CN105640951B - 不对称芳香二硫醚类化合物作为病毒3c蛋白酶抑制剂在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

不对称芳香二硫醚类化合物作为病毒3c蛋白酶抑制剂在制备抗病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种不对称芳香二硫醚类化合物作为病毒3C蛋白酶抑制剂在制备抗病毒药物中的应用。所述化合物的结构式如式I或式Ⅱ所示，式I中，R1表示苯环上的单取代基或多取代基，R1独立地选自‑NO2、C1‑C3烷基、C1‑C3烷氧基、R’OCO‑和与苯环直接稠合构筑得到的稠环，其中R’表示C1‑C3烷基；R2表示H或碳原子数为1~3的酰基，R3表示H或C1‑C3烷基；式Ⅱ中，X表示NH或S；R4表示苯环上的单取代基或多取代基，R1独立地选自‑NO2、C1‑C3烷基和卤素；R5表示H或R’’OCO‑，其中R’’表示C1‑C3烷基；R6表示H或R’’’CONH‑，其中R’’’表示C1‑C3烷基。本发明不对称芳香二硫醚类化合物可以通过抑制CVB3 3C活性，在细胞水平上产生CVB3病毒抑制效果，具有良好的抗病毒药物应用前景。

Description

不对称芳香二硫醚类化合物作为病毒3C蛋白酶抑制剂在制备 抗病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及不对称芳香二硫醚类化合物作为病毒3C蛋白酶抑制剂在制备抗病毒药物中的应用，具体涉及对柯萨奇病毒(Coxsackie virus)B3亚型(CVB3)的3C蛋白酶有较强抑制效果的不对称芳香二硫醚类化合物。
背景技术
病毒性心肌炎(Viralmyocarditis)是一种严重威胁人类的感染性疾病。柯萨奇病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，能够导致重症心肌炎和神经系统疾病，严重危害人类，特别是婴幼儿的生命健康。现已发现，该病毒的3C蛋白酶在其复制及侵染宿主的过程中发挥重要作用，而且人体中没有其同源基因，因此是一个理想的药物设计靶点(Esfandiarei and McManus,Molecular Biology and Pathogenesis of ViralMyocarditis.Annual Review of Pathology:Mechanisms of Disease,2008.3(1):p.127-155.)。人类鼻病毒(human rhinovirus)的特异性抑制剂—芦平曲韦(rupintrivir)，就是由此诞生的一种肽类药物(AK Patick,et al,In Vitro Antiviral Activity of AG7088,a Potent Inhibitor of Human Rhinovirus 3C Protease.Antimicrobial Agents&Chemotherapy,1999.43(10):p.2444-50)，它具有与3C蛋白酶底物相似的空间构型，因而能够同底物竞争性地与酶结合，发挥对酶的抑制作用。但目前对3C蛋白酶抑制剂的研究主要局限于这种肽类化合物，化合物结构类型相对单一，而且尚无专门针对心肌炎病毒3C蛋白酶的药物。目前尚未有关于不对称芳香二硫醚类化合物作为心肌炎病毒3C蛋白酶的抑制剂的任何报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种不对称芳香二硫醚类化合物作为病毒3C蛋白酶抑制剂在制备抗病毒药物中的应用，不对称芳香二硫醚类化合物对小RNA病毒的3C蛋白酶具有很好的抑制活性，并且在细胞水平上对几种能引起感染的病毒具有较强的抑制活性。
本发明首先提供不对称芳香二硫醚类化合物在制备预防和/或治疗含有3C蛋白酶的病毒感染的抗病毒药物中的应用；
所述不对称芳香二硫醚类化合物的结构式如式I或式Ⅱ所示，
式I中，R1表示苯环上的单取代基或多取代基，R1独立地选自-NO2、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、R’OCO-和与苯环直接稠合构筑得到的稠环，其中R’表示C1-C3烷基；
R2表示H或碳原子数为1～3的酰基，
R3表示H或C1-C3烷基；
式Ⅱ中，X表示NH或S；
R4表示苯环上的单取代基或多取代基，R1独立地选自-NO2、C1-C3烷基和卤素；
R5表示H或R”OCO-，其中R”表示C1-C3烷基；
R6表示H或R”’CONH-，其中R”’表示C1-C3烷基。
