invención promueven la diferenciación de células T auxiliares y linfocitos T citotóxicos. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la diferenciación de células T auxiliares y/o linfocitos T citotóxicos.

Terapias celulares

Terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T)

La administración de las composiciones para su uso en la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-6. La expresión de 11-6 aumentada se ha correlacionado con la respuesta a terapia con CD19 CAR-T de la leucemia linfocitaria crónica. Un aumento de la IL-6 en suero se asoció con la expansión de las células CAR-T, mientras que la inhibición de IL-6 se asoció con la inhibición de la proliferación de las células CAR-T [94]. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede aumentar la expresión de IL-6, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en la terapia celular, en particular en terapia con células CAR-T. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en terapia celular. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la terapia con células CAR-T. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de leucemia linfocítica crónica.

Se ha demostrado que el agotamiento selectivo de Tregs mejora la eficacia de los linfocitos citotóxicos [95]. Las células CAR-T son un subconjunto de linfocitos citotóxicos y, por lo tanto, se piensa que el agotamiento selectivo de Tregs es eficaz en la terapia con células CAR-T. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede agotar las Treg, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en la terapia celular, en particular en la terapia con células CAR-T.

Por lo tanto, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en la terapia celular, en particular para potenciar la respuesta a una terapia celular.

Terapia con células madre mesenquimales (MSC)

Se ha informado que la terapia con células madre mesenquimales (MSC) tiene propiedades inmunoestimuladoras. Cuando las MSC se tratan con LPS, regulan por incremento las citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-8, lo que provoca una proliferación de células B aumentada [96]. Por lo tanto, como las composiciones para su uso en la invención pueden aumentar la expresión de IL-6, pueden ser útiles en combinación con la terapia celular MSC.

Terapia de trasplante de células madre

Se ha informado que, en lugar de usar células madre no diferenciadas en la terapia de trasplante de células madre, puede ser beneficioso diferenciar las células madre hasta cierto punto antes del trasplante. Por ejemplo, Heng et al. [97] informaron que la diferenciación cardiomiogénica de las células madre puede ser beneficiosa al tener una mayor eficiencia de injerto, una regeneración de los miocitos mejorada y una restauración de la función cardíaca aumentada. Como la administración de las composiciones para su uso en la invención puede iniciar la diferenciación neuronal en células de neuroblastoma no diferenciadas, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para la diferenciación de células madre en la terapia de trasplante de células madre.

Trasplante de células madre hematopoyéticas

El trasplante de células madre hematopoyéticas es el trasplante de células madre hematopoyéticas multipotentes, habitualmente derivadas de la médula ósea, sangre periférica o sangre del cordón umbilical. Se ha demostrado que la colonización del intestino con Enterococi (Enterococcus gallinarum y Enterococcus casseliflavus) antes del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas mejora significativamente la supervivencia de los pacientes a los 2 años debido a la disminución de la mortalidad sin recaída [98]. Por lo tanto, el efecto inmunomodulador mostrado en los ejemplos puede ser útil en la terapia de trasplante de células madre hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para mejorar la supervivencia después del trasplante de células madre hematopoyéticas y, en particular, después del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

Las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles en combinación con el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. Las composiciones para su uso en la invención pueden tener un efecto en el refuerzo de la respuesta con éxito del paciente al trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención se administran antes del trasplante de células madre hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención son para la administración a un paciente programado para recibir un trasplante de células madre hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención se administran después del trasplante de células madre hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención son para la administración a un paciente que ha recibido un trasplante de células madre hematopoyética. Inmunosenescencia

Fulop et a/.[99] identificaron que un aumento en el número de células Treg y una disminución en el número de células B están asociados con el envejecimiento en el sistema inmunitario adaptativo. Por lo tanto, las composiciones para su uso en la invención pueden usarse para prevenir o retrasar la inmunosenescencia. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención de la inmunosenescencia. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia caracterizada por un aumento en el número de células Treg. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia caracterizada por una disminución en el número de células B. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia caracterizada por un aumento en el número de células Treg y una disminución en el número de células B. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia disminuyendo el número de células Treg. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia aumentando el número de células B. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia disminuyendo el número de células Treg y aumentando el número de células B. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades provocadas por inmunosenescencia. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el envejecimiento retrasando y/o previniendo la inmunosenescencia.

Además, se ha propuesto que los adyuvantes de las vacunas pueden superar la inmunosenescencia [100]. Como las composiciones para su uso en la invención son adecuadas para su uso como adyuvantes de vacunas, las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para prevenir o retrasar la inmunosenescencia. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso y/o prevención de la inmunosenescencia como adyuvante de vacunas. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvantes de vacunas, en donde las composiciones retrasan y/o previenen la inmunosenescencia.

Las enfermedades que están asociadas con la inmunosenescencia incluyen enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, cáncer, diabetes mellitus tipo 2 [101] y trastornos autoinmunes [102].

Modos de administración

Preferiblemente, las composiciones para su uso en la invención se administran por inyección, preferiblemente por vía subcutánea o alternativamente por vía intravenosa o intraperitoneal. En la siguiente sección se proporcionan detalles adicionales sobre las composiciones adecuadas para administración mediante inyección. En realizaciones alternativas, las composiciones para su uso en la invención son para su administración en el tracto gastrointestinal. Se sabe que el sistema inmunitario está modulado por la presencia de bacterias y proteínas bacterianas en el tracto gastrointestinal. Las composiciones para su uso en la invención se administran por vía oral, pero pueden administrarse por vía rectal, intranasal o por vía bucal o sublingual.

En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención pueden administrarse como una espuma, un aerosol o un gel.

En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención pueden administrarse como un supositorio, como un supositorio rectal, por ejemplo en forma de una composición de aceite de teobroma (manteca de cacao), grasa dura sintética (por ejemplo, suppocire, witepsol), glicero-gelatina, polietilenglicol o glicerina de jabón.

En ciertas realizaciones, la composición para su uso en la invención se administra al tracto gastrointestinal a través de un tubo, como un tubo nasogástrico, tubo orogástrico, tubo gástrico, tubo de yeyunostomía (tubo J), gastrostomía endoscópica percutánea (PEG) o un puerto, como un puerto de pared torácica que proporciona acceso al estómago, yeyuno y otros puertos de acceso adecuados.

Las composiciones para su uso en la invención pueden administrarse una vez o pueden administrarse secuencialmente como parte de un régimen de tratamiento. En ciertas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención son para administrarse diariamente.

En ciertas realizaciones para su uso en la invención, el tratamiento de acuerdo con la invención va acompañado de una evaluación de la microbiota intestinal del paciente.

Las composiciones para su uso en la invención pueden administrarse a un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer, o que se ha identificado que tiene riesgo de cáncer. Las composiciones también pueden administrarse como medida profiláctica para prevenir el desarrollo de cáncer en un paciente sano.

Las composiciones para su uso en la invención pueden administrarse a un paciente que se ha identificado que tiene una microbiota intestinal anormal. Por ejemplo, el paciente puede tener una colonización reducida o nula por Enterococcus spp, en particular Enterococcus gallinarum.

Generalmente, las composiciones para su uso en la invención son para el tratamiento de humanos, aunque pueden usarse para tratar animales que incluyen mamíferos monogástricos como aves, cerdos, gatos, perros, caballos o conejos. Las composiciones para su uso en la invención pueden ser útiles para mejorar el crecimiento y el rendimiento de los animales. Si se administra a animales, puede usarse alimentación forzada oral.

Composiciones

Generalmente, la composición para su uso en la invención comprende un polipéptido de flagelina del género Enterococcus y en particular de la especie Enterococcus gallinarum.

En realizaciones preferidas, la composición para su uso en la invención se encapsula para permitir la administración de flagelina al intestino. La encapsulación protege la composición de la degradación hasta la administración en el lugar objetivo a través, por ejemplo, de la ruptura con estímulos químicos o físicos como la presión, la actividad enzimática o la disgregación física, que pueden desencadenarse por cambios en el pH. Puede usarse cualquier método de encapsulación apropiado. Las técnicas de encapsulación ejemplares incluyen atrapamiento dentro de una matriz porosa, fijación o adsorción en superficies de soporte sólidas, autoagregación por floculación o con agentes de reticulación y contención mecánica detrás de una membrana microporosa o una microcápsula.

