JP2023532735A - 組み換えエンテロウイルスおよびその使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は一般に、ウイルス構造タンパク質をコードする部分的または完全な核酸配列を欠いている改変エンテロウイルスゲノムをコードする核酸構成物に特に関する。本開示はまた、エンテロウイルスの欠陥干渉（ＤＩ）粒子を生成するのに、並びに免疫疾患やウイルス感染といった様々な健康状態を予防および／または治療するのに有用な組成物および方法も提供する。【選択図】図１４－２

Description

〔政府支援によるＲ＆Ｄに関する陳述〕
本発明は、国防高等研究計画局（The Defense Advanced Research Project Agency）によって付与された認可番号ＨＲ ００１１－１７－２－００２７の下で政府支援を用いてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、２０２０年７月２日に出願された米国仮特許出願第６３／０４７，３９８号明細書に対する優先権を主張し、その出願の開示は、全ての図面を含む全内容が参照により組み込まれる。
〔配列表の挿入〕
添付の配列表の資料は、参照により本出願明細書に組み込まれる。ファイル名048536_687001WO_Sequene_Listing_ST25.txtが付けられた、添付の配列表テキストファイルは、２０２１年６月２５日に作成され、サイズは１３ＫＢである。
〔技術分野〕
本開示は、一般に、分子ウイルス学および免疫学の分野に関し、特に、ウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている改変エンテロウイルスゲノムをコードする核酸構築物に関する。本開示はまた、エンテロウイルスの欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）を産生するのに有用であり、免疫疾患およびウイルス感染などの様々な健康状態の予防および／または治療に有用である、組成物および方法も提供する。
ウイルスは、ヒトと動物の健康にとって大きな脅威であり、ウイルス性疾患を予防および治療するために今世紀に渡って相当な努力がなされてきた。その結果、いくつかの強力な抗ウイルス薬が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザＡ型ウイルス、およびヘルペスウイルスなどの様々なウイルスに関連する疾患の治療に現在利用可能である。近年、卵子および細胞ベースの生産システムを用いて、強力で、安全、安価なウイルスのヒト用および動物用ワクチンを開発することにおいて著しい進歩がみられている。さらに、ＤＮＡワクチンおよびＲＮＡワクチンを含む、ワクチン接種のためのいくつかの新規なアプローチが開発中である。
これらの著しい進歩にもかかわらず、重要な課題が残っている。例えば、ウイルス感染症のまん延を効果的に制御することは非常に困難であることが証明されている。一方、人類は、ジカ（Ｚｉｋａ）ウイルス、ＭＥＲＳ－コロナウイルス、エボラウイルスをはじめとする新規ウイルスによって常に挑戦を受けている。特に、最近のエンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ６８）、インフルエンザ（ｆｌｕ）、およびＣＯＶＩＤ－１９の大流行により、米国および世界中で健康関心が高まっている。その一方で、大部分のウイルスは選択圧にさらされると急激に変化するので、抗ウイルス剤耐性の出現が重大な課題である。これらの課題は既存の技術により部分的にのみ対処できているに過ぎない。その理由は、新規ワクチンの開発、既存の製造プロセスの適合、新規抗ウイルス標的の同定、および新規抗ウイルス剤の開発が、多くの場合、時間を消耗し、費用がかかるプロセスであるためである。
従って、ウイルス感染に関連する健康状態の予防、治療、および／または管理のために、安全でかつ効果的な追加のアプローチが依然として緊急的に必要とされている。
本開示は、一般に、免疫疾患および微生物感染などの様々な健康状態の予防および管理に使用するための、エンテロウイルス欠陥干渉（ＤＩ）粒子（ＤＩＰ）などの免疫治療薬およびそれを含む医薬組成物の開発に関する。特に、本明細書でより詳細に記載されるように、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部の欠損が、ＤＩ表現型に必要かつ十分であると判明した。また、以下の実施例に示すように、野生型ウイルス粒子の集団とＤＩ粒子の集団との間のウイルス間相互作用は、ウイルス感染の病因および持続性におけるウイルス－宿主間相互作用の免疫標的の定量的調節方法を提供することができる。特に、実施例１２～１３に示されるように、エンテロウイルスＤＩＰは、ポリオウイルス、非ポリオエンテロウイルス、ライノウイルスおよびインフルエンザウイルスをはじめとする、多くのウイルスに対する広域スペクトル抗ウイルス剤として使用することができる。特に、本明細書に提示されるデータは、予防的投与および／または治療的投与としての鼻腔内感染により、エンテロウイルスＤＩＰが粘膜表面で致死性ポリオウイルスに対する防御を提供することができることを実証している。さらに、本明細書で提示されるデータは、気道におけるＤＩＰ誘導性粘膜免疫が防御効果に寄与することを実証している。
本開示の一態様において、改変エンテロウイルスゲノムをコードする核酸配列を含む核酸構築物が本明細書で提供され、前記改変エンテロウイルスゲノムは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている。
本開示の核酸構築物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、またはそれらの任意の組み合わせをコードする配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的部分を欠いている。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を全く含まない。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ライノウイルスＡ、ライノウイルスＢ、およびライノウイルスＣから成る群より選択されるライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）種に属するウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、エンテロウイルスＡ、エンテロウイルスＢ、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＥ、エンテロウイルスＦ、エンテロウイルスＧ、エンテロウイルスＨ、エンテロウイルスＩ、エンテロウイルスＪ、エンテロウイルスＫ、およびエンテロウイルスＬから成る群より選択されるエンテロウイルス種に属するウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ＰＶ１、ＰＶ２およびＰＶ３から成る群より選択されるポリオウイルス血清型に由来する。いくつかの実施形態では、改変ポリオウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ポリオウイルス１型（ＰＶ１）に由来する。いくつかの実施形態では、改変ポリオウイルスゲノムをコードする核酸配列は、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
本開示のいくつかの実施形態では、改変ポリオウイルスゲノムをコードする核酸配列は、異種核酸配列に操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、選択可能マーカーのためのコード配列またはプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、改変ポリオウイルスゲノムをコードする核酸配列は、発現カセットまたは発現ベクターに組み込まれる。
一態様では、本開示のいくつかの実施形態は、エンテロウイルスの欠陥干渉（ＤＩ）粒子（ＤＩＰ）に関する。いくつかの実施形態では、エンテロウイルスＤＩ粒子は、本開示の核酸構築物を含む。いくつかの実施形態では、エンテロウイルスＤＩ粒子が、異種カプシド構造タンパク質によって包み込まれている本開示の核酸構築物を含む。
別の態様では、（ａ）本開示の核酸構築物、および／または（ｂ）本開示のＤＩ粒子、を含む組み換え細胞が本明細書で提供される。本開示の組み換え細胞の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、ヒト細胞である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、エンテロウイルスの欠陥干渉（ＤＩ）粒子を産生するための方法であって、ａ）エンテロウイルス構造タンパク質またはその一部を発現するように操作された宿主細胞を提供する工程と、ｂ）提供された宿主細胞を本開示の核酸構築物でトランスフェクトする工程と、ｃ）発現されたエンテロウイルス構造タンパク質またはその一部によって包み込まれた核酸構築物を含むエンテロウイルスＤＩＰの産生のための条件下で、トランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程とを含む方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるエンテロウイルス欠陥干渉（ＤＩ）粒子を産生する方法は、産生されたＤＩＰを収得する工程をさらに含む。従って、本明細書では、本明細書に記載の方法によって産生された欠陥干渉（ＤＩ）粒子も提供される。
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、薬学的に許容される賦形剤、並びに（ａ）本開示のＤＩＰ、（ｂ）本開示の核酸構築物、および／または（ｃ）本開示の組み換え細胞を含む医薬組成物である。
本開示の医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示のＤＩＰと薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示の核酸構築物と薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、組成物はリポソーム、脂質ナノ粒子、またはポリマーナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物はワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はアジュバントとして製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物のうちの１つ以上の鼻腔内投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、および経口投与用に製剤化される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、免疫応答を誘発するための方法であって、それを必要とする対象に、（ａ）本開示のＤＩＰ、（ｂ）本開示の核酸構築物、（ｃ）本開示の組み換え細胞、および／または（ｄ）本開示の医薬組成物、を含む組成物を投与することを含む方法である。
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、必要がある対象における健康状態を予防および／または治療するための方法であり、本方法は、（ａ）本開示のＤＩＰ、（ｂ）本開示の核酸構築物、（ｃ）本開示の組み換え細胞、および／または（ｄ）本開示の医薬組成物、を含む組成物を前記対象に予防的または治療的に投与することを含む。
本開示の方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、前記状態が、免疫疾患または感染である。いくつかの実施形態では、前記対象が免疫疾患または感染に関連する状態を有するかまたは有する疑いがある。いくつかの実施形態では、前記感染が季節性呼吸器ウイルス感染または急性呼吸器ウイルス感染である。いくつかの実施形態では、前記感染は、ヒトオルソニューモウイルス（Human orthopneumovirus）属の種、エンテロウイルス（Enterovirus）科の種、コロナウイルス（Coronaviridae）科の種、またはオルソミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科の亜型に属するウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、オルソミクソウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルスまたはパラインフルエンザ（Parainfluenza）ウイルスである。いくつかの実施形態では、インフルエンザＡ型ウイルスは亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７から成る群より選択される。いくつかの実施形態では、パラインフルエンザウイルスは、亜型ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、およびＨＰＩＶ－４から成る群より選択される。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、β－ＣｏＶ重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスβ－ＣｏＶ感染は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、およびＢａｔ ＳＬ－ＣｏＶ－ＷＩＶ１などのすべての株を含む）から成る群より選択される１または複数のサルベコウイルス（Sarvecovirus）亜属、平頭コウモリ（Tylonycteris bat）コロナウイルスＨＫＵ４（ＢｔＣｏＶ－ＨＫＵ４）、アブラコウモリ（Pipistrellus bat）コロナウイルスＨＫＵ５（ＢｔＣｏＶ－ＨＫＵ５）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルスＭＥＲＳ－ＣｏＶ（種ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵｌを含む）から成るメルベコウイルス（Merbecovirus）亜属に関連する。いくつかの実施形態では、ヒトオルソミクソウイルスは、ヒトＲＳウイルス（ＨＲＳＶ）である。いくつかの実施形態では、ＨＲＳＶは、亜型Ａおよび／または亜型Ｂに関連付けられる。
本開示のいくつかの実施形態では、ウイルス感染は、エンテロウイルス感染またはライノウイルス感染である。いくつかの実施形態では、ライノウイルス感染は、ライノウイルスＡ種、ライノウイルスＢ種、およびライノウイルスＣ種から成る群より選択される１つ以上のライノウイルス種に関連する。いくつかの実施形態では、エンテロウイルス感染は、エンテロウイルスＡ種、エンテロウイルスＢ種、エンテロウイルスＣ種、エンテロウイルスＤ種、エンテロウイルスＥ種、エンテロウイルスＦ種、エンテロウイルスＧ種、エンテロウイルスＨ種、エンテロウイルスＩ種、エンテロウイルスＪ種、エンテロウイルスＫ種、およびエンテロウイルスＬ種から成る群より選択される１つ以上のエンテロウイルス種に関連する。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ポリオウイルス１型（ＰＶ１）、ポリオウイルス３型（ＰＶ３）、コクサッキーウイルスＡ２、コクサッキーウイルスＡ４、コクサッキーウイルスＡ１６、コクサッキーウイルスＢｌ、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶ－Ｂ３）、コクサッキーウイルスＢ６、パラエコーウイルス（エコーウイルス）、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶ－Ａ７１）、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ６８）、ライノウイルスＨＲＶ１６、およびライノウイルスＨＲＶ１Ｂのうちの１つ以上に関連する。
いくつかの実施形態では、組成物は、鼻腔内投与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、または頭蓋内投与のうちの１つ以上のために製剤化される。いくつかの実施形態では、投与された組成物は、対象においてインターフェロン産生を増加させる。いくつかの実施形態では、組成物は、単一療法（単剤療法）として、または少なくとも１つの追加の療法と組み合わせた第１療法として、対象に個別に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、および手術から成る群より選択される。
別の態様では、キットが本明細書で提供され、該キットは（ａ）本開示のＤＩＰ、（ｂ）本開示の核酸構築物、および／または（ｃ）本開示の医薬組成物を含む、健康状態もしくはウイルス感染の予防および／または治療のための、免疫応答を誘発するキットである。
本明細書に記載される態様および実施形態の各々は、実施形態または態様の文脈から明示的にまたは明白に除外されない限り、一緒に使用することができる。
上記の概要は例示であり、限定するものではない。本明細書に記載の例示的な実施形態および特徴に加えて、本開示の更なる態様、実施形態、目的および特徴は、図面と詳細な説明並びに特許請求の範囲から十分に明らかになるであろう。
図１Ａ～１Ｅは、本開示のいくつかの実施形態に従って、ポリオウイルスＤＩＰの例示的な設計およびｅＴＩＰの産生を示すために実施した実験の結果を概略的に要約する。図１Ａは、野生型ポリオウイルス（ＰＶ）およびｅＴＩＰゲノムの概略図である。ＰＶゲノムは、高次構造化された５′ＵＴＲに続いて単一の転写解読枠およびポリアデニル化３′ＵＴＲを含む。コード領域は、構造遺伝子と非構造遺伝子に分けることができる。ウイルスカプシドを形成するために構造遺伝子（Ｐｌ／カプシド）が必要とされ、非構造遺伝子（Ｐ２／Ｐ３）は複製サイクルの成功に全て必要とされる。ポリオウイルスの欠陥干渉粒子（ｅＴＩＰ）：ｅＴＩＰは、ＰＶ１ウイルスのＰ１遺伝子を欠損しており、ＧＦＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子により置き換えられていた。ｅＴＩＰ２は陰性対照（ネガティブコントロール）であって、ヌクレオチド５，６００から７，５００まで（ゲノムの３′末端全体）に及ぶ欠失を有すること以外は、ｅＴＩＰｌと同じであった。ｅＴＩＰ２は、複製することはできないが、ほとんどのｅＴＩＰｌタンパク質を発現することができる。図１Ｂは、ｅＴＩＰの産生を示す概略図である。野生型（ＷＴ）ＲＮＡを、パッケージング細胞株であるポリオウイルスのＰ１遺伝子を安定に発現するＨｅｌａ Ｓ３細胞（Ｈｅｌａ Ｓ３／Ｐ１）にトランスフェクトした（方法）。そしてＨｅｌａ Ｓ３細胞において、ｅＴＩＰを力価測定した。 図１Ｃは、銀染色ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（左パネル）および電子顕微鏡（ＥＭ）染色（右パネル）を用いた実験結果を模式的に要約し、ｅＴＩＰの精製を示す。これらの実験では、ｅＴＩＰｌをショ糖勾配により精製し、銀染色および電子顕微鏡法およびネガティブ染色を用いてＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により調べた。 図１Ｄは、Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝０．１でＨｅｌａ細胞、ＰＶ１、ＣＶＢ３、ＰＶ３およびライノウイルス（ＨＲＶ１６、ＨＲＶ１Ｂ）における重複感染を証明するために行った実験結果を模式的に要約している。ウイルス＋ｅＴＩＰ比は１：１、１：１０、１：２０、１：５０または１：１００であった。感染後９時間目にサンプルを採取した。ウイルス力価をプラークアッセイにより測定した。ＰＶ１は、野生型ポリオウイルス１型のマホニー株を表す。ＰＶ３はＷＴ３型ウイルスＬｅｏｎ株を表す。ＣＶＢ３は野生型のコクサッキーウイルスＢ３株を表す。 図１Ｅは、重複感染によりｅＴＩＰが細胞培養においてライノウイルスＨＲＶ８７（ＥＶ－Ｄ６８）感染を阻害することを示すために実施した実験の結果を概略的に要約する。ＥＶ－Ｄ６８は野生型エンテロウイルスＤ６８を表し、それはＨＲＶ８７とも呼ばれる。 図２Ａ～２Ｈは、野生型エンテロウイルスをｅＴＩＰと共に重複感染させると感染動物の生存率を増加させることを示すために実施した実験結果を概略的に要約する。図２Ａは、野生型エンテロウイルスをｅＴＩＰと共に重複感染させると感染動物の生存率を増加させることを示すために実施された実験結果を概略的に要約する。これらの実験では、６～８週齢のＴｇ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、野生型ポリオウイルス（ＰＶ１）単独で感染させ、または混合ＰＶｌ＋ｅＴＩＰで重複感染させた。２００プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＰＶ１単独または比１：５０００での混合ＰＶｌ＋ｅＴＩＰを用いた。マウスの数は、１群あたり１３～１４匹である（ｎ＝１３～１４）。実線は野生型エンテロウイルス単独を表す。点線は、重複感染群を表す。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定によって実施され、ｐ＜０．０５を有意とみなした。 図２Ｂは、筋肉内の組織分布（プラークアッセイによる）を示すグラフである。ＩＦＮＡＲ-/-マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、２００ＰＦＵの野生型ポリオウイルスに感染させるか、または１：５０００の比で混合ＰＶｌ＋ｅＴＩＰに重複感染させた。指示時点（Ｘ軸）に組織を回収した。Ｙ軸は、組織１グラム当たりのＰＦＵを表す。黒色のバーは、ＰＶ１群におけるＰＶ１力価を表す。灰色のバーは、重複感染群におけるＰＶ１力価を表す。図２Ｃは、脾臓における組織分布（プラークアッセイによる）を示すグラフである。ＩＦＮＡＲ-/-マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、２００ＰＦＵの野生型ポリオウイルスに感染させるか、または１：５０００の比で混合ＰＶｌ＋ｅＴＩＰに重複感染させた。指示時点（Ｘ軸）に組織を回収した。Ｙ軸は、組織１グラム当たりのＰＦＵを表す。黒色のバーはＰＶ１群におけるＰＶ１力価を表す。灰色のバーは、重複感染群におけるＰＶ１力価を表す。図２Ｄは、脊髄中の組織分布（プラークアッセイによる）を示すグラフである。ＩＦＮＡＲ-/-マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、２００ＰＦＵの野生型ポリオウイルスに感染させるか、または１：５０００の比で混合ＰＶｌ＋ｅＴＩＰに重複感染させた。指示時点（Ｘ軸）に組織を回収した。Ｙ軸は、組織１グラム当たりのＰＦＵを表す。黒色のバーはＰＶ１群におけるＰＶ１力価を表す。灰色のバーは、重複感染群におけるＰＶ１力価を表す。野生型群と比較して、重複感染群の脊髄および脳内のＰＶ１力価は、感染後６日目に有意に減少した。図２Ｅは、脳内の組織分布（プラークアッセイによる）を示すグラフである。ＩＦＮＡＲ-/-マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、２００ＰＦＵの野生型ポリオウイルスで感染させるか、または１：５０００の比で混合ＰＶｌ＋ｅＴＩＰで重複感染させた。指示時点（Ｘ軸）に組織を回収した。Ｙ軸は、組織１グラム当たりのＰＦＵを表す。黒色バーはＰＶ１群におけるＰＶ１力価を表す。灰色のバーは、重複感染群におけるＰＶ１力価を表す。野生型群と比較して、重複感染群の脊髄および脳内のＰＶ１力価は、感染後６日目に有意に減少した。 図２Ｆは、筋肉内のウイルスゲノムを定量するために実施したｑＰＣＲ実験の結果を概略的に要約する。ＲＮＡゲノムコピー数は、ウイルス力価測定法ではなくデジタル小滴ＰＣＲ法によって測定した。Ｙ軸は、全ＲＮＡ １ｍｇあたりのＲＮＡゲノムコピー数を表す。三角形を有する実線は、野生型ウイルス単独群におけるＰＶ１ゲノムコピー数を表す。ドットを有する点線は、重複感染群における力価でのＰＶ１ゲノムコピー数を表す。白抜き四角形を有する点線は、重複感染群における力価でのｅＴＩＰゲノムコピー数を表す。マウスの数は、各群あたりおよび各時点あたり３匹（ｎ＝３）である。両側多重ｔ検定、Ｐ＜０．０５は有意性を表す。図２Ｇは、脾臓中のウイルスゲノムを定量するために実施したｑＰＣＲ実験結果を概略的に要約する。ＲＮＡゲノムコピー数は、ウイルス力価測定法ではなくデジタル小滴ＰＣＲ法によって測定した。Ｙ軸は、全ＲＮＡ １ｍｇあたりのＲＮＡゲノムコピー数を表す。三角形を有する実線は、野生型ウイルス単独群におけるＰＶ１ゲノムコピー数を表す。ドットを有する点線は、重複感染群における力価でのＰＶ１ゲノムコピー数を表す。白抜き四角形を有する点線は、重複感染群における力価でのｅＴＩＰゲノムコピー数を表す。マウスの数は、各群あたりおよび各時点あたり３匹（ｎ＝３）である。両側多重ｔ検定、Ｐ＜０．０５は有意を表す。図２Ｈは、脊髄中のウイルスゲノムを定量化するために実施したｑＰＣＲ実験結果を概略的に要約する。ＲＮＡゲノムコピー数は、ウイルス力価測定法ではなくデジタル小滴ＰＣＲ法によって測定した。Ｙ軸は、全ＲＮＡ １ｍｇあたりのＲＮＡゲノムコピー数を表す。三角形を有する実線は、野生型ウイルス単独群におけるＰＶ１ゲノムコピー数を表す。ドットを有する点線は、重複感染群における力価でのＰＶ１ゲノムコピー数を表す。白抜き四角形を有する点線は、重複感染群における力価でのｅＴＩＰゲノムコピー数を表す。マウスの数は、各群あたりおよび各時点あたり３匹（ｎ＝３）である。両側多重ｔ検定、Ｐ＜０．０５は有意を表す。 図３Ａ～３Ｆは、ＰＶ１に対するｅＴＩＰ防御に及ぼす異なる比率の影響を示すために実施した実験結果を概略的に要約する。ｅＴＩＰと共に重複感染させた野生型エンテロウイルスは、感染動物の生存率を増加させる。図３Ａは、５０００ＰＦＵのＰＶ１を単独でまたは比１：１０および１：１００の混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰで感染させたときの生存率を示すグラフである（ｎ＝８～１０）。ＰＶ１は、野生型ポリオウイルス１型マホニー株を表す。Ｔｇ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、野生型（ＷＴ）エンテロウイルス単独で感染させたか、または重複感染混合ＷＴ＋ｅＴＩＰで重複感染させた。ドットを有する実線は野生型エンテロウイルス単独を表す。塗りつぶしの四角形を有する点線は、重複感染群を表す。図３Ｂは、５０００ＰＦＵのＰＶ３を単独でまたは比１：１０００の混合ＰＶ３＋ｅＴＩＰで感染させたときの生存率を示すグラフである（ｎ＝２０）。ＰＶ３はＷＴ３型ウイルスＬｅｏｎ株を表す。Ｔｇ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路で、野生型（ＷＴ）エンテロウイルス単独で感染させたか、または混合ＷＴ＋ｅＴＩＰで重複感染させた。ドットを有する点線は野生型エンテロウイルス単独を表す。塗りつぶしの四角形を有する実線は、重複感染群を表す。 図３Ｃは、２０ＰＦＵのＣＶＢ３単独でまたは比１：５００００の混合ＣＶＢ３＋ｅＴＩＰで感染させたときの生存率を示すグラフである（ｎ＝２０）。ＣＶＢ３は野生型のコクサッキーウイルスＢ３株である。Ｔｇ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、野生型（ＷＴ）エンテロウイルス単独で感染させたか、または、混合ＷＴ＋ｅＴＩＰで重複感染させた。ドットを有する実線は、野生型エンテロウイルス単独を表す。塗りつぶしの四角形を有する点線は、重複感染群を表す。図３Ｄは、頭蓋内経路により、５～７日齢のｐｕｐｓを２×１０3ＴＣＩＤ５０ ＰＦＵのＥＶ－Ｄ６８単独で感染させたか、または比１：１０００の混合ＥＶ－Ｄ６８＋ｅＴＩＰで感染させたときの生存率を示すグラフである。ＥＶ－Ｄ６８は野生型エンテロウイルスＤ６８を表す。マウスの数は、１群当たり７～１０匹（ｎ＝７～１０）である。ＴＧ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、野生型（ＷＴ）エンテロウイルス単独で感染させたか、または混合ＷＴ＋ｅＴＩＰで重複感染させた。ドットを有する実線は、野生型エンテロウイルス単独を表す。塗りつぶしの四角形を有する点線は、重複感染群を表す。 図３Ｅは、ＩＦＮＡＲ-/-マウスにおけるｅＴＩＰ安全性試験の結果を概略的に要約する。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定によって実施され、ｐ＜０．０５を有意とした。ＰＶ１は、野生型ポリオウイルス１型のマホニー株を表す。Ｔｇ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、野生型（ＷＴ）エンテロウイルス単独で感染させたか、または混合ＷＴ＋ｅＴＩＰで重複感染させた（ｎ＝１０）。図３Ｆは、Ｔｇ２１ ＰＶＲマウスにおけるｅＴＩＰ安全性試験の結果を概略的に要約する。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定によって実施され、ｐ＜０．０５を有意とした。ＰＶ１は野生型ポリオウイルス１型のマホニー株を表す。Ｔｇ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路により、野生型（ＷＴ）エンテロウイルス単独で感染させたか、または、混合ＷＴ＋ｅＴＩＰで重複感染させた（ｎ＝１０）。 図４Ａ～４Ｇは、ｅＴＩＰと共に重複感染させたＰＶ１が、免疫能のある感染動物においてＩＰ経路により生存率を増加させることを実証するために実施した実験の結果を概略的に要約する。図４Ａは、感染動物でのＩ．Ｐ．接種によるｅＴＩＰの防御効果を示すグラフである。Ｔｇ２１ ＰＶＲ株を、Ｉ．Ｐ．経路によって、１０７ＰＦＵのＰＶ１単独で感染させたか、または１：１０の比の混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰで重複感染させた。Ｔｇ２１ ＰＶＲ株のマウスの数は１７匹であり（ｎ＝１７）、２つの独立した実験をまとめた。ｅＴＩＰと共に重複感染させたＰＶ１は、免疫能のある感染動物（Ｔｇ２１ＰＶＲ株）の生存率を増加させる。塗りつぶしの四角形を有する点線は、重複感染群を表す。 図４Ｂは、感染動物でのＩ．Ｐ．接種によるｅＴＩＰの防御効果を示すグラフである。ＩＦＮＡＲ-/-マウスを、Ｉ．Ｐ．経路によって、１０4ＰＦＵのＰＶ１単独で感染させたか、または１：１０の比の混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰで重複感染させた。ＩＦＮＡＲ-/-マウスのマウス数は、７～８匹である（ｎ＝７～８）。ドットを有する黒い実線は、ＰＶ１単独を表す。ｅＴＩＰと共に重複感染させたＰＶ１は、感染した免疫能のある動物（Ｔｇ２１ＰＶＲ株）の生存率を増加させるが（図４Ａ）、１型インターフェロン受容体を欠いているマウス（ＩＦＮＡＲ-/-）では増加させない。塗りつぶしの四角形を有する点線は、重複感染群を表す。 図４Ｃは、感染動物の中和抗体価を示すグラフである。図４Ａの感染後２８日目に生存マウスから血清を採取し、次いで中和抗体価をプラーク減少中和試験いわゆるＰＲＮＴによって試験した。 図４Ｄは、１日目および３日目の脾臓におけるウイルス複製を示すグラフである。ウイルスは、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞上でのプラークアッセイによって測定され、そのデータを組織１グラムあたりのＰＦＵとして表した。パターン付のバーは１０７ＰＦＵ ＰＶ１を表し、そして塗りつぶしのバーは、比が１：１０でｅＴＩＰと共に重複感染させたＰＶ１を表す（ｎ．ｄ．は、検出されずを表す）。両側多重ｔ－検定。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定によって行われ、*ｐ＜０．０５を有意とした。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。ｎｓ＝有意でない。図４Ｅは、１日目および３日目の脳内におけるウイルス複製を示すグラフである。ウイルスは、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞上のプラークアッセイによって測定され、そのデータを組織１グラムあたりのＰＦＵとして表した。パターン付きのバーは１０７ＰＦＵ ＰＶ１を表し、そして塗りつぶしのバーは、比が１：１０でｅＴＩＰと共に重複感染させたＰＶ１を表す（ｎ．ｄ．は、検出されずを表す）。両側多重ｔ－検定。