CN102046198A

CN102046198A - 鞭毛蛋白多肽疫苗

Info

Publication number: CN102046198A
Application number: CN2009801201236A
Authority: CN
Inventors: A·A·阿德瑞姆; A·H·德克斯; E·A·缪; C·M·罗森伯格
Original assignee: SYSTEMS BIOLOGY INSTITUTE
Current assignee: SYSTEMS BIOLOGY INSTITUTE
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2009-04-24
Publication date: 2011-05-04
Also published as: EP2278994A2; JP2011519834A; WO2009130618A3; WO2009130618A2; BRPI0911604A2; US20090297552A1; EP2278994A4

Abstract

包含或生成能够在胞内和胞外刺激先天免疫应答的免疫调节鞭毛蛋白多肽的疫苗采用包含该类多肽表达系统的病毒、细菌或寄生细胞，以及包含抗原和/或细胞穿透肽连同免疫调节肽的融合蛋白。

Description

鞭毛蛋白多肽疫苗

通过EFS-WEB提交的序列表的引用

按照专利审查程序手册(MPEP)§1730II.B.2(a)(C)批准说明，通过美国专利商标局(USPTO)EFS-WEB服务器电子提交的以下序列表全部内容通过引用全文纳入本文以用于所有目的。序列表根据电子提交文本文件鉴定如下：

技术领域

本发明涉及提供鞭毛蛋白多肽以便刺激先天免疫应答的疫苗。所述鞭毛蛋白多肽可单独使用或与抗原联用以引发适应性免疫应答。

背景技术

鞭毛蛋白是约500个氨基酸的单体蛋白质，其聚合形成与细菌运动相关的鞭毛。鞭毛是通过类似螺旋桨的旋转赋予细菌运动性的鞭状结构。这些结构是由鞭毛蛋白组成的聚合物，通过基础小体和钩状体结构锚定到细菌细胞壁上。术语“鞭毛蛋白”指聚合形成丝状体的单体亚基，而术语“鞭毛”更常指丝状体、基础小体或钩状体的任何组分。

鞭毛基因表达受到严格调控，钩状体和基础小体(HBB)基因首先表达，最终的鞭毛组分仅在HBB装配完全时才表达。鞭毛基因分为三种转录类型。I类基因包括主转录调控蛋白FlhC/FlhD。II类基因编码基础小体和钩状体，还包括转录激活蛋白FliA和FliA的阻抑蛋白FlgM。HBB完成后，阻抑蛋白FlgM经HBB被输出。这会消耗FlgM蛋白的细菌胞质溶胶，由此释放FliA，其与III类基因启动子结合，激活III类基因的转录。III类基因编码钩状体-丝状体衔接头、帽、发动蛋白、化感系统和聚合形成鞭毛丝状体的鞭毛蛋白。

通过位于HBB中的III型分泌系统(T3SS)输出鞭毛蛋白，该分泌系统与转运毒力因子的其它T3SS在进化上相关。该分泌机构形成跨越内膜、壁膜间隙和外膜的单一结构，终止于细菌细胞壁外表面的钩状体结构。鞭毛蛋白经HBB的中空核心被输出，最多30,000个鞭毛蛋白亚基在钩状体末端进行装配。

来自各类细菌的鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：23所示。编码所列鞭毛蛋白多肽的核苷酸序列还在NCBI GenBank数据库中公开可得。其中，已知来自鼠伤寒沙门氏菌I(S.Typhimurium 1)、幽门螺杆菌(H.Pylori)、霍乱弧菌(V.Cholera)、粘质沙雷氏菌(S.marcesens)、福氏痢疾杆菌(S.flexneri)、梅毒螺旋体(T.Pallidum)、嗜肺军团菌(L.pneumophila)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferei)、艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、根癌农杆菌(A.tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、卡氏巴尔通体(B.clarridgeiae)、奇异变形杆菌(P.Mirabilis)、枯草杆菌(B.subtilus)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)的鞭毛蛋白序列。

鞭毛蛋白单体的形状类似大写的希腊字母γ(Γ)，由结构域D0穿过D3形成。形成主干的D0和D1由串联的长α螺旋组成，在不同的细菌中高度保守。在单体发生层叠时，D0和D1埋于丝状体中心。Γ的顶部由D2和D3组成，这是两个高度可变的球状结构域，暴露在鞭毛丝状体的表面上，是抗体应答指向的结构域。然而，D2和D3结构域不参与引发先天免疫应答。

先天免疫应答分别由细胞表面的toll样受体(TLR)、细胞内的Nod-LRR蛋白(NLR)以及D1和D0区域介导。先天免疫应答包括对TLR(包括TLR5)激活作用起反应而生成细胞因子，以及对某些NLR(包括Ipaf)起反应而激活胱冬酶-1的和分泌IL-1β。该应答不依赖特异性抗原，但可作为抗原特异性适应性免疫应答的佐剂发挥作用。所述抗原可以疫苗或感染的形式由外部提供，或可来自本身，例如肿瘤相关抗原的情况。

2002年10月31日公开的PCT公布WO02/085933证明，鞭毛多肽能够通过与toll样受体5(TLR5)的相互作用刺激先天免疫应答。该受体展示于细胞表面上，与鞭毛蛋白多肽在胞外发生相互作用。2005年7月7日公开的美国专利公布2005/0147627注意到负责与TLR5相互作用的鞭毛蛋白区域仅发现于D1结构域。Smith，K.D.等，Nature Immunol.(2003)4：1247-1253公开了TLR5识别鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白上的一个位点，其由N末端残基78-129和135-173以及C末端残基395-444组成。

之后发现，胞质鞭毛蛋白激活胱冬酶1，并通过Ipaf实现白介素1β分泌，Ipaf也称为NLRC4。Miao，E.A.等，Nat.Immunol.(2006)7：569-575；Miao，E.A.等，Semin.Immunopathol.(2007)29：275-288。负责该激活作用的鞭毛蛋白区域似乎是嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)鞭毛蛋白D0区域C末端第441-475位的35个氨基酸，其足够激活由功能性NLR凋亡抑制蛋白5(Naip5)增强的NLRC4。Lightfield，K.L.等，Nature Immunol.(2008)9：1171-1178。

虽然这些多肽在疫苗中的用途已得到广泛描述，但未提示提供对鞭毛蛋白多肽的胞内和胞外两种应答的疫苗，也未描述对包含与所需抗原融合的免疫调节鞭毛蛋白多肽的融合肽。因此，本发明涉及改进采用鞭毛蛋白多肽引发先天免疫应答的疫苗。

在此背景部分和说明书全文中引用的任何文献均通过引用全文纳入本文，本文提到的肽/蛋白质的氨基酸和核苷酸序列和从出版物和公共数据库中可得的其相应ORF也是如此。

发明内容

本发明涉及采用能够引发基于胞外和胞内的两种先天免疫应答的鞭毛蛋白多肽的改进疫苗，以及包含由偶联于所需抗原和/或促进细胞摄取的序列的免疫调节鞭毛蛋白多肽组成的融合蛋白的疫苗。

由于细菌和病毒均能够侵入细胞，且由于细菌在具备信号序列时通过内源性分泌机制可有效地向预定感染的细胞中分泌鞭毛蛋白，本发明包括基于含有基因构建体以便产生鞭毛蛋白多肽的修饰病毒和细菌的疫苗。此外，细胞蛋白转染介质，如李斯特菌溶胞素O和其它转染试剂如tat蛋白和蜂毒肽提供将鞭毛蛋白递送到胞质中的手段。最后一种方法在Amer，A.等，J.Biol.Chem.(2006)281：35217-35223；Franchi，L.等，Nat.Immunol.(2006)7：576-582；Miao，E.A.等，Nat.Immunol.(2006)7：569-575；Molofsky，A.B.等，J.Exp.Med.(2006)203：1093-1104和Wren，T.等，PLoS Pathog(2006)2：e18的体外研究中有描述。本发明还包括提供药学上可接受的转染试剂的蛋白质疫苗。

