CN106880630A - Retro‑2cycl及相关衍生物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了Retro‑2cycl和/或Retro‑2.1及相关衍生物在制备预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物中的应用。本发明中研究表明Retro‑2cycl和/或Retro‑2.1及其衍生物可有效抑制由肠道病毒71型引起的细胞病变效应、病毒空斑效应，显著降低肠道病毒71型子代病毒产量，显著抑制肠道病毒71型感染小鼠，证明Retro‑2cycl和/或Retro‑2.1及相关衍生物可有效预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病。

Description

Retro-2cycl及相关衍生物的用途
技术领域
本发明涉及药物新用途领域，特别涉及Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物中的应用。
背景技术
小RNA病毒是一种微小的无包膜的正链RNA病毒，目前包含17个病毒属，如肠病毒属、鼻病毒属和肝病毒属等。小RNA病毒是许多人类和动物疾病的病原体，较常见的致病病毒包括肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)和甲肝病毒(Hepatitis A virus)等，可引起诸如手足口病、脊髓灰质炎、甲型肝炎等多种疾病，导致呼吸系统炎症、手足口炎症、脑膜炎、急性骨髓灰白质炎、心血管疾病、出血性结膜炎、肝炎等多种疾病，严重时将导致死亡。小RNA病毒在全球范围内流行，已经成为严重危害公众健康的问题。
目前，临床上主要通过支持治疗和对症治疗的方法控制由小RNA病毒感染引起的疾病，使用广谱常规抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦、更昔洛韦等抑制病毒活性，以及通过免疫调节物如干扰素、免疫球蛋白及糖皮质激素发挥免疫保护作用。由于广谱药物的使用会导致耐药病毒株的出现，而目前缺乏与常规抗病毒药物具有不同靶点的新型抗病毒药物，因此，急需研制与开发用于预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病的药物。
研究表明，小RNA病毒的生命周期中许多重要事件已经被描述，包括病毒的吸附与进入、病毒核酸复制与蛋白合成、病毒的包装与释放等，这些事件在小RNA病毒科各个病毒之间相对保守。因此，研究与开发出靶向于相对保守生命周期各事件的抑制剂，将为由小RNA病毒感染引起的疾病的预防和/或治疗提供新的方向。
Retro-2cycl化学名称为：2-(5-甲基噻吩-2-基)-3-苯基-2,3-二氢喹唑啉-4(1氢)-酮(2-(5-methylthiophen-2-yl)-3-phenyl-2,3-dihydroquinazolin-4(1H)-one)；分子量为：320.41；结构式如下：
Retro-2.1化学名称为：6-氟-1-甲基-2-(5-(2-甲基噻唑-4-基)噻吩-2-基)-3-苯基-2,3-二氢喹唑啉-4(1氢)-酮(6-fluoro-1-methyl-2-(5-(2-methylthiazol-4-yl)thiophen-2-yl)-3-phenyl-2,3-dihydroquinazolin-4(1H)-one)；分子量为：435.54；结构式如下：
Retro-2cycl最初是通过细胞高通量筛选的方法得到的蓖麻毒素和细菌志贺毒素的小分子抑制剂，随后，研究者基于Retro-2cycl针对不同药效基团对其进行了改造和优化，得到了91个相关衍生物，并进一步优化得到Retro-2.1。这些衍生物特异性地靶向于病原体在宿主细胞中与囊泡相关的Retrograde转运途径，而在病毒感染生命周期中，囊泡同样参与了许多重要过程。因此，Retro-2cycl和Retro-2.1及相关衍生物将有希望在病毒感染生命周期中发挥作用。已有报道证明，除了对毒素产生抑制作用外，Retro-2cycl对多瘤病毒及乳头瘤病毒的感染也具有抑制作用。但是，目前关于Retro-2cycl和Retro-2.1及相关衍生物对小RNA病毒感染的抑制作用并无报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物中的应用。本发明中研究表明Retro-2cycl和/或Retro-2.1可有效抑制由肠道病毒71型引起的细胞病变效应、病毒空斑效应，显著降低肠道病毒71型子代病毒产量，显著抑制肠道病毒71型感染小鼠，证明Retro-2cycl和/或Retro-2.1可有效预防和/或治疗手足口病等由小RNA病毒感染引起的疾病。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备抑制由肠道病毒71型引起的细胞病变效应药物中的应用；