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定によって行われ、*ｐ＜０．０５を有意とした。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。ｎｓ＝有意でない。 図４Ｆは、１日目および３日目の腎臓におけるウイルス複製を示すグラフである。ウイルスは、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞上でのプラークアッセイによって測定され、そのデータは、組織１グラムあたりのＰＦＵとして表した。パターン付きのバーは１０７ＰＦＵ ＰＶ１を表し、そして塗りつぶしのバーは、比が１：１０でｅＴＩＰと共に重複感染させたＰＶ１を表す（ｎ．ｄ．は、検出されずを表す）。両側多重ｔ－検定。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定によって行われ、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。ｎｓ＝有意でない。図４Ｇは、１日目および３日目の肝臓におけるウイルス複製を示すグラフである。ウイルスは、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞上でのプラークアッセイによって測定され、そのデータを組織１グラムあたりのＰＦＵとして表した。パターン付きのバーは１０7ＰＦＵ ＰＶ１を表し、そして塗りつぶしのバーは、比が１：１０でｅＴＩＰと共に重複感染させたＰＶ１を表す（ｎ．ｄ．は、検出されずを表す）。両側多重ｔ－検定。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定によって行われ、*ｐ＜０．０５を有意とした。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。ｎｓ＝有意でない。 図５Ａは、ｅＴＩＰ単独で感染させた、またはＰＶ１と共にｅＴＩＰで重複感染させた、初代胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を示す概略図である。 図５Ｂは、Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝０．１で、またはＰＶｌ＋ｅＴＩＰ＝ｌ：１０、ＰＶｌ＋ｅＴＩＰ＝１：１００の比でプラークアッセイにより測定されたウイルス力価を示すグラフである。感染後４８時間目に、ｅＴＩＰは、ＰＶ１複製をほぼ２倍阻害する。感染後９時間目にＧＦＰ陽性細胞により測定したときのＨｅｌａ Ｓ３細胞上のｅＴＩＰ力価。Ｙ軸はＩＵ／ｍＬとして表す。図５Ｃは、ｅＴＩＰとＰＶ１との重複感染が、感染４８時間後に、１：１０の比でインターフェロン誘導を有意に増加させることを示すために実施した実験の結果を模式的に要約する（ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。両側スチューデントｔ－検定、Ｐ＜０．０５は有意であることを表す。 図６Ａ～６Ｅは、感染動物における鼻腔内接種によるｅＴＩＰの防御効果を示すために行った実験の結果を模式的に要約する。図６Ａは、感染動物におけるｅＴＩＰの防御効果を示すグラフである。免疫能のあるマウス（Ｔｇ２１ＰＶＲ株）を、鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）経路によって、２×ｌ０5ＰＦＵのＰＶ１単独で感染させたか、または、１：３０の比で混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰで重複感染させた。マウスの数は１１～１７匹（ｎ＝ｌ１～１７）である。塗りつぶしの四角形を有する点線は、重複感染群を表す。ＵＶｅｄ処置ｅＴＩＰ：２時間にわたるＵＶｅｄ。図６Ｂは、感染動物におけるｅＴＩＰの効果を示すグラフである。免疫不全マウス（ＩＦＮＡＲ-/-）を、鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）経路によって１０4ＰＦＵのＰＶ１単独で、または１：３０の比の混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰで重複感染させた。ＵＶｅｄ処置ｅＴＩＰ：２時間にわたるＵＶｅｄ。マウス数は７～８匹である（ｎ＝７～８）。ドットを有する実線は、ＰＶ１単独を表す。塗りつぶしの四角形を有する点線は、重複感染群を表す。 図６Ｃは、ｅＴＩＰの予防効果を示すグラフである。６×１０6ＩＵのＤＩＰを、鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）経路により、Ｔｇ２１ＰＶＲマウスに接種した。接種後４８時間目に、マウスを鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）経路により２×１０5ＰＦＵのＰＶ１に感染させた。ドットを有する実線は、ＰＶ１単独を表す。塗りつぶしの四角形を有する点線は、４８時間前処理を表す。 図６Ｄは、ｅＴＩＰの治療効果を示すグラフである。Ｔｇ２１ＰＶＲマウスに２×１０5ＰＦＵのＰＶ１を鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）経路により感染させた後、６×１０6ＩＵのｅＴＩＰを、感染後１日目から５日目まで鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）経路によって接種した（１日１回）。マウスの数は１６～２１匹（ｎ＝１６～２１）である。 図６Ｅは、ｅＴＩＰがインフルエンザ（ｆｌｕ）感染に対して防御することを示すグラフである（ｎ＝７～８）。Ｔｇ２１ＰＶＲマウスに、１０5ＰＦＵのＨ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルスを鼻腔内接種し、ＰＲ８株を単独で接種し（ＲＰ８）、または１：１００の比においてｅＴＩＰと共にＰＲ８を重複感染させた。各マウスを毎日体重測定し、初期体重に対して正規化した。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定によって行われた。＊ｐ＜０．０５を有意とみなす。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ＝有意でない。図６Ａ、図６Ｃおよび図６Ｄの２つの独立した実験をプールした。 図７Ａは、複製の間、ＲＮＡウイルスが、親ウイルスの複製および病原性を軽減することができる欠陥ウイルスゲノム（ＤＶＧ）を産生することを示すために実施した実験の結果を概略的に要約したものである。 図７Ｂは、野生型ポリオウイルス（ＰＶ１）、および本明細書ではｅＴＩＰｌと呼ばれる遺伝子操作されたＤＶＧゲノムの概略図である。構造遺伝子（カプシド）は、ウイルスのカプシドタンパク質をコードし、非構造的コード領域は、複製に必要な酵素機構をコードする。ｅＴＩＰｌは、ＰＶ１ウイルスのカプシドタンパク質中に約１，７００塩基の大きな欠失を有しており、ＧＦＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子が、操作されたウイルスポリタンパク質のＮ末端に挿入されている。 図７Ｃは、ｅＴＩＰｌ粒子の産生を示す概略図である。インビトロ転写されたＲＮＡを、ポリオウイルスのカプシドタンパク質の前駆体を発現するパッケージング細胞株（ＨｅｌａＳ３／Ｐｌ）にトランスフェクトした。ｅＴＩＰｌ粒子をＨｅｌａＳ３／Ｐｌ細胞において３回継代させ、より高い力価のｅＴＩＰｌ原液（約１０7感染単位／ｍＬ）を作製した。 図７Ｄは、Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝１でｅＴＩＰｌに感染したＨｅＬａ細胞の免疫組織化学的分析を示す。感染後２４時間目に、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞を固定し、ポリオ３Ａ抗体（赤）、ＧＦＰ（緑）およびＤＡＰＩ（青）に対する抗体での免疫染色によって分析した。 図７Ｅは、ｅＴＩＰｌが細胞培養において広範囲のエンテロウイルス亜種（例えば、ＰＶ１およびＰＶ３、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶ－Ａ７１）、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ８６）、ライノウイルス１６（ＨＲＶ１６）、ライノウイルス１Ａ（ＨＲＶ１Ａ）、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を阻害することを示すグラフである。 図８Ａは、ｅＴＩＰ１が免疫能のある野生型マウスにおいてポリオウイルス（ＰＶ１）にして防御することを示すグラフである。免疫能のあるＴｇ２１ＰＶＲマウスにおける腹腔内接種は、１０7ＰＦＵのポリオウイルス（ＰＶ）または１：１０の比での重複感染ｅＴＩＰｌであった。対照として、ＰＶ１をＵＶ不活性化ｅＴＩＰｌ（ＵＶ／ｅＴＩＰｌ）と同時接種した。生存曲線の統計解析は、ログランク（Mantel-Cox）検定により実施した。ｎｓ＝有意でない。図８Ｂは、ｅＴＩＰ１が免疫能のある野生型マウスにおいてポリオウイルス（ＰＶ１）に対して防御することを示すグラフである。Ｔｇ２１ＰＶＲ株を３×１０5ＰＦＵのＰＶ１で鼻腔内（ＩＮ）により感染させるか、または１：２０の比でｅＴＩＰｌまたはＵＶ／ｅＴＩＰｌで重複感染させた。生存曲線の統計解析はログランク（Mantel-Cox）検定により実施した。ｎｓ＝有意でない。 図８Ｃは、ｅＴＩＰ１が免疫能のある野生型マウスにおいてポリオウイルス（ＰＶ１）に対して防御することを示すグラフである。１：２０の比でｅＴＩＰｌと共に鼻腔内（ＩＮ）経路により重複感染させたＰＶ１の組織分布。組織を指示時点で収集し、ホモジナイズし、プラークアッセイにより力価測定した。ｎ＝３～５。図８Ｃのデータは、対のないスチューデントｔ－検定を使って分析した。ｎ．ｄ．（検出されず）。 図８Ｄは、ｅＴＩＰｌの予防および治療効果を示すグラフである。予防効果については、６×１０6ＩＵのｅＴＩＰｌを、ＩＮ経路によってＴｇ２１ＰＶＲマウスに接種し、そして感染後４８時間目に、マウスをＩＮ経路により３×１０5ＰＦＵのＰＶ１で感染させた。治療効果については、Ｔｇ２１ＰＶＲマウスをＩＮ経路により３×ｌ０５ＰＦＵのＰＶ１で感染させ、次いで感染後１～５日目にＩＮ経路により６×ｌ０６ＩＵのｅＴＩＰｌを１日１回接種した。ｎ＝１６～２１。２つの独立した実験。生存曲線の統計解析は、ログランク（Mantel-Cox）検定により実施した。 図９Ａは、ｅＴＩＰｌ粒子を接種した、免疫能のあるＴｇ２１ＰＶＲマウスからの、肺および脾臓のｍＲＮＡＳｅｑトランスクリプトームプロファイリングである。Ｔｇ２１ＰＶＲマウスに６×１０6ＩＵのｅＴＩＰｌ粒子またはＰＢＳ（ｍｏｃｋ：模擬）で４８時間感染させた。肺および脾臓からｍＲＮＡを単離し、ＲＮＡＳｅｑにより分析し、そしてｍｏｃｋ（模擬）処置群に比較して、発現レベルが有意に変化した遺伝子のボルケーノプロットとして表わした。遺伝子のインターフェロン誘導遺伝子のヒートマップは、ｍｏｃｋ（模擬）処置群と比較した倍率変化（fold-change）として示される（ＦＤＲ、ｑ値＜０．０５）。 図９Ｂは、ｅＴＩＰｌ粒子またはｍｏｃｋ（模擬）を鼻腔内接種した肺における免疫細胞の定量のためのフローサイトメトリーを示すグラフである。データは、ｍｏｃｋ（模擬）に比較したｅＴＩＰ１接種の倍率変化として提示される。ｎ＝３～４。データは２つの独立した実験からのものである。対のないスチューデントｔ検定。ｎ．ｓ．＝有意でない。 図９Ｃは、Ｉ型インターフェロン応答を欠いている（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスにおいて、ｅＴＩＰｌが腹腔内（ＩＰ）経路でポリオウイルス（ＰＶ１）に対して防御しないことを示すグラフである。ＩＦＮＡＲ-/-マウスを、１０4ＰＦＵのＰＶ１単独でまたは１：１０の比での混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰｌでＩＮ経路により重複感染させた。ｎ＝７～１０。２つの独立した実験の結果をプールした。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定によって実施した。ｎｓ＝有意でない。図９Ｄは、Ｉ型インターフェロン応答を欠いている（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスにおいて、ｅＴＩＰｌが鼻腔内（ＩＮ）経路でポリオウイルス（ＰＶ１）に対して防御しないことを示すグラフである。ＩＦＮＡＲ-/-マウスを、１０4ＰＦＵのＰＶ１単独で、またはＩＰ経路により１：１０の比でもしくはＩＮ経路により１：２０の比での混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰｌで重複感染させた。ｎ＝７～１０。２つの独立した実験の結果をプールした。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定により実施した。ｎｓ＝有意でない。 図９Ｅは、自己複製するｅＴＩＰ１ ＲＮＡが細胞質ｄｓＲＮＡ中間体を形成し、そしてパターン認識受容体を活性化して、ＩＦＮ感作遺伝子の産生をもたらすことを示す概略図である。これはまた、局所組織内の抗ウイルス防御状態を促進することもできる。感染細胞の原形質膜は、ｅＴＩＰｌ複製の部位に様々な種類の循環白血球を動員する完全性および損傷関連分子放出パターンを失っていた。 図１０Ａは、ｅＴＩＰｌ ＲＮＡリポプレックスおよび鼻腔の粘膜表面における自然免疫応答の誘導、並びにｅＴＩＰｌ ＲＮＡを接種したマウスからの肺および脳のｍＲＮＡＳｅｑトランスクリプトームプロファイリングの概略図である。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスに、３０μｇのｅＴＩＰｌ ＲＮＡまたはｍｏｃｋ（模擬）（空のリポプレックスを有するＰＢＳ）を鼻腔内に接種した。接種後２０時間目に肺および脳を回収し、それらの組織からｍＲＮＡを単離した。空のリポプレックスでの対照処置群と比較した倍率変化（fold-change）として示されるｅＴＩＰ１ ＲＮＡ／リポプレックスの鼻腔内接種後のインターフェロン誘導遺伝子のヒートマップ（ＦＤＲ、ｑ値＜０．０５）、ｎ＝３、Ｒｅｐ－１～３は、３匹の複製マウスを表す。 図１０Ｂは、３０μｇのｅＴＩＰｌ ＲＮＡまたはｍｏｃｋ（模擬）（空のリポプレックスを有するＰＢＳ）を鼻腔内接種した、または３×１０6感染単位のｅＴＩＰ１を感染させた、マウスの免疫組織化学的分析を示す。接種動物の頭部を、接種後２４時間目に免疫組織化学により分析した。頭部および肺を収集し、４％ＰＦＡ中で固定し、パラフィンワックスに包埋し、５μｍのスライドに切断した。ｅＴＩＰｌ粒子およびｅＴＩＰｌ ＲＮＡを、ポリオウイルス抗体ＶＰｇ（３Ｂタンパク質）を用いて染色した。ポリオウイルスＶＰｇ（３Ｂ）（赤）、ＡＣＴＵＢ（緑）、核（青）。ｅＴＩＰｌ複製は、上気道鼻腔に制限されていた。肺での複製は観察されなかった。 図１０Ｃは、ｅＴＩＰｌがどのように抗ウイルス免疫の非自律性活性化を誘導するのかの作用機序モデルを示す概略図である。 図１０Ｄは、ｅＴＩＰｌが感染動物の中枢神経系（ＣＮＳ）への野生型ウイルスの拡散を阻害するが、脾臓および脊髄では複製しないことを示すグラフである。６～８週齢のＴｇ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスを、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）経路で、２００ＰＦＵの野生型ポリオウイルスに感染させるか、または１：５０００の比で混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰｌに重複感染させた。ｅＴＩＰｌおよびＰＶ１のＲＮＡゲノムコピー数を、デジタル液滴ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。Ｙ軸は、全ＲＮＡ １ｍｇあたりのＲＮＡゲノムコピー数を表す。マウスの数は、各群あたり、および各時点ごとに３匹である（ｎ＝３）。両側多重ｔ－検定、ｐ＜０．０５は有意であることを表す。 図１１Ａは、ｅＴＩＰ ＲＮＡが感染マウスにおけるＳＡＲ－ＣｏＶ－２複製を阻害することを示すグラフである。３０μｇのｅＴＩＰｌ ＲＮＡまたはｍｏｃｋ（空のリポプレックス）をＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスに鼻腔内で送達し、２０時間後、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスを６×１０4ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内にチャレンジ投与した。３日後に組織（肺および脳）を採取し、ホモジナイズし、上清をＶｅｒｏ－Ｅ６細胞でのプラークアッセイにより力価滴定した。全ＲＮＡを抽出し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子に対するプライマー標的を用いるｑＲＴ－ＰＣＲにより定量し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。ｎ＝６。対のないスチューデントｔ－検定。 図１１Ｂは、感染動物の肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫組織化学染色である。肺および脳組織を感染後３日目と６日目に収集し、４％ＰＦＡで固定し、パラフィンワックスに包埋し、５μｍ切片に切断した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ、赤）およびスパイクタンパク質（ＳＰ、灰色）を認識する抗体でスライドを染色した。ＡＣＴＵＢ（緑）、核（ＤＡＰＩ、青）。ＳＰ、ＮＰタンパク質の発現レベルを、平均強度を有するＦｕｊｉ／ＩｍａｇｅＪによって定量し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染群に対して正規化した。各画像について、異なる群において同じ場所の少なくとも１０か所の領域を選択した。対のないスチューデントｔ－検定、各比較のためにｐ値を用いる。 図１１Ｃは、感染動物の脳におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫組織化学染色である。肺および脳組織を感染後３日目と６日目に収集し、４％ＰＦＡで固定し、パラフィンワックスに包埋し、５μｍ切片に切断した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ、赤）およびスパイクタンパク質（ＳＰ、灰色）を認識する抗体でスライドを染色した。ＡＣＴＵＢ（緑）、核（ＤＡＰＩ、青）。ＳＰ、ＮＰタンパク質の発現レベルを、平均強度を有するＦｕｊｉ／ＩｍａｇｅＪによって定量し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染群に対して正規化した。各画像について、異なる群において同じ場所の少なくとも１０か所の領域を選択した。対のないスチューデントｔ－検定、各比較のためにｐ値を用いる。 図１１Ｄは、図１１Ｂの免疫組織化学染色の相対強度を示すグラフである。 図１１Ｅは、図１１Ｃの免疫組織化学染色の相対強度を示すグラフである。 図１２Ａは、ｅＴＩＰが、感染マウスにおいてＣＯＶＩＤ－１９疾患の症状および肺損傷を低減することを示すグラフである。３０μｇのｅＴＩＰｌ ＲＮＡまたはｍｏｃｋ（空のリポプレックス）をＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスに鼻腔内で送達し、２０時間後、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスを６×１０4ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内に追加免疫した。体重変化は、各マウスごとに初期体重に対して正規化した。２つの独立した実験における条件ごとに、ｎ＝９である。動物が自身の体重の１５％を失った後、それらを人道的見地から安楽死させた。 図１２Ｂは、図１２Ａのマウスの免疫組織化学染色である。肺組織を感染後３日目に採取し、４％ＰＦＡ固定し、パラフィンワックスに包埋し、５μｍ切片に切断した。スライドは、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスからの肺のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した組織片であった。 図１２Ｃは、包括的な組織学的変化および炎症進行について組織片を評価するグラフである。 図１３Ａは、ｅＴＩＰのアジュバント特性を示すグラフである。ｅＴＩＰの鼻腔内送達は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の産生を増強させる。 図１３Ｂは、ｅＴＩＰのアジュバント特性を示すグラフである。ｅＴＩＰの鼻腔内送達は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の産生を増強する。ｅＴＩＰは、不活化され精製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンによって誘発される免疫原性を増強させる。 図１４Ａは、ｅＴＩＰ１が、前処理を伴う肺細胞型Ｃａｌｕ－３およびＡ５４９－Ａｃｅ２細胞においてポリオウイルス（ＰＶ１）に対して防御することを示す。２４ウェル中の１０5個のＣａｌｕ－３細胞をＭＯＩ＝５にてｅＴＩＰ１粒子で処理し、５時間後に細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＭＯＩ＝０．１にてポリオウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。指示時点で上清を採取し、次いでＰＶ１についてはＨｅｌａ Ｓ３上で、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についてはＶｅｒｏ－Ｅ６上でのプラークアッセイによりウイルス複製を測定した。多重スチューデントｔ－検定を用いてＬｏｇ値を比較した。＊ｐ＜０．０５を有意とした。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ＝有意でない。ｎ＝３。 図１４Ｂは、ｅＴＩＰ１が、前処理を伴う肺細胞型Ｃａｌｕ－３およびＡ５４９－Ａｃｅ２細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して防御することを示す。２４ウェル中の１０5個のＣａｌｕ－３細胞をＭＯＩ＝５にてｅＴＩＰ１粒子で処理し、５時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＭＯＩ＝０．１にてポリオウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。指示時点で上清を採集し、ＰＶ１についてはＨｅｌａＳ３上で、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についてはＶｅｒｏ－Ｅ６上でのプラークアッセイにより、多重スチューデントｔ－検定を用いてＬｏｇ値を比較した。＊ｐ＜０．０５を有意とした。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ＝有意でない。ｎ＝３。 図１５は、ｅＴＩＰｌ ＲＮＡトランスフェクションおよび細胞内発現を示す概略図である。細胞培養モデルにおけるｅＴＩＰｌ ＲＮＡ発現。２μｇのｅＴＩＰｌ ＲＮＡを、リポフェクタミン２０００を用いてＨｅｌａＳ３細胞中にトランスフェクトし、次いでトランスフェクション後８時間目にポリオウイルス３Ａ抗体で免疫蛍光（ＩＦ）染色した。ポリオウイルス３Ａタンパク質染色（赤）、ｅＴＩＰｌ（緑）、核（青）。 図１６は、ｅＴＩＰｌ ＲＮＡが組織中のインターフェロン誘導遺伝子ＭｘｌおよびＩＦＮ感作遺伝子５６（ＩＳＧ５６）を誘導することを示すグラフである。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスを３０μｇのｅＴＩＰｌ ＲＮＡまたはｍｏｃｋ（空のリポフェクタミン２０００を有するＰＢＳ）で２０時間トランスフェクションした。肺および脳を採取し、全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（商標）試薬で抽出した。ｑＲＴ－ＰＣＲを実施して、インターフェロン誘導遺伝子ＭｘｌおよびＩＦＮ誘導遺伝子５６、ＩＳＧ５６（ＩＦＩＴ１）を定量した。ｎ＝３、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。対のないスチューデントｔ－検定。＊ｐ＜０．０５を有意とみなした。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ＝有意でない。 図１７は、ｅＴＩＰ１が腹腔内重複感染によりインフルエンザＨ１Ｎ１感染を防御することを示すグラフである。ｅＴＩＰｌは、インフルエンザ感染を防御する（ｎ＝７～８）。Ｔｇ２１ＰＶＲを、１０5ＰＦＵのＨ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルスで鼻腔内接種し、ＰＲ８株単独（ＲＰ８）で、または１：１００の比でＰＲ８をｅＴＩＰと共に重複感染させた。各マウスは、毎日体重測定し、初期体重に対して正規化した。生存曲線の比較は、ログランク（Mantel-Cox）検定により実施され、＊ｐ＜０．０５を有意とみなした。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ＝有意でない。
本開示は、概して、免疫状態およびウイルス感染と関連がある健康状態の治療のための新規な抗ウイルス療法の開発に関する。特に、本開示のいくつかの態様および実施形態は、免疫疾患および微生物感染などの様々な健康状態の予防および管理に使用するためのエンテロウイルスの欠陥干渉（ＤＩ）粒子（ＤＩＰ）の開発に関する。特に、本明細書でより詳細に記載されるように、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部が欠損していることは、ＤＩ表現型にとって必要かつ十分であると判明した。加えて、実施例に示されるように、野生型ウイルス粒子の集団とＤＩ粒子の集団との間のウイルス間相互作用は、ウイルス感染の病原性および持続性に関するウイルス－宿主間相互作用の免疫標的の定量的な調節方法を提供することができる。
近年、Ｄ６８（ＥＶ－Ｄ６８）、インフルエンザ（ｆｌｕ）、ＣＯＶＩＤ－１９のような種々のエンテロウイルスの大流行が、米国および世界中で健康問題を引き起こしている。ポリオウイルスに対するワクチンの開発が近年進歩しているにもかかわらず、細菌、ウイルス、または寄生虫を問わず、他の感染症の拡大を効果的に制御することは非常に困難であると報告されている。例えば、ポリオウイルス撲滅作戦として、ある者が個体へのワクチン接種を停止するなら、ある者が代替の抗ウイルス剤を開発する必要もあるだろう。一方、上記のようなエンテロウイルスの大流行は、新たな抗ウイルス剤およびワクチンを開発するための緊急の必要性を示している。
ウイルスの拡散を予防しかつ感染症を治療するための可能なアプローチは、ウイルスそれ自体の使用である。このアプローチは、本質的に、複製能のある無傷の（完全体の）対応物の拡散を阻止して、感染性ウイルスの産生量を減少させることができる、ＤＩ粒子（ＤＩＰ）の開発に関するものである。ＤＩＰは、インフルエンザＡ型ウイルスの未希釈の連続継代についての種々の研究において、１９５０年代初期に初めて同定された。細胞培養レベルにおけるＤＩＰの野生型ウイルスの阻害は、１９８０年代初期に観察されているが、ＤＩＰが治療用抗ウイルス剤として使用できるかどうか、および作用機序がどのようなものかは、依然として不明確なままである。
ＤＩＰは、ウイルス複製（ＤＩＰ）の間に天然に生成することができ、一般に、ウイルスゲノム中のヌクレオチドの欠失および／または挿入によって特徴付けられ、ウイルスの拡散に必須の１または複数のタンパク質の産生を防止する。ＤＩＰはウイルスＲＮＡ複製のための必須部分を維持しているのでそのＲＮＡゲノムを正常に複製することができるが、ウイルスゲノムの様々な部分を欠いているため、それは感染性子孫を生成することはできない。ＤＩＰは、欠損したウイルスタンパク質をトランス作用で補給する、標準ウイルス（ＳＴＶ）と呼ばれる場合がある同種のヘルパー野生型ウイルスの存在によって、その複製が左右される。注目すべきことに、研究されたほとんどのウイルスについてＤＩＰの存在が実証されており、そのためＤＩＰがより多くのウイルス性疾患を予防および／または治療するための有効な選択肢の１つになっている。
ＤＩＰアプローチは、従来の薬剤ベースの療法およびワクチンを上回るいくつかの潜在的利益を提供する。第一に、欠陥干渉（ｅＴＩＰ）ＲＮＡは、ウイルスゲノムに由来し、複製またはパッケージングを目当てにウイルスゲノムと競合することによって作用する。それらのパッケージング能力は、特異的かつ効率的に標的指向するウイルスを提供する。第二に、ＤＩＰは、より小さい／より短いゲノムであるために、感染細胞において野生型ウイルスよりも速く複製する。その結果、ＤＩＰは、野生型ウイルスによって産生される細胞内ウイルス資源に対して野生型ウイルスとしばしば競合して打ち勝ち（outcompete）、その結果としてｅＴＩＰが野生型ウイルスよりも効率的に感染細胞または動物から伝播することができるだろう。従って、感染動物におけるＤＩＰの有効性および安全性を試験し、治療目的での抗ウイルス用途のためにそのメカニズムを解明することが重要である。第三に、宿主の自然免疫が、ウイルス感染に対する防御の最前線にとって重要であると考えられる。例えば、ヒト自然免疫応答、特にＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答は、ウイルス侵入に対する高ロバストでかつ有効な防御の最前線である。ＤＩＰの防御効果が、標準ウイルス（ＳＴＶ）複製との直接干渉によるのか、強力な免疫感作効果によるのか、またはその両方の組み合わせによるのか、を決定することは依然として残っている。以下でより詳細に説明するように、多数のポリオウイルスのｅＴＩＰが設計および評価されている。具体的には、実施例１２～１３に示されるように、ｅＴＩＰは、ポリオウイルス、非ポリオエンテロウイルス、ライノウイルスおよびインフルエンザウイルスを含む広範囲のＲＮＡウイルスに対する広域抗ウイルス剤として使用することができる。特に、本明細書に提示されるデータは、ｅＴＩＰが、予防的投与および／または治療的投与として、鼻腔内感染によって粘膜表面で致死性ポリオウイルスを防御することを実証している。さらに、本明細書で提示されるデータは、気道におけるｅＴＩＰ誘導粘膜免疫が防御効果に寄与することを実証している。
〔定義〕
別段に定義されない限り、本明細書で使用される技術、表記および他の科学用語もしくは用語法のすべての用語は、本開示に関連する当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。場合によって、明確化および／または容易な参照のために、一般的に理解される意味を有する用語が本明細書で定義されるが、本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも当技術分野で一般的に理解されるものに対する実質的な差異を表していると解釈されるべきではない。本明細書に記載または参照される技術および手順の多くは、当業者による従来の方法論を用いて十分に理解されかつ一般的に使用される。
単数形（「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数形への言及を含む。例えば、用語「細胞」は、それらの混合物を含む１つ以上の細胞を包含する。以下の選択肢：「Ａ」、「Ｂ」、「ＡまたはＢ」、および「ＡおよびＢ」の全てを含めるために、本明細書では「Ａおよび／またはＢ」を使用する。
本明細書で使用するときの「投与」および「投与する」という用語は、鼻腔内、経皮、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口および局所投与、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない投与経路による、生物活性組成物または製剤の送達を指す。この用語は、限定されるものではないが、医療専門家による投与および自己投与を含む。
