CN112522287B - 肠道病毒缺损基因组、缺损干扰颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于微生物工程技术和生物制品领域，提供了抑制肠道病毒感染和/或复制的缺损干扰基因组和应用、缺损干扰颗粒及其制备方法和应用，该抑制肠道病毒的肠道病毒缺损基因组为脊髓灰质炎病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和人鼻病毒中的任一种肠道病毒的缺损型基因组，其缺失基因区为P1基因区、2BC基因区和3CD基因区的任一种。本发明提供的肠道病毒缺损干扰颗粒，在细胞中当与完整肠道病毒共感染时，能够抑制完整肠道病毒的复制和后代产生。而且，缺损病毒单独感染不能产生后代，所以具备安全性。另外，缺损干扰颗粒免疫小鼠后显示出免疫原性，可用于制造疫苗或成为疫苗组成成分。

Description

肠道病毒缺损基因组、缺损干扰颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术和生物制品领域，尤其涉及肠道病毒缺损基因组、缺损干扰颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
肠道病毒是一类感染人类和动物的、无包膜、基因组为单股正链RNA的小RNA病毒科病毒，包括脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)、肠道病毒71型(en terovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16,CVA16)、人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)和埃可病毒(Echovirus)等，所致人类传染病包括手足口病、脊髓灰质炎、普通感冒、疱疹性咽峡炎、病毒性心肌炎等。
然而，肠道病毒的治疗上目前没有特效药物，临床以对症治疗为主，其效率低下，不能在早期抑制病毒复制、增殖。另外，以前进入临床试验的化合物药物均失败，目前并没有有望进入临床试验的药物。虽然有中药在使用，但是机理不明、鲜见疗效方面的数据。所以开发特效抗病毒药的需求急迫。此外，目前市售的肠道病毒疫苗仅限于预防脊髓灰质炎病毒与肠道病毒71型，针对其他肠道病毒的疫苗仍有待开发。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供抑制肠道病毒的肠道病毒缺损基因组和缺损干扰颗粒，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，抑制肠道病毒的肠道病毒缺损基因组，其为肠道病毒的缺损型基因组。
优选地，所述肠道病毒缺损基因组为I型脊髓灰质炎病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和人鼻病毒A1型中的任一种肠道病毒的缺损型基因组。
优选地，所述肠道病毒缺损基因组的缺失基因区为P1基因区、2BC基因区和3CD基因区的任一种。
优选地，所述肠道病毒缺损基因组用于广谱抑制肠道病毒的感染和/或复制。
优选地，所述肠道病毒缺损基因组用于广谱抑制脊髓灰质炎病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和人鼻病毒中的至少一种肠道病毒。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的肠道病毒缺损基因组在制备广谱抑制肠道病毒的感染和/或复制的制剂中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供抑制肠道病毒的缺损干扰颗粒，其包含如上述的肠道病毒缺损基因组。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的抑制肠道病毒的缺损干扰颗粒的制备方法，其包括以下步骤：
制备表达肠道病毒缺损基因组的缺失基因区编码的蛋白的细胞系；
将肠道病毒缺损基因组转染到上述细胞系中，或将缺损干扰颗粒感染该细胞系，收获得到所述缺损干扰颗粒。
具体的，上述制备方法可包括以下步骤：
合成表达肠道病毒缺损基因组的缺失基因区的表达质粒；
将缺失基因区的表达质粒分别转染至Hela S3、RD、RD、Hela H1细胞，经筛选得到稳转细胞系；