Retro-2cycl的结构式如式I所示：
Retro-2.1的结构式如式II所示：
相关衍生物如式III～VIII所示：
其中，R1独立选自：5-Me、4-Me、4-MeO、4-F、5-F；
其中，R2独立选自：
其中，R3独立选自：
其中，R4独立选自：t-Boc、COPh、Bn、Me、Et、Pr、n-Bu；
其中，R5独立选自：Et、CHO、CH2OH、CH2NHBn、CH2Cl、SMe、SPh、CN、Ph、3,4-(OMe)2Ph、3-NO2Ph、4-CO2MePh、4-COMePh、PhOPh、3,4,5-(OMe)3Ph、4-(OMe)Ph、4-CNPh、
其中，R6独立选自：Cl、I、OMe、SMe、F、Br、CN、OPh、SPh、Ph、Bn、CF3、OCF3、OBn、SO2Ph、NO2。
在本发明中，由肠道病毒71型引起的细胞病变效应是指由肠道病毒71型病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的效应。
作为优选，Retro-2cycl作用于细胞的浓度为0.1～200μM。
优选地，Retro-2cycl的浓度为0.78～100μM。
优选地，Retro-2cycl的浓度为1.56～75μM。
更优选地，Retro-2cycl的浓度为3.13～50μM。
作为优选，Retro-2.1作用于细胞的浓度为0.0005～100μM。
优选地，Retro-2.1的浓度为0.0015～75μM。
优选地，Retro-2.1的浓度为0.0061～50μM。
更优选地，Retro-2.1的浓度为0.024～25μM。
作为优选，细胞为人细胞。
优选地，细胞为人胚肾细胞。
更优选地，细胞为稳定转染肠道病毒71型受体human SCARB2的人胚肾细胞。
本发明还提供了Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备抑制由肠道病毒71型引起的病毒空斑效应药物中的应用。
在本发明中，由肠道病毒71型引起的空斑效应是指肠道病毒71型感染已形成致密单层状态的细胞群体时，经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染、死亡、脱落，形成肉眼可见的空斑。
作为优选，Retro-2cycl作用于细胞的浓度为0.1～200μM。
优选地，Retro-2cycl的浓度为0.78～100μM。
优选地，Retro-2cycl的浓度为1.56～75μM。
更优选地，Retro-2cycl的浓度为3.13～50μM。
作为优选，Retro-2.1作用于细胞的浓度为0.0005～100μM。
优选地，Retro-2.1的浓度为0.0015～75μM。
优选地，Retro-2.1的浓度为0.0061～50μM。
更优选地，Retro-2.1的浓度为0.024～25μM。
作为优选，细胞为人细胞。
优选地，细胞为人胚肾细胞。
更优选地，细胞为稳定转染肠道病毒71型受体human SCARB2的人胚肾细胞。
本发明还提供了Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备降低肠道病毒71型子代病毒产量药物中的应用。
在本发明中，肠道病毒71型子代病毒产量是衡量单位体积内子代病毒感染力的指标。
作为优选，Retro-2cycl作用于细胞的浓度为0.1～200μM。
优选地，Retro-2cycl的浓度为0.78～100μM。
优选地，Retro-2cycl的浓度为1.56～75μM。
更优选地，Retro-2cycl的浓度为3.13～50μM。
作为优选，Retro-2.1作用于细胞的浓度为0.0005～100μM。
优选地，Retro-2.1的浓度为0.0015～75μM。
优选地，Retro-2.1的浓度为0.0061～50μM。
更优选地，Retro-2.1的浓度为0.024～25μM。
作为优选，细胞为人细胞。
优选地，细胞为人胚肾细胞。
更优选地，细胞为稳定转染肠道病毒71型受体human SCARB2的人胚肾细胞。