「細胞」、「細胞培養物」、および「細胞系」という用語は、特定の対象の細胞、細胞培養物または細胞系だけでなく、培養中の移行または継代の数に関係なく、そのような細胞、細胞培養物または細胞系の子孫もしくは潜在的子孫も指す。すべての子孫は、親細胞と全く同一ではないことを理解すべきである。これは、突然変異（例えば、意図的または偶発的突然変異）または環境因子（例えばメチル化または他のエピジェネティック修飾）のいずれかのために、後続世代においてある種の改変が起こりうるからである。そのような改変とは、子孫が、実際には親細胞と同じでなくてもよいが、子孫が元の細胞、細胞培養物または細胞系のものと同じ機能を保持している限り、本明細書で用いられる用語の範囲内に依然として含まれるような改変である。
本開示の組成物、例えば、ＤＩＰ、核酸構築物または医薬組成物の「有効量」、「治療上有効な量」、または「薬学的に有効な量」という用語は、一般に、組成物が存在しない場合に比較して、所定の目的を達成するのに十分な量を指す（例えば、組成物が投与されると、免疫応答を刺激し、疾患を予防もしくは治療し、または疾患、障害もしくは健康状態の１つ以上の症状を軽減するという効果を達成する）。「有効量」の一例は、疾患の１つ以上の症状の治療、予防または軽減に寄与するのに十分な量であり、これは、治療上有効な量とも称され得る。症状の「軽減」は、症状の重症度または頻度を減少させることを意味し、または症状の除去を意味する。治療上有効な量を含む組成物の正確な量は、治療目的に左右され、公知の技術を使用して当業者により確かめられるだろう（例えば、Lieberman、Pharmaceutical Dosage Forms (1-3巻、1992), Lloyd The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版、2003、Gennaro編、Lippincott, Williams & Wikinsを参照されたい）。
数値の範囲が提供される場合、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、下限の単位の小数点以下第１位への各々の介在する数値は、その範囲の上限と下限との間、およびその言及された範囲内の任意の他の指定の値もしくは介在値が、本開示の範囲内に包含されるものと解釈される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、独立して、より狭い範囲に含まれてもよく、示した範囲において任意の具体的な排除限界を受けることになる、本開示の範囲内にも含まれる。記載された範囲は、上下限のうちの一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか一方または両方を除いた範囲もまた、本開示に含まれる。
特定の範囲は、本明細書では、数値に先行して「約」という用語が提示されるが、この用語は、本明細書で用いるとき、およそという通常の意味を有する。この用語は、該用語が先行して置かれている正確な数のための文字的なサポートを提供する目的で使用され、また、該用語が先行して置かれている数に近いか、またはその数に近い数を提供するために使用される。数値が特定の記載された数に近いか、または具体的に記載された数にほぼ近いかどうかを判断する際に、提示される文脈において、記載されていない数は、具体的に列挙された数の実質的均等物を提供する数とすることができる。近似の程度が文脈から明らかでない場合には、提供された値を包含する全ての場合において、提供された値の±１０％以内であるか、または最も近い有意な桁（figure）に丸められているかのいずれかを意味する。
「構築物」という用語は、異種の起源からの１つ以上の単離された核酸配列を含む組み換え分子を指す。例えば、核酸構築物は、異なる起源の２つ以上の核酸配列が単一の核酸分子に組み込まれているキメラ核酸分子であり得る。従って、代表的な核酸構築物は、（１）互いに隣接した形で天然に見出されない調節配列およびコード配列を含む核酸配列（例えば、少なくとも１つのヌクレオチド配列が、別のヌクレオチド配列の少なくとも１つに関して異種である）、または（２）天然には接合していない機能的ＲＮＡ分子またはタンパク質の一部をコードする配列、または（３）天然には接合していないプロモーターの一部、を含有する任意の構築物を包含する。代表的な核酸構築物は、任意の組み換え核酸分子、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製ポリヌクレオチド分子、ファージなどの任意起源に由来し、ゲノムへの組み込みまたは自律複製が可能であり、１または複数の核酸配列が操作可能に連結されている核酸分子を含んでいる、直鎖もしくは環状の、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ核酸分子を包含する。本開示の構築物は、当該構築物にも含まれる注目すべき核酸配列の発現を指令するための必要な要素を含むことができる。そのような要素は、注目すべき核酸配列に操作可能に（該核酸配列の転写を指令するように）連結されているプロモーターなどの調節要素を含んでよく、そして任意にポリアデニル化配列を含む。本開示のいくつかの実施形態では、核酸構築物は、ベクター内に含まれてよい。構築物の構成要素に加えて、ベクターは、例えば、１つ以上の選択可能マーカー、原核生物および真核生物源などの複製のための１つ以上の複製開始点、少なくとも１つの複数のクローニング部位、および／または細胞のゲノム中への構築物の安定した組み込みを促進するための要素を含み得る。２つ以上の構築物を単一の核酸分子、例えば単一のベクター内に含めることができ、あるいは２つ以上の別々の核酸分子、例えば２つ以上の別々のベクターの中に含めることができる。「発現構築物」は、概して、注目すべきヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節配列を少なくとも含む。このようにして、例えば、発現させようとするヌクレオチド配列と操作可能に連結されたプロモーターが、細胞内発現のための発現構築物中に提供される。本開示の実施のために、構築物と細胞を調製および使用するための組成物と方法は、当業者に既知である。
本明細書で使用されるように、「操作可能に連結された」という用語は、２つ以上の要素、例えば、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の物理的または機能的結合を意味し、このような結合は、それらを意図した様式で操作できるようにする。例えば、本明細書に記載の核酸分子、または核酸分子内のコード配列およびプロモーター配列に関連して使用される場合、「操作可能に連結された」という用語は、コード配列およびプロモーター配列が、転写因子またはＲＮＡポリメラーゼによるそれぞれの結合の転写に与える効果を許容するために、インフレーム（in-frame）でありかつ適切な空間および距離で離れていることを意味する。操作可能に連結された要素は、連続的であっても非連続的（例えば、リンカーを介して互いに連結されている）であってもよいことを理解されたい。ポリペプチド構築物の文脈において、「操作可能に連結された」とは、構築物に記載の活性を提供するためのアミノ酸配列（例えば異なるセグメント、部分、領域、またはドメイン）間の物理的結合（例えば直接的または間接的に連結された）を指す。本明細書に開示されたポリペプチドまたは核酸分子の操作可能に連結されたセグメント、部分、領域、およびドメインは、連続的または非連続的（例えば、リンカーを介して互いに連結されている）であってもよい。
２つ以上の核酸またはタンパク質の文脈において本明細書で使用される「同一性％」という用語は、後述のデフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使って、または手動整列もしくは目視検査により測定したときに、同一であるかまたは特定比率の同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸を有する、２以上の配列もしくは部分配列（例えば、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大一致について比較し整列したとき、特定領域にわたって約６０％の配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高い同一性）を指す。例えば、ncbi.nlm.nih.gov/BLASTのＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい。そのような配列は、「実質的に同一」であると称される。この定義はまた、配列の相補体を指すかまたは適用することができる。この定義は、欠失および／または付加を有する配列、並びに置換を有する配列も包含する。配列同一性は、公開された技法、例えばＧＣＳプログラムパッケージ（Devereuxら、Nucleic Acid Res. 12:387, 1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul他、J. Mol. Biol. 215:403、1990）など、広く利用可能なコンピュータプログラムを使用して計算することができる。配列同一性は、そのデフォルトパラメータを用いて、ウイスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（University of Wisconsin Biotechnology Center)(1710 University Avenue、Madison、Wis 53705）における遺伝学コンピュータグループのシーケンス解析ソフトウェアパッケージ（Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group）などのシーケンス解析ソフトウェアを使用して測定することができる。
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、対象への着目の化合物（１または複数）の投与のための薬学的に許容される担体、添加剤または希釈剤を提供する、任意の適切な物質を指す。従って、薬学的に許容される賦形剤は、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される添加剤、および薬学的に許容される担体と呼ばれる物質を包含することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬剤投与に適合する、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。補助活性化合物（例えば、抗生物質および追加の治療剤）もまた、組成物に含めることができる。
本明細書で使用する場合、「対象」または「個体」は、ヒト（例えば、ヒト個体）および非ヒト動物などの動物を含む。いくつかの実施形態では、「対象」または「個体」は、医師のケアを受けている患者である。従って、対象は、注目すべき疾患（例えば癌）および／または疾患の１つ以上の症状を有するか、有するリスクがあるか、またはその疑いがある、ヒト患者または個体とすることができる。また、対象は、診断時またはそれ以降に注目すべき状態を有するリスクがあると診断された個体であってもよい。「非ヒト動物」という用語は、例えば、哺乳類、例えばげっ歯類、例えばマウス、非ヒト霊長類、および他の哺乳類、例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、および非哺乳類、例えば両性類、爬虫類などの全ての脊椎動物を含む。
特定の範囲は、本明細書では、「約」という用語によって先行されている数値を用いて示される。この「約」という用語は、本明細書では、該用語が先行して置かれる正確な数のための文字的なサポートを提供するために使用される。数値が、具体的に列挙された数に近いか、または具体的に列挙された数にほぼ近いかどうかを判断する際に、列挙されていない近似の数またはほぼ近い数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数の実質的等価物（同値）を提供する数であってもよい。
本明細書に記載される開示の態様および実施形態は、その態様および実施形態「…を含む」、「…から成る」、および「本質的に…から成る」を含むものと理解される。本明細書で使用される場合、「…を含む」は、「…を包含する」、「…を含有する」、または「…により特徴付けられる」と同義であり、それは包括的またはオープンエンド（無制限）であり、そして追加の、列挙されていない要素または方法の工程（ステップ）を排除しない。本明細書で使用される場合、「…から成る」は、クレームの組成物または方法において特定されていない任意の要素、工程または成分を排除する。本明細書で使用される場合、「本質的に…から成る」は、クレームの組成物または方法の基本的および新規な特徴に実質的に影響を与えない材料または工程を排除しない。本明細書における「…を含む」という用語の任意の言及、特に、組成物の構成要素の説明の際のまたは方法の工程の説明の際の当該用語の言及は、列挙された構成要素または工程から本質的に成るおよびそれから成る組成物および方法を包含するものと理解される。
明確化のため、別々の実施形態の文脈で説明されている本開示の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいと理解される。逆に、簡略化のため、単一の実施形態の文脈で説明されている本開示の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切な部分組み合わせで提供されてもよい。本開示に関する実施形態の全ての組み合わせは、本開示により具体的に包含され、各々の組み合わせおよび全ての組み合わせが、あたかも個別的にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびその要素のすべての部分組み合わせも、本開示によって具体的に包含され、本明細書では、各々のおよびすべてのそのような部分組み合わせが、あたかも個別的にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。
エンテロウイルス
エンテロウイルスは、単一のプラス（＋）鎖ゲノムＲＮＡにより特徴づけられる小ＲＮＡウイルスの大きな群であるピコルナウイルス科（Picornaviridae）の１つの属に属する。エンテロウイルス（Enterovirus）は、腸を経由するそれらの伝達経路により名づけられ（entericは小腸を意味する）、ヒト、哺乳動物、ならびに他の動物における広範な症状、症候群、および疾患に関連する。これらには、急性良性心膜炎、急性肉質麻痺、急性出血性結膜炎、無菌性髄膜炎、各種発疹、心筋炎、クループ、脳炎、粘膜疹、胃腸疾患、肝炎、手足口病、種々の呼吸器疾患、心筋炎、多臓器不全、心膜炎、神経痛、かぶれ、未分化型熱をはじめとする新生児疾患が挙げられる。一般に、それらの症候群は特定のエンテロウイルス血清型と相関がなく、血清型も特定の疾患と特異的に相関しないが、ある症例では血清型が特定の疾患と相関する場合がある。
エンテロウイルスは多くの感染の原因となる。ライノウイルス以後、エンテロウイルスは、ヒトにおいて最も一般的なウイルス感染であることが報告されている。エンテロウイルス感染は、無菌性髄膜炎、心筋炎、脳炎、急性出血性結膜炎、非特異的フェブリル病、および上気道感染症のため、毎年多数の入院に至っている。エンテロウイルスはまた、動物モデルにおける急性弛緩性麻痺、並びに拡張型心筋症においても関与している。コクサッキーＢウイルスの６つの血清型は、髄膜炎、心筋炎、および重度の新生児疾患などの様々な臨床疾患に関与している。最近では、エンテロウイルス感染は、慢性疲労症候群にも関連付けられている。３つの既知の血清型、ＰＶ１、ＰＶ２、およびＰＶ３を有するポリオウイルスは、ヒトに感染することが知られている別のエンテロウイルスである。
属名が示すように、エンテロウイルスは小ＲＮＡウイルスである。全てのエンテロウイルスは、約７，５００塩基のゲノムを含み、低忠実度複製および高頻度組み換えのため、高い突然変異率を有することが知られている。ウイルス一本鎖ＲＮＡは、５′非翻訳領域に続いて、Ｍｒ＝２４０～２５０×１０3Ｄａのポリタンパク質前駆体をコードする転写解読枠を含み、それに続いて、３′非コード配列およびポリ（Ａ）領域を含む。ウイルスのコード領域は、従来、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３と呼ばれる３つのセクションに分割されている。Ｐ１領域は、構造（カプシド）タンパク質をコードする。Ｐ２領域は、ＲＮＡ複製に必要なタンパク質と、宿主細胞のキャップ依存性翻訳の遮断を担うウイルスタンパク質分解酵素の１つをコードする。Ｐ３領域は、主要ウイルスプロテイナーゼ（３Ｃpro）、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（３Ｄpol）、およびＲＮＡ複製に必要とされる他のタンパク質を含む。コード領域の前には異常に長い５′ＮＣＲが先行して置かれ、それは、キャップ依存性機能の不在下で配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）による翻訳開始を指令する。ウイルスゲノムはまた、ウイルス複製開始複合体による鋳型認識に関与するシス作用性配列を含むと考えられる、短い３′ＮＣＲも含む。
ポリタンパク質では、遺伝子産物の配列は、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、および２Ａで始まる。１Ａ～１Ｄは、それぞれ、ウイルスカプシドの構造タンパク質ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１であり；ＶＰ１の後には転写解読枠内で非構造タンパク質２Ａが続く。宿主細胞に入ると、ウイルスＲＮＡゲノムは複製され、単一のポリタンパク質に翻訳され、続いてウイルスによりコードされるプロテアーゼによって構造カプシドタンパク質と非構造タンパク質とにプロセシングされ、次いで、ウイルスゲノムは構造カプシド外殻の中に包み込まれて成熟ウイルス粒子を生成する。非構造タンパク質は、主にウイルスの複製に関与する。
血清学的に異なるエンテロウイルスは、当初はエンテロウイルス内で５つの群に分類されていた：コクサッキーウイルスＡ（ＣＡ）、コクサッキーウイルスＢ（ＣＢ）、エコーウイルス（Ｅ）、および番号付きエンテロウイルス（ＥＶ）、並びにポリオウイルス（ＰＶ）。ポリオウイルス、並びにコクサッキーおよびエコーウイルスは、ふん口経路を通って拡散される。感染は、軽度の呼吸器疾患（普通の風邪）、手、足および口の疾患、急性出血性結膜炎、無菌性髄膜炎、心筋炎、重度の新生児敗血症様疾患、急性増悪麻痺、および関連した急性ＦＬＡＣＩＤ骨髄炎を含む、多種多様な症状をもたらし得る。
エンテロウイルスは、現在、配列番号が割り当てられ、遺伝子および表現型類似性に基づいてグループ化されている。今日まで、ヒトおよび非ヒト霊長類に感染する遺伝子的に異なるエンテロウイルスが１１０より多く同定されている。エンテロウイルス属には、現在次の１５種が含まれる：エンテロウイルスＡ（正式にはヒトエンテロウイルスＡ）、エンテロウイルスＢ（正式にはヒトエンテロウイルスＢ）、エンテロウイルスＣ（正式にはヒトエンテロウイルスＣ）、エンテロウイルスＤ（正式にはヒトエンテロウイルスＤ）、エンテロウイルスＥ（正式にはウシエンテロウイルスＡ）、エンテロウイルスＦ（正式にはウシエンテロウイルスＢ）、エンテロウイルスＧ（ブタエンテロウイルスＢ）、エンテロウイルスＨ（正式にはサルエンテロウイルスＡ）、エンテロウイルスＩ、エンテロウイルスＪ、エンテロウイルスＫ、エンテロウイルスＬ、ライノウイルスＡ（正式にはヒトライノウイルスＡ）、ライノウイルスＢ（正式にはヒトライノウイルスＢ）、およびライノウイルスＣ（正式にはヒトライノウイルスＣ）。
コクサッキーウイルスは、エンテロウイルスＡ（例示的血清型は、ＣＶＡ－２、ＣＶＡ－３、ＣＶＡ－４、ＣＶＡ－５、ＣＶＡ－６、ＣＶＡ－７、ＣＶＡ－８、ＣＶＡ－１０、ＣＶＡ－１２、ＣＶＡ－１４、及びＣＶＡ－１６）；エンテロウイルスＢ（例示的血清型は、血清型ＣＶＢ－１、ＣＶＢ－２、ＣＶＢ－３、ＣＶＢ－４、ＣＶＢ－５、ＣＶＢ－６、及びＣＶＡ－９）；エンテロウイルスＣ（例示的血清型は、血清型ＣＶＡ－１、ＣＶＡ－１１、ＣＶＡ－１３、ＣＶＡ－１７、ＣＶＡ－１９、ＣＶＡ－２０、ＣＶＡ－２１、ＣＶＡ－２２、およびＣＶＡ－２４を含む）に属する血清型を含む。
エコーウイルスは、エンテロウイルスＢに属する血清型を含む。代表的な血清型はＥ－ｌ、Ｅ－２、Ｅ－３、Ｅ－４、Ｅ－５、Ｅ－６、Ｅ－７、Ｅ－９、Ｅ－ｌ１～Ｅ－２１、Ｅ－２４、Ｅ－２５、Ｅ－２６、Ｅ－２７、Ｅ－２９、Ｅ－３０、Ｅ－３１、Ｅ－３２、およびＥ－３３を含む。
エンテロウイルスは、エンテロウイルスＡ（例示的な血清型は、ＥＶ－Ａ７１、ＥＶ－Ａ７６、ＥＶ－Ａ８９～ＥＶ－Ａ９２、ＥＶ－Ａ１１４、ＥＶ－Ａ１１９、ＥＶ－Ａ１２０、ＥＶ－Ａ１２１、ＳＶ１９、ＳＶ４３、ＳＶ４６、ＢａｂＥＶ－Ａ１３を含む）；エンテロウイルスＢ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｂ６９、ＥＶ－Ｂ７３～ＥＶ－Ｂ７５、ＥＶ－Ｂ７７～ＥＶ－Ｂ８８、ＥＶ－Ｂ９３、ＥＶ－Ｂ９７、ＥＶ－Ｂ９８、ＥＶ－Ｂ１００、ＥＶ－Ｂ１０１、ＥＶ－Ｂ１０６、ＥＶ－Ｂ１０７、ＥＶ－Ｂ１１０～ＥＶ－Ｂ１１３、およびＳＡ５を含む）；エンテロウイルスＣ（例示的血清型は、血清型ＥＶ－Ｃ９５、ＥＶ－Ｃ９６、ＥＶ－Ｃ９９、ＥＶ－Ｃ１０２、ＥＶ－Ｃ１０４、ＥＶ－Ｃ１０５、ＥＶ－Ｃ１０９、ＥＶ－Ｃ１１３、ＥＶ－Ｃ１１６、ＥＶ－Ｃ１１７、ＥＶ－Ｃ１１８を含む）；エンテロウイルスＤ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｄ６８、ＥＶ－Ｄ７０、ＥＶ－Ｄ９４、ＥＶ－Ｄ１１１、およびＥＶ－Ｄ１２０を含む）；エンテロウイルスＥ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｅ１、ＥＶ－Ｅ２、ＥＶ－Ｅ３、ＥＶ－Ｅ４、およびＥＶ－Ｅ５を含む）；エンテロウイルスＦ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｆ１、ＥＶ－Ｆ２、ＥＶ－Ｆ３、ＥＶ－Ｆ４、ＥＶ－Ｆ５、ＥＶ－Ｆ６、およびＥＶ－Ｆ７を含む）；エンテロウイルスＧ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｇ１～ＥＶ－Ｇ２０を含む）；エンテロウイルスＨ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｈを含む）；エンテロウイルスＩ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｉ１およびＥＶ－Ｉ２を含む）；エンテロウイルスＪ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｊ１、ＥＶ－Ｊ１０３、およびＥＶ－Ｊ１０８を含む）；エンテロウイルスＫ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｋ１およびＥＶ－Ｋ２を含む）；およびエンテロウイルスＬ（例示的血清型は、ＥＶ－Ｌ１を含む）に属する血清型を含む。
ライノウイルスは、ライノウイルスＡ（例示的な血清型はＲＶ－Ａ１、ＲＶ－Ａ１Ｂ、ＲＶ－Ａ２、ＲＶ－Ａ７～ＲＶ－Ａ１３、ＲＶ－Ａ１５、ＲＶ－Ａ１６、ＲＶ－Ａ１８～ＲＶ－Ａ２５、ＲＶ－Ａ２８～ＲＶ－Ａ３４、ＲＶ－Ａ３６、ＲＶ－Ａ３８～ＲＶ－Ａ４１、ＲＶ－Ａ４３、ＲＶ－Ａ４５～ＲＶ－Ａ４７、ＲＶ－Ａ４９～ＲＶ－Ａ５１、ＲＶ－Ａ５３～ＲＶ－Ａ６８、ＲＶ－Ａ７１、ＲＶ－Ａ７３～ＲＶ－Ａ７８、ＲＶ－Ａ８０～ＲＶ－Ａ８２、ＲＶ－Ａ８５、ＲＶ－Ａ８８～ＲＶ－Ａ９０、ＲＶ－Ａ９４、ＲＶ－Ａ９６、ＲＶ－Ａ１００～ＲＶ－Ａ１０８を含む）；ライノウイルスＢ（例示的血清型はＲＶ－Ｂ３～ＲＶ－Ｂ６、ＲＶ－Ｂ１４、ＲＶ－Ｂ１７、ＲＶ－Ｂ２６、ＲＶ－Ｂ２７、ＲＶ－Ｂ３５、ＲＶ－Ｂ３７、ＲＶ－Ｂ４２、ＲＶ－Ｂ４８、ＲＶ－Ｂ５２、ＲＶ－Ｂ６９、ＲＶ－Ｂ７０、ＲＶ－Ｂ７２、ＲＶ－Ｂ７９、ＲＶ－Ｂ８３、ＲＶ－Ｂ８４、ＲＶ－Ｂ８６、ＲＶ－Ｂ９１～ＲＶ－Ｂ９３、ＲＶ－Ｂ９７、およびＲＶ－Ｂ９９～ＲＶ－Ｂ１０４を含む）；ライノウイルスＣ（例示的血清型は、血清型ＲＶ－Ｃ１～ＲＶ－Ｃ５１、ＲＶ－Ｃ５４、ＲＶ－Ｃ５５、およびＲＶ－Ｃ５６を含む）を含む。
ポリオウイルスは、エンテロウイルスＣに属する血清型を含む例示的なポリオウイルス血清型は、ＰＶ－１、ＰＶ－２およびＰＶ－３を含む。これらのポリオウイルスの３つの血清型は、それぞれ、わずかに異なるカプシドタンパク質を有する。カプシドタンパク質は、細胞受容体特異性およびウイルス抗原性を規定する。ＰＶ－１は、自然界に遭遇する最も一般的な形態であるが、３つの形態はすべて、非常に感染性である。ポリオウイルスは脊髄に影響を及ぼすことがあり、髄膜炎を引き起こす可能性がある。
欠陥干渉粒子
欠陥干渉（ＤＩ）粒子（ＤＩＰ）はウイルス由来であり、それらと同種の野生型ウイルス（標準ウイルス、ＳＴＶと呼ばれる場合もある）と同様の構造的特徴を共有しているが、しかしウイルスゲノムの切断形態を含んでいる。ゲノム情報の欠損の結果、ＤＩＰはウイルス複製に欠陥があるため、いったんは細胞内に導入されても子孫ビリオンの産生を引き起こすことができない。しかしながら、完全な感染性をもつ相同ＳＴＶとの重複感染によって補完すると、正常のウイルス生活環との干渉を観察することができ、ＳＴＶ複製および主に非感染性子孫ＤＰの放出を抑制することができる。このアウトカムは、全長（ＦＬ）対応物を上回るＤＩゲノムの増殖上の利点の結果であり、増強されたゲノム複製、細胞またはウイルス資源目当ての競合に打ち勝ち（out-competition）、そしてウイルス粒子中への優先的なパッケージングによって具現化される。さらに、ウイルスの複製を抑制するＤＩＰの能力を考慮して、抗ウイルス剤としてのＤＩＰの潜在的用途における関心が高まっていることが報告されている。しかしながら、感染動物における野生型ウイルスに対するＤＩＰの防御効果は十分に特徴付けられておらず、ＤＩＰを有効な抗ウイルス剤および治療剤として使用できるかどうかは依然としてあまり明白ではない。
以下により詳細に示すように、ポリオウイルスの代表的ＤＩＰであるｅＴＩＰは、細胞培養および感染動物において産生され試験されてきた。以下に記載される実験データは、本開示のｅＴＩＰが、野生型ポリオウイルス、非ポリオエンテロウイルス、およびインフルエンザウイルスの種々の株を含む広範囲のＲＮＡウイルスを阻害することを実証する。特に、本明細書に記載の実験データは、ｅＴＩＰを、鼻腔内接種による予防用抗ウイルス剤および治療用抗ウイルス剤として使用できることを実証している。さらに、本明細書に記載の実験データは、ｅＴＩＰが、ウイルス感染に対する防御に重要な役割を果たす、宿主のインターフェロン応答を誘導することを実証している。一緒にまとめると、本明細書に記載の実験データは、ポリオウイルスＤＩＰによって例示されるＤＩＰが、ポリオウイルス、非ポリオエンテロウイルス、ライノウイルスおよびインフルエンザウイルスをはじめとする広範囲のＲＮＡウイルスに対して広域スペクトル抗ウイルス効果を付与することができることを実証した。特に、本明細書に提示されるデータは、ｅＴＩＰが、予防的投与および／または治療的投与としての鼻腔内感染により、粘膜表面で致死性ポリオウイルスを防御することを実証している。さらに、本明細書で提示されるデータは、気道におけるｅＴＩＰ誘導性粘膜免疫がこの防御効果に寄与することを実証している。
本明細書では、多様なウイルス感染を治療的および予防的に防御する、安全な広域スペクトル抗ウイルス剤を開発するために利用できるＤＶＧが提供される。一実施形態では、いくつかのエンテロウイルス、ＣＯＶＩＤ－１９およびインフルエンザ（Ｆｌｕ）を含むある範囲の呼吸器ウイルス感染に対抗するために、宿主に有害な副作用を伴わずに鼻腔内投与することができるナノ粒子ＤＶＧである、ｅＴＩＰｌが本明細書で提供される。ｅＴＩＰｌの鼻腔内接種は、感染の４８時間前または誘発後２４時間目に投与したとしても防御を提供することができるので、小分子抗ウイルス剤と比べて遜色ない有効な治療可能時間域を提供することができる。
以下の実施例でより詳細に説明されるように、ある特定の本開示のＤＩＰは、治療的抗ウイルス戦略としての使用に適している。特に、重複感染により試験した場合、細胞培養において広範囲のエンテロウイルスとライノウイルスの両方に対して感染を１０～１００分の１に減少させることができることによって示されるように、非常に有効なｅＴＩＰが開発され実証された。本明細書に提示される実験データはまた、本明細書に開示されるｅＴＩＰが安全であり、異なるエンテロウイルス（例えば、図１～３参照）およびライノウイルス（例えば、図１および３を参照）によって引き起こされる感染および死亡から動物を防御することを実証している。免疫不全マウスにおいて、競合効果は、（ｉ）ゲノム配列との類似性、（ｉｉ）パッケージングの効率、および／または（ｉｉｉ）動物に送達された初期比と相関するように見える。さらに、本明細書に提示される実験データは、ｅＴＩＰが治療的（例えば図６を参照）にも予防的にも作用することができることを実証する。具体的には、本明細書に提示される実験データは、動物モデルにおいて多数のエンテロウイルス（例えば、コクサッキーウイルスＢ３、他のポリオウイルス血清型株、ＥＶ－Ｄ６８）およびＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスからの、ｅＴＩＰ交差防御を実証する。特に、鼻腔内接種後の粘膜表面で最も強固な防御が観察された。また、ｅＴＩＰは、野生型ウイルスによる誘発（challenge）の４８時間前までに投与された場合であっても（予防効果）、誘発後に５日間連続して投与された場合でも（治療効果）、鼻腔内接種からマウスを防御することができることが観察された。
ｅＴＩＰが何故および如何にして感染動物においてそれらの防御効果を発揮するのかを調べるために、作用機序実験も実施した（例えば、図３、図４および図５を参照のこと）。ｅＴＩＰの複製が防御に必要であることが観察された。全体的に、この作用機序の理解は、出願人がＤＩＰ設計を改良して、それらの知見を他のウイルスファミリーに移し替える（translate）ことができるようにする。具体的には、本明細書に記載の実験データは、（ｉ）ｅＴＩＰによる前処理がインターフェロン応答を誘導すること（宿主ｍＲＮＡトランスクリプトーム研究に示されるように）、（ｉｉ）インターフェロン応答が野生型マウスにおける防御に重要な役割を果たすこと、および（ｉｉｉ）ｅＴＩＰに対して重要な役割を果たす局所的な自然免疫応答の誘導が、ウイルス複製を阻害することを実証した。
抗菌剤およびワクチンの大成功にもかかわらず、細菌、ウイルスまたは寄生虫のいずれであるかを問わずに、感染症の拡散を効果的に制御することは並外れて困難であることが判明した。ポリオウイルスの撲滅作戦として、誰かが人々へのワクチン接種を停止すると、誰かが代替のワクチンおよび抗ウイルス剤を開発しなければならないだろう。ヒト、家畜、および飼育種におけるウイルス病を予防するための、新規または改良ワクチンの創製は、出現するウイルスの大流行により、かなり困難のままであり、ワクチンは常に効果的というわけではなく、それを試験することは時間を要する。ウイルスには、現在使用されている限定範囲の抗ウイルス剤に対して耐性になるという不穏な能力がある。インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス剤としてのｅＴＩＰには賛否両論があるけれども、ｅＴＩＰアプローチは、従来の薬剤ベースの療法およびワクチンを上回るいくつかの潜在的利益を提供する。
ｅＴＩＰと野生型ゲノムとの間の相互作用のさらなる解析は、感染性生物におけるウイルス複製の基本的機序、並びにウイルス感染過程の活性調節の基本的機序への追加的な見識を得ることが期待される。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、ｅＴＩＰは、ヘルパーウイルスによりコードされる複製および構造タンパク質と競合することによって、ヘルパーウイルスを犠牲にして優先的に複製され、細胞の持続性ウイルス感染の確立および維持を促進することができると考えられる。また、これらのｅＴＩＰ粒子は、ＲＮＡゲノムにおける遺伝子組み換えの分子機序に関連し得ると仮定される。ｅＴＩＰゲノムの生成は、おそらくはコピー選択機序によって、非相同組み換えにより果たされうる。
最も重要なことに第３の可能性は、ｅＴＩＰまたはウイルス－ｅＴＩＰ重複感染が、自然免疫と獲得免疫を調節する役割を果たしうることである。特に、以下に詳述するように、鼻腔内感染によるｅＴＩＰでの野生型マウスの前処理実験では、４８時間前処理でｅＴＩＰの防御率が８０％であると認められたが、一方で２４時間前処理では全く有意な防御効果は認められなかった。ｅＴＩＰは、ウイルスに対するｅＴＩＰ防御効果を高めるための宿主インターフェロン応答の刺激剤として用いることができる。インターフェロン応答は脾臓でも観察され、このことは、細胞型特異的免疫応答（例えば、樹状細胞、マクロファージまたはＴ細胞応答）がこれらの条件の範囲内で誘導されたことを示唆している。ｅＴＩＰは、粘膜免疫および細胞型特異的免疫を刺激するための抗ウイルス剤および広域ワクチンとして使用できることが期待される。ｅＴＩＰはワクチンアジュバントとしても使用できることが期待される。