所述病毒可为柯萨奇病毒，具体可为B3亚型。
本发明还进一步提供了所述不对称芳香二硫醚类化合物在制备病毒3C蛋白酶抑制剂中的应用，其中所述病毒具体可为柯萨奇病毒B3亚型。
活性成分为所述不对称芳香二硫醚类化合物的预防和/或治疗含有3C蛋白酶的病毒感染的抗病毒药物也属于本发明的保护范围，所述病毒具体可为柯萨奇病毒B3亚型。
所述抗病毒药物还可包括一种或多种药学上可接受的载体，所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂或增效剂等。
所述抗病毒药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用，其给药途径可以为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
式I中，R1表示苯环上的单取代基或双取代基，R1独立地选自-NO2、甲基、甲氧基、CH3OCO-和与苯环直接稠合构筑得到的苯环；
R2表示H或乙酰基；
R3表示H或甲基；
式Ⅱ中，R4表示苯环上的单取代基，R1选自-NO2、甲基和溴；
R5表示H或C2H5OCO-；
R6表示H或CH3CONH-。
不对称芳香二硫醚类化合物具体可为下述式1-式11所示化合物中任一种，
本发明所涉及的不对称芳香二硫醚类化合物可按照文献(王建国等，中国发明专利ZL201210055728.5；王建国等，中国发明专利ZL201210084848.8)公开的方法制备。
通过体外酶活测试，本发明涉及的不对称芳香二硫醚类化合物对CVB3 3C蛋白酶有着很强的抑制作用，IC50达到μM级，与阳性对照芦平曲韦(IC50＝1.57μM)活性相似，但化学结构与芦平曲韦等短肽化合物完全不同，很可能具有与芦平曲韦完全不同的作用机制。经过细胞水平活性测试，本发明涉及的不对称芳香二硫醚类化合物对CVB3病毒有抑制作用。因此本发明涉及的不对称芳香二硫醚类化合物在制备CVB3亚型的3C蛋白酶抑制剂方面有很大应用潜力。本发明涉及的不对称芳香二硫醚类化合物可以通过抑制CVB3 3C活性，在细胞水平上产生CVB3病毒抑制效果，具有良好的抗病毒药物应用前景。
附图说明
图1是式1-11所示不对称芳香二硫醚类化合物对CVB3 3C蛋白酶的抑制曲线。
图2是式1、式2、式3、式5和式6所示不对称芳香二硫醚类化合物对CVB3病毒感染的Hela细胞的抑制活性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例用于合成不对称芳香二硫醚类化合物所使用的化学原料及试剂3-巯基-[1,2,4]-三唑、3-巯基-5-甲基-[1,2,4]-三唑、1-乙酰基-3-巯基-5-甲基-[1,2,4]-三唑、2-巯基-4-乙氧羰基-咪唑、2-巯基-5-乙酰氨基-噻唑、邻硝基苯硫氯、邻甲基苯硫氯、邻甲氧羰基苯硫氯、2-硝基-4-甲氧基-苯硫氯、β-萘硫氯、对甲基苯硫氯、对溴苯硫氯购自Alfa Aesar(天津)化学品公司、上海晶纯试剂有限公司或美国Aurora化学品公司，其余原料和试剂均为天津本地市售。
下述实施例所使用生化原料及试剂如下：
氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、二甲基亚砜DMSO(以上均购自国药集团化学试剂有限公司)，三羟甲基氨基甲烷(Tris，购自NOVON公司)、咪唑(购自MPBiomedicals公司)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT，购自北京欣经科生物公司)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA,购自Sigma公司)、甘油(购自Sigma公司)、芦平曲韦(rupintrivir，购自加拿大Toronto Research Chemicals公司)、细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8，购自同仁化学公司)、3C蛋白酶底物(H-Asp-{Glu(EDANS)}-Met-Ser-Ala-Ile-Phe-Gln-Gly-Pro-Ile-Ser-{Lys(DABCYL)}-Asp-OH,购自上海吉尔生化公司)、3925黑色平底不透明96孔酶标板(购自Corning公司)、CVB3 3C蛋白酶(47μM，20mM Tris，200mM NaCl，250mM咪唑，5％(v/v)甘油)、2×phosphate bufferedsaline(PBS)缓冲液(16g NaCl，0.4g KCl，7.16g Na2HPO4·12H2O，0.48g KH2PO4,溶于1000mL水，调pH值至7.4，使用高压蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌20分钟，冷却备用),荧光酶标仪(Spectra max GEMINI xps,Molecular Devices公司)。