本发明还提供了Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备抑制肠道病毒71型感染小鼠药物中的应用。
作为优选，降低肠道病毒71型感染小鼠所致死亡率的Retro-2cycl注射剂量为0.1～200mg/kg/天。
优选地，Retro-2cycl注射剂量为0.5～100mg/kg/天。
优选地，Retro-2cycl注射剂量为1～75mg/kg/天。
更优选地，Retro-2cycl注射剂量为1.5～50mg/kg/天。
优选地，小鼠为BALB/c小鼠；
优选地，小鼠为BALB/c新生乳鼠；
更优选地，小鼠为1日龄的BALB/c新生乳鼠。
本发明还提供了Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物中的应用。
在本发明提供的实施例中，由小RNA病毒感染引起的疾病为由肠道病毒71型感染所致的手足口病。
作为优选，预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物的服用者为人。
优选地，预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物的服用者为16岁及以下的儿童。
更优选地，预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物的服用者为5岁及以下的儿童。
作为优选，药物包含Retro-2cycl、Retro-2.1或相关衍生物中的一种或几种，以及一种或多种药用载体。
作为优选，药物还包含其他用于预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病的药物。
本发明提供了Retro-2cycl和/或Retro-2.1在制备预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物中的应用。本发明至少具有如下优势之一：
1、Retro-2cycl和Retro-2.1在对由肠道病毒71型引起的293S细胞病变效应的有效抑制浓度下无细胞毒性或毒性很小；浓度为0～31.25μM的Retro-2cycl或Retro-2.1对细胞无任何毒性；
Retro-2cycl和Retro-2.1对293S细胞的CC50分别为：>500μM和268.2μM，因此，Retro-2cycl和Retro-2.1属于低细胞毒性药物；
2、Retro-2cycl和Retro-2.1对由肠道病毒71型引起的293S细胞病变效应具有明显的抑制作用，且抑制率与药物浓度呈正相关，最优抑制率分别为60.8％和71.93％，EC50分别为：12.72μM和0.026μM；可用治疗指数SI综合评价药物抗病毒的效果，研究表明当SI>4时，可作为具有潜力的候选药物进行开发，Retro-2cycl和Retro-2.1的SI分别为39.31和10315.38，证明其能有效降低肠道病毒71型对细胞的杀伤并伴随着较低的药物毒性；
Retro-2cycl和Retro-2.1对由肠道病毒71型引起的293S细胞病毒空斑效应具有明显的抑制作用，且抑制率与药物浓度呈正相关，最优抑制率分别为56.28％和71.86％；经计算EC50分别为：18.49μM和0.28μM，与实施例2中其对肠道病毒71型引起的293S细胞病变效应抑制率的EC50接近；进一步证明，Retro-2cycl和Retro-2.1能有效抑制肠道病毒71型感染；
Retro-2cycl和Retro-2.1在肠道病毒71型感染过程中对病毒核酸含量及蛋白含量均无显著降低作用，证明Retro-2cycl和Retro-2.1对肠道病毒71型的进入过程以及复制过程均无抑制作用，两者对肠道病毒71型抑制作用的靶点非病毒进入及复制过程；
Retro-2cycl和Retro-2.1对肠道病毒71型子代病毒产量具有明显的降低作用，可以将子代病毒滴度降低1-2个数量级，从病毒水平方面进一步证明了Retro-2cycl和Retro-2.1能有效抑制肠道病毒71型感染；
Retro-2cycl的注射能够显著降低由肠道病毒71型感染新生乳鼠所致的死亡率，最优剂量为注射10mg/kg/天Retro-2cycl，能够将乳鼠死亡率由100％降低至10％，证明Retro-2cycl对肠道病毒71型的在新生乳鼠上的感染具有明显的保护作用，从动物模型方面进一步证明了Retro-2cycl能有效抑制肠道病毒71型感染；