Por lo tanto, las composiciones pueden ser farmacéuticamente aceptables. Habitualmente incluirán componentes además del polipéptido de flagelina (o ácido nucleico), por ejemplo, típicamente incluyen uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticos.

Las composiciones pueden administrarse a un humano en forma acuosa. Sin embargo, en tales realizaciones, antes de la administración, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunos agentes terapéuticos se fabrican en forma acuosa, luego se llenan, distribuyen y administran también en forma acuosa, otros agentes terapéuticos se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento de su uso. Por lo tanto, una composición para su uso en la invención puede secarse, como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservantes como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, se prefiere que los agentes terapéuticos estén sustancialmente libres de (es decir, menos de 5 pg/ml) de material mercurial, por ejemplo, libres de tiomersal. Los agentes terapéuticos que no contienen mercurio son más típicos. Se favorecen particularmente los agentes terapéuticos libres de conservantes.

Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector de la temperatura. A continuación se proporcionan más detalles de tales agentes.

Para controlar la tonicidad, es típico incluir una sal fisiológica, como una sal de sodio. Generalmente se usa cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 10+2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

Las composiciones tendrán generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, más habitualmente entre 240-360 mOsm/kg, y más típicamente estarán dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón de citrato. Los tampones se incluirán típicamente en el intervalo de 5-20 mM.

El pH de una composición estará generalmente entre 5,0 y 8,1, y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8.

La composición es típicamente estéril. La composición también es típicamente no pirógena, por ejemplo, contiene <1 EU (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, por ejemplo, <0,1 EU por dosis. La composición a menudo es sin gluten.

La composición puede incluir material para una única administración, o puede incluir material para múltiples administraciones (es decir, un kit 'multidosis'). La inclusión de un conservante es típica en disposiciones multidosis. Como alternativa (o además de) a la inclusión de un conservante en las composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tenga un adaptador aséptico para la eliminación del material.

Los agentes terapéuticos de proteínas humanas se administran típicamente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque pueden administrarse la mitad de la dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) a los niños.

Las composiciones para su uso en la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. A menudo, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, que se analizan adicionalmente a continuación.

Las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada por pulverización-congelación). La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo, como pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, como un aerosol o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un aerosol. La composición puede prepararse como un supositorio o un pesario. La composición puede prepararse para administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñado de tal manera que una composición combinada se reconstituye justo antes de la administración a un mamífero. Tales kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados. En ciertas realizaciones, la flagelina para su uso en la invención presente en la composición puede fusionarse o conjugarse con uno o más antígenos.

Cuando una composición deba prepararse extemporáneamente antes de su uso (por ejemplo, cuando un componente se presenta en forma liofilizada) y se presenta como un kit, el kit puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringuilla precargada y un vial, usándose el contenido de la jeringuilla para reactivar el contenido del vial antes de la inyección.

Las composiciones utilizadas como agentes terapéuticos comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de polipéptido o ácido nucleico codificante, así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por ‘cantidad inmunológicamente eficaz’ se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una única dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del médico tratante y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos de rutina. Cuando se incluye más de un antígeno en una composición, entonces dos antígenos pueden estar presentes en la misma dosis que el otro o en dosis diferentes.

Como se ha mencionado anteriormente, una composición puede incluir un agente protector de la temperatura, y este componente puede ser particularmente útil en composiciones adyuvantes (particularmente las que contienen un adyuvante mineral, como una sal de aluminio). Como se describe en la referencia 103, puede añadirse un agente protector de temperatura líquido a una composición de vacuna acuosa para reducir su punto de congelación, por ejemplo, para reducir el punto de congelación por debajo de 0° C. Por tanto, la composición puede almacenarse por debajo de 0° C, pero por encima de su punto de congelación, para inhibir la descomposición térmica. El agente protector de la temperatura también permite la congelación de la composición a la vez que protege los adyuvantes de sales minerales contra la aglomeración o sedimentación después de la congelación y descongelación, y también puede proteger la composición a temperaturas elevadas, por ejemplo, por encima de 40° C. Pueden mezclarse una vacuna acuosa de partida y el agente protector de temperatura líquido de tal manera que el agente protector de temperatura líquido forme del 1 al 80% en volumen de la mezcla final. Los agentes protectores de la temperatura adecuados deben ser seguros para la administración humana, fácilmente miscibles/solubles en agua y no deben dañar otros componentes (por ejemplo, antígeno y adyuvante) en la composición. Los ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol, y/o polietilenglicol (PEG). Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular medio que varía de 200-20.000 Da. En una realización, el polietilenglicol puede tener un peso molecular medio de aproximadamente 300 Da ("PEG-300").

La invención proporciona una composición que comprende: (i) uno o más polipéptidos de flagelina; y (ii) un agente protector de la temperatura. Esta composición puede formarse mezclando (i) una composición acuosa que comprende uno o más antígenos, con (ii) un agente protector de la temperatura. Luego, la mezcla puede almacenarse, por ejemplo, por debajo de 0° C, de 0-20° C, de 20-35° C, de 35-55° C o más. Puede almacenarse en forma líquida o congelada. La mezcla puede liofilizarse. La composición puede formarse alternativamente mezclando (i) una composición seca que comprende uno o más antígenos, con (ii) una composición líquida que comprende el agente protector de la temperatura. Por tanto, el componente (ii) puede usarse para reconstituir el componente (i).

La composición puede administrarse por vía oral y puede estar en forma de comprimido, cápsula o polvo. Otros ingredientes (como la vitamina C, por ejemplo), pueden incluirse como captadores de oxígeno y sustratos prebióticos para mejorar la administración y/o la colonización parcial o total y la supervivencia in vivo.

Una composición para su uso en la invención incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de flagelina como se describe en la presente. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de flagelina es suficiente para ejercer un efecto beneficioso sobre un paciente.

Las composiciones para su uso en la invención pueden comprender excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de tales excipientes adecuados pueden encontrarse en la referencia [104]. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en la referencia [105]. Los ejemplos de portadores adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua. La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como portador, excipiente o diluyente, o además del mismo, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante. Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica pueden proporcionarse conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico. También pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión.

En algunas realizaciones, la composición comprende más de un polipéptido de flagelina del género Enterococcus para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer. En ciertas realizaciones, la composición comprende un polipéptido de flagelina con la SEQ ID NO: 1 y por lo menos un polipéptido de flagelina adicional del género Enterococcus. En ciertas realizaciones, la composición comprende un polipéptido de flagelina con la SEQ ID NO: 1 y por lo menos un polipéptido de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum.

En ciertas realizaciones, la composición comprende un polipéptido de flagelina con la SEQ ID NO: 1 y por lo menos un polipéptido de flagelina seleccionado de un grupo que consiste de las SEQ ID NO 2-42. En algunas realizaciones, la composición puede comprender por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 polipéptidos de flagelina del género Enterococcus y en particular de la especie Enterococcus gallinarum. En algunas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención comprenden menos de 50 polipéptidos de flagelina de la misma especie (por ejemplo, menos de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 cepas) y, opcionalmente, no contienen polipéptidos de flagelina de ninguna otra especie. En algunas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención comprenden 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1- 7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25 o 31-50 polipéptidos de flagelina de la misma especie y, opcionalmente, no contienen polipéptidos de flagelina de ninguna otra especie.

En algunas realizaciones en las que la composición para su uso en la invención comprende más de un polipéptido de flagelina, los polipéptidos de flagelina individuales pueden ser para administración separada, simultánea o secuencial. Por ejemplo, la composición puede comprender todos los polipéptidos de flagelina, o los polipéptidos de flagelina pueden almacenarse por separado y administrarse por separado, simultánea o secuencialmente. En algunas realizaciones, los más de un polipéptido de flagelina se almacenan por separado pero se mezclan antes de su uso.

Las composiciones para su uso de acuerdo con la invención pueden requerir o no aprobación de comercialización.

Las composiciones para su uso en la invención pueden comprender excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se usa en la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se usa en la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno es cáncer de mama. En realizaciones preferidas, el cáncer es carcinoma mamario. En realizaciones preferidas, el cáncer es cáncer de mama en estadio IV.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se usa en la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno es cáncer de pulmón. En realizaciones preferidas, el cáncer es carcinoma de pulmón.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se usa en la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno es cáncer de hígado. En realizaciones preferidas, el cáncer es un hepatoma (carcinoma hepatocelular).