将肠道病毒缺损基因组的DNA质粒进行体外转录，将转录成的RNA经转染到上述稳转细胞系中后，再进行细胞培养，然后经冻融、离心、取上清，得到所述抑制肠道病毒的缺损干扰颗粒。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的缺损干扰颗粒。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述缺损干扰颗粒在制备广谱抑制肠道病毒的感染和/或复制的制剂中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述缺损干扰颗粒在制备预防肠道病毒感染的疫苗中的应用。
本发明实施例提供的一种抑制肠道病毒的肠道病毒缺损基因组或缺损干扰颗粒，在细胞中当与完整肠道病毒共感染时，能够抑制完整肠道病毒的复制、后代产生和对细胞的杀伤，而且，缺损干扰颗粒单独感染不能产生后代，所以具备安全性。具体的，缺损干扰颗粒又叫缺损病毒，或缺陷病毒，其基因组有部分缺失，自身不能有效复制和包装子代病毒；但是与完整病毒共感染细胞时可以竞争性地争夺完整病毒复制和包装所需资源；同时缺损病毒的基因组比较短，复制相对快，从而减少了完整病毒基因组在体系中的份额。
另外，缺损干扰颗粒免疫小鼠后显示出免疫原性，可用于制造肠道病毒疫苗或成为疫苗组成成分。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例通过基因合成(委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成)获得了多种肠道病毒缺损型基因组(Defective Viral Genome,DVG)DNA。其中肠道病毒种类涉及I型脊髓灰质炎病毒(Poliovirus type 1,PV1)、肠道病毒71型(E nterovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16,CVA16)和人鼻病毒A1型(Human Rhinovirus A1,HRV A1)。基因组缺损的位置和长度也有多种，涉及P1基因区缺失、2BC基因区缺失、3CD基因区缺失。其中，对于P1基因区缺失的构建中，在缺失基因区中可插入C-myc编码序列(5’-GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3’，如序列表SEQ ID NO:1所示)，做到不改变读码框。多种肠道病毒缺损型基因组(DVG)的构建具体见表1。
表1
Figure BDA0002823244210000041
实施例2
通过反向遗传学手段，上述肠道病毒缺损基因组RNA与同种完整病毒基因组RNA共转染细胞后培养12小时，培养上清中形成的完整病毒滴度比单独转染完整病毒基因组RNA后形成的病毒滴度降低。肠道病毒缺损基因组RNA与不同种肠道病毒完整基因组RNA共转染时也能抑制完整病毒的产生。
具体的，将含肠道病毒全长基因组DNA的质粒(T7启动子)和上述表1中的肠道病毒DVG基因组DNA的质粒(T7启动子)分别在polyA后进行EcoR1限制性内切酶消化使其线性化，经T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA P roduction System体外转录试剂盒(Promega公司，按照说明书操作)进行体外转录，转录成病毒全长基因组RNA和病毒DVG基因组RNA。
其中，PV1的宿主细胞Hela S3(人卵巢癌细胞)、EV71和CVA16的宿主细胞RD(人横纹肌肉瘤细胞)、HRV的宿主细胞Hela H1(人卵巢癌细胞)各自培养于T150培养瓶中，达到90％汇合度，0.25％胰酶消化并用PBS重悬。使用MicroPulser电穿孔仪(美国BIO-RAD公司，按照说明书操作)将病毒基因组RNA(单种病毒基因组RNA使用20μg，两种共转染时使用各20μg)与8×106对应宿主细胞混合后电击转染，后置于6孔板中培养；12h后收获上清液，测定病毒滴度(空斑形成单位PFU/mL)。
将收获的上清液10倍梯度稀释，取250μl分别加入到含80％汇合度宿主细胞的6孔板中，感染1h后移除上清；孔中加入温的1％琼脂糖，待冷却形成凝胶，置于培养箱中培养；48～72h后加入2％甲醛固定，后移除凝胶；用0.1％结晶紫溶液染色，计算空斑形成单位(PFU/mL)＝(孔中空斑数/0.25ml)×稀释倍数。各组DVG代号见表1。