可见，Retro-2cycl和Retro-2.1及相关衍生物可以成为抗肠道病毒71型感染候选药物的先导化合物，进而开发成为用于制备用于预防或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病的药物。
具体实施方式
本发明公开了Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物中的应用中所用药物、试剂或仪器均可由市场购得。本发明所检测的Retro-2cycl和Retro-2.1均为小分子化合物，由法国原子能研究中心提供。除非另外说明，实施例中使用的各种仪器和试剂均为普通市售品。实施例6所述的1日龄BALB/c乳鼠为BALB/c孕鼠生产后24h内的子代，孕鼠购于长春生物制品所。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：构建293S细胞
将合成的两端有EcoR I&Xba I酶切位点的EV71受体human SCARB2基因片段(GenBank accession no:NM_005506.3，由上海捷瑞公司合成)插入慢病毒载体Lenti-XpLVX-Puro载体(购自Clontech)，并使用慢病毒载体试剂盒中的转染试剂(购自Clontech)按说明书转染人胚肾细胞(HEK 293细胞，购自ATCC，登录号#CRL-1573)，获得稳定转染human SCARB2的HEK 293细胞，简称293S细胞。
实施例2：Retro-2cycl和Retro-2.1的细胞毒性和对由肠道病毒71型引起细胞病变效应的抑制作用
取对数生长期的293S细胞，以3×104个/孔的密度接种于96孔培养板，培养24小时。293S细胞在37℃和5％CO2下培养，使用的培养液为含有1.25μg/ml嘌呤霉素(购自Clontech)补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液(简称为10％FBS-DMEM，FBS和DMEM均购自Sigma)。
在检测Retro-2cycl和Retro-2.1的细胞毒性时，吸掉原细胞培养液，向各孔中加入100μl含不同浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的补充有2％胎牛血清的DMEM细胞培养液(简称为2％FBS-DMEM)，使Retro-2cycl和Retro-2.1的终浓度为500μM，250μM，125μM，62.5μM，31.25μM，15.63μM，7.81μM，3.91μM，每个浓度设3个复孔；继续培养细胞48h后，按照说明书的指导下使用CellTiter-荧光细胞活性检测试剂盒(购自Promega公司)，在多标记微孔板检测系统(Multilabel Plate Reader 2030，购自Perkin Elmer公司)上测定560nm下的荧光值，荧光值的大小反映细胞的活性。
在检测Retro-2cycl和Retro-2.1对由肠道病毒71型引起细胞病变效应的抑制作用时，吸掉原细胞培养液，在加入50μl肠道病毒71型(EV71-C4，GenBank accession no:KJ508817，获自吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室)感染之前(感染复数为0.04)，向各孔细胞中分别加入50μl含不同浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的2％FBS-DMEM细胞培养液，使Retro-2cycl和Retro-2.1的终浓度分别为100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.13μM，1.56μM，0.78μM和25μM，6.25μM，1.56μM，0.39μM，0.098μM，0.024μM，0.0061μM，0.0015μM，每个浓度设3个复孔，孵育5h；随后加入EV71感染并维持药物存在；继续培养细胞48h，如上述方法测定560nm下的荧光值。
同时还设置了仅加入2％FBS-DMEM细胞培养液处理的细胞对照及仅加入肠道病毒71型进行感染的病毒对照，除了加入的物质不同以外，其他操作同上。
细胞毒效应用CC50(细胞存活率为50％时的药物浓度)表示，细胞存活率＝(给药组荧光值/细胞对照组荧光值)×100％；根据不同浓度的药物对每孔细胞毒性分别算出存活率为50％时的药物浓度，用半数毒性浓度CC50表示；