因此，在一个方面，本发明涉及包含重组构建体以便产生鞭毛蛋白多肽的组合物，所述鞭毛蛋白多肽能够产生针对鞭毛蛋白多肽的胞外应答或针对鞭毛蛋白多肽的胞内应答或两种应答。在该通用概念内可预计有各种替代实施方式。

在一个实施方式中，将编码鞭毛蛋白多肽D0或D1或该两个区域的核苷酸序列插入减毒病毒如流感病毒的基因组中。该实施方式中包括：仅靶向胞内受体的疫苗，其中所述核苷酸序列可仅编码鞭毛蛋白单体的D0区域，仅编码激活外部受体的D1区域或编码D0和D1两个区域从而激活两种受体的实施方式。

在另一个实施方式中，采用具有编码鞭毛蛋白单体D1和/或D0或两个区域的核苷酸序列的减毒细菌菌株，所述核苷酸序列包含于在染色体外或基因组内操作的表达系统中。也可采用真核寄生虫细胞。

在第三个实施方式中，相关鞭毛蛋白单体与无毒转染试剂一起给予，二者可采用独立部分或融合蛋白的形式。

在另外一个实施方式中，鞭毛蛋白多肽的相关部分与所需抗原偶联。该实施方式也包含D0和/或D1区域。

其它方面是处理或降低哺乳动物中致病性感染或疾病风险的方法，包括给予哺乳动物本发明的组合物。

附图简要说明

图1A和图1B显示包含来自pWSK29中SPI2调控启动子的FliC基因的修饰鼠伤寒沙门氏菌进行实验的结果。图1A显示这些修饰细胞产生鞭毛蛋白的能力，该能力通过野生型或缺乏Ipaf的巨噬细胞中IL-1b的分泌确定。图1B显示用这些细菌感染的野生型和Ipaf无效小鼠中脾脏和肝脏的细菌计数。

本发明的实施方式

本发明涉及活的或可复制的疫苗组合物以及使用该疫苗组合物的方法，包含例如，病毒、细菌或真核寄生生物，其中所述疫苗组合物包含编码和内源性表达免疫调节鞭毛蛋白多肽的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述活疫苗组合物是减毒的，使其可在哺乳动物中复制，并由此产生广泛有效的免疫应答，但通常不会造成致病性感染。

本文提供的免疫调节鞭毛蛋白多肽通常起到刺激和/或增强先天免疫应答的作用，由此刺激和/或增强适应性免疫应答(即体液和细胞介导的免疫应答)。增强的免疫应答引起免疫系统活性全面升高，导致外源或病理异常细胞的破坏，否则细胞可逃避免疫应答。在某些实施方式中，本发明的内源性表达鞭毛蛋白多肽刺激toll样受体5(TLR-5)和Ipaf，二者例如通过调控各种免疫调节细胞因子的表达和分泌介导先天免疫应答的某些方面。

定义

除非上下文另有明确表述，本申请中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。

“分离的”指基本或大致不含其在天然状态下通常伴有的组分的材料。

术语“复制活性”或“活的”通常指在宿主或宿主细胞中能够进行多于一轮分裂或扩增的病毒、细菌或寄生虫。例如，复制活性病毒通常能够在细胞群中(例如，在细胞培养物或生物体中)进行超出一轮感染的复制或扩增，如感染第一个细胞，在第一个细胞中产生一个或多个能够感染其它细胞的病毒颗粒，依此类推。活细菌通常能够进行多次细胞分裂，由此从一个亲细胞产生(多个)子细胞，后者通常进行进一步的细胞分裂。

术语“减毒的”通常指能够在宿主内复制或进行细胞分裂但对宿主不具显著致病性(即不引起显著“病理状况”)的病毒、细菌或寄生虫。在不利条件下培养所述微生物或病毒，导致其丧失毒力或致病性但保留诱导保护性免疫的能力，或通过去除会有利于微生物或病毒的发病或其毒力的某些非必需基因(例如，复制或细胞分裂非必需的基因)，由此可从活的微生物或病毒制备减毒疫苗。

术语“预防”或“预防的”或“预防性的”涉及在获得疾病或病理状况如微生物、病毒感染或癌症状况方面“降低风险”。术语“预防”不一定去除获得给定疾病或状况的所有风险。例如，接受“预防的”疫苗组合物的哺乳动物比未接受该“预防”疫苗组合物的哺乳动物获得特定疾病或状况的可能性较小，但仍可能获得所述疾病或状况。在某些情况中，尽管接受了“预防”疫苗给药但仍获得疾病或状况的哺乳动物仍比未接受所述预防疫苗的哺乳动物具有较少的毒性症状。

术语“治疗”包括对疾病或状况的症状或病理学产生的任何所需效果，甚至可包括所治疗疾病或状况的一个或多个可测量标记的最小降低量。“治疗”不一定表示所述疾病或状况或其相关症状的完全根除或治愈。接受该治疗的对象一般是需要治疗的任何动物，包括灵长类，特别是人，以及其它哺乳动物，如马、牛、猪和绵羊；以及家禽和宠物。

以下讨论描述了各种免疫调节鞭毛蛋白多肽和包含它们的融合蛋白。在很多情况中，重组产生这些多肽或融合蛋白，用于其产生的构建体是本发明的一部分。因此，对所述多肽或融合蛋白的描述同样适用于编码它们的核苷酸序列，反之亦然。也就是说，对多肽性质的描述也包括对编码它们的核苷酸序列的本质描述，对编码多肽或蛋白质的核苷酸序列的描述本质上描述了这些编码氨基酸序列的特征。因此，除非上下文有明确表示，对氨基酸序列的描述本质上也描述了其编码核苷酸序列，反之亦然。

本文提供的免疫调节鞭毛蛋白多肽通常发挥刺激先天免疫应答的作用，如上所述，其不仅可增强适应性免疫应答，还可提供独立于适应性免疫应答的有益的免疫相关应答。所述疫苗组合物包含编码免疫调节鞭毛蛋白多肽并指导其表达的核酸，由此刺激先天免疫应答的某些方面。例如，存在于感染细胞、细菌、寄生虫或病毒颗粒表面或通过分泌或细胞裂解被释放到胞外环境中的鞭毛蛋白多肽可与toll样受体分子发生相互作用和/或刺激该分子，toll样受体分子如toll样受体5存在于某些哺乳动物细胞包括免疫细胞和基质细胞的表面。或者，例如在用表达鞭毛蛋白的转基因病毒或细菌进行感染的过程中存在于哺乳动物细胞胞质溶胶中的鞭毛蛋白多肽可与细胞内Ipaf介导的信号传导途径发生相互作用和/或刺激该途径。在其它方面中，表达于本文提供的活疫苗环境中的鞭毛蛋白多肽可与TLR5和Ipaf介导途径发生相互作用和/或刺激二者，由此提供增强免疫应答的协同作用。

先天免疫细胞如巨噬细胞和树突细胞能够决定鞭毛蛋白是否留在哺乳动物细胞外面，或如果其进入胞质溶胶，鞭毛蛋白的Ipaf激活作用是否独立于TLR5激活作用发生。不想受任何理论的限制，本发明的某些实施方式提供能够激活Ipaf介导的免疫应答和TLR-5介导的免疫应答二者的优点。在说明中，先前的疫苗相关方法将外源产生、分离和纯化的鞭毛蛋白多肽用作疫苗佐剂。但直接给予分离的鞭毛蛋白多肽通常不一定允许这些多肽(至少以能够刺激Ipaf的功能完整形式)进入靶免疫细胞的胞质。由于Ipaf是一种胞内途径，将分离的外源鞭毛蛋白多肽直接给予哺乳动物通常不会刺激Ipaf介导的免疫应答，而是仅与细胞表面的TLR5分子发生相互作用和/或刺激该分子。相比之下，根据本发明某些实施方式给予的鞭毛蛋白多肽可在细胞内如在胞质中表达，或可通过细菌宿主注射到胞质中，因此不仅可例如在细胞裂解后释放鞭毛蛋白时刺激细胞表面上的TLR5分子，还可刺激胞内的Ipaf信号传导途径。