ＤＶＧは、宿主資源を目当てに親ウイルスと競合することによって感染を調節すると考えられたが、本明細書で提供される実験は、ｅＴＩＰ１防御作用機序が自然応答の誘導に依存することを示した。この考え方と一致して、本明細書で提供されるデータは、ｅＴＩＰｌ処置がＩ型インターフェロンに欠損のある動物を防御しないことを示す（図９Ｃ～９Ｄ）。さらに、ｅＴＩＰｌは、本明細書に提供される提唱された作用機序と一致する、非細胞自律的様式（図１０Ａ～１０Ｄ）において、異なるファミリー由来のウイルスに対しても高度に効果的な防御を提供する。
ウイルス感染は、抗ウイルス剤開発にいくつかの固有の課題を提示しており、最も顕著であるのは、ほとんどの薬物療法と抗体療法までも無効にしてしまう変異可塑性である。直接ウイルス感染に対処するための唯一の利用可能なツールであるワクチン接種は、生物の自然防御を利用する。同様のアプローチは、現在のところ予防または治療に利用可能でない。本明細書で提供されるのは、例えばｅＴＩＰｌであり、これは、この緊急の必要性を満たす抗ウイルス剤開発において、新規概念を提供する。ｅＴＩＰ１は、小分子抗ウイルス剤またはモノクローナル抗体などの従来の薬剤ベースの治療法を上回る、いくつかの潜在的利点を付与することができる。ウイルスは、現在利用可能な限定範囲の抗ウイルス剤または抗体に対して耐性になる高い能力を持つが、単回投与のｅＴＩＰｌは、宿主自身の抗ウイルス性防御（因子）を動員して少なくとも数日間持続する抗ウイルス状態を作り出すことができる。ｅＴＩＰｌは、多成分抗ウイルス応答を多様なＩＳＧ（ＩＦＮ感作遺伝子）の形で誘導することができ、これはウイルスの突然変異を介した耐性の発生に対して不応性であるだろう。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、幾つかの重要な安全性特徴を有するｅＴＩＰ、例えばｅＴＩＰｌであり、多くの重要な安全性特徴を有する。第一に、ｅＴＩＰｌは、それ自体疾患を引き起こすことのない安全なポリオウイルス主鎖をベースにしたものであり、非侵襲的に投与することができる。第二に、ｅＴＩＰｌは良性の感染を模倣しているが、その複製は接種部位付近の少数の細胞に限定される（図１０Ｂおよび図１０Ｄ）。従って、ｅＴＩＰ２は、疾患を引き起こさないが、非細胞自律性防御免疫応答を誘発する（図１０Ｃ）。第三に、ｅＴＩＰｌは、それが侵入する少数の細胞において自己増幅することができるため、完全な非細胞自律性抗ウイルス防御を誘導するのに、より少量のｅＴＩＰｌ ＲＮＡを必要とする。最後に、ｅＴＩＰｌのナノ粒子製剤は、既存の免疫が反復投与過程を妨害してしまうだろうといういずれの懸念も回避する。
ｅＴＩＰｌ防御作用の別の重要な特徴は、バランスの取れた非有害の抗ウイルス状態を誘導することができる点である。実際に、ｅＴＩＰｌで処置された動物のいずれにも体重減少や苦痛の兆候がなく、ＳＡＲＳに重複感染したものであっても、病気の兆候は認められなかった。対照的に、インターフェロン、またはポリ（Ｉ：Ｃ）もしくは５′三リン酸ｄｓＲＮＡのようなｄｓＲＮＡ模倣分子の投与に依存する抗ウイルス処置は、熱、頭痛、疲労、関節痛、および筋肉痛などの重大な副作用を有することが報告されている。従って、本明細書に提供されるｅＴＩＰ１は、インターフェロン投与の有害作用を回避するために重要である、バランスのとれた自然応答の調節を達成することができる。
鼻腔内単回投与後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｅＴＩＰｌの防御効果は、進行中のＣＯＶＩＤ－１９パンデミック、およびインフルエンザや普通の風邪を含む将来の呼吸器疾患、並びに他のエンテロウイルス疾患と闘うための、強力な予防および治療用武器（対抗手段）を提供することができる。ＣＯＶＩＤの場合、ｅＴＩＰｌは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による炎症誘発性（proinflammatory）応答の誘導を阻止し、それによって肺および脳への損傷を防ぐことができる（図１１Ａ～図１１Ｅ）。誘発されたサイトカインは、炎症誘発性ではなく抗ウイルス性である（図９Ａおよび図１０Ａ）。従って、ｅＴＩＰｌは、ＣＯＶＩＤ１９を制御することにおいて重要な第１段階であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製をブロックするが、炎症からのＳＡＲＳ感染に対する宿主応答を有効な抗ウイルス応答へと方向転換し、それが疾患からの治療的防御を増加させるだろう。実際に、ＳＡＲＳ感染動物へのｅＴＩＰｌ投与は、疾患から防御することができ、肺にリンパ球細胞を動員する（図９Ｂ）けれども、炎症誘発性サイトカインの産生を阻止することができる（図１２Ｂ～１２Ｃ）。従って、ｅＴＩＰｌは、抗ウイルス性免疫を媒介しかつ炎症を予防することができる。
併せて、本明細書に記載される実験データは、本開示のポリオウイルスｅＴＩＰが、感染動物におけるインフルエンザウイルスを含む野生型エンテロウイルスの様々な株を阻害することができ、ｅＴＩＰが、バランスの取れた、安全で、かつ制御された様式で、免疫系が疾患を引き起こすことなく防御を提供するということを確実にするように進化した調節回路を利用して、感染と闘うために自然過程を活用する、有効な抗ウイルスアプローチであるという概念を実証した。これらの研究では、ｅＴＩＰの複製が防御にとって重要である。本明細書に記載の実験データはさらに、ｅＴＩＰが、高病原性ウイルスによる呼吸器感染から防御することができ、重要なことに、ヒト病原体の多様な集団に対する防御のための予防および治療戦略として使用できることを実証する。いかなる特定の理論にも縛られることなく、免疫能のあるマウスへの効果は、自然免疫応答の刺激に起因する可能性がある。本明細書に提供される抗ウイルス療法は、他の従来の薬剤ベースの療法よりも大きな利点および安全性を提供することができ、ＣＯＶＩＤと闘うためのアプローチを変更し、ウイルス脅威を出現および／または再出現させうるアプローチを一変させることが可能である。
本開示の組成物
Ａ．核酸構築物
上記で概説したように、本開示の一態様は、改変エンテロウイルスゲノムをコードする核酸配列を含む新規核酸構築物に関する。例えば、改変エンテロウイルスゲノムは、親エンテロウイルスゲノムの１つ以上のゲノム領域に欠失、置換および／または挿入を含むことができる。
本開示の核酸構築物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部分を欠いている。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４のうちの１つ以上をコードする配列の少なくとも一部分を欠いている。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ＶＰ１をコードする配列の一部分または全配列を欠いている。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ＶＰ２をコードする配列の一部分または全配列を欠いている。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ＶＰ３をコードする配列の一部分または全配列を欠いている。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ＶＰ４をコードする配列の一部分または全配列を欠いている。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４の組み合わせをコードする配列の一部分または全配列を欠いている。
いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的部分を欠いている。当業者は、当業者による配列の手動評価によるか、またはＢＬＡＳＴ（商標）等のアルゴリズムを用いたコンピュータ自動化配列比較および同定（例えば、”Basic Local Alignment Search Tool”; Altschul SF 他、J. Mol. Biol. 215:403-410, 1993を参照されたい）によるかのいずれかにより、ウイルス構造ポリペプチドをコードする核酸配列の実質的部分が、そのポリペプチドを予測同定するのに十分な、ウイルス構造ポリペプチドをコードする核酸配列の部分を含むことができることを理解するであろう。従って、ヌクレオチド配列の実質的部分は、その配列を含む核酸断片の特異的同定および／または単離をもたらすのに十分な配列を含む。例えば、核酸配列の実質的部分は、全長配列の少なくとも約２０％、例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％を含むことができる。本開示は、１つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする部分的または完全な核酸配列を欠いている核酸分子および核酸構築物を提供する。当業者は、本明細書に開示されるような配列の利点があれば、当業者に既知である目的のために、開示配列の全部または実質的部分を容易に使用することができる。従って、本願は、本明細書に開示されるような完全配列、例えば添付の配列表中に記載されたもの、並びに上記に定義されたそれらの配列の実質的部分を包含する。
いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ウイルス構造タンパク質をコードする全配列を欠いており、例えば、改変エンテロウイルスゲノムは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を全く含まない。
いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ライノウイルスＡ、ライノウイルスＢ、およびライノウイルスＣから成る群より選択されたライノウイルス種に属するウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、エンテロウイルスＡ、エンテロウイルスＢ、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＥ、エンテロウイルスＦ、エンテロウイルスＧ、エンテロウイルスＨ、エンテロウイルスＩ、エンテロウイルスＪ、エンテロウイルスＫ、およびエンテロウイルスＬから成る群より選択されたエンテロウイルス種に属するウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、エンテロウイルスＣ種のポリオウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムは、ＰＶ１、ＰＶ２およびＰＶ３から成る群より選択されたポリオウイルス血清型に由来する。いくつかの実施形態では、改変ポリオウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ポリオウイルス１型（ＰＶ１）に由来する。
いくつかの実施形態では、改変ポリオウイルスゲノムをコードする核酸配列は、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。注目すべきエンテロウイルスの構造タンパク質をコードする配列に対して高度の配列同一性（例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）を有する核酸配列は、本明細書中に同定された配列（例えば配列番号１）または当業界で既知であるような他の任意のものを使うことにより、それぞれのエンテロウイルスゲノムにおいて同定された配列由来の縮重プライマーもしくは遺伝子特異的プライマーを用いるゲノム配列分析、ハイブリダイゼーション、および／またはＰＣＲによって、同定しそして／または単離することができる。
ＤＮＡの２つ以上の配列を一緒に操作可能に連結するための基本的な技術は、熟練技術者に精通しており、そのような方法は、標準的な分子生物学的操作について多数の文書に記載されている。これらの新規核酸分子を構築しそして特徴づける分子技術および方法は、本明細書の実施例においてより詳細に記載されている。
本開示のいくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムをコードする核酸配列は、異種核酸配列に操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、プロモーター配列または選択可能マーカーのためのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、改変エンテロウイルスゲノムをコードする核酸配列は、発現カセットまたは発現ベクターに組み込まれる。発現カセットは、概して、コード配列および細胞内、生体内（in vivo）および／または生体外（ex vivo）でコード配列の適切な転写および／または翻訳を指令するのに十分な調節情報を含む、遺伝物質の構築物を包含することが理解されるだろう。一般に、発現カセットは、所望の宿主細胞におよび／または個体に標的指向化するためにベクター中に挿入されてもよい。従って、いくつかの実施形態では、本開示の発現カセットは、本明細書に開示されるような改変エンテロウイルスゲノムをコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、プロモーターなどの発現調節要素に操作可能に連結され、任意選択的に、コード配列の転写または翻訳に影響を与える他の核酸配列の任意のまたは１つの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は発現ベクターに組み込まれる。「ベクター」という用語は、一般に、宿主細胞間の移し替えのために設計された組み換えポリヌクレオチド構築物を意味し、宿主細胞への異種ＤＮＡの導入などの形質転換のために使用され得ることが当業者には理解されよう。従って、いくつかの実施形態では、ベクターは、挿入されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントを挿入することができる、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり得る。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、組み込み型ベクターであり得る。
Ｂ．組み換え細胞
本開示の核酸構築物を宿主細胞に導入して、核酸分子を含む組み換え細胞を作製することができる。従って、本明細書に記載される改変エンテロウイルスゲノムをコードする核酸構築物を含む原核細胞または真核細胞もまた、本開示の特徴である。関連する態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に提供されるような核酸構築物を、動物細胞などの宿主細胞に導入し、次いで形質転換細胞を選択またはスクリーニングすることを含む、細胞を形質転換する方法に関する。本開示の核酸分子の細胞内への導入は、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などの当業者に公知の方法によって達成することができる。
関連する態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の核酸構築物を含む組み換え細胞、例えば組み換え動物細胞に関する。核酸構築物は、宿主ゲノム中に安定的に統合することができ、または、エピソーム的に複製させることができ、または安定発現もしくは一過性発現のための小型環状発現ベクターとして組み換え宿主細胞内に存在することができる。従って、本開示のいくつかの実施形態では、本開示のいくつかの実施形態では、核酸構築物は、エピソーム単位として組み換え宿主細胞内に維持されて複製される。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、組み換え細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。古典的なランダムゲノム組み換え技術を用いて、またはガイドＲＮＡ指令型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９もしくはＴＡＬＥＮゲノム編集などのより正確なゲノム編集技術を使用して、安定な統合を完成させることができる。いくつかの実施形態では、組み換え宿主細胞内に存在する核酸構築物は、安定または一過性発現のための小型環状発現ベクターとして存在する。
本開示において有用な宿主細胞は、本明細書に記載の核酸構築物を導入することができるものである。一般的な宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、例えばＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ ２）、ＨｅＬａ Ｓ３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ ２．２）、ＢＳＣ－１細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ ２６）由来のＢＳＣ－４０細胞と命名されたアフリカミドリザル細胞、およびＨＥｐ－２細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ ２３）である。エンテロウイルス核酸構築物は、連続継代の前にカプシドに包み込まれるので、そのような連続継代用の宿主細胞は、一般に、エンテロウイルス複製、例えばポリオウイルス複製に対して許容性（permissive）である。エンテロウイルス複製に許容性である細胞は、改変エンテロウイルスゲノムに感染し、ウイルス核酸の複製、ウイルスタンパク質の発現、および子孫ウイルス粒子の形成を可能にする細胞である。試験管内（in vitro）では、ポリオウイルスは宿主細胞を溶解させる。しかしながら、生体内（in vivo）では、ポリオウイルスは、溶菌様式では作用しないことがある。非許容性細胞は、許容性細胞となるように適合させることができ、そのような細胞は、本開示で使用できる宿主細胞のカテゴリーに含められるものである。例えば、ポリオウイルス複製に対して通常は非許容性である細胞株のマウス細胞系Ｌ９２９は、ポリオウイルス受容体をコードする遺伝子を用いたトランスフェクションによりポリオウイルス複製を許容するように適合されている。このより多くの関連情報は、例えば、Mendelsohn、C.L.他 (1989) Cell 56:855-865;Mendelsohn、C.L.他 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7845-7849に見つけることができる。
いくつかの実施形態では、組み換え細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は生体内（in vivo）である。いくつかの実施形態では、細胞は生体外（ex vivo）である。いくつかの実施形態では、細胞は試験管内（in vitro）である。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト霊長類細胞である。
上述した多種多様な宿主細胞および種を形質転換するための技術は、当該技術分野で公知であり、技術文献や科学文献に記載されている。従って、本明細書に開示の少なくとも１つの組み換え細胞を含む細胞培養も、本出願の範囲内である。細胞培養物の作製および維持に適した方法およびシステムは、当該技術分野で公知である。
Ｃ．本開示のエンテロウイルス欠陥干渉粒子
本開示の一態様では、本明細書で提供されるのは、エンテロウイルス欠陥干渉（ＤＩ）粒子を産生するための方法である。いくつかの実施形態では、該方法は、ａ）エンテロウイルス構造タンパク質またはその一部分を発現するように操作された宿主細胞を提供する工程と、ｂ）提供された宿主細胞を本開示の核酸構築物でトランスフェクトする工程と、ｃ）発現されたエンテロウイルス構造タンパク質またはその一部分により包み込まれた核酸構成物を含むエンテロウイルスのＤＩＰの産生の条件下で、トランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程と、を含む。
本明細書に開示されるエンテロウイルスのＤＩ粒子の産生方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、構造タンパク質のコード配列を含む完全なエンテロウイルスゲノムを有するエンテロウイルス（場合により「ヘルパーウイルス」と呼ばれることもある）に予め感染している。いくつかの実施形態では、宿主細胞によって発現されるエンテロウイルス構造タンパク質の少なくとも１つは、核酸構築物によってコードされるエンテロウイルスゲノムに対して異種である。例えば、いくつかの実施形態では、発現されたエンテロウイルス構造タンパク質の少なくとも１つは、核酸構築物によりコードされるエンテロウイルスゲノムが誘導されるエンテロウイルス種とは異なるエンテロウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、宿主細胞によって発現されるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３および／またはＶＰ４をコードする配列の少なくとも一部は、核酸構築物によってコードされるエンテロウイルスゲノムに対して異種である。いくつかの実施形態では、宿主細胞により発現されるエンテロウイルス構造タンパク質の全部が、改変エンテロウイルスゲノムの由来である同一のエンテロウイルス種に由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるエンテロウイルスＤＰの製造方法は、生成されたＤＩＰを収集および／または精製することをさらに含む。エンテロウイルスＤＩＰの収集および／または精製に適した方法、アプローチ、プロトコル、およびシステムは、当該技術分野で公知である。例えば、本開示に従って製造されたエンテロウイルスＤＩＰは、遠心分離、濾過、ＰＥＧ沈殿、または抗表面抗体のカラムへの通過といった１つ以上の方法によって収集することができる。この点におけるより多くの情報は、例えば、米国特許第５，９８０，９０１号明細書およびＰＣＴ特許公報ＷＯ２００７１３５４２０Ａ２に見出すことができる。従って、本明細書に記載された方法によって製造されたＤＩＰもまた、本開示の範囲内である。
関連態様では、本明細書に提供されるのは、本開示の核酸構築物を含むエンテロウイルスＤＩＰである。いくつかの実施形態では、エンテロウイルスＤＩ粒子は、異種カプシド構造タンパク質、例えば、異なるウイルスゲノムに由来する（例えばそれから発現される）カプシド構造タンパク質により包み込まれている、本開示の核酸構築物を含む。いくつかの実施形態では、エンテロウイルスＤＩ粒子は、同種ヘルパー野生型ウイルスに由来する（例えばそれから発現される）カプシド構造タンパク質によって包み込まれている、本開示の核酸構築物を含む。
Ｄ．医薬組成物
本開示の核酸構築物、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、組み換え細胞、および／または細胞培養物は、医薬組成物をはじめとする組成物中に組み込むことができる。そのような組成物は、一般に、本明細書に提供および説明されるような核酸構築物、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、組み換え細胞、および／または細胞培養物のうちの１つ以上、薬学的に許容される賦形剤、例えば担体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、健康状態、例えば免疫疾患またはウイルス感染の予防、治療または管理のために製剤化される。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のＤＩＰと薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の核酸構築物と薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、該組成物は、（ｉ）本明細書に記載のＤＩＰ、（ｉｉ）本明細書に記載の核酸構築物、および（ｉｉｉ）薬学的に許容される賦形剤を含む。
いくつかの実施形態では、核酸構築物および／またはＤＩＰは、リポソームに製剤化される。いくつかの実施形態では、核酸構築物および／またはＤＩＰは脂質ナノ粒子へと製剤化される。いくつかの実施形態では、核酸構築物および／またはＤＩＰは、ポリマーナノ粒子へと製剤化される。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、免疫原性組成物、例えば、対象において免疫応答を刺激することができる組成物である。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、ワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物はアジュバントとして製剤化される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、および経口投与のうちの１つ以上のために製剤化される。
注射用に適した医薬組成物は、無菌注射用の溶剤または分散剤を一時的に調製するための滅菌水溶液または分散媒と、無菌粉末とを含む。静脈内投与用については、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（ＢＡＳＦ社、米国ニュージャージー州Parsippany）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されなければならず、容易な注入針通過性（syringability）が存在する程度に流動性でなければならない。製造および貯蔵の条件下で安定であり得、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散体の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムを使用することによって、維持することができる。微生物の作用の防止は、各種の抗菌剤および防カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザール等により達成することができる。多くの場合、一般に、等張化剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めるのが一般的だろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
滅菌注射可能な溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせを用いて、必要量の活性化合物を必要量で含有させた後、濾過滅菌によって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を無菌ビヒクルに組み込むことによって調製され、無菌ビヒクルは、基本的な分散媒と、上記に列挙したものから選択された必要な他の成分とを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、鼻腔内投与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、または頭蓋内投与のうちの１つ以上のために処方される。いくつかの実施形態では、投与された組成物は、対象においてインターフェロンの産生を増加させる。
本開示の方法
本明細書に記載の治療用組成物のいずれか１つの投与は、例えば、核酸構築物、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、組み換え細胞、および医薬組成物の投与は、免疫疾患および微生物感染（例えばウイルス感染）などの関連する健康状態について対象を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸構築物、ＤＩＰ、組み換え細胞、および医薬組成物は、自己免疫疾患またはウイルス感染などの１つ以上の健康状態を発症する疑いがあるかまたはそのリスクが高い対象を予防または治療する方法において使用するための治療薬に組み込むことができる。
従って、一態様では、必要とする対象において免疫応答を誘発するための方法が提供され、本方法は、（ａ）本開示のＤＩＰ、（ｂ）本開示の核酸構築物、（ｃ）本開示の組み換え細胞、および／または（ｄ）本開示の医薬組成物、を含む組成物を対象に投与することを含む。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、必要とする対象において健康状態を予防および／または治療するための方法であり、本方法は、（ａ）本開示のＤＩＰ、（ｂ）本開示の核酸構築物、（ｃ）本開示の組み換え細胞、および／または（ｄ）本開示の医薬組成物、を含む組成物を対象に予防的にもしくは治療的に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＩＰは、粘膜免疫応答を刺激するための、並びに全身性免疫応答を刺激するための組成物において使用することができる。粘膜免疫応答は、粘膜細胞を介して宿主細胞に侵入することができるウイルスなどの感染性物質に対する防御の最前線を提供するために、重要な免疫応答である。本開示のエンテロウイルスＤＩＰを投与すると、対象は、一般に粘膜と全身性の両方の抗エンテロウイルス抗体を産生することによって免疫処置に応答する。本開示のエンテロウイルス核酸構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態において、対象にて全身性および粘膜免疫応答を刺激するための組成物においても使用することができる。いくつかの実施形態では、エンテロウイルス核酸構築物のＲＮＡ形態の投与は、それが通常は宿主細胞ゲノムに統合されないという理由で、実施される。
本開示のＤＩＰおよび／またはカプシドに内包されていない（non-encapsidated）エンテロウイルス核酸構築物は、薬学的に許容される担体中で、および免疫応答を刺激するのに有効な量で、対象に投与することができる。一般に、対象は、最初の一連の注射（または後述する他の経路の１つを経由した投与）を通して免疫処置することができ、続いて、最初の一連の投与によって得られる防御を増加させるためにブースター（追加免疫）が与えられる。最初の一連の注射および後続のブースター投与は、対象において免疫応答を刺激するのに必要とされるような用量および時間にわたって投与される。
上述したように、注射用に適した薬学的に許容される担体には、滅菌可能な注射用溶液または分散液を即座に調製するための無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液と、無菌粉末とが含まれる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易な注射針通過性（syringability）が存在する程度に流動性でなければならない。組成物は、製造および貯蔵の条件下でさらに安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、分散時に必要な粒子サイズを維持することにより、界面活性剤を使用することにより、レシチンなどのコーティングを使用することにより、維持することができる。微生物の作用の防止は、各種の抗菌剤や防カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザール等により達成することができる。
無菌注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙された成分のうちの１つまたは組み合わせを用いて、必要とされるマウント中にＤＩＰを組み込むことによって調製することができ、その後、滅菌ろ過によって調製することができる。
ＤＩＰおよび／またはカプシドに内包されていない（non-encapsidated）エンテロウイルス核酸構築物が適切に保護されている場合、上述のように、それらは、例えば不活性希釈剤または同化できる可食性担体を用いて経口投与することができる。ＤＩＰおよび／またはカプシドに内包されていないエンテロウイルス核酸構築物および他の成分は、硬質または軟質シェルのゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、または個体の食餌に直接組み込まれてもよい。経口治療投与のために、活性化合物は賦形剤を含有してもよく、チュアブル錠、バッカル錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェファーなどの形態で使用されてもよい。