EV71引起的细胞病变效应抑制率＝[(感染并给药组荧光值-感染对照组荧光值)/细胞对照组荧光值]×100％；根据不同浓度的药物对每孔细胞病变效应抑制率分别算出抑制率为50％时的药物浓度，用半数抑制浓度EC50表示；
药物抗EV71感染效果以治疗指数SI评价，SI＝CC50/EC50。
独立实验重复两次，结果取两次平均值。
实验结果如下：
表1 Retro-2cycl对293S细胞的细胞毒性
表2 Retro-2.1对293S细胞的细胞毒性
Retro-2.1(μM) 细胞毒性(％)
0 0.00±0.00
3.91 0.00±0.00
7.81 0.00±0.00
15.63 0.00±0.00
31.25 0.00±0.00
62.5 21.35±3.66
125 34.03±2.26
250 53.67±3.40
500 59.07±0.97
表3 Retro-2cycl对由EV71引起的293S细胞病变效应的抑制率
表4 Retro-2.1对由EV71引起的293S细胞病变效应的抑制率
Retro-2.1(μM) 抑制率(％)
0 0.00±0.00
0.0015 16.23±25.98
0.0061 17.67±21.12
0.024 30.92±32.01
0.098 61.34±16.80
0.39 62.76±10.32
1.56 68.23±11.82
6.25 71.93±14.99
25 18.07±10.37
表5在293S细胞中Retro-2cycl和Retro-2.1抗EV71感染的治疗效果
药物 SI
>500 12.72 39.31
Retro-2.1 268.2 0.026 10315.38
通过以上结果可以得到如下结论，Retro-2cycl和Retro-2.1在对由肠道病毒71型引起的293S细胞病变效应的有效抑制浓度下，并无细胞毒性，对293S细胞的CC50分别为：>500μM和268.2μM，因此，Retro-2cycl和Retro-2.1属于低细胞毒性药物；Retro-2cycl和Retro-2.1对由肠道病毒71型引起的293S细胞病变效应具有明显的抑制作用，且抑制率与药物浓度呈正相关，最优抑制率分别为60.8％和71.93％，EC50分别为：12.72μM和0.026μM；可用治疗指数SI综合评价药物抗病毒的效果，研究表明当SI>4时，可作为具有潜力的候选药物进行开发，Retro-2cycl和Retro-2.1的SI分别为39.31和10315.38，证明两者能有效降低肠道病毒71型对细胞的杀伤并伴随着较低的药物毒性；因此，Retro-2cycl和Retro-2.1及相关衍生物可以成为抗肠道病毒71型感染候选药物的先导化合物，进而开发成为用于制备用于预防或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病的药物。
实施例3：Retro-2cycl和Retro-2.1对由肠道病毒71型引起病毒空斑效应的抑制作用
取对数生长期的293S细胞，以5×105个/孔的密度接种于12孔培养板，培养24h。293S细胞在37℃和5％CO2下，使用的培养液为含有1.25μg/ml嘌呤霉素的10％FBS-DMEM。各孔吸掉原细胞培养液，在加入500μlEV71感染之前(感染量为100PFU/孔)，各孔细胞分别加入500μl含有不同浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的2％FBS-DMEM细胞培养液，使Retro-2cycl和Retro-2.1的终浓度分别为25μM，12.5μM，6.25μM，3.13μM，1.56μM和6.25μM，1.56μM，0.39μM，0.098μM，0.024μM，每个浓度3个复孔，孵育5h；随后加入EV71感染并维持药物存在，继续培养细胞1h，吸掉原细胞培养液并用无菌PBS将单细胞层漂洗两遍，向药物组加入400μl含相应浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的1％琼脂-2％FBS-DMEM细胞培养液；待培养基凝固后，将细胞倒置培养72h，用4％多聚甲醛固定15min，结晶紫(购自北京鼎国公司)染色，计数空斑。
同时还设置了仅加入肠道病毒71型进行感染的病毒对照，除了加入的物质不同以外，其他操作同上。
EV71引起的病毒空斑效应的抑制率＝[(感染对照组空斑个数-感染并给药组空斑个数)/感染对照组空斑个数]×100％；根据不同浓度的药物对每孔细胞病毒空斑效应的抑制率分别算出抑制率为50％时的药物浓度，用半数抑制浓度EC50表示；