相比单次给予外源产生的鞭毛蛋白多肽，通过单次给予活疫苗试剂进行鞭毛蛋白多肽的胞内产生和扩增还提供增强和持续的免疫调节活性(即免疫应答)。该优点允许使用较小的初始疫苗剂量或较小的“免疫原性量”，不需重复给予外源鞭毛蛋白多肽或依赖大量外源产生和纯化的鞭毛蛋白。

由于鉴定免疫应答的方法为本领域熟知，因此不难确定疫苗组合物是否诱导先天、体液、细胞介导的免疫应答或这些类型免疫应答的任何组合。先天免疫应答检测通常可在给予疫苗后数小时或数天内完成。可通过测定已用疫苗组合物致敏的哺乳动物中抗原特异性抗体的效价或经ELIZA、Western印迹或其它熟知方法确定是否存在与抗原交叉反应的抗体来确定疫苗组合物或制剂诱导体液应答的能力。可通过例如采用多种本领域熟知的方法测定细胞毒性T细胞对抗原的应答来确定细胞介导的免疫应答。

免疫调节鞭毛蛋白多肽

本发明所有组合物均包含“免疫调节鞭毛蛋白多肽”。如本领域所理解，这些多肽是鞭毛蛋白单体的各部分或其确定的变体，实现包括TLR5介导的免疫应答、Ipaf介导的免疫应答或二者兼有的先天免疫应答。

通过与TLR5相互作用在胞外实现的该应答采用D1结构域的相关部分，包含所述蛋白质氨基和羧基结构域的毗邻残基，进一步定义如下。D1形成“γ”状鞭毛蛋白单体的茎干顶部和肘部。因此，设计为与TLR5相互作用的组合物至少包含D1结构域的有效部分。所述组合物可大致由该结构域的这些部分组成，或可由该结构域的这些部分组成。所述应答的胞内引发由D0结构域与Ipaf/NLRC4的相互作用产生。因此，设计为与Ipaf相互作用的组合物至少基本上包含所述D0结构域，即指所述单体羧基末端的约35个氨基酸。所述组合物可大致由该结构域组成，或可由该结构域组成。以上两种表述均指多肽/氨基酸水平上的这些结构域，以及相关编码核酸，根据特定构建体和方法所述核酸可以是RNA或DNA。

所述免疫调节鞭毛蛋白多肽可具有与天然鞭毛蛋白单体相关部分完全相同的氨基酸序列，或与这些序列发生无关紧要的偏差。一般来说，所述相关序列在细菌种属间具有保守性，从本文SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：23所显示的鞭毛蛋白全长序列中显而易见。可容忍取代特别是这些区域中非关键残基的取代，带有这类取代的这些区域的实施方式包括在本发明的范围内。通过鞭毛蛋白结合TLR-5或激活Ipaf的能力表示该免疫调节功能。

就TLR5激活作用而言，对参与序列进行了精确作图。所述识别位点需要来自所述蛋白质D1结构域内至少两段毗邻氨基酸的残基：1)残基88-114和2)残基411-431(刊于“鼠伤寒沙门氏菌FliC鞭毛蛋白”(Salmonella typhimurium FliC fiagellin)(Smith，Nature Immunology(2003)4：1247-1253(同上)))。这两个区域中，残基88-100具有特别强的保守性，可最佳地视作TLR5激活作用的特征。在88-100区域中的13个氨基酸内，允许在沙门氏菌鞭毛蛋白和仍保持TLR5激活作用的其它鞭毛蛋白之间存在至少6个取代(如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，其具有6个取代)，而包含8个不同于沙门氏菌的突变的序列(如幽门螺杆菌(Helicobacterpylori))则未检测到(E.Andersen-Nissen，PNAS(2005)102：9247-9252)。因此，免疫调节鞭毛蛋白单体包括类似鞭毛蛋白的序列，其激活TLR5，包含与沙门氏菌FliC 88-100序列具有53％或更高相同性的13个氨基酸的基序(LQRVRELAVQSAN)。该基序中的某些氨基酸不变，在保持TLR5激活作用时不能发生突变(Smith，2003，同上)。这些包括该TLR5激活基序中下划线标出的残基：LQRVRELAVQSAN。

未能良好测定激活Ipaf的鞭毛蛋白基序，但其位于所述鞭毛蛋白羧基末端的35个氨基酸中。在该区域内，在嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)FlaA鞭毛蛋白和鼠伤寒沙门氏菌FliC鞭毛蛋白之间存在15个取代，二者均通过Ipaf检测。因此，所述免疫调节鞭毛蛋白多肽包括类似鞭毛蛋白的免疫调节序列，其激活Ipaf，并包含与鼠伤寒沙门氏菌FliC鞭毛蛋白的羧基末端35个氨基酸(其序列为TEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR)具有至少57％相同性的35个氨基酸序列。

在替代的定义中，只要保留了免疫调节功能，且总氨基酸序列与至少一个特定的天然区域具有至少85％或95％(或97％或99％)相同性，天然细菌鞭毛蛋白单体序列的变体就包括在“免疫调节鞭毛蛋白多肽”的定义内。在该形式的免疫调节鞭毛蛋白多肽的定义中，所述D0区域对应于鼠伤寒沙门氏菌的35个C末端氨基酸，所述D1区域定义为对应于Smith(同上)所述的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的残基88-114和残基411-431。本领域已鉴定出不能取代的关键残基，具体见以上引用的公开的美国专利申请2005/0147627，在以上同样引用的Smith，K.D.等，Nat.Immunol.(2003)4：1247-1253中也有描述。因此，所述免疫调节鞭毛蛋白多肽相关区域中氨基酸序列的结构功能关系是本领域所了解的。

可采用已结合到ALIGN程序(版本2.0)的Meyers和W.Miller(Cabios(1989)4：11-17)中的算法确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的相同性百分比，采用PAM120权重残基表，缺口长度罚分12，缺口罚分4。

也可按照编码本发明免疫调节鞭毛蛋白多肽的核苷酸序列定义所述多肽。因此，本发明的免疫调节鞭毛蛋白多肽包括由在特定严谨性条件下与编码SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：23所示天然鞭毛蛋白的D0和/或D1区域中任何区域的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，其中D0和D1区域如以上定义。因此，所述鞭毛蛋白多肽包括由在中等严谨性或高严谨性条件下与这些参比鞭毛蛋白核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽。进行杂交反应的指导可参见Ausubel等(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6节。中等严谨性指在约45℃于6×SSC中杂交，之后在60℃于0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。高严谨性指在约45℃于6×SSC中杂交，之后在65℃于0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。

在一些实施方式中，鞭毛蛋白多肽由在“非常高”严谨性条件下与公开的核苷酸序列杂交的多核苷酸编码，所述“非常高”严谨性条件指在约65℃于0.5M磷酸钠，7％SDS中杂交，之后在65℃于0.2×SSC，1％SDS中洗涤一次或多次。