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se describe en la presente; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno es cáncer de colon. En realizaciones preferidas, el cáncer es adenocarcinoma colorrectal.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se describe en la presente; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno es carcinoma.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se describe en la presente; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno es un cáncer no inmunogénico.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se describe en la presente; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno es un cáncer inmunogénico.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se describe en la presente; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste de carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, tumores glandulares, tumores carcinoides y carcinomas indiferenciados.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se describe en la presente; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste de hepatoblastoma, colangiocarcinoma, cistoadenocarcinoma colangiocelular o cáncer de hígado resultante de una infección viral.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de flagelina como se describe en la presente; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste de carcinoma ductal invasivo, carcinoma ductal in situ o carcinoma lobulillar invasivo.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: polipéptido de flagelina como se describe en la presente; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde el polipéptido de flagelina está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste de leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, carcinoma de células basales, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, tumor óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales, glioma, vía visual infantil e hipotalámico, linfoma de Hodgkin, melanoma, carcinoma de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de células renales, cáncer de laringe, leucemias, linfomas, mesotelioma, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, cáncer de faringe, adenoma pituitario, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, sarcoma, cáncer testicular, cáncer de tiroides o cáncer de útero.

Una dosis de un ácido nucleico (por ejemplo, un agente terapéutico a base de ácidos nucleicos) puede tener < 100 pg de ácidos nucleicos; por ejemplo, de 10 a 100 pg, como aproximadamente 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75 pg o 100 pg, pero la expresión puede verse a niveles mucho más bajos; por ejemplo, usando <1 pg/dosis, <100 ng/dosis, <10 ng/dosis, <1 ng/dosis, etc. De manera similar, una dosis de un antígeno proteico puede tener <100 pg de proteína; por ejemplo, de 10 a 100 pg, como aproximadamente 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75 pg o 100 pg. El polipéptido puede administrarse en una dosis de aproximadamente 0,1-10 mg/kg de peso corporal.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención o las composiciones para su uso en la invención pueden administrarse en una dosis individual o más preferiblemente en dosis repetidas. Preferiblemente, las dosis repetidas se administran aproximadamente cada 2, 5, 10, 7, 10 o 15 días. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra a una dosis de 100 pg/kg, 200 pg/kg, 300 pg/kg, 400 pg/kg, 500 pg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg o 500 mg/kg del peso corporal del sujeto.

Las dosis unitarias adecuadas incluyen 1 mg, 2 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 1000 mg, 100-500 mg, 500-1000 mg, 200-400 mg, 5-00 -750 mg, 750-1000 mg.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior que comprende células huésped para su uso en la invención. Una dosis diaria adecuada de las células huésped, por ejemplo para un humano adulto, puede ser de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias (CFU); por ejemplo, de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1010 CFU; en otro ejemplo, de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1010 CFU.

En ciertas realizaciones, la composición contiene la célula huésped en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1011 CFU/g, con respecto al peso de la composición; por ejemplo, de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 CFU/g. La dosis puede ser, por ejemplo, 1 g, 3 g, 5 g y 10 g. En algunas realizaciones, la composición comprende una mezcla de células huésped vivas y células huésped que han muerto.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste de oral, rectal, subcutáneo, nasal, bucal, sublingual, subcutáneo, intravenoso e intramuscular.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un portador seleccionado del grupo que consiste de lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol y sorbitol.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un diluyente seleccionado del grupo que consiste de etanol, glicerol y agua.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste de almidón, gelatina, glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorante de maíz, acacia, tragacanto, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio y cloruro de sodio.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende además por lo menos uno de un conservante, un antioxidante y un estabilizante.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un conservante seleccionado del grupo que consiste de benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde cuando la composición se almacena en un recipiente sellado a aproximadamente 4° C o aproximadamente 25° C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tiene una humedad relativa del 50%, por lo menos un 80% de la cepa bacteriana medida en unidades formadoras de colonias, permanece después de un período de por lo menos aproximadamente: 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1,5 años, 2 años, 2,5 años o 3 años.

En algunas realizaciones, la composición para su uso en la invención se proporciona en un recipiente sellado que comprende una composición como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el recipiente sellado es una bolsita o una botella. En algunas realizaciones, la composición para su uso en la invención se proporciona en una jeringuilla que comprende una composición como se describe en la presente.

La composición de la presente invención puede, en algunas realizaciones, proporcionarse como una formulación farmacéutica. Por ejemplo, la composición puede proporcionarse en forma de comprimido o cápsula. En algunas realizaciones, la cápsula es una cápsula de gelatina ("cápsula de gel").

En algunas realizaciones, las composiciones para su uso en la invención se administran por vía oral. La administración oral puede implicar la deglución, de tal manera que el compuesto entre en el tracto gastrointestinal, y/o la administración bucal, lingual o sublingual mediante la cual el compuesto entra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral incluyen tabletas sólidas, micropartículas sólidas, semisólidas y líquidas (incluyendo sistemas de fases múltiples o dispersos) como comprimidos; cápsulas blandas o duras que contienen multi- o nanoparticulados, líquidos (por ejemplo, soluciones acuosas), emulsiones o polvos; pastillas para chupar (incluyendo las rellenas de líquido); gomas de mascar; geles; formas de dosificación de dispersión rápida; películas; óvulos; aerosoles; y parches bucales/mucoadhesivos.

En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica es una formulación entérica, es decir, una formulación gastrorresistente (por ejemplo, resistente al pH gástrico) que es adecuada para el administración de la composición para su uso en la invención al intestino mediante administración oral. Las formulaciones entéricas pueden ser particularmente útiles cuando la bacteria u otro componente de la composición es sensible a los ácidos, por ejemplo, propenso a la degradación en condiciones gástricas.

En algunas realizaciones, la formulación entérica comprende un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones, la formulación es una forma de dosificación con recubrimiento entérico. Por ejemplo, la formulación puede ser un comprimido con recubrimiento entérico o una cápsula con recubrimiento entérico o similares. El recubrimiento entérico puede ser un recubrimiento entérico convencional, por ejemplo, un recubrimiento convencional para un comprimido, cápsula o similar para administración oral. La formulación puede comprender un recubrimiento de película, por ejemplo, una capa de película delgada de un polímero entérico, por ejemplo, un polímero insoluble en ácido.

En algunas realizaciones, la formulación entérica es intrínsecamente entérica, por ejemplo, gastrorresistente sin necesidad de un recubrimiento entérico. Por tanto, en algunas realizaciones, la formulación es una formulación entérica que no comprende un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula hecha de un material termogelificante. En algunas realizaciones, el material termogelificante es un material celulósico, como metilcelulosa, hidroximetilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En algunas realizaciones, la cápsula comprende una cubierta que no contiene ningún polímero formador de película. En algunas realizaciones, la cápsula comprende una cubierta y la cubierta comprende hidroxipropilmetilcelulosa y no comprende ningún polímero formador de película (por ejemplo, ver [106]). En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula intrínsecamente entérica (por ejemplo, Vcaps® de Capsugel).

En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula blanda. Las cápsulas blandas son cápsulas que, debido a la adición de ablandadores como, por ejemplo, glicerol, sorbitol, maltitol y polietilenglicoles, presentes en la cubierta de la cápsula, pueden tener una cierta elasticidad y blandura. Las cápsulas blandas pueden producirse, por ejemplo, a base de gelatina o almidón. Las cápsulas blandas a base de gelatina están disponibles comercialmente de varios proveedores. Dependiendo del método de administración como por ejemplo, oral o rectal, las cápsulas blandas pueden tener varias formas, pueden ser, por ejemplo, redondas, ovaladas, oblongas o con forma de torpedo. Las cápsulas blandas pueden producirse mediante procesos convencionales como, por ejemplo, mediante el proceso Scherer, el proceso Accogel o el proceso de gotitas o soplado.

General

La puesta práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, las referencias [107] y [108-114], etc.