其中，I型脊髓灰质炎病毒的缺损型基因组(PV1-DVG)转染抑制PV1复制具体的检测结果如表2所示，PV1-DVG转染抑制EV71复制具体的检测结果如表3所示，PV1-DVG转染抑制CVA16复制具体的检测结果如表4所示，PV1-DVG转染抑制HRV复制具体的检测结果如表5所示；肠道病毒71型的缺损型基因组(EV71-DVG)转染抑制EV71复制具体的检测结果如表6所示，EV71-DVG转染抑制PV1复制具体的检测结果如表7所示，EV71-DVG转染抑制CVA16复制具体的检测结果如表8所示，EV71-DVG转染抑制HRV复制具体的检测结果如表9所示；柯萨奇病毒A16型的缺损型基因组(CVA16-DVG)转染抑制CVA16复制具体的检测结果如表10所示；CVA16-DVG转染抑制PV1复制具体的检测结果如表11所示，CVA16-DVG转染抑制EV71复制具体的检测结果如表12所示，CVA16-DVG转染抑制HRV复制具体的检测结果如表13所示；人鼻病毒A1型的缺损型基因组(HRV-DVG)转染抑制HRV A1复制具体的检测结果如表14所示，HRV-DVG转染抑制PV1复制具体的检测结果如表15所示，HRV-DVG转染抑制EV71复制具体的检测结果如表16所示，HR V-DVG转染抑制CVA16复制具体的检测结果如表17所示。
表2
PV1滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染PV1 2.1x 10^6
PV1-DVG-ΔP1与PV1共转染 5.4x 10^4
PV1-DVG-Δ2BC与PV1共转染 4.6x 10^5
PV1-DVG-Δ3CD与PV1共转染 7.7x 10^4
表3
Figure BDA0002823244210000061
Figure BDA0002823244210000071
表4
CVA16滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染CVA16 3.6x 10^5
PV1-DVG-ΔP1与CVA16共转染 2.9x 10^4
PV1-DVG-Δ2BC与CVA16共转染 6.1x 10^4
PV1-DVG-Δ3CD与CVA16共转染 5.2x 10^4
表5
HRV滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染HRV 7.5x 10^4
PV1-DVG-ΔP1与HRV共转染 6.9x 10^3
PV1-DVG-Δ2BC与HRV共转染 9.1x 10^3
PV1-DVG-Δ3CD与HRV共转染 8.7x 10^3
表6
EV71滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染EV71 7.3x 10^4
EV71-DVG-ΔP1与EV71共转染 1.1x 10^4
EV71-DVG-Δ2BC与EV71共转染 4.2x 10^4
EV71-DVG-Δ3CD与EV71共转染 1.7x 10^4
表7
Figure BDA0002823244210000072
Figure BDA0002823244210000081
表8
CVA16滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染CVA16 2.8x 10^5
EV71-DVG-ΔP1与CVA16共转染 1.7x 10^4
EV71-DVG-Δ2BC与CVA16共转染 1.0x 10^5
EV71-DVG-Δ3CD与CVA16共转染 3.8x 10^4
表9
HRV滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染HRV 1.8x 10^5
EV71-DVG-ΔP1与HRV共转染 3.7x 10^4
EV71-DVG-Δ2BC与HRV共转染 1.2x 10^5
EV71-DVG-Δ3CD与HRV共转染 5.4x 10^4
表10
CVA16滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染CVA16 4.6x 10^5
CVA16-DVG-ΔP1与CVA16共转染 9.1x 10^3
CVA16-DVG-Δ2BC与CVA16共转染 3.2x 10^4
CVA16-DVG-Δ3CD与CVA16共转染 7.7x 10^3
表11
PV1滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染PV1 1.9x 10^6
CVA16-DVG-ΔP1与PV1共转染 3.8x 10^5
CVA16-DVG-Δ2BC与PV1共转染 7.2x 10^5
CVA16-DVG-Δ3CD与PV1共转染 5.8x 10^5
表12
EV71滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染EV71 7.6x 10^4
CVA16-DVG-ΔP1与EV71共转染 6.4x 10^3
CVA16-DVG-Δ2BC与EV71共转染 1.1x 10^4