融合蛋白

本发明还包括利用鞭毛蛋白嵌合或融合蛋白以在哺乳动物中产生免疫应答。本文所用的鞭毛蛋白“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与非鞭毛蛋白多肽连接的鞭毛蛋白多肽。“非鞭毛蛋白多肽”指具有对应于不同于鞭毛蛋白，来自同一或不同生物体的蛋白质的氨基酸序列的多肽。所述融合蛋白的鞭毛蛋白多肽可对应于鞭毛蛋白氨基酸序列的全部或免疫调节部分，例如本文所述的片段。鞭毛蛋白融合蛋白至少包含鞭毛蛋白D0或D1区域或二者的相关部分。非鞭毛蛋白多肽可融合到鞭毛蛋白多肽的N末端或C末端。

所述融合蛋白可包含具有高配体亲和力的部分或接头序列。例如，所述融合蛋白可以是GST-鞭毛蛋白融合蛋白，其中鞭毛蛋白序列融合到GST序列的C末端或本领域技术人员已知的一个或多个不同的表位标签。鞭毛蛋白多肽可融合到来自GSK3b的表位或流感HA表位，或融合到同时包含来自GSK3b的表位和流感HA表位的双表位标签，其被单克隆抗体HA.11所识别，即融合到氨基酸序列MSGRPRTTSFAESLDYPYDVPDYA。可去除鞭毛蛋白的D2和D3结构域并用接头结构域代替，使D1(如果需要包括D0)结构域的氨基和羧基末端区段通过接头结构域桥连。所述接头结构域可包含任何功能性异源多肽序列。这样的融合或嵌合蛋白可促进鉴定疫苗组合物环境内的鞭毛蛋白，可有利于蛋白质折叠和稳定性。

在某些宿主细胞中，可通过使用异源信号序列调控鞭毛蛋白的分泌，因此所述异源肽可以是信号序列。所述异源肽也可增强细胞穿透，例如，鞭毛蛋白融合多肽可包含蛋白转导结构域或细胞穿透肽，如HIV转录因子Tat和果蝇转录因子触角(Antennapedia)所述的(见Green等，TRENDS inPharmacological Sciences(2003)24：213-215；Chauhan等，J Control Release(2007)117：148-162；和Vives等，J Biol Chem(1997)272：16010-16017，均通过引用纳入本文)。包含蛋白转导结构域促进鞭毛蛋白多肽从细菌细胞或病毒感染细胞分泌，包括细胞裂解后，邻近细胞摄取鞭毛蛋白多肽。在某些实施方式中，所述细胞穿透肽可包含衍生自HIV tat的氨基酸序列RKKRRQR。

此外，某些转录后修饰可用来将包含蛋白质的鞭毛蛋白递送到哺乳动物细胞胞质溶胶。豆蔻酰基是天然产生的转录后修饰，用来将胞质蛋白靶向到胞内膜，使多肽的豆蔻酰化引起膜导向，然而，豆蔻酰化也显示可将胞外蛋白递送到胞质溶胶(Nelson等，Biochemistry(2007)46：14771-14781)。N-豆蔻酰基转移酶根据是否存在适当的序列基序催化豆蔻酸根与各种蛋白质的N末端共价结合(Maurer-Stroh等，J Mol Biol.(2002)317：523-540)。相应地，本发明包括用适当的蛋白豆蔻酰化基序修饰的鞭毛蛋白多肽，以允许体外生产过程中豆蔻酰基与所述鞭毛蛋白多肽的N末端结合。随后将该蛋白质递送给动物会导致鞭毛蛋白被递送到胞质溶胶和Ipaf被激活。

在重要的实施方式中，与所述免疫调节鞭毛蛋白多肽融合的异源氨基酸序列可以是适应性免疫应答所需的一种或多种抗原。这样的抗原包括代表感染因子，包括病毒、细菌和寄生虫的抗原；代表内源性靶点的抗原如肿瘤相关抗原；和免疫应答所需的任何其它序列。合适的病毒和细菌抗原与疫苗所针对的疾病相关，如下详述。肿瘤相关抗原的性质也是本领域熟知的，这样的抗原常基于内源性肿瘤的个体表达。

病毒疫苗

在本发明的一个方面，所述组合物包含分离的复制活性或感染性病毒，其在进入和感染靶细胞后编码和表达免疫调节鞭毛蛋白多肽。可对复制活性病毒进行减毒，使其在宿主内复制但不引起显著的病理状况。据信，鞭毛蛋白多肽在病毒感染细胞胞质内的内源性表达优于将外源加入的鞭毛蛋白用作疫苗一部分，如将鞭毛蛋白多肽用作病毒疫苗佐剂时。例如，免疫调节鞭毛蛋白多肽在病毒感染细胞内的内源性表达允许刺激胞内Ipaf信号传导途径，其以不同于刺激细胞表面TLR5的方式刺激先天免疫。

鞭毛蛋白多肽的病毒表达可将所述多肽释放到感染细胞的胞质溶胶中，从而激活Ipaf，鞭毛蛋白与病毒表面蛋白融合时也可如此。这些病毒也会激活TLR5。病毒感染的细胞裂解时，将鞭毛蛋白作为胞质溶胶蛋白表达的病毒也会激活TLR5。

在某些实施方式中，所述复制活性病毒选自腺病毒科(Adenoviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳多孔病毒科(Papovaviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、披盖病毒科(Togaviridae)或流感病毒科(Influenzae)。所述病毒可在感染细胞内表达免疫调节鞭毛蛋白多肽。

因此，可用于构建本发明疫苗的病毒的例子包括但不限于腺病毒科家族成员，包括人腺病毒A到F；杯状病毒科家族成员，如诺沃克病毒(Norwalkvirus)(或诺罗病毒(norovirus))；小核糖核酸病毒科家族成员，包括例如，肠道病毒(enterovirus)A到D、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、鼻病毒(rhinovirus)A和B、甲型肝炎病毒、脑心肌炎(encephalomyocarditis)病毒、口蹄疫病毒、人副肠孤病毒(perchovirus)1到6、马鼻炎B病毒1到3；疱疹病毒科家族成员，包括例如，人疱疹病毒1到8(HHV1-8)、也称为单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)-1、HSV2、水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus)、非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、玫瑰疹病毒(roseolovirus)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus)(KSHV)。疱疹病毒科的其它例子包括牛疱疹病毒、马疱疹病毒、犬疱疹病毒和猫疱疹病毒。

肝脱氧核糖核酸病毒科的其它例子包括乙型肝炎病毒；纤丝病毒科的其它例子包括例如出血热病毒，如埃博拉(Ebola)病毒和马尔堡(Marburg)病毒；黄病毒科的其它例子包括例如登革热病毒、日本脑炎病毒、墨累山谷(Murray Valley)脑炎病毒、圣路易(St.Louis)脑炎病毒、蜱传(Tick-born)脑炎病毒、西尼罗(West Nile)病毒、黄热病病毒和丙型肝炎病毒。可用于本发明逆转录病毒科的例子包括例如，α-逆转录病毒，如鲁斯(Rous)肉瘤病毒、UR2肉瘤病毒和Y73肉瘤病毒；β-逆转录病毒，如小鼠乳房肿瘤病毒、绵羊肺腺瘤(Jaagsiekte sheep)逆转录病毒、马森-法衣扎猴(Mason-Pfizermonkey)病毒和蓝格(Langur)病毒；γ-逆转录病毒，如小鼠白血病病毒、猫白血病病毒、长臂猿白血病病毒、猫肉瘤病毒和小鼠肉瘤病毒；δ-逆转录病毒，如牛白血病病毒、灵长类T-亲淋巴病毒(T-1ymphotropic virus)和人T-亲淋巴病毒；慢病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)-1、HIV-2、猿免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒、马免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒和绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺病(Visna/maedi)病毒；和泡沫病毒(spumavirus)，如猕猴泡沫病毒、牛泡沫病毒、马泡沫病毒、猫泡沫病毒和人泡沫病毒。