El término "que comprende" abarca tanto "que incluye" como "que consiste", por ejemplo, una composición que "comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x+10%.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

El término "polipéptidos de flagelina del género Enterococcus” abarca polipéptidos de flagelina de tipo salvaje y polipéptidos de flagelina mutados que muestran propiedades inmunoestimuladoras, por ejemplo, que pueden activar eficazmente las respuestas de TLR5. El término "polipéptidos de flagelina" también abarca fragmentos de polipéptidos de flagelina de tipo salvaje y polipéptidos de flagelina mutados que muestran propiedades inmunoestimuladoras, por ejemplo, que pueden activar eficazmente las respuestas de TLR5.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de proteínas significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de residuos de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la ref. [115]. Un método preferido usa la alineación MUSCLE de secuencias de proteínas y puede realizarse con Geneious (78,02% de identidad por pares), matriz de puntuación Blossom62, umbral = 1.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de nucleótidos son los mismos al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. [116]. Una alineación preferida se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de espacio afín con una penalización de apertura de espacio de 12 y una penalización de extensión de espacio de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se describe en la ref. [117].

En general, a menos que se especifique lo contrario (por ejemplo, en relación con los fragmentos), la identidad de la secuencia se calcula sobre la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) y no sobre la longitud de la secuencia de consulta. Por lo tanto, no se considera que las secuencias cortas e irrelevantes tengan una alta identidad de secuencia con las secuencias de la invención.

A menos que se indique específicamente, un proceso o método que comprende numerosos pasos puede comprender pasos adicionales al principio o al final del método, o puede comprender pasos intermedios adicionales.

En la presente se describen varias realizaciones de la invención. Se apreciará que las características especificadas en cada realización pueden combinarse con otras características especificadas para proporcionar realizaciones adicionales. En particular, las realizaciones resaltadas en la presente como adecuadas, típicas o preferidas pueden combinarse entre sí (excepto cuando se excluyen mutuamente).

MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

Ejemplo 1 - Activación de células informadoras de TLR5 por MRx0518

Resumen

Este estudio probó la eficacia de la cepa bacteriana MRx0518 para activar las células informadoras de TLR5.

Ensayo de activación de TLR5

Las células HEK-Blue TLR5 son células HEK293 cotransfectadas con el gen TLR5 humano y un gen informador SEAP (fosfatasa alcalina embrionaria secretada) inducible. El gen SEAP se coloca bajo el control del promotor mínimo de IFN-p fusionado con cinco sitios de unión a NF-^kB y AP-1. La estimulación con un ligando de TLR5 activa NF-^kB y AP-1 que inducen la producción de SEAP. El nivel de fosfatasa alcalina se relaciona así con la actividad de TLR5.

• Materiales

Línea celular informadora: HEK-Blue hTLR5 (Invivogen, hkb-htlr5)

Medio de crecimiento celular: DMEM (Sigma, D6171) suplementado con 10% (v/v) de FBS (Sigma, F9665), L-glutamina 4 mM (Sigma, G7513), 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina (Sigma, P4333), 100 ug/ml de normocina (Invivogen, ant-nr-1) y antibióticos selectivos blasticidina (30 ug/ml, Invivogen, ant-bl-05) y zeocina (100 ug/ml, Invivogen, ant-zn-1)

Medios libre de antibióticos: DMEM suplementado con 10% de FBS (v/v) y L-glutamina 4 mM.

• Condiciones de crecimiento bacteriano

Condiciones de crecimiento bacteriano: Todos los cultivos de MRx0518 de Enterococcus gallinarum se cultivaron en caldo de extracto de levadura, hidrolizado de caseína y ácidos grasos (YCFA) (E&O Laboratories, Reino Unido) a 37° C, en condiciones anaeróbicas.

Células de MRx0518 en fase estacionaria: Se cultivaron cultivos de 16-18 horas de la cepa MRx0518 en las condiciones descritas anteriormente usando un inóculo al 1% de células MRx0518, se almacenaron congeladas como bancos de células de trabajo a -80° C.

Células de MRx0518 de fase logarítmica tardía: se cultivaron cultivos de 3 horas (aprox.) de la cepa MRx0518 en las condiciones descritas anteriormente usando un inóculo al 10% de células MRx0518 en fase estacionaria.

• Procedimiento

El ensayo de activación de TLR5 se realizó con los siguientes tratamientos en dos dosificaciones: 10:1 (3 x 105 bacterias) o 100: 1 (3 x 106 bacterias):

- Bacterias MRx0518 vivas

- Bacteria MRx0518 matadas con calor

- SFC de MRx0518

Se realizó un control positivo con FLA-ST ultrapuro a una concentración de 20 ng/ml y 5 ng/ml. Se realizó un control negativo con medios libres de antibióticos que no contenían células informadoras para controlar la producción de fosfatasa alcalina por algo que no fuera las células indicadoras. Se realizaron dos controles adicionales con YCFA y agua. Para todos los tratamientos se realizaron tres repeticiones.

• Preparación de sobrenadante vivo y libre de células (CFS) MRx0518

Los tratamientos vivos y CFS se prepararon a partir de un cultivo de 10 ml de células MRx0518 de fase logarítmica tardía después de la centrifugación de las células a 5000xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sedimento bacteriano se lavó una vez en PBS (Sigma, D8537) y se volvió a suspender en medio libre de antibióticos hasta una densidad estimada de 1,4 x 108 CFU/ml (dilución de 2 veces) y 1,4 x 107 CFU/ml (dilución de 20 veces). El sobrenadante bacteriano se recogió, se filtró (0,22 um) en condiciones estériles y se diluyó 10 y 20 veces usando H2O (Sigma, W3500) para proporcionar equivalentes para las suspensiones de bacterias descritas anteriormente. El CFS contiene flagelos de MRx0518 desprendidos en el sobrenadante.

• Preparación de células matadas por calor (HK)

Por separado, se generaron células HK incubando un cultivo de 10 ml de células MRx0518 de fase logarítmica tardía a 80° C durante 40 minutos. Después de la centrifugación (condiciones descritas anteriormente), se descartó el sobrenadante del cultivo y el sedimento celular se lavó una vez en PBS (Sigma, D8537) y se volvió a suspender en medio libre de antibióticos hasta una densidad estimada de 1,4 x 108 CFU/ml (dilución de dos veces) y 1,4 x 107 CFU/ml (dilución de 20 veces). Una vez preparados, todos los tratamientos se almacenaron en hielo antes de su uso. Se determinaron los recuentos de células viables por ml para todas las preparaciones de células de MRx0518 vivas y matadas por calor.

• Preparación del control positivo

Se preparó un agonista conocido de TLR5, la flagelina de S. typhimurium (ultrapura, FLA-ST ultrapura de Invitrogen, tlrl-epsitfla) a 200 ng/ml o 50 ng/ml en H2O.

• Condiciones del ensayo de TLR5

Se colocaron en placas 20 gl del tratamiento apropiado (células bacterianas, sobrenadante libre de células, ligandos de control positivo, flagelina recombinante, controles negativos, por ejemplo, YCFA, medios libres de antibióticos, H2O, PBS) por duplicado o triplicado en placas de cultivo celular de 96 pocillos (Sigma, CLS3596). Se añadieron 180 gl de suspensión de células informadoras a cada pocillo para dar un volumen final de 200 gl y una concentración final de células HEK-blue TLR5 de 3 x 104. Los ensayos se incubaron a 37° C, 5% de CO2 durante 22 h.

Después de la incubación, se añadieron 20 gl del ensayo a 180 gl de sustrato Quantiblue (Invivogen, repqb1) en una nueva placa de 96 pocillos y se incubó a 37° C, 5% de CO2 durante 2 h. Se tomaron imágenes de las placas que contenían Quantiblue en un lector de microplacas (Bio-Rad, iMark) tomando lecturas de densidad óptica de 655 nm. Los resultados se promediaron a partir de repeticiones técnicas y luego se promediaron posteriormente experimentos independientes para proporcionar datos para los gráficos finales.

Conclusiones

El tratamiento con MRx0518 vivo e inactivado por calor llevó a niveles intermedios y altos de respuestas de TLR5. Estos datos muestran que la cepa MRx0518 es capaz de inducir una respuesta de TLR5 y que esta respuesta no se elimina por inactivación por calor. Estos datos sugieren que la flagelina del género Enterococcus y, en particular, la flagelina de MRx0518 pueden provocar una respuesta TLR5 y que la flagelina es termoestable.

El nivel más alto de actividad de TLR5 se observó después del tratamiento con MRx0518-CFS y fue incluso más alto que el agonista de TLR5 FLA-ST (Figura 6) conocido. El CFS contiene flagelos de MRx0518 desprendidos en el sobrenadante. Estos datos muestran que la flagelina del género Enterococcus y en particular de MRx0518 produce una respuesta de TLR5 muy fuerte y, por lo tanto, puede ser útil en terapia, en particular en el tratamiento del cáncer. Estos datos también muestran que MRx0518 es eficaz para desprender su flagelina en el sobrenadante.