独立实验重复两次，结果取两次平均值。
实验结果如下：
表6 Retro-2cycl对由EV71引起的293S细胞病毒空斑效应抑制率
抑制率(％)
0 0.00±0.00
1.56 11.29±7.48
3.13 11.88±8.57
6.25 22.29±10.84
12.5 43.80±6.59
25 56.28±3.21
表7 Retro-2.1对由EV71引起的293S细胞病毒空斑效应抑制率
Retro-2.1(μM) 抑制率(％)
0 0.00±0.00
0.024 25.12±3.36
0.098 43.02±5.26
0.39 56.65±6.36
1.56 65.06±13.07
6.25 71.86±14.09
通过以上结果可以得到如下结论，Retro-2cycl和Retro-2.1对由肠道病毒71型引起的293S细胞病毒空斑效应具有明显的抑制作用，且抑制率与药物浓度呈正相关，最优抑制率分别为56.28％和71.86％；经计算EC50分别为：18.49μM和0.28μM，与实施例2中其对肠道病毒71型引起的293S细胞病变效应抑制率的EC50接近；进一步证明，Retro-2cycl和Retro-2.1能有效抑制肠道病毒71型感染；因此，Retro-2cycl和Retro-2.1及相关衍生物可以成为抗肠道病毒71型感染候选药物的先导化合物，进而开发成为用于制备用于预防或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病的药物。
实施例4：Retro-2cycl和Retro-2.1对肠道病毒71型核酸复制和蛋白合成的作用
在考察Retro-2cycl和Retro-2.1对肠道病毒71型核酸复制作用实验中，取对数生长期的293S细胞，以2.5×105个/孔的密度接种于24孔培养板，培养24h。293S细胞在37℃和5％CO2下培养，使用的培养液为含有1.25μg/ml嘌呤霉素的10％FBS-DMEM。吸掉原细胞培养液，在加入500μlEV71感染之前(感染复数为0.1)，各孔细胞分别加入500μl含有不同浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的2％FBS-DMEM细胞培养液，使Retro2cycl和Retro2.1的终浓度分别为25μM和6.25μM，每个样品三个复孔，孵育5h；随后加入EV71感染并维持药物存在，继续培养细胞1h，吸掉原细胞培养液并用无菌PBS将单细胞层漂洗两遍，加入500μl含有对应浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的2％FBS-DMEM细胞培养液；继续培养细胞16h，收集细胞和上清液，按照说明书指导下使用病毒检测用RNA提取试剂盒(天根)及One StepPrimeScriptTM RT-PCR Kit II(TaKaRa)提取并定量检测细胞和上清液中肠道病毒71型RNA含量。
在考察Retro-2cycl和Retro-2.1对肠道病毒71型蛋白合成作用实验中，取对数生长期的293S细胞，以3×104个/孔的密度接种于96孔培养板，培养24h。293S细胞在37℃和5％CO2下培养，使用的培养液为含有1.25μg/ml嘌呤霉素的10％FBS-DMEM。吸掉原细胞培养液，在加入50μlEV71-EGFP(GenBank accession no.HM002485.1，包含反转录的全套EV71基因和插入到5`NTR与VP41基因之间的EGFP基因，获自吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室)感染之前，各孔细胞分别加入50μl含有不同浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的2％FBS-DMEM细胞培养液，使Retro2cycl和Retro2.1的终浓度分别为25μM和6.25μM，每个样品三个复孔，孵育5h；随后加入EV71-EGFP感染并维持药物存在，继续培养细胞1h，吸掉原细胞培养液并用无菌PBS将单细胞层漂洗两遍，加入100μl含有对应浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的2％FBS-DMEM细胞培养液；继续培养细胞16h，吸掉原细胞培养液，用RIPA裂解液(碧云天)将细胞裂解并在多标记微孔板检测系统(Multilabel Plate Reader 2030，购自Perkin Elmer公司)上测定535nm下的荧光值，荧光值的大小反映EV71-EGFP蛋白合成能力。