病毒的其它例子包括正粘病毒科，如流感病毒A到C；副粘病毒科(Paramyxoviridae)，如麻疹病毒、流行性腮腺炎(mumps)病毒、仙台(sendai)病毒、副流感(parainfluenza)病毒1到3、人和牛呼吸道合胞体病毒(respiratory syncytial virus)、人偏肺病毒(metapneumovirus)、牛疫(Rinderpest)病毒和犬瘟热(distemper)病毒；乳多孔病毒科，包括例如乳头瘤病毒(papillomavirus)，如人乳头瘤病毒(HPV)-1、HPV-2、HPV-4、HPV-3、HPV-5、HPV-6、HPV-7、HPV-10、HPV-11、HPV-13、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-32、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51和HPV-55，以及多瘤病毒(polyomavirus)如SV40；和微小病毒科，如B19病毒、腺相关病毒(AAV)-1、AAV-2、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8，包括这些病毒的杂合体。其它例子包括痘病毒科，如牛痘病毒、牛痘、天花、传染性软疣(molluscum contagiosum)病毒；呼肠孤病毒科，如哺乳动物正呼肠孤病毒(orthoreovirus)、轮状病毒(rotavirus)A、科罗拉多蜱传热(Colorado tick fever)病毒；和披盖病毒科，如辛德毕斯(Sindbis)病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、罗斯河(Ross River)病毒、阿尼昂尼昂(O′nyong′nyong)病毒和风疹病毒。

流感是一种严重的常见病毒感染，改进疫苗对其有重要意义。因此，以下例子作为插入病毒疫苗载体的例子突出了所述鞭毛蛋白多肽在流感疫苗中的效用。所述病毒疫苗可包含流感病毒(IV)，如流感病毒A、流感病毒B或流感病毒C，其中免疫调节鞭毛蛋白多肽插入到流感病毒基因组中。IV大致为球形，但其也可被拉长或呈不规则形状。在该病毒内部，单链RNA有8个区段包含形成该病毒的遗传信息。该病毒最显著的特征是其表面上有一层向外凸出的刺突。刺突分两种不同类型：一种由血凝素(HA)分子组成，另一种由神经氨酸酶(NA)组成。HA分子允许病毒粘附到细胞上，启动感染。NA分子允许新形成的病毒离开其宿主细胞而不与细胞表面或彼此发生粘附。病毒壳体由病毒核糖核酸和若干所谓的“内部”蛋白(聚合酶(PB1、PB2和PA)、基质蛋白(M1)和核蛋白(NP))组成。由于传统上已证实针对HA和NA的抗体在对抗感染方面最有效，很多研究都集中在这些分子的结构、功能和遗传性变异方面。流感病毒也包含两个非结构蛋白M2和NS1，二者均在病毒感染中发挥重要作用。

流感病毒体包含7个区段(流感病毒C)或8个区段(流感病毒A和B)的线性负义单链RNA。该病毒基因组的大多数区段编码单一蛋白质。就很多流感病毒而言，现已知其全基因组。细胞被给定类型的两种不同病毒共同感染时这些病毒后代中亲代基因区段的互混产生病毒的基因重排。流感病毒基因组的区段性质促进该现象。基因重排表现为病毒表面抗原中的突然变化。

所述鞭毛蛋白多肽可插入到流感病毒编码区域中，如编码病毒多肽的核苷酸序列，或可插入到基因组中而不干扰病毒多肽的编码区域。所述鞭毛蛋白多肽可操作性连接于流感病毒启动子或异源启动子，如CMV启动子、泛素启动子或分子生物学领域已知的其它启动子。

可例如通过在毒力基因如与流感感染致病性相关的基因中造成一个或多个缺失和/或突变来对流感病毒进行减毒。在一个实施例中，可通过改变野生型NS-1基因对流感病毒进行减毒，否则其通过将鞭毛蛋白多肽的编码序列插入到NS-1的编码序列将有利于流感病毒致病性，或所述病毒可编码与完整或部分NS-1核苷酸序列N末端或C末端融合的鞭毛蛋白多肽。可通过以下方法截短NS1基因：加入起始/终止序列，所述起始/终止序列下游包含鞭毛蛋白多肽的编码序列，通过在第125个氨基酸处加入起始/终止序列(TAATG)，其在第125个氨基酸后终止NS1，并为鞭毛蛋白多肽编码序列提供起始密码子。

可将编码鞭毛蛋白多肽的多核苷酸插入其它病毒多肽编码序列中，例如插入定位于流感病毒颗粒表面的NA、HA和/或M蛋白的编码序列中。不想受任何理论的限制，据信，鞭毛蛋白多肽在病毒表面的表达可在病毒与细胞相互作用后刺激各种TLR5介导的细胞应答，而感染细胞随后在胞内表达鞭毛蛋白多肽可刺激Ipaf介导的细胞应答，由此对病毒疫苗提供免疫应答的协同增强作用。

通过引用全文纳入本文的WO94/21797公开了包含编码NP、HA、M1、PB1和NS1的DNA构建体的IV疫苗组合物，还公开了对IV感染的保护方法，包括用预防有效量的这些DNA疫苗组合物进行免疫。

本发明也包括采用各种病毒载体或核酸构建体产生对一种或多种所需多肽抗原的增强免疫应答。除编码所需多肽抗原如病毒抗原、肿瘤抗原、细菌抗原和/或寄生虫抗原的多核苷酸序列以外，病毒载体或构建体可包含编码鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列。采用的病毒载体可与所需抗原相关或不相关。例如，可采用逆转录病毒(例如，MLV或慢病毒载体)、牛痘、疱疹或腺相关病毒载体递送肿瘤或细菌抗原或来自非相关病毒的抗原。病毒载体的例子包括腺病毒、金丝雀痘(canarypox)、水泡性口炎(vesicularstomatitis)病毒、腺相关病毒、痘病毒、α病毒复制子和复制型腺病毒4。

如本文所述，病毒载体在给予哺乳动物后能复制，或其在给予后仅能感染一轮。通常，编码鞭毛蛋白多肽和所需抗原的多核苷酸序列操作性连接于一个或多个启动子序列。在某些实施方式中，鞭毛蛋白多肽和所需多肽抗原可形成融合或嵌合蛋白。同样地，可利用包含内源性表达鞭毛蛋白多肽的病毒载体递送系统产生对任何所需抗原的增强免疫应答。

细菌疫苗

本发明也包括使用减毒活细菌疫苗，其中所述细菌包含编码免疫调节鞭毛蛋白多肽的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列操作性连接于细菌启动子。

根据细菌菌株的性质，可能需要提供的免疫调节肽编码序列带有编码信号序列的操作性连接序列。分泌信号为本领域所熟知，如果要实现TLR5激活，则应提供信号序列。然而，如果细菌菌株表达逃避TLR5的鞭毛蛋白(例如，螺杆菌属(Helicobacter)和弯曲杆菌属(Campylobacter))，可表达不逃避TLR5的异源鞭毛蛋白多肽，并通过天然鞭毛分泌机构分泌，以从胞外空间激活TLR5。不经进一步修饰估计这些细菌不会激活Ipaf。

如志贺杆菌(Shigella)、李斯特菌(Listeria)以及其它细菌所示，如果细菌菌株感染导致细菌逃离到胞质溶胶中，则可加入分泌信号，以将所述蛋白输出到细菌外部进入胞质溶胶从而激活Ipaf。TLR5也可在感染细胞裂解后或细菌驻留在宿主细胞外部或之间时被激活。因此，技术人员应理解如何适当地分泌多肽，以提供与TLR5、Ipaf或二者的充分接触。因此，由于鞭毛蛋白多肽与适当受体发生相互作用，修饰细菌会引发两种先天应答，以及对存在于所述细菌上的抗原的增强适应性应答。