实施例1：不对称芳香二硫醚类化合物的合成
反应方程式如上所示。
将0.50g(5mmol)3-巯基-[1,2,4]-三唑-加入到0.94g(5mmol)的邻硝基苯硫氯的乙醚溶液当中，室温反应3个小时，过滤，无水乙醚洗涤，即得目标化合物，粗品过柱，得1.13g黄色邻硝基苯二硫基-1H-[1,2,4]-三唑(式1所示化合物，产率89％)。
基本按照同样的方法合成式2-11所示化合物。
式1-11所示化合物的物化表征数据见表1，1HNMR、高分辨质谱数据见表2。
表1不对称芳香二硫醚类化合物的物化参数
表2不对称芳香二硫醚类化合物的1HNMR、高分辨质谱
实施例2：不对称芳香二硫醚类化合物对CVB3 3C蛋白酶抑制活性的测定
测试模型每孔总体积为50μL，包括3C蛋白酶溶液(终浓度2.3μM)、底物溶液(终浓度25μM)和PBS-BSA缓冲液(2×PBS缓冲液额外添加2mg/mL BSA和5.85mg/mL NaCl)，每种化合物两倍浓度梯度，不对称芳香二硫醚类化合物终浓度为0-200μM；同时设置负对照(不含CVB3 3C蛋白酶)和空白组(DMSO)，另设置了正对照芦平曲韦组。每个组设3个平行，混匀后37℃孵育60分钟后用Spectra max GEMINI xps荧光酶标仪读取荧光数值，激发波长为340nm，发射波长为490nm。将各孔的数值减掉空白组得到真实值，计算化合物对3C蛋白酶的抑制率，抑制率计算公式为抑制率(％)＝100×(负对照-待测化合物组数值)/负对照。同时计算其IC50值。
式1-11所示不对称芳香二硫醚类化合物对CVB3 3C蛋白酶的IC50数据见表3。
由表3可以看出，本发明所提供的不对称芳香二硫醚类化合物对CVB3 3C蛋白酶有着很强的抑制作用，IC50达到μM级，与阳性对照芦平曲韦(IC50＝1.57μM)活性相似。
实施例3：不对称芳香二硫醚类化合物对Hela细胞的细胞毒性的测试
测试模型每孔总体积为100μL，接种人子宫颈癌细胞Hela细胞(终浓度5×105个/mL)，于37℃、5％CO2条件下培养24h后，加入不同浓度的被试化合物，继续孵育16h，再加入10μL CCK-8溶液，4h后检测波长450nm处吸光度。本模型同时设置模型组(DMSO)和空白组(未加DMSO)，每个组设3个平行。
结果见表3所示，由表3可知，各化合物在相应IC50剂量范围内对Hela细胞没有显示细胞毒性。
表3式1-11所示不对称芳香二硫醚类化合物对CVB3 3C蛋白酶的抑制活性和细胞毒性
化合物编号 半数抑制浓度(IC50/μM) 细胞毒性(IC50/μM)
1 2.79 38.28
2 1.61 44.56
3 2.15 78.17
4 1.49 26.08
5 1.24 30.12
6 0.785 63.08
7 5.53 >126.9
8 1.917 >123.04
9 12.82 >135.57
10 7.718 >111.14
11 3.69 >91.7
实施例4：不对称芳香二硫醚类化合物对细胞抗CVB3病毒感染的影响测试
本测试模型选取10μg/mL的药物来测试其对细胞抗CVB3感染的活性。将状态良好的HeLa细胞种在12孔板中，于37℃、5％CO2条件下培养24h后，将培养基换为不含血清的DMEM培养基继续培养1h后加入相应药物，孵育40min后按MOI＝0.1感染CVB3病毒，正对照组只含细胞，不加入药物和病毒，负对照组细胞只加入病毒，不加药物处理，继续培养16h至负对照细胞出现明显细胞病变效应(CPE)后用MTS试剂检测细胞活力，各组数据与负对照组利用t检验作差异显著性分析，测试结果如图2所示。从图2可以看出，各实验组与负对照相比均有显著性差异，说明本发明涉及的不对称芳香二硫醚类化合物对细胞对抗CVB3感染也有活性。

Claims (1)

1.不对称芳香二硫醚类化合物在制备预防和/或治疗含有3C蛋白酶的病毒感染的抗病毒药物中的应用；
所述不对称芳香二硫醚类化合物的结构式如式1、式2、式3、式5或式6所示，
所述病毒为柯萨奇病毒；
所述柯萨奇病毒为B3亚型。
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