本開示のＤＰを産生する組み換え細胞を対象に導入することができ、それにより、エンテロウイルス核酸構築物によってコードされた要素に対する免疫応答を感作することができる。いくつかの実施形態では、対象に導入された組み換え細胞は、最初に対象から除去され、上記の両方のエンテロウイルス核酸構築物と生体外で接触する。ＤＩＰを産生する組み換え細胞は、次いで、例えば、注入または移植によって、対象に再導入することができる。この方法によって改変でき、対象に注入することができる細胞の例としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球およびマクロファージなどの末梢血単核細胞が挙げられる。皮膚細胞および粘膜細胞などの他の細胞を改変し、対象に移植することもできる
本開示の方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物、例えば、核酸構築物、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、組み換え細胞は、自己免疫疾患を発症する疑いがあるか、またはそのリスクが高い対象を、予防または治療する方法で使用するための治療用組成物に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、組み換え細胞は、ウイルス感染を有するか、有する疑いがあるか、または発症するリスクが高い対象を予防または治療する方法で使用するための治療用組成物に組み込まれる。いくつかの実施形態では、感染は季節性呼吸器ウイルス感染または急性呼吸器ウイルス感染である。いくつかの実施形態では、感染は、ヒトオルソニューモウイルス（Human orthopneumovirus）属の種、エンテロウイルス（Enterovirus）科の種、コロナウイルス（Coronaviridae）科の種、またはオルソミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科の亜型に属するウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、オルソミクソウイルスは、インフルエンザウイルスまたはパラインフルエンザウイルスである。本明細書に記載の方法に適したインフルエンザＡ型ウイルスの亜型の非限定的例としては、インフルエンザＡ型の亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７が挙げられる。
本開示の方法に適したパラインフルエンザウイルス亜型の例としては、パラインフルエンザ亜型ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、ＨＰＩＶ－４が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、β－ＣｏＶ重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスβ－ＣｏＶ感染は、１つ以上のサルベコウイルス（Salbecovirus）亜属に関連する。適当なサルベコウイルス亜属の例としては、限定されないが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ｂａｔ ＳＬ－ＣｏＶ－ＷＩＶｌ等の全ての株を含む）、平頭コウモリ（Tylonycteris bat）コロナウイルスＨＫＵ４（ＢｔＣｏＶ－ＨＫＵ４）、アブラコウモリ（Pipistellus bat）コロナウイルスＨＫＵ５（ＢｔＣｏＶ－ＨＫＵ５）、および中東呼吸器症候群関連コロナウイルスＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵｌ種を含む）から成るメルベコウイルス（Merbecovirus）亜属が挙げられる。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ヒトに関連するＳＡＲＳ－１、ＳＡＲＳ－２、ＭＥＲＳ、および地方病性（endemic）コロナウイルス２２９Ｅ、Ｎ６３、ＯＣ４３、およびＨＫＵ１などのコロナウイルス感染である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連する。いくつかの実施形態では、ＨＲＳＶは、亜型Ａおよび／または亜型Ｂに関連付けられる。
本開示のいくつかの実施形態では、ウイルス感染はエンテロウイルス感染である。いくつかの実施形態では、エンテロウイルス感染は、エンテロウイルスＡ種、エンテロウイルスＢ種、エンテロウイルスＣ種、エンテロウイルスＤ種、エンテロウイルスＥ種、エンテロウイルスＦ種、エンテロウイルスＧ種、エンテロウイルスＨ種、エンテロウイルスＩ種、エンテロウイルスＪ種、エンテロウイルスＫ種、およびエンテロウイルスＬ種から成る群より選択される、１以上のエンテロウイルス種に関連する。本開示のいくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ライノウイルス感染である。いくつかの実施形態では、ライノウイルス感染は、ライノウイルスＡ種、ライノウイルスＢ種、およびライノウイルスＣ種から成る群より選択される、１つ以上のライノウイルス種に関連する。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ポリオウイルス１型（ＰＶ１）、ポリオウイルス３型（ＰＶ３）、コクサッキーウイルスＡ２、コクサッキーウイルスＡ４、コクサッキーウイルスＡ１６、コクサッキーウイルスＢｌ、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶ－Ｂ３）、コクサッキーウイルスＢ６、パラエコーウイルス（エコーウイルス）、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶ－Ａ７１）、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ６８）、ライノウイルスＨＲＶ１６、およびライノウイルスＨＲＶ１Ｂのうちの１以上に関連する。
追加の治療法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物のうちのいずれか１つ、例えば、本明細書に記載の核酸構築物、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、組み換え細胞、細胞培養物、および／または医薬組成物は、単一療法（単剤療法）として個別に対象に投与することができる。加えてまたは代替的に、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、組み換え細胞、細胞培養物、および／または医薬組成物は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の追加の療法（例えば、第２療法）と組み合わせた第１療法として対象に投与することができる。本開示の組成物と組み合わせて併用投与される適切な療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、および手術を含むが、これらに限定されない。１つ以上の追加の療法と併用する投与は、同時（併用）投与および任意順序での連続投与を含む。従って、いくつかの実施形態では、第２療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法または手術から成る群より選択される。いくつかの実施形態では、第１療法と第２療法が併用投与される。いくつかの実施形態では、第１療法が第２療法と同時に投与される。いくつかの実施形態では、第１療法と第２療法が順次投与される。いくつかの実施形態では、第１療法が第２療法の前に投与される。いくつかの実施形態では、第１療法が第２療法の後に投与される。いくつかの実施形態では、第１療法が第２療法の前および／または後に投与される。いくつかの実施形態では、第１療法と第２療法が循環的に投与される。いくつかの実施形態では、第１療法と第２療法が、単一製剤中で一緒に投与される。
キット
本明細書では、本明細書に記載の方法の実施のための様々なキットも提供される。特に、本開示のいくつかの実施形態は、対象において免疫応答を誘発するためのキットを提供する。いくつかの他の実施形態は、必要とする対象における健康状態を予防するためのキットに関する。いくつかの他の実施形態は、必要とする対象における健康状態を治療する方法のためのキットに関する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に提供され、説明されるような、ＤＩＰ、核酸、組み換え細胞、細胞培養物、または医薬組成物のうちの１つ以上を含むキット、並びにそれらを作製および使用するための指示を含むキットが本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、提供される核酸構築物、ＤＩＰ、組み換え細胞、細胞培養物、または医薬組成物のいずれか１つを対象に投与するのに有用な１つ以上の手段をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のキットは、提供されるＤＩＰ、核酸構築物、組み換え細胞、細胞培養物、または医薬組成物のいずれか１つを対象に投与するために使用される１つ以上の注射器（充填済注射器を含む）および／またはカテーテル（充填済カテーテルを含む）をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、別のキット成分と同時にまたは連続的に投与することができる１または複数の追加の治療薬を含みうる。別のキット成分は、所望の目的、例えば対象における免疫応答を惹起させるため、必要とする対象における診断、予防、または治療のための成分である。
上記キットはいずれも、１つ以上の追加の試薬をさらに含むことができる。ここで、そのような追加の治療薬は、希釈剤、緩衝剤、再構成溶液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクター、陰性対照（ネガティブコントロール）、陽性対照（ポジティブコントロール）、ＤＩＰのインビトロ生産に適当な試薬、組み換え細胞、または本開示の医薬組成物を含みうる。
いくつかの実施形態では、キットの成分は、別々の容器に存在することができる。いくつかの他の実施形態では、キットの成分は、単一容器内で組み合わせることができる。例えば、本開示のいくつかの実施形態では、キットは、１つの容器（例えば無菌のガラス製またはプラスチック製バイアル）に、本明細書に記載の提供された核酸構築物、ＤＩＰ、組み換え細胞、細胞培養物、または医薬組成物のうちの１つ以上を含み、そして別の容器（例えば無菌のガラス製またはプラスチック製バイアル）に追加の治療薬を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示される方法を実施するためにキットの成分を使用する指示をさらに含むことができる。例えば、キットは、キット中の医薬組成物および剤形に関する情報を含んだ添付文書を含むことができる。一般に、このような情報は、封入された医薬組成物および剤形を効果的にかつ安全に使用する際に、患者および医師の助けとなる。例えば、本開示の組み合わせに関する以下の情報が当該添付文書に提供される：薬物動態、薬力学、臨床試験、有効性パラメータ、適応および用法、禁忌、警告、注意、副作用、過剰投与量、適正投与量および投与法、供給方法、適正貯蔵条件、参考文献、製造業者／販売業者情報、並びに知的財産情報。
いくつかの実施形態では、キットは、当該方法を実施するためにキットの成分を使用するための指示をさらに含むことができる。当該方法を実施するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができ、その指示は、キットまたはその成分の容器のラベル上に、または添付文書としてキット内に、存在させることができる（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどの適当なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在することができ、実際の指示はキット内に存在しないが、遠隔ソースから（例えばインターネットを介して）指示を取得するための手段を提供することができる。本実施形態の例は、指示を見ることができそして／または指示をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を取得するための手段は、適切な基板上に記録することができる。
本明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願があたかも具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に引用された任意の参考文献が先行技術を構成するものであるとする許諾ではない。参考文献の論述は、それらの著者が何を主張しているのかを述べるものであり、本出願人は、引用された文書の正確性および適切性に異議を唱える権利を有する。科学ジャーナル論文、特許文献、および教科書をはじめとする多数の情報源を本明細書で参照するが、これらの参考文献が当該技術分野における一般知識の一部を構成するという許諾を構成するものではないことは、明らかに理解されよう。
本明細書に与えられる一般的な方法の論述は、例示目的のみを意図している。他の代替的な方法および代替物は、本開示をレビューすれば当業者に明らかであり、本願の精神および範囲内に含まれるべきである。
追加の実施形態は、例示として提供される以下の実施例においてさらに詳細に開示され、これは本開示または特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当業者によく知られている分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来技術を使用するであろう。そのような技術は、Sambrook, J. & Russell, D.W. (2012）などの文献において充分に説明される。Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第4版) Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第3版) Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory（本明細書ではこれらを纏めて”Sambrook”と称する）；Ausubel, F.M. (1987) Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (2014からの増補版を含む); Bollag, D.M.他(1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss;Huang, L.他(2005) Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego, CA: Academic Press;Kaplitt, M.G.他 (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego: Academic Press; Kefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A.他 (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K.B., Ferre, F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E.A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (第2版). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S.L.他(2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley（2014からの増補を含む）；およびMakrides, S.C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.、これらの開示は参考により本明細書中に組み込まれる。
実施例１：細胞、プラスミドおよびウイルス
Ｈｅｌａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２．２）、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１８５TM（商標））、一次胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、Ｃａｌｕ－３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－５５）、およびＡ５４９－Ａｃｅ２細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（ｌＯ０×ＰＳＧ、Ｇｉｂｃｏ）が補足されたＤＭＥＭ高グルコース／Ｆ１２培地中で培養した。パッケージング細胞株の場合、ポリオウイルスＰ１遺伝子を安定的に過剰発現するＨｅｌａ Ｓ３細胞（Ｈｅｌａ Ｓ３／Ｐ１）を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（ｌＯ０×ＰＳＧ、Ｇｉｂｃｏ）＋０．０１５％ゼオシン（Ｚｅｏｓｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補足されたＤＭＥＭ高グルコース／Ｆ１２培地中で培養した。ＲＤ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１３６TM（商標））は、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（１００×ＰＳＧ、Ｇｉｂｃｏ）が補足されたＤＭＥＭ／Ｈ２１培地中で培養した。Ａ５４９－ＡＣＥ２細胞は、Ｐｅｔｅｒ Ｊａｃｋｓｏｎラボ（スタンフォード大学）から提供された－ＣＭＶプロモーター下で安定した発現であった。Ｈｅｌａ Ｈ１細胞またはＲＤ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１３６TM（商標））は、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（１００×ＰＳＧ、Ｇｉｂｃｏ）が補足されたＤＭＥＭ／Ｈ２１培地中で培養した。
この研究では、野生型ＰＶ１ウイルスとして、ポリオウイルス１型（ＰＶ１）のマホニー株を用いた。いくつかの実施形態では、欠陥干渉粒子（ｅＴＩＰ）は、ＰＶ１ウイルスのＰ１遺伝子を欠損しており、ＧＦＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子に置換されていた。プラスミドｐｒｉｂ（＋）ＸｐＡを、ＮｒｕＩおよびＳｎａＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって消化し、連結してｐｒｉｂ（＋）ＸｐＡを作製した。これは、１１７５位～２９５６位のｐｒｉｂ（＋）ＸｐＡ１６由来のポリオウイルスカプシドコード化領域を欠失していた。ＥＶ－Ｄ６８ウイルスは、プラスミド（ＰＵＣ５７－ＥＶ－Ｄ６８－４９１３１）により産生され、線形化され、ＰＶ１としてインビトロ転写（ＩＶＴ）された。コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）はNancy株であり、３型ポリオウイルス（ＰＶ３）はLeon株であった。インフルエンザＡ型ウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）はChristpher Byron Brooke博士（イリノイ大学）からの提供であった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を増幅するために、Ａ５４９－Ａｃｅ２細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床分離株（Ｓｐｉｋｅ Ｄ６１４Ｇ（Ｄｅｎｇ他、２０２１）、ＵＣＳＦ患者からの臨床ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２分離株）を、２％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトアビジンが補足されたＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中でＭ．Ｏ．Ｉ．＝約０．０５に感染させた。感染３日後、培地を回収し、４℃にて３０００×ｇで１０分間遠心分離することによって細胞破片から清澄化した（例えば、実施例１２参照）。ウイルス価は、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞上でのプラークアッセイにより測定した。
実施例２：試験管内転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ、トランスフェクションおよびｅＴＩＰ産生
ウイルスおよびｅＴＩＰを生成するために、Ｔ７ポリメラーゼを使用して、ＡｐａＩによって線形化された対応ｐｒｉｂ（＋）ＸｐＡ ＭａｈｏｎｅｙまたはｅＴＩＰプラスミドに由来する試験管内転写（ＩＶＴ）ウイルスＲＮＡを作製した。得られた１０μｇのＰＶ１のＩＶＴ ＲＮＡを８×１０6個のＨｅｌａ Ｓ３細胞にエレクトロポレーションした。そしてｅＴＩＰのＩＶＴ ＲＮＡを８×１０6個のパッケージング細胞系にエレクトロポレーションした。Ｈｅｌａ Ｓ３またはパッケージング細胞の単層をトリプシン処理し、次いでＤ－ＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞をＤ－ＰＢＳ中に再懸濁し、細胞数を血球計数計上でカウントし、次いで１ｍＬあたり１０7個の細胞濃度に調整した。８００μＬの細胞および１０μｇのＩＶＴ ＲＮＡを冷却した４ｍｍエレクトロポレーションキュベットに移し、氷上で２０分間インキュベートした。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｉ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）を用いてＩＶＴ ＲＮＡを細胞にエレクトロポレーションし（電圧＝２００Ｖ、キャパシタンス＝１０００μＦ）、次いで８ｍＬの予熱培地中に回収した。ウイルスおよびｅＴＩＰを約２４時間の時点（または総ＣＰＥ）で収穫し、Ｐ０ウイルスまたはｅＴＩＰ原液を生成した。Ｐ０ウイルス株を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝約０．２にて２％血清培地中で培養したＨｅｌａ Ｓ３中で１回増幅させ、第１回継代（Ｐ１）原液を生成した。Ｐ０ ｅＴＩＰ株を、Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝約０．２にて２％血清培地中で培養したパッケージング細胞系で１回増幅させ、第１回継代（Ｐ１）原液を作製した。インフルエンザＡ型ウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）は、Christopher教授からの寄贈である。
実施例３：ウイルスおよびｅＴＩＰサンプルの力価滴定
６ウェルプレート中のＨｅｌａ Ｓ３細胞の単層を、連続希釈されたウイルスサンプル２５０μＬで感染させ、次いで３７℃で約３０分間インキュベートした後、１％アガロース重層をその上に添加した。ｅＴＩＰの力価測定については、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞を４８ウェルプレート中で増殖させた。翌日、１０倍ずつ連続希釈した１００μＬのｅＴＩＰサンプルを各ウェルに添加した。１時間インキュベートした後、４００μＬの標準培地を各ウェルに添加した。感染後８～９時間目に、ＧＦＰ陽性細胞をｅＴＩＰ力価としてカウントし、ＩＵ／ｍＬで表した。ＥＶ－Ｄ６８感染サンプルを測定するために、ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）をＲＤ細胞上で実施した。ＲＤ細胞を、ＴＣＩＤ５０を実施する１日前に、２％ＦＢＳ ＤＭＥＭ／Ｈ２１培地を含む９６ウェルプレートに１０4細胞／ウェルにて接種した。
実施例４．プライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの設計（液滴ＰＣＲ）
液滴デジタルＰＣＲアッセイのためのプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブを、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ（商標）ツール（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて設計した。ＰＶ１ゲノムのプライマーおよびプローブは、５′－ＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＧＡＴＣＣＣＡＴＡＣ－３′（配列番号２）、５′－ＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＡＧＴＡＡＴ－３′（配列番号３）、および５′－６－ＦＡＭTM－ＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴ－３′－ＢＨＱ－ｌ（登録商標）（配列番号４）であった。ｅＴＩＰ１ゲノムのプライマーおよびプローブは、５′－ＧＡＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡ－３′（配列番号５）、５′－ＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＴＣＧＴＣＣＣＡＴＴＴ－３′（配列番号６）、および５′－ＨＥＸ－ＡＣＧＡＡＡＧＡＧ／ＺＥＮTM／ＴＣＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＧＧＣ－３′－ＩＡＢｋＦＱ（配列番号７）であった。上記プライマーおよびプローブに結合された蛍光団または色素ＦＡＭ（商標）、ＢＨＱ－１（登録商標）、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、ＺＥＮ（商標）およびＩＡＢｋＦＱ（Ｉｏｗｉａ Ｂｌａｃｋ ＦＱクエンチャー）に関する情報は、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社ウェブサイト（idtdna.com）に見つけることができる。
液滴デジタルＰＣＲアッセイ：２μＬの連続希釈されたｃＤＮＡサンプルを、１０μＬのプローブ用２×ｄｄＰＣＲスーパーミックス（Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）、１μＬの２０×ＰＶ１またはｅＴＩＰプライマー／プローブ、１μＬの２０×ｅＴＩＰプライマー／プローブ、および６μＬのヌクレアーゼフリーの水と混合した。各サンプルの２０μＬ反応混合物を、液滴発生器のカートリッジに分配した後、ＱＸ１００液滴発生器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）による液滴生成を行った。次いで、次のパラメータを使って熱循環器上でＰＣＲを実施した：９５℃で１０分と６０℃で１分の１サイクルを４０サイクル。次いで、ＰＣＲ産物を読み出し、ＱＸ１００液滴リーダーによって計算した。
実施例５：ＨｅｌａおよびＭＥＦにおけるＰＶ１のウイルス増殖曲線および重複感染の複製速度論
２．５×ｌ０5個のマウスＭＥＦｓまたはＨｅｌａ Ｓ３細胞を２４ウェルプレートに播種した。翌日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬの２％血清培地中でＭ．Ｏ．Ｉ．＝０．１にてＰＶ１単独で感染させるか、または混合ＰＶ１＋ＤＩ（１：１０または１：１００の比）で重複感染させるか、またはｅＴＩＰ単独でＭＯＩ＝１もしくは１０にて感染させた（各ウイルスについて各時点で３つの複製ウェルを使用した）。３７℃での１時間インキュベーションに続いて、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、細胞を新鮮な完全培地で覆った。各指示時点で、対応するプレートを－８０℃で凍結させた。該プレートの３回の凍結－解凍サイクルに続いて、６ウェルプレート中で増殖させた単層Ｈｅｌａ Ｓ３細胞上で標準プラークアッセイを実施した（ウェルあたり約１０6個のＨｅｌａ Ｓ３細胞）。
実施例６：ＥＬＩＳＡおよびｑＲＴ－ＰＣＲによって測定されたインターフェロン産生
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＡ）を１３～１４日齢の胚から単離した。ＭＥＦ単層を２４ウェルプレート中２．５×１０5細胞／ウェルに播種し、ＭＯＩ＝０．１にてＰＶ１ポリオウイルスによりまたは種々の比１：１、１：１０、１：２０、１：１００の混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰにより感染させた。指示時点で、上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってインターフェロン誘導を測定した（ＶｅｒＫｉｎｅ－ＨＳマウスインターフェロンβ血清ＥＬＩＳＡキット、ＰＢＬ Ａｓｓａｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）。Ｈｅｌａ Ｓ３細胞におけるプラークアッセイによりウイルス力価を算出し、ＧＦＰ陽性細胞によりｅＴＩＰ力価を測定した。
実施例７：細胞培養モデルにおけるＰＶ１または他の野生型ウイルスのウイルス増殖曲線および重複感染の複製速度論
２．５×ｌＯ5個のＨｅｌａ Ｓ３細胞を２４ウェルプレートに播種した。翌日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬの２％血清培地中でＭ．Ｏ．Ｉ．＝０．１にて、ウイルス単独で感染させ、または混合ウイルス＋ｅＴＩＰ１（１：１０、１：２０、１：５０、１：１００の比）で重複感染させ、またはＭＯＩ＝５にてｅＴＩＰ１単独で感染させた。３７℃で１時間の培養に続いて、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、細胞を新鮮な完全培地で覆った。指示された各時点で、対応するプレートを－８０℃で凍結した。プレートの３回の凍結－解凍サイクルに続いて、６ウェルプレート（ウェルあたり－１０6個のＨｅＬａ Ｓ３細胞）中で増殖させた単層ＨｅＬａ Ｓ３細胞に対して、標準プラークアッセイを行い、またはＲＤ細胞に対してＥＶ－Ｄ６８のＴＣＩＤ５０測定を行った。
実施例８：ｅＴＩＰ粒子の精製
ｅＴＩＰを産生するパッケージング細胞系（５００ｍＬ）を、０．５％ＮＰ－４０を用いて収穫し、サンプルを－８０℃で保存した。ウイルス精製のため、サンプルを３回の凍結－解凍サイクルに供した。ウイルス沈殿のために、ＰＥＧ８０００を１０％の最終濃度に加え、４℃で一晩保存した。沈殿したサンプルを３，５００×ｇで１時間回転させることによりペレット化した。そのペレットを１０ｍＬのＥＢ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５％ＮＰ－４０）に懸濁し、そして３，５００×ｇで４℃にて３０分間遠心分離し、細胞破片および不溶性材料を除去した。上清中のｅＴＩＰ含有可溶性画分を、４℃で３時間１０５，０００×ｇにおいてＥＢ緩衝液中２ｍＬの３０％ショ糖クッション上に重層した。ペレットをＥＢ緩衝液に懸濁し、４℃にて１２，０００×ｇで３０分間遠心分離して不溶性材料を除去した。次いで、上清のｅＴＩＰ含有可溶性画分を、ＥＢ緩衝液中の１５～４５％ショ糖勾配の上に積層し、４℃にて１０５，０００×ｇで３０分間遠心分離した。勾配の最上部からｅＴＩＰを含む１ｍＬサイズの画分を回収した。上から２つの画分を一緒にプールし、サンプル中のショ糖を、スピン脱塩カラム〔Ｚｅｂａ（商標）；Ｐｉｅｒｃｅ製〕を使って除去し、そしてＰＢＳと緩衝液交換した。次いで、ＰＢＳ中のｅＴＩＰを、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）を有するＡｍｉｃｏｎ製Ｕｌｔｒａ（商標）装置を使用して濃縮した。ｅＴＩＰの純度および完全性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと銀染色によって評価した。ネガティブ染色および電子顕微鏡法を当該粒子に使用した。画分＃５～６を一緒にし、マウスへの接種に使用した。
実施例９：感受性マウスの感染