如果感染中采用的细菌菌株表达某些毒力因子分泌机构，则这些可促进将鞭毛蛋白转运入宿主细胞的胞质溶胶中，由此激活Ipaf。例子包括III型分泌系统(如沙门氏菌中发现的)和IV型分泌系统(如军团病菌中发现的)。可通过这两种系统将鞭毛蛋白从细菌胞质溶胶易位到宿主胞质溶胶而无需不加入异源分泌信号，然而，可能需要鞭毛伴侣蛋白(鼠伤寒沙门氏菌中的FliS)。因此，就表达III型分泌系统但不表达鞭毛蛋白的细菌而言，可在细菌中表达鞭毛蛋白，引起鞭毛蛋白易位到宿主胞质溶胶中，从而可通过Ipaf检测。该方法可能有用的细菌例子是沙门氏菌(Salmonella spp)和鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)。

活细菌疫苗包含在宿主中复制的细菌菌株，使疫苗可引发类似于天然感染所引发的免疫应答。可对活细菌疫苗减毒，意味着通过生物或技术操作尽可能降低或消除其致病能力。通常，活细菌疫苗既没有减毒不足，即保留有限致病性，也没有减毒过度，即不再具有成为有效疫苗的足够感染性。活细菌疫苗通常引发体液免疫和细胞免疫。预计本文所述包含外源鞭毛蛋白多肽的活细菌疫苗可引发增强的先天免疫应答，进而促进更为剧烈的体液和细胞免疫应答。

可通过经典方法生产减毒活细菌疫苗，如在抑制毒力因子的条件下体外培养。例如，结核疫苗由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)减毒活菌株组成(卡介苗)，通过连续体外传代培养方法对其减毒，已为全世界亿万人口进行了接种。然而，卡介苗在临床试验中具有不同的免疫原性和保护效力。本发明的某些实施方式可包括本文所述的包含外源鞭毛蛋白编码核苷酸序列的减毒活卡介苗，以增强该疫苗的免疫原性。

也可通过化学诱变生产减毒活细菌疫苗。例如，根据化学诱变技术获得了伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)Ty21a菌株，其获批准用于预防或降低伤寒风险。因此，本发明包括使用化学诱变生产的减毒疫苗，如沙门氏菌Ty21a菌株，其中化学突变细菌包含外源提供的鞭毛蛋白多肽编码序列以增强该疫苗试剂的免疫原性，如通过刺激TLR5和/或Ipaf介导的细胞免疫应答。因此，例如，从组成型启动子表达鞭毛蛋白的Ty21a沙门氏菌引发的免疫应答强于亲代Ty21a菌株。

也可通过重组技术生产减毒活细菌疫苗。例如，一种方案可包括鉴定负责毒力、建群和/或存活的基因，去除这个或这些基因，或消除或调节其体内表达。在某些实施方式中，可能需要删除两个或多个有利于毒力的独立基因或基因座，以降低回复突变的可能性。例如，获批准的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)疫苗基于通过删除编码毒力因子(例如霍乱毒素)的基因产生的菌株。此外，已通过对特定质粒或染色体基因进行突变开发了志贺杆菌菌株，以降低致病性。同样地，本发明包括使用通过重组技术减毒的细菌疫苗，如本领域已知的弧菌和志贺杆菌疫苗，如本文所提供，其中所述细菌包含编码免疫调节鞭毛蛋白多肽的外源多核苷酸序列。

包含编码免疫调节鞭毛蛋白多肽的外源核苷酸序列的减毒活细菌菌株是本发明的一部分，其中外源核苷酸序列操作性连接于细菌启动子。所述细菌菌株可以是不包含内源鞭毛蛋白基因的菌株，如选自以下的细菌：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、鼠疫耶尔森菌、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、A组链球菌属(group A Streptococcus)、B组链球菌属(group B Streptococcus)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningiditis)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumii)。

在其它实施方式中，所述细菌包含不诱导TLR5介导的免疫应答或Ipaf介导的免疫应答的内源鞭毛蛋白多肽。这样的细菌包括例如，幽门螺杆菌和空肠弯曲杆菌(Camphylobacter jejuni)。

在其它的实施方式中，所述细菌经修饰不产生能够诱导TLR5和/或Ipaf介导的应答的内源鞭毛蛋白多肽序列。这样的细菌可选自鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)或单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)。

在某些实施方式中，包含外源提供的鞭毛蛋白多肽序列的细菌可表达鞭毛蛋白多肽作为细菌表面组分或分泌分子。在某些实施方式中，所述细菌是能够在哺乳动物宿主细胞内复制(即胞内复制)的类型。细菌疫苗可包含含有内源鞭毛蛋白编码核苷酸序列的细菌，或其可不含这样的内源序列。例如，细菌疫苗可包含非鞭毛细菌、不天然诱导TLR5或Ipaf介导的细胞应答的鞭毛细菌和/或含能够诱导TLR5或Ipaf介导的细胞应答的鞭毛蛋白多肽、但仍然抑制内源鞭毛蛋白的表达以避免激活感染细胞的先天免疫的鞭毛细菌。

所述非鞭毛细菌(即通常不含内源鞭毛蛋白基因的细菌)的例子包括但不限于：结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、A组链球菌属(GAS)、B组链球菌属(GBS)、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和鲍氏不动杆菌。不想受任何理论的限制，据信，整合表达鞭毛蛋白多肽作为非鞭毛细菌细胞表面或分泌分子的多核苷酸序列会刺激TLR5和/或Ipaf介导的细胞应答，由此增强对给定非鞭毛细菌疫苗的先天和适应性免疫应答。

含内源鞭毛蛋白基因但不诱导TLR5介导和/或Ipaf介导的免疫应答(即TLR5和/或Ipaf无法与内源性细菌鞭毛蛋白相互作用)的鞭毛细菌的例子包括但不限于空肠弯曲杆菌和幽门螺杆菌。在说明中，已显示尽管TLR5识别鞭毛蛋白中高度保守的结构域，但一些鞭毛细菌在D1结构域中包含阻止TLR5检测的序列变化。例如，如上所示，包括人病原体空肠弯曲杆菌和幽门螺杆菌在内的ε-变形菌包含允许TLR5逃避的序列变化以及保留鞭毛蛋白聚合作用和运动性的补偿性突变。据信，加入如本文所述编码和表达免疫调节鞭毛蛋白多肽的外源多核苷酸序列会刺激TLR和/或Ipaf介导的细胞应答，由此增强对这些类型细菌的免疫应答。

含能够诱导TLR5或Ipaf介导的应答的鞭毛蛋白多肽、但仍抑制所述鞭毛蛋白基因的表达以避免激活先天免疫的鞭毛细菌的例子包括但不限于鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。就这些类型的细菌而言，据信，将免疫调节鞭毛蛋白多肽置于所述细菌无法抑制的启动子如细菌启动子的调控下，会刺激TLR和/或Ipaf介导的细胞应答，由此增强对这些类型细菌的免疫应答。

可采用本领域已知的技术将编码免疫调节鞭毛蛋白多肽的外源多核苷酸序列引入细菌。

真核寄生生物疫苗

本发明也包括使用包含真核寄生生物的疫苗组合物，其中所述寄生生物包含编码免疫调节鞭毛蛋白多肽的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列操作性连接于启动子。寄生生物的例子包括但不限于溶组织内阿米巴(Entemoeba histolytica)、美洲板口线虫(Necator americanus)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、利什曼原虫属(Leishmania)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(P.malariae)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(S.haematobium)、日本血吸虫(S.japonicum)、盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和麦地那龙线虫(Dracunculusmedinensis)。