Ejemplo 2 - La activación de TLR5 por el CFS es particularmente fuerte para MRx0518

Resumen

Este estudio probó si la activación de TLR5 usando CFS varía entre las cepas. Tanto MRx0518 como DSM100110 son cepas flageladas de Enterococcus gallinarum. Se realizó un estudio para observar si el SFC de ambas de estas cepas lleva a una respuesta de TLR5.

Ensayo de activación de TLR5

Se realizó un ensayo de TLR5 como se describe en el Ejemplo 1.

• Procedimiento

El ensayo de activación de TLR5 se realizó con los siguientes tratamientos en dos dosificaciones - 10:1 y 100:1:

- MRx0518-CFS

- DSM100110-CFS

Se realizaron tres controles negativos con medio libre de antibióticos, YCFA y agua. Se realizó un control positivo con FLA-ST ultrapuro a una concentración de 20ng/ml. Para todos los tratamientos se realizaron tres repeticiones.

Conclusiones

MRx0518-CFS fue capaz de estimular una respuesta alta de TLR5. DSM100110-CFS también produjo una respuesta de TLR5 con un MOI de 100:1, aunque se redujo con respecto a MRx0518-CFS. Estos datos muestran que mientras que el sobrenadante de ambas cepas provocó una respuesta inmunoestimuladora, esto varía entre las cepas. Estos datos son sorprendentes ya que las cepas MRx0518 y DSM100110 son ambas cepas flageladas de Enterococcus gallinarum. El MRx0518-CFS produce una respuesta de TLR5 más alta en comparación con DSM100110-CFS, posiblemente porque MRx0518 tiene una capacidad mejorada para liberar su flagelina en el sobrenadante en comparación con otras cepas de Enterococcus gallinarum, lo que puede hacerlo particularmente útil en la terapia.

Estos datos sugieren que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden ser eficaces para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, en particular los cánceres que están asociados con TLR5, como el cáncer de mama, colorrectal y gástrico.

Ejemplo 3 - Activación de TLR5 después del tratamiento con tripsina

Resumen

Este estudio probó si la activación de TLR5 por MRx0518-CFS depende de la tripsina.

Ensayo de activación de TLR5

Se realizó un ensayo de TLR5 como se describe en el Ejemplo 1.

• Procedimiento

El ensayo de activación de TLR5 se realizó con los siguientes tratamientos en dos dosificaciones - 10:1 y 100:1 solo o en combinación con tripsina:

- MRx0518-CFS

- DSM100110-CFS

- YCFA

Para todos los tratamientos se realizaron tres repeticiones.

Los CFS se digirieron con 500 pg/ml de tripsina (0,22 um filtrada, Sigma, T3924), o un volumen equivalente de vehículo de tripsina (solución salina equilibrada de Hank, Fisher Scientific, 1175129) como control de digestión simulada, durante 1 hora a 37° C, 5% de CO2. Después de la incubación, las muestras de CFS digeridas y digeridas simuladas se suplementaron con FBS hasta una concentración final del 10% (v/v) para inhibir la actividad de la tripsina.

Se realizaron tres controles negativos con medio libre de antibióticos, HBSS y agua. Se realizó un control positivo con FLA-ST ultrapuro a una concentración de 20ng/ml.

Conclusiones

La activación de TLR5 por MRx0518-CFS fue suprimida por el tratamiento con tripsina (Figura 8). Estos datos muestran que la respuesta de TLR5 es activada por proteínas en el MRx0518-CFS. La degradación de estas proteínas por la tripsina suprime la respuesta de TLR5. La proteína de flagelina de MRx0518 (FlaAMRx0518) contiene 36 sitios de escisión de tripsina, algunos de los cuales están localizados en los dominios de interacción de TLR5. Ejemplo 4 - Activación de TLR5 con proteínas de flagelina purificadas

Resumen

Este estudio probó los perfiles estimulantes de flagelina MRx0518 y DSM100110 purificada.

Producción de proteínas de flagelina recombinantes

En la Figura 9a se muestra una descripción general de la estrategia de clonación. Los genes de longitud completa para flagelina MRx0518 y DSM100110 se clonaron en el constructo de expresión recombinante pQE-30 (que tiene una etiqueta 6xHis N-terminal) usando una enzima de restricción digerida para producir constructos pQE-30-FlaAMRx0518 y pQE-30-FlaADSM100110. Las colonias positivas se identificaron usando PCR de colonias, digestiones con enzimas de restricción y técnicas de secuenciación de ADN bien conocidas en la técnica.

Las proteínas de flagelina recombinantes, FlaAMRx0518 y FlaADSM100110 se expresaron en células de E.coli y se purificaron usando una cromatografía de afinidad con metales inmovilizados y elución con imidazol, seguido de eliminación de endotoxinas (consultar la tabla a continuación). Esto da como resultado preparaciones de alta pureza con niveles mínimos de endotoxinas. El tamaño y la pureza de las proteínas se confirmó usando un gel SDS-PAGE (Figura 9b).

Respuesta a la dosis de proteínas FlaAMRx0518 y FlaApSM ¹⁰⁰¹ w recombinantes purificadas

Se realizó un ensayo de TLR5 como se describe en el Ejemplo 1.

• Procedimiento

El ensayo de activación de TLR5 se realizó con los siguientes tratamientos:

• FlaA MRx0518 recombinante purificado a concentraciones de 5, 1,0,2, 0,04 y 0,008 ng/ml

• FlaA DSM100110 recombinante purificado a concentraciones de 5, 1,0,2, 0,04 y 0,008 ng/ml

Se realizó un control negativo con un vehículo FLA a una concentración de 5 ng/ml y se realizó un control positivo con FLA-ST ultrapuro a una concentración de 20 ng/ml. Para cada tratamiento se realizaron tres repeticiones.

Conclusiones

Tanto FlaA Rx0518 como FlaADSM100110 recombinantes pueden activar las respuestas de TLR5. La Figura 10compara la activación de TLR5 con diferentes dosis de FlaAMRx0518 y FlaADSM100110 recombinantes con los tratamientos descritos en los ejemplos 3 y 4. A una concentración de 5 ng/ml, ambas proteínas de flagelina recombinantes pueden producir una respuesta de TLR5 superior a la producida por el agonista de TLR5 FLA-ST bien conocido usándose a una concentración más alta (20 ng/ml). Estos datos muestran que los polipéptidos de flagelina de la especie Enterococcus gallinarum son más eficaces para activar una respuesta de TLR5 que S.

typhimurium. Se sabe que los polipéptidos de flagelina de S. typhimurium suprimen el crecimiento tumoral a través de la activación de TLR5. Por lo tanto, estos datos sugieren que los polipéptidos de flagelina de Enterococcus gallinarum son más eficaces que los polipéptidos de flagelina de S. typhimurium para tratar o prevenir el cáncer.

FlaAMRx0518 y FlaADSM100110 tienen diferentes perfiles inmunoestimuladores. En concentraciones de 1 ng/ml y 0,2 ng/ml, FlaAMRx0518 produce una respuesta de TLR5 aproximadamente cinco veces más potente que FlaADSM100110. Tanto MRx0518 como DSM100110 son cepas estrechamente relacionadas. Ambas son cepas flageladas de Enterococcus gallinarum, sin embargo, expresan flagelinas fundamentalmente diferentes que tienen diferentes perfiles inmunoestimuladores. El sorprendente descubrimiento de que FlaAMRx0518 es un potente activador de TLR5 muestra que este polipéptido de flagelina es particularmente eficaz para tratar o prevenir el cáncer.

Estos ejemplos demuestran que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son agonistas de TLR5. Los agonistas de TLR5 se han implicado en el tratamiento de linfomas de células T y B. Por lo tanto, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus pueden ser particularmente eficaces para tratar o prevenir los linfomas de células T y B.

Se ha demostrado que la activación de TLR5 mejora el daño tisular inducido por la radiación. Los ejemplos muestran que los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus son fuertes activadores de la respuesta de TLR5. Por lo tanto, los polipéptidos de flagelina del género Enterococcus, y en particular de la especie Enterococcus gallinarum, pueden ser particularmente eficaces para mejorar el daño tisular inducido por radiación.