本実施例は、マウス研究のためにＵＣＳＦ国際実験動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従うことにより、感受性マウスの感染を調査するために実施した実験の結果を記載する。これらの実験では、５～６週齢のＴｇ２１ ＰＶＲ（Ｔｇ２１）または６～８週齢のＴｇ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）の雄雌両マウスを使用し、麻酔下で感染させた。Ｔｇ２１およびＩＦＮＡＲ-/-は、テキサス大学南西医療センター（University of Texas Southwestern Medical Center）のJulie Pfeiffer博士により寄贈された。それは東京都神経科学総合研究所（Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience）（東京）の小池智博士（Dr. Satoshi Koike）によって最初に作製された。
マウス生存試験のために、各ウイルスの連続希釈液を用い、（ｉ）筋肉内（Ｉ．Ｍ．、５０μＬの接種材料を各後ろ足に投与した）、（ｉｉ）腹腔内注射（Ｉ．Ｐ．、１００μＬ／マウス）、（ｉｉｉ）鼻腔内注射（Ｉ．Ｎ．、２０～３５μＬ／マウス）、または（ｉｖ）頭蓋内注射（Ｉ．Ｃ．、２０μＬ／マウス）により、それぞれマウスに注射した。ＵＶ処理を伴う場合、ｅＴＩＰを２時間ＵＶ処理した。インフルエンザＨ１Ｎ１（ＰＲ８株）実験では、マウスを毎日体重測定した。麻痺の発生についてマウスを１日２回観察し、死亡時には麻酔下で安楽死させた。
防御研究のために、Ｔｇ２１マウス（１群あたり８～１０匹のマウス）に、Ｉ．Ｐ．経路ではマウス１匹あたりウイルス上清１０7ＰＦＵのＰＶ１単独でまたは１：１、１：１０の比でのｅＴＩＰと共に、Ｉ．Ｎ．経路では１：２０の比でのｅＴＩＰと共に（ＰＶ１は２×１０5ＰＦＵ／マウスであった）、Ｉ．Ｍ．経路では２００ＰＦＵのＰＶ１単独でまたは１：１０、１：１００、１：２５０、１：５０００、１：７５００の種々の比でのｅＴＩＰと共にウイルス上清をそれぞれ投与した。防御研究のために、２００ ＰＦＵのＰＶ１ウイルスをＩ．Ｍ．経路でＩＦＮＡＲ-/-に接種し、次いで、感染後３日目、４日目、５日目に、２×ｌ０5ＩＵのｅＴＩＰをそれぞれ頭蓋内（Ｉ．Ｃ．）経路で接種した（１群当たり４匹のマウス）。組織分布研究のために、Ｔｇ２１マウス（１群あたり３～５匹のマウス）にＩ．Ｎ．経路ではマウス１匹あたり３×１０5ＰＦＵのＰＶ１ウイルスを接種し、Ｉ．Ｍ．経路ではＩＦＮＡＲ-/-マウスにマウス１匹あたり２００ＰＦＵのＰＶ１を単独でまたはｅＴＩＰと共に（ＰＶ１：ｅＴＩＰ比＝１：５０００）注射した。感染マウスから臓器の半分量を採取し、１ｍＬの無血清培地中でホモジナイズした。組織ホモジネートからウイルス上清を採取し、３回の凍結－解凍サイクルに続いて、卓上遠心分離機を用いて４℃にて５０００×ｇで１０分間遠心分離した。通常のプラークアッセイをＨｅｌａ Ｓ３細胞上で実施して、組織からのウイルス上清を力価測定した。
前処理実験では、Ｔｇ２１マウスにＰＢＳ中６×１０6ＩＵのｅＴＩＰを鼻腔内接種した。接種から２４時間および４８時間目に、２×ｌ０5ＰＦＵのＰＶ１をＴｇ２１マウスに接種した。４８時間目の前処理接種時に、治療実験のために、Ｔｇ２１マウスにそれぞれ２×ｌ０5ＰＦＵのＰＶ１を０日目に鼻腔内に注射し、次いで１日目から５日目まで毎日ＰＢＳ中の６×１０6ＩＵのｅＴＩＰを鼻腔内に注射した。
組織分布研究のために、ＩＦＮＡＲ-/-マウスを、マウス１匹あたり２００ＰＦＵのＰＶ１を単独でまたはｅＴＩＰと共に（ＰＶ１：ｅＴＩＰｌ比＝１：５０００）、Ｉ．Ｍ．経路で各マウスに接種した（群当たり３匹のマウス）。マウスをＣＯ2で安楽死させ、感染後１日目、３日目および６日目に筋肉、脾臓、脊椎を採取した。組織を１ｍＬのＴｒｉｚｏｌTM（商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ製）中でホモジナイズした。全ＲＮＡを抽出し、ＤＮアーゼＩ（ＮＥＢ製）で処理した。ＲＴ－ｑＰＣＲは液滴ｑＰＣＲのマイクロコンパートメントとして構成された。
実施例１０：肺からの免疫細胞のフローサイトメトリー分析
この実施例は、ポリオウイルス誘発のための予防的実験の結果を記載する。これらの実験では、６週齢のＴｇ２１ＰＶＲマウスに、ＰＢＳ中の６×１０6ＩＵのｅＴＩＰ１粒子を鼻腔内に接種した。接種４８時間目に、マウスをＣＯ2で安楽死させ、ＰＢＳを還流させた。全肺を切除し、ＰＢＳとＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ製）で２回洗浄した。全肺を小片に細断し、４ｍＬの消化緩衝液（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＤ＋１０ｍｇ／ｍＬのＤＮアーゼ１、５％ＦＢＳ）で３０分間処理した。組織を１０ｍＬシリンジを使ってミンチし、７０μｍ細胞ろ過器を通過させた。次いで細胞をスピンダウンし、４℃にて６５０×ｇで５分間にわたりＤ－ＰＢＳで２回洗浄した。赤血球をＡＣＳ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、カタログ番号Ａ１０４９２０１）で２分間溶解させた。細胞をスピンダウンし、４℃にて６５０×ｇで５分間にわたりＤ－ＰＢＳ、コラーゲンＤ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製、カタログ番号ＬＳ００４２１０）、ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号１１２８４９３２００１）で２回洗浄した。
細胞をトリパンブルーで染色し、カウントした。１０6個の細胞を、表１に示すような抗体での完全抗体パネル染色に使用した。１０5個の細胞を、１５分間の生死判別染色に使用し（ｅＦｌｕｏｒ ５０６ Ｆｉｘ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号６５－０８６６－１４）、単一抗体または未染色細胞またはすべての抗体が使用された。マウスＦｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カタログ番号５５３１４１）をＤ－ＰＢＳ中に希釈した。抗体は、ＢＤブリリアント染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号＃５６３７９４）中に１：１００希釈した。染色の全工程が完了した後、細胞を２％ＰＦＡで４℃にて３０分間固定し、次いでＤ－ＰＢＳで２回洗浄した。サンプルを３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（Ｄ－ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。サンプルをＢＤ Ａｒｉｅｓ ３（商標）に流し、Ｆｌｏｗｊｏ（商標）ソフトウェアで解析した。
Figure 2023532735000002
 実施例１１：中和抗体アッセイ（Ｎａｂ）
血清をＤＭＥＭで２倍ずつの連続希釈（５０μＬ）で希釈した後、５０μＬの２００ＰＦＵのＷＴウイルス粒子と共に３７℃で２時間インキュベートした。次いで、１００μＬの血清とウイルスを、１ウェルあたり１００μＬ中に５×１０3個の細胞を含む９６ウェルプレートに移した。７日後、ＣＰＥをチェックし、ＣＰＥ不含有の細胞をＮＡｂ生成としてカウントした。
実施例１２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による実験
この実施例は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を用いて行われる実験で使用される、一般的な方法と材料を説明する。一般に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２細胞培養および動物試験は、生物安全性レベル３（ＢＳＬ－３）において実施された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの増殖および感染
アフリカミドリザル腎臓Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞株（ＡＴＣＣ＃１５８６）およびＣａｌｕ－３細胞〔ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－５５〕をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ＃１５８６）から取得し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）が補足された最小必須培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に、湿潤５％ＣＯ2インキュベータ中で３７℃に維持した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０、ＢＥＩカタログ番号：ＮＲ－５２２８１）の臨床分離株は、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞およびＡ５４９－ＡＣＥ２細胞中で増殖させた。ウイルス力価をプラークアッセイで定量した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の文脈における全ての感染は、生物安全性レベル３（ＢＳＬ－３）で実施された。
予防および重複感染の実験のために、Ｃａｌｕ－３細胞の～７０％単層（２４ウェルプレート中１×１０5個の細胞／ウェル７２０）を、ＭＯＩ＝５でｅＴＩＰ１粒子により５時間前処理し（前処理）、次いで３７℃で１時間ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ＝０．１）に感染させ、ウイルス混合物を取り除き、細胞を培地中でさらに培養した。指示時点１６、２４、３６、４８ｈｐｉ（感染後時間）において、上清を採取し、上清のウイルス力価をプラークアッセイにより検出した。
重複感染の実験のために、Ｃａｌｕ－３細胞に３７℃で１時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ＝０．１）を単独で感染させるか、または異なる比率（１：１、１：１０、１：５０）でｅＴＩＰ１粒子を重複感染させ、ウイルス混合物を取り除き、細胞を培地中でさらに培養した。指示時点：２４、３６、２８、４８ｈｐｉ（感染後時間）において、上清を採取し、上清のウイルス価をＶｅｒｏ－Ｅ６細胞上でのプラークアッセイにより測定した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のプラークアッセイ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プラークアッセイのために、６ウェルプレートで増殖したＶｅｒｏ Ｅ６細胞の８０％コンフルエント（集密度）の単層を、３７℃で１時間、ウイルスサンプルの連続希釈液（２５０μＬ／ウェル）と共にインキュベートした。次に、２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭが補足された１％アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で細胞を重層した。３日後に、細胞を４％ホルムアルデヒドで２時間固定し、上層を捨て、サンプルをクリスタルバイオレット色素で染色した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のマウス実験
Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、www.jax.org/strain/034860、ストック番号：０３４８６０、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ、ヘミ接合型）。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスは、飼育されＵＣＳＦ動物施設に収容された。該マウスは、本研究で実施されるすべての実験について麻酔下にあり、ＢＳＬ３レベルであった。リポフェクタミン－２０００を有する３０μｇのｅＴＩＰ１ ＲＮＡを、マウスの鼻腔内に接種した。１８～２０時間後に、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスをイソフルランで麻酔し、６×ｌ０4ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内に接種した。マウスを毎日モニタリングし、指示時点で体重を測定した。組織分布のために、指示時点でマウスを犠牲にし、組織を収集し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ－Ｃチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ製、カタログ番号１３０－０９３－２３７）を使って、１ｍＬの２％ＦＢＳ ＭＥＭ培地中で組織をホモジナイズした。ウイルスの力価測定のためプラークアッセイを行った。ＲＮＡ抽出のため、１００ｍｇの組織を１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ社製）中でｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ－Ｍチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製、カタログ番号１３０－０９３－２３６）を用いてホモジナイズし、ＲＮＡをＤＮアーゼＩで処理した。１ｍｇの全ＲＮＡを使用してＩｓｃｒｉｐｔTM（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によりｃＤＮＡを作製した。ＲＮＡをＤＮアーゼ１で処理し、１ｍｇの全ＲＮＡを用いてＩｓｃｒｉｐｔTM（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）７２によりｃＤＮＡを作製した。ＤＮアーゼ１で処理した合計７２のＲＮＡを、次いでポリＡビーズ精製（Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）し、次いでＫＡＰＡ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（ＫＡＰＡ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリー調製キット）を用いてＲＮＡＳｅｑライブラリーを調製した。
組織片のヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）免疫蛍光（ＩＦ）染色およびイメージング
病理学および免疫蛍光用に、マウス組織を採取し、４％ＰＦＡ中で固定し、次いで組織をパラフィンとワックスで包埋し、加工処理した。組織サンプルを５μＭに細断し、Gladstone Histology and light coreにおいてＨ＆Ｅ染色を実施した。脱パラフィン、再水和、およびＨＩＥＲを、ＳＴ４０２０小型リニア染色装置（Ｌｅｉｃａ社製）上で実施した。脱パラフィンのために、スライドを７０℃で１～１．５時間焼成し、続いて、下降する濃度のエタノール（１００％２回、９５％２回、８０％、７０％、ｄｄＨ2Ｏ ２回；各工程３０秒間）中で再水和を行った。洗浄は、Ｌｅｉｃａ社製ＳＴ４０２０小型リニア染色装置（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ国ヴェルツラー）を使い、１回洗浄あたり各３０秒間ずつ３回の浸漬にプログラミングされた。Ｈ＆Ｅ染色を実施した。Ｉ．Ｆ．については、ＨＩＥＲ（熱処理によるエピトープ露出：Heat-induced Epitope Retrieval）をＬａｂ ＶｉｓｉｏｎTM（商標）ＰＴモジュール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）においてＤａｋｏ抗原賦活液（Target Retrieval Solution）ｐＨ ９（Ｓ２３６７８４－２、ＤＡＫＯ Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使って９７℃にて１０分間実施し、次いで６５℃に冷却した。さらに室温まで３０分間冷却した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（Ｃｅｌｌ Ｍａｒｑｕｅ；ＴＢＳＴ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中でスライドを１０分間ずつ３回洗浄した。次いで組織片をＴＢＳＴ中５％正常ロバ血清中で室温にて１時間ブロックし、続いてブロック溶液中で一次抗体と共にインキュベートした。一次抗体との４℃で一晩のインキュベーション後、組織片をＴＢＳＴで３回洗浄し、３％ウシ胎児血清アルブミン、０．４％サポニン、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で、室温にて１時間染色した。この後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止用封入剤を用いて組織片をマウントした。一次抗体および最終力価は、マウス抗アセチル化チューブリン（ＡＣＴＵＢ）（１：３００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ－２３９５０）、ウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）（１：１０００；ＧｅｎｅＴｅｘ ＧＴＸ ３５３６１）、およびマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）（１：６００；ＧｅｎｅＴｅｘ ＧＴＸ６３２６０４）であった。二次抗体は、高度交差吸着ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、１：５００（Ｔｈｅｒｍｏ Ａ３２７９５）および高度交差吸着ロバ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、１：５００（Ｔｈｅｒｍｏ Ａ３２７７３）を含んだ。ポリオウイルスｅＴＩＰｌを接種したマウス頭部および肺部の免疫蛍光測定（ＩＦ）は、α－ポリオウイルス抗体３Ｂに対する抗体（Ｖｐｇ）（１：２００）を用いて行った。蛍光免疫標識された画像は、Ｚｅｉｓｓ製ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ（商標）Ｚ１顕微鏡またはＫｅｙｅｎｃｅ製ＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡を用いて取得した。撮影後の加工は、ＦＩＪＩ／ＩｍａｇｅＪを用いて行った。ヌクレオカプシド（Ｎ）およびスパイク（ＳＰ）の強度は、各組織切片中の同一場所における少なくとも１０個の領域の平均強度によって限定された。
マウス肺組織学的解析
マウス肺のためのパラフィン包埋された肺組織ブロックを５μｍ切片に細断した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、分析した。全体として（in toto）処理された全肺のデジタル光学顕微鏡スキャンは、熟練した獣医学病理学者によって検査された。Ｋ１８ｈ ＡＣＥ２マウスからの肺のヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片は、４つの異なる組織病理学的パラメータ：（１）血管周囲炎症；（２）気管支上皮変性または壊死；（３）気管支炎症；および（４）肺胞炎症を考慮に入れた、半定量的な５点等級付け方法（０－正常限界内、１－軽度、２－中等度、３－強度、４－重症度）を実施することによって検査した。これらの変化は、この評価に使用した群からの賦形剤およびプリチデプシン（Plitidepsin）で処置した未感染マウスからの肺では、欠失していた（等級０）。
実施例１３：ＭＲＮＡ配列ライブラリーの調製および分析
マウス組織を収集し、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ社製）中でホモジナイズした。全ＲＮＡを抽出し、１ｍｇをＤＮアーゼ１（ＮＥＢ社製）で処理した。次いで、ポリＡビーズによりｍＲＮＡを精製し、次いで、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の指示書に従って、ｍＲＮＡｓｅｑライブラリーを調製した。次いで、ｍＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーをプールし、ＵＣＳＦコア施設（Center for Advanced Technology）において１回の読みを行うイルミナ社製ＨｉＳｅｑTM４０００によって配列決定した。
TopHat-Cufflinks-CuffdiffパイプラインによるｍＲＮＡ－Ｓｅｑ実験の示差的遺伝子および転写産物発現解析。図面は、Ｒ．ＣｏｍｍｕｎｄＲおよびｇｐｌｏｔ２パッケージによってプロットしたものである。
実施例１４：データ解析および統計解析
データを平均±ＳＤとして提示した。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。統計的有意性は、両側スチューデントｔ－検定を使用して計算され、ｐ値＜０．０５が有意であると見なされた。有意性は、図の凡例に記載されているように、星印で示されている。動物実験は、盲検化または無作為化されておらず、どの動物またはサンプルも、外れ値として分析から除去されなかった。５０％致死量（ＬＤ５０）および生存曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実装されるログランク（Mantel-Cox）検定方法と比較した。これらの実験では、ｐ値＜０．０５を有意とした。
実施例１５：広域スペクトル抗ウイルス剤としての欠陥ポリオウイルスゲノムの操作
本実施例は、本明細書に開示されるＤＩＰがエンテロウイルス複製を阻害することができるという概念を実証するために行った実験を記載する（図７Ａ）。これらの実験では、モデルとして十分に研究されたポリオウイルスを用いた。
ポリオウイルス１型（ＰＶ１）のＤＶＧ（欠陥ウイルスゲノム）（ここではｅＴＩＰｌ；すなわち、エンテロウイルス治療干渉粒子１）は、構造タンパク質をコードするＰ１領域全体を削除し、ＧＦＰ遺伝子を挿入することによって操作された（例えば、図１Ａおよび図７Ｂ参照）。ｅＴＩＰ１感染性粒子は、ＰＶ１カプシドタンパク質前駆体Ｐ１を安定して発現するパッケージング細胞（Ｈｅｌａ Ｓ３／Ｐ１）を用いて作製した（例えば、図１Ｂおよび図７Ｃ参照）。このパッケージング細胞系は、ｅＴＩＰの試験管内（in vitro）転写ＲＮＡをパッケージング細胞にトランスフェクトすることによって、ｅＴＩＰ１粒子の生成を促進する。試験管内転写ｅＴＩＰ１ ＲＮＡによるＨｅＬａＳ３／Ｐｌのトランスフェクションは、ｅＴＩＰ１感染性粒子を生成し、それをＨｅｌａＳ３／Ｐ１の反復感染によって増幅させた。高力価（＞１０8感染単位／ｍＬ）の該粒子を、ショ糖クッションと勾配を用いて、銀染色－ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）によって測定した場合に９５％純度にまで精製した（例えば、図１Ｃ参照；また実施例８も参照されたい）。精製されたｅＴＩＰｌ粒子は、細胞を感染させる能力をもち、これはポリオ－３Ａ抗体染色を用いるＧＦＰおよび免疫蛍光（Ｉ．Ｆ．）の発現によって判別された（例えば、図７Ｅ参照）。ｅＴＩＰｌは、ヘルパー細胞として作用する野生型（ＷＴ）ＰＶ１なしでは、細胞から細胞に拡散しなかった。１：２０の比で細胞培養において野生型ウイルスおよびｅＴＩＰのパネルを重複感染させた。ｅＴＩＰは、１型および３型ポリオウイルス（ＰＶ１およびＰＶ３）、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）およびエンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ６８）、ライノウイルス１Ａおよび１Ｂを含む試験したエンテロウイルスのすべてを阻害した（例えば、図１Ａ～１Ｅおよび図７Ａ～７Ｅ参照）。ウイルス複製は、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞上での重複感染において１０～１００分の１に低減された；ウイルス複製は、細胞上のプラーク形成アッセイまたはＴＣＩＤ５０によって測定された（図１Ｄと図７Ｄ参照；また実施例３も参照されたい）。興味深いことに、ｅＴＩＰは、同時感染によって、ＰＶ１、ＰＶ３およびＣＶＢ３よりもＥＶ－Ｄ６８およびライノウイルス群において、より大きくウイルス複製を阻害した。細胞培養実験は、ｅＴＩＰがウイルス複製および重複感染による産生を阻害することができること、そしてｅＴＩＰが他のウイルスよりも強力にＥＶ－Ｄ６８を阻害することを示唆しており、このことは、阻害のレベルがウイルス複製の動力学に関連することを示している。
実施例１６：ｅＴＩＰは、マウスモデルにおいて広域スペクトル抗ウイルス活性を付与する
本実施例では、生存率を測定することによって、感染動物におけるｅＴＩＰの防御効果を評価するために行った実験が記載される。これらの実験では、免疫不全マウス、Ｔｇ２１ ＰＶＲインターフェロンα／β受容体ノックアウト（ＩＦＮＡＲ-/-）マウスを、５０％致死量の５倍である２００プラーク形成単位（ＰＦＵ）の野生型ポリオウイルス１型（ＰＶ１）により、筋肉内（ＩＭ）経路で感染させた。ＩＦＮＡＲ-/-マウスを、単一時点の感染により、ＰＶ１単独で感染させるか、または１：５０００の比での混合ＰＶｌ＋ｅＴＩＰで重複感染させた（方法）。ＰＶ１単独で感染させたＩＦＮＡＲ-/-マウスの１００％が、感染後１４日以内に死亡した（ｎ＝１３～１４）。対照的に、ＰＶｌ＋ｅＴＩＰで重複感染させたマウスの７０％が、感染後１４日目に生存していた（１４匹中１１匹、ｐ＜０．００１）。これらのデータは、ｅＴＩＰが生存率を有意に増加させることを実証した（ログランク（Mantel-Cox）検定）。防御率は、単回投与処置で約７０％であった（例えば、図２および表２を参照）。
Figure 2023532735000003
 実施例１７：ｅＴＩＰは、感染動物の筋肉から中枢神経系（ＣＮＳ）への野生型ウイルスの拡散を阻害する
本実施例は、ｅＴＩＰが感染動物においてＰＶ１の拡散を阻害するかどうかを調べるために実施した実験を記載する。ＩＦＮＡＲ-/-マウスに、Ｉ．Ｍ．経路により２００ＰＦＵのＰＶ１ウイルスを単独で感染させ、またはＰＶｌ＋ｅＴＩＰを１：５０００の比で重複感染させた（方法および図２）。筋肉、脾臓、脊髄、脳を指示時点で収集した［方法］。ＰＶ１群では、ＰＶ１ウイルスは筋肉内で迅速に複製し、脊髄と脳に広がった；ウイルス力価をプラークアッセイにより測定した（例えば、図２Ｂ～２Ｅ参照）。対照的に、ＰＶｌ＋ｅＴＩＰ重複感染群では、ＰＶ１ウイルスのレベルは、筋肉および脾臓において感染後３日目と６日目に１００分の１に低減し（例えば図２Ｂ～２Ｅ）、ＰＶ１は脊椎と脳において感染後６日目に検出不可能であった（例えば図２Ｂ～２Ｅ参照、ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。これらのデータは、単回処置であっても、ｅＴＩＰによってＰＶ１ウイルスの拡がりが大きく阻害されることを示唆している。
ＲＮＡゲノムコピー数がウイルス力価よりもはるかに感受性であるため、組織からのＰＶ１ウイルスおよびｅＴＩＰのＲＮＡレベルも測定した。１μｇの全ＲＮＡあたりのウイルスＲＮＡゲノムコピー数を、デジタル液滴ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した［方法］。ウイルス力価の結果と一致して（例えば、図２Ｂ～２Ｅ）、ＰＶ１ウイルスＲＮＡレベルは、ＰＶ１ウイルス単独による感染後、筋肉および脾臓で迅速に増加した。これに対して、重複感染群では、ＰＶ１のＲＮＡゲノムコピー数は、（単独の）ＰＶ１群と比較して、筋肉中で１００分の１であり、脾臓中では１０００分の１であった。さらに、重複感染群のＰＶ１のＲＮＡゲノムは、脊髄中で検出不可能であった（例えば、図２Ｆ～２Ｈ参照）。これらのデータは、ｅＴＩＰが感染動物の中枢神経系（ＣＮＳ）への野生型ウイルスＰＶ１の拡散を阻害し、ＰＶ１感染動物の生存率を増加させることを示唆している。
実施例１８：ｅＴＩＰの防御効果を様々な比率で評価する
本実施例では、ＰＶ１とｅＴＩＰとの比が防御効果にどのように影響を及ぼすかを試験する実験が記載される。これらの実験では、ＩＦＮＡＲ-/-マウスに、筋肉内感染により、２００ＰＦＵのＰＶ１を単独で感染させ、または様々な比のｅＴＩＰと共に（ＰＶｌ＋ｅＴＩＰ、比＝ｌ：１０、１：１００）重複感染させた。ＰＶ１単独で感染させたＩＦＮＡＲ-/-マウスの１００％が、感染後１４日目に死亡した（ｎ＝８～１０）。対照的に、１：１００の比でのＰＶ１＋ｅＴＩＰによる重複感染は、生存率を有意に増加させた。防御率は、単独処置で６０％であった（ログランクMantel-Cox検定、ｎ＝８～１０、ｐ＜０．０５）。ＰＶｌ＋ｅＴＩＰを１：１０の比で重複感染させたマウスは、ＰＶ１単独と比較して有意差はなかった；８０％（１０匹のうち８匹）のマウスが感染後１４日目に死亡した（図３Ａ）。これらのデータは、ｅＴＩＰの防御率が、１：１０と１：１００の間のＰＶ１＋ｅＴＩＰ比と相関する（例えば図３Ａおよび表２参照）ため、防御がおそらく直接競合によるものであろうということを示唆している。１：２５０（ここでは図示しないデータ）のような１：１００より大きい比は、防御率が約７０％にとどまっている。
後続の実験を実施して、ｅＴＩＰが、他のエンテロウイルス株の致死量感染でチャレンジ投与したマウスを防御することができるかどうか、実際に、ｅＴＩＰが試験した全てのウイルス株からの防御を提供できるかどうかを試験した。ポリオウイルス３型（ＰＶ３）群について、防御率は、１：２５０の比のＰＶ３＋ｅＴＩＰでは３０％（ｎ＝２０、ｐ＝０．０３３７）であった（例えば、図３Ｂ参照）。コクサッキーウイルスＢ３株（ＣＶＢ３）群については、防御率は、１：５０００の比のＣＶＢ３＋ｅＴＩＰでは２０％（ｎ＝２０、ｐ＝０．０２２１）であった（例えば、図３Ｃ参照）。Ｉ．Ｃ．経路により１：１０００の比のＥＶＤ６８＋ｅＴＩＰを用いた場合、防御率は４０％（ｎ＝８～１０、ｐ＜０．００１）であった（例えば図３Ｄ参照）。これらのデータは、ｅＴＩＰが感染動物においてポリオウイルスおよび非ポリエンテロウイルスに対して防御する能力を有することを示唆する。いずれか特定の理論に結び付けたとき、防御率は、ゲノム配列分析の相同性と免疫不全動物に送達された初期比に相関するため、観察された結果は、ＩＦＮＡＲ-/-マウスへの局所感染による直接競合に起因する可能性がある。ｅＴＩＰの安全性についても、ｅＴＩＰをＵＶ処理し、Ｔｇ２１ＰＶＲ ＩＦＮＡＲ-/-マウスにＩ．Ｍ．感染によって導入することにより試験した。これらのマウスのいずれも死亡しなかったことが観察され、これはｅＴＩＰ自体が動物において安全であることを示唆している（例えば、図３Ｅ～３Ｆ参照）。
実施例１９：免疫能のあるマウスにおけるｅＴＩＰの防御作用およびＩＦＮ応答の役割
本実施例は、免疫能のあるマウスにおいて、ＩＦＮ応答が防御上の重要な役割を果たすかどうかをさらに調べるために実施された、いくつかの追加の対照実験を記載する。これらの実験は、防御機序を理解するために重要であり、これは、より効果的な治療法を創出する方法を明らかにすることができる。例えば、パッケージング細胞系により産生されたサイトカインがｅＴＩＰ製剤中に存在しており、防御がこれらの共存物質（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ）によって媒介された可能性がある。この重要な問題に対処するために、銀染色ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＥＭ陰性染色によって測定したときに９５％純度にまでｅＴＩＰを精製した（例えば、図１Ｃ参照）。免疫能のあるマウスＴｇ２１ＰＶＲまたはＩＦＮＡＲ-/-に、Ｉ．Ｐ．経路のみによって、ＰＶ１ウイルス単独（それぞれ１０7ＰＦＵまたは１０4ＰＦＵ、５０％致死量の約１０倍）を感染させたか、または１：１０の比でｅＴＩＰと共に重複感染させた（例えば、図４Ａ～４Ｂ、および表３参照）。
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Ｔｇ２１ ＰＶＲマウスでは、重複感染群（ＰＶｌ＋ｅＴＩＰ＝ｌ：１０）において、ｅＴＩＰは感染後２１日目にＰＶ１単独群と比較して生存率を４０％増加させた。これに対して、同じ比のＩＦＮＡＲ-/-マウス群（ＰＶ１＋ｅＴＩＰ＝１：１０）では、生存率が全てのＩＦＮＡＲ-/-群で同じであったので、ｅＴＩＰは、ＰＶ１に対する防御を全く示さなかった（例えば、図４Ｂ参照）。濃縮と精製後に可能であったｅＴＩＰの最高量であるため、１：１０のウイルス対ｅＴＩＰの比を使用した。
後続の実験を行って、生存マウスが獲得免疫を生成するかどうかを調べた。感染２８日目にマウスから血清を採取し（例えば、図４Ａ参照）、中和抗体（ＮＡｂ）価測定を細胞培養において試験した。ＰＶｌ＋ｅＴＩＰ群では、ＮＡｂのレベルは、ＰＶ１群と比較して有意に高かった（６４倍希釈と比較した５１２倍希釈）（例えば、図４Ｃ参照）。ＮＡｂｓは、ＵＶ不活性化ｅＴＩＰ群では検出されなかった（例えば、図４Ｃ参照）。