用于给药的组合物/制剂

本发明包括包含本文所述的复制活性病毒、病毒载体、减毒活细菌和/或真核寄生生物(即疫苗试剂)或融合蛋白的药物组合物和疫苗组合物。药物组合物通常包含与本发明疫苗试剂结合的药学上可接受的运载体或赋形剂。疫苗组合物通常另外包含与本发明疫苗试剂结合的药学上可接受的佐剂。

本发明的药物和疫苗组合物可基于任何适当的给药途径给予，包括但不限于吸入、皮内、经皮、肌内、局部、鼻内、皮下、直接注射和制剂。

本发明的组合物可包含本文提供的活性疫苗试剂(例如病毒或细菌)的溶液，可在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇、其混合物和油中制备。在常见的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止不需要的微生物生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有的情况中，所述溶液形式均应无菌，并应是达到容易装入注射器程度的流体。它在制造和储存条件下应是稳定的，在保存过程中应能够抵抗不良微生物如与本文提供的疫苗试剂无关的细菌和真菌的污染。运载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣如卵磷脂，如果是分散体则通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在某些实施方式中，所述组合物中不包含活细菌，可通过各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等防止非所需微生物的作用。在很多情况中，优选包含等张剂，例如糖类或氯化钠。可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶用于组合物中来延长可注射组合物的吸收。

一般来说，合适的制剂描述于通过引用纳入本文的《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)最新版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，PA)。

疾病的治疗方法

本发明包括利用本文提供的疫苗治疗或降低获得多种疾病或状况的风险，除由病理异常细胞引起的状况如退化状况或癌症外，还包括感染性疾病如病毒感染、细菌感染和寄生虫感染。

病毒感染疾病或因子的例子包括但不限于本文它处所述的甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、杯状病毒相关腹泻、轮状病毒腹泻、B型流感嗜血杆菌肺炎和侵入性疾病、流感、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、副流感相关肺炎、呼吸道合胞体病毒(RSV)肺炎、严重急性呼吸道综合征(SARS)、人乳头瘤病毒、单纯疱疹II型生殖器溃疡、HIV/AIDS、登革热、日本脑炎、蜱传脑炎、西尼罗病毒相关疾病、黄热病、非洲淋巴细胞瘤病毒、拉沙(Lassa)热、克里米亚-刚果(Crimean-Congo)出血热、埃博拉出血热、马尔堡出血热、狂犬病(Rabies)、裂谷(Rift Valley)热、天花、麻风病(leprosy)、上下呼吸道感染、脊髓灰质炎(poliomyelitis)等。

细菌感染疾病或因子的例子包括但不限于本文它处所述的炭疽(Bacillus antracis)、伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏杆菌(Brucella canus)、羊流产布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psitacci)、沙眼衣原体、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(C.perfringens)、破伤风梭状芽孢杆菌(C.tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(即白喉(diphtheria))、肠道球菌(Enterococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、钩端螺旋体(Leptospira)、单核细胞增生李斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立氏立克次体(Rickettsia recketisii)、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内志贺杆菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、腐生性葡萄球菌(S.saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌、酿脓链球菌(S.pyogenes)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌、百日咳博代杆菌(Bordatella pertussis)和中耳炎(otitis media)(例如，通常由肺炎链球菌、流感嗜血杆菌或卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)引起)等。

某些实施方式包括治疗或降低哺乳动物中致病寄生虫感染或寄生虫疾病的风险，包括给予哺乳动物包含分离的真核寄生生物的组合物，其中所述寄生生物包含编码免疫调节鞭毛蛋白肽的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列操作性连接于启动子。寄生虫感染疾病的例子包括但不限于阿米巴病(Amebiasis)(例如溶组织内阿米巴)、钩虫病(Hookworm Disease)(例如线虫寄生虫，如美洲板口线虫和十二指肠钩虫)、利什曼病(Leishmaniasis)、疟疾(四种疟原虫属原生寄生虫：恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫)、血吸虫病(寄生血吸虫：曼氏血吸虫、埃及血吸虫和日本血吸虫)、盘尾丝虫(河盲症(River blindness))、克氏锥虫(南美洲锥虫病(Chagas disease)/美洲昏睡病(American sleeping disease))和麦地那龙线虫、淋巴丝虫病(lymphatic filariasis)。

本文提供的方法也可用于治疗或降低特征在于“病理异常细胞”的状况，如癌症或退化状况的相关风险。例如，某些实施方式包括治疗癌症或退化状况(即特征在于“病理异常细胞”的状况)的方法，包括给予哺乳动物包含分离的复制活性病毒或非复制活性病毒(即仅能感染一轮)的组合物，其中所述复制活性病毒包含编码免疫调节鞭毛蛋白多肽的核苷酸序列，所述病毒包含编码所需抗原的核苷酸序列。在某些实施方式中，所需抗原与癌细胞如肿瘤细胞相关，但与正常细胞没有显著关联。例如，所述癌细胞或肿瘤细胞可在其细胞表面上表达特征性抗原，可为采用本文提供疫苗的免疫治疗提供靶点。例如，5T4抗原在恶性肿瘤的发育过程中广泛表达，发现于肿瘤如结直肠肿瘤、卵巢肿瘤和胃部肿瘤中。在这些情况中将5T4表达用作预后辅助手段，由于其在正常组织中表达非常有限，因此其代表了与本文提供方法联用的所需抗原。据信，例如通过刺激TLR-5介导的应答和/或Ipaf介导的细胞应答来刺激对癌细胞相关抗原的增强免疫应答会诱导免疫应答，如对癌细胞或肿瘤细胞的细胞免疫应答，从而有助于破坏癌细胞或肿瘤细胞。

可根据本发明治疗的癌症或肿瘤的例子包括但不限于前列腺癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、皮肤黑色素瘤、胰腺癌、白血病、乳腺癌、子宫内膜癌、非何杰金淋巴瘤、卵巢癌、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、甲状腺癌、皮肤癌(非黑色素瘤)。

本发明还包括将本文提供的疫苗组合物用作化疗辅助物，包括与抗癌剂如生物试剂(生物治疗)、化疗剂和放疗剂联用。

已广泛使用的放疗的例子包括通常称为γ射线、X射线和/或将放射性同位素直接递送给肿瘤细胞的放疗方法。还包括其它形式的DNA损伤因素，如微波和紫外线辐射。这些因素很有可能会对DNA、DNA前体、DNA复制和修复、染色体装配和维持造成广泛损伤。

提供以下实施例以说明而非限制本发明。

实施例1

克隆插入鞭毛蛋白的流感NS

PCR扩增鞭毛蛋白(基因)，并通过链重叠交换PCR将其插入流感NS区段中。所得产物包含来自质粒pHW198-NS的PR8的NS区段，其中鞭毛蛋白(基因)插入NS1基因中。NS1被起始/终止序列(TAATG)在氨基酸125处截短，使NS1氨基酸125后终止，鞭毛蛋白插入基因从此起始。我们利用可被TLR5和Ipaf识别的最小鞭毛蛋白序列。该鞭毛蛋白的可变结构域被去除，并包含鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白fliC氨基酸1-184、表位标签接头(GSK-HA)和之后的鞭毛蛋白残基395-494。该构建体保留了NS2基因剪接位点，使NS2保持不间断。用ApaI和NheI切割所述PCR产物，将其插入到用同样的酶切割的pHW198-NS中。

实施例2

通过重组流感病毒体外激活TLR5

在该实施例中，验证表达鞭毛蛋白的重组流感病毒以激活TLR5。采用表达鞭毛蛋白的两类重组流感病毒：1)与流感病毒包膜蛋白(HA或NA)之一融合的免疫调节鞭毛蛋白多肽，或2)在感染细胞胞质溶胶内游离表达并可在感染细胞破裂后逃离至胞外空间的该肽。将表达重组鞭毛蛋白多肽的此类流感病毒感染的细胞的上清液与由NF-κB应答启动子驱动表达人TLR5和萤光素酶的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)温育。该细胞系能通过萤光素酶活性评估TLR5的参与。将萤光素酶产生阳性作为重组病毒成功表达鞭毛蛋白多肽的证据。由这些病毒编码的鞭毛蛋白多肽必须包含D1结构域的相关部分，但可包含所述蛋白更多的部分。

