CN112546038A - 杨梅素在制备预防或治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，公开了杨梅素在制备预防或治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用，杨梅素或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.1‑1000mg/kg。杨梅素对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2相互作用的靶点及其对SARS‑CoV‑2的Spike蛋白结合域的RBD蛋白、受体蛋白ACE2具有高蛋白亲和力；此外，杨梅素还可抑制SAR‑Cov‑2、HCoV‑229E、H1N1病毒活性，且可减轻炎症动物模型的体内炎症反应。本发明首次确定杨梅素具有对SARS‑CoV‑2的抑制作用及其作用靶点，且未见毒性反应。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及杨梅素在制备预防或治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用。
背景技术
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(即SARS-CoV-2或COVID-19)感染引起的是一种传染性强，潜伏期长的新发传染病。人群普遍易感，呼吸道飞沫和接触传播是主要的传播途径。对于SARS-CoV-2感染性疾病，目前仍无确切有效的治疗方法。因此，如何迅速开发防治这种病毒感染的药物是全球性热点问题。
在抗击SARS-CoV-2疫情过程中，中医药发挥了重要的作用，发现中草药中所含针对新冠病毒的活性成分能够制备成抑制病毒复制的高效、低毒/无毒的药品、食品、保健食品和消毒制剂等，这对于预防感染及早期干预阻断新冠肺炎病情进展具有重大意义。现有技术中对这类活性成分的发现和应用还有待进一步改善，才能更好的防治新冠病毒或其他病毒。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出杨梅素在制备预防或治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用，本发明通过实验确定杨梅素对SARS-CoV-2相关靶点具有相互作用，且与RBD蛋白、ACE2蛋白亲和力好。此外，杨梅素还对HCoV-229E、H1N1病毒具有显著的抑制作用，并能抑制多种炎症动物模型病理程度恶化和减低体内炎症介质和细胞因子水平。
本发明一方面提供一种含杨梅素或其药学上可接受的盐的药物。
具体的，一种药物，包含杨梅素或其药学上可接受的盐，所述杨梅素或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.1-1000mg/kg(即每kg体重的给药量为0.1-1000mg的杨梅素或其药学上可接受的盐)。
本发明的另一方面提供杨梅素或其药学上可接受的盐的应用。
具体的，杨梅素或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用；所述杨梅素或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.1-1000mg/kg。
杨梅素的结构如式(1)：
优选的，所述杨梅素或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.5-500mg/kg；进一步优选的，所述杨梅素或其药学上可接受的盐的给药剂量为5-400mg/kg；更优选的，所述杨梅素或其药学上可接受的盐的给药剂量为100-150mg/kg。
优选的，所述冠状病毒选自新型冠状病毒SARS-CoV-2和/或冠状病毒HCoV-229E。
优选的，所述流感病毒为流感病毒H1N1。
优选的，所述应用中的药物的特点在于，所述杨梅素是通过作用于SARS-CoV-2的Spike蛋白(刺突蛋白)结合域及其受体ACE2蛋白来抑制SARS-CoV-2感染。