Ejemplo 5 - Producción de mutante MRx0518 flaA- Resumen

Se creó un mutante de inserción de NlRx0518 que alteró el gen de la flagelina.

Condiciones experimentales

Se clonó un fragmento interno de flaA en el vector pORI19 (repA-). Los vectores resultantes //aAMRxü518intpORI19 se transformaron en MRx0518 y el inserto se integró en el genoma bacteriano usando recombinación homóloga (ver la Figura 13).

Se seleccionaron las colonias positivas para detectar la presencia del gen em y usando PCR y se confirmaron adicionalmente mediante secuenciación. El análisis fenotípico de los mutantes usando ensayos de motilidad también confirmó el mutante de inserción MRx0518 flaA-. El inserto contiene resistencia a la eritromicina del vector pORI19. La Figura 11 muestra que el mutante MRx0518 flaA- no es móvil en agar de motilidad BBL complementado con 20 pg/ml de eritromicina en comparación con el tipo salvaje.

Ejemplo 6 - La activación de TLR5 se elimina en el mutante de MRx0518

Resumen

Se probó la capacidad de CFS del mutante de MRx0518 flaA- para activar una respuesta de TLR5.

Ensayo de activación de TLR5

Se realizó un ensayo de TLR5 como se describe en el Ejemplo 1.

• Procedimiento

El ensayo de activación de TLR5 se realizó con los siguientes tratamientos a dos dosificaciones: 10:1 y 100:1:

- MRx0518-CFS

- MRx0518 /laA--SFC

Los controles positivos se realizaron con FLA-ST ultrapuro a concentraciones de 5 ng/ml y 20 ng/ml. Se realizó un control negativo con YFCA a dos dosificaciones: 10:1 y 100:1. Para todos los tratamientos se realizaron tres repeticiones.

Conclusiones

La capacidad de MRx0518-CFS para estimular una respuesta de TLR5 se eliminó en el mutante MRx0518 /laA -(Figura 12). Estos datos muestran que el polipéptido de flagelina es esencial para la activación de la respuesta de TLR5 por MRx0518-CFS.

Ejemplo 7 - Caracterización de MRx0518

Resumen

La morfología de las bacterias, como el tamaño, la presencia o ausencia de fimbras/flagelos/pilli, o la presencia de matriz extracelular, influyen tanto en la motilidad como en la adherencia y, por lo tanto, son importantes en la caracterización de las bacterias.

Los cultivos de MRx0518 se examinaron a nivel de microscopio electrónico (barrido y transmisión) para permitir la visualización de la estructura de las bacterias a una resolución y aumento más altos que los permitidos porlos métodos convencionales de microscopía óptica.

Metodología

• Microscopía Electrónica de Transmisión

Se recibió una alícuota de cultivo bacteriano MRx0518 en fase exponencial directamente de una campana anaeróbica en un Eppendorf sellado. Los cultivos se fijaron en glutaraldehído al 2,5%, cacodilato de Na 0,1 M, pH 7,2, recién preparado y enfriado con hielo. El Eppendorf se invirtió suavemente varias veces antes de colocarlo en hielo y dejar que se fijara durante 3-5 minutos. Después de la fijación, las bacterias se centrifugaron brevemente para sedimentar y se volvieron a suspender en agua mili pura. Usando una pipeta de vidrio, se aplicó una gota del cultivo fijado a rejillas Cu de 300mesh recubiertas con Formvar. Se permitió que las bacterias se sedimentasen y se adsorbieran durante aproximadamente 1-2 minutos y el exceso de solución se eliminó de la rejilla usando papel de filtro Whatman N° 3. Se aplicaron 10 pl de acetato de uranilo al 2% a la rejilla durante unos segundos y se eliminaron por acción capilar usando papel de filtro como antes. Se dejó que las rejillas se secasen completamente antes de ser examinadas en un Philips CM100 TEM a kV variable.

• Microscopía electrónica de barrido

Se tomó una alícuota del mismo cultivo que anters para el análisis SEM. Las bacterias se fijaron como antes pero no se sedimentaron. Se pretrataron FILTROS SPI PORE (25 mm de diámetro, tamaño de poro de 0,2 um) con polilisina al 0,01% inmediatamente antes de empujar las bacterias fijadas usando una jeringuilla Luer-Lok en el filtro. A esto le siguió empujar suavemente 1 ml de agua milipura a través del filtro. Los filtros se cortaron a medida y se deshidrataron a través de una serie de soluciones de etanol (50%, 70%, 90% y 3x 100%). Luego, los filtros se sumergieron secuencialmente a través de concentraciones crecientes de hexametildisilazano (HMDS 25%, 50%, 75% en etanol) con el paso final de deshidratación llevado a cabo usando 100% HMDS. Esto se dejó evaporar durante la noche. Los filtros se secaron al punto crítico y se recubrieron con 10nm de oro paladio antes de examinarlos en un microscopio de electrones de barrido Zeiss EVO MA10.

Conclusiones

Ambos métodos de visualización a nivel de microscopio electrónico mostraron que MRx0518 tiene flagelos (Figura 14). Tanto el análisis TEM como el SEM mostraron que MRx0518 tenía flagelos (flechas blancas continuas). El tamaño de la célula varió entre 1-2 pm. La presencia de vesículas de la membrana exterior solo fue evidente en las imágenes SEM de MRx0518. La imagen SEM muestra lo que parecen ser vesículas de la membrana exterior (flecha blanca discontinua).

Ejemplo 8 - Activación de TLR5 murino por proteínas de flagelina recombinantes de las cepas MRx0518 y DSM 100110 de Enterococcus gallinarum

Resumen

MRx0518 es una cepa bacteriana aislada de una muestra humana, mientras que DSM 100110 es de origen murino. Se probó la capacidad de las proteínas de flagelina recombinantes de las cepas MRx0518 y DSM 100110 de Enterococcus gallinarum para activar TLR5 murino.

Metodología

Se produjeron MRx0518 recombinante purificado (FIÍC^mrx0518) y DSM 100110 (FIÍC^dsm100110) como se describe en el Ejemplo 4.

Se realizó un ensayo de TLR5 como se describe en el Ejemplo 1. El ensayo de activación de TLR5 se realizó con los siguientes tratamientos:

- FIÍC^mrx0518 recombinante purificado a concentraciones de 5, 1,0,2, 0,04 y 0,008 ng/ml

- FIÍCDSM100110 recombinante purificado a concentraciones de 5, 1, 0,2, 0,04 y 0,008 ng/ml. Se realizaron tres repeticiones independientes.

Conclusiones

Tanto FIÍC^mrx0518 como FIÍCDSM100110 activaron TLR5 murino y no hubo diferencia en los niveles de activación entre FIÍC^mrx0518 y FIÍCDSM100110 a cualquier dosis (Figura 15). Este efecto es diferente a los resultados observados para la activación de TLR5 humano por FIÍC^mrx0518 y FIÍCDSM100110. Como se muestra en el Ejemplo 4, Figura 10, FIÍC^mrx0518 puede estimular el TLR5 humano a niveles mayores que FIÍCDSM100110 a concentraciones de 1 ng/ml e inferiores. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, los diferentes perfiles de activación de TLR5 humano y murino por proteínas de flagelina recombinantes de diferentes cepas de Enterococcus gallinarum pueden deberse a diferencias de secuencia entre FIÍC^mrx0518 y FIÍCDSM100110, así como a la variabilidad del sitio de unión entre TLR5 humano y murino..

Como se muestra en la Figura 3, los inventores han notado que la mayor parte de la variación de secuencia entre diferentes polipéptidos de flagelina se observa en la región D2-D3. Una alineación de secuencias de FIÍCmrx0518 y FIÍCDSM100110 muestra una gran variación en el dominio D2-D3 (Figura 16). La alineación se realizó usando el software de alineación de secuencias múltiples CLUTAL OMEGA v1.2.4.

Ejemplo 9 - Capacidad inmunoestimuladora de cepas motiles de E. gallinarum y E. casseliflavus derivadas de humanos

Resumen

Se evaluó la capacidad de cepas de E. gallinarum y E . casseliflavus motiles derivadas de humanos para activar TLR5 humano in vitro.

Metodología

• Cepas bacterianas probadas

Las cepas de MRX y de prueba se aislaron de uno de los cuatro donantes de la colección de cultivos de 4D Pharma (números de donantes F00, F14, F19 y F22).