CVA16-DVG-Δ3CD与EV71共转染 6.7x 10^3
表13
HRV滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染HRV 9.3x 10^4
CVA16-DVG-ΔP1与HRV共转染 1.6x 10^4
CVA16-DVG-Δ2BC与HRV共转染 5.2x 10^4
CVA16-DVG-Δ3CD与HRV共转染 3.7x 10^4
表14
HRV滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染HRV 8.1x 10^4
HRV-DVG-ΔP1与HRV共转染 5.9x 10^3
HRV-DVG-Δ2BC与HRV共转染 3.2x 10^4
HRV-DVG-Δ3CD与HRV共转染 9.7x 10^3
表15
PV1滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染PV1 2.8x 10^6
HRV-DVG-ΔP1与PV1共转染 6.6x 10^5
HRV-DVG-Δ2BC与PV1共转染 1.0x 10^6
HRV-DVG-Δ3CD与PV1共转染 8.5x 10^5
表16
EV71滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染EV71 3.3x 10^4
HRV-DVG-ΔP1与EV71共转染 8.6x 10^3
HRV-DVG-Δ2BC与EV71共转染 9.9x 10^3
HRV-DVG-Δ3CD与EV71共转染 8.3x 10^3
表17
CVA16滴度PFU/mL
空白对照 0
单独转染CVA16 1.1x 10^5
HRV-DVG-ΔP1与CVA16共转染 4.4x 10^4
HRV-DVG-Δ2BC与CVA16共转染 8.9x 10^4
HRV-DVG-Δ3CD与CVA16共转染 6.3x 10^4
实施例3
该实施例建立肠道病毒衣壳蛋白表达细胞系，在该细胞系中通过反向遗传学的手段将DVG-ΔP1肠道病毒缺损基因组分别包装成缺损干扰颗粒(Defective In terferingParticle,DIP)，分别命名为PV1-DIP-ΔP1、EV71-DIP-ΔP1、CVA16-DI P-ΔP1、HRV-DIP-ΔP1。这种缺损干扰颗粒具备正常的衣壳和肠道病毒缺损基因组。
具体的，首先合成使用pBudCE4.1真核表达载体(美国invitrogen公司)的病毒P1基因区和3CD基因区双表达质粒(委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成与质粒构建，简称P1-3CD表达质粒)，质粒信息见表18。pBudCE4.1载体具备2个独立的基因表达座位，受2个不同的真核启动子控制，可使P1基因区和3CD基因区独立表达，以获得高效的DIP包装效率。P1区表达产物提供DVG中缺失的衣壳蛋白，3CD区表达产物提供3C蛋白酶用于切割P1表达出的多聚蛋白前体和3D聚合酶用于提高DVG复制效率。构建时P1区5’末端原本含有起始密码子ATG，3’末端人为安装终止密码子TGA；3CD区5’末端人为安装起始密码子ATG，3’末端原本含有终止密码子TGA。
表18
Figure BDA0002823244210000111
将PV1、EV71、CVA16、HRV的P1-3CD表达质粒分别经lipofectamine 2000转染试剂(美国invitrogen公司，根据说明书操作)转染到Hela S3、RD、R D、Hela H1细胞，经200μg/mL博来霉素(zeocin，美国Thermo Fisher公司)筛选，挑取单细胞克隆培养，得到4种病毒各自的P1-3CD稳转细胞系。4种D VG-ΔP1病毒基因组DNA质粒分别在polyA后进行EcoR1限制性内切酶消化使其线性化，使用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA ProductionSystem体外转录试剂盒(Promega公司，按照说明书操作)进行体外转录，将转录成的RNA经电击转染到上述各自病毒的P1-3CD稳转细胞系中。
具体的，P1-3CD稳转细胞各自培养于T150培养瓶中，达到90％汇合度，0.25％胰酶消化并用PBS重悬。使用MicroPulser电穿孔仪(美国BIO-RAD公司，按照说明书操作)将病毒基因组RNA(各20μg)与8x106对应宿主细胞混合后电击转染，后置于T75培养瓶中培养。培养24～48小时后，冻融3次后离心(10000x g，30分钟)，收集上清获得包装成的缺损干扰颗粒(DIP)，分别命名为PV1-DIP-ΔP1、EV71-DIP-ΔP1、CVA16-DIP-ΔP1、HRV-DIP-ΔP1。