进一步优选的，所述应用中的药物的特点在于，所述杨梅素是通过与SARS-CoV-2相关靶点PLpro、3CLpro、RdRp、S-ACE2相互作用来抑制SARS-CoV-2感染。
优选的，所述应用中的杨梅素至少满足以下任一条件：
(1)与RBD蛋白亲和力常数小于100μM；
(2)与ACE2蛋白亲和力常数小于100μM。
杨梅素或其药学上可接受的盐在制备防治冠状病毒、流感病毒的食品、化妆品或消毒剂中的应用；所述杨梅素的给药剂量为0.1-1000mg/kg。
优选的，所述食品还包括保健品。
优选的，所述杨梅素来自于杨梅科、葡萄科、豆科、杜鹃花科和大戟科等多科植物中提取或化学合成或生物工程技术合成。
杨梅素具有抗炎活性，能够调节机体内炎症介质和细胞因子水平，且无不良反应的优点。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
通过实验确定了杨梅素对新型冠状病毒SARS-CoV-2相互作用的靶点及其对SARS-CoV-2的Spike蛋白结合域的RBD蛋白、受体蛋白ACE2具有高蛋白亲和力；此外，杨梅素还可抑制SAR-Cov-2、HCoV-229E、H1N1病毒活性，且可减轻炎症动物模型的体内炎症反应。本发明首次确定杨梅素具有对SARS-CoV-2的抑制作用及其作用靶点，且未见毒性反应。因此，杨梅素有可能开发成为抑制严重急性呼吸系统综合征SARS-CoV-2感染的食品、保健食品、药品、化妆品和消毒剂，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为实施例3中杨梅素和瑞德西韦对SARS-CoV-2病毒感染Vero E6细胞的抑制作用；
图2为实施例3中杨梅素和瑞德西韦对HCoV-229E病毒感染Huh-7细胞的抑制作用；
图3为实施例3中杨梅素对H1N1病毒感染MDCK细胞的抑制作用；
图4为实施例6中杨梅素和瑞德西韦对Huh-7细胞的MTT细胞毒性试验结果；
图5为实施例6中杨梅素对Vero E6细胞的MTT细胞毒性试验结果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1：杨梅素与新冠病毒相关靶点间相互作用
通过从现有技术中的数据库中查阅杨梅素、新型冠状病毒SARS-CoV-2三维结构后，在工作站中通过分子对接计算方法寻找蛋白质活性配体来确定杨梅素与新型冠状病毒SARS-CoV-2相关靶点间的相互作用。结果显示：杨梅素与新型冠状病毒SARS-CoV-2中病毒复制蛋白酶(PLpro)、3C类似蛋白酶(3CLpro)、核糖核酸合成酶(RdRp)、刺突蛋白-宿主细胞的ACE2受体(S-ACE2)等4个靶点具有相互作用，结果如表1所示(表1中的负值绝对值大于5表示杨梅素与靶点间有较强的相互作用；负值的绝对值越大，说明杨梅素与靶点的相互作用越强)。
表1：杨梅素与新型冠状病毒相关靶点间相互作用计算机分子模拟对接分值
实施例2：杨梅素与ACE2、SARS-CoV-2中刺突蛋白(Spike)亲和力试验
将杨梅素采用二倍梯度稀释法稀释6个浓度梯度后，分别与制备好的RBD探针、ACE2探针在分子相互作用仪上进行检测，检测结果发现杨梅素与RBD蛋白(Kd＝12.31±4.95)、ACE2蛋白(Kd＝26.2±4.38)具有较强的亲和力(Kd值越小表明亲和力越大，Kd<100μM即提示有较强亲和力，μM表示μmol/L)，结果如表2所示。
表2：杨梅素与SARS-CoV-2的Spike蛋白(刺突蛋白)结合域、ACE2蛋白的亲和力
| RBD探针Kd(μM) | ACE2探针Kd(μM) |
| 12.31±4.95 | 26.2±4.38 |
实施例3：杨梅素对SARS-CoV-2、HCoV-229E、H1N1病毒的抑制活性试验