同时还设置了仅加入病毒进行感染的病毒对照，除了加入的物质不同以外，其他操作同上。
独立实验重复两次，结果取两次平均值。
实验结果如下：
表8 Retro-2cycl和Retro-2.1对EV71核酸复制的作用
组别 病毒对照 Retro-2.1
病毒核酸含量(％) 100.00±0.00 110.46±10.91 107.92±6.63
表9 Retro-2cycl和Retro-2.1对EV71蛋白合成的作用
组别 病毒对照 Retro-2.1
病毒EGFP含量(％) 100.00±0.00 107.65±0.25 92.35±0.21
通过以上结果可以得到如下结论，Retro-2cycl和Retro-2.1在肠道病毒71型感染过程中对病毒核酸含量及蛋白含量均无显著降低作用，证明Retro-2cycl和Retro-2.1对肠道病毒71型的进入过程以及复制过程均无抑制作用，两者对肠道病毒71型抑制作用的靶点非病毒进入及复制过程。
实施例5：Retro-2cycl和Retro-2.1降低肠道病毒71型子代病毒产量
取对数生长期的293S细胞，以2.5×105个/孔的密度接种于24孔培养板，培养24h。293S细胞在37℃和5％CO2下培养，使用的培养液为含有1.25μg/ml嘌呤霉素的10％FBS-DMEM。吸掉原细胞培养液，在加入500μlEV71感染之前(感染复数为0.1)，各孔细胞分别加入500μl含有不同浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的2％FBS-DMEM细胞培养液，使Retro2cycl和Retro2.1的终浓度分别为25μM和6.25μM，每个样品三个复孔，孵育5h；随后加入EV71感染并维持药物存在，继续培养细胞1h，吸掉原细胞培养液并用无菌PBS将单细胞层漂洗两遍，加入500μl含有对应浓度的Retro-2cycl和Retro-2.1的2％FBS-DMEM细胞培养液；继续培养细胞16h，收集细胞上清液。
同时还设置了仅加入肠道病毒71型进行感染的病毒对照，除了加入的物质不同以外，其他操作同上。
取对数生长期的293S细胞，以3×104个/孔的密度接种于96孔培养板，培养24h。293S细胞在37℃和5％CO2下培养，使用的培养液为含有1.25μg/ml嘌呤霉素的10％FBS-DMEM。吸掉原培养液，各孔中加入100μl含有不同稀释度的上述细胞上清液的2％FBS-DMEM细胞培养液，每个梯度8个复孔，并向各孔中补充100ul 2％FBS-DMEM；继续培养细胞7天，观察细胞病变孔数，采用Reed-Muench法计算法测定病毒滴度。
独立实验重复两次，结果取两次平均值。
实验结果如下：
表10 Retro-2cycl和Retro-2对EV71子代病毒产量的作用
组别 病毒对照 Retro-2.1
8.70±0.71 6.31±0.03 6.96±0.66
通过以上结果可以得到如下结论，Retro-2cycl和Retro-2.1对肠道病毒71型子代病毒产量具有明显的降低作用，可以将子代病毒滴度降低1-2个数量级；由于药物对病毒进入、复制及释放过程的抑制作用均可引起子代病毒产量的降低，而根据实施例4得到的结论，Retro-2cycl和Retro-2.1对肠道病毒71型的进入及复制过程并无抑制作用，证明Retro-2cycl和Retro-2.1是通过抑制肠道病毒71型的释放过程而发挥抗病毒作用；因此，Retro-2cycl和Retro-2.1及相关衍生物可以成为抗肠道病毒71型感染候选药物的先导化合物，进而开发成为用于制备用于预防或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病的药物。
实施例6：Retro-2cycl抑制肠道病毒71型对新生乳鼠的感染
将1日龄BALB/c乳鼠进行分组：安慰剂组，2mg/kg/天Retro-2cycl组，10mg/kg/天Retro-2cycl组，50mg/kg/天Retro-2cycl组，每组10-12只。
用无菌胰岛素注射器向乳鼠颅内注射25ul致死量的肠道病毒71型病毒液，攻毒剂量为600000TCID50；随后，用无菌胰岛素注射器向乳鼠腹腔注射25ul安慰剂或不同剂量的Retro-2cycl注射液；将乳鼠放置鼠笼内，给予母鼠及水和食物，自由采食母乳喂养；随后，分别于感染后的第1到6天，向乳鼠腹腔注射25ul安慰剂或不同剂量的Retro-2cycl注射液。