就所述试验而言，用克隆入pEF6/V5-His TOPO载体(英杰公司(Invitrogen))、ELAM-LUC49和pRL-TK(普洛麦格公司(Promega))质粒的人或小鼠TLR5 cDNA转染CHO K1细胞，用灭菌素进行选择，通过有限稀释克隆。对稳定克隆刺激4-5小时，检验萤光素酶活性。一式三份进行所有试验，各实验至少重复三次。通过将测试条件下的萤光素酶值除以对照条件下的相对萤光素酶值计算“诱导倍数”。

实施例3

重组流感病毒体外激活Ipaf

在该实施例中，分析表达重组鞭毛蛋白多肽的流感病毒的Ipaf激活作用。鞭毛蛋白多肽在感染细胞的胞质溶胶中作为游离蛋白表达。为测定Ipaf激活作用，用重组病毒颗粒感染巨噬细胞，与野生型流感病毒进行比较测定IL-1β的分泌。采用衍生自缺乏Ipaf小鼠的巨噬细胞，或通过采用shRNA或siRNA在人单核细胞衍生的巨噬细胞中进行敲除来测定对Ipaf信号传导的依赖性。在这些病毒中表达的鞭毛蛋白必须包含D0结构域，但可包含所述蛋白更多的部分。

实施例4

重组流感病毒体内激活TLR5和Ipaf信号传导

一旦以上实施例2和3证实了上述重组流感病毒，就可将它们用于感染小鼠。用表达鞭毛蛋白多肽的重组流感病毒鼻内感染小鼠。将鞭毛蛋白多肽对病毒复制、细胞因子表达、组织病理学和产生保护性适应性免疫应答的作用与野生型流感病毒进行比较。在TLR5缺陷、Ipaf缺陷或二者缺陷的小鼠中重复这些实验，以确定作用机制。

实施例5

通过Ipaf检测胞质鞭毛蛋白

胞质鞭毛蛋白刺激IL-1β的分泌。(a)用ELISA检测用卵清蛋白(OVA)或各种量的鞭毛蛋白(FliC)处理的LPS刺激的BMM产生的IL-1β。(b)用ELISA检测用30ng鞭毛蛋白(FliC)或在正常感染过程中进入巨噬细胞胞质溶胶的其它细菌毒力因子、SspH1(沙门氏菌SPI1 TTSS效应物)、SseI(沙门氏菌SPI2 TTSS效应物)、ActA(李斯特菌毒力因子)或磷酸缓冲盐水(PBS)处理的BMM产生的IL-1β。(c)用ELISA检测用125ng OVA、鞭毛蛋白(FliC)或用蛋白酶K过夜消化的蛋白质处理的BMM产生的IL-1β。省略Profect试剂作为对照。(d)用免疫印迹检测用60ng鞭毛蛋白(FliC)或OVA转染的BMM分泌的成熟IL-1β。细胞毒性可忽略不计，且在样品之间相等(＜5％)。

应答胞质鞭毛蛋白需要Ipaf。(a-b)在用60ng纯化鞭毛蛋白进行Profect转染前，用LPS对野生型(WT)、Ipaf敲除(Ipaf-KO)或TLR5敲除(TLR5-KO)小鼠衍生的BMM刺激2小时。(a)用ELISA检测IL-1β分泌。在WT和TLR5-KO无效BMM之间观察到的差异不具有统计学显著性(p＞0.05)，而Ipaf-KO BMM则显著低于WT和TLR5-KO BMM(p＜0.05)。(b)在用纯化鞭毛蛋白或OVA进行2小时Profect转染后，通过免疫印迹检测加工过的胱冬酶1。(c)用ELISA检测用LPS(50ng/ml)或Poly I∶C(5μg/ml)和R848(5μg/ml)刺激24小时的WT或Ipaf-KO BMM的IL-1β分泌。(d)用ELISA检测在用30ng纯化鞭毛蛋白进行Profect转染前用10ng/mlLPS刺激2小时的WT、Ipaf-KO或ASC-KO小鼠的BMM的IL-1β分泌。在WT和ASC-KO BMM之间观察到的差异具有统计学显著性(p＜0.05)。细胞毒性可忽略不计，且在样品之间相等(＜5％)。

实施例6

Ipaf限制表达鞭毛蛋白的病原体

鼠伤寒沙门氏菌通过体外SPI1 T3SS递送鞭毛蛋白激活Ipaf，但在全身感染时通过PhoP/PhoQ调控系统抑制鞭毛蛋白表达。在鼠伤寒沙门氏菌感染的小鼠脾脏检测不到鞭毛蛋白的表达，Ipaf无效小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染的易感性没有显著升高。相比之下，嗜肺军团菌没有采用该逃避策略，在感染过程中保持鞭毛蛋白的表达，引起Ipaf介导的清除。

为研究Ipaf介导的对鞭毛病原体的防御的重要性，我们构建了不能在体内抑制鞭毛蛋白的菌株，且这些细菌特异性地将鞭毛蛋白递送到宿主细胞的胞质溶胶中。我们从高稳定性pWSK29表达载体携带的SPI2共调控启动子表达FliC(pSPI2 fliC)。这些细菌通过SPI2 T3SS将鞭毛蛋白分泌到宿主胞质溶胶中，诱导Ipaf依赖性的IL-1β分泌。用MOI为12的WT或表达pSPI2 fliC的SPI2突变型(ssaT)鼠伤寒沙门氏菌感染衍生自骨髓的巨噬细胞(BMDM)1小时，随后用庆大霉素处理7小时。通过ELISA测定IL-1β分泌。结果见图1A。

我们清楚该菌株不能反映正常鼠伤寒沙门氏菌的发病机理，因为WT鼠伤寒沙门氏菌进化出逃避Ipaf的策略。我们试图将该菌株用作研究Ipaf在先天免疫应答中作用的特异性探针。

为测试该菌株作为疫苗的有效性，进行了预实验。用表达pSPI2 fliC的鼠伤寒沙门氏菌口服感染一只小鼠。两周后，用致死剂量的野生型鼠伤寒沙门氏菌攻击该小鼠。对照小鼠在5-7天死亡，而接种疫苗的小鼠在感染后存活，且没有明显症状。

为检测Ipaf在体内的作用，用各5x10⁴cfu的卡那霉素抗性标记鼠伤寒沙门氏菌WT和氨苄青霉素抗性标记鼠伤寒沙门氏菌pSPI2 fliC腹膜内共感染WT或Ipaf无效小鼠，并测定脾脏和肝脏中的细菌存留时间。用携带pSPI2 fliC(于pWSK29载体上；氨苄青霉素)或空pWSK129载体(卡那霉素)的鼠伤寒沙门氏菌以1∶1的比率共感染WT或Ipaf无效小鼠。2天后，处死小鼠，测定脾脏和肝脏的细菌计数。用log10(pSPI2 fliC/载体)表示(-2对应于减少100倍)。结果见图1B。表达pSPI2 fliC的细菌具有不能在WT小鼠中进行复制的缺陷，与WT鼠伤寒沙门氏菌相比，回收的细菌少100倍。在Ipaf无效小鼠中未观察到该限制作用，表明Ipaf激活作用限制细菌生长。在这些体外和体内实验中，所述细菌包含完整的SPI1和鞭毛蛋白基因。然而，所述细菌经培养而SPI1 T3SS和鞭毛蛋白基因无转录活性(过夜稳定期细菌培养物)。