96孔培养板每孔加入100μL浓度为2×105个/mL的Huh-7或Vero E6细胞，37℃、5％CO2培养24小时；药物实验组和病毒对照组加入50个TCID50(半数组织培养感染剂量)的HCoV-229E或SARS-CoV-2病毒液100μL/孔，37℃、5％CO2培养箱吸附1小时。弃去培养液，加入100μL/孔的两倍梯度稀释的受试药物，每个浓度4个复孔，同时设立细胞对照、病毒对照(阴性对照)和阳性药物对照瑞德西韦(Remdesivir)。37℃、5％CO2孵箱孵育3天后，光学显微镜下记录CPE(病毒引起的细胞病变)，程度按以下6级标准记录出现CPE的细胞占总细胞的百分比：“-”表示“无”；“±”表示“＜10％”；“+”表示“25％”；“++”表示“50％”；“+++”表示“75％”；“++++”表示“＞75％”。记录CPE后，弃上清，MTT染色(噻唑蓝染色)(方法同药物细胞毒性试验)。采用软件GraphPad Prism8.0的Nonlinear regression方法计算CPE减少法和MTT染色法中药物对病毒感染致细胞死亡的半数抑制浓度(IC50)。计算选择指数SI(SI为selective index，选择性指数，细胞毒性CC50与IC50的比值，细胞毒性越小，CC50数值就越大，SI值也就越大，抗病毒的选择性就越高)。
图1为实施例3中杨梅素和瑞德西韦对SARS-CoV-2病毒感染Vero E6细胞的抑制作用，其中，图1中的(a)表示杨梅素对SARS-CoV-2病毒感染Vero E6细胞的抑制作用，杨梅素对SARS-CoV-2感染致CPE具有显著抑制作用(IC50＝55.18μM)；图1中的(b)表示瑞德西韦对SARS-CoV-2病毒感染Vero E6细胞的抑制作用，瑞德西韦对SARS-CoV-2感染致CPE显示出抑制活性(IC50＝0.651μM)(图1中纵坐标“Inhibition”表示“抑制率”，横坐标表示浓度)。
图2为实施例3中杨梅素和瑞德西韦对HCoV-229E病毒感染Huh-7细胞的抑制作用；其中，图2中的(a)表示杨梅素对HCoV-229E病毒感染Huh-7细胞的抑制作用(IC50＝53.51μM，SI＝4.02)；图2中的(b)表示瑞德西韦对HCoV-229E病毒感染Huh-7细胞的抑制作用(IC50＝0.05617μM，SI＞1000)(图2中的“CPE reduction assay”表示“CPE还原测定”，“MTT assay”表示“MTT测定”)。
图3为实施例3中杨梅素对H1N1病毒感染MDCK细胞的抑制作用；杨梅素(IC50＝15.18μM)对H1N1病毒感染致CPE具有抑制作用。
实施例4：杨梅素对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抑制作用
除空白对照组外，所有小鼠腹背部剃毛，第0天和第1天，分别取20ul已配好的0.5％二硝基氟苯(DNFB)造模剂均匀涂抹在造模组小鼠的腹背部，取20ul丙酮/橄榄油混合液均匀涂抹在空白对照组小鼠的腹背部。第6天取20ul已配好的0.5％DNFB造模剂均匀涂抹在造模组小鼠的左耳上下两面，取20ul丙酮/橄榄油混合液均匀涂抹在空白对照组小鼠的左耳上下两面，右耳均不涂，作对照。按造模情况随机分组后，造模当天(第0天)给药两小时后开始造模，连续口服给药至第8天后处死动物，取相关脏器进行检测，结果如表3所示(50mg杨梅素对应的是157.11μmol，对应1.57*106μM)。
表3：小鼠耳肿胀厚度的测试结果
从表3可以看出，杨梅素可减轻二硝基氟苯所致的小鼠耳肿胀，随着给药剂量的增加，耳肿胀缓解程度越明显。以上结果说明：杨梅素可缓解二甲苯致耳肿胀小鼠体内炎症水平。
实施例5：杨梅素对角叉菜胶所致大鼠急性足肿胀的影响
大鼠随机分组，杨梅素按照不同浓度灌胃给药7天后按照毛细管放大测量法测量所有大鼠右后足足容积作为基础足容积；测量完毕后在其右后足足跖部位皮下注射角叉菜胶0.1ml/只，空白对照组注射等体积生理盐水。注射完毕后，分别用毛细管放大测量法测量致炎后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时大鼠右后足足容积。其后处死大鼠，进行相关脏器检测，结果如表4和表5所示。
表4：大鼠急性足肿胀增加的体积的测试结果
从表4可以看出，杨梅素能抑制大鼠足肿胀，且具有剂量依赖关系，表明杨梅素可缓解角叉菜胶引起大鼠急性足肿胀模型的体内炎症水平。
表5：杨梅素对角叉菜胶所致的大鼠急性足肿胀模型血沉的影响结果
| 血沉(均数±标准差)(mm) | |
| 空白对照组 | 9.15±3.56*** |
| 模型组 | 17.14±5.68 |
| 地塞米松阳性药对照组(1mg/天/kg) | 6.0±2.89**** |