连续观察16天，每天记录乳鼠死亡数量。
实验结果如下：
表11 Retro-2cycl对肠道病毒71型感染新生乳鼠所致死亡率的作用
组别 安慰剂 2mg/kg 10mg/kg 50mg/kg
死亡率(％) 100.00 17.65 10.00 100.00
通过以上结果，可得到如下结论，Retro-2cycl的注射能够显著降低由肠道病毒71型感染新生乳鼠所致的死亡率；最优剂量为注射10mg/kg/天Retro-2cycl，能够将乳鼠死亡率由100％降低至10％，证明Retro-2cycl对肠道病毒71型的在新生乳鼠上的感染具有明显的保护作用；从动物模型方面进一步证明了Retro-2cycl能有效抑制肠道病毒71型感染；因此，Retro-2cycl和Retro-2.1及相关衍生物可以成为抗肠道病毒71型感染候选药物的先导化合物，进而开发成为用于制备用于预防或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备抑制由肠道病毒71型引起的细胞病变效应药物中的应用；
所述Retro-2cycl的结构式如式I所示：
所述Retro-2.1的结构式如式II所示：
所述相关衍生物如式III～VIII所示：
其中，R1独立选自：5-Me、4-Me、4-MeO、4-F、5-F；
其中，R2独立选自：
其中，R3独立选自：
其中，R4独立选自：t-Boc、COPh、Bn、Me、Et、Pr、n-Bu；
其中，R5独立选自：Et、CHO、CH2OH、CH2NHBn、CH2Cl、SMe、SPh、CN、Ph、3,4-(OMe)2Ph、3-NO2Ph、4-CO2MePh、4-COMePh、PhOPh、3,4,5-(OMe)3Ph、4-(OMe)Ph、4-CNPh、
其中，R6独立选自：Cl、I、OMe、SMe、F、Br、CN、OPh、SPh、Ph、Bn、CF3、OCF3、OBn、SO2Ph、NO2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Retro-2cycl作用于细胞的浓度为0.1～200μM；所述Retro-2.1作用于细胞的浓度为0.0005～100μM；所述细胞为人细胞。
3.Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备抑制由肠道病毒71型引起的病毒空斑效应药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Retro-2cycl作用于细胞的浓度为0.1～200μM；所述Retro-2.1作用于细胞的浓度为0.0005～100μM；所述细胞为人细胞。
5.Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备降低肠道病毒71型子代病毒产量药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Retro-2cycl作用于细胞的浓度为0.1～200μM；所述Retro-2.1作用于细胞的浓度为0.0005～100μM；所述细胞为人细胞。
7.Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备抑制肠道病毒71型感染小鼠药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述降低肠道病毒71型感染小鼠所致死亡率的Retro-2cycl注射剂量为0.1～200mg/kg/天。
9.Retro-2cycl和/或Retro-2.1及相关衍生物在制备预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述由小RNA病毒感染引起的疾病为由肠道病毒71型感染所致的手足口病。
11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病药物的服用者为人。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包含Retro-2cycl、Retro-2.1或相关衍生物中的一种或几种，以及一种或多种药用载体。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包含其他用于预防和/或治疗由小RNA病毒感染引起的疾病的药物。
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