インターフェロン欠損ＩＦＮＡＲ-/-動物では、防御のために高い比率のｅＴＩＰが必要であることが観察された（図２および図３）。一方で野生型マウスでは、低い比率で十分であった（図４）。このことは、宿主免疫応答がｅＴＩＰ防御にとって重要な役割を果たす可能性を示している。興味深いことに、ＵＶ不活化ｅＴＩＰは、Ｔｇ２１ＰＶＲおよびＩＦＮＡＲ-/-マウスでは防御効果を全く示さなかった。従って、防御にとってｅＴＩＰの複製が必要不可欠であることを示唆している。さらに、本明細書で提示されるデータは、ｅＴＩＰが宿主の獲得免疫を刺激する可能性があることを示唆しており、野生型ウイルスと共に重複感染させたｅＴＩＰ（ＰＶｌ＋ｅＴＩＰ）がＮＡｂ産生および獲得免疫を増加させることから、ｅＴＩＰをワクチン産生のアジュバントとして使用することができる。
様々な組織におけるウイルスの拡散および複製をさらに調べるために、後続の実験を実施した。Ｔｇ２１ ＰＶＲマウスをＰＶ１でまたは１：１０の比のＰＶ１＋ｅＴＩＰで感染させ、指示時点で脾臓、腎臓、肝臓および脳を採取した（例えば、図４Ｃ～４Ｅおよび方法を参照）。試験した全ての組織から、重複感染群（ＰＶｌ＋ｅＴＩＰ）はウイルス複製を有意に減少させ、ウイルス負荷を少なくとも２ ｌｏｇ減少させた（例えば、図４Ｃ～４Ｅを参照）。Ｉ．Ｐ．経路での全身性感染により、防御効果はおそらく、野生型ウイルス単独の場合と比較して、ＰＶ１とｅＴＩＰに重複感染することによって異なる免疫応答パターンを誘導することに起因するのであろう。
実施例２０：ｅＴＩＰは、初代細胞中のポリオウイルスを阻害し、重複感染によってインターフェロン応答を誘導する
本実施例は、初代マウス（Ｔｇ２１ＰＶＲマウス由来のＭＥＦ）においてｅＴＩＰ防御効果を評価するために実施した実験を記載する。ＭＥＦを、ＰＶ１単独、ｅＴＩＰ単独、または様々な比のＰＶ１とｅＴＩＰに重複感染させた。次いで、ＰＶ１の複製、ｅＴＩＰ、およびインターフェロンの誘導を測定した。ＰＶ１感染群では、ウイルス産生量が約１０倍増加し、１：１０の比でｅＴＩＰと共に重複感染させた群では、ＰＶ１の野生型産生は対照と比較して１０分の１になった（１０倍低くなった）。興味深いことに、重複感染群では４８時間目のＩＦＮ誘導は、ＥＬＩＳＡによって測定したとき、ＰＶ１単独またはｅＴＩＰ単独よりも約３倍増加した。プラークアッセイによりウイルス産生を測定し、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞中のＧＦＰ陽性細胞によってｅＴＩＰレベルを測定した。これらのデータは、（ｉ）１：１０の比でＰＶ１と共に重複感染させたｅＴＩＰが、インターフェロン誘導を増加させること、（ｉｉ）インターフェロン誘導がウイルス複製を必要とすること、および（ｉｉｉ）ＰＶ１とｅＴＩＰとの比が、ＰＶ１およびインターフェロン誘導に対する阻害効果にとって重要な因子であることを示唆している。これらのデータは、野生型ＰＶＲマウスにおける所見と一致している（例えば、図５参照）。
実施例２１：ｅＴＩＰは、気道感染における予防的および治療的抗ウイルス活性を付与し、粘膜免疫がｅＴＩＰ防御において重要な役割を果たす
この実施例は、ｅＴＩＰが気道感染における予防的および治療的抗ウイルス活性を付与すること、そして粘膜免疫がｅＴＩＰ防御に重要な役割を果たすことを示すために実施した実験を記載する。ポリオウイルスは、免疫能のあるマウスであるＴｇ２１ＰＶＲマウスに鼻腔内で感染することができることが報告されている。これは、ポリオウイルスが、上部気道において複製し、嗅覚神経を通って非常に迅速にＣＮＳを侵し、重篤な疾患を引き起こすために重要である。この実施例で記載する実験は、ｅＴＩＰが、鼻腔内接種した重複感染ポリオウイルスによるＰＶ１複製を阻害できる、という仮説に基づいて設計され、実行された。これらの実験では、免疫能のあるマウスＴｇ２１ＰＶＲ株（Ｔｇ２１）を２×ｌ０５ＰＦＵのＰＶ１ウイルス（５０％致死量の約５倍）単独により、または１：３０の比での混合ＰＶ１＋ｅＴＩＰにより鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）経路で重複感染させた。ＰＶ１ウイルス単独で感染させたＴｇ２１ＰＶＲマウスの８０％が、感染後２１日目に死亡した（ｎ＝１７）。注目すべきことに、重複感染群では、８０％のマウスが２１日目まで生存していた（ｎ＝１３、ｐ＜０．００１）。対照的に、野生型マウスで防御効果を示したＰＶ１と同じｅＴＩＰの比では、ＩＦＮＡＲ-/-マウスを防御しなかった（例えば図６参照）。これらのデータは、より低い比（１：３０）で、免疫能のあるマウスでの鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）感染による免疫能のあるマウスでのｅＴＩＰの防御効果がより高いことを示唆している。さらに、該データは、ＵＶ照射した（ＵＶｅｄ）ｅＴＩＰが、野生型およびＩＦＮＡＲ-/-マウスの両方での防御をいずれも示さなかったため、防御効果にはｅＴＩＰを複製する能力が必要であることを示している。
ｅＴＩＰの治療効果を試験するために、Ｔｇ２１ ＰＶＲ株（Ｔｇ２１）マウスを、２×１０5ＰＦＵのＰＶ１ウイルスにより鼻腔内感染させ（５０％致死量の～５倍）１８、そして２４時間後、ｅＴＩＰ（６×１０6ＩＵ／マウス）を送達し、このプロセスを計５日間にわたり毎日繰り返した。２１日後にＰＶ１群のマウスの８０％（ｎ＝２１）が死亡したが、一方でｅＴＩＰでの治療群では死亡率が３０％（ｎ＝１７、ｐ＝０．００３９）であった。ｅＴＩＰの防御率は約５０％であった。興味深いことに、感染後３日目～４日目のｅＴＩＰ単独の送達は、治療実験の場合は防御効果を生じなかった。加えて、ｅＴＩＰの予防効果も試験した。これらの実験では、Ｔｇ２１ ＰＶＲマウスに、ＰＶ１感染の２４時間前または４８時間前にｅＴＩＰを接種した。２４時間予防群（ｎ＝５）については防御効果が認められなかったが、一方で４８時間群についてはｅＴＩＰが６０％防御を付与した。２０％のマウスが生存していたＰＶ１群と比較して、Ｉ．Ｎ．感染により８０％のマウスが生存した。
ｅＴＩＰが他の気道ＲＮＡウイルスに対して防御できるかどうかをさらに試験するために、追加の実験を実施した。インフルエンザＨ１Ｎ１を、マウスにおいて鼻腔内接種によりｅＴＩＰと共に重複感染させた。実際に、ｅＴＩＰはインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８株単独と比較して体重減少を低減させた。いずれの特定の理論にも縛られることなく、ｅＴＩＰは宿主のインターフェロン応答を誘導することができ、特に気道において粘膜免疫を誘導すると考えられる。さらに樹状細胞などの細胞型特異的免疫応答が予測され、マクロファージまたはＴ細胞応答がこれらの条件の下で誘導されたと考えられる。
実施例２２：ｅＴＩＰｌ ＤＶＧの治療能
この実施例は、本明細書に記載のｅＴＩＰ ＤＶＧの治療能力を調査するために実施した実験を記載する。まず、ｅＴＩＰｌが、ＰＶ１の複製および臨床的に重要な関連エンテロウイルスのセットの複製を阻止することができるかどうかを調べた。細胞をｅＴＩＰｌの存在下または非存在下で、１：２０の比でエンテロウイルスに感染させた（ｅＴＩＰｌ多重感染度（ＭＯＩ）＝１～５）。ｅＴＩＰｌは、循環病原性エンテロウイルスＥＶ－Ｄ６８、ＥＶ－Ａ７１、コクサッキーウイルス（ＣＶＢ３）およびライノウイルスを含む、ＰＶおよび他のエンテロウイルスの複製を効果的に阻止する（例えば図７Ｅを参照；また実施例１も参照）。ウイルス複製は、検査したウイルスおよび細胞株に依存して、１０～１０００倍阻害された（例えば、図７Ｅを参照）。ｅＴＩＰｌ抗ウイルス活性がそのウイルス属に限定されているかどうかを判定するために、無関連のウイルスに対するｅＴＩＰｌ活性を試験した。肺上皮のＣａｌｕ－３細胞に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を単独でまたは異なる比のｅＴＩＰｌと共に感染させたとき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は１：５０の比で少なくとも１００分の１に低減された（図７Ｅ）。防御効果は、ＥＶ－Ｄ６８に対して前記比を１：１０から１：５０に増加したときに観察されるように、用量依存であった（例えば図１Ｇ参照）。
ｅＴＩＰｌ干渉プロセスをさらに調べるために、増殖曲線を試験した。肺上皮Ｃａｌｕ－３またはＡ５４９－Ａｃｅ２細胞株にｅＴＩＰｌ（Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝５）を感染させ、その５時間後、細胞をポリオウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染させた。複数回の感染後にウイルス力価を測定した。顕著なことに、ｅＴＩＰｌは、ポリオウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を予防的に阻害することが見出された（例えば、図１４Ａ～１４Ｂ参照）。これらのデータは、ｅＴＩＰｌの阻害活性が、複製に必要なウイルスカプシドまたは他のエンテロウイルス因子などのエンテロウイルスタンパク質を目当てにした直接競合に依存しないことを示唆している。
実施例２３：ｅＴＩＰｌは、マウスにおける致死的感染を防止する
この実施例は、細胞培養物でのｅＴＩＰｌの驚くべき広域スペクトル阻害効果を鑑みて、高病原性ポリオウイルス１型Mahoney株（ＰＶ１）に感染したマウスにおいて、致死性疾患を予防するｅＴＩＰｌの能力を調べるために実施した実験を記載する。ＰＶ１感受性の免疫能のあるトランスジェニックマウス（Ｔｇ２１）中への腹腔内接種（Ｉ．Ｐ．）の後、ＰＶ１は、多様な組織において、高力価で複製および蓄積し、最終的に中枢神経系（ＣＮＳ）に到達し、麻痺および死亡を引き起こす。同様に、上気道（Ｉ．Ｎ．）のＰＶ１感染は、嗅覚神経を経由して迅速にＣＮＳに到達し、脊髄および脳を感染させて重篤な疾患を発症させる。
従って、マウスを腹腔内（図８Ａ）または鼻腔内（図８Ｂ）経路により、高用量のＰＶ１（それぞれ１０7ＰＦＵまたは３×１０5ＰＦＵ）を用いてｅＴＩＰｌとの重複感染を行うか、またはＰＶ１を用いずにｅＴＩＰ１単独で感染させた。これらの条件下で、ｅＴＩＰｌは疾患を有意に軽減し、致死的な感染から８０～９０％のマウスを防御した。重要なことに、紫外線照射によって不活化されたｅＴＩＰｌの同時接種は、ＰＶ１からマウスを防御せず、このことは、ｅＴＩＰｌゲノムが抗ウイルス活性を生起するのに自身の自己増幅能を維持しなければならないことを示す。この研究はまた、ｅＴＩＰ１産生中に蓄積された未知のまたは未検出の共存物質（contaminants）による非特異的な防御の可能性を排除する。注目すべきことに、ｅＴＩＰｌは、ＥＶ－Ｄ６８を含むいくつかの他のエンテロウイルスとの重複感染後に動物を死亡から防御した（データは図示せず）。組織へのｅＴＩＰ１ウイルス複製の効果を検討するために、ＰＶ１またはＰＶ１＋ｅＴＩＰｌのいずれかで鼻腔内に感染した動物の脾臓および脳を、１日目、３日目に採取し、プラークアッセイによりウイルス力価を決定した。ｅＴＩＰｌは、ＰＶ１ウイルスの負荷を約５００倍超から検出できないレベルにまで劇的に減少させた（図８Ｃ）。これらの結果は、ｅＴＩＰ１が、１回量の鼻腔内投与後であっても、高病原性ウイルスによって引き起こされる死亡から動物を防御することができることを示している。
次に、ｅＴＩＰｌがその抗ウイルス活性を経時的に維持できるかどうかを調べた。単回投与量のｅＴＩＰｌを鼻腔内に投与し、４８時間後に動物を病原性ＰＶ１で免疫処置した。顕著には、ＰＶ単独を接種した動物は、感染のため死亡したが、ｅＴＩＰで前処置したものは、致死性疾患から９０％の動物を防御した（図８Ｄ、左）。加えて、ＰＶ１感染後２４時間目のｅＴＩＰ１での処置もまた有意な防御を誘発した（図８Ｄ、右）。ｅＴＩＰｌ接種の防御効果は７２時間後に喪失した（図示せず）。これらの結果は、ｅＴＩＰｌが鼻腔内感染に対する予防的および治療的防御活性の両方を有し、重度の疾患および死亡を防止することを示している。
実施例２４：ｅＴＩＰｌ媒介の抗ウイルス防御におけるインターフェロン（ＩＦＮ）の役割
本実施例は、ｅＴＩＰ１が全身的な抗ウイルス防御効果を誘導するメカニズムを調べるために実施した実験の結果を記載する。理論上、２つのモデルを考えることができる。１つは、ＤＶＧが細胞資源および構造タンパク質によるカプシド内包化に関して全長ウイルスゲノムよりも勝っており（outcompete）、組織内の他の細胞への親ウイルスの伝播を阻害すると推測される。ＤＶＧの小さいゲノムは、全長ゲノムを上回る利点を提供しうる。もう１つの代替的な可能性は、宿主の抗ウイルス応答を無効にするために必要とされるＤＶＧウイルスタンパク質またはその機能が、依然として自然免疫機構により感知されることである。ＲＮＡウイルスは、宿主の自然免疫応答の様々な成分を不活性化する、進化した多機能を有する。自己複製性ＲＮＡ、特に細胞質ｄｓＲＮＡ中間体を形成するＤＶＧは、パターン認識受容体を活性化し、ＩＦＮ感作遺伝子（ＩＳＧ）の産生に至る免疫応答を触発（トリガー）する。このようにして、ＤＶＧは、ＷＴウイルスの複製と干渉する、全身的な抗ウイルス状態を誘導することができる。加えて、ＤＶＧは、細胞にそれらの細胞膜の完全性を失わせ、様々なタイプの循環白血球をその部位に動員する、損傷関連の分子パターンを放出することができる。第１のオプションは、干渉が起こるためにはＤＶＧとＷＴウイルスの重複感染を必要とするが、第２のモデルは、ＤＶＧが非細胞自律的方法でウイルス複製を阻害することと相応している。
本明細書で提供されるデータは、第２のメカニズムと一致しており、ｅＴＩＰ１は、気道内で抗ウイルス状態を誘導することによってウイルス複製を阻止する。この仮説をテストするために、非バイアストランスクリプトーム・プロファイリング分析を、ｅＴＩＰｌまたはｍｏｃｋ（模擬；ＰＢＳ）処置マウスの肺および脾臓サンプルについて実施した。６×１０6感染単位（ＩＵ）のｅＴＩＰ１の鼻腔内投与後２日目の肺のＲＮＡ－Ｓｅｑ分析は、ｍｏｃｋ（模擬）感染マウスに比較して、ｅＴＩＰ１投与に応答して４倍より大きく発現が変化した遺伝子を同定した（誤検出率で、ｑ＜０．０５、Ｎ＝４０１４）（例えば、図９Ａ参照）。この分析は、ｅＴＩＰｌが既知の免疫遺伝子および真正な（bona fide）抗ウイルス遺伝子のセットを誘導することを示した。これらの遺伝子は、それらの転写応答において顕著な類似性を示した（例えば、図９Ａ、ヒートマップ参照）。この結果は、ｅＴＩＰ１感染の間のそれらの緊密な同時制御を強調している。高度にアップレギュレーションされた遺伝子のクラスターは、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩＴ３ｂ、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＩＳＧ１５、Ｍｘｌ、Ｍｘ２、ＳＴＡＴ１、および多数のＯＡＳパラログ（paralog）を含む、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答性遺伝子から成っていた。
次に、６×１０6ＩＵのｅＴＩＰ１による鼻腔内感染後の肺組織の免疫細胞についてフローサイトメトリー分析を行った。これらの実験により、ｅＴＩＰｌ感染が、好酸球（ＥＯＳ）および形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）を含む特定のリンパ球様細胞の肺への動員を誘導し、それが自然免疫応答の誘導と一致することが明らかになった（例えば、図９Ｂ参照）。
上記の実験は、ｅＴＩＰｌがＩＦＮ媒介性抗ウイルス状態を誘導することを裏付ける。次に、ｅＴＩＰｌ媒介性抗ウイルス防御が、ＩＦＮ応答の全身性自然免疫感作を必要とするかどうかを試験した。そのために、ＩＦＮ－α／β受容体を欠いている（ＩＦＮＡＲ-/-）動物をＰＶ１感染に対して防御する、ｅＴＩＰｌの治療能を調べた。顕著には、ｅＴＩＰｌが免疫能のあるＷＴマウスにおいてロバストな防御活性を誘発する条件下で（例えば図２Ａ～２Ｄ参照）、ＩＦＮＡＲ-/-マウスでは抗ウイルス防御が完全に失われた（例えば図９Ｃおよび９Ｄ参照）。これは、ＩＦＮ応答が、病原性ＰＶ１による鼻腔内感染からのｅＴＩＰｌ媒介性防御応答にとって重要であることを示す。
これらの知見に基づいて、本明細書では、ｅＴＩＰｌによるＤＶＧウイルス干渉について以下のモデルが提案される。ｅＴＩＰｌは、投与部位の初感染細胞において、他の細胞に拡散することなく複製する（例えば、図９Ｅ参照）。そのｄｓＲＮＡ複製中間体は、パターン認識受容体によって認識され、Ｉ型ＩＦＮの合成に至り、強力な自然応答を誘導する。ｅＴＩＰｌ中のＰＶプロテアーゼおよび他の非構造ウイルスタンパク質は、細胞小器官および経路（パスウェイ）の再配置を誘導するので、ｅＴＩＰｌは細胞壊死や細胞質流体の漏出をももたらすことができる。これは、白血球を組織内に動員し、免疫能のある環境を促進するであろう。従って、ｅＴＩＰ１をトリガーする分子過程は、免疫防御機序の異なるアームをバランスよく動員し、全身性の抗ウイルス応答を生成する、自然感染の現象を模倣している。なお、ＲＮＡウイルスによる粘膜投与は、短期的または長期的な免疫機能不全を伴う、副作用のない無菌免疫を果たす。本明細書で提供されるデータは、本来の抗ウイルス性自然免疫の調節が、ウイルス複製を阻害するｅＴＩＰ１の抗ウイルス活性の主たる決定因子であることを示唆している。重要なことには、鼻腔内単回投与が、小分子抗ウイルス抗体または治療用モノクローナル抗体の単回投与よりも長い期間にわたり、重篤なウイルス性疾患への進行を防止することが見出された。
実施例２５：鼻腔内単回投与による抗ウイルス状態の誘導は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および病理学から動物を防御する
本実施例は、ｅＴＩＰｌリポプレックスの鼻腔内単回投与による抗ウイルス状態の誘導が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および病理学から動物を防御することを示す実験の結果を記載する。
ｅＴＩＰｌ ＤＶＧが宿主の抗ウイルス応答を全身的に誘導することによってウイルス感染と干渉作用するという知見は、抗ウイルス治療薬としてのその潜在的用途を浮上させる。しかしながら、実際上の懸念は、ＰＶ受容体（ＰＶＲ）が標的細胞に侵入することを必要とするという点で、ｅＴＩＰ１粒子の適用性を制限し、そしてワクチン接種個体において既存のＰＶ１免疫によって中和され得ることである。従って、偏在する（universal）エンドサイトーシスを介してＲＮＡを送達する、合成ナノ構造脂質／ＲＮＡ複合体（本明細書ではリポプレックスと呼ばれる）が、ｅＴＩＰ１ ＤＶＧのための万能キャリア（担体）を提供することができるかどうかを検討するために、追加の実験を実施した。ＲＮＡ／リポプレックスは、既存の免疫の影響を受けず、多剤併用処置で反復投与することができる。本研究において、核酸のリン酸骨格に良好に結合し、比較的容易に調製することができ、かつ広範に特徴づけられている、カチオン性脂質製剤を選択した（図１０Ａ）。加えて、リポプレックスは、ＲＮＡ分子を加水分解から保護し、粘膜修復表面へのそれらの生体内送達を支援する。
まず、細胞培養における合成ｅＴＩＰ１ ＲＮＡの送達ビヒクルとしてのリポプレックスの能力を確かめた（例えば、図１５参照）。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に感受性のＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおいて、鼻腔内単回投与後２０時間目に抗ウイルス防御応答を誘導するそれらの能力を検査した。ｅＴＩＰ１粒子について観察されたのと同様に（例えば、図９Ａ参照）、ｅＴＩＰ１ ＲＮＡリポプレックスの鼻腔内単回送達は、肺においてＩＦＮ応答性遺伝子を強力に誘導したが、しかし、空のリポプレックスでは誘導しなかった（例えば、ＩＦＩＬＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩＴ３ｂ、ＩＲＦ７、ＩＳＧ１５、Ｍｘｌ、Ｍｘ２、ＣｘｃｌｌＯ、およびＯＡＳ Ｌ２）（例えば、図１０Ａ参照）。軽度のＩＦＮ応答が脳組織においても観察された（図１０Ａ）。これらの結果を、２４時間鼻腔内経路でｅＴＩＰ１に感染させたマウスの肺および脳からのｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲで確認した。２つのＩＦＮ感作遺伝子（ＩＳＧ）、ＭＸ１およびＩＳＧ５６（ＩＦＩ１）は、ｍｏｃｋ（模擬感染）対照と比較して、ｅＴＩＰ１処置群においてアップレギュレートされた（例えば図１６）。従って、ｅＴＩＰｌ粒子で観察されたものと同様に、ｅＴＩＰ１ ＲＮＡリポソームの鼻腔内送達は、抗ウイルス自然免疫応答を感作した。
次に、ｅＴＩＰ１リポプレックスまたはｅＴＩＰ１粒子の鼻腔内接種が、処置動物の頭部および肺の様々な部位において、ｅＴＩＰ１によりコードされるタンパク質の複製と産生をもたらすかどうかを調べた。接種後２４時間では、ポリオウイルス３Ｂ／ＶＰｇに対する抗体を用いる免疫組織化学により、接種動物の頭部および肺においてｅＴＩＰ１複製を調べた。いずれの場合においても、ｅＴＩＰ１複製は、上気道鼻腔の篩骨鼻甲介（ethmoid turbinates）腔内の少数の上皮細胞にのみ観察された（例えば、図１０Ａ～１０Ｂ）。注目すべきは、ＩＳＧの活性化、好酸球および形質細胞様樹状細胞の動員（例えば図９Ａ～９Ｂ）、並びにＰＶ感染からの完全な防御（例えば図８Ｂ）が観察されたとしても、肺においてｅＴＩＰ１複製は全く観察されなかった（図示せず）。結論として、リポプレックスまたはｅＴＩＰ１粒子のいずれかを用いた鼻腔内接種は、上気道内に制限されたそれらの複製を引き起こす（例えば図１０Ｂ）が、気道全体を全身的に防御する非細胞自律的抗ウイルス応答を誘導した（例えば、図１０Ｃ参照）。
防御の機序をより理解するために、追加の実験を行い、ｅＴＩＰ１が病原性ウイルスと同じ細胞および組織において複製するかどうかを調べた。高感受性マウス（ＩＦＮＲ-/-）に、ｅＴＩＰｌ（５０，０００感染単位）の存在下または非存在下で、２００ＰＦＵのＰＶ１を筋肉内に接種した。筋肉内接種は、ＰＶ１とｅＴＩＰ１が細胞に重複感染する確率（chance）をより高くなるのを確実にし、従ってｅＴＩＰ１は、ＰＶ１によりトランスに（in trans）提供されるカプシドタンパク質によって包み込まれ得る。ウイルスおよびｅＴＩＰ１複製をＲＴ－ｑＰＣＲによって筋肉、脾臓および脊髄において調べた。ｅＴＩＰ１ ＲＮＡは、１日目、３日目に接種部位に蓄積され、そして６日目まで減衰した（図１０Ｄ参照）。対照的に、ｅＴＩＰ１ ＲＮＡは、脾臓または脊髄のいずれにも、ほとんどまたは全く検出されず、このことは、ｅＴＩＰ１が、ＰＶ１の存在下でも接種部位を超えて拡散していないことを示す（例えば図１０Ｄ参照）。この結果は、ｅＴＩＰ１それ自体が初感染部位から広がらなくても、ｅＴＩＰ１が遠隔部位（例えば中枢神経系）のウイルス複製を阻害することを示す。
ｅＴＩＰｌがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から動物を防御するかどうかを調査した。鼻腔内単回投与量のｅＴＩＰｌリポプレックスをＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスに投与し、２０時間後、マウスを６×１０4ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で腹腔内感染させた。ｅＴＩＰｌ処置が関連組織におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に影響を及ぼすかどうかを決定し、感染後３日目と６日目に採取した肺と脳を測定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製は、プラークアッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲ（図１１Ａ）、並びにヌクレオカプシド（ＮＰ）およびスパイク（ＳＰ）タンパク質に対する抗体による免疫組織化学分析によって測定した（例えば、図１１Ｂ～１１Ｃ参照）。予想通り、対照のリポプレックス処置マウスは、肺および脳組織全体にわたって顕著なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価並びに広範なＮＰおよびＳＰ免疫反応性を示した（例えば、図１１Ａ～１１Ｃ参照）。顕著には、ｅＴＩＰｌリポプレックスの投与は、肺および脳においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価およびウイルスＲＮＡの蓄積を２～３ｌｏｇだけ減少させ（例えば図１１Ａ参照）、そして免疫組織化学は、ｅＴＩＰ１処置が肺および脳におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を強力に減少させることを確証した（例えば、図１１Ｂ～図１１Ｃ参照）。
体重減少は、動物の苦痛の高感度な尺度である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染マウスは、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の進行にために体重を喪失した。顕著には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したマウスでは、鼻腔内ｅＴＩＰ１単回投与が体重減少を防止（abrogated）した。実際に、ｅＴＩＰｌ処置動物は、実験期間を通して、ｍｏｃｋ（模擬）感染した対照群と同程度に体重を維持していた（例えば、図１２Ａ参照）。この実験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製を阻害することに加えて、ｅＴＩＰｌが疾患症状を予防することを示し、さらに、ｅＴＩＰｌ自体が苦痛を発生させないことも確証する。
ｅＴＩＰｌがＣＯＶＩＤ様の炎症性損傷から肺を防御するかどうかを調査した。肺切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した後に分析し、組織病理学においてスコア付けした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染マウスは、ｍｏｃｋ（模擬）感染マウスよりも有意に高い組織病理学スコアを示した（例えば、図１２Ｂ～１２Ｃ参照）。感染マウスにおける主要な組織病理学的所見は、肺胞空間のタンパク様デブリ、間質空間の好中球、および肺胞中隔濃縮であった。これらの所見は、間質性肺炎、炎症性細胞浸潤、肺胞中隔濃縮を含む徴候が検出された以前の研究と一致している。組織病理学的分析は、ｅＴＩＰ１リポプレックスでの処置が、感染後３日目に肺のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２炎症を減少させることを示した（空のリポプレックスの組織病理学スコア５．４／１６に比較して、１／１６の組織病理学スコア）（例えば、図１２Ｂ～１２Ｃ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ｅＴＩＰ１を参照）。注目すべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製が強力に阻害されたとしても、防御と相関のあるリンパ球様細胞の肺への浸潤を示した。これは、肺におけるｅＴＩＰ１媒介性抗ウイルス防御環境に結び付けられ得る。重要な点として、動物をｅＴＩＰ１単独で処置したとき、肺に気管支周囲炎症は観察されなかった。このことは、感染部位においてｅＴＩＰ１ ＲＮＡレベルが時間経過とともに明確になり、持続性炎症を引き起こさないことを示す（例えば、図１２Ｂ、ｅＴＩＰ１を参照）。これらの実験は、鼻腔内ｅＴＩＰ１単回処置が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を数オーダー減縮させ、インビボで肺の炎症を減少させ、ＣＯＶＩＤ－１９疾患の症状を緩和することを示している。
さらに、広域スペクトル抗ウイルス剤としてのｅＴＩＰ１の可能性をさらに裏付けるために、以下の観察を行った：ｅＴＩＰ１による鼻腔内単回接種が、インフルエンザウイルス感染および疾患からマウスを防御した（図１７）。結論として、ｅＴＩＰ１ナノ粒子の鼻腔内送達は、感染から防御し、ウイルス負荷を減少させ、かつ疾患を予防する、宿主の抗ウイルス性自然免疫応答を安全にかつ強力に刺激する。従って、本明細書に開示されるｅＴＩＰ１は、呼吸器疾患の治療において魅力的な臨床的効果をもたらす可能性を有する。
実施例２６：ｅＴＩＰは、核酸ベースのワクチンに対する抗体応答を増強する
この実施例は、ｅＴＩＰが核酸ベースのワクチンに対する抗体応答を増強することを示す実験結果を記載している。これらの実験では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓ ＨｅｘａＰｒｏ）の融合前の安定化されたスパイクタンパク質をコードする哺乳動物発現ベクターを、ナノ構造を有するリポプレックス複合体に製剤化した。ヒトポリオウイルス受容体（Ｔｇ２１）を担持しているマウスに、３０μｇのＳ ＨｅｘａＰｒｏ ＤＮＡリポプレックスを単独で鼻腔内にワクチン接種し、またはその後で３０時間後に１．５×１０6の生物学的ｅＴＩＰを鼻腔内送達した。ワクチン接種後２週間目に、ワクチン接種動物（各群の中の５匹）からの血清の連続希釈液を、プラークアッセイを使って抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の存在について分析した。ＤＮＡリポプレックスと生物学的ｅＴＩＰとの組み合わせによりワクチン接種したマウスからの血清は、ＤＮＡリポプレックス単独でワクチン接種したマウスの血清よりも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プラーク形成単位（ＰＦＵ）をより効率的に（２．５倍）阻害した。２回量のモデルナ（Ｍｏｄｅｒｎａ）ワクチンＲＮＡ－１２７３によってワクチン接種した回復期ヒト患者から得られた血清の同様の希釈液を使用したとき、ＰＦＵは全く検出されなかった。ｅＴＩＰの鼻腔内送達は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の産生を増強した（図１３Ａ）。
実施例２７：ｅＴＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化ワクチンに対する抗体応答を増強する
この実施例は、ｅＴＩＰがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化ワクチンに対する抗体応答を増強することを示す実験の結果を記載する。精製された不活化ウイルスは、伝統的にワクチン開発に使用されてきたものであり、このようなワクチンは、インフルエンザウイルスおよびポリオウイルスなどのウイルスによって引き起こされる疾患の予防にとって安全でかつ有効であることが認められている。大流行が始まって以来、世界中の研究者達は、ＣＯＶＩＤ－１９用のワクチンを開発しようと試みた。ワクチンの開発に対する努力の結果、不活化ワクチンを含む多数のプラットフォームから誘導された、いくつかの候補ワクチンの作出に至った。例えば、ＣｏｒｏｎａＶａｃ（コロナバック）（Ｓｉｎｏｖａｃ社）は、ヒトへの使用を裏付ける、良好な免疫原性を示す。
本実施例に記載の実験は、ｅＴＩＰが、不活化され精製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンによって誘発される免疫原性を増強することができるかどうかを試験したものであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を誘導するために必要とされるワクチンの量を減少させ、かつＣＯＶＩＤ１９に対するワクチン保護を延長することができる。マウスを、ｅＴＩＰ（５×１０6感染単位）と共に、５μｇの不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子（ｉＳＡＲＳ）により、筋肉内経路で免疫処置した。対照として、マウスにｉＳＡＲＳ単独、ｅＴＩＰ、または生理食塩水（ｍｏｃｋ）を接種した。２回の接種（第０週および第５週）の後、８０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ ８０％）を、１回目の接種から１０週間後にＶｅｒｏ－ｅ６細胞上で実施した。その結果は、ｅＴＩＰが中和抗体の産生を５倍率だけ増加させることを実証した（例えば図１３Ｂ参照）。
本開示の特定の選択肢が開示されているが、様々な修正および組み合わせが可能であり、添付の特許請求の範囲の真の精神および範囲内に企図されるものと理解されるべきである。従って、本明細書で提示される正確な要約および開示に限定する意図はない。
参考文献
１．Wimmer, E., Hellen, C. V. T. & Cao, X. GENETICS OF POLIOVIRUS. 1-84 (1993).