| 杨梅素低剂量组(50mg/天/kg) | 12.36±3.45 |
| 杨梅素中剂量组(100mg/天/kg) | 12.20±3.48 |
| 杨梅素高剂量组(150mg/天/kg) | 9.04±3.95*** |
从表5可以看出，杨梅素能抑制大鼠足血沉(血沉指红细胞沉降率)，且具有剂量依赖关系，表明杨梅素可缓解角叉菜胶引起大鼠急性足肿胀模型的体内炎症水平。
实施例6：杨梅素细胞毒性试验(MTT法)
96孔培养板每孔加100μL浓度为1×105个/mL的Huh-7或Vero E6细胞，37℃、5％CO2培养24小时；药物实验组和空白对照组加入100μL/孔的两倍梯度稀释的受试药物，每个浓度4个复孔，同时设立细胞对照和阳性药物对照瑞德西韦(Remdesivir)，继续培养24h。加入10μl MTT继续孵育4h后，弃上清，加入150μl的DMSO，用全波长多功能酶标仪检测490nm处吸光度值。
图4为实施例6中杨梅素和瑞德西韦对Huh-7细胞的MTT细胞毒性试验结果；图4中的(a)为杨梅素对Huh-7细胞的MTT细胞毒性试验结果，杨梅素对Huh-7细胞的无毒浓度为CC0＝80μM，CC50＝247.54μM；图4中的(b)为瑞德西韦对Huh-7细胞的MTT细胞毒性试验结果，瑞德西韦对Huh-7细胞的无毒浓度为CC0＝50μM，CC50＝108.1μM(图4中的纵坐标“Cellviability”表示“细胞活力”，横坐标表示浓度)。
图5为实施例6中杨梅素对Vero E6细胞的MTT细胞毒性试验结果，杨梅素对VeroE6细胞的半数毒性浓度为83.35±4.11μM(图5中的纵坐标“Cell viability”表示“细胞活力”，横坐标表示浓度)。
Claims (10)
1.一种药物，其特征在于，包含杨梅素或其药学上可接受的盐，所述杨梅素或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.1-1000mg/kg。
2.杨梅素或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用；所述杨梅素或其药学上可接受的给药剂量为0.1-1000mg/kg。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述杨梅素的给药剂量为0.5-500mg/kg；优选的，所述杨梅素的给药剂量为100-150mg/kg。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒选自新型冠状病毒SARS-CoV-2和/或冠状病毒HCoV-229E。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述流感病毒为流感病毒H1N1。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用中的药物中的杨梅素是通过作用于SARS-CoV-2的Spike蛋白结合域及其受体ACE2蛋白来抑制SARS-CoV-2感染。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用中的药物中的杨梅素是通过与SARS-CoV-2相关靶点PLpro、3CLpro、RdRp、S-ACE2相互作用来抑制SARS-CoV-2感染。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用中的杨梅素至少满足以下任一条件：
(1)与RBD蛋白亲和力常数小于100μM；
(2)与ACE2蛋白亲和力常数小于100μM。
9.杨梅素或其药学上可接受的盐在制备防治冠状病毒、流感病毒的食品、化妆品或消毒剂中的应用；所述杨梅素或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.1-1000mg/kg。
10.根据权利要求2-8或9中任一项所述的应用，其特征在于，所述杨梅素来自于杨梅科、葡萄科、豆科、杜鹃花科、大戟科提取或化学合成，或生物工程技术合成。
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