• Condiciones del ensayo TLR5

Las cepas bacterianas se cultivaron en caldo YCFA (E&O Laboratories, Bonnybridge, Escocia, Reino Unido) hasta que alcanzaron la fase de crecimiento estacionario. Las células y los sobrenadantes se separaron por centrifugación a 5000 x g durante 5 min. Los sobrenadantes se pasaron a través de un filtro de 0,22 gm y se diluyeron en agua.

Se cultivaron células HEK-Blue™-hTLR5 (InvivoGen, San Diego, CA, USA) de manera rutinaria en DMEM suplementado con FBS al 10%, L-glutamina 4 mM, 4,5 mg/ml de glucosa, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 100 pg/ml de Normocin™ (InvivoGen), 30 pg/ml de blastocidina (InvivoGen) y 100 pg/ml de zeocina (InvivoGen) al 90% de densidad. Las líneas celulares se cultivaron a 37° C y 5% de CO2. Todos los reactivos fueron suministrados por Sigma-Aldrich, Gillingham, Inglaterra, Reino Unido, a menos que se indique lo contrario.

Para los cocultivos, las células que crecieron hasta una densidad del 90% se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich) y se volvieron a suspender en medios de cultivo sin antibiótico a una densidad de 140 000 células/ml. Se añadieron sobrenadantes a las células a una multiplicidad de infección (MOI) equivalente a 100:1. El control positivo del ensayo, flagelina de Salmonella Typhimurium (FLA-ST) (InvivoGen), se usó a 20 ng/ml. Las células se incubaron con los sobrenadantes a 37° C en una atmósfera con un 5% de CO2 durante 22 h. Se añadió QUANTI-Blue™ (InvivoGen), las placas se incubaron durante 2 horas adicionales y se registró la densidad óptica a 655 nm. Se realizaron tres repeticiones biológicas independientes para todas las cepas.

Los datos en la Figura 18 representan tres repeticiones independientes.

Conclusiones

Todos los sobrenadantes de las cepas de E. gallinarum y E. casseliflavus probadas pudieron activar potentemente una respuesta de TLR5 en comparación con el control no tratado. De las tres cepas de E. casseliflavus analizadas, se descubrió que la Prueba 6 activa fuertemente una respuesta de TLR5, mientras que la Prueba 5 y DSM25781 provocan respuestas de TLR5 menos potentes.

Ejemplo 10 - Activación de NF-^k B por MRx518

Se investigó la capacidad de la cepa bacteriana MRx0518 para activar NF-kB. Los resultados se presentan en la Figura 18. El sobrenadante de MRx0518 fue el activador más potente de NF-^kB. La activación de NF-^kB se eliminó después del tratamiento con tripsina.

Estos datos muestran que la flagelina del género Enterococcus y en particular de MRx0518 produce una respuesta de NF-kB muy fuerte y, por lo tanto, puede ser útil en terapia.

Ejemplo 11 - Diferenciación de células T

Se exploró in vitro la capacidad de MRx0518 para inducir la diferenciación de células T en células mononucleares de sangre periférica (PBMC, Stemcell, Cat: 70025).

Metodología

Las PBMC se sembraron en placas de 96 pocillos sembradas con anti-CD3 (Ebioscience, anticuerpo monoclonal CD3 (clon OKT3), grado funcional, N° de cat. 16-0037-81) a 400.000/pocillo en 50 pl de medio cRPMI por pocillo (cRPMI contiene RpMI 1640 (+L-Glut, 21875-034) concentración final de 2 mM Stock 200 mM, 10% de HIFBS (Gibco life technologies, 10082-147), 50 pm de mercaptoetanol (Gibco life technologies, 21985-023) y 1% de pen/estrep (P4333, 10 mg/ml). Luego, se añadió sobrenadante de MRx518 a cada pocillo, 4.000.000 en 100 pl/pocillo. Los sobrenadantes se pasaron a través de un filtro de 0,22 pm y se diluyeron apropiadamente en cocultivo.

Después de 3 días en una incubadora a 37° C, las células se extrajeron y se volvieron a suspendern en un medio que contenía PMA-(Sigma, N° de Cat. P8139), Ionomicina (Sigma, N° de Cat 13909) y GolgiSTOP (BD, N° de Cat. 554724).) durante 5 horas. El stock de PMA era de 1 mg/ml en DMSO que se diluyó adicionalmente en 100 ug/ml (cada muestra requirió 50 ng/ml en cRPMI), el stock de ionomicina era de 1 mM en DMSO (se usó 1 pM en cRPMI) y la concentración de GolgiStop se usó a 4 pl/6 ml.

Luego, las células se sometieron a una tinción de citometría de flujo:

después del lavado, las células se incubaron con colorante fijable Viobility 405/520 de Miltenyi biotec (1 pl/muestra) bloque Fc humano, cat. 564219 (1 pl/muestra) en PBS durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Luego se añadieron los anticuerpos de superficie (2 pl de cada uno) directamente a los pocillos durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente - CD3-ApC-Vio 770 (Miltenyi, N° de cat. 130-113-136), CD4-VioBlue (Miltenyi, N° de catálogo 130-114-534) y CD25-VioBright FITC (Miltenyi, N° de catálogo 130-113-283). Luego las células se lavaron dos veces en PBS y se centrifugaron a 300 g/5 min/TA.

Luego, se usó el tampón de tinción del factor de transcripción FoxP3 de eBioscience para fijar y permeabilizar las células (N° de cat. 00-5523). Siguiendo el protocolo de eBioscience, se preparó un tampón permanente/fijo usando concentrado 1x y diluyente 3. Las células se fijaron durante 1 h a TA y luego se lavaron 2x en 1 x lavado Perm y se centrifugaron a 300 g/5min/TA. Se añadieron los siguientes anticuerpos de factor de transcripción o tinción intracelular a las muestras en lavado perm (1x) durante 45 ml/oscuridad/TA o en el refrigerador durante la noche (hasta 18 h), seguido de lavado de los anticuerpos 2x usando lavado Perm (300 gl) y resuspensión en PBS (250gl) para adquirir en el citómetro:

• Anticuerpos humanos anti IFNy-PE Vio770 (Miltenyi, N° de cat. 130-114-025)

• Anticuerpos humanos anti IL10-PE (Miltenyi, N° de cat. 130-112-728)

• Anticuerpos humanos anti IL17a-APC (Miltenyi, N° de cat. 130-099-202)

• Anticuerpos humanos anti RoRyt-PE (Miltenyi, N° de cat. 130-103-837)

• Anticuerpos humanos anti Tbet-APC (Miltenyi, N° de cat. 130-098-655

• Anticuerpo monoclonal Foxp3 (236A/E7), Pe cy7 (ebioscience) N° de cat. 25-4777-41

s

Conclusiones

Como puede verse en la Figura 19, el sobrenadante de MRx518 (SP 518) puede inducir la diferenciación de células T auxiliares y células T citotóxicas.

Ejemplo 12 - Generación de un mutante de inserción génica de flagelina de MRx0518 de E. gallinarum Este ejemplo proporciona una estrategia alternativa para inactivar el gen de la flagelina en comparación con el Ejemplo 5. El gen fliC fue alterado por la inserción impulsada por homología del plásmido suicida pORI19 (ver Figura 20). La inserción de pORI19 dentro del gen fliC se confirmó mediante secuenciación de ADN y el fenotipo no motil de la cepa mutante resultante se confirmó in vitro.

Metodología

El mutante de inserción de flagelina se creó usando el plásmido no replicativo pORI19 (Emr repA-Ori+; vector de clonación [118]). Se amplificó un fragmento interno del gen fliC de MRx0518 de E. gallinarum usando los cebadores DC020 (SEQ ID NO: 43: CCCGGGGGATCCGCGGTAAATGTTGCTAAAGCATCATCG) y DC021 (SEQ ID NO: 44: ACGACGGTCGACCCACAGCATCTTAGGGCGTATGCG) y se clonó en pORI19. Se usaron enzimas de restricción y Quick Ligasa (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este constructo se propagó en E. coli EC101 por transformación química [118] y se aisló usando el kit Genopure Plasmid Maxi (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) a partir de un cultivo de 500 ml. El ADN del plásmido aislado se concentró usando acetato de sodio 0,3 M pH 5,2 y etanol hasta 20 gl.