２．Abdool Karim, S.S., and de Oliveira, T. (2021). New SARS-CoV-2 Variants - Clinical, Public Health, and Vaccine Implications. N Engl J Med.
３．Ascough, S., Vlachantoni, I., Kalyan, M., Haijema, B.-J., Wallin-Weber, S., Dijkstra-Tiekstra, M., Ahmed, M.S., van Roosmalen, M., Grimaldi, R., Zhang, Q., et al. (2019). Local and Systemic Immunity against Respiratory Syncytial Virus Induced by a Novel Intranasal Vaccine. A Randomized, Double-Blind, Placebo-controlled Clinical Trial. Am J Respir Crit Care Med 200, 481-492.
４．Brooke, C.B., Ince, W.L., Wei, J., Bennink, J.R., and Yewdell, J.W. (2014). Influenza A virus nucleoprotein selectively decreases neuraminidase gene-segment packaging while enhancing viral fitness and transmissibility. Proc Natl Acad Sci USA 111, 16854-16859.
５．Burrill, C.P., Strings, V.R., and Andino, R. (2013a). Poliovirus: Generation, Quantification, Propagation, Purification, and Storage. Current Protocols in Microbiology 29, 15H.1.1-15H.1.27.
６．Burrill, C.P., Strings, V.R., Schulte, M.B., and Andino, R. (2013b). Poliovirus: Generation and Characterization of Mutants. Current Protocols in Microbiology 29, 15H.2.1-15H.2.32.
７．Caskey, M., Lefebvre, F., Filali-Mouhim, A., Cameron, M.J., Goulet, J.-P., Haddad, E.K., Breton, G., Trumpfheller, C., Pollak, S., Shimeliovich, I., et al. (2011). Synthetic double-stranded RNA induces innate immune responses similar to a live viral vaccine in humans. J Exp Med 208, 2357-2366.
８．Channappanavar, R., Fehr, A.R., Vijay, R., Mack, M., Zhao, J., Meyerholz, D.K., and Perlman, S. (2016). Dysregulated Type I Interferon and Inflammatory Monocyte-Macrophage Responses Cause Lethal Pneumonia in SARS-CoV-Infected Mice. Cell Host & Microbe 19, 181-193.
９．Crotty, S. (2004). Poliovirus vaccine strains as mucosal vaccine vectors and their potential use to develop an AIDS vaccine. Advanced Drug Delivery Reviews 56, 835-852.
１０．Deng, X., Garcia-Knight, M.A., Khalid, M.M., Servellita, V., Wang, C., Morris, M.K., Sotomayor-Gonzalez, A., Glasner, D.R., Reyes, K.R., Gliwa, A.S., et al. (2021). Transmission, infectivity, and antibody neutralization of an emerging SARS-CoV-2 variant in California carrying a L452R spike protein mutation. medRxiv.
１１．Dinnon, K.H., Leist, S.R., Schafer, A., Edwards, C.E., Martinez, D.R., Montgomery, S.A., West, A., Yount, B.L., Hou, Y.J., Adams, L.E., et al. (2020). A mouse-adapted model of SARS-CoV-2 to test COVID-19 countermeasures. Nature 1-16.
１２．Gu, H., Chen, Q., Yang, G., He, L., Fan, H., Deng, Y.-Q., Wang, Y., Teng, Y., Zhao, Z., Cui, Y., et al. (2020). Rapid adaptation of SARS-CoV-2 in BALB/c mice: Novel mouse model for vaccine efficacy. 1-38.
１３．Huang, A.S., and Baltimore, D. (1970). Defective Viral Particles and Viral Disease Processes. Nature 1-3.
１４．Ida-Hosonuma, M., Iwasaki, T., Yoshikawa, T., Nagata, N., Sato, Y., Sata, T., Yoneyama, M., Fujita, T., Taya, C., Yonekawa, H., et al. (2005). The Alpha/Beta Interferon Response Controls Tissue Tropism and Pathogenicity of Poliovirus. Journal of Virology 79, 4460-4469.
１５．Jangra, S., De Vrieze, J., Choi, A., Rathnasinghe, R., Laghlali, G., Uvyn, A., Van Herck, S., Nuhn, L., Deswarte, K., Zhong, Z., et al. (2021). Sterilizing Immunity against SARS-CoV-2 Infection in Mice by a Single-Shot and Lipid Amphiphile Imidazoquinoline TLR7/8 Agonist-Adjuvanted Recombinant Spike Protein Vaccine*. Angew Chem Int Ed Engl 60, 9467-9473.
１６．Kikkert, M. (2020). Innate Immune Evasion by Human Respiratory RNA Viruses. J Innate Immun 12, 4-20.
１７．Kitamura, N., Semler, B.L., Rothberg, P.G., Larsen, G.R., and Wimmer, E. (1981). Primary structure, gene organization and polypeptide expression of poliovirus. 1-7.
１８．Kranz, L.M., Diken, M., Haas, H., Kreiter, S., Loquai, C., Reuter, K.C., Meng, M., Fritz, D., Vascotto, F., Hefesha, H., et al. (2016). Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature 534, 396-401.
１９．Meganck, R.M., and Baric, R.S. (2021). Developing therapeutic approaches for twenty-first-century emerging infectious viral diseases. Nat Med 1-10.
２０．Meyerholz, D.K., and Beck, A.P. (2019). Histopathologic Evaluation and Scoring of Viral Lung Infection. In Hepatitis C Virus Protocols, (New York, NY: Springer US), pp. 205-220.
２１．Moreau, G.B., Burgess, S.L., Sturek, J.M., Donlan, A.N., Petri, W.A., Jr., and Mann, B.J. (2020). Evaluation of K18- hACE2mice as a model of SARS-CoV-2 infection. 1-12.
２２．Myong, S., Cui, S., Cornish, P.V., Kirchhofer, A., Gack, M.U., Jung, J.U., Hopfner, K.-P., and Ha, T. (2009). Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5′-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA. Science 323, 1070-1074.
２３．Nagata, N., Iwasaki, T., Ami, Y., Sato, Y., Hatano, I., Harashima, A., Suzaki, Y., Yoshii, T., Hashikawa, T., Sata, T., et al. (2004). A poliomyelitis model through mucosal infection in transgenic mice bearing human poliovirus receptor, TgPVR21. Virology 321, 87-100.
２４．Nelemans, T., and Kikkert, M. (2019). Viral Innate Immune Evasion and the Pathogenesis of Emerging RNA Virus Infections. Viruses 11, 961.
２５．Ohka, S., Igarashi, H., Nagata, N., Sakai, M., Koike, S., Nochi, T., Kiyono, H., and Nomoto, A. (2007). Establishment of a Poliovirus Oral Infection System in Human Poliovirus Receptor-Expressing Transgenic Mice That Are Deficient in Alpha/Beta Interferon Receptor. Journal of Virology 81, 7902-7912.
２６．Pathinayake, P., Hsu, A., and Wark, P. (2015). Innate Immunity and Immune Evasion by Enterovirus 71. Viruses 7, 6613-6630.
２７．Peersen, O.B. (2017). Picornaviral polymerase structure, function, and fidelity modulation. Virus Research 234, 4-20.
２８．Perrault, J., and Semler, B.L. (1979). Internal genome deletions in two distinct classes of defective interfering particles of vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci USA 76, 6191-6195.
２９．Perrault, J. (1981). Origin and Replication of Defective Interfering Particles. In Initiation Signals in Viral Gene Expression, A.J. Shatkin, ed. (Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg), pp. 151-207.
３０．Pfeiffer, J.K. (2010). Innate Host Barriers to Viral Trafficking and Population Diversity. (Elsevier), pp. 85-118.
３１．Rahim, M.M.A., Parsons, B.D., Price, E.L., Slaine, P.D., Chilvers, B.L., Seaton, G.S., Wight, A., Medina-Luna, D., Dey, S., Grandy, S.L., et al. (2020). Defective Influenza A Virus RNA Products Mediate MAVS-Dependent Upregulation of Human Leukocyte Antigen Class I Proteins. Journal of Virology 94.
３２．Rezelj, V.V., Carrau, L., Merwaiss, F., Levi, L.I., Erazo, D., Tran, Q.D., Henrion-Lacritick, A., Gausson, V., Suzuki, Y., Shengjuler, D., et al. (2021). Defective viral genomes as therapeutic interfering particles against flavivirus infection in mammalian and mosquito hosts. Nature Communications 1-14.
３３．Rogers, T.F., Zhao, F., Huang, D., Beutler, N., Burns, A., He, W.-T., Limbo, O., Smith, C., Song, G., Woehl, J., et al. (2020). Isolation of potent SARS-CoV-2 neutralizing antibodies and protection from disease in a small animal model. Science 369, 956-963.
３４．Scheideler, M., Vidakovic, I., and Prassl, R. (2020). Lipid nanocarriers for microRNA delivery. Chem Phys Lipids 226, 104837.
３５．Schlee, M., Roth, A., Hornung, V., Hagmann, C.A., Wimmenauer, V., Barchet, W., Coch, C., Janke, M., Mihailovic, A., Wardle, G., et al. (2009). Recognition of 5′ triphosphate by RIG-I helicase requires short blunt double-stranded RNA as contained in panhandle of negative-strand virus. Immunity 31, 25-34.
３６．Schmolke, M., and Garcia-Sastre, A. (2010). Evasion of innate and adaptive immune responses by influenza A virus. Cell Microbiol 12, 873-880.
３７．Schoggins, J.W., and Rice, C.M. (2011). Interferon-stimulated genes and their antiviral effector functions. Current Opinion in Virology 1, 519-525.
３８．Schoggins, J.W., MacDuff, D.A., Imanaka, N., Gainey, M.D., Shrestha, B., Eitson, J.L., Mar, K.B., Richardson, R.B., Ratushny, A.V., Litvak, V., et al. (2014). Pan-viral specificity of IFN-induced genes reveals new roles for cGAS in innate immunity. Nature 505, 691-695.
３９．Semler, B.L., Perrault, J., Abelson, J., and Holland, J.J. (1978). Sequence of a RNA templated by the 3′-OH RNA terminus of defective interfering particles of vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci USA 75, 4704-4708.
４０．Shirogane, Y., Rousseau, E., Voznica, J., Xiao, Y., Su, W., Catching, A., Whitfield, Z.J., Rouzine, I.M., Bianco, S., and Andino, R. (2021). Experimental and mathematical insights on the interactions between poliovirus and a defective interfering genome. bioRxiv 7, 118-150.
４１．Sun, Y., Jain, D., Koziol-White, C.J., Genoyer, E., Gilbert, M., Tapia, K., Panettieri, R.A., Hodinka, R.L., and Lopez, C.B. (2015). Immunostimulatory Defective Viral Genomes from Respiratory Syncytial Virus Promote a Strong Innate Antiviral Response during Infection in Mice and Humans. PLoS Pathog 11, e1005122-21.
４２．Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D.R., Pimentel, H., Salzberg, S.L., Rinn, J.L., and Pachter, L. (2012). Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature Protocols 7, 562-578.
４３．Vignuzzi, M., and Lopez, C.B. (2019a). Defective viral genomes are key drivers of the virus-host interaction. Nat Microbiol 1-13.
４４．Vignuzzi, M., and Lopez, C.B. (2019b). Defective viral genomes are key drivers of the virus-host interaction. Nat Microbiol 1-13.
４５．Wang, C., Li, W., Drabek, D., Okba, N.M.A., Haperen, R., Osterhaus, A.D.M.E., Kuppeveld, F.J.M., Haagmans, B.L., Grosveld, F., and Bosch, B.-J. (2020). A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection. Nature Communications 1-6.
４６．White, K.M., Rosales, R., Yildiz, S., Kehrer, T., Miorin, L., Moreno, E., Jangra, S., Uccellini, M.B., Rathnasinghe, R., Coughlan, L., et al. (2021). Plitidepsin has potent preclinical efficacy against SARS-CoV-2 by targeting the host protein eEF1A. Science 371, 926-931.
４７．WHO (2021). COVID-19 Weekly Epidemiological Update. 1-33.
４８．Winkler, E.S., Bailey, A.L., Kafai, N.M., Nair, S., McCune, B.T., Yu, J., Fox, J.M., Chen, R.E., Earnest, J.T., Keeler, S.P., et al. (2020). SARS-CoV-2 infection of human ACE2-transgenic mice causes severe lung inflammation and impaired function. Nature Immunology 1-21.
４９．Xiao, Y., Dolan, P.T., Goldstein, E.F., Li, M., Farkov, M., Brodsky, L., and Andino, R. (2017). Poliovirus intrahost evolution is required to overcome tissue-specific innate immune responses. Nature Communications 1-12.
５０．Zhou, B., Thao, T.T.N., Hoffmann, D., Taddeo, A., Ebert, N., Labroussaa, F., Pohlmann, A., King, J., Steiner, S., Kelly, J.N., et al. (2021). SARS-CoV-2 spike D614G change enhances replication and transmission. Nature 592, 122-127.
５１．Zhu, N., Zhang, D., Wang, W., Li, X., Yang, B., Song, J., Zhao, X., Huang, B., Shi, W., Lu, R., et al. (2020). A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med NEJMoa2001017-NEJMoa2001017.

Claims (52)

  1. 改変エンテロウイルスゲノムをコードする核酸配列を含む核酸構成物であって、該改変エンテロウイルスゲノムが、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部分を欠いている、核酸構成物。
  2. 前記改変エンテロウイルスゲノムが、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、またはそれらの任意組み合わせをコードする核酸配列の少なくとも一部分を欠いている、請求項１に記載の核酸構成物。
  3. 前記改変エンテロウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的部分を欠いている、請求項１または２のいずれか一項に記載の核酸構成物。
  4. 前記改変エンテロウイルスゲノムが、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を全く含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸構成物。
  5. 前記改変エンテロウイルスゲノムが、ライノウイルスＡ、ライノウイルスＢ、およびライノウイルスＣから成る群より選択されたライノウイルス種に属するウイルスに由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸構成物。
  6. 前記改変エンテロウイルスゲノムが、エンテロウイルスＡ、エンテロウイルスＢ、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＥ、エンテロウイルスＦ、エンテロウイルスＧ、エンテロウイルスＨ、エンテロウイルスＩ、エンテロウイルスＪ、エンテロウイルスＫ、およびエンテロウイルスＬから成る群より選択されたエンテロウイルス種に属するウイルスに由来する。請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸構成物。
  7. 前記改変エンテロウイルスゲノムが、エンテロウイルスＣ種のポリオウイルスに由来する、請求項６に記載の核酸構成物。
  8. 前記改変エンテロウイルスゲノムが、ＰＶ１、ＰＶ２、およびＰＶ３から成る群より選択されたポリオウイルス血清型に由来する、請求項７に記載の核酸構成物。
  9. 前記改変ポリオウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ポリオウイルス１型（ＰＶ１）に由来する、請求項８に記載の核酸構成物。
  10. 前記改変ポリオウイルスゲノムをコードする核酸配列が、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構成物。
  11. 改変ポリオエンテロウイルスゲノムをコードする核酸配列が、異種核酸配列に操作可能に連結されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸構成物。
  12. 前記異種核酸配列が、プロモーター配列または選択可能マーカーのコード配列を含む、請求項１１に記載の核酸構成物。
  13. 改変ポリオウイルスゲノムをコードする核酸配列が、発現カセットまたは発現ベクター中に組み込まれる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸構成物。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構成物を含むエンテロウイルスの欠陥干渉（ＤＩ）粒子。
  15. 前記核酸構成物が異種カプシド構造タンパク質により包み込まれている、請求項１４に記載のＤＩ粒子。
  16. （ａ）請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構成物、および／または（ｂ）請求項１４～１５のいずれか一項に記載のＤＩ粒子を含む組み換え細胞。
  17. 前記組み換え細胞が真核細胞である、請求項１６に記載の組み換え細胞。
  18. 前記真核細胞が動物細胞である、請求項１７に記載の組み換え細胞。
  19. 前記動物細胞がヒト細胞である、請求項１８に記載の組み換え細胞。
  20. エンテロウイルスの欠陥干渉（ＤＩ）粒子を産生する方法であって、
    ａ）エンテロウイルス構造タンパク質を発現するように操作された宿主細胞を提供し；
    ｂ）前記提供された宿主細胞を、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構成物によりトランスフェクトし；そして
    ｃ）前記トランスフェクトされた宿主細胞を、発現されたエンテロウイルス構造タンパク質によって包み込まれた核酸構成物を含むエンテロウイルスのＤＩＰの産生のための条件下で培養する
    工程を含む方法。
  21. 前記産生された欠陥干渉（ＤＩ）粒子を収穫する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記請求項２０～２１のいずれか一項に記載の方法により産生される、欠陥干渉（ＤＩ）粒子。
  23. 薬学的に許容される賦形剤と、
    請求項１４～１５および２２のいずれか一項に記載のＤＩ粒子、
    請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構成物、および／または
    請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組み換え細胞
    とを含む医薬組成物。
  24. 前記組成物が、請求項１４～１５および１６のいずれか一項に記載の欠陥干渉（ＤＩ）粒子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記組成物が、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  26. 前記組成物が、リポソーム、脂質ナノ粒子、またはポリマーナノ粒子中に製剤化される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  27. 前記組成物が免疫原性組成物である、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  28. 前記免疫原性組成物がワクチンとして製剤化される、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 前記医薬組成物がアジュバントとして製剤化される、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  30. 前記医薬組成物が、鼻腔内投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、および経口投与のうちの１つ以上のために製剤化される、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  31. 必要がある対象に免疫応答を誘発させる方法であって、前記対象に、
    （ａ）請求項１４～１５および２２のいずれか一項に記載の欠陥干渉（ＤＩ）粒子；
    （ｂ）請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構成物；
    （ｃ）請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組み換え細胞；および／または
    （ｄ）請求項２３～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物
    を含む組成物を投与することを含む方法。
  32. 必要がある対象において健康状態を予防および／または治療する方法であって、前記対象に、
    （ａ）請求項１４～１５および２２のいずれか一項に記載の欠陥干渉（ＤＩ）粒子；
    （ｂ）請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構成物；
    （ｃ）請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組み換え細胞；および／または
    （ｄ）請求項２３～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物
    を含む組成物を、予防的にまたは治療的に投与することを含む方法。
  33. 前記状態が免疫疾患または感染である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記対象が、免疫疾患または感染に関連する状態を有するか、またはそれを有する疑いがある、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記感染が季節性呼吸器ウイルス感染または急性呼吸器ウイルス感染である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記感染が、ヒトオルソニューモウイルス属の種、エンテロウイルス科の種、コロナウイルス科の種、またはオルソミクソウイルス科の亜型に属するウイルスによって引き起こされる、請求項３４～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記オルソミクソウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルスまたはパラインフルエンザウイルスである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記インフルエンザＡ型ウイルスが、亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、およびＨ１０Ｎ７から成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記パラインフルエンザウイルスが、亜型ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、およびＨＰＩＶ－４から成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記コロナウイルスが、β－ＣｏＶ重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項３６に記載の方法。
  41. 前記コロナウイルスβ－ＣｏＶ感染が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＢａｔ ＳＬ－ＣｏＶ－ＷＩＶ１などの株をすべて包含する）から成る群より選択された１つ以上のサルベコウイルス亜属、平頭コウモリ（Tylonycteris bat）コロナウイルス（ＢｔＣｏＶ－ＨＫＵ４）、アブラコウモリ（Pipistrellus bat）コロナウイルスＨＫＵ５（ＢｔＣｏＶ－ＨＫＵ５）、および中東呼吸器症候群関連コロナウイルスＭＥＲＳ－ＣｏＶ（これはＨｃｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１種を包含する）から成るメルベコウイルス亜属に関連付けられる、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ヒトオルソミクソウイルスがヒトＲＳウイルス（ＨＲＳＶ）である、請求項３６に記載の方法。
  43. 前記ＨＲＳＶが亜型Ａおよび／または亜型Ｂに関連付けられる、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ウイルス感染がエンテロウイルス感染またはライノウイルス感染である、請求項３６に記載の方法。
  45. 前記ライノウイルス感染が、ライノウイルスＡ種、ライノウイルスＢ種、およびライノウイルスＣ種から成る群より選択された１つ以上のライノウイルス種に関連付けられる、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記エンテロウイルス感染が、エンテロウイルスＡ種、エンテロウイルスＢ種、エンテロウイルスＣ種、エンテロウイルスＤ種、エンテロウイルスＥ種、エンテロウイルスＦ種、エンテロウイルスＧ種、エンテロウイルスＨ種、エンテロウイルスＩ種、エンテロウイルスＪ種、エンテロウイルスＫ種およびエンテロウイルスＬ種から成る群より選択された１つ以上のエンテロウイルス種に関連付けられる、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記ウイルス感染が、ポリオウイルス１型（ＰＶ１）、ポリオウイルス３型（ＰＶ３）、コクサッキーウイルスＡ２、コクサッキーウイルスＡ４、コクサッキーウイルスＡ１６、コクサッキーウイルスＢ１、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶ－Ｂ３）、コクサッキーウイルスＢ６、パラエコーウイルス（エコーウイルス）、エンテロウイルスＡ７１（ＥＶ－Ａ７１）、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ－Ｄ６８）、ライノウイルスＨＲＶ１６、およびライノウイルスＨＲＶ１Ｂのうちの１つ以上に関連付けられる、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記組成物が、鼻腔内投与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、または頭蓋内投与のうちの１つ以上のために製剤化される、請求項３１～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記投与された組成物が、対象においてインターフェロンの産生の増加をもたらす、請求項３１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記組成物が、単独療法（単剤療法）としてまたは少なくとも１つの追加の療法と組み合わせた第一療法として個別に対象に投与される、請求項３２～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記少なくとも１つの追加の療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒物療法、ターゲット療法、および手術から成る群より選択される、請求項５０に記載の方法。
  52. 健康状態またはウイルス感染の予防および／または治療のために、免疫応答を誘発するためのキットであって、
    請求項１４～１５および２２のいずれか一項に記載の欠陥干渉（ＤＩ）粒子；
    請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構成物；
    請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組み換え細胞；および／または
    請求項２３～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物
    を含むキット。
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