DIP测定滴度(C-myc免疫荧光观测法)：每种宿主细胞分别在24孔板中培养到90％汇合度。分别将PV1-DIP-ΔP1、EV71-DIP-ΔP1、CVA16-DIP-ΔP1、H RV-DIP-ΔP1进行10倍梯度稀释，并分别逐级加入24孔板里的对应的宿主细胞进行感染(n＝3)，每孔加入100μL。9～12小时后进行C-myc免疫荧光检测。细胞弃上清，4％多聚甲醛固定，triton-X100打孔，2％BSA封闭，加入C-myc抗体(美国Abcam公司)杂交2小时，Cy5荧光标记二抗(美国Abcam公司)杂交2小时。后置于Zeiss LSM 710荧光显微镜(德国Zeiss公司)下计数孔中表现Cy5荧光的细胞数，计算DIP滴度(IU/mL)＝(孔中所有荧光细胞计数/0.1ml)×稀释倍数。
DIP的扩大制备：P1-3CD稳转宿主细胞分别培养在T150培养瓶中达到70％汇合度，将初步包装的PV1-DIP-ΔP1、EV71-DIP-ΔP1、CVA16-DIP-ΔP1、HRV-DIP-ΔP1分别以MOI＝0.1～0.5感染对应的P1-3CD稳转宿主细胞。48～72小时待大部分细胞发生细胞病变CPE，收获细胞和上清，冻融3次后离心(10000x g，30分钟)，收集上清。使用C-myc免疫荧光观测法测定DIP滴度(IU/mL)。此方法可使DIP滴度(IU/mL)逐步提高。
实施例4
上述DIP与同种完整肠道病毒共感染细胞时，能够抑制完整病毒后代的产生。DIP与非同种完整肠道病毒交叉共感染时也能抑制完整病毒后代产生。
具体的，宿主细胞分别培养在24孔板中达到90％汇合度，分别将PV1-DIP-ΔP1、EV71-DIP-ΔP1、CVA16-DIP-ΔP1、HRV-DIP-ΔP1(MOI＝10)与同种完整病毒(MOI＝1)共感染相应的宿主细胞(Hela S3、RD、RD、Hela H1细胞)。共感染1小时后移除上清，PBS清洗2遍，加入含2％胎牛血清(美国Gibco公司)培养基培养。9小时后收获上清液，测定完整病毒滴度(空斑形成单位PFU/mL)，其测定结果如表19-22。
表19
PV1滴度PFU/mL
空白对照 0
单独感染PV1 3.2x 10^7
PV1-DIP-ΔP1与PV1共感染 1.8x 10^6
EV71-DIP-ΔP1与PV1共感染 7.7x 10^6
CVA16-DIP-ΔP1与PV1共感染 4.8x 10^6
HRV-DIP-ΔP1与PV1共感染 7.2x 10^6
表20
Figure BDA0002823244210000131
Figure BDA0002823244210000141
表21
CVA16滴度PFU/mL
空白对照 0
单独感染CVA16 6.1x 10^6
PV1-DIP-ΔP1与CVA16共感染 2.0x 10^5
EV71-DIP-ΔP1与CVA16共感染 9.3x 10^5
CVA16-DIP-ΔP1与CVA16共感染 3.5x 10^5
HRV-DIP-ΔP1与CVA16共感染 1.1x 10^6
表22
HRV滴度PFU/mL
空白对照 0
单独感染HRV 7.7x 10^5
PV1-DIP-ΔP1与HRV共感染 9.0x 10^3
EV71-DIP-ΔP1与HRV共感染 1.3x 10^5
CVA16-DIP-ΔP1与HRV共感染 4.4x 10^4
HRV-DIP-ΔP1与HRV共感染 8.2x 10^4
实施例5：
将PV1-DIP-ΔP1、EV71-DIP-ΔP1、CVA16-DIP-ΔP1、HRV-DIP-ΔP1分别以MOI＝1感染各自的宿主细胞(感染实验方法同实施例4)，96小时内未发现细胞病变效应(CPE现象)，表明没有细胞杀伤。此时收获培养上清，取100μl感染各自的宿主细胞(感染实验方法同实施例4)，48小时后进行C-myc免疫荧光检测(免疫荧光实验方法同实施例3)，未见任何含阳性荧光细胞，做空斑形成实验(空斑形成实验方法同实施例2)也检测不到活病毒滴度，表明未形成可感染的DIP或完整病毒。说明DIP单独感染不造成细胞杀伤，也不能产生DIP或完整病毒后代，所以具备安全性。
实施例6：
PV1-DIP-ΔP1、EV71-DIP-ΔP1、CVA16-DIP-ΔP1、HRV-DIP-ΔP1分别经过纯化，后分别免疫小鼠，采集血清，通过ELISA法可检测到抗同种肠道病毒的IgG抗体，显示四种DIP均具有免疫原性，可用于制造疫苗或成为疫苗组成成分。细节如下。