Las células electrocompetentes se generaron con éxito cultivando cultivos bacterianos en concentraciones subinhibidoras de glicina seguido de tratamientos con mutanolisina y lisozima para debilitar aún más la capa de peptidoglicano de la pared celular. Se desarrolló un protocolo para preparar células electrocompetentes de MRx0518 de E. gallinarum, que se adaptó de un método publicado con anterioridad [119]. En resumen, se cultivó MRx0518 de E. gallinarum durante 18 h en caldo GM17, suplementado con sacarosa 0,5 M y glicina al 3% (p/v) (Sigma-Aldrich). Luego, las células se lavaron dos veces con sacarosa 0,5 M y glicerol al 10% (v/v) y se trataron con 10 gg/ml de lisozima y 10 U/ml de mutanolisina (Sigma-Aldrich) durante 30 min a 37°C. Luego las células de MRx0518 de E. gallinarum se transformaron mediante electroporación con 10 gg de ADN plasmídico y se recuperaron en caldo BHI antes de sembrarlas en agar BHI selectivo. Las colonias positivas se seleccionaron para determinar la presencia del gen em usando los cebadores DC047 (SEQ ID NO: 45: CCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAACGAG) y DC048 (SEQ ID NO: 46: GATGCAGTTTATGCATCCCTTAAC). La inserción del plásmido se confirmó para transformantes con éxito mediante amplificación y secuenciación por PCR (GATC Biotech, Konstanz, Alemania) usando los cebadores DC013 (SEQ ID NO: 47: CCGAT AAAT AGT AGCAGAGGGAAACC) y DC014 (SEQ ID NO: 48: GGCTGAATATCCATCAGAGCTTCCTC).

La motilidad in vitro del mutante de inserción de flagelina se evaluó usando medio de prueba de motilidad BBL™ suplementado con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio al 0,005% (p/v) (BD, Sparks, MD, USA). En resumen, se inoculó con bastones una colonia fresca en 20 ml de medio equilibrado y se incubó durante 48 h a 37° C en condiciones anaeróbicas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Secuencias

SEQ ID NO: 1 -Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx0518

SEQ ID NO:2-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum DSM100110 SEQ ID NO:3-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx0554 SEQ ID NO: 4-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx0556 SEQ ID NO:5-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx1548 SEQ ID NO: 6-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx1650 SEQ ID NO:7-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx1763 SEQ ID NO:8-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx1766 SEQ ID NO: 9-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx1775 SEQ ID NO:10-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx1886 SEQ ID NO:11 -Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum 2A8

SEQ ID NO:12-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum 9402

SEQ ID NO:13-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum A6981 SEQ ID NO:14-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum MRx1649 SEQ ID NO:15-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum EG2

SEQ ID NO:16-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum SKF1

SEQ ID NO: 17-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus DSM 7370 SEQ ID NO:18-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus 1a6A SEQ ID NO:19-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus 3hl0B SEQ ID NO:20-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus 14-MB-W-14 SEQ ID NO:21-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus ATCC12755 SEQ ID NO:22-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus DSM4841 SEQ ID NO:23-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus DSM20680 SEQ ID NO:24-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus EC10 SEQ ID NO:25-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus EC20 SEQ ID NO:26-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus EC30 SEQ ID NO:27-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus F1129 SEQ ID NO:28-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus F1129F 46 SEQ ID NO:29-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus NBRC 100478 SEQ ID NO:30-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus PAVET15 SEQ ID NO:31-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus NLAE-zl-G268 SEQ ID NO:32-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus NLAE-zl-C414 SEQ ID NO:33-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum FDAARGOS-163 SEQ ID NO:34-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus MRx0858 SEQ ID NO:35-Polipéptido de flagelina de Enterococcus casseliflavus DSM25781 SEQ ID NO:36-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum DSM28564 SEQ ID NO:37-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum DSM28565 SEQ ID NO:38-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum F1213F 228 SEQ ID NO:39-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum DSM20718 SEQ ID NO:40-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum DSM20628 SEQ ID NO:41-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum NBRC100675 SEQ ID NO: 42-Polipéptido de flagelina de Enterococcus gallinarum DSM24841

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Claims (15)

R E IV IN D IC A C IO N E S

1. Un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en terapia.

2. El polipéptido de flagelina para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

a) el polipéptido de flagelina es de la especie Enterococcus gallinarum; y/o

b) el polipéptido de flagelina es de la cepa depositada en NCIMB con el número de registro NCIMB 42488; y/o c) el polipéptido de flagelina no contiene un dominio D3; y/o

d) el polipéptido de flagelina está en forma monomérica; y/o

e) el polipéptido de flagelina contiene un sitio de reconocimiento de TLR5 que es por lo menos un 99%, 99,5% o 99,9% idéntico a los residuos 87-96 y 290-295 en la SEQ ID NO: 1; y/o

f) el polipéptido de flagelina es parte de un ensamblaje flagelar bacteriano.

3. El polipéptido de flagelina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido de flagelina:

(a) tiene por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, o

(b) tiene por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2, o

(c) tiene por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 3-42, opcionalmente en donde el polipéptido de flagelina tiene una secuencia con por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO: 3-16; o

(d) en donde el polipéptido de flagelina comprende la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2.

4. Un fragmento de un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en terapia, en donde el fragmento comprende los aminoácidos 87-96, 165-272 y 290-295 de la SEQ ID NO:1; opcionalmente en donde a) el fragmento comprende los aminoácidos 2-32, 87-96, 165-272, 234-358, 290-295 de la SEQ ID NO: 1; y/o b) el fragmento tiene una longitud de por lo menos 200, 250, 300 o 350 aminoácidos; y/o

c) el fragmento tiene por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1; y/o

d) el polipéptido de flagelina se define de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. El polipéptido de flagelina para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, conjugado con un antígeno, como un antígeno patogénico o un antígeno tumoral.

6. Un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de flagelina para su uso en terapia, en donde el polipéptido de flagelina se define de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5; en donde el polipéptido de fusión comprende opcionalmente un antígeno, como un antígeno patogénico o un antígeno tumoral.

7. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento de un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, en donde el fragmento

a) comprende los aminoácidos 87-96, 165-272 y 290-295 de la SEQ ID NO:1 y uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables; o

b) comprende los aminoácidos 2-32, 87-96, 165-272, 234-358, 290-295 de la SEQ ID NO: 1 y uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

8. El fragmento de un polipéptido de flagelina o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

a) el polipéptido es parte de un ensamblaje flagelar bacteriano; y/o

b) el polipéptido comprende adicionalmente uno o más antígenos.

9. Una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en terapia; opcionalmente en donde el polipéptido de flagelina se define de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5; opcionalmente además donde la secuencia de polipéptidos codificada tiene por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, o es la SEQ ID NO:1.

10. Una célula huésped

a) que expresa un polipéptido de flagelina recombinante del género Enterococcus, para su uso en terapia; o b) que comprende una secuencia de polinucleótidos recombinante que codifica un polipéptido de flagelina del género Enterococcus, para su uso en terapia;

opcionalmente en donde el polipéptido de flagelina se define de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-9.

11. Un vector o plásmido que comprende una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 9.

12. Una célula huésped que comprende el vector o plásmido de la reivindicación 11; opcionalmente en donde la célula huésped expresa adicionalmente un antígeno heterólogo, como un antígeno patogénico o un antígeno tumoral.

13. Una composición para su uso en terapia, en donde la composición comprende un polipéptido de flagelina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un fragmento de un polipéptido de flagelina de acuerdo con la reivindicación 5, un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 10, una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 y 13, o un vector de acuerdo con la reivindicación 12.

14. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer; opcionalmente en donde

a) la composición es para su uso en el tratamiento de tumores inmunogénicos; y/o

b) la composición es para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de hígado o cáncer de colon; y/o

c) la composición es para su uso en un método para reducir el tamaño del tumor, reducir el crecimiento del tumor, prevenir la metástasis o prevenir la angiogénesis

15. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 14,

a) para su uso en el tratamiento, prevención o retraso de la inmunosenescencia; o

b) para su uso como adyuvante de vacunas; o

c) para su uso en la mejora de una terapia celular, como CAR-T

opcionalmente en donde

i) la composición aumenta el nivel y/o la actividad de NF-^kB; y/o

ii) la composición es para administración oral; y/o

iii) la composición comprende uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.