DIP的纯化：DIP溶液分别装载到30％蔗糖离心介质上，于100000x g离心3.5小时(SW28转子，美国Beckman超速离心机)弃上清，沉淀溶于PBS中。使用Nano Drop 2000分光光度仪(美国Thermo Scientific公司)在280nm波长测定蛋白含量，为每种DIP定量。
DIP免疫小鼠与血清采集：将6-8周龄雌性ICR品系小鼠(购自长春生物制品所)分组每组6只，分别在第0周，2周，4周以腹腔注射将5μg/只单种DIP免疫小鼠。并在第2周，4周，6周从小鼠尾静脉取血浆。血浆在37゜C放置1h，3000x g离心30分钟，吸取上层血清，血清于56゜C灭活30分钟。
ELISA方法检测DIP免疫血清中抗同种肠道病毒的IgG抗体：96孔板分别用单种活病毒(分别为PV1、EV71、CVA16、HRV单独)包被4゜C过夜，用含3％BSA的PBS溶液37゜C封闭2小时，接着用PBS-T(0.5％Tween-20)溶液洗板3次。同种病毒DIP免疫小鼠血清样品梯度稀释于100μL含0.3％BSA的PBS溶液中，加入孔板中37゜C孵育2小时，后洗板5次，加入辣根过氧化物酶HRP偶联的羊抗小鼠IgG(H+L)(1：4000稀释，购自美国Thermo Fisher Scientific公司)，37゜C孵育1小时，后洗板5次，加入100μL TMB底物(购自美国Thermo FisherScientific公司)室温避光孵育15分钟，加入100μl 2M H2SO4终止反应，于450nm波长测定吸光度(使用美国PerkinElmer VICTORTM X2多功能检测系统)。结果判定：大于cut-off值2.1倍的结果为阳性，否则为阴性。4组DIP免疫血清中均可检到明确的对同种病毒的IgG抗体产生，且随免疫次数增加抗体滴度增加，结果如表23～26所示。
表23
Figure BDA0002823244210000161
表24
Figure BDA0002823244210000162
表25
Figure BDA0002823244210000163
表26
Figure BDA0002823244210000164
Figure BDA0002823244210000171
综上所述，本发明提供的肠道病毒缺损基因组，在细胞中当与完整肠道病毒共转染时，能够抑制完整肠道病毒的复制和后代产生，且能够广谱抑制非同种肠道病毒的复制。本发明提供了将肠道病毒缺损基因组包装、制备成缺损干扰颗粒的方法。本发明提供的缺损干扰颗粒，在细胞中当与完整肠道病毒共感染时，能够抑制完整肠道病毒的复制和后代产生，且能够广谱抑制非同种肠道病毒的复制。而且，缺损病毒单独感染不造成细胞杀伤，也不能产生后代，所以具备安全性。此外，肠道病毒缺损干扰颗粒免疫小鼠后显示出免疫原性，可用于制造疫苗或成为疫苗组成成分。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure BDA0002823244210000181
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种抑制肠道病毒的缺损干扰颗粒及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 30

Claims (3)

1.肠道病毒缺损基因组在制备广谱抑制肠道病毒的感染和/或复制的制剂中的应用，其特征在于，所述肠道病毒缺损基因组为肠道病毒的缺损型基因组；所述肠道病毒缺损基因组为I型脊髓灰质炎病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和人鼻病毒A1型中的任一种肠道病毒的缺损型基因组；所述肠道病毒缺损基因组的缺失基因区为P1基因区、2BC基因区和3CD基因区的任一种。
2.缺损干扰颗粒在制备广谱抑制肠道病毒的感染和/或复制的制剂或者预防肠道病毒感染的疫苗中的应用，其特征在于，所述缺损干扰颗粒包含肠道病毒缺损基因组，所述肠道病毒缺损基因组为肠道病毒的缺损型基因组；所述肠道病毒缺损基因组为I型脊髓灰质炎病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和人鼻病毒A1型中的任一种肠道病毒的缺损型基因组；所述肠道病毒缺损基因组的缺失基因区为P1基因区、2BC基因区和3CD基因区的任一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述缺损干扰颗粒的制备方法包括以下步骤：
制备表达肠道病毒缺损基因组的缺失基因区编码的蛋白的细胞系；
将肠道病毒缺损基因组转染到上述细胞系中，或将缺损干扰颗粒感染该细胞系，收获得到所述缺损干扰